DE10220753A1

DE10220753A1 - Verfahren zum Erhöhen des Ölgehaltes in Pflanzen

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Publication number: DE10220753A1
Application number: DE2002120753
Authority: DE
Original assignee: BASF Plant Science GmbH
Current assignee: BASF Plant Science GmbH
Priority date: 2002-05-08
Filing date: 2002-05-08
Publication date: 2003-11-27

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Erhöhen des Ölgehaltes in Pflanzen, bevorzugt in pflanzlichen Samen, durch Expression von Glycerol-3-phosphatdehydrogenasen (G3PDH) aus Hefen, bevorzugt aus Saccharomyces cerevisiae. Die Erfindung betrifft ferner Expressionskonstrukte zur Expression von Hefe G3PDH in Pflanzen, bevorzugt in pflanzlichen Samen, transgene Pflanzen exprimierend Hefe G3PDH, sowie die Verwendung von besagter transgener Pflanzen zur Herstellung von Nahrungs-, Futtermitteln, Saatgut, Pharmazeutika oder Feinchemikalien, insbesondere zur Herstellung von Ölen.

Description

Die Erfindung betrifft Verfahren zum Erhöhen des Ölgehaltes in Pflanzen, bevorzugt in pflanzlichen Samen, durch Expression von Glycerol-3-phosphatdehydrogenasen (G3PDH) aus Hefen, bevorzugt aus Saccharomyces cerevisiae. Die Erfindung betrifft ferner Expressionskonstrukte zur Expression von Hefe G3PDH in Pflanzen, bevorzugt in pflanzlichen Samen, transgene Pflanzen exprimierend Hefe G3PDH, sowie die Verwendung von besagter transgener Pflanzen zur Herstellung von Nahrungs-, Futtermitteln, Saatgut, Pharmazeutika oder Feinchemikalien, insbesondere zur Herstellung von Ölen.
Die Erhöhung des Ölgehalts in Pflanzen und insbesondere in Pflanzensamen ist für die klassische wie für die modernen Pflanzenzüchtung und insbesondere die pflanzliche Biotechnologie von großem Interessen. Bedingt durch den steigenden Verbrauch von Pflanzenölen für Ernährung bzw. industrielle Anwendungen sind Möglichkeiten zur Steigerung bzw. Modifikation von Pflanzenölen zunehmend Gegenstand aktueller Forschung (z. B. Töpfer et al. (1995) Science 268: 681-686). Ziel ist dabei insbesondere die Erhöhung des Gehaltes an Fettsäuren in Samenölen.
Auch die aus den pflanzlichen Ölen erhältlichen Fettsäuren sind von besonderem Interesse. Sie kommen beispielsweise als Grundstoffe für Weichmacher, Schmierstoffe, Tenside, Kosmetika usw. zum Einsatz oder werden in der Lebens- und Futtermittelindustrie als wertvoll Grundstoffe eingesetzt. So ist beispielsweise die Bereitstellung von Rapsölen mit Fettsäuren mittlerer Kettenlänge von besonderem Interesse, da diese besonderes in der Tensidherstellung begehrt sind.
Durch die gezielte Modulation pflanzlicher Stoffwechselwege mittels gentechnische Verfahren kann der pflanzlichen Metabolismus in einer Weise vorteilhaft verändert werden, die durch klassische Züchtungsmethoden nur über langwierige Schritte bzw. überhaupt nicht zu erreichen wären. So werden ungewöhnliche Fettsäuren, beispielsweise bestimmte polyungesättigte Fettsäuren, nur in bestimmten Pflanzen bzw. überhaupt nicht in Pflanzen synthetisiert und können deshalb nur nur durch Expression des entsprechenden Enzyms in transgenen Pflanzen hergestellt werden (z. B. Millar et al. (2000) Trends Plant Sci 5: 95-101).
Triacylgylceride und andere Lipide werden aus Fettsäuren synthetisiert. Die Fettsäure- und Triacylglyceridbiosynthese lassen sich aufgrund der Kompartimentierung als getrennte Biosynthesewege, jedoch im Hinblick auf das Endprodukt, als ein Biosyntheseweg ansehen. Die Lipidsynthese kann dabei in zwei Teilmechanismen unterteilt werden, einen quasi "prokaryotischen" und einen quasi "eukaryotischen" (Browse et al. (1986) Biochemical J 235: 25-31; Ohlrogge & Browse (1995) Plant Cell 7: 957-970). Der prokaryotische Mechanismus ist in den Plastiden lokalisiert und umfasst die Biosynthese der freien Fettsäuren, die in das Cytosol exportiert werden, wo sie als Fettsäureacyl-CoA-Ester in den eukaryotischen Mechanismus eingehen und mit Glycerin-3-phosphat (G3P) zu Phosphatidsäure (PA) verestert werden. PA ist der Ausgangspunkt für die Synthese von neutralen und polaren Lipiden. Die neutralen Lipide werden dabei über den Kennedy-Weg am Endoplasmatischen Reticulum synthetisiert (Voelker (1996) Genetic Engineering, Setlow (ed.) 18: 111-113; Shankline & Cahoon (1998) Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 49: 611-649; Frentzen (1998) Lipids 100: 161-166). Neben der Biosynthese Triacylglyceriden dient G3P auch der Synthese von Glycerol (z. B. zur Osmoregulation und gegen Kältestress).
Das für die Synthese wesentliche G3P wird dabei durch Reduktion von Dihydroxyacetonphosphat (DHAP) mittels der Glycerin-3-Phosphat-Dehydrogenase (G3PDH), auch als Dihydroxyacetonphosphatreduktase bezeichnet, synthetisiert. Dabei fungiert in der Regel NADH als reduzierendes Cosubstrat (EC 1.1.1.8). Eine weitere Klasse von Glycerin-3-Phosphat-Dehydrogenasen (EC 1.1.99.5) verwendet FAD als Cosubstrat. Die Enzyme dieser Klasse katalysieren die Reaktion von DHAP zu G3P. In eukaryontischen Zellen sind die beiden Enzymklassen in unterschiedlichen Kompartimenten verteilt, wobei die NAD-abhängigen cytosolisch und die FAD- abhängigen mitochondriell lokalisiert sind (für Saccharomyces cerevisiae siehe z. B. Larsson et al., 1998, Yeast 14: 347-357). EP-A 0 353 049 beschreibt eine NAD-unabhängige G3PDH aus Bacillus sp. Auch in Saccharomyces cerevisiae wurde eine NAD-unabhängige G3PDH identifiziert (Miyata K, Nagahisa M (1969) Plant Cell Physiol 10(3): 635-643).
G3PDH ist ein essentielles Enzym in Prokaryoten und Eukaryoten, das neben der Funktion in der Lipidbiosynthese auch für die Aufrechterhaltung des zellulären Redoxstatus durch den Einfluss auf das NAD+/NADH Verhältnis mitverantwortlich ist. Die Deletion des GPD2 Gens in Saccharomyces cerevisae (eine von zwei Isoformen der G3PDH in dieser Hefe) hat ein vermindertes Wachstum unter anaeroben Bedingungen zur Folge. Darüberhinaus scheint die G3PDH eine Rolle in der Stressantwort der Hefe v. a. gegen osmotischen Stress zu spielen. Die Deletion des GPD1 Gens bedingt in Saccharomyces cerevisae eine Hypersensitivität gegen Salz.
Sequenzen für G3PDHs wurden beschrieben für Insekten (Drosophila melanogaster, Drosophila virilis), Pflanzen (Arabidopsis thaliana, Cuphea lanceolata), Säugern (Homo sapiens, Mus musculus, Sus scrofa, Rattus norvegicus), Fischen (Salmo salar, Osmerus mordax), Vögeln (Ovis aries), Amphibien (Xenopus laevis), Nematoden (Caenorhabditis elegans), Algen und Bakterien.
Pflanzliche Zellen weisen mindestens zwei Isoformen der G3PDH auf, eine cytoplasmatische und eine plastidäre (Gee RW et al. (1988) Plant Physiol 86: 98-103; Gee RW et al. (1988) Plant Physiol 87: 379-383). Die enzymatische Aktivität der Glycerin-3- Phosphat-Dehydrogenase wurde bei Pflanzen erstmals in Kartoffelknollen festgestellt (Santora GT et al. (1979) Arch Biochem Biophys 196: 403-411). Weitere zytosolisch und plastidär lokalisierte G3PDH Aktivitäten wurden in anderen Pflanzen wie Erbse, Mais oder Soja detektiert (Gee RW et al. (1988) PLANT PHYSIOL 86(1): 98-103). Beschrieben sind ferner G3PDHs aus Algen wie z. B. zwei plastidäre und einer zytosolische G3PDH-Isoform aus Dunaliella tertiolecta (Gee R et al. (1993) Plant Physiol 103(1): 243-249; Gee R et al. (1989) PLANT PHYSIOL 91(1): 345-351). Für die pflanzliche G3PDH aus Cuphea lanceolata wurde vorgeschlagen, durch Überexpression in Pflanzen eine Erhöhung des Ölgehaltes oder eine Verschiebung im Fettsäuremuster zu erreichen (WO 95/06733). Entsprechende Effekte konnten jedoch nicht belegt werden.
Bakterielle G3PDHs und ihre Funktion sind beschrieben (Hsu und Fox (1970) J Bacteriol 103: 410-416; Beil (1974) J Bacterial 117: 1065-1076).
WO 01/21820 beschreibt die heterologe Expression einer mutierten E. coli G3PDH für erhöhte Stresstoleranz und Änderung der Fettsäurezusammensetzung in Speicherölen. Die mutierte E. coli G3PDH (gpsA2FR) weist einen einzelnen Aminosäureaustausch auf, der eine verinderte Inhibition durch G3P bedingt. Die heterologe Expression der gpsA2FR Mutante führt zu Glycerolipiden mit einem erhöhten Anteil an C18-Fettsäuren und einem einhergehenden verminderten Anteil an C18-Fettsäuren. Die Veränderungen im Fettsäuremuster sind relativ gering: Ein Anstieg von 2 bis 5% an 16 : 0 Fettsäuren und 1,5 bis 3,5% bei 16 : 3 Fettsäuren, sowie eine Verminderung an 18 : 2 und 18 : 3 Fettsäuren um 2 bis 5% wurde beobachtet. Der Gesamtgehalt als Glycerolipiden blieb unbeeinflusst.
Beschrieben sind ferner G3PDH aus Hefen (Ascomyceten) wie

a) Schizosaccharomyces pombe (Pidoux AL et al. (1990) Nucleic Acids Res 18 (23): 7145; GenBank Acc.-No.: X56162; Ohmiya R et al. (1995) Mol Microbiol 18(5): 963-73; GenBank Acc.-No.: D50796, D50797),
b) Yarrowia lipolytica (GenBank Acc.-No.: AJ250328)
c) Zygosaccharomyces rouxii (Iwaki T et al. Yeast (2001) 18(8): 737-44; GenBank Acc.-No: AB047394, AB047395, AB047397) oder
d) Saccharomyces cerevisiae (Albertyn J et al. (1994) Mol Cell Biol 14(6): 4135-44; Albertyn J et al. (1992) FEBS LETT 308(2): 130-132; Merkel JR et al. (1982) Anal Biochem 122 (1): 180-185; Wang HT et al. (1994) J Bacteriol. 176(22): 7091-5; Eriksson P et al. (1995) Mol Microbiol. 17(1): 95-107; GenBank Acc.-No.: U04621, X76859, Z35169).

Es stellte sich daher die Aufgabe alternative Verfahren zur Erhöhung des Ölgehaltes in Pflanzen bereitzustellen. Diese Aufgabe wird durch die vorliegende Erfindung gelöst.
Ein erster Gegenstand der Erfindung umfasst ein Verfahren zum Erhöhen des Gesamtölgehalt in einem pflanzlichen Organismus oder einem Gewebe, Organ, Teil oder Zelle desselben, umfassend

a) transgene Expression einer Glycerol-3-phosphat Dehydrogenase aus einer Hefe in besagtem pflanzlichen Organismus oder einem Gewebe, Organ, Teil oder Zelle desselben und
b) Auswahl von pflanzlichen Organismen, bei denen - im Unterschied oder Vergleich zur Ausgangsorganismus - der Gesamtölgehalt in dem besagten pflanzlichen Organismus oder einem Gewebe, Organ, Teil oder Zelle desselben erhöht ist.

