WO2000044911A1 - Überexpression einer dna-sequenz codierend für transketolase in pflanzen - Google Patents

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WO2000044911A1
WO2000044911A1 PCT/EP2000/000472 EP0000472W WO0044911A1 WO 2000044911 A1 WO2000044911 A1 WO 2000044911A1 EP 0000472 W EP0000472 W EP 0000472W WO 0044911 A1 WO0044911 A1 WO 0044911A1
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plants
transketolase
plant
dna sequence
amino acids
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PCT/EP2000/000472
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Stefan Henkes
Ralf Badur
Marc Stitt Nigel
Ralf-Michael Schmidt
Andreas Reindl
Rita Zrenner
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Basf Aktiengesellschaft
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    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
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Definitions

  • the present invention relates to the use of DNA sequences coding for a transketolase for the production of plants with an increased content of tocopherols, vitamin K, chlorophylls, aromatic amino acids and / or lignin, in particular the use of DNA sequences SEQ-ID No. 1 or with this hybridizing DNA sequences, a process for the production of plants with an increased content of tocopherols, vitamin K, chlorophylls, aromatic amino acids and / or lignin, and the plant itself produced in this way.
  • the eight naturally occurring compounds with vitamin E activity are derivatives of 6-chromanol (Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, Vol. A 27 (1996), VCH Verlagsgesellschaft, Chapter 4., 478-488, vitamin E).
  • the first group (la-d) is derived from tocopherol, the second group consists of derivatives of tocotrienol (2ad):
  • ⁇ -Tocopherol is of great economic importance.
  • the genetic engineering process for example isolating the essential biosynthesis genes coding for the tocopherol synthesis performance and transferring them in crop plants in a targeted manner, is superior to the classic breeding method. This method assumes that biosynthesis and its regulation are known and that genes that influence biosynthesis performance are identified.
  • Isoprenoids or terpenoids consist of different classes of lipid-soluble molecules and are partially or completely formed from C 5 isoprene units.
  • Pure prenyl lipids eg carotenoids
  • mixed prenyl lipids eg chlorophylls, tocopherols and vitamin K
  • the ring structures of the mixed prenyl lipids that lead to the formation of vitamins E and K are quinones, the starting metabolites of which come from the Shikimate pathway.
  • the aromatic amino acids phenylalanine and tyrosine are converted into hydroxyphenyl pyruvate, which is converted into homogenisic acid by dioxygenation.
  • the chorismate is formed on the one hand by erythrose-4-phosphate, 3-dehydroquinate, 3 '-dehydroshikimate, shikimate, shikimate-3-phosphate and 5'-enolpyruvylshikimate-3-phosphate (Fig. 1).
  • Erythrose-4-phosphate is provided by the enzymatic activity of the plastid transketolase.
  • Fructose-6-phosphate and glyceraldehyde-3-phosphate are converted to xylulose-5-phosphate and erythrose-4-phosphate.
  • the homogentisic acid described above is then bound to PPP to form the precursor of ⁇ -tocopherol and ⁇ -tocoquinone, the 2-methyl-6-phytylquinol.
  • Methylation steps with S-adenosylmethionine as the methyl group donor initially produce 2,3-dimethyl-6-phytylquinol, then by cyclization ⁇ -tocopherol and by repeated methylation of ⁇ -tocopherol (Richter, biochemistry of plants, Georg Thieme Verlag Stuttgart, 1996).
  • phenylalanine-ammonium lyase catalyzes the breakdown of phenylalanine and thus removes it from phenylpropanoid biosynthesis (BHencee et al., Proc. Natl. Acad. Sei USA 91 (16): 7608-7612 (1994); Howles et al., Plant Physiol. 112, 1617-1624 (1996)).
  • the object of the present invention was to develop a transgenic plant with an increased content of tocopherols, vitamin K, aromatic amino acids, chlorophylls and / or lignin.
  • the object was surprisingly achieved by overexpressing a transketolase gene in the plants.
  • chorismate as an essential starting substrate for all plastidic isoprenoids
  • the activity of plastid transketolase was increased in transgenic plants by overexpression of the transketolase gene from yeast. In principle, this can also be achieved by expressing homologous or heterologous transketol genes.
  • the transketolase gene (SEQ-ID No. 1, Accesion No. M 63302) from yeast (Saccharomyces cerevisiae) is expressed to a greater extent in transgenic plants.
  • the structural gene of the yeast is trans-
  • ketolase preceded a transit signal sequence.
  • a DNA sequence which codes for a transketolase gene which is identified by SEQ-ID No. 1 hybridizes and that comes from other organisms or from other plants.
  • the transgenic plants are produced by transforming the plants with a construct containing the transketolase gene.
  • Tobacco and rapeseed were used as model plants for the production of tocopherols, vitamin K, lignins, chlorophylls and aromatic amino acids.
  • Antisense constructs and homologous or heterologous plant transketolase genes were transformed into plants independently of one another. Measurements on transketolase antisense plants showed a drastic decrease in the content of aromatic amino acids, chlorophyll, lignin and tocopherol content, see Figures 2 to 7. This demonstrates the direct influence of plastid plant transketolase on the synthesis of aromatic amino acids , Chlorophylls, lignins and tocopherols.
  • the invention relates to the use of the DNA sequence SEQ-ID No. 1 from yeast, which code for a transketolase or its functional equivalents, for the production of a plant with an increased content of tocopherols, vitamin K, chlorophylls, lignins and / or aromatic amino acids.
  • the nucleic acid sequence can e.g. be a DNA or cDNA sequence. Coding sequences suitable for insertion into an expression cassette are, for example, those which code for a transketolase and which give the host the ability to overproduce tocopherols, vitamin K, chlorophylls and / or aromatic amino acids.
  • the expression cassettes also contain regulatory nucleic acid sequences which control the expression of the coding sequence in the host cell.
  • an expression cassette comprises upstream, i.e. at the 5 'end of the coding sequence, a promoter and downstream, i.e. at the 3 'end, a polyadenylation signal and, if appropriate, further regulatory elements which are operatively linked to the intermediate coding sequence for the transketolase gene.
  • An operative link is understood to mean the sequential arrangement of promoter, coding sequence, terminator and, if appropriate, further regulatory elements in such a way that each of the regulatory elements can fulfill its function as intended in the expression of the coding sequence.
  • sequences preferred but not limited to the operative linkage are targeting sequences to ensure the subcellular localization in the apoplast, in the vacuole, in plastids, in the mitochondrion, in the endoplasmic reticulum (ER), in the cell nucleus, in olbodies or other compartments and Translation enhancers such as the 5 'guiding sequence from the tobacco mosaic virus (Gallie et al., Nucl. Acids Res. 15 (1987), 8693-8711).
  • the plant expression cassette can be installed in the tobacco transformation vector pBinAR-Hyg.
  • Fig. 8 shows the tobacco transformation vectors pBinAR-Hyg with 35S promo tor (A) or pBinAR-Hyg with seed-specific promoter Phaseolin 796 (B):
  • HPT hygromycin phosphotransferase 5 - OCS: octopine synthase terminator PNOS: nopaline synthase promoter such restriction sites are also shown that only cut the vector once.
  • any promoter that can control the expression of foreign genes in plants is suitable as promoters of the expression cassette.
  • a plant promoter or a plant virus-derived promoter is preferably used.
  • the CaMV 35S promoter is particularly preferred
  • this promoter contains different recognition sequences for transcriptional effectors, which in their entirety lead to permanent and constitutive expression of the introduced gene (Benfey et al., EMBO J. 8 (1989),
  • the expression cassette can also contain a chemically inducible promoter, by which the expression of the exogenous transketolase gene in the plant at a certain point in time is
  • Such promoters as e.g. the PRPl promoter (Ward et al., Plant. Mol. Biol. 22 (1993), 361-366), a promoter inducible by salicylic acid (WO 95/19443), one inducible by benzenesulfonamide (EP-A 388186 ), a tetracycline-inducible (Gatz et al., (1992) Plant J. 2,
  • an abscisic acid-inducible (EP-A 335528) or an ethanol- or cyclohexanone-inducible (WO 93/21334) promoter can include be used.
  • promoters are particularly preferred which ensure expression in tissues or parts of plants in which, for example, the biosynthesis of tocopherol or its precursors takes place. Promoters that ensure leaf-specific expression should be mentioned in particular.
  • the promoter of the cytosolic FBPase from potatoes or the ST-LSI 40 promoter from potatoes should be mentioned (Stockhaus et al., EMBO J. 8 (1989), 2445-245).
  • the expression cassette can therefore, for example, specific promoter (preferably the phaseolin promoter (US 5504200), the USP- (Baumlein, H. et al., Mol. Gen. Genet. (1991) 225 (3), 459-467) or LEB4 promoter (Fiedler and Conrad, 1995)), the LEB4 signal peptide, the gene to be expressed and 5 an ER retention signal.
  • specific promoter preferably the phaseolin promoter (US 5504200), the USP- (Baumlein, H. et al., Mol. Gen. Genet. (1991) 225 (3), 459-467) or LEB4 promoter (Fiedler and Conrad, 1995)
  • the LEB4 signal peptide the gene to be expressed and 5 an ER retention signal.
  • An expression cassette is produced by fusing a suitable promoter with a suitable transketolase DNA sequence and preferably one between promoter and transketo
  • Sequences which targeting in the apoplasts, in plastids, in the vacuole, in the mitochondrium, in the endoplasmic reticulum (ER) or due to a lack are particularly preferred.
  • Expression cassettes can also be used, the DNA sequence of which codes for a transketolase fusion protein, part of the fusion protein being a transit peptide which translates the
  • Transit peptides are preferred for the chloroplasts, which are cleaved enzymatically from the transketolase part after translocation of the transketolase gene into the chloroplasts.
  • the transit peptide which is derived from the plastid transketolase or a
  • this transit peptide e.g. the transit peptide of the Rubisco small subunit or the ferredoxin NADP oxidoreductase.
  • DNA sequences of three cassettes of the plastid transit peptide of potato plastid transketolase in three reading frames are particularly preferred as Kpnl / BamHI fragments with an ATG codon in the Ncol interface:
  • the inserted nucleotide sequence coding for a transketolase can be produced synthetically or obtained naturally or contain a mixture of synthetic and natural DNA components, as well as consist of different heterologous transketolase gene sections of different organisms.
  • synthetic nucleotide sequences with codons are generated which are preferred by plants. These codons preferred by plants can be determined from codons with the highest protein frequency, which are expressed in most interesting plant species.
  • various DNA fragments can be manipulated in order to obtain a nucleotide sequence which expediently reads in the correct direction and which is equipped with a correct reading frame.
  • adapters or linkers can be attached to the fragments.
  • the promoter and terminator regions can expediently be provided in the transcription direction with a linker or polylinker which contains one or more restriction sites for the insertion of this sequence.
  • the linker has 1 to 10, mostly 1 to 8, preferably 2 to 6 restriction put.
  • the linker has a size of less than 100 bp, often less than 60 bp, but at least 5 bp within the regulatory ranges.
  • the promoter can be native or homologous as well as foreign or heterologous to the host plant.
