WO2007051642A1 - Verfahren zur erhöhung des gesamtölgelhaltes in ölpflanzen - Google Patents

Verfahren zur erhöhung des gesamtölgelhaltes in ölpflanzen Download PDF

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WO2007051642A1
WO2007051642A1 PCT/EP2006/010592 EP2006010592W WO2007051642A1 WO 2007051642 A1 WO2007051642 A1 WO 2007051642A1 EP 2006010592 W EP2006010592 W EP 2006010592W WO 2007051642 A1 WO2007051642 A1 WO 2007051642A1
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glycerol
nucleic acid
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PCT/EP2006/010592
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Thorsten Zank
Oliver Oswald
Jörg BAUER
Helène VIGEOLAS
Peter Geigenberger
Peter Waldeck
Mark Stitt
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MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V.
Basf Plant Science Gmbh
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    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
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    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
    • C12N15/8247—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine involving modified lipid metabolism, e.g. seed oil composition
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)

Definitions

  • the invention relates to processes for increasing the total oil content and / or the content of glycerol-3-phosphate in transgenic oil plants containing at least 20% by weight of oleic acid based on the total fatty acid content, preferably in plant seeds, by expression of glycerol-3-phosphate dehydrogenases ( G3PDH) from yeasts, preferably from Saccharomyces cerevisiae.
  • G3PDH glycerol-3-phosphate dehydrogenases
  • the oil obtained in the process and / or the free fatty acids are added to polymers, foods, animal feeds, cosmetics, pharmaceuticals or industrial applications.
  • the fatty acids obtainable from vegetable oils are also of particular interest. They are used, for example, as basic substances for plasticizers, lubricants, surfactants, cosmetics, etc., or are used as valuable raw materials in the food and animal feed industry.
  • plasticizers for example, as plasticizers, lubricants, surfactants, cosmetics, etc.
  • surfactants for example, as lubricants, surfactants, cosmetics, etc.
  • the provision of rapeseed oils with medium chain fatty acids is of particular interest, as they are particularly sought after in surfactant production.
  • the lipid synthesis can be subdivided into two partial mechanisms, a quasi "prokaryotic” and a quasi “eukaryotic” [Browse et al. (1986) Biochemical J 235: 25-31; Ohlrogge & Browse (1995) Plant Cell 7: 957-970].
  • the prokaryotic mechanism of the synthesis is localized in the plastids and comprises the biosynthesis of the free fatty acids, which are exported to the cytosol, where they enter the eukaryotic mechanism as fatty acid acyl-CoA esters and are treated with glycerol-3-phosphate (G3P, Glycerol-3-phosphate) to phosphatidic acid (PA).
  • G3P glycerol-3-phosphate
  • PA phosphatidic acid
  • PA is the starting point for the synthesis of neutral and polar lipids.
  • the neutral lipids are synthesized via, inter alia, the Kennedy pathway on the endoplasmic reticulum [Voelker (1996) Genetic Engineering, Setlow (ed.) 18: 1 11-1 13; Shankline & Cahoon (1998) Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 49: 611-649; Frentzen (1998) Lipids 100: 161-166].
  • G3P also serves to synthesize glycerol (eg for osmoregulation and against cold stress).
  • the G3P essential for the synthesis is synthesized by reduction of dihydroxyacetone phosphate (DHAP) by means of glycerol-3-phosphate dehydrogenase (G3PDH), also known as dihydroxyacetone phosphate reductase.
  • DHAP dihydroxyacetone phosphate
  • G3PDH glycerol-3-phosphate dehydrogenase
  • NADH acts as a reducing cosubstrate (EC 1.1 .1.8.).
  • Another class of glycerol-3-phosphate dehydrogenases (EC 1.1.99.5) uses FAD as cosubstrate.
  • the enzymes of this class catalyze the reaction of DHAP to G3PDH.
  • the two classes of enzymes are distributed in different compartments, with the NAD-dependent cytosolic and the FAD-dependent mitochondrially localized (for Saccharomyces cerevisiae see, for example, Larsson et al., 1998, Yeast 14: 347-357).