Überraschenderweise konnte festgestellt werden, dass die samenspezifische heterologe Expression des Hefeproteins Gpd1p (G3PDH aus Saccharomyces cerevisiae; SEQ ID NO: 2) in Arabidopsis-Samen zu einer signifikanten Erhöhung des Gehalts an Triacylglyceriden (Speicheröle) führt. Der Ölgehalt wurde dabei um etwa 22%, in einer transgenen Linie sogar um 41%, verglichen mit Wildtyp- Kontrollpflanzen gesteigert (siehe Fig. 1). Die transgene Expression der Glycerol 3-phosphat Dehydrogenase aus Hefe zeigte keine nachteiligen Effekte auf das Wachstum oder andere Eigenschaften der transformierten Pflanzen.
Da G3PDH ein Schlüsselenzym der Biosynthese in allen pflanzlichen Organismen ist, kann das erfindungsgemäße Verfahren im Prinzip auf alle Pflanzenarten - neben der als Modelpflanze eingesetzten Art Arabidopsis thaliana - angewendet werden. Bevorzugt wird das erfindungsgemäße Verfahren auf Ölpflanzen angewendet, die bereits natürlicherweise einen hohen Ölgehalt aufweisen und/oder zu industriellen Gewinnung von Ölen verwendet werden.
"Pflanzlicher Organismus oder Gewebe, Organ, Teil, Zelle oder Vermehrungsgut desselben" meint allgemein jeden ein oder mehrzelligen Organismus oder ein Zelle, Gewebe, Teile oder Vermehrungsgut (wie Samen oder Früchte) desselben, der zur Photosynthese befähigt ist. Eingeschlossen sind im Rahmen der Erfindung alle Gattungen und Arten höherer und niederer Pflanzen des Pflanzenreiches. Einjährige, mehrjährige, monocotyledone und dicotyledone Pflanzen sind bevorzugt. Eingeschlossen sind reife Pflanze, Saatgut, Sprosse und Keimlinge, sowie davon abgeleitete Teile, Vermehrungsgut (zum Beispiel Knollen, Samen oder Früchte) und Kulturen, zum Beispiel Zell- oder Kalluskulturen. Reife Pflanzen meint Pflanzen zu jedem beliebigen Entwicklungsstadium jenseits des Keimlings. Keimling meint eine junge, unreife Pflanze in einem frühen Entwicklungsstadium.
"Pflanze" im Rahmen der Erfindung meint alle Gattungen und Arten höherer und niederer Pflanzen des Pflanzenreiches. Eingeschlossen unter dem Begriff sind die reifen Pflanzen, Saatgut, Sprossen und Keimlinge, sowie davon abgeleitete Teile, Vermehrungsgut, Pflanzenorgane, Gewebe, Protoplasten, Kallus und andere Kulturen, zum Beispiel Zellkulturen, sowie alle anderen Arten von Gruppierungen von Pflanzenzellen zu funktionellen oder strukturellen Einheiten. Reife Pflanzen meint Pflanzen zu jedem beliebigen Entwicklungsstadium jenseits des Keimlings. Keimling meint eine junge, unreife Pflanze in einem frühen Entwicklungsstadium. "Pflanze" umfasst alle einjährigen und mehrjährige, monokotyledonen und dikotyledonen Pflanzen und schließt beispielhaft jedoch nicht einschränkend solche der Gattungen Cucurbita, Rosa, Vitis, Juglans, Fragaria, Lotus, Medicago, Onobrychis, Trifolium, Trigonella, Vigna, Citrus, Linum, Geranium, Manihot, Daucus, Arabidopsis, Brassica, Raphanus, Sinapis, Atropa, Capsicum, Datura, Hyoscyamus, Lycopersicon, Nicotiana, Solarium, Petunia, Digitalis, Majorana, Ciahorium, Helianthus, Lactuca, Bromus, Asparagus, Antirrhinum, Heterocallis, Nemesis, Pelargonium, Panieum, Pennisetum, Ranunculus, Senecio, Salpiglossis, Cucumis, Browaalia, Glycine, Pisum, Phaseolus, Lolium, Oryza, Zea, Avena, Hordeum, Secale, Triticum, Sorghum, Picea und Populus ein.
Bevorzugt sind Pflanzen nachfolgender Pflanzenfamilien: Amaranthaceae, Asteraceae, Brassicaceae, Carophyllaceae, Chenopodiaceae, Compositae, Cruciferae, Cucurbitaceae, Labiatae, Leguminosae, Papilionoideae, Liliaceae, Linaceae, Malvaceae, Rosaceae, Rubiaceae, Saxifragaceae, Scrophulariaceae, Solanacea, Sterculiaceae, Tetragoniacea, Theaceae, Umbelliferae.
Bevorzugte monokotyle Pflanzen sind insbesondere ausgewählt aus den monokotylen Kulturpflanzen, wie zum Beispiel der Familie der Gramineae wie Reis, Mais, Weizen oder andere Getreidearten wie Gerste, Hirse, Roggen, Triticale oder Hafer sowie dem Zuckerrohr sowie alle Arten von Gräsern.
Die Erfindung wird ganz besonders bevorzugt aus dikotyledone pflanzliche Organismen angewendet. Bevorzugte dikotyle Pflanzen sind insbesondere ausgewählt aus den dikotylen Kulturpflanzen, wie zum Beispiel

- Asteraceae wie Sonnenblume, Tagetes oder Calendula und andere mehr,
- Compositae, besonders die Gattung Lactuca, ganz besonders die Art sativa (Salat) und andere mehr,
- Cruciferae, besonders die Gattung Brassica, ganz besonders die Arten napus (Raps), campestris (Rübe), oleracea cv Tastie (Kohl), oleracea cv Snowball Y (Blumenkohl) und oleracea cv Emperor (Broccoli) und weitere Kohlarten; und der Gattung Arabidopsis, ganz besonders die Art thaliana sowie Kresse oder Canola und andere mehr,
- Cucurbitaceae wie Melone, Kürbis oder Zucchini und andere mehr,
- Leguminosae besonders die Gattung Glycine, ganz besonders die Art max (Sojabohne) Soja sowie Alfalfa, Erbse, Bohnengewächsen oder Erdnuss und andere mehr
- Rubiaceae, bevorzugt der Unterklasse Lamiidae wie beispielsweise Coffea arabica oder Coffea liberica (Kaffeestrauch) und andere mehr,
- Solanaceae besonders die Gattung Lycopersicon, ganz besonders die Art esculentum (Tomate) und die Gattung Solanum, ganz besonders die Art tuberosum (Kartoffel) und melongena (Aubergine) sowie Tabak oder Paprika und andere mehr,
- Sterculiaceae, bevorzugt der Unterklasse Dilleniidae wie beispielsweise Theobroma cacao (Kakaostrauch) und andere mehr,
- Theaceae, bevorzugt der Unterklasse Dilleniidae wie beispielsweise Camellia sinensis oder Thea sinensis (Teestrauch) und andere mehr,
- Umbelliferae, besonders die Gattung Daucus (ganz besonders die Art carota (Karrotte)) und Apium (ganz besonders die Art graveolens dulce (Selarie)) und andere mehr; und die Gattung Capsicum, ganz besonders die Art annum (Pfeffer) und andere mehr,

Umfasst sind ferner Schmuckpflanzen, Nutz- oder Zierbäume, Blumen, Schnittblumen, Sträucher oder Rasen. Beispielhaft aber nicht einschränkend seien zu nennen Angiospermen, Bryophyten wie zum Beispiel Hepaticae (Leberblümchen) und Musci (Moose); Pteridophyten wie Farne, Schachtelhalm und Lycopoden; Gymnospermen wie Koniferen, Cycaden, Ginkgo und Gnetalen, die Familien der Rosaceae wie Rose, Ericaceae wie Rhododendrons und Azaleen, Euphorbiaceae wie Weihnachtssterne und Kroton, Caryophyllaceae wie Nelken, Solanaceae wie Petunien, Gesneriaceae wie das Usambaraveilchen, Balsaminaceae wie das Springkraut, Orchidaceae wie Orchideen, Iridaceae wie Gladiolen, Iris, Freesie und Krokus, Compositae wie Ringelblume, Geraniaceae wie Geranien, Liliaceae wie der Drachenbaum, Moraceae wie Ficus, Araceae wie Philodendron und andere mehr.
Pflanzliche Organismen im Sinne der Erfindung sind weiterhin weitere photosynthetisch aktive befähigte Organismen, wie zum Beispiel Algen, Cyanobakterien sowie Moose. Bevorzugte Algen sind Grünalgen, wie beispielsweise Algen der Gattung Haematococcus, Phaedactylum tricornatum, Volvox oder Dunaliella. Insbesondere bevorzugt ist Synechocystis.
Am meisten bevorzugt sind Ölpflanzen. Ölpflanzen meint Pflanzen, die bereits natürlicherweise einen hohen Ölgehalt aufweisen und/oder zu industriellen Gewinnung von Ölen verwendet werden. Diese Pflanzen können einen hohen Ölgehalt und/oder aber eine besondere, industriell interessante Fettsäurezusammensetzung aufweisen. Bevorzugt sind Pflanzen, die einen Lipidanteil von mindestens 1 Gew.-% aufweisen. Ölpflanzen umfassen beispielhaft: Bovago oficinalis (Borretsch); Brassica Arten wie B. campestris, B. napus, B. rapa (Senf, Raps oder Rübsel); Cannabis sativa (Hanf); Curthamus tinctorius (Färberdiestel); Cocos nucifera (Kokosnuss); Crambe abyssinica (Krambe); Cuphea Arten (Cuphea Arten liefern fettsäuren von mittlerer Kettenlänge insbesondere für industrielle Anwendungen); Elaeis guinensis (Afrikanische Ölpalme); Ekels oleiferu (Amerikanische Ölpalme); Glycine max (Sojabohne); Gossypium hirisfum (Amerikanische Baumwolle); Gossypium barbadense (Ägyptische Baumwolle); Gossypium herbaceum (Asiatische Baumwolle); Helianthus annus (Sonnenblume); Linum usitatissimum (Lein oder Flachs); Oenethem biennis (Nachtkerze); Ozea europea (Olive); Oryza sativa (Rice); Ricinus communis (Castor); Sesamum indicum (Sesam); Triticum Arten (Weizen); Zea maize (Mais) sowie verschiedene Nussarten wie beispielsweise Walnuss oder Mandel.
"Gesamtölgehalt" meint die Summe aller Öle, bevorzugt die Summe die Triacylglyceride.
"Öle" umfasst neutrale und/oder polare Lipiden und Mischungen derselben. Beispielhaft jedoch nicht einschränkend seien die in Tabelle 1 aufgeführten zu nennen. Tab. 1 Pflanzliche Lipidklassen
Neutrale Lipide meint bevorzugt Triacylglyceride. Sowohl die neutralen als auch die polaren Lipide können ein breites Spektrum an verschiedenen Fettsäuren enthalten. Beispielhaft jedoch nicht einschränkend seien die in Tabelle 2 aufgeführten Fettsäuren zu nennen. Tab. 2 Übersicht über verschiedene Fettsäuren (Auswahl)
Öle meint bevorzugt Samenöle.
"Erhöhung" des GesamtÖlgehaltes meint die Steigerung des Gehaltes an Ölen in einer Pflanze oder einem Teil, Gewebe oder Organ derselben, bevorzugt in den Samenorganen der Pflanze. Dabei ist der Ölgehalt im Vergleich zu einer nicht dem erfindungsgemäßen Verfahren unterworfenen, aber ansonsten unveränderten Ausgangspflanze unter ansonsten gleichen Rahmenbedingungen um mindestens 5%, bevorzugt mindestens 10%, besonders bevorzugt mindestens 15%, ganz besonders bevorzugt mindestens 20%, am meisten bevorzugt mindestens 25% erhöht. Rahmenbedingungen meint dabei alle für die Keimung, Kultivierung oder Wachstum der Pflanze relevanten Bedingungen wir Boden-, Klima- oder Lichtverhältnisse, Düngung, Bewässerung, Pflanzenschutzmaßnahmen usw.
"Glycerol 3-phosphat Dehydrogenase aus Hefe" (infolge "Hefe G3PDH") meint allgemein all solche Enzyme, die in der Lage sind, Dihydroxyacetonphosphat (DHAP) zu Glycerol-3-phosphat (G3P) - bevorzugt unter Verwendung eines Cosubstrates wie NADH - umzusetzen und natürlicherweise in einer Hefe exprimiert werden.
Hefen meint eine die Gruppe einzelliger Pilze mit ausgeprägter Zellwand und Bildung von Pseudomyzel (im Ggs. zu Schimmelpilzen). Ihre Vermehrung erfolgt vegetativ durch Sprossung und/oder Spaltung (Schizosaccharomyces bzw. Saccharomycodes).
Umfasst sind sogenannte unechte Hefen, und zwar bevorzugt die Familien Cryptococcaceae, Sporobolomycetaceae mit den Gattungen Cryptococcus, Torulopsis, Pityrosporum, Brettanomyces, Candida, Kloeckera, Trigonopsis, Trichosporon, Rhodotorula bzw. Sporobolomyces und Bullera, sowie echte Hefen (Hefen mit auch geschlechtlicher Vermehrung; Ascus), und zwar bevorzugt die Familien Endo- u. Saccharomycetaceae, mit den Gattungen Saccharo-, Debaro-, Lipomyces, Hansenula, Endomycopsis, Pichia, Hanseniaspora. Am meisten bevorzugt sind die Arten Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, Hansenula polymorpha, Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces lactis, Zygosaccharomyces rouxii und Yarrowia lipolitica.
Hefe G3PDH meint insbesondere Polypeptide die als "wesentlichen Eigenschaften" nachfolgende Eigenschaften aufweisen:

a) die Umsetzung von Dihydroxyacetonphosphat zu Glycerin-3-phosphat unter Verwendung von NADH als Cosubstrat (EC 1.1.1.8), und
b) eine Peptidsequenz umfassend mindestens ein Sequenzmotiv ausgewählt aus der Gruppe von Sequenzmotiven bestehend aus
- a) GSGNWGT(A/T)IAK (SEQ ID NO: 22)
- b) H(E/Q)NVKYL (SEQ ID NO: 23)
- c) (D/N)(I/V)(L/I)V(F/W)(V/N)(L/I/V)PHQF(V/L/I) (SEQ ID NO: 24)
- d) (A/G)(I/V)SC(L/I)KG (SEQ ID NO: 25)
- e) CG(V/A)LSGAN(L/I/V)AXE(V/I)A (SEQ ID NO: 26)
- f) (L/V)FXRPYFXV (SEQ ID NO: 27)
- g) G(L/M)(L/G)E(M/I)(I/Q)(R/K/N)F(G/S/A) (SEQ ID NO: 28)
bevorzugt ist das Sequenzmotiv ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus
- a) GSGNWGTTIAKV(V/I)AEN (SEQ ID NO: 29)
- b) NT(K/R)HQNVKYLP (SEQ ID NO: 30)
- c) D(I/V)LVFN(I/V)PHQFL (SEQ ID NO: 31)
- d) RA(I/V)SCLKGFE (SEQ ID NO: 32)
- e) CGALSGANLA(P/T)EVA (SEQ ID NO: 33)
- f) LFHRPYFHV (SEQ ID NO: 34)
- g) GLGEII(K/R)FG (SEQ ID NO: 35)
besonders bevorzugt enthält die Peptidsequenz mindestens 2 oder 3, ganz besonders bevorzugt mindestens 4 oder 5, am meisten bevorzugt alle der Sequenzmotive ausgewählt aus der Gruppe der Sequenzmotive i), ii), iii), iv), v), vi und vii) oder ausgewählt aus der Gruppe viii), ix), x), xi), xii), xiii und xiv). (Angaben in Klammern meinen alternativ mögliche Aminosäuren an dieser Position; z. B. mein (V/I), dass an dieser Position Valin oder Isoleucin möglich ist).