  • the expression cassette contains in the 5 '-3' transcription direction the promoter, a DNA sequence which codes for a transketolase gene and a region for the transcriptional termination. Different termination areas are interchangeable.
  • Preferred polyadenylation signals are plant polyadenylation signals, preferably those which essentially correspond to T-DNA polyadenylation signals from Agrobacterium tumefaciens, in particular gene 3 of T-DNA (octopine synthase) of the Ti plasmid pTiACH5 (Gielen et al., EMBO J. 3 (1984), 835 ff) or functional equivalents.
  • An expression cassette can contain, for example, a constitutive promoter (preferably the CaMV 35 S promoter), the LeB4 signal peptide, the gene to be expressed and the ER retention signal.
  • a constitutive promoter preferably the CaMV 35 S promoter
  • the amino acid sequence KDEL lysine, aspartic acid
  • Glutamic acid, leucine are used.
  • the fused expression cassette which codes for a transketolase gene is preferably cloned into a vector, for example pBin19, which is suitable for transforming Agrobacterium tumefaciens.
  • Agrobacteria transformed with such a vector can then be used in a known manner to transform Plants, in particular cultivated plants, such as tobacco plants, can be used, for example, by bathing wounded leaves or leaf pieces in an agrobacterial solution and then cultivating them in suitable media.
  • the transformation of plants by agrobacteria is known, inter alia, from FF White, Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; in Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, edited by SD Kung and R. Wu, Academic Press, 1993, pp. 15-38.
  • Transgenic plants can be regenerated in a known manner from the transformed cells of the wounded leaves or leaf pieces which contain a gene integrated into the expression cassette for the expression of a transketolase gene.
  • an expression cassette is inserted as an insert into a recombinant vector, the vector DNA of which contains additional functional regulation signals, for example sequences for replication or integration.
  • additional functional regulation signals for example sequences for replication or integration.
  • Suitable vectors are inter alia in "Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology" (CRC Press), Chap. 6/7, pp. 71-119 (1993).
  • the expression cassettes can be cloned into suitable vectors which enable their multiplication, for example in E. coli.
  • suitable cloning vectors include pBR332, pUC series, Ml3mp series and pACYC184.
  • Binary vectors which can replicate both in E. coli and in agrobacteria are particularly suitable.
  • Another object of the invention relates to the use of an expression cassette containing DNA sequences SEQ-ID No. 1 or hybridizing with these DNA sequences for transforming plants, cells, tissues or parts of plants.
  • the aim of the use is preferably to increase the content of tocopherols, vitamin K, lignins, chlorophylls and / or the aromatic amino acids of the plant.
  • the expression can take place specifically in the leaves, in the seeds or in other parts of the plant.
  • Such transgenic plants, their reproductive material and their plant cells, tissue or parts are a further subject of the present invention.
  • the expression cassette can also be used to transform bacteria, cyanobacteria, yeast, filamentous fungi and algae with the aim of increasing the content of tocophero- len, vitamin K, lignin, chlorophyll and / or aromatic amino acids are used.
  • transformation The transfer of foreign genes into the genome of a plant is called transformation.
  • the methods described for the transformation and regeneration of plants from plant tissues or plant cells for transient or stable transformation are used. Suitable methods are protoplast transformation by polyethylene glycol-induced DNA uptake, the biolistic method with the gene cannon - the so-called particle bombardment method, electroporation, the incubation of dry embryos in DNA-containing solution, microinjection and the gene transfer mediated by Agrobacterium.
  • the methods mentioned are described, for example, in B. Jenes et al. , Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, edited by S.D. Kung and R. Wu, Academic Press (1993), 128-143 and in Potrykus, Annu. Rev.
  • the construct to be expressed is preferably cloned into a vector which is suitable for transforming Agrobacterium tumefaciens, for example pBin19 (Bevan et al., Nucl. Acids Res. 12 (1984), 8711).
  • Agrobacteria transformed with an expression cassette can also be used in a known manner to transform plants, in particular crop plants, such as cereals, maize, oats, soybeans, rice, cotton, sugar beet, canola, sunflower, flax, hemp, potatoes, tobacco, tomatoes, rape, Alfalfa, lettuce and the various tree, nut and wine species can be used, e.g. by bathing wounded leaves or leaf pieces in an agrobacterial solution and then cultivating them in suitable media.
  • crop plants such as cereals, maize, oats, soybeans, rice, cotton, sugar beet, canola, sunflower, flax, hemp, potatoes, tobacco, tomatoes, rape, Alfalfa, lettuce and the various tree, nut and wine species can be used, e.g. by bathing wounded leaves or leaf pieces in an agrobacterial solution and then cultivating them in suitable media.
  • Functionally equivalent sequences which code for a transketolase gene are those sequences which, despite a different nucleotide sequence, still have the desired functions. Functional equivalents thus include naturally occurring variants of the sequences described herein as well as artificial, e.g. Artificial nucleotide sequences obtained by chemical synthesis and adapted to the codon use of a plant.
  • a functional equivalent is also understood to mean, in particular, natural or artificial mutations of an originally isolated sequence coding for a transketolase, which furthermore show the desired function. Mutations include substitutions, additions, deletions, exchanges or insertions of one or more nucleotide residues.
  • nucleotide sequences are also present Includes invention, which is obtained by modification of the transketolase nucleotide sequence. The aim of such a modification can, for example, be to further narrow down the coding sequence contained therein or, for example, also to insert further restriction enzyme interfaces.
  • Functional equivalents are also those variants whose function is weakened or enhanced compared to the original gene or gene fragment.
  • artificial DNA sequences are suitable, as long as, as described above, they impart the desired property, for example to increase the tocopherol content in the plant by overexpressing the transketolase gene in crop plants.
  • Such artificial DNA sequences can be determined, for example, by back-translation of proteins constructed using molecular modeling, which have transketolase activity, or by in vitro selection. Coding DNA sequences which are obtained by back-translating a polypeptide sequence according to the codon usage specific for the host plant are particularly suitable. The specific codon usage can easily be determined by a person skilled in plant genetic methods by computer evaluations of other, known genes of the plant to be transformed.
  • constitutive expression of the exogenous transketolase gene is advantageous.
  • inducible expression may also appear desirable.
  • the effectiveness of the expression of the transgenically expressed transketolase gene can be determined, for example, in vitro by increasing the number of shoots.
  • a change in the type and level of expression of the transketolase gene and its effect on the tocopherol biosynthesis performance on test plants can be tested in greenhouse experiments.
  • the invention also relates to transgenic plants transformed with an expression cassette containing the sequence SEQ-ID No. 1 or hybridizing with these DNA sequences, as well as transgenic cells, tissues, parts and propagation material of such plants.
  • Transgenic crop plants such as e.g. Barley, wheat, rye, corn, oats, soy, rice, cotton, sugar beet, canola, sunflower, flax, hemp, potato, tobacco, tomato, rape, alfalfa, lettuce and the various tree, nut and wine species.
  • Plants in the sense of the invention are mono- and dicotyledonous plants or algae.
  • transketolase SEQ-ID NO. 1 By overexpressing the gene sequence coding for a transketolase SEQ-ID NO. 1 In principle, increased resistance to transketolase inhibitors can be achieved in a plant.
  • the transgenic plants produced in this way are also the subject of the invention.
  • Cloning methods such as Restriction cleavage, agarose gel electrophoresis, purification of DNA fragments, transfer of nucleic acids to nitrocellulose and nylon membranes, linking of DNA fragments, transformation of E. coli
  • the bacterial strains used below (E. coli, XL-I Blue) were obtained from Stratagene.
  • the Agrobacterium strain used for plant transformation (Agrobacterium tumefaciens, C58C1 with the plasmid pGV2260 or pGV3850kan) was developed by Deblaere et al. in nucl. Acids Res. 13 (1985), 4777. Alternatively, you can also use the Agrobacterium strain
  • LBA4404 (Clontech) or other suitable strains can be used.
  • the vectors pUC19 (Yanish-Peron, Gene 33 (1985), 103-119) pBluescript SK- (Stratagene), pGEM-T (Promega), pZerO (Invitrogen), pBinl9 (Bevan et al., Nucl Acids Res. 12 (1984), 8711-8720) and pBinAR (Höfgen and Willmitzer, Plant Science 66 (1990), 221-230).
  • RNA from tobacco leaves was developed according to one of Logemann et al. (Anal. Biochem. (1987) 163,21).
  • the poly (A) RNA was then purified using 01igo (dT) cellulose type 7 (Pharmacia, Freiburg) according to the manufacturer's instructions. After the photometric concentration had been determined, 5 ⁇ g of the RNA thus obtained were used for the cDNA synthesis. All chemicals and enzymes required for the production of the cDNA were obtained from Stratagene (La Jolla CA 92037, USA). The methods used were carried out according to the manufacturer's instructions. The synthesis of the first and second strand of the cDNA was carried out using the ZAP-cDNA synthesis kit.
  • DNA fragments were used as hybridization probes, which were radioactively labeled with the aid of a “Multiprime DNA labeling System” (Amersham Buchler) in the presence of a- 32 P-dCTP (specific activity 3000 Ci / mmol) according to the manufacturer's instructions.
  • the membrane was hybridized after prehybridization at 42 ° C. in PEG buffer (Amasino (1986) Anal. Biochem. 152, 304-307) for 12-16 hours. The filters were then washed 3 ⁇ 20 minutes in 2 ⁇ SSC, 0.1% SDS at 42 ° C. Positive hybridizing phages were visualized by autoradiography and purified by standard techniques. 4. Analysis of total RNA from plant tissues
  • RNA from plant tissues was, as in Logemann et al. (Anal. Biochem. (1987) 163,21). For the analysis, 20-40 ⁇ g R ⁇ A were separated in a 1.5% agarose gel containing formaldehyde. After electrophoretic separation of the RNA molecules, the RNA was transferred to a nylon membrane using capillary transfer. The detection of specific transcripts was carried out as described in Amasino (Anal. Biochem. (1986) 152, 304). The cDNA fragments used as a probe were radioactively labeled with a random primed DNA labeling kit (Boehringer, Mannheim).
  • the sequencing of recombinant DNA molecules was carried out with a laser fluorescence DNA sequencer from Licor (sales by MWG Biotech, Ebersbach) according to the method of Sanger (Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74 (1977 ), 5463 - 5467).
  • a clone coding for transketolase was selected from a leaf-specific cDNA library from tobacco (variety Samsun NN).
  • the DNA sequence is in SEQ-ID No. 3 (Accession No. A 52295).
  • the 2629 base pair long cDNA clone 21 contains an open reading frame of 2229 bases and codes for a protein with 743 amino acids.
  • Analysis of the polypeptide using the sequence program PC / genes (submenu TRANSPEP) showed that a chloroplastidic transit peptide of presumably 77 amino acids is present at the N-terminus of the protein, see also EP-A 0 723 017.
  • a 1300 base pair fragment (1329-2611) of this clone was cloned in antisense orientation into a binary vector pBinl9AR under the control of the 35S promoter.
  • This construct was transformed into tobacco by Agrobacterium-mediated transformation. Regenerated plants were made for plastid transketolase mRNA quantities examined. Plants with reduced transketolase activity were self-treated and the seeds obtained were harvested. For further analysis of the plants, seeds from the Fl generation of the following lines were used: TK 7 and TK 8. The 5 data described below were obtained by analyzing these lines.