  • EP-A 0 353 049 describes an NAD-independent G3PDH from Bacillus sp. Also in Saccharomyces cerevisiae an NAD-independent G3PDH was identified [Miyata K, Nagahisa M (1969) Plant Cell Physiol 10 (3): 635-643].
  • G3PDH is an essential enzyme in prokaryotes and eukaryotes, which, in addition to its function in lipid biosynthesis, is also responsible for maintaining the cellular redox status by influencing the NAD + / NADH ratio.
  • the Deletion of the GPD2 gene in Saccharomyces cerevisae results in decreased growth under anaerobic conditions.
  • G3PDH seems to play a role in the yeast's stress response, especially against osmotic stress.
  • the deletion of the GPD1 gene causes a hypersensitivity to salt in Saccharomyces cerevisae.
  • sequences for G3PDHs for insects for insects (Drosophila melanogaster, Drosophila virilis), plants (Arabidopsis thaliana, Cuphea lanceolata), mammals (Homo sapiens, Mus musculus, Sus scrofa, Rattus norvegicus), fish (Salmo salar, Osmerus mordax), birds ( Ovis aries), amphibians (Xenopus laevis), namatods (Caenorhabditis elegans), algae and bacteria.
  • Plant cells have at least two isoforms of G3PDH, one cytoplasmic and one plastid [Gee RW et al. (1988) Plant Physiol 86: 98-103; Gee RW et al. (1988) Plant Physiol 87: 379-383].
  • the enzymatic activity of glycerol-3-phosphate dehydrogenase was first detected in potato tubers in plants [Santora GT et al. (1979) Arch Biochem Biophys 196: 403-411].
  • Other cytosolic and plastid localized G3PDH activities have been detected in plants such as pea, corn or soy [Gee RW et al.
  • g3PDHs from algae such as e.g. two plastid and a cytosolic G3PDH isoform of Dunaliella tertiolecta [Gee R et al. (1993) Plant Physiol 103 (1): 243-249; Gee R et al. (1989) PLANT PHYSIOL 91 (1): 345-351].
  • G3PDH from Cuphea lanceolata it has been proposed to achieve an increase in the oil content or a shift in the fatty acid pattern by overexpression in plants (WO 95/06733). However, corresponding effects could not be proven.
  • WO 01/21820 describes the heterologous expression of a mutant E. coli G3PDH for increased stress tolerance and alteration of the fatty acid composition in storage oils.
  • the mutant E. coli G3PDH (gpsA2FR) has a single amino acid change that causes decreased inhibition by G3P.
  • the heterologous expression of the gpsA2FR mutant leads to glycerolipids with an increased proportion of C16 fatty acids and a concomitant reduced proportion of C18 fatty acids.
  • the changes in the fatty acid pattern are relatively small: an increase of 2 to 5% in 16: 0 fatty acids and 1, 5 to 3.5% in 16: 3 fatty acids, as well as a decrease in 18: 2 and 18: 3 fatty acids by 2 to 5% were observed.
  • the total content as glycerolipids was unaffected.
  • WO 03/095655 describes the expression of the yeast protein Gpd i p in Arabidopsis.
  • the oil content of the analyzed Arabidopsis plants could be increased by about 22%.
  • Single seeds of a single transgenic line showed an increase of 41% compared to wild-type control plants.
  • a disadvantage of this method is that Arabidopsis is a model plant, which is unsuitable for the commercial production of oils due to their agronomic properties.
  • Arabidopsis accumulates significant amounts of eicosenoic acid (20: 1), which prohibits use of the oil in foods or pharmaceuticals.
  • G3PDH from yeasts (ascomycetes) such as
  • the fatty acid profile should as far as possible not be changed or only slightly changed between the wild type and the transgenic plant.
  • This object has been achieved by a process for increasing the total oil content in transgenic oil plants, characterized in that the transgenic oil plants contain at least 20% by weight of oleic acid based on the total fatty acid content and comprising the following process steps
  • the transgenic oil plants contain at least 21, 22, 23, 24 or 25% by weight of oleic acid, advantageously at least 26, 27, 28, 29 or 30% by weight of oleic acid based on the total fatty acid content, more preferably at least 35, 40, 45, 50, 55 or 60% by weight of oleic acid based on the total fatty acid content, most preferably at least 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69 or 70% by weight of oleic acid based on the total fatty acid content or more.