Am meisten bevorzugt meint Hefe G3PDH das Hefeproteins Gpd1p gemäß SEQ ID NO: 2, sowie funktionelle Äquivalente als auch funktionell äquivalente Teile der vorgenannten.
Funktionelle Äquivalente meint insbesondere natürliche oder künstliche Mutationen des Hefeproteins Gpd1p gemäß SEQ ID NO: 2 sowie homologe Polypeptide aus anderen Hefen, die die gleichen wesentlichen Eigenschaften einer Hefe G3PDH, entsprechend oben gegebener Definition, aufweisen. Mutationen umfassen Substitutionen, Additionen, Deletionen, Inversion oder Insertionen eines oder mehrerer Aminosäurereste. Insbesondere Bevorzugt sind die Polypeptide beschrieben durch SEQ ID NO: 4, 5, 7, 9, 11, 12, 14 oder 16.
Die zu den im Rahmen dieser Erfindung vorteilhaft einzusetzenden Hefe G3PDH können durch Datenbanksuche oder Durchmustern von Gen- oder cDNA-Bibliotheken - unter Verwendung der beispielhaft aufgeführten Hefe G3PDH-Sequenz gemäß SEQ ID NO: 2 oder der für dieses kodierenden Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1 als Suchsequenz bzw. Sonde - leicht aufgefunden werden.
Bevorzugt haben besagte funktionelle Äquivalente eine Homologie von mindestens 60%, besonders bevorzugt mindestens 70%, besonders bevorzugt mindestens 80%, am meisten bevorzugt mindestens 90% zu dem Protein mit der SEQ ID NO: 2.
Unter Homologie zwischen zwei Polypeptiden wird die Identität der Aminosäuresequenz über die gesamte Sequenzlänge verstanden, die durch Vergleich mit Hilfe des Programmalgorithmus GAP (Wisconsin Package Version 10.0, University of Wisconsin, Genetics Computer Group (GCG), Madison, USA) unter Einstellung folgender Parameter berechnet wird:
Gap Weight: 8
Average Match: 2,912
Length Weight: 2
Average Mismatch: -2,003
Beispielhaft wird unter einer Sequenz, die eine Homologie von mindestens 80% auf Proteinbasis mit der Sequenz SEQ ID NO: 2 aufweist, eine Sequenz verstanden, die bei einem Vergleich mit der Sequenz SEQ ID NO: 2 nach obigem Programmalgorithmus mit obigem Parametersatz eine Homologie von mindestens 80% aufweist.
Funktionelle Äquivalente umfasst auch solche Proteine, die durch Nukleinsäuresequenzen kodiert werden, die eine Homologie von mindestens 60%, besonders bevorzugt mindestens 70%, besonders bevorzugt mindestens 80%, am meisten bevorzugt mindestens 90% zu der Nukleinsäuresequenz mit der SEQ ID NO: 1 haben.
Unter Homologie zwischen zwei Nukleinsäuresequenzen wird die Identität der beiden Nukleinsäuresequezen über die gesamte Sequenzlänge verstanden, die durch Vergleich mit Hilfe des Programmalgorithmus GAP (Wisconsin Package Version 10.0, University of Wisconsin, Genetics Computer Group (GCG), Madison, USA; Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3389ff) unter Einstellung folgender Parameter berechnet wird:
Gap Weight: 50
Average Match: 10
Length Weight: 3
Average Mismatch: 0
Beispielhaft wird unter einer Sequenz, die eine Homologie 1 von mindestens 80% auf Nukleinsäurebasis mit der Sequenz SEQ ID NO: 1 aufweist, eine Sequenz verstanden, die bei einem Vergleich mit der Sequenz SEQ ID NO: 1 nach obigem Programmalgorithmus mit obigem Parametersatz eine Homologie von mindestens 80% aufweist.
Funktionelle Äquivalente umfasst auch solche Proteine, die durch Nukleinsäuresequenzen kodiert werden, die unter Standardbedingungen mit einer der durch SEQ ID NO: 1 beschriebenen Nukleinsäuresequenz, der zu dieser komplementären Nukleinsäuresequenz oder Teilen der vorgenannten hybridisieren und die wesentlichen Eigenschaften einer Hefe G3PDH aufweisen.
"Standardhybridisierungsbedingungen" ist breit zu verstehen, meint aber bevorzugt stringent Hybridisierungsbedingungen. Solche Hybridisierungsbedingungen sind unter anderem bei Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T et al., in Molecular Cloning (A Laboratory Manual), 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, Seiten 9.31-9.57) oder in Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y. (1989), 6.3.1-6.3.6. beschrieben. Beispielhaft können die Bedingungen während des Waschschrittes ausgewählt sein aus dem Bereich von Bedingungen mit hoher Stringenz (mit ungefähr 0,2 × SSC bei 50°C bevorzugt bei 65°C) (20 × SSC: 0,3 M Natriumcitrat, 3 M NaCl, pH 7,0). Während der Hybridisierung können auch denaturierende Agenzien wie zum Beispiel Formamid oder SDS eingesetzt werden. In Gegenwart von 50% Formamid wird die Hybridisierung bevorzugt bei 42°C ausgeführt.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft transgene Expressionskonstrukte, die eine transgene Expression einer Hefe G3PDH, in einem pflanzlichen Organismus oder einem Gewebe, Organ, Teil Zellen oder Vermehrungsmaterial des besagten pflanzlichen Organismus gewährleisten können.
Für die Hefe G3PDH gilt dabei die oben genannte Definition, besonders bevorzugt ist die transgene Expression einer Hefe G3PDH beschrieben durch die Sequenz mit der SEQ ID NO: 2.
In besagten transgenen Expressionskonstrukten steht ein Nukleinsäuremolekül kodierend für eine Hefe G3PDH bevorzugt in funktioneller Verknüpfung mit mindestens einem genetischen Kontrollelement (beispielsweise einem Promotor), das eine Expression in einem pflanzlichen Organismus oder einem Gewebe, Organ, Teil, Zelle oder Vermehrungsmaterial desselben gewährleistet.
Unter einer funktionellen Verknüpfung versteht man zum Beispiel die sequentielle Anordnung eines Promotors mit der zu exprimierenden Nukleinsäuresequenz kodierend für eine Hefe G3PDH (zum Beispiel der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 1) und ggf. weiterer regulativer Elemente wie zum Beispiel einem Terminator derart, dass jedes der regulativen Elemente seine Funktion bei der transgenen Expression der Nukleinsäuresequenz erfüllen kann. Dazu ist nicht unbedingt eine direkte Verknüpfung im chemischen Sinne erforderlich. Genetische Kontrollsequenzen, wie zum Beispiel Enhancer-Sequenzen, können ihre Funktion auch von weiter entfernten Positionen oder gar von anderen DNA-Molekülen aus auf die Zielsequenz ausüben. Bevorzugt sind Anordnungen, in denen die transgen zu exprimierende Nukleinsäuresequenz hinter der als Promoter fungierenden Sequenz positioniert wird, so dass beide Sequenzen kovalent miteinander verbunden sind. Bevorzugt ist dabei der Abstand zwischen der Promotorsequenz und der transgen zu exprimierende Nukleinsäuresequenz geringer als 200 Basenpaare, besonders bevorzugt kleiner als 100 Basenpaare, ganz besonders bevorzugt kleiner als 50 Basenpaare.
Die Herstellung einer funktionellen Verknüpfung als auch die Herstellung einer transgenen Expressionskassette kann mittels gängiger Rekombinations- und Klonierungstechniken realisiert werden, wie sie beispielsweise in Maniatis T, Fritsch EF und Sambrook J (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor (NY), in Silhavy TJ, Berman ML und Enquist LW (1984) Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor (NY), in Ausubel FM et al. (1987) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience und bei Gelvin et al. (1990) In: Plant Molecular Biology Manual beschrieben sind. Zwischen beide Sequenzen können aber auch weitere Sequenzen positioniert werden, die zum Beispiel die Funktion eines Linkers mit bestimmten Restriktionsenzymschnittstellen oder eines Signalpeptides haben. Auch kann die Insertion von Sequenzen zur Expression von Fusionsproteinen führen. Bevorzugt kann die Expressionskassette, bestehend aus einer Verknüpfung von Promoter und zu exprimierender Nukleinsäureseguenz, integriert in einem Vektor vorliegen und durch zum Beispiel Transformation in ein pflanzliches Genom insertiert werden.
Unter einer transgenen Expressionskassette sind aber auch solche Konstruktionen zu verstehen, bei denen die Nukleinsäuresequenz kodierend für eine Hefe G3PDH so hinter einen endogenen, pflanzlichen Promotor platziert wird, das dieser die Expression der Hefe G3PDH bewirkt.
Bevorzugt werden in den transgenen Expressionskassetten Promotoren eingesetzt, die in einem pflanzlichen Organismus oder einem Gewebe, Organ, Teil, Zelle oder Vermehrungsmaterial desselben funktionell sind. In pflanzlichen Organismen funktionelle Promotoren meint grundsätzlich jeden Promotor, der die Expression von Genen, insbesondere Fremdgenen, in Pflanzen oder Pflanzenteilen, -zellen, -geweben, -kulturen steuern kann. Dabei kann die Expression beispielsweise konstitutiv, induzierbar oder entwicklungsabhängig sein.
Bevorzugt sind:

a) Konstitutive Promotoren

"Konstitutive" Promotoren meint solche Promotoren, die eine Expression in zahlreichen, bevorzugt allen, Geweben über einen größeren Zeitraum der Pflanzenentwicklung, bevorzugt zu allen Zeitpunkten der Pflanzenentwicklung, gewährleisten (Benfey et al. (1989) EMBO J 8: 2195-2202). Vorzugsweise verwendet man insbesondere einen pflanzlichen Promotor oder einen Promotor, der einem Pflanzenvirus entstammt. Insbesondere bevorzugt ist der Promotor des 35S-Transkriptes des CaMV Blumenkohlmosaikvirus (Franck et al. (1980) Cell 21: 285-294; Odell et al. (1985) Nature 313: 810-812; Shewmaker et al. (1985) Virology 140: 281-288; Gardner et al. (1986) Plant Mol Biol 6: 221-228) oder der 195 CaMV Promotor (US 5,352,605; WO 84/02913; Benfey et al. (1989) EMBO J 8: 2195-2202). Ein weiterer geeigneter konstitutiver Promotor ist der "Rubisco small subunit (SSU)"-Promotor (US 4,962,028), der LeguminB-Promotor (GenBank Acc.-Nr. X03677), der Promotor der Nopalinsynthase aus Agrobacterium, der TR-Doppelpromotor, der OCS (Octopin Synthase) Promotor aus Agrobacterium, der Ubiquitin Promotor (Holtorf S et al. (1995) Plant Mol Biol 29: 637-649), den Ubiquitin 1 Promotor (Christensen et al. (1992) Plant Mol Biol 18: 675-689; Bruce et al. (1989) Proc Natl Acad Sci USA 86: 9692-9696), den Smas Promotor, den Cinnamylalkoholdehydrogenase-Promotor (US 5,683,439), die Promotoren der vakuolärer ATPase Untereinheiten, den Promotor des Nitrilase-1 Gens aus Arabidopsis thaliana (GenBank Acc.-No.: U38846, Nukleotide 3862 bis 5325 oder alternativ 5342) oder der Promotor eines prolinreichen Proteins aus Weizen (WO 91/13991), sowie weitere Promotoren von Genen, deren konstitutive Expression in Pflanzen dem Fachmann bekannt ist. Besonders bevorzugt sind der CaMV 35S-Promotor und der Nitrilase-1 Promotor aus Arabidopsis thaliana.