  • Figure 7 shows plastid transketolase activities of individual plants of the lines TK 7 and TK 8. The determinations are made on the basis of RNA and protein measurements. The activities are based on% WT (WT activity is 100%
  • the transketolase activity was determined in a coupled enzymatic in vitro test from raw plant extracts. The detailed experimental procedure has been published by Haake (Haake et al, 1998, The Plant Journal 14:
  • Enzyme extraction buffer 100 mM Hepes pH 7.7, 10 mM MgCl 2 , 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 2 mM aminocapronate, 0.5 mM PMSF, 10% glycerol, 0.01% Triton X-100, 5 mM DTT, Extraction: 1:20 (w / v).
  • SH7P sedoheptulose-7-P
  • GA3P glyceraldehyde-3-P
  • DHAP di-hydroxyacetone-P
  • G3P glycerol-3-P
  • TPI triose-P-isomerase
  • GDH glyceraldehyde-3-P-dehydrogenase
  • the primers were selected so that they contained interfaces which enabled directional sense cloning of the fragment into the overexpression vector TK-Tp-BinAR-9. It is derived from the binary expression vector pBinAR (Höfgen and Willmitzer, 1990, Plant Sciences 66, pp. 221-230) and allows the translation fusion of any protein with the transit peptide of plastidic transketolase (TK-Tp) from tobacco for the directing of heterologous proteins in the chloroplasts under the control of the 35S CaMV promoter (35S).
  • the polyadenylation signal of gene 3 of the T-DNA of the Ti plasmid pTiACH 5 (OCS) serves as a terminator (Gielen et al., 1984, EMBO J. 3, 835-846).
  • Plants with an overexpression of the transketolase were first selected by determining the transketolase activity, followed by an examination for an increased amount of transketolase mRNA and protein.
  • Extraction buffer 80% ethanol, 10 mM Hepes pH 7.0, 1 mM ascorbate
  • BAP benzylaminopurine
  • NAA 0.2 mg / l naphthylacetic acid
  • transgenic rapeseed plants which have an altered prenyl lipid content, was based on a protocol by Bade, J.B. and Damm, B. (in Gene Transfer to Plants, Polypus, I. and Spangenberg, G., eds, Springer Lab Manual, Springer Verlag, 1995, 30-38), in which the compositions of the media and buffers used are specified.
  • 600 explants obtained in this way are washed with 50 ml of basal medium for 30 min and transferred to a 300 ml flask. After adding 100 ml of callus induction medium, the cultures were incubated for 24 h at 100 rpm.
  • the callus induction medium was removed from the oilseed rape explants using sterile pipettes, 50 ml of Agrobacterium solution were added, mixed gently and incubated for 20 min. The Agrobacteria suspension was removed, the oilseed rape explant washed with 50 ml callus induction medium for 1 min and then 100 ml callus induction medium added. The co-cultivation was carried out on a rotary shaker at 100 rpm for 24 h. The co-cultivation was stopped by removing the callus induction medium and the explants were washed twice for 1 min with 25 ml and twice for 60 min with 100 ml washing medium at 100 rpm. The washing medium with the explants was transferred to 15 cm petri dishes and the medium was removed with sterile pipettes.
  • the yeast transketolase was overexpressed in tobacco as described in Example 4.

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Abstract

Verfahren zur Herstellung von Pflanzen mit erhöhtem Gehalt an Tocopherolen, Vitamin K, Chlorophyllen, Ligninen und/oder aromatischen Aminosäuren durch Überexpression eines Transketolase Gens.

Description

Überexpression einer DNA-Sequenz codierend für eine Transketolase in Pflanzen
Beschreibung
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von DNA-Sequenzen codierend für eine Transketolase zur Herstellung von Pflanzen mit erhöhtem Gehalt an Tocopherolen, Vitamin K, Chlorophyllen, aromatischen Aminosäuren und/oder Lignin, speziell die Verwendung von DNA-Sequenzen SEQ-ID No. 1 oder mit dieser hybridisierenden DNA-Sequenzen, einem Verfahren zur Herstellung von Pflanzen mit erhöhtem Gehalt an Tocopherolen, Vitamin K, Chlorophyllen, aromatischen Aminosäuren und/oder Lignin, sowie die derart herge- stellte Pflanze selbst.
Ein wichtiges Ziel pflanzenmolekulargenetischer Arbeiten ist bisher die Erzeugung von Pflanzen mit erhöhtem Gehalt an Zuckern, Enzymen und Aminosäuren. Wirtschaf lich interessant ist jedoch auch die Entwicklung von Pflanzen mit erhöhtem Gehalt an Vitaminen, wie z.B. der Erhöhung des Tocopherol-Gehaltes.
Die in der Natur vorkommenden acht Verbindungen mit Vitamin E-Aktivität sind Derivate des 6-Chromanols (Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, Vol. A 27 (1996), VCH Verlagsgesellschaft, Chapter 4., 478-488, Vitamin E) . Die erste Gruppe (la-d) stammt von Tocopherol ab, die zweite Gruppe besteht aus Derivaten des Tocotrienols (2a- d) :
Figure imgf000003_0001
la , α-Tocopherol : R1 = R2 = R3 = CH3 lb , ß-Tocopherol [ 148-03-8] : R1 = R3 = CH3 , R2 = H lc , γ-Tocopherol [ 54-28-4 ] : R1 = H, R2 = R3 = CH3 ld, δ-Tocopherol [ 119-13-1 ] : Rl = R2 = H , R3 = CH3
Figure imgf000004_0001
2a, α-Tocotrienol [1721-51-3]: R1 = R2 = R3 = CH3
2b, ß-Tocotrienol [490-23-3]: R1 = R3 = CH3, R2 = H 2c, γ-Tocotrienol [14101-61-2]: R1 = H, R2 = R3 = CH3
2d, δ-Tocotrienol [25612-59-3]: R1 = R2 = H, R3 = CH3
Wirtschaftlich große Bedeutung besitzt α-Tocopherol .
Der Entwicklung von Kulturpflanzen mit erhöhtem Gehalt an Tocopherolen, Vitamin K, Chlorophyllen, aromatischen Aminosäuren und/ oder Lignin durch Gewebekultur oder Samenmutagenese und natürliche Auswahl sind Grenzen gesetzt. So muß einerseits beispielsweise der Tocopherol-Gehalt bzw. der Gehalt des gewünschten StoffWechselendproduktes bereits in Gewebekultur erfaßbar sein und andererseits können nur diejenigen Pflanzen über Gewebekulturtechniken manipuliert werden, deren Regeneration zu ganzen Pflanzen aus Zellkulturen gelingt. Außerdem können Kulturpflanzen nach Mutagenese und Selektion unerwünschte Eigenschaften zeigen, die durch teilweise mehrmalige Rückkreuzungen wieder beseitigt werden müssen. Auch wäre beispielsweise die Erhöhung des Tocophe- rol-Gehaltes durch Kreuzung auf Pflanzen der selben Art beschränkt .
Aus diesen Gründen ist das gentechnische Vorgehen, beispielsweise die für die Tocopherol Syntheseleistung kodierenden, essentiellen Biosynthesegene zu isolieren und in Kulturpflanzen gezielt zu übertragen, dem klassischen Züchtungsverfahren überlegen. Dieses Verfahren setzt voraus, daß die Biosynthese und deren Regulation bekannt ist und daß Gene, die die Biosyntheseleistung beeinflussen, identifiziert werden.
Isoprenoide oder Terpenoide bestehen aus verschiedenen Klassen lipidlöslicher Moleküle und werden teilweise oder vollständig aus C5-Isopren-Einheiten gebildet. Reine Prenyllipide (z.B. Caroti- noide) bestehen aus C-Gerüsten, die ausschließlich auf Isopren- Einheiten zurückgehen, während gemischte Prenyllipide (z.B. Chlo- rophylle, Tocopherole und Vitamin K) eine Isoprenoid-Seitenkette besitzen, die mit einem aromatischen Kern verbunden ist. Bei den Ringstrukturen der gemischten Prenyllipide, die zur Bildung der Vitamine E und K führen, handelt es sich um Quinone, deren Ausgangsmetabolite aus dem Shikimat-Weg stammen. Die aromatischen Aminosäuren Phenylalanin bzw. Tyrosin werden in Hydroxy- phenyl-Pyruvat umgewandelt, welches durch Dioxygenierung in Homo- gentisinsäure überführt wird. Das Chorismat wird einerseits über Erythrose-4-Phosphat, 3 -Dehydrochinat, 3 '-Dehydroshikimat, Shi- kimat, Shikimat-3-Phosphat und 5 '-Enolpyruvylshikimat-3-Phosphat gebildet (Abb. 1). Die Bereitstellung von Erythrose-4-Phosphat erfolgt durch die enzymatische Aktivität der plastidaren Transketolase. Dabei werden Fruktose-6-Phosphat und Glycerinalde- hyd-3-Phosphat zu Xylulose-5-Phosphat und Erythrose-4-Phosphat umgesetzt. Die oben beschriebene Homogentisinsäure wird anschließend an PPP gebunden, um den Vorläufer von α-Tocopherol und α-To- coquinon, das 2-Methyl-6-phytylquinol, zu bilden. Durch Methylie- rungsschritte mit S-Adenosylmethionin als Methyl-Gruppen-Donor entsteht zunächst 2 , 3-Dimethyl-6-phytylquinol, dann durch Zykli- sierung γ-Tocopherol und durch nochmalige Methylierung α-Tocophe- rol (Richter, Biochemie der Pflanzen, Georg Thieme Verlag Stutt- gart, 1996) .
In der Literatur finden sich Beispiele die zeigen, daß die Manipulation eines Enzyms den Metabolit-Fluß direktional beeinflußen kann. In Experimenten mit einer veränderten Expression der Phy- toen Synthase, welche zwei GGPP-Moleküle zu 15-cis-Phytoen miteinander verknüpft, konnte ein direkter Einfluß auf die Caroti- noid-Mengen dieser transgenen Tomatenpflanzen gemessen werden (Fray und Grierson, Plant Mol. Biol .22 (4) , 589-602 (1993 ) ; Fray et al., Plant J. , 8, 693-701(1995)). Wie zu erwarten, zeigen trans- gene Tabakpflanzen mit verringerten Mengen an Phenylalanin-Ammo- nium Lyase reduzierte Phenylpropanoid-Mengen. Das Enzym Phenylalanin-Ammonium Lyase katalysiert den Abbau von Phenylalanin, entzieht es also der Phenylpropanoid-Biosynthese (Bäte et al.,Proc. Natl. Acad. Sei USA 91 (16): 7608-7612 (1994); Howles et al . , Plant Physiol. 112. 1617-1624 (1996)).
Über die Erhöhung des Metabolitflusses zur Steigerung des Toco- pherol-Gehaltes in Pflanzen durch Überexpression einzelner Biosynthesegene ist bisher wenig bekannt. Lediglich WO 97/27285 be- schreibt eine Modifikation des Tocopherol-Gehaltes durch verstärkte Expression bzw. durch Herunterregulation des Enzyms p-Hy- droxyphenylpyruvatdioxygenase (HPPD) .