b) Gewebespezifische Promotoren

Bevorzugt sind ferner Promotoren mit Spezifitäten für Samen, wie zum Beispiel der Promotor des Phaseolins (US 5,504,200; Bustos mm et al. (1989) Plant Cell 1(9): 839-53), des 25 Albumingens (Joseffson LG et al. (1987) J Biol Chem 262: 12196-12201), des Legumins (Shirsat A et al. (1989) Mol Gen Genet 215(2): 326-331), des USP (unknown seed protein; Bäumlein H et al. (1991) Mol Gen Genet 225(3): 459-67), des Napin Gens (US 5,608,152; Stalberg K et al. (1996) L Planta 199: 515-519), des Saccharosebindeproteins (WO 00/26388) oder der Legumin B4-Promotor (LeB4; Bäumlein H et al. (1991) Mol Gen Genet 225: 121-128; Baeumlein et al. (1992) Plant Journal 2(2): 233-9; Fiedler U et al. (1995) Biotechnology (NY) 13(10): 1090f), der Oleosin-Promoter aus Arabidopsis (WO 98/45461), der Bce4-Promoter aus Brassica (WO 91/13980).
Weitere geeignete samenspezifische Promotoren sind die der Gene kodierend für das "High Molecular Weight Glutenin" (HMWG), Gliadin, Verzweigungsenzym, ADP Glucose Pyrophosphatase (AGPase) oder die Stärkesynthase. Bevorzugt sind ferner Promotoren, die eine samenspezifische Expression in Monokotyledonen wie Mais, Gerste, Weizen, Roggen, Reis etc. erlauben. Vorteilhaft eingesetzt werden können der Promoter des lpt2 oder lpt1-Gen (WO 95/15389, WO 95/23230) oder die Promotoren beschrieben in WO 99/16890 (Promotoren des Hordein-Gens, des Glutelin-Gens, des Oryzin-Gens, des Prolamin-Gens, des Gliadin-Gens, des Glutelin-Gens, des Zein-Gens, des Kasirin-Gens oder des Secalin-Gens).

c) Chemisch induzierbare Promotoren

Die Expressionskassetten können auch einen chemisch induzierbaren Promotor enthalten (Übersichtsartikel: Gatz et al. (1997) Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 48: 89-108), durch den die Expression des exogenen Gens in der Pflanze zu einem bestimmten Zeitpunkt gesteuert werden kann. Derartige Promotoren, wie z. B. der PRP1 Promotor (Ward et al. (1993) Plant Mol Biol 22: 361-366), durch Salicylsäure induzierbarer Promotor (WO 95/19443), ein durch Benzolsulfonamid-induzierbarer Promotor (EP 0 388 186), ein durch Tetrazyklin-induzierbarer Promotor (Gatz et al. (1992) Plant J 2: 397-404), ein durch Abscisinsäure induzierbarer Promotor (EP 0 335 528) bzw. ein durch Ethanol- oder Cyclohexanon-induzierbarer Promotor (WO 93/21334) können ebenfalls verwendet werden. Ferner geeignet ist der Promotor des Glutathione-S-transferase Isoform II Gens (GST-II-27), der durch exogen applizierte Safener wie z. B. N,N-Diallyl-2,2-dichloroacetamid aktiviert werden kann (WO 93/01294) und in zahlreichen Geweben von sowohl Monokotyledonen als auch Dikotyledonen funktionell ist.
Besonders bevorzugt sind konstitutive sowie ganz besonders bevorzugt samenspezifische Promotoren, insbesondere der Napin- und der USP-Promotor.
Es können ferner weitere Promotoren funktionell mit der zu exprimierenden Nukleinsäuresequenz verknüpft sein, die eine Expression in weiteren Pflanzengeweben oder in anderen Organismen, wie zum Beispiel E. coli Bakterien ermöglichen. Als Pflanzen Promotoren kommen im Prinzip alle oben beschriebenen Promotoren in Frage.
Die in den erfindungsgemäßen transgenen Expressionskassetten oder transgenen Vektoren enthaltenen Nukleinsäuresequenzen können mit weiteren genetischen Kontrollsequenzen neben einem Promoter funktionell verknüpft sein. Der Begriff der genetischen Kontrollsequenzen ist breit zu verstehen und meint all solche Sequenzen, die einen Einfluss auf das Zustandekommen oder die Funktion der erfindungsgemäßen Expressionskassette haben. Genetische Kontrollsequenzen modifizieren zum Beispiel die Transkription und Translation in prokaryotischen oder eukaryotischen Organismen. Vorzugsweise umfassen die erfindungsgemäßen transgenen Expressionskassetten 5'-stromaufwärts von der jeweiligen transgen zu exprimierenden Nukleinsäuresequenz einen pflanzenspezifischen Promoter und 3'-stromabwärts eine Terminatorsequenz als zusätzliche genetische Kontrollsequenz, sowie gegebenenfalls weitere übliche regulative Elemente, und zwar jeweils funktionell verknüpft mit der transgen zu exprimierenden Nukleinsäuresequenz.
Genetische Kontrollsequenzen umfassen auch weitere Promotoren, Promotorelemente oder Minimalpromotoren, die die expressionsteuernden Eigenschaften modifizieren können. So kann durch genetische Kontrollsequenzen zum Beispiel die gewebespezifische Expression zusätzlich abhängig von bestimmten Stressfaktoren erfolgen. Entsprechende Elemente sind zum Beispiel für Wasserstress, Abscisinsäure (Lam E und Chua NH, J Biol Chem 1991; 266(26): 17131-17135) und Hitzestress (Schoffl F et al. (1989) Mol Gen Genetics 217(2-3): 246-53) beschrieben.
Weitere vorteilhafte Kontrollsequenzen sind beispielsweise in den gram-positiven Promotoren amy und SPO2, in den Hefe- oder Pilzpromotoren ADC1, MFa, AC, P-60, CYC1, GAPDH, TEF, rp28, ADH.
Prinzipiell können alle natürlichen Promotoren mit ihren Regulationssequenzen wie die oben genannten für das erfindungsgemäße Verfahren verwendet werden. Darüberhinaus können auch synthetische Promotoren vorteilhaft verwendet werden.
Genetische Kontrollsequenzen umfassen ferner auch die 5'-untranslatierte Regionen, Introns oder nichtkodierende 3'-Region von Genen wie beipielsweise das Actin-1 Intron, oder die Adh1-S Introns 1, 2 und 6 (allgemein: The Maize Handbook, Chapter 116, Freeling and Walbot, Eds., Springer, New York (1994)). Es ist gezeigt worden, dass diese eine signifikante Funktionen bei der Regulation der Genexpression spielen können. So wurde gezeigt, dass 5'-untranslatierte Sequenzen die transiente Expression heterologer Gene verstärken können. Beispielhaft für Translationsverstärker sei die 5'-Leadersequenz aus dem Tabak- Mosaik-Virus zu nennen (Gallie et al. (1987) Nucl Acids Res 15: 8693-8711) und dergleichen. Sie können ferner die Gewebsspezifität fördern (Rouster J et al. (1998) Plant J 15: 435-440).
Die transgene Expressionskassette kann vorteilhafterweise eine oder mehrere sogenannte "enhancer Sequenzen" funktionell verknüpft mit dem Promoter enthalten, die eine erhöhte transgene Expression der Nukleinsäuresequenz ermöglichen. Auch am 3'-Ende der transgen zu exprimierenden Nukleinsäuresequenzen können zusätzliche vorteilhafte Sequenzen inseriert werden, wie weitere regulatorische Elemente oder Terminatoren. Die transgen zu exprimierenden Nukleinsäuresequenzen können in einer oder mehreren Kopien im Genkonstrukt enthalten sein.
Als Kontrollsequenzen geeignete Polyadenylierungssignale sind pflanzliche Polyadenylierungssignale, vorzugsweise solche, die im wesentlichen T-DNA Polyadenylierungssignale aus Agrobacterium tumefaciens, insbesondere des Gens 3 der T-DNA (Octopin Synthase) des Ti-Plasmids pTiACHS entsprechen (Gielen et al. (1984) EMBO J 3: 835 ff) oder funktionelle Äquivalente davon. Beispiele für besonders geeignete Terminatorsequenzen sind der OCS (Octopin- Synthase)-Terminator und der NOS (Nopalin-Synthase)-Terminator.
Als Kontrollsequenzen sind weiterhin solche zu verstehen, die eine homologe Rekombination bzw. Insertion in das Genom eines Wirtsorganismus ermöglichen oder die Entfernung aus dem Genom erlauben. Bei der homologen Rekombination kann zum Beispiel die kodierende Sequenz eines bestimmten endogenen Gens gegen die für eine dsRNA kodierende Sequenz gezielt ausgetauscht werden. Methoden wie die cre/lox-Technologie erlauben eine gewebespezifische, unter Umständen induzierbare Entfernung der Expressionskassette aus dem Genom des Wirtsorganismus (Sauer B (1998) Methods. 14(4): 381-92). Hier werden bestimmte flankierende Sequenzen dem Zielgen angefügt (lox-Sequenzen), die später eine Entfernung mittels der cre-Rekombinase ermöglichen.
Eine transgene Expressionskassetten und die von ihr abgeleiteten transgenen Vektoren können weitere Funktionselemente enthalten. Der Begriff Funktionselement ist breit zu verstehen und meint all solche Elemente, die einen Einfluss auf Herstellung, Vermehrung oder Funktion der erfindungsgemäßen Expressionskassetten, Vektoren oder transgenen Organismen haben. Beispielhaft aber nicht einschränkend seien zu nennen:

a) Selektionsmarker, die eine Resistenz gegen einen Metabolismusinhibitor wie 2-Desoxyglucose-6-phosphat (WO 98/45456), Antibiotika oder Biozide, bevorzugt Herbizide, wie zum Beispiel Kanamycin, G 418, Bleomycin, Hygromycin, oder Phosphinotricin etc. verleihen. Besonders bevorzugte Selektionsmarker sind solche die eine Resistenz gegen Herbizide verleihen. Beispielhaft seien genannt: DNA Sequenzen, die für Phosphinothricinacetyltransferasen (PAT) kodieren und Glutaminsynthaseinhibitoren inaktivieren (bar und pat Gen), 5-Enolpyruvylshikimat-3-phosphatsynthasegene (EPSP Synthasegene), die eine Resistenz gegen Glyphosat® (N-(phosphonomethyl)glycin) verleihen, das für das Glyphosat® degradierende Enzyme kodierende gox Gen (Glyphosatoxidoreduktase), das deh Gen (kodierend für eine Dehalogenase, die Dalapon inaktiviert), Sulfonylurea- und Imidazolinon inaktivierende Acetolactatsynthasen sowie bxn Gene, die für Bromoxynil degradierende Nitrilaseenzyme kodieren, das aasa-Gen, das eine Resistenz gegen das Antibiotikum Apectinomycin verleih, das Streptomycinphosphotransferase (SPT) Gen, das eine Resistenz gegen Streptomycin gewährt, das Neomycinphosphotransferas (NPTII) Gen, das eine Resistenz gegen Kanamycin oder Geneticidin verleiht, das Hygromycinphosphotransferase (HPT) Gen, das eine Resistenz gegen Hygromycin vermittelt, das Acetolactatsynthas Gen (ALS), das eine Resistenz gegen Sulfonylharnstoff-Herbizide verleiht (z. B. mutierte ALS-Varianten mit z. B. der S4 und/oder Hra Mutation).
b) Reportergene, die für leicht quantifizierbare Proteine kodieren und über Eigenfarbe oder Enzymaktivität eine Bewertung der Transformationseffizienz oder des Expressionsortes oder -zeitpunktes gewährleisten. Ganz besonders bevorzugt sind dabei Reporter-Proteine (Schenborn E, Groskreutz D. Mol Biotechnol. 1999; 13(1): 29-44) wie das "green fluorescence protein" (GFP) (Sheen et al. (1995) Plant Journal 8(5): 777-784), die Chloramphenicoltransferase, eine Luziferase (Ow et al. (1986) Science 234: 856-859), das Aequorin- Gen (Prasher et al. (1985) Biochem Biophys Res Commun 126(3): 1259-1268), die β-Galactosidase, ganz besonders bevorzugt ist die β-Glucuronidase (Jefferson et al. (1987) EMBO J 6: 3901-3907).
c) Replikationsursprünge, die eine Vermehrung der erfindungsgemäßen Expressionskassetten oder Vektoren in zum Beispiel E. coli gewährleisten. Beispielhaft seien genannt ORI (origin of DNA replication), der pBR322 ori oder der P15A ori (Sambrook et al.: Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2^nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989).
d) Elemente, die für eine Agrobakterium vermittelte Pflanzentransformation erforderlich sind, wie zum Beispiel die rechte oder linke Begrenzung der T-DNA oder die vir-Region.

Zur Selektion erfolgreich homolog rekombinierter oder auch transformierter Zellen ist es in der Regel erforderlich, einen selektionierbaren Marker zusätzlich einzuführen, der den erfolgreich rekombinierten Zellen eine Resistenz gegen ein Biozid (zum Beispiel ein Herbizid), einen Metabolismusinhibitor wie 2-Desoxyglucose-6-phosphat (WO 98/45456) oder ein Antibiotikum verleiht. Der Selektionsmarker erlaubt die Selektion der transformierten Zellen von untransformierten (McCormick et al. (1986) Plant Cell Reports 5: 81-84).
Zusätzlich kann besagte transgene Expressionskassette oder Vektoren weitere Nukleinsäuresequenzen enthalten, die nicht für eine Hefe G3PDH kodieren, und deren transgene Expression zu einer zusätzlichen Steigerung der Fettsäure-Biosynthese führt (infolge proOIL). Diese zusätzlich transgen exprimierte proOIL Nukleinsäuresequenz kann beispielhaft aber nicht einschränkend ausgewählt sein aus Nukleinsäuren kodierend für Acetyl-CoA-Carboxylase (ACCase), Glycerol-3-Phosphat Acyltransferase (GPAT), Lysophosphatidat-Acyltransferase (LPAT), Diacylglycerol-Acyltransferase (DAGAT) und Phospholipid:diacylglycerol-acyltransferase (PDAT). Entsprechende Sequenzen sind dem Fachmann bekannt und aus Datenbanken oder entsprechenden cDNA-Banken der jeweiligen Pflanzen leicht zugänglich.
Die Einführung einer erfindungsgemäßen Expressionskassette in einen Organismus oder Zellen, Geweben, Organe, Teile bzw. Samen desselben (bevorzugt in Pflanzen bzw. pflanzliche Zellen, Gewebe, Organe, Teile oder Samen), kann vorteilhaft unter Verwendung von Vektoren realisiert werden, in denen die transgenen Expressionskassetten enthalten sind. Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft daher besagte transgene Vektoren, die eine transgene Expressionskassette für eine Hefe G3PDH umfassen.
Vektoren können beispielhaft Plasmide, Cosmide, Phagen, Viren oder auch Agrobacterien sein. Die Expressionskassette kann in den Vektor (bevorzugt ein Plasmidvektor) über eine geeignete Restriktionsschnittstelle eingeführt werden. Der entstandene Vektor wird zunächst in E. coli eingeführt. Korrekt transformierte E. coli werden selektioniert, gezüchtet und der rekombinante Vektor mit dem Fachmann geläufigen Methoden gewonnen. Restriktionsanalyse und Sequenzierung können dazu dienen, den Klonierungsschritt zu prüfen. Bevorzugt sind solche Vektoren, die eine stabile Integration der Expressionskassette in das Wirtsgenom ermöglichen.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft transgene pflanzliche Organismen oder Gewebe, Organ, Teil, Zellen oder Vermehrungsgut desselben, die eine Hefe G3PDH entsprechend oben gegebener Definition, eine transgene Expressionskassette für eine Hefe G3PDH oder einen transgenen Vektor umfassend eine solche Expressionskassette enthalten.
Die Herstellung eines entsprechenden transgenen pflanzlichen Organismus erfolgt z. B. mittels Transformation oder Transfektion mittels der entsprechenden Proteine oder Nukleinsäuren. Die Herstellung eines transformierten Organismus (bzw. einer transformierten Zelle oder Gewebes) erfordert, dass die entsprechende DNA (z. B. der Expressionsvektor), RNA oder Protein in die entsprechende Wirtszelle eingebracht wird. Für diesen Vorgang, der als Transformation (oder Transduktion bzw. Transfektion) bezeichnet wird, steht eine Vielzahl von Methoden zur Verfügung (Keown et al. (1990) Methods in Enzymology 185: 527-537). So kann die DNA oder RNA beispielhaft direkt durch Mikroinjektion oder durch Bombardierung mit DNA-beschichteten Mikropartikeln eingeführt werden. Auch kann die Zelle chemisch, zum Beispiel mit Polyethylenglycol, permeabilisiert werden, so dass die DNA durch Diffusion in die Zelle gelangen kann. Die DNA kann auch durch Protoplastenfusion mit anderen DNA-enthaltenden Einheiten wie Minicells, Zellen, Lysosomen oder Liposomen erfolgen. Elektroporation ist eine weitere geeignete Methode zur Einführung von DNA, bei der die Zellen reversibel durch einen elektrischen Impuls permeabilisert werden. Möglich sind ferner das Quellen von Pflanzenteilen in DNA-Lösungen sowie Pollen- oder Pollenschlauchtransformation. Entsprechende Verfahren sind beschrieben (beispielsweise bei Bilang et al. (1991) Gene 100: 247-250; Scheid et al. (1991) Mol Gen Genet 228: 104-112; Guerche et al. (1987) Plant Science 52: 111-116; Neuhause et al. (1987) Theor Appl Genet 75: 30-36; Klein et al. (1987) Nature 327: 70-73; Howell et al. (1980) Science 208: 1265; Horsch et al. (1985) Science 227: 1229-1231; DeBlock et al. (1989) Plant Physiology 91: 694-701; Methods for Plant Molecular Biology (Weissbach and Weissbach, eds.) Academic Press Inc. (1988); and Methods in Plant Molecular Biology (Schuler and Zielinski, eds.) Academic Press Inc. (1989)).
Bei Pflanzen werden dabei die beschriebenen Methoden zur Transformation und Regeneration von Pflanzen aus Pflanzengeweben oder Pflanzenzellen zur transienten oder stabilen Transformation genutzt. Geeignete Methoden sind vor allem die Protoplastentransformation durch Polyethylenglykol-induzierte DNA- Aufnahme, das biolistische Verfahren mit der Genkanone, die sogenannte "particle bombardment" Methode, die Elektroporation, die Inkubation trockener Embryonen in DNA-haltiger Lösung und die Mikroinjektion.
Neben diesen "direkten" Transformationstechniken kann eine Transformation auch durch bakterielle Infektion mittels Agrobacterium tumefaciens oder Agrobacterium rhizogenes und Übertragung von entsprechenden rekombinanten Ti-Plasmiden oder Ri-Plasmiden durch oder durch Infektion mit transgenen Pflanzenviren durchgeführt werden. Die Agrobacterium-vermittelte Transformation ist am besten für dicotyledone Pflanzenzellen geeignet. Die Verfahren sind beispielsweise beschrieben bei Horsch RB et al. (1985) Science 225: 1229f).
Werden Agrobacterien verwendet, so ist die Expressionskassette in spezielle Plasmide zu integrieren, entweder in einen Zwischenvektor (englisch: shuttle or intermediate vector) oder einen binären Vektor. Wird ein Ti oder Ri Plasmid zur Transformation verwendet werden soll, ist zumindest die rechte Begrenzung, meistens jedoch die rechte und die linke Begrenzung der Ti oder Ri Plasmid T-DNA als flankierende Region mit der einzuführenden Expressionskassette verbunden.
Bevorzugt werden binäre Vektoren verwendet. Binäre Vektoren können sowohl in E. coli als auch in Agrobacterium replizieren. Sie enthalten in der Regel ein Selektionsmarkergen und einen Linker oder Polylinker flankiert von der rechten und linken T-DNA Begrenzungssequenz. Sie können direkt in Agrobacterium transformiert werden (Holsters et al. (1978) Mol Gen Genet 163: 181-187). Das Selektionsmarkergen erlaubt eine Selektion transformierter Agrobakteria und ist zum Beispiel das nptII Gen, das eine Resistenz gegen Kanamycin verleiht. Das in diesem Fall als Wirtsorganismus fungierende Agrobacterium sollte bereits ein Plasmid mit der vir-Region enthalten. Diese ist für die Übertragung der T-DNA auf die pflanzliche Zelle erforderlich. Ein so transformiertes Agrobacterium kann zur Transformation pflanzlicher Zellen verwendet werden. Die Verwendung von T-DNA zur Transformation pflanzlicher Zellen ist intensiv untersucht und beschrieben (EP 120 516; Hoekema, In: The Binary Plant Vector System, Offsetdrukkerij Kanters B. V., Alblasserdam, Chapter V; An et al. (1985) EMBO J 4: 277-287). Verschiedene binäre Vektoren sind bekannt und teilweise kommerziell erhältlich wie zum Beispiel pBI101.2 oder pBIN19 (Clontech Laboratories, Inc. USA).
Weitere zur Expression in Pflanzen geeignet Promotoren sind beschrieben (Rogers et al. (1987) Meth in Enzymol 153: 253-277; Schardl et al. (1987) Gene 61: 1-11; Berger et al. (1989) Proc Natl Acad Sci USA 86: 8402-8406).
Direkte Transformationstechniken eignen sich für jeden Organismus und Zelltyp. Im Falle von Injektion oder Elektroporation von DNA bzw. RNA in pflanzliche Zellen sind keine besonderen Anforderungen an das verwendete Plasmid gestellt. Einfache Plasmide wie die der pUC-Reihe können verwendet werden. Sollen vollständige Pflanzen aus den transformierten Zellen regeneriert werden, so ist er erforderlich, das sich auf dem Plasmid ein zusätzliches selektionierbares Markergen befindet.
Stabil transformierte Zellen d. h. solche, die die eingeführte DNA integriert in die DNA der Wirtszelle enthalten, können von untransformierten selektioniert werden, wenn ein selektionierbarer Marker Bestandteil der eingeführten DNA ist. Als Marker kann beispielhaft jedes Gen fungieren, dass eine Resistenz gegen Antibiotika oder Herbizide (wie Kanamycin, G 418, Bleomycin, Hygromycin oder Phosphinotricin etc.) zu verleihen vermag (s. o.). Transformierte Zellen, die ein solches Markergen exprimieren, sind in der Lage, in der Gegenwart von Konzentrationen eines entsprechenden Antibiotikums oder Herbizides zu überleben, die einen untransformierten Wildtyp abtöten. Beispiel sind oben genannt und umfassen bevorzugt das bar Gen, dass Resistenz gegen das Herbizid Phosphinotricin verleiht (Rathore KS et al. (1993) Plant Mol Biol 21(5): 871-884), das nptII Gen, dass Resistenz gegen Kanamycin verleiht, das hpt Gen, das Resistenz gegen Hygromycin verleiht, oder das EPSP-Gen, das Resistenz gegen das Herbizid Glyphosat verleiht. Der Selektionsmarker erlaubt die Selektion von transformierten Zellen von untransformierten (McCormick et al. (1986) Plant Cell Reports 5: 81-84). Die erhaltenen Pflanzen können in üblicher Weise gezüchtet und gekreuzt werden. Zwei oder mehr Generationen sollten kultiviert werden, um sicherzustellen, dass die genomische Integration stabil und vererblich ist.
Die oben genannten Verfahren sind beispielsweise beschrieben in Jenes B et al. (1993) Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, herausgegeben von SD Kung und R Wu, Academic Press, S. 128-143 sowie in Potrykus (1991) Annu Rev Plant Physiol Plant Molec Biol 42: 205-225). Vorzugsweise wird das zu exprimierende Konstrukt in einen Vektor kloniert, der geeignet ist, Agrobacterium tumefaciens zu transformieren, beispielsweise pBin19 (Bevan et al. (1984) Nucl Acids Res 12: 8711f).
Sobald eine transformierte Pflanzenzelle hergestellt wurde, kann eine vollständige Pflanze unter Verwendung von dem Fachmann bekannten Verfahren erhalten werden. Hierbei geht man beispielhaft von Kalluskulturen aus. Aus diesen noch undifferenzierten Zellmassen kann die Bildung von Spross und Wurzel in bekannter Weise induziert werden. Die erhaltenen Sprösslinge können ausgepflanzt und gezüchtet werden.
Dem Fachmann sind such Verfahren bekannt, um aus Pflanzenzellen, Pflanzenteile und ganze Pflanzen zu regenerieren. Beispielsweise werden hierzu Verfahren beschrieben von Fennell et al. (1992) Plant Cell Rep. 11: 567-570; Stoeger et al (1995) Plant Cell Rep. 14: 273-278; Jahne et al. (1994) Theor Appl Genet 89: 525-533 verwendet.
"Transgen" meint bezüglich zum Beispiel einer Hefe G3PDH Nukleinsäuresequenz, einer Expressionskassette oder einem Vektor enthaltend besagte G3PDH Nukleinsäuresequenz oder einem Organismus transformiert mit besagter Nukleinsäuresequenz, Expressionskassette oder Vektor alle solche durch gentechnische Methoden zustandegekommene Konstruktionen, in denen sich entweder

a) die Nukleinsäuresequenz kodierend für eine Hefe G3PDH, oder
b) eine mit besagter Nukleinsäuresequenz unter a) funktionell verknüpfte genetische Kontrollsequenz, zum Beispiel ein in pflanzlichen Organismen funktioneller Promotor, oder
c) (a) und (b)