Aufgabe der vorliegenden Erfindung war die Entwicklung einer transgenen Pflanze mit erhöhtem Gehalt an Tocopherolen, Vitamin K, aromatischen Aminosäuren, Chlorophyllen und/oder Lignin. Die Aufgabe wurden überraschenderweise gelöst durch die Überexpression eines Transketolase-Gens in den Pflanzen.
Um beispielsweise den Metabolit-Fluß aus dem Primärstoffwechsel 5 in die Tocopherol-Biosynthese zu verstärken, wurde die Bildung von Chorismat als essentiellem AusgangsSubstrat für alle plastidaren Isoprenoide erhöht. Zu diesem Zweck wurde in transgenen Pflanzen die Aktivität der plastidaren Transketolase durch Überexpression des Transketolasegens aus Hefe erhöht. Dies kann prin- 10 zipiell auch durch Expression homologer oder heterologer Transke- tolasegene erreicht werden.
Gene, die für Transketolase kodieren, wurden bisher aus Saccharo- myces cerevisiae (Flechter et al., Biochemistry 31, 1892-1896,
15 1993; Sundström et al., J. Biol. Chem. 268,24346-24352, 1993; Schaff-Gerstenschläger et al., Eur. J. Biochem. 217, 487-492, 1993), aus Hansenula polymorpha (Janowicz et al . , Nucl . Acids Res. 13, 3043-3062, 1985), menschlichen Erythrozyten (Abedinia et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 183, 1159-1166, 1992; McCool
20 et al., J. Biol. Chem. 268, 1397-1404, 1993), Rhodobacter sphae- roides (Chen et al . , J. Biol. Chem. 266, 20447-20452, 1992), Escherichia coli (Sprenger, Biochem. Biophys. Acta 1216, 307-310, 1992; Tida et al . , J. Bacteriol. 175, 5375-5383, 1993), sowie aus Tabak (EP-A 0723017) isoliert und beschrieben.
25
In einem Ausführungsbeispiel wird das Transketolase-Gen (SEQ-ID No. 1, Accesion Nr. M 63302) aus Hefe (Saccharomyces cerevisiae) in transgenen Pflanzen verstärkt exprimiert. Um eine Plastidenlo- kalisation zu gewährleisten wird dem Strukturgen der Hefe Trans-
30 ketolase eine Transitsignalsequenz vorangestellt. Auch geeignet als Expressionskassette ist eine DNA-Sequenz, die für ein Transketolase-Gen codiert, das mit SEQ-ID No. 1 hybridisiert und das aus anderen Organismen bzw. aus anderen Pflanzen stammt.
35 Das durch die zusätzliche Expression des Transketolasegens nun vermehrt zur Verfügung stehende Erythrose-4-Phosphat wird weiter über Chorismat und Prephenat in Richtung Tocopherole, Vitamin K, Lignine, Chlorophylle und aromatische Aminosäuren umgesetzt.
40 Die Herstellung der transgenen Pflanzen erfolgt durch Transformation der Pflanzen mit einem das Transketolase-Gen enthaltenden Konstrukt. Als Modellpflanzen für die Produktion von Tocopherolen, Vitamin K, Ligninen, Chlorophyllen und aromatischen Aminosäuren wurden Tabak und Raps eingesetzt. Antisensekonstrukte sowie homologe bzw. heterologe pflanzliche Transketolasegene wurden unabhängig voneinander in Pflanzen transformiert. Messungen an Transketolase-Antisensepflanzen ergaben bezüglich des Gehaltes an aromatischen Aminosäuren, des Chlo- rophyll-, des Lignin- und des Tocopherolgehaltes eine drastische Abnahme, siehe Abbildungen 2 bis 7. Dies belegt den direkten Einfluß der plastidaren pflanzlichen Transketolase auf die Synthese von aromatischen Aminosäuren, Chlorophyllen, Ligninen und Tocopherolen.
Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung der DNA-Sequenz SEQ-ID No. 1 aus Hefe, die für eine Transketolase oder deren funktioneile Äquivalente kodieren, zur Herstellung einer Pflanze mit erhöhtem Gehalt an Tocopherolen, Vitamin K, Chlorophyllen, Ligninen und/oder aromatischen Aminosäuren. Die Nukleinsäurese- quenz kann dabei z.B. eine DNA- oder cDNA-Sequenz sein. Zur In- sertion in eine Expressionskassette geeignete kodierende Sequenzen sind beispielsweise solche, die für eine Transketolase kodieren und die dem Wirt die Fähigkeit zur Überproduktion von Toco- pherolen, Vitamin K, Chlorophyllen und/oder aromatischen Aminosäuren verleihen.
Die Expressionskassetten beinhalten außerdem regulative Nuklein- säuresequenzen, welche die Expression der kodierenden Sequenz in der Wirtszelle steuern. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform umfaßt eine Expressionskassette stromaufwärts, d.h. am 5 '-Ende der kodierenden Sequenz, einen Promotor und stromabwärts, d.h. am 3 '-Ende, ein Polyadenylierungssignal und gegebenenfalls weitere regulatorische Elemente, welche mit der dazwischenliegenden ko- dierenden Sequenz für das Transketolase-Gen operativ verknüpft sind. Unter einer operativen Verknüpfung versteht man die sequen- zielle Anordnung von Promotor, kodierender Sequenz, Terminator und ggf. weiterer regulativer Elemente derart, daß jedes der regulativen Elemente seine Funktion bei der Expression der kodie- renden Sequenz bestimmungsgemäß erfüllen kann. Die zur operativen Verknüpfung bevorzugten aber nicht darauf beschränkten Sequenzen sind Targeting-Sequenzen zur Gewährleistung der subzellulären Lokalisation im Apoplasten, in der Vakuole, in Piastiden, im Mito- chondrium, im Endoplasmatischen Retikulum (ER), im Zellkern, in Olkorperchen oder anderen Kompartimenten und Translationsverstärker wie die 5 '-Führungssequenz aus dem Tabak-Mosaik-Virus (Gallie et al., Nucl. Acids Res. 15 (1987), 8693 -8711).
Beispielhaft kann die pflanzliche Expressionskassette in den Ta- bak-Transformationsvektor pBinAR-Hyg eingebaut werden. Abb. 8 zeigt die Tabaktransformationsvektoren pBinAR-Hyg mit 35S-Promo- tor (A) bzw. pBinAR-Hyg mit samenspezifischem Promotor Phaseolin 796 (B) :
HPT: Hygromycin-Phosphotransferase 5 - OCS: Octopin-Synthase-Terminator PNOS : Nopalin-Synthase-Promotor außerdem sind solche Restriktionsschnittstellen eingezeichnet, die nur einmal den Vektor schneiden.
10 Als Promotoren der Expressionskassette ist grundsätzlich jeder Promotor geeignet, der die Expression von Fremdgenen in Pflanzen steuern kann. Vorzugsweise verwendet man insbesondere einen pflanzlichen Promotor oder einen Promotor, der einem Pflanzenvirus entstammt. Insbesondere bevorzugt ist der CaMV 35S-Promotor
15 aus dem Blumenkohl-Mosaik-Virus (Franck et al., Cell 21 (1980), 285 - 294). Dieser Promotor enthält bekanntlich unterschiedliche ErkennungsSequenzen für transkriptionale Effektoren, die in ihrer Gesamtheit zu einer permanenten und konstitutiven Expression des eingeführten Gens führen (Benfey et al . , EMBO J. 8 (1989),
20 2195-2202) .
Die Expressionskassette kann auch einen chemisch induzierbaren Promotor enthalten, durch den die Expression des exogenen Trans- ketolase-Gens in der Pflanze zu einem bestimmten Zeitpunkt ge-
25 steuert werden kann. Derartige Promotoren wie z.B. der PRPl-Pro- motor (Ward et al., Plant. Mol. Biol. 22 (1993), 361-366), ein durch Salizylsäure induzierbarer Promotor (WO 95/19443), ein durch Benzenesulfonamid-induzierbarer (EP-A 388186) , ein durch Tetrazyklin-induzierbarer (Gatz et al . , (1992) Plant J. 2,
30 397-404), ein durch Abscisinsäure-induzierbarer (EP-A 335528) bzw. ein durch Ethanol- oder Cyclohexanon-induzierbarer (WO 93/21334) Promotor können u.a. verwendet werden.
Weiterhin sind insbesonders solche Promotoren bevorzugt, die die 35 Expression in Geweben oder Pflanzenteilen sicherstellen, in denen beispielsweise die Biosynthese von Tocopherol bzw. dessen Vorstufen stattfindet. Insbesondere zu nennen sind Promotoren, die eine blattspezifische Expression gewährleisten. Zu nennen sind der Promotor der cytosolischen FBPase aus Kartoffel oder der ST-LSI 40 Promotor aus Kartoffel (Stockhaus et al., EMBO J. 8 (1989), 2445 - 245) .
Mit Hilfe eines samenspezifischen Promotors konnte ein Fremdprotein stabil bis zu einem Anteil von 0,67 % des gesamten löslichen 45 Samenproteins in den Samen transgener Tabakpflanzen exprimiert werden (Fiedler und Conrad, Bio/Technology 10 (1995), 1090-1094). Die Expressionskassette kann daher beispielsweise einen samenspe- zifischen Promotor (bevorzugt den Phaseolin-Promotor (US 5504200), den USP- (Baumlein, H. et al . , Mol. Gen. Genet. (1991) 225 (3), 459 - 467) oder LEB4-Promotor (Fiedler und Conrad, 1995)), das LEB4-Signalpeptid, das zu exprimierende Gen und 5 ein ER-Retentionssignal enthalten.
Die Herstellung einer Expressionskassette erfolgt durch Fusion eines geeigneten Promotors mit einer geeigneten Transketolase-DNA Sequenz und vorzugsweise einer zwischen Promotor und Transketo-
10 lase-DNA-Sequenz inserierten DNA, die für ein chloroplastenspezi- fisches Transitpeptid kodiert, sowie einem Polyadenylierungssi- gnal nach gängigen Rekombinations- und Klonierungstechniken, wie sie beispielsweise in T. Maniatis, E.F. Fritsch und J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Labo-
15 ratory, Cold Spring Harbor, NY (1989) sowie in T.J. Silhavy, M.L. Berman und L.W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984) und in Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley-Interscience (1987) beschrie-
20 ben sind.
Insbesondere bevorzugt sind Sequenzen, die ein Targeting in den Apoplasten, in Piastiden, in die Vakuole, in das Mitochondrium, in das Endoplasmatische Retikulum (ER) oder durch ein Fehlen ent-
25 sprechender operativer Sequenzen einen Verbleib im Kompartiment des Entstehens, dem Zytosol, gewährleisten (Kermode, Crit. Rev. Plant Sei. 15, 4 (1996), 285-423). Für die Menge der Proteinakkumulation in transgenen Pflanzen besonders förderlich erwiesen hat sich eine Lokalisation im ER (Schouten et al . , Plant Mol. Biol.
30 30 (1996) , 781-792) .
Es können auch Expressionskassetten verwendet werden, deren DNA- Sequenz für ein Transketolase-Fusionsprotein kodiert, wobei ein Teil des Fusionsproteins ein Transitpeptid ist, das die Translo-
35 kation des Polypeptides steuert. Bevorzugt sind für die Chloro- plasten spezifische Transitpeptide, welche nach Translokation des Transketolase-Gens in die Chloroplasten vom Transketolase-Teil enzymatisch abgespalten werden. Insbesondere bevorzugt ist das Transitpeptid, das von der plastidaren Transketolase oder einem
40 funktionellen Äquivalent dieses Transitpeptids (z.B. dem Transitpeptid der kleinen Untereinheit der Rubisco oder der Ferredoxin NADP Oxidoreduktase) abgeleitet ist.
45 Besonders bevorzugt sind DNA-Sequenzen von drei Kassetten des Plastiden-Transitpeptids der plastidaren Transketolase aus Kartoffel in drei Leserastern als Kpnl/BamHI Fragmente mit einem ATG-Codon in der Ncol Schnittstelle:
pTP09
KpnI_GGTACCATGGCGTCTTCTTCTTCTCTCACTCTCTCTCAAGCTATCCTCTCTCGTTCTGTC CCTCGCCATGGCTCTGCCTCTTCTTCTCAACTTTCCCCTTCTTCTCTCACTTTTTCCGGCCTTAA ATCCAATCCCAATATCACCACCTCCCGCCGCCGTACTCCTTCCTCCGCCGCCGCCGCCGCCGTCG TAAGGTCACCGGCGATTCGTGCCTCAGCTGCAACCGAAACCATAGAGAAAACTGAGACTGCGGGA TCC_BamHI
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KpnI_GGTACCATGGCGTCTTCTTCTTCTCTCACTCTCTCTCAAGCTATCCTCTCTCGTTCTGTC CCTCGCCATGGCTCTGCCTCTTCTTCTCAACTTTCCCCTTCTTCTCTCACTTTTTCCGGCCTTAA ATCCAATCCCAATATCACCACCTCCCGCCGCCGTACTCCTTCCTCCGCCGCCGCCGCCGCCGTCG TAAGGTCACCGGCGATTCGTGCCTCAGCTGCAACCGAAACCATAGAGAAAACTGAGACTGCGCTG GATCC_BamHI
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Die inserierte Nukleotid-Sequenz kodierend für eine Transketolase kann synthetisch hergestellt oder natürlich gewonnen sein oder eine Mischung aus synthetischen und natürlichen DNA-Bestandteilen enthalten, sowie aus verschiedenen heterologen Transketolase-Ge- nabschnitten verschiedener Organismen bestehen. Im allgemeinen werden synthetische Nukleotid-Sequenzen mit Kodons erzeugt, die von Pflanzen bevorzugt werden. Diese von Pflanzen bevorzugten Kodons können aus Kodons mit der höchsten Proteinhäufigkeit be- stimmt werden, die in den meisten interessanten Pflanzenspezies exprimiert werden. Bei der Präparation einer Expressionskassette können verschiedene DNA-Fragmente manipuliert werden, um eine Nukleotid-Sequenz zu erhalten, die zweckmäßigerweise in der korrekten Richtung liest und die mit einem korrekten Leseraster ausge- stattet ist. Für die Verbindung der DNA-Fragmente miteinander können an die Fragmente Adaptoren oder Linker angesetzt werden.
Zweckmäßigerweise können die Promotor- und die Terminator-Regionen in Transkriptionsrichtung mit einem Linker oder Polylinker, der eine oder mehrere Restriktionsstellen für die Insertion dieser Sequenz enthält, versehen werden. In der Regel hat der Linker 1 bis 10, meistens 1 bis 8, vorzugsweise 2 bis 6 Restriktions- stellen. Im allgemeinen hat der Linker innerhalb der regulatorischen Bereiche eine Größe von weniger als 100 bp, häufig weniger als 60 bp, mindestens jedoch 5 bp. Der Promotor kann sowohl nativ bzw. homolog als auch fremdartig bzw. heterolog zur Wirtspflanze sein. Die Expressionskassette beinhaltet in der 5 '-3 '-Transkriptionsrichtung den Promotor, eine DNA-Sequenz die für ein Transketolase-Gen codiert und eine Region für die transkriptionale Ter- mination. Verschiedene Terminationsbereiche sind gegeneinander beliebig austauschbar.
Ferner können Manipulationen, die passende Restriktionsschnittstellen bereitstellen oder die überflüssige DNA oder Restriktionsschnittstellen entfernen, eingesetzt werden. Wo Insertionen, Deletionen oder Substitutionen wie z.B. Transitionen und Trans- Versionen in Frage kommen, können in vitro-Mutagenese, "primerre- pair", Restriktion oder Ligation verwendet werden. Bei geeigneten Manipulationen, wie z.B. Restriktion, "chewing-back" oder Auffüllen von Überhängen für "bluntends", können komplementäre Enden der Fragmente für die Ligation zur Verfügung gestellt werden.
Von Bedeutung für den erfindungsgemäßen Erfolg kann u.a. das Anhängen des spezifischen ER-Retentionssignals SEKDEL sein (Schou- ten, A. et al . , Plant Mol. Biol. 30 (1996), 781 - 792), die durchschnittliche Expressionshöhe wird damit verdreifacht bis vervierfacht. Es können auch andere Retentionssignale, die natürlicherweise bei im ER lokalisierten pflanzlichen und tierischen Proteinen vorkommen, für den Aufbau der Kassette eingesetzt werden.
Bevorzugte Polyadenylierungssignale sind pflanzliche Polyadeny- lierungssignale, vorzugsweise solche, die im wesentlichen T-DNA- Polyadenylierungssignale aus Agrobacterium tumefaciens, insbesondere des Gens 3 der T-DNA (Octopin Synthase) des Ti-Plasmids pTiACH5 entsprechen (Gielen et al . , EMBO J. 3 (1984), 835 ff) oder funktioneile Äquivalente.
Eine Expressionskassette kann beispielsweise einen konstitutiven Promotor (bevorzugt den CaMV 35 S-Promotor) , das LeB4-Signalpep- tid, das zu exprimierende Gen und das ER-Retentionssignal enthal- ten. Als ER-Retentionssignal wird bevorzugt die Aminosäuresequenz KDEL (Lysin, Asparaginsäure, Glutaminsäure, Leucin) verwendet.
Vorzugsweise wird die fusionierte Expressionskassette, die für ein Transketolase-Gen kodiert, in einen Vektor, beispielsweise pBinl9, kloniert, der geeignet ist, Agrobacterium tumefaciens zu transformieren. Mit einem solchen Vektor transformierte Agrobak- terien können dann in bekannter Weise zur Transformation von Pflanzen, insbesondere von Kulturpflanzen, wie z.B. von Tabakpflanzen, verwendet werden, indem beispielsweise verwundete Blätter oder Blattstücke in einer Agrobakterienlösung gebadet und anschließend in geeigneten Medien kultiviert werden. Die Transfor- mation von Pflanzen durch Agrobakterien ist unter anderem bekannt aus F.F. White, Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; in Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, herausgegeben von S.D. Kung und R. Wu, Academic Press, 1993, S. 15 - 38. Aus den transformierten Zellen der verwundeten Blätter bzw. Blattstücke können in bekannter Weise transgene Pflanzen regeneriert werden, die ein in die Expressionskassette integriertes Gen für die Expression eines Transketolase-Gens enthalten.
Zur Transformation einer Wirtspflanze mit einer für eine Transke- tolase kodierenden DNA wird eine Expressionskassette als Insertion in einen rekombinanten Vektor eingebaut, dessen Vektor-DNA zusätzliche funktionelle Regulationssignale, beispielsweise Sequenzen für Replikation oder Integration enthält. Geeignete Vektoren sind unter anderem in "Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology" (CRC Press), Kap. 6/7, S. 71 - 119 (1993) beschrieben.
Unter Verwendung der oben zitierten Rekombinations- und Klonie- rungstechniken können die Expressionskassetten in geeignete Vek- toren kloniert werden, die ihre Vermehrung, beispielsweise in E. coli, ermöglichen. Geeignete Klonierungsvektoren sind u.a. pBR332, pUC-Serien, Ml3mp-Serien und pACYC184. Besonders geeignet sind binäre Vektoren, die sowohl in E. coli als auch in Agrobakterien replizieren können.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft die Verwendung einer Expressionskassette enthaltend DNA-Sequenzen SEQ-ID No. 1 oder mit diesen hybridisierende DNA-Sequenzen zur Transformation von Pflanzen, -zellen, -geweben oder Pflanzenteilen. Vorzugsweise ist Ziel der Verwendung die Erhöhung des Gehaltes an Tocopherolen, Vitamin K, Ligninen, Chlorophyllen und/oder der aromatischen Aminosäuren der Pflanze.
Dabei kann je nach Wahl des Promotors die Expression spezifisch in den Blättern, in den Samen oder anderen Teilen der Pflanze erfolgen. Solche transgenen Pflanzen, deren Vermehrungsgut, sowie deren Pflanzenzellen, -gewebe oder -teile sind ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung.
Die Expressionskassette kann darüberhinaus auch zur Transformation von Bakterien, Cyanobakterien, Hefen, filamentösen Pilzen und Algen mit dem Ziel einer Erhöhung des Gehaltes an Tocophero- len, Vitamin K, Lignin, Chlorophyll und/oder aromatischen Aminosäuren eingesetzt werden.
Die Übertragung von Fremdgenen in das Genom einer Pflanze wird als Transformation bezeichnet. Es werden dabei die beschriebenen Methoden zur Transformation und Regeneration von Pflanzen aus Pflanzengeweben oder Pflanzenzellen zur transienten oder stabilen Transformation genutzt. Geeignete Methoden sind die Protoplasten- transformation durch Polyethylenglykol-induzierte DNA-Aufnähme , das biolistische Verfahren mit der Genkanone - die sogenannte particle bombardment Methode, die Elektroporation, die Inkubation trockener Embryonen in DNA-haltiger Lösung, die Mikroinjektion und der durch Agrobacterium vermittelte Gentransfer. Die genannten Verfahren sind beispielsweise in B. Jenes et al . , Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, herausgegeben von S.D. Kung und R. Wu, Academic Press (1993), 128 - 143 sowie in Potrykus, Annu. Rev. Plant Phy- siol. Plant Molec. Biol. 42 (1991), 205 - 225) beschrieben. Vorzugsweise wird das zu exprimierende Konstrukt in einen Vektor kloniert, der geeignet ist, Agrobacterium tumefaciens zu transformieren, beispielsweise pBinl9 (Bevan et al., Nucl. Acids Res. 12 (1984), 8711).
Mit einer Expressionskassette transformierte Agrobakterien können ebenfalls in bekannter Weise zur Transformation von Pflanzen, insbesondere von Kulturpflanzen, wie Getreide, Mais, Hafer, Soja, Reis, Baumwolle, Zuckerrübe, Canola, Sonnenblume, Flachs, Hanf, Kartoffel, Tabak, Tomate, Raps, Alfalfa, Salat und den verschiedenen Baum-, Nuß- und Weinspezies, verwendet werden, z.B. indem verwundete Blätter oder Blattstücke in einer Agrobakterienlösung gebadet und anschließend in geeigneten Medien kultiviert werden.