Als transgene Organismen bevorzugte Wirts- oder Ausgangsorganismen sind vor allem Pflanzen gemäß der oben genannten Definition. Eingeschlossen sind im Rahmen der Erfindung alle Gattungen und Arten höherer und niedrigerer Pflanzen des Pflanzenreiches, insbesondere Pflanzen, die für die Gewinnung von Ölen verwendet werden wie beispielsweise Raps, Sonnenblume, Sesam, Färberdistel, Ölbaum, Soja, Mais, Weizen und Nussarten. Eingeschlossen sind ferner die reifen Pflanzen, Saatgut, Sprossen und Keimlinge, sowie davon abgeleitete Teile, Vermehrungsgut und Kulturen, zum Beispiel Zellkulturen. Reife Pflanzen meint Pflanzen zu jedem beliebigen Entwicklungsstadium jenseits des Keimlings. Keimling meint eine junge, unreife Pflanze in einem frühen Entwicklungsstadium.
Die Herstellung der transgenen Organismen kann mit den oben beschriebenen Verfahren zur Transformation oder Transfektion von Organismen realisiert werden.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft die Verwendung der erfindungsgemäßen, transgenen Organismen und der von ihnen abgeleitete Zellen, Zellkulturen, Teile - wie zum Beispiel bei transgenen pflanzlichen Organismen Wurzeln, Blätter etc. -, und transgenes Vermehrungsgut wie Saaten oder Früchte, zur Herstellung von Nahrungs- oder Futtermitteln, Pharmazeutika oder Feinchemikalien, insbesondere von Ölen, Fetten, Fettsäuren oder Derivaten der vorgenannten.
Neben der Beeinflussung des Ölgehaltes kann die transgene Expression einer Hefe G3PDH in Pflanzen noch weitere vorteilhafte Effekte vermitteln, wie beispielsweise eine erhöhte Stressresistanz z. B. gegen osmotischen Stress. Die Hefe G3PDH vermittelt über erhöhte Glycerolspiegel einen Schutz gegen derartigen Stress, indem Glycerol als Osmoprotektivum wirkt. Derartiger osmotischer Stress tritt beispielsweise bei salzhaltigen Böden und Wasser auf und ist ein zunehmendes Problem in der Landwirtschaft. Eine erhöhte Stresstoleranz bietet hier beispielsweise die Möglichkeit zur landwirtschaftlichen Nutzung von Flächen, in denen übliche Ackerpflanzen nicht gedeihen können.
Ferner kann die transgene Expression der Hefe G3PDH den NADH Spiegel und so das REDOX-Gleichgewicht in dem pflanzlichen Organismus beeinflussen. Stress, wie beispielsweise Trockenheit, Hitze, Kälte, UV Licht etc. kann zu erhöhten NADH Spiegeln und zu einer vermehrten Bildung von reaktivem Sauerstoff (ROS) führen. Die transgene Expression der Hefe G3PDH kann einen unter besagten Stressbedingungen anfallenden NADH Überschuss abbauen, so das REDOX-Gleichgewicht stabilisieren und die Auswirkungen des Stress mildern.

Sequenzen

1. SEQ ID NO: 1
Nukleinsäuresequenz kodierend für Saccharomyces cerevisiae G3PDH (Gpd1p)
2. SEQ ID NO: 2
Proteinsequenz kodierend für Saccharomyces cerevisiae G3PDH (Gpd1p)
3. SEQ ID NO: 3
Nukleinsäuresequenz kodierend für Saccharomyces cerevisiae G3PDH (Gpd2p)
4. SEQ ID NO: 4
Proteinsequenz kodierend für Saccharomyces cerevisiae G3PDH (Gpd2p)
5. SEQ ID NO: 5
Proteinsequenz kodierend für Saccharomyces cerevisiae G3PDH (Gpd2p) mit zweitem, alternativem Start-Codon
6. SEQ ID NO: 6
Nukleinsäuresequenz kodierend für Schizosaccharomyces pombe G3PDH
7. SEQ ID NO: 7
Proteinsequenz kodierend für Schizosaccharomyces pombe G3PDHD
8. SEQ ID NO: 8
Nukleinsäuresequenz kodierend für Schizosaccharomyces pombe G3PDH
9. SEQ ID NO: 9
Proteinsequenz kodierend für Schizosaccharomyces pombe G3PDH
10. SEQ ID NO: 10
Nukleinsäuresequenz kodierend für Yarrowinia lipolytica G3PDH
11. SEQ ID NO: 11
Proteinsequenz kodierend für Yarrowinia lipolytica G3PDH
12. SEQ ID NO: 12
Proteinsequenz kodierend für Yarrowinia lipolytica G3PDH, mit zweitem, alternativem Start-Codon
13. SEQ ID NO: 13
Nukleinsäuresequenz kodierend für Zygosaccharomyces rouxii G3PDH
14. SEQ ID NO: 14
Proteinsequenz kodierend für Zygosaccharomyces rouxii G3PDH
15. SEQ ID NO: 15
Nukleinsäuresequenz kodierend für Zygosaccharomyces rouxii G3PDH
16. SEQ ID NO: 16
Proteinsequenz kodierend für Zygosaccharomyces rouxii G3PDH
17. SEQ ID NO: 16
Expressionsvektor auf Basis von pSUN-USP für S. cerevisiae G3PDH (Gpd1p; Insert von bp 1017-2190)
18. SEQ ID NO: 18 Oligonukleotidprimer ONP1
5'-ACTAGTATGTCTGCTGCTGCTGATAG-3'
19. SEQ ID NO: 19 Oligonukleotidprime ONP2
5'-CTCGAGATCTTCATGTAGATCTAATT-3'
20. SEQ ID NO: 20 Oligonukleotidprime ONP3
5'-GCGGCCGCCATGTCTGCTGCTGCTGATAG-3'
21. SEQ ID NO: 21 Oligonukleotidprime ONP4
5'-GCGGCCGCATCTTCATGTAGATCTAATT-3'
22. SEQ ID NP 22 bis 35: Sequenzmotive für Hefe G3PDHs mit Angabe von möglichen Sequenzvariationen. Die Variationen eines einzelnen Motives können jeweils einzeln aber auch in den unterschiedlichen Kombinationen miteinander vorkommen.
23. SEQ ID NO: 36
Expressionsvektor pGPTV-gpd1 auf Basis von pGPTV-Napin für S. cerevisiae G3PDH (Gpd1p; Insert gdp1 von bp 11962-13137; nos-Terminator: 13154-13408; Napin-Promotor: 10807-11951).

Abbildungen

Fig. 1 Ölgehalt in transgenen GPD1p-Linien
Messung des TAG-Gehalts in T2 Samen von transgenen Arabidopsis-Linien mit dem Gpd1p-Gen aus Saccharomyces cerevisiae (G2 bis G30). Zum Vergleich ist der Gehalt in entsprechenden untransformierten (Wilttyp-Pflanzen; W1 bis W10) bestimmt worden. Es wurden 8 Arabidopsis- Linien mit einem signifikant gesteigertem Ölgehalt identifiziert. Die angegebenen Fehlerabweichung ergeben sich aus jeweils 3 unabhängigen Messungen.

Beispiele

Allgemeine Methoden

Alle Chemikalien, wenn nicht anders erwähnt, stammen von den Firmen Fluka (Buchs), Merck (Darmstadt), Roth (Karlsruhe), Serva (Heidelberg) und Sigma (Deisenhofen). Restriktionsenzyme, DNA- modifizierende Enzyme und Molekularbiologie-Kits wurden von den Firmen Amersham-Pharmacia (Freiburg), Biometra (Göttingen), Roche (Mannheim), New England Biolabs (Schwalbach), Novagen (Madison, Wisconsin, USA), Perkin-Elmer (Weiterstadt), Qiagen (Hilden), Stratagen (Amsterdam, Niederlande), Invitrogen (Karlsruhe) und Ambion (Cambridgeshire, United Kingdom). Die verwendeten Reagenzien wurden entsprechend der Angaben des Herstellers eingesetzt.
Die chemische Synthese von Oligonukleotiden kann beispielsweise, in bekannter Weise, nach der Phosphoamiditmethode (Voet, Voet, 2. Auflage, Wiley Press New York, Seite 896-897) erfolgen. Die im Rahmen der vorliegenden Erfindung durchgeführten Klonierungsschritte wie z. B. Restriktionsspaltungen, Agarosegelelektrophorese, Reinigung von DNA-Fragmenten, Transfer von Nukleinsäuren auf Nitrozellulose und Nylonmembranen, Verknüpfen von DNA-Fragmenten, Transformation von E. coli Zellen, Anzucht von Bakterien, Vermehrung von Phagen und Sequenzanalyse rekombinanter DNA werden wie bei Sambrook et al. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press; ISBN 0-87969-309-6 beschrieben durchgeführt. Die Sequenzierung rekombinanter DNA-Moleküle erfolgt mit einem Laserfluoreszenz-DNA-Sequenzierer der Firma ABI nach der Methode von Sanger (Sanger et al. (1977) Proc Natl Acad Sci USA 74: 5463-5467).

Beispiel 1

Allgemeine Verfahren

Die Pflanze Arabidopsis thaliana repräsentiert ein Mitglied der höheren Pflanzen (Samenpflanzen). Diese Pflanze ist eng verwandt mit anderen Pflanzenarten aus der Familie der Cruciferen wie z. B. Brassica napus, aber auch mit anderen Pflanzenfamilien der Dikotyledonen. Aufgrund des hohen Grades an Homologie ihrer DNA-Sequenzen bzw. Polypeptidsequenzen kann Arabidopsis thaliana als Modellpflanze für andere Pflanzenarten eingesetzt werden.

a) Anzucht von Arabidopsis Pflanzen

Die Pflanzen werden entweder auf Murashige-Skoog Medium mit 0,5% Saccharose (Ogas et al. (1997) Science 277: 91-94) oder auf Erde gezogen (Focks & Benning (1998) Plant Physiol 118: 91-101). Um einheitliche Keimungs- und Blühzeiten zu erreichen, werden die Samen nach Ausplattieren bzw. Ausstreuen auf Erde zwei Tage bei 4°C stratifiziert. Nach der Blüte werden die Schoten markiert. Entsprechend der Markierungen werden dann Schoten mit einem Alter von 6 bis 20 Tagen nach der Blüte geerntet.

Beispiel 2

Klonierung des Gpd1-Gens aus Hefe

Genomische DNA aus Saccharomyces cerevisiae Stamm S288C (Mat alpha SUC2 mal mel gal2 CUP1 flo1 flo8-1; Invitrogen, Karlsruhe, Deutschland) wurde nach folgendem Protokoll isoliert:
Eine 100 ml Kultur wurde bis zu einer optischen Dichte von 1,0 bei 30°C angezogen. Davon wurden 60 ml abzentrifugiert bei 3000 xg für 3 min. Das Pellet wurde in 6 ml doppelt-destilliertem H₂O resuspendiert und auf 1,5 ml Gefäße verteilt, abzentrifugiert und der Überstand verworfen. Die Pellets wurden mit 200 µl Lösung A, 200 µL Phenol/Chloroform (1 : 1) und 0,3 g Glaskugeln durch Vortexen resuspendiert und lysiert. Nach Zugabe von 200 µl TE-Puffer pH 8,0 wurde für 5 min zentrifugiert. Der Überstand wurde einer Ethanolfällung mit 1 ml Ethanol unterzogen. Das erhaltene Pellet nach Fällung wurde in 400 µL TE-Puffer pH 8,0 + 30 µg/mL RnaseA gelöst. Nach Inkubation für 5 min bei 37°C wurden 18 µL 3 M Natriumacetat-Lösung pH 4,8 und 1 mL Ethanol zugegeben und die präzipitierte DNA durch Zentrifugation pelletiert. Das DNA-Pellet wurde in 25 µL doppelt-destilliertem H₂O gelöst. Die Konzentration der genomischen DNA wurde durch deren Absorption bei 260 nm bestimmt. Lösung A 2% Trition-X100
1% SDS
0,1 M NaCl
0,01 M Tris-HCl pH 8,0
0,001 M EDTA
Für die Klonierung des Gpd1-Gens wurde die isolierte Hefe-DNA in einer PCR-Reaktion mit den Oligonukleotidprimern ONP1 und ONP2 eingesetzt.
ONP1: 5'-ACTAGTATGTCTGCTGCTGCTGATAG-3' (SEQ ID NO: 18)
ONP2: 5'-CTCGAGATCTTCATGTAGATCTAATT-3' (SEQ ID NO: 19) Zusammensetzung des PCR-Ansatzes (50 µL) 5,00 µL 5 µg genomische Hefe-DNA
5,00 µL 10× Puffer (Advantage-Polymerase)+ 25 mM MgCl₂
5,00 µL 2 mM dNTP
1,25 µL je Primer (10 µmol/uL)
0,50 µL Advantage-Polymerase
Die Advantage-Polymerase von Clontech wurden eingesetzt.