Funktioneil äquivalente Sequenzen, die für ein Transketolase-Gen kodieren, sind solche Sequenzen, welche trotz abweichender Nu- kleotidsequenz noch die gewünschten Funktionen besitzen. Funktionelle Äquivalente umfassen somit natürlich vorkommende Varianten der hierin beschriebenen Sequenzen sowie künstliche, z.B. durch chemische Synthese erhaltene, an den Kodon-Gebrauch einer Pflanze angepaßte, künstliche Nukleotid-Sequenzen.
Unter einem funktionellen Äquivalent versteht man insbesondere auch natürliche oder künstliche Mutationen einer ursprünglich isolierten für eine Transketolase kodierende Sequenz, welche weiterhin die gewünschte Funktion zeigen. Mutationen umfassen Sub- stitutionen, Additionen, Deletionen, Vertauschungen oder Inser- tionen eines oder mehrerer Nukleotidreste. Somit werden beispielsweise auch solche Nukleotidsequenzen durch die vorliegende Erfindung mit umfaßt, welche man durch Modifikation der Transke- tolase-Nukleotidsequenz erhält. Ziel einer solchen Modifikation kann z.B. die weitere Eingrenzung der darin enthaltenen kodierenden Sequenz oder z.B. auch die Einfügung weiterer Restriktionsenzym-Schnittstellen sein.
Funktionelle Äquivalente sind auch solche Varianten, deren Funktion, verglichen mit dem Ausgangsgen bzw. Genfragment, abgeschwächt oder verstärkt ist.
Außerdem sind artifizielle DNA-Sequenzen geeignet, solange sie, wie oben beschrieben, die gewünschte Eigenschaft beispielsweise der Erhöhung des Tocopherol-Gehaltes in der Pflanze durch Überexpression des Transketolase-Gens in Kulturpflanzen vermitteln. Solche artifiziellen DNA-Sequenzen können beispielsweise durch Rückübersetzung mittels Molecular Modelling konstruierter Proteine, die Transketolase-Aktivität aufweisen oder durch in vi tro- Selektion ermittelt werden. Besonders geeignet sind kodierende DNA-Sequenzen, die durch Rückübersetzung einer Polypeptidsequenz gemäß der für die Wirtspflanze spezifischen Kodon-Nutzung erhalten wurden. Die spezifische Kodon-Nutzung kann ein mit pflanzengenetischen Methoden vertrauter Fachmann durch Computerauswertungen anderer, bekannter Gene der zu transformierenden Pflanze leicht ermitteln.
Als weitere geeignete äquivalente Nukleinsäure-Sequenzen sind zu nennen Sequenzen, welche für Fusionsproteine kodieren, wobei Bestandteil des Fusionsproteins ein Transketolase-Polypeptid oder ein funktioneil äquivalenter Teil davon ist. Der zweite Teil des Fusionsproteins kann z.B. ein weiteres Polypeptid mit enzymati- scher Aktivität sein oder eine antigene Polypeptidsequenz mit deren Hilfe ein Nachweis auf Transketolase-Expression möglich ist (z.B. myc-tag oder his-tag) . Bevorzugt handelt es sich dabei jedoch um eine regulative Proteinsequenz, wie z.B. ein Signal- oder Transitpeptid, das das Transketolase-Protein an den gewünschten Wirkort leitet.
Erhöhung des Gehaltes an Tocopherolen, Vitamin K, Chlorophyllen, Ligninen und/oder aromatischen Aminosäuren bedeutet im Rahmen der vorliegenden Erfindung die künstlich erworbene Fähigkeit einer erhöhten Biosyntheseleistung dieser Verbindungen durch funktio- nelle Überexpression des Transketolase-Gens in der Pflanze gegenüber der nicht gentechnisch modifizierten Pflanze für die Dauer mindestens einer Pflanzengeneration. Der Biosyntheseort von Tocopherolen beispielsweise ist im allgemeinen das Blattgewebe, so daß eine blattspezifische Expression des Transketolase-Gens sinnvoll ist. Es ist jedoch naheliegend, daß die Tocopherol-Biosynthese nicht auf das Blattgewebe be- schränkt sein muß, sondern auch in allen übrigen Teilen der
Pflanze - beispielsweise in fetthaltigen Samen - gewebespezifisch erfolgen kann.
Darüberhinaus ist eine konstitutive Expression des exogenen Transketolase-Gens von Vorteil. Andererseits kann aber auch eine induzierbare Expression wünschenswert erscheinen.
Die Wirksamkeit der Expression des transgen exprimierten Transketolase-Gens kann beispielsweise in vi tro durch Sproßmeristemver- mehrung ermittelt werden. Zudem kann eine in Art und Höhe veränderte Expression des Transketolase-Gens und deren Auswirkung auf die Tocopherol-Biosyntheseleistung an Testpflanzen in Gewächshausversuchen getestet werden.
Gegenstand der Erfindung sind außerdem transgene Pflanzen, transformiert mit einer Expressionskassette enthaltend die Sequenz SEQ-ID No. 1 oder mit diesen hybridisierende DNA-Sequenzen, sowie transgene Zellen, Gewebe, Teile und Vermehrungsgut solcher Pflanzen. Besonders bevorzugt sind dabei transgene Kulturpflanzen, wie z.B. Gerste, Weizen, Roggen, Mais, Hafer, Soja, Reis, Baumwolle, Zuckerrübe, Canola, Sonnenblume, Flachs, Hanf, Kartoffel, Tabak, Tomate, Raps, Alfalfa, Salat und die verschiedenen Baum-, Nuß- und Weinspezies.
Pflanzen im Sinne der Erfindung sind mono- und dikotyle Pflanzen oder Algen.
Durch Überexpression der für eine Transketolase kodierenden Gensequenz SEQ-ID NO. 1 in einer Pflanze kann prinzipiell eine er- höhte Resistenz gegenüber Inhibitoren der Transketolase erreicht werden. Die derart hergestellten transgenen Pflanzen sind ebenfalls Gegenstand der Erfindung.
Weitere Gegenstände der Erfindung sind:
Verfahren zur Transformation einer Pflanze dadurch gekennzeichnet, daß man Expressionskassetten enthaltend eine DNA- Sequenz SEQ-ID No. 1 oder mit diesen hybridisierende DNA-Sequenzen in eine Pflanzenzelle, in Kallusgewebe, eine ganze Pflanze oder Protoplasten von Pflanzen einbringt. Verwendung der Expressionskassette enthaltend eine DNA-Sequenz SEQ-ID No. 1 oder mit diesen hybridisierende DNA-Sequenzen zur Herstellung von Pflanzen mit erhöhter Resistenz gegenüber Inhibitoren der Transketolase durch verstärkte Ex- pression der DNA-Sequenzen SEQ-ID No. 1 oder mit diesen hybridisierende DNA Sequenzen.
Die Erfindung wird durch die nun folgenden Beispiele erläutert, ist aber nicht auf diese beschränkt:
Allgemeine Klonierungsverfahren
Gentechnische Verfahren, die den Beispielen zugrundeliegen:
1. Allgemeine Klonierungsverfahren
Klonierungsverfahren wie z.B. Restriktionsspaltungen, Aga- rose-Gelelektrophorese, Reinigung von DNA-Fragmenten, Transfer von Nukleinsäuren auf Nitrozellulose und Nylon Membranen, Verknüpfen von DNA-Fragmenten, Transformation von E. coli
Zellen, Anzucht von Bakterien, Vermehrung von Phagen und Sequenzanalyse rekombinanter DNA wurden wie bei Sambrook et al . (1989) (Cold Spring Harbor Laboratory Press: ISBN 0-87969-309-6) beschrieben durchgeführt. Die Transformation von Agrobacterium tumefaciens wurde entsprechend der Methode von Höfgen und Willmitzer (Nucl. Acid Res. (1988) 16, 9877) ausgeführt. Die Anzucht der Agrobakterien erfogte in YEB Medium (Vervliet et al., J. Gen. Virol. (1975) 26, 33).
Die im folgenden verwendeten Bakterienstämme ( E. coli , XL-I Blue) wurden von Stratagene bezogen. Der zur Pflanzentransformation verwendete Agrobakterienstamm (Agrobacterium tumefaciens, C58C1 mit dem Plasmid pGV2260 oder pGV3850kan) wurde von Deblaere et al. in Nucl. Acids Res. 13 (1985), 4777 be- schrieben. Alternativ können auch der Agrobakterienstamm
LBA4404 (Clontech) oder andere geeignete Stämme eingesetzt werden. Zur Klonierung können die Vektoren pUC19 (Yanish-Per- ron, Gene 33 (1985), 103 - 119) pBluescript SK- (Stratagene), pGEM-T (Promega) , pZerO (Invitrogen) , pBinl9 (Bevan et al . , Nucl. Acids Res. 12 (1984), 8711 - 8720) und pBinAR (Höfgen und Willmitzer, Plant Science 66 (1990), 221 - 230) benutzt werden. 2. Erzeugung von cDNA-Bibliotheken
Zur Herstellung von Blatt-spezifischen cDNA Bibliotheken wurde Gesamt-RNA aus Tabakblättern nach einer von Logemann et al. (Anal. Biochem. (1987) 163,21) beschriebenen Methode isoliert. Anschließend wurde die poly(A)-RNA über 01igo(dT)-Cel- lulose Type 7 (Pharmacia, Freiburg) nach Angaben des Herstellers gereinigt. Nach photometrischer Konzentrationsbestimmung wurden 5 μg der so erhaltenen RNA für die cDNA Synthese ein- gesetzt. Alle für die Herstellung der cDNA notwendigen Chemikalien und Enzyme wurden durch die Firma Stratagene (La Jolla CA 92037, USA) bezogen. Die angewandten Methoden wurden nach Angaben des Herstellers durchgeführt. Die Synthese des ersten und zweiten Stranges der cDNA wurde mit dem ZAP-cDNA Synthese Kit durchgeführt. Die erhaltenen doppelsträngigen cDNAs wurden anschließend mit EcoRI-Notl Adaptoren versehen und in einen EcoRI gespaltenen Lambda ZAPII Vektor kloniert. Nach in vitro Verpackung (Gigapack II Verpackungsextrakt) der rekom- binanten Lambda DNA wurden XL-1 E. coli Zellen (Stratagene) transformiert. Durch Auszählen der gebildeten Plaques wurde der Titer der cDNA-Bibliotheken bestimmt.