PCR-Programm

Anfangsdenaturierung für 2 min bei 95°C, dann 35 Zyklen mit 45 sec 95°C, 45 sec 55°C und 2 min 72°C. Abschließende Extension von 5 min bei 72°C.
Das PCR-Produkte wurde in den pCR2.1-TOPO Vektor (Invitrogen) gemäß Herstellerangaben kloniert, resultierend in dem Vektor pCR2.1-gpd1 und die Sequenz wurde durch Sequenzierung überprüft.
Für die Klonierung in den Agrotransformationsvektor pGPTV wurden 0,5 µg des Vektors pCR2.1-gpd1 mit den Restriktionsenzym XhoI (New England Biolabs) für 2 Stunde inkubiert und anschließend 15 min mit Klenow-Fragment (New England Biolabs) inkubiert. Nach Inkubation für 2 Stunden mit SpeI wurden die DNA-Fragmente per Gelelektorphorese aufgetrennt. Das neben dem Vektor (3,9 kb) 1185 bp große Fragment der gpd1-Sequenz wurde aus dem Gel ausgeschnitten und mit dem "Gelpurification"-Kit von Qiagen nach Herstellerangaben aufgereinigt und mit 50 µL Elutionspuffer eluiert. 0,1 µg des Vektors pGPTV wurde zuerst für 1 Stunde mit dem Restriktionsenzym SacI verdaut, dann für 15 min mit Klenow- Fragment (New England Biolabs) inkubiert. 10 µL des Eluates des gpd1-Fragments und 10 ng des behandelten Vektors pGPTV wurden über Nacht bei 16°C ligiert (T4 Ligase von New England Biolabs).
Die Ligationsprodukte werden dann in TOP10 Zellen (Stratagene) nach Herstellerangaben transformiert und entsprechend selektioniert, resultierend in dem Vektor pGPTV-gpd1. Positive Klone werden mit den Primern ONP1 und ONP2 durch PCR und Sequenzierung verifiziert.
Für die Herstellung des Vektors pSUN-USP-gpd1 wurde eine PCR vom Vektor pCR2.1-gpd1 mit den Primern ONP3 und ONP4 durchgeführt.
ONP3: 5'-GCGGCCGCCATGTCTGCTGCTGCTGATAG-3' (SEQ ID NO: 20)
ONP4: 5'-GCGGCCGCATCTTCATGTAGATCTAATT-3' (SEQ ID NO: 21) Zusammensetzung des PCR-Ansatzes (50 µL) 5 ng DNA Plasmid pCR2.1-gpd1
5,00 µL 10× Puffer (Advantage-Polymerase)+ 25 mM MgCl₂
5,00 µL 2 mM dNTP
1,25 µL je Primer (10 µmol/uL)
0,50 µL Advantage-Polymerase
Die Advantage-Polymerase von Clontech wurden eingesetzt.

PCR-Programm

Anfangsdenaturierung für 2 min bei 95°C, dann 35 Zyklen mit 45 sec 95°C, 45 sec 55°C und 2 min 72°C. Abschließende Extension von 5 min bei 72°C.
Das 1190 bp große PCR-Produkt wurde mit dem Restriktionsenzym NotI für 24 Stunden verdaut. Der Vektor pSUN-USP wurde für 2 Stunden mit NotI verdaut, dann 15 min mit alkalischer Phosphatase (New England Biolabs) inkubiert. 100 ng des vorbehandelten gpd1-Fragments und 10 ng des behandelten Vektors pGPTV wurden über Nacht bei 16°C ligiert (T4 Ligase von New England Biolabs). Die Ligationsprodukte werden dann in TOP10 Zellen (Stratagene) nach Herstellerangaben transformiert und entsprechend selektioniert, resultierend in dem Vektor pSUN-USP- gpd1. Positive Klone werden mit den Primern ONP3 und ONP4 durch PCR und Sequenzierung verifiziert.

Beispiel 3

Plasmide für die Pflanzentransformation

Zur Pflanzentransformation können binäre Vektoren, wie pBinAR verwendet werden (Höfgen und Willmitzer (1990) Plant Science 66: 221-230). Die Konstruktion der binären Vektoren kann durch Ligation der cDNA in Sense- oder Antisense-Orientierung in T-DNA erfolgen. 5' der cDNA aktiviert ein Pflanzenpromotor die Transkription der cDNA. Eine Polyadenylierungssequenz befindet sich 3' von der cDNA.
Die gewebespezifische Expression lässt sich unter Verwendung eines gewebespezifischen Promotors erzielen. Beispielsweise kann die samenspezifische Expression erreicht werden, indem der Napin- oder der LeB4- oder der USP-Promotor 5' der cDNA einkloniert wird. Auch jedes andere samenspezifische Promotorelement kann verwendet werden. Zur konstitutiven Expression in der ganzen Pflanzen lässt sich der CaMV-35S-Promotor verwenden.
Ein weiteres Beispiel für binäre Vektoren ist der Vektor pSUN-USP und pGPTV-Napin in welche das Fragment aus Beispiel 2 kloniert wurde. Der Vektor pSUN-USP enthält den USP-Promotor sowie den OCS Terminator. Der Vektor pGPTV-Napin enthält einen verkürzte Version des Napin-Promotors und den nos-Terminator.
Die Fragmente aus Beispiel 2 wurden in die multiple Klonierungsstelle des Vektors pSUN-USP bzw. pGPTV-Napin kloniert, um die samenspezifische Expression der Suppressionskonstrukte zu ermöglichen. Das entsprechende Konstrukt pSUN-USP-gpd1 ist mit der SEQ ID NO: 17 beschrieben, das Konstrukt von G3PDH in pGPTV-Napin (pGPTV-gpd1) ist durch SEQ ID NO: 36 beschrieben.

Beispiel 4

Transformation von Agrobacterium

Die Agrobacterium-vermittelte Pflanzentransformation kann zum Beispiel unter Verwendung der Agrobacterium tumefaciens-Stämme GV3101 (pMP90) (Koncz und Schell (1986) Mol Gen Genet 204: 383-396) oder LBA4404 (Clontech) durchgeführt werden. Die Transformation kann durch Standard-Transformationstechniken durchgeführt werden (Deblaere et al. (1984) Nucl Acids Res 13: 4777-4788).

Beispiel 5

Pflanzentransformation

Die Agrobacterium-vermittelte Pflanzentransformation kann unter Verwendung von Standard-Transformations- und Regenerationstechniken durchgeführt werden (Gelvin SB, Schilperoort R, Plant Molecular Biology Manual, 2. Aufl., Dordrecht: Kluwer Academic Publ., 1995, in Sect., Ringbuc Zentrale Signatur: BT11-P ISBN 0-7923-2731-4; Glick BR, Thompson JE, Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Boca Raton: CRC Press, 1993, 360 S., ISBN 0-8493-5164-2).
Die Transformation mittels Agrobacterium von Arabidopsis thaliana wurde durch die Methode nach Bechthold et al., 1993 (C. R. Acad. Sci. Ser. III Sci. Vie., 316, 1194-1199) durchgeführt.
Beispielsweise kann Raps mittels Kotyledonen- oder Hypokotyltransformation transformiert werden (Moloney et al. (1989) Plant Cell Report 8: 238-242; De Block et al. (1989) Plant Physiol 91: 694-701). Die Verwendung von Antibiotika für die Agrobacterium- und Pflanzenselektion hängt von dem für die Transformation verwendeten binären Vektor und Agrobacterium-Stamm ab. Die Rapsselektion wird gewöhnlich unter Verwendung von Kanamycin als selektierbarem Pflanzenmarker durchgeführt.
Der Agrobacterium-vermittelte Gentransfer in Lein (Linum usitatissimum) lässt sich unter Verwendung von beispielsweise einer von Mlynarova et al. (1994) Plant Cell Report 13: 282-285 beschriebenen Technik durchführen. Die Transformation von Soja kann unter Verwendung von beispielsweise einer in EP-A-0 0424 047 (Pioneer Hi-Bred International) oder in EP-A-0 0397 687, US 5,376,543, US 5,169,770 (University Toledo) beschriebenen Technik durchgeführt werden.
Die Pflanzentransformation unter Verwendung von Teilchenbeschuss, Polyethylenglycol-vermittelter DNA-Aufnahme oder über die Siliziumcarbonatfaser-Technik ist beispielsweise beschrieben von Freeling und Walbot "The maize handbook" (1993) ISBN 3-540-97826-7, Springer Verlag New York).

Beispiel 6

Untersuchung der Expression eines rekombinanten Genproduktes in einem transformierten Organismus

Die Aktivität eines rekombinanten Genproduktes im transformierten Wirtsorganismus wurde auf der Transkriptions- und/oder der Translationsebene gemessen.
Ein geeignetes Verfahren zur Bestimmung der Menge an Transkription des Gens (ein Hinweis auf die Menge an RNA, die für die Translation des Genproduktes zur Verfügung steht) ist die Durchführung eines Northern-Blots wie unten ausgeführt (als Bezugsstelle siehe Ausubel et al. (1988) Current Protocols in Molecular Biology, Wiley: New York, oder den oben erwähnten Beispielteil), wobei ein Primer, der so gestaltet ist, dass er an das Gen von Interesse bindet, mit einer nachweisbaren Markierung (gewöhnlich radioaktiv oder chemilumineszent) markiert wird, so dass, wenn die Gesamt-RNA einer Kultur des Organismus extrahiert, auf einem Gel aufgetrennt, auf eine stabile Matrix transferiert und mit dieser Sonde inkubiert wird, die Bindung und das Ausmaß der Bindung der Sonde das Vorliegen und auch die Menge der mRNA für dieses Gen anzeigt. Diese Information zeigt den Grad der Transkription des transformierten Gens an. Zelluläre Gesamt-RNA kann aus Zellen, Geweben oder Organen mit mehreren Verfahren, die alle im Fachgebiet bekannt sind, wie zum Beispiel das von Bormann, E. R., et al. (1992) Mol. Microbiol. 6: 317-326 beschriebene, präpariert werden.

Northern-Hybridisierung

Für die RNA-Hybridisierung wurden 20 µg Gesamt-RNA oder 1 µg poly(A)⁺-RNA mittels Gelelektrophorese in Agarosegelen mit einer Stärke von 1,25% unter Verwendung von Formaldehyd, wie beschrieben in Amasino (1986, Anal. Biochem. 152, 304) aufgetrennt, mittels Kapillaranziehung unter Verwendung von 10 × SSC auf positiv geladene Nylonmembranen (Hybond N+, Amersham, Braunschweig) übertragen, mittels UV-Licht immobilisiert und 3 Stunden bei 68°C unter Verwendung von Hybridisierungspuffer (10% Dextransulfat Gew./Vol., 1 M NaCl, 1% SDS, 100 mg Heringssperma-DNA) vorhybridisiert. Die Markierung der DNA-Sonde mit dem Highprime DNA labeling-Kit (Roche, Mannheim, Deutschland) erfolgte während der Vorhybridisierung unter Verwendung von alpha-³²P-dCTP (Amersham Pharmacia, Braunschweig, Deutschland). Die Hybridisierung wurde nach Zugabe der markierten DNA-Sonde im gleichen Puffer bei 68°C über Nacht durchgeführt. Die Waschschritte wurden zweimal für 15 min unter Verwendung von 2 × SSC und zweimal für 30 min unter Verwendung von 1 x SSC, 1% SDS, bei 68°C durchgeführt. Die Exposition der verschlossenen Filter wurde bei -70°C für einen Zeitraum von 1 bis 14 T durchgeführt.
Zur Untersuchung des Vorliegens oder der relativen Menge an von dieser mRNA translatiertem Protein können Standardtechniken, wie ein Western-Blot, eingesetzt werden (siehe beispielsweise Ausubel et al. (1988) Current Protocols in Molecular Biology, Wiley: New York). Bei diesem Verfahren werden die zellulären Gesamt- Proteine extrahiert, mittels Gelelektrophorese aufgetrennt, auf eine Matrix, wie Nitrozellulose, übertragen und mit einer Sonde, wie einem Antikörper, der spezifisch an das gewünschte Protein bindet, inkubiert. Diese Sonde ist gewöhnlich mit einer chemilumineszenten oder kolorimetrischen Markierung versehen, die sich leicht nachweisen lässt. Das Vorliegen und die Menge der beobachteten Markierung zeigt das Vorliegen und die Menge des gewünschten, in der Zelle vorliegenden mutierten Proteins an.