3. Durchmusterung einer cDNA-Bibliothek mittels heterologer DNA- Sonden
2 x 105 rekombinante Lambda Phagen (Lambda ZapII) einer blattspezifische cDNA-Bibliothek aus Tabak (Varietät Samsun NN) wurden auf Agarplatten ausplattiert. Die Phagen-DNA wurde mittels Standardverfahren (Sambrook et al . (1989); Cold Spring Harbor Laboratory Press: ISBN 0-87969-309-6) auf Nylon-Membranen (Hybond N, Amersham Buchler) transferiert und durch Inkubation für 2 Stunden bei 80°C auf den Filtern fixiert. Als Hybridisierungssonden dienten DNA-Fragmente, die mit Hilfe eines "Multiprime DNA labelling Systems" (Amersham Buchler) in Anwesenheit von a-32P-dCTP (spezifische Aktivität 3000 Ci/mmol) nach Herstellerangaben radioaktiv markiert wurden. Hybridisierung der Membran erfolgte nach Prähybridisie- rung bei 42°C in PEG-Puffer (Amasino (1986) Anal. Biochem. 152, 304-307) für 12-16 Stunden. Anschließend wurden die Fil- ter 3 x 20 Minuten in 2 x SSC, 0,1 % SDS bei 42°C gewaschen. Positiv hybridisierende Phagen wurden durch Autoradiographie sichtbar gemacht und durch Standardtechniken gereinigt. 4. Analyse von Gesamt-RNA aus pflanzlichen Geweben
Gesamt-RNA aus pflanzlichen Geweben wurde wie bei Logemann et al. (Anal. Biochem. (1987) 163,21) beschrieben isoliert. Für die Analyse wurden jeweils 20-40 μg RΝA in einem Formaldehyd- haltigen 1,5 %igen Agarosegel aufgetrennt. Nach elektrophore- tischer Auftrennung der RNA Moleküle wurde die RNA mittels Kapillartransfer auf eine Nylon Membran übertragen. Der Nachweis spezifischer Transkripte wurde wie bei Amasino (Anal. Biochem. (1986) 152, 304) beschrieben durchgeführt. Die als Sonde eingesetzten cDNA-Fragmente wurden mit einem Random Primed DNA Labeling Kit (Boehringer, Mannheim) radioaktiv markiert.
5. Sequenzanalyse rekombinanter DNA
Die Sequenzierung rekombinanter DNA-Moleküle erfolgte mit einem Laserfluoreszenz-DNA-Sequenzierer der Firma Licor (Vertrieb durch MWG Biotech, Ebersbach) nach der Methode von San- ger (Sanger et al . , Proc. Natl. Acad. Sei. USA 74 (1977), 5463 - 5467) .
Beispiel 1
Klonierung der plastidaren Transketolase
Aus einer blattspezifischen cDNA-Bibliothek aus Tabak (Varietät Samsun NN) wurde ein Klon, der für Transketolase kodiert, ausgewählt. Die DNA Sequenz ist in SEQ-ID No. 3 dargestellt (Accession NR. A 52295) .
Der 2629 Basenpaar lange cDNA-Klon 21 enthält einen offenen Leseraster von 2229 Basen und kodiert für ein Protein mit 743 Aminosäuren. Analyse des Polypeptides unter Verwendung des Sequenzpro- gramms PC/Gene (Untermenü TRANSPEP) ergab, daß am N-Terminus des Proteins ein chloroplastidäres Transitpeptid von vermutlich 77 Aminosäuren vorhanden ist, siehe auch EP-A 0 723 017.
Beispiel 2
Herstellung von Transketolase-Antisense-Transformanten
Ein 1300 Basenpaar-Fragment (1329-2611) dieses Klons wurde in An- tisense-Orientierung in einen binären Vektor pBinl9AR unter der Kontrolle des 35S-Promotors kloniert. Dieses Konstrukt wurde durch Agrobakterium-vermittelte Transformation in Tabak übertragen. Regenerierte Pflanzen wurden auf plastidäre Transketolase mRNA-Mengen hin untersucht. Pflanzen mit reduzierter Transketola- seaktivität wurden einer Selbstung unterzogen und der erhaltene Samen geerntet. Zur weiteren Analyse der Pflanzen wurde Samen aus der Fl-Generation folgender Linien verwendet: TK 7 und TK 8. Die 5 nachfolgend beschriebenen Daten sind durch Analysen dieser Linien gewonnen worden.
Alle untersuchten Antisense-Pflanzen zeigten hinsichtlich der Pflanzengröße deutliche Unterschiede auf. Es wurden Pflanzen ge-
10 funden, die die gleiche Größe hatten wie der Wildtyp, bis hin zu ganz kleinen Pflanzen. Die nachfolgenden Generationen waren also nicht einheitlich. Dies gilt auch für die Reduktion in der Trans- ketolase-Aktivität, die innerhalb einer Linie nicht einheitlich war, d.h. man kann eine Linie nicht durch eine spezifische Reduk-
15 tion in der Transketolase-Aktivität definieren, sondern die Linien spalten auf (Sedoheptulose-1, 7-Bisphosphatase-antisense-Ta- bak-Pflanzen weisen ein vergleichbares Phänomen auf; vgl. Harri- son et al. 1998, Planta 204: 27-36).
20 Die Biomassen-Analyse ergab eine Korrelation zwischen Reduktion der Transketolase-Aktivität und Reduktion in der Biomasse.
Sämtliche Pflanzen wurden vor der Durchführung der eigentlichen Experimente auf ihre plastidäre Transketolase-Aktivität hin un-
25 tersucht. Pflanzen mit vergleichbarer Reduktion in der Transketolase -Aktivität wurden gepoolt und über ihre relative Reduktion der TK-Aktivität gegenüber dem Wildtyp definiert (z.B. Gruppe von transgenen Pflanzen mit einer Reduktion der TK-Aktivität um 50 % im Vergleich zum Wildtyp) .
30
In Abbildung 7 sind plastidäre Transketolase-Aktivitäten von individuellen Pflanzen der Linien TK 7 und TK 8 angegeben. Die Bestimmungen erfolgen auf Basis von RNA- und Proteinmessungen. Die Aktivitäten sind bezogen auf % WT (WT-Aktivität ist 100% ge-
35 setzt) .
Beispiel 3
Bestimmung der Transketolase-Aktivität
40
Die Transketolase-Aktivität wurde in einem gekoppelten enzymati- schen in vitro-Test aus pflanzlichen Rohextrakten ermittelt. Die detaillierte experimentelle Verfahrensweise ist von Haake veröffentlicht worden (Haake et al , 1998, The Plant Journal 14:
45 147-157) . Schockgefrorenes Blattmaterial wird in einem eisgekühlten Extraktionspuffer homogenisiert und die löslichen Proteine extrahiert . Der erhaltene Extrakt wird nach Abzentrifugieren der unlöslichen Zellrückstände unmittelbar im Transketolase-Aktivitätstest einge- setzt. Hierbei setzt die im Extrakt vorhandene Transketolase die zugesetzten Substrate Xylulose-5-P und Erythrose-4-P um, wobei Sedoheptulose-7-P und Glycerinaldehyd-3-P entstehen. Letzteres kann mit Hilfe zugesetzter Hilfsenzyme (Triose-P-Isomerase und Glycerin-3-P-Dehydrogenase) nach Isomeri- sierung zum Keton
(Dihydroxyacetonphosphat) reduziert werden zum Alkohol (Glyce- rol-3-P) . Dabei wird NADH als Elektronendonator der Redoxreaktion oxidiert, was spektrophotometrisch nachgewiesen werden kann (Wellenlänge: 340 nm) .
Enzymextraktionspuffer: 100 mM Hepes pH 7,7, 10 mM MgCl2, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 2 mM Aminocapronat, 0,5 mM PMSF, 10 % Glycerin, 0,01 % Triton X-100, 5 mM DTT, Extraktion: 1:20 (w/v) .
Nach Abzentrifugieren der Zellreste wird ein Aliquot des Überstandes in einem gekoppelten Enzymassay eingesetzt.
100 mM Hepes pH 7,7, 0,2 mM Cocarboxylase, 10 mM MgCl2, 0,15 mM NADH, 0,8 mM Xylulose-5-P (X5P) , 1 U TPI/GDH-Mix (Boehringer Mannheim)
Start: 0,8 mM Erythrose-4-P (E4P)
Reaktionsschema: X5P + E4P — (TK) —> SH7P + GA3P GA3P — (TPI)—> DHAP
DHAP — (GDH) —> G3P (bei dieser Reaktion wird NADH verbraucht; photometrischer Nachweis bei 340 nm)
SH7P = Sedoheptulose-7-P, GA3P = Glycerinaldehyd-3-P, DHAP = Di- hydroxyaceton-P, G3P = Glycerin-3-P, TPI = Triose-P-Isomerase, GDH = Glycerinaldehyd-3-P-Dehydrogenase
Beispiel 4
Klonierung einer Transketolase-Isoform aus Saccharo yces cerevi siae in den pflanzlichen Expressionsvektor TK-Tp-BinAR-9 zur Überexpression der Hefe-Transketolase in Nicotiana tabacum SNN.
Aufgrund vorhandener Sequenzinformationen aus der Datenbank (Hefe Transketolase TKT1; Accession number: M63302) wurden Primer hergestellt, mit deren Hilfe mittels PCR aus Hefe-DNA ein ca. 2 , 1 Kb großes Fragment ("YTK") isoliert werden konnte. Dieses konnte durch Sequenzieren als Transketolase-Isoform TKT1 identifiziert werden, siehe SEQ-ID NO. 1.
Die Primer waren so gewählt, daß sie Schnittstellen enthielten, die eine gerichtete sense-Klonierung des Fragmentes in den Überexpressionsvektor TK-Tp-BinAR-9 ermöglichten. Er ist vom binären Expressionsvektor pBinAR (Höfgen und Willmitzer, 1990, Plant Sciences 66, S. 221-230) abgeleitet und erlaubt die Translations- fusion eines beliebigen Proteins mit dem Transitpeptid der plastidaren Transketolase (TK-Tp) aus Tabak zur Dirigierung heterologer Proteine in den Chloroplasten unter der Kontrolle des 35S-CaMV-Promotors (35S) . Als Terminator dient das Polyadenylie- rungssignal des Gens 3 der T-DNA des Ti-Plasmids pTiACH 5 (OCS), (Gielen et al . , 1984, EMBO J. 3, 835-846).
Dieses Überexpressionskonstrukt, siehe Abbildung 10, wurde mit Hilfe des Agrobacterium tumefaciens vermittelten Gentransfers in Nicotiana tabacum Varietät Samsun NN transformiert (Rosahl et al., 1987, EMBO J. 6, S. 23-29).
Die Selektion von Pflanzen mit einer Überexpression der Transketolase erfolgte zunächst durch Ermittlung der Transketolase-Aktivität, gefolgt von einer Untersuchung auf erhöhte Transketolase mRNA- und Proteinmenge.
Beispiel 5
Extraktion und Detektion von Tocopherol
Extraktionsverfahren :
100 mg Feuchtgewicht Blattmaterial
Extraktionspuffer : 80 % Ethanol, 10 mM Hepes pH 7,0, 1 mM Ascorbat
Extraktion: 1:5 (w/v)
Inkubation bei 50°C, 30 Minuten
Keine Zentrifugation
Zugabe von Vz Volumen n-Hexan zu dem Extrakt - Vortex und Zentrifugation (5 Minuten, Raumtemperatur)
Gewinnung der oberen sehr grün gefärbten Phase
Wiederholung der n-Hexan Extraktion mit der unteren Phase
Vereinigung der n-Hexan Phasen
Vakuum. Trocknung (2-3 Stunden für 1 ml n-Hexan bei Raumtempe- ratur)
Wiederauflösung des Rückstandes in ca. 1/5 des ursprünglichen n-Hexan Volumens Injektion von 30 - 50 μl auf die HPLC HPLC-Detektion für Tocopherol
Detektion der Fluoreszenz: Anregung bei 295 nm, Emission bei 330 nm - Säule: RP-18 (Nucleosil 100, C18, 3μm, Fa. Knauer) Isokratisches System: n-Hexan plus 0,2 % 2-Propanol Fluß: 0,8 ml/min (Druck: 110 bar) Standards von Sigma oder Merck Laufzeit: 15 Minuten
Beispiel 6
Extraktion phenolischer Substanzen aus Blättern und HPLC-Analytik
Die Extraktion phenolischer Substanzen aus Blättern wurde wie bei Yao et al., The Plant Cell, 7 (1995), 1787 - beschrieben durchgeführt .