Beispiel 7

Analyse der Auswirkung der rekombinanten Proteine auf die Produktion des gewünschten Produktes

Die Auswirkung der genetischen Modifikation in Pflanzen, Pilzen, Algen, Ciliaten oder auf die Produktion einer gewünschten Verbindung (wie einer Fettsäure) kann bestimmt werden, indem die modifizierten Mikroorganismen oder die modifizierte Pflanze unter geeigneten Bedingungen (wie den vorstehend beschriebenen) gezüchtet werden und das Medium und/oder die zellulären Komponenten auf die erhöhte Produktion des gewünschten Produktes (d. h. von Lipiden oder einer Fettsäure) untersucht wird. Diese Analysetechniken sind dem Fachmann bekannt und umfassen Spektroskopie, Dünnschichtchromatographie, Färbeverfahren verschiedener Art, enzymatische und mikrobiologische Verfahren sowie analytische Chromatographie, wie Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (siehe beispielsweise Ullman, Encyclopedia of Industrial Chemistry, Bd. A2, S. 89-90 und S. 443-613, VCH: Weinheim (1985); Fallon A et al. (1987) "Applications of HPLC in Biochemistry" in: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Bd. 17; Rehm et al. (1993) Biotechnology, Bd. 3, Kapitel III: "Product recovery and purification", S. 469-714, VCH: Weinheim; Belter PA et al. (1988) Bioseparations: downstream processing for Biotechnology, John Wiley and Sons; Kennedy JF und Cabral JMS (1992) Recovery processes for biological Materials, John Wiley and Sons; Shaeiwitz JA und Henry JD (1988) Biochemical Separations, in: Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, Bd. B3; Kapitel 11, S. 1-27, VCH: Weinheim; und Dechow, F. J. (1989) Separation and purification techniques in biotechnology, Noyes Publications).
Neben den oben erwähnten Verfahren werden Pflanzenlipide aus Pflanzenmaterial wie von Cahoon et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96 (22): 12935-12940, und Browse et al. (1986) Analytic Biochemistry 152: 141-145, beschrieben extrahiert. Die qualitative und quantitative Lipid- oder Fettsäureanalyse ist beschrieben bei Christie, William W., Advances in Lipid Methodology, Ayr/Scotland: Oily Press (Oily Press Lipid Library; 2); Christie, William W., Gas Chromatography and Lipids. A Practical Guide - Ayr, Scotland: Oily Press, 1989, Repr. 1992, IX, 307 S. (Oily Press Lipid Library; 1); "Progress in Lipid Research, Oxford: Pergamon Press, 1 (1952)-16 (1977) u. d. T.: Progress in the Chemistry of Fats and Other Lipids CODEN.
Zusätzlich zur Messung des Endproduktes der Fermentation ist es auch möglich, andere Komponenten der Stoffwechselwege zu analysieren, die zur Produktion der gewünschten Verbindung verwendet werden, wie Zwischen- und Nebenprodukte, um die Gesamteffizienz der Produktion der Verbindung zu bestimmen. Die Analyseverfahren umfassen Messungen der Nährstoffmengen im Medium (z. B. Zucker, Kohlenwasserstoffe, Stickstoffquellen, Phosphat und andere Ionen), Messungen der Biomassezusammensetzung und des Wachstums, Analyse der Produktion üblicher Metabolite von Biosynthesewegen und Messungen von Gasen, die während der Fermentation erzeugt werden. Standardverfahren für diese Messungen sind in Applied Microbial Physiology; A Practical Approach, P. M. Rhodes und P. F. Stanbury, Hrsgb., IRL Press, S. 103-129; 131-163 und 165-192 (ISBN: 0199635773) und darin angegebenen Literaturstellen beschrieben.
Ein Beispiel ist die Analyse von Fettsäuren (Abkürzungen: FAME, Fettsäuremethylester; GC-MS, Gas-Flüssigkeitschromatographie- Massenspektrometrie; TAG, Triacylglycerin; TLC, Dünnschichtchromatographie).
Der unzweideutige Nachweis für das Vorliegen von Fettsäureprodukten kann mittels Analyse rekombinanter Organismen nach Standard-Analyseverfahren erhalten werden: GC, GC-MS oder TLC, wie verschiedentlich beschrieben von Christie und den Literaturstellen darin (1997, in: Advances on Lipid Methodology, Vierte Aufl.: Christie, Oily Press, Dundee, 119-169; 1998, Gaschromatographie-Massenspektrometrie-Verfahren, Lipide 33: 343-353).
Das zu analysierende Material kann durch Ultraschallbehandlung, Mahlen in der Glasmühle, flüssigen Stickstoff und Mahlen oder über andere anwendbare Verfahren aufgebrochen werden. Das Material muss nach dem Aufbrechen zentrifugiert werden. Das Sediment wird in Aqua dest. resuspendiert, 10 min bei 100°C erhitzt, auf Eis abgekühlt und erneut zentrifugiert, gefolgt von Extraktion in 0,5 M Schwefelsäure in Methanol mit 2% Dimethoxypropan für 1 Std. bei 90°C, was zu hydrolysierten Öl- und Lipidverbindungen führt, die transmethylierte Lipide ergeben. Diese Fettsäuremethylester werden in Petrolether extrahiert und schließlich einer GC-Analyse unter Verwendung einer Kapillarsäule (Chrompack, WCOT Fused Silica, CP-Wax-52 CB, 25 mikrom, 0,32 mm) bei einem Temperaturgradienten zwischen 170°C und 240°C für 20 min und 5 min bei 240°C unterworfen. Die Identität der erhaltenen Fettsäuremethylester muss unter Verwendung von Standards, die aus kommerziellen Quellen erhältlich sind (d. h. Sigma), definiert werden.
Für die quantitative Öl-Analyse der mit dem Gpd1-Gen transformierten Arabidopsis Pflanzen wurde folgendes Protokoll angewendet:
Die Extraktion der Lipide aus Samen wird nach der Methode von Bligh & Dyer (1959) Can J Biochem Physiol 37: 911 durchgeführt. Dazu werden 5 mg Arabidopsis Samen in 1,2 ml Qiagen-Microtubes (Qiagen, Hilden) auf einer Sartorius (Göttingen) Mikrowaage abgewogen. Das Samenmaterial wird mit 500 uL Chloroform/Methanol (2 : 1; enthält Mono-C17-glycerin von Sigma als internen Standard) in der Rätschmühle MM300 der Firma Retsch (Haan) homogenisiert und 20 min bei RT inkubiert. Nach Zugabe von 500 uL 50 mM Kaliumphosphatpuffer pH 7,5 erfolgt die Phasentrennung. Von der organischen Phase werden 50 µL abgenommen, mit 1500 uL Chloroform verdünnt und 5 µL auf die Kapillaren Chromarods SIII der Firma Iatroscan (SKS, Bechenheim) aufgetragen. Nach Auftrag der Proben werden diese für 15 min in einer Dünnschichtkammer, die gesättigt ist mit 6 : 2 : 2 Chloroform : Methanol : Toluol in einem ersten Schritt aufgetrennt. Nach Ablauf der Zeit werden die Kapillaren 4 min bei Raumtemperatur getrocknet und dann für 22 min in eine Dünnschichtkammer, die gesättigt ist mit 7 : 3 n-Hexan : Dieethylether gestellt. Nach einem weiteren Trocknungsschritt für 4 min bei Raumtemperatur werden die Proben in einem Iatroscan MK-5 (SKS, Bechenheim) entsprechend Fraser & Taggart, 1988 J. Chromatogr. 439: 404 analysiert. Folgende Parameter wurden für die Messungen eingestellt: Slice width 50 msec, Treshold 20 mV, Noise 30, Skim ratio 0. Die Quantifizierung der Daten erfolgte anhand des internen Standards Mono-C17-glycerin (Sigma) sowie einer erstellten Eichkurve mit Tri-C17-glycerin (Sigma) mittels des Programms ChromStar (SKS, Beichenheim).
Für die quantitative Bestimmung der Ölgehalte wurden T2 Samen von mehreren, unabhängigen transgenen Linien mit den Konstrukten pSUN-USP-gpd1 bzw. pGPTV-gpd1 analysiert. Von den Samenpools jeder Linie wurden drei unabhängige Extraktionen durchgeführt und die Extrakte unabhängig gemessen. Aus den drei unabhängigen Messungen wurde der Mittelwert sowie die Standardabweichung berechnet.
Das Ergebnis der Messungen für die Linien mit dem Konstrukt pGPTV-gpd1 zeigte einen signifikant höheren Ölgehalt in mehreren (10) transgenen Linien (Fig. 1), verglichen mit den Messungen von 10 Wildtyp-Pflanzen. Für das Konstrukt pSUN-USP-gpd1 werden ähnliche Ölgehalte gemessen (nicht gezeigt).
Der durchschnittliche Ölgehalt der oben aufgeführten Linien beträgt 34,86 ± 1,56%, während der Durchschnitt der Wildtyppflanzen bei 27,75 ± 2,64% liegt. Dies entspricht einer Steigerung des Ölgehalts um absolut 7,1% (realtiv 25,6%). SEQUENZPROTOKOLL

Claims

1. Verfahren zum Erhöhen des Gesamtölgehalt in einem pflanzlichen Organismus oder einem Gewebe, Organ, Teil, Zelle oder Vermehrungsgut desselben, umfassend

a) transgene Expression einer Glycerol-3-phosphat Dehydrogenase aus einer Hefe in besagtem pflanzlichen Organismus oder einem Gewebe, Organ, Teil, Zelle oder Vermehrungsgut desselben und

b) Auswahl von pflanzlichen Organismen, bei denen - im Unterschied oder Vergleich zur Ausgangsorganismus - der Gesamtölgehalt in dem besagten pflanzlichen Organismus oder einem Gewebe, Organ, Teil, Zelle oder Vermehrungsgut desselben erhöht ist.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Glycerol-3-phosphat Dehydrogenase aus einer Hefe stammt ausgewählt aus den Gattungen Cryptococcus, Torulopsis, Pityrosporum, Brettanomyces, Candida, Kloeckera, Trigonopsis, Trichosporon, Rhodotorul, Sporobolomyces, Bullera, Saccharomyces, Debaromyces, Lipomyces, Hansenula, Endomycopsis, Pichia und Hanseniaspora.

3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, wobei die Glycerol-3-phosphat Dehydrogenase aus einer Hefe stammt ausgewählt aus den Arten Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, Hansenula polymorpha, Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces lactis, Zygosaccharomyces rouxii und Yarrowia lipolitica.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Glycerol-3-phosphat Dehydrogenase die Umsetzung von Dihydroxyacetonphosphat zu Glycerin-3-phosphat unter Verwendung von NADH als Cosubstrat bewirkt und eine Peptidsequenz aufweist, die mindestens ein Sequenzmotiv umfasst ausgewählt aus der Gruppe von Sequenzmotiven bestehend aus

a) GSGNWGT(A/T)IAK

b) H(E/Q)NVKYL

c) (D/N)(I/V)(L/I)V(F/W)(V/N)(L/I/V)PHQF(V/L/I)

d) (A/G)(I/V)SC(L/I)KG

e) CG(V/A)LSGAN(L/I/V)AXE(V/I)A

f) (L/V)FXRPYFXV

g) G(L/M)(L/G)E(M/I)(I/Q)(R/K/N)F(G/S/A)

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Glycerol-3-phosphat Dehydrogenase die Umsetzung von Dihydroxyacetonphosphat zu Glycerin-3-phosphat unter Verwendung von NADH als Cosubstrat bewirkt und eine Peptidsequenz aufweist, die mindestens ein Sequenzmotiv umfasst ausgewählt aus der Gruppe von Sequenzmotiven bestehend aus

a) GSGNWGTTIAKV(V/I)AEN

b) NT(K/R)HQNVKYLP

c) D(I/V)LVFN(I/V)PHQFL

d) RA(I/V)SCLKGFE

e) CGALSGANLA(P/T)EVA

f) LFHRPYFHV

g) GLGEII(K/R)FG

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Glycerol-3-phosphat Dehydrogenase aus einer Hefe beschrieben ist durch

a) eine Sequenz mit der SEQ ID NO: 2, 4, 5, 7, 9, 11, 12, 14 oder 16, oder

b) ein funktionelle Äquivalent von a) mit einer Identität von mindestens 60% eine Sequenz mit der SEQ ID NO: 2.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die Pflanze eine Ölpflanze ist.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei der Gesamtölgehalt im Samen einer Pflanze erhöht wird.

9. Transgene Expressionskassette umfassend unter Kontrolle eines in einem pflanzlichen Organismus oder einem Gewebe, Organ, Teil oder Zelle desselben funktionellen Promotors eine Nukleinsäuresequenz kodierend für eine Glycerol-3- phosphat Dehydrogenase aus einer Hefe entsprechend einem der Ansprüche 2 bis 6.

10. Transgene Expressionskassette nach Anspruch 9, wobei die Nukleinsäuresequenz kodierend für eine Glycerol-3-phosphat Dehydrogenase beschrieben ist durch

a) eine Sequenz mit der SEQ ID NO: 1, 3, 6, 8, 10, 13 oder 15 oder

b) eine Sequenz, die sich entsprechend dem degenerierten genetischen Code von einer Sequenz mit der SEQ ID NO: 1, 3, 6, 8, 10, 13 oder 15 ableitet, oder

c) eine Sequenz, die eine Identität von mindestens 60% zu der Sequenz mit der SEQ ID NO: 1 aufweist.

11. Transgene Expressionskassette nach einem der Ansprüche 9 oder 10, wobei der Promotor ein samenspezifischer Promotor ist.

12. Transgener Vektor enthaltend eine Expressionskassette nach einem der Ansprüche 9 bis 11.

13. Transgener pflanzlicher Organismus oder Gewebe, Organ, Teil, Zelle oder Vermehrungsgut desselben, enthaltend eine Glycerol-3-phosphat Dehydrogenase aus einer Hefe entsprechend einem der Ansprüche 2 bis 6 oder eine Expressionskassette nach einem der Ansprüche 9 bis 11 oder einen Vektor nach Anspruch 12.

14. Transgener pflanzlicher Organismus nach Anspruch 13, wobei der pflanzliche Organismus ausgewählt ist aus der Gruppe der Ölpflanzen bestehend aus Bovago oficinalis, Brassica campestris, Brassica napus, Brassica rapa, Cannabis sativa, Curthamus tinctorius, Cocos nucifera, Crambe abyssinica, Cuphea Arten, Elaeis guinensis, Ekeis oleiferu, Glycine max, Gossypium hirisfum, Gossypium barbadense, Gossypium herbaceum, Helianthus annus, Linum usitatissimum, Oenethem biennis, Ozea europea, Oryza sativa, Ricinus communis, Sesamum indicum, Triticum Arten, Zea maize, Walnuss und Mandel.

15. Verwendung eines transgenen pflanzlichen Organismus oder Gewebe, Organ, Teil, Zelle oder Vermehrungsgut desselben nach einem der Ansprüche 13 oder 14 zur Herstellung von Ölen, Fetten, freien Fettsäuren oder Derivaten der vorgenannten.