Beispiel 7
Quantitative Bestimmung des Ligningehaltes
Die Extraktion des Lignins aus Stammgewebe erfolgte wie in Lange et al. beschrieben (1995).
Beispiel 8
Extraktion der aromatischen Aminosäuren und Nachweis mit Hilfe der HPLC.
Eine detaillierte Darstellung der Methoden zur Extraktion und zum Nachweis von Aminosäuren ist in Scheible et al. veröffentlicht (Scheible et al., 1997, The Plant Cell 9: 783-798).
Beispiel 9
Herstellung von transgenen Tabakpflanzen (Nicotiana tabacu L. cv. Samsun NN) .
Für die Herstellung transgener Tabakpflanzen, die einen veränderten Prenyllipidgehalt aufweisen, wurden TabakblattScheiben mit Sequenzen der Transketolase (SEQ-ID No. 1, SEQ-ID No. 3) transformiert. Zur Transformation von Tabakpflanzen wurden 10 ml einer unter Selektion gewachsenen Übernachtkultur von Agrobacterium tu- mefaciens abzentrifugiert, der Überstand verworfen und die Bakterien in gleichem Volumen Antibiotika-freien Mediums resuspendiert. In einer sterilen Petrischale wurden Blattscheiben steri- ler Pflanzen (Durchmesser ca. 1 cm) in dieser Bakteriensuspension gebadet. Anschließend wurden die Blattscheiben in Petrischalen auf MS-Medium (Murashige und Skoog, Physiol . Plant (1962) 15, 473) mit 2% Saccharose und 0.8% Bacto-Agar ausgelegt. Nach 2-tä- giger Inkubation im Dunkeln bei 25°C wurden sie auf MS-Medium mit 100mg/l Kanamycin, 500mg/l Claforan, lmg/1 Benzylaminopurin (BAP), 0.2mg/l Naphtylessigsäure (NAA) , 1.6% Glukose und 0.8% Bacto-Agar übertragen und die Kultivierung (16 Stunden Licht / 8 Stunden Dunkelheit) fortgesetzt. Wachsende Sprosse wurden auf hormonfreies MS-Medium mit 2% Saccharose, 250mg/l Claforan und 0.8% Bacto-Agar überführt.
Beispiel 10
Herstellung von transgenen Rapspflanzen (Brassica napus)
Die Herstellung der transgenen Rapspflanzen, die einen veränderten Prenyllipidgehalt aufweisen, orientierte sich an einem Protokoll von Bade, J.B. und Damm, B. (in Gene Transfer to Plants, Po- trykus, I. und Spangenberg, G. , eds, Springer Lab Manual, Springer Verlag, 1995, 30-38), in welchem auch die Zusammensetzungen der verwendeten Medien und Puffer angegeben sind.
Die Transformationen erfolgten mit dem Agrobacterium tumefaciens Stamm LBA4404 (Clontech GmbH, Heidelberg) . Als binäre Vektoren wurden das bereits oben beschriebene binäre Konstrukt mit der gesamten cDNA der Transketolase aus Saccaromyces cerevisiae (SEQ-ID No. 1) verwendet. In allen hier verwendeten binären Vektoren wurde die NOS-Terminatorsequenz durch das Polyadenylierungssignal des Gens 3 der T-DNA des Ti-Plasmids pTIACH5 (Gielen et al . ,
1984) zur Transkriptionstermination ersetzt. Brassica napus Samen wurden mit 70% (v/v) Ethanol oberflächensteril gemacht, 10 min bei 55°C in H0 gewaschen, in l%iger Hypochlorit-Lösung (25% v/v Teepol, 0,1% v/v Tween 20) für 20 min inkubiert und sechsmal mit sterilem H0 für jeweils 20 min gewaschen. Die Samen wurden drei Tage auf Filterpapier getrocknet und 10-15 Samen in einem Glasskolben mit 15 ml Keimungsmedium zur Keimung gebracht. Von mehreren Keimlingen (ca. 10 cm groß) wurden die Wurzeln und Apices entfernt und die verbleibenden Hypokotyle in ca. 6 mm lange Stücke geschnitten. Die so gewonnenen ca. 600 Explante werden 30 min mit 50 ml Basalmedium gewaschen und in einen 300 ml Kolben überführt. Nach Zugabe von 100 ml Kallus-Induktionsmedium wurden die Kulturen für 24 h bei 100 U/min inkubiert.
Vom Agrobacterium-Stamm wurde eine Übernachtkultur bei 29°C in Lu- ria Broth-Medium mit Kanamycin (20 mg/1) angesetzt, davon 2 ml in 50 ml Luria Broth-Medium ohne Kanamycin für 4 h bei 29°C bis zu einer ODδoo von 0,4 - 0,5 inkubiert. Nach der Pelletierung der Kultur bei 2000 U/min für 25 min wurde das Zellpellet in 25 ml Basalmedium resuspendiert. Die Konzentration der Bakterien in der Lösung wurde durch Zugabe von weiterem Basalmedium auf eine OD500 von 0.3 eingestellt.
Aus den Raps-Explanten wurde das Kallus-Induktionsmedium mit sterilen Pipetten entfernt, 50 ml Agrobacterium-Lösung hinzugefügt, vorsichtig gemischt und für 20 min inkubiert. Die Agrobacterien- Suspension wurde entfernt, die Raps-Explante für 1 min mit 50 ml Kallus-Induktionsmedium gewaschen und anschließend 100 ml Kallus- Induktionsmedium hinzugefügt. Die Co-Kultivierung wurde für 24 h auf einem Rotationsschüttler bei 100 U/min durchgeführt. Die Co- Kultivierung wurde durch Wegnahme des Kallus-Induktionsmediums gestoppt und die Explante zweimal für jeweils 1 min mit 25 ml und zweimal für 60 min mit jeweils 100 ml Waschmedium bei 100 U/min gewaschen. Das Waschmedium mit den Explanten wurde in 15 cm Pe- trischalen überführt und das Medium mit sterilen Pipetten entfernt .
Zur Regeneration wurden jeweils 20-30 Explante in 90 mm Petri- schalen überführt, welche 25 ml Sproß-Induktionsmedium mit Kanamycin enthielten. Die Petrischalen wurden mit 2 Lagen Leukopor verschlossen und bei 25°C und 2000 lux bei Photoperioden von 16 Stunden Licht/8 Stunden Dunkelheit inkubiert. Alle 12 Tage wurden die sich entwickelnden Kalli auf frische Petrischalen mit Sproß- Induktionsmedium überführt. Alle weiteren Schritte zur Regeneration ganzer Pflanzen wurde wie von Bade, J.B. und Damm, B. (in Gene Transfer to Plants, Potrykus, I. und Spangenberg, G. , eds, Springer Lab Manual, Springer Verlag, 1995, 30-38) beschrieben durchgeführt .
Beispiel 11
Steigerung der Tocopherolbiosynthese in Tabak
Die Überexpression der Hefe-Transketolase in Tabak erfolgte wie in Beispiel 4 beschrieben.
Mit den entsprechenden Konstrukten transformierte Takakpflanzen wurden im Gewächshaus angezogen. Anschließend wurde der α-Toco- pherolgehalt der Gesamtpflanze bzw. der Samen der Pflanze bestimmt. In allen Fällen war die α-Tocopherolkonzentration im Vergleich zur nicht transfomierten Pflanze erhöht. Beispiel 12
Steigerung der Tocopherolbiosynthese in Raps
Die cDNA der Transketolase aus Saccharomyces cerevisiae
(SEQ-No.l) wurde mit einem CaMV35S-Promotor versehen und in Raps unter Verwendung des 35S-Promotors überexprimiert. Parallel dazu wurde der samenspezifische Promotor des Phaseolingenes verwendet, um den Tocopherolgehalt spezifisch im Rapssamen zu erhöhen. Mit den entsprechenden Konstrukten transformierte Rapspflanzen wurden im Gewächshaus angezogen. Anschließend wurde der α-Tocopherolge- halt der Gesamtpflanze bzw. der Samen der Pflanze bestimmt. In allen Fällen war die α-Tocopherolkonzentration im Vergleich zur nicht transfomierten Pflanze erhöht.

Claims

Patentansprüche
1. Verwendung von DNA-Sequenzen codierend für eine Transketolase zur Herstellung von Pflanzen mit erhöhtem Gehalt an Tocopherolen, Vitamin K, Chlorophyllen, Ligninen und/oder aromatischen Aminosäuren.
_0 2. Verwendung einer DNA-Sequenz SEQ ID No. 1 oder einer mit dieser hybridisierenden DNA-Sequenz kodierend für eine Transketolase (TK) zur Herstellung von Pflanzen mit erhöhtem Gehalt an Tocopherolen, Vitamin K, Chlorophyllen, Ligninen und/oder aromatischen Aminosäuren. 5
3. Verfahren zur Herstellung von Pflanzen mit erhöhtem Gehalt an Tocopherolen, Vitamin K, Chlorophyllen, Ligninen und/oder aromatischen Aminosäuren, dadurch gekennzeichnet, daß eine DNA-Sequenz SEQ-ID No . 1 oder eine mit dieser hybridisierende 0 DNA-Sequenz in Pflanzen exprimiert wird.
4. Verfahren zur Transformation einer Pflanze dadurch gekennzeichnet, daß man eine Expressionskassette enthaltend einen Promotor und eine DNA-Sequenz SEQ-ID No. 1 oder eine mit die- ser hybridisierende DNA-Sequenz in eine Pflanzenzelle, Kallusgewebe, eine ganze Pflanze oder Protoplasten von Pflanzenzellen einbringt.
5. Verfahren zur Transformation von Pflanzen gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Transformation mit Hilfe des Stammes Agrobacterium tumefaciens, der Elektroporation oder der particle bombardment Methode erfolgt.
5 6. Pflanze mit erhöhtem Gehalt an Tocopherolen, Vitamin K, Chlorophyllen, Ligninen und/oder aromatischen Aminosäuren enthaltend eine Expressionskassette gemäß Anspruch 4.
7. Pflanze nach Anspruch 6, ausgewählt aus der Gruppe Soja, Ca- 0 nola, Gerste, Hafer, Weizen, Raps, Mais oder Sonnenblume.
5 Zeichn. Überexpression einer DNA-Sequenz codierend für eine Transketolase in Pflanzen
Zusammenfassung
Verfahren zur Herstellung von Pflanzen mit erhöhtem Gehalt an Tocopherolen, Vitamin K, Chlorophyllen, Ligninen und/oder aromatischen Aminosäuren durch Überexpression eines Transketolase Gens.
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