  • Plants which are advantageous for the method according to the invention also have a preferred palmitic acid content of at most 30, 29, 28, 27 or 26% by weight, advantageously 25, 24, 23, 22, 21 or 20% by weight, particularly advantageously of 15, 14, 13, 12, 1, 1, 10 or 9% by weight, based on the total fatty acid content.
  • Further advantageous plants have a linoleic acid content of at least 20, 25, 30, 35, 40, 45 or 50% by weight, preferably 55, 60, 65 or 70% by weight, based on the total fatty acid content.
  • Advantageous plants may also have a combination of the aforementioned fatty acids, the total fatty acid content being 100% by weight.
  • the total oil content in the transgenic ⁇ lplfanzen by at least 26, 27, 28, 29 or 30% by weight preferably by at least 31, 32, 33, 34 or 35% by weight, more preferably by at least 36, 37, 38 , 39 or 40% by weight, most advantageously increased by at least 41, 42, 43, 44 or 45% by weight.
  • Preferred oil plants used in the process have a high oil content in the seed.
  • Advantageous plants have an oil content of at least 20, 25, 30, 35 or 40 wt .-%, advantageously of at least 41, 42, 43, 44 or 45 wt .-%, particularly advantageously of at least 46, 47, 48, 49 or 50% by weight or more.
  • Preferred oil plants in the process produce oils, lipids and / or free fatty acids containing less than 4, 3, 2 or 1% by weight, advantageously less than 0.9; 0.8; 0.7; 0.6 or 0.5% by weight, more preferably less than 0.4; 0.3; 0.2; Contain 0.1 or 0.09 wt% or less myristic acid. Further advantageous oil plants contain less than 5, 4 or 3 wt .-% palmitic acid and / or less than 2; 1, 5 or 1 wt .-% stearic acid.
  • Advantageous oil plants should also have a low protein content in the seed in addition to a high oil content in the seed.
  • This proportion of protein should be as low as possible to be 30, 25 or 20 wt .-%, advantageously less than 19, 18, 17, 16 or 15 wt .-%.
  • the oil plants preferred in the process advantageously have no significant change in the fatty acid profile of the fatty acids C16: 0, C16: 3, C18: 0, C18: 1, C18: 2, C18: 3 and C20: 0 after introduction of the nucleic acid sequences coding for the G3PDH That is, the relative percentages of each of the stated fatty acids in total fatty acid content in weight percent remains substantially the same. Substantially equal means that the variations in the fatty acid values of the fatty acids differ by less than 5 percentage points.
  • Advantageous plants used in the process have a high yield of oil per hectare.
  • This oil crop yield is at least 100, 110, 120, 130, 140 or 150 kg oil / ha, advantageously at least 250, 300, 350, 400, 450 or 500 kg oil / ha, preferably at least 550, 600, 650, 700 , 750, 800, 850, 900 or 950 kg oil / ha, more preferably at least 1000 kg oil / ha or more.
  • all culturable oil plants are suitable for the process according to the invention.
  • oil plants selected from the group of plants consisting of the families Anacardiaceae, Arecaceae, Asteraceae, Brassicaceae, Cannabaceae, Euphorbiaceae, Fabaceae, Juglandaceae, Linaceae, Lythraceae, Oleaceae, Poaceae and Rosaceae, which already naturally high oil content and / or used for industrial recovery of oils.
  • the plants used in the process are selected from the group of oil plants selected from the group consisting of the genera and species Anacardium occidentale, Arachis hypogaea, Borago officinalis, Brassica campestris, Brassica napus, Brassica rapa, Brassica juncea, Camelina sativa, Cannabis.
  • the seed-specific, heterologous expression of the yeast gpdi p gene in the preferred plant family of Brassicaceae eg in Brassica napus and especially in the seed leads to a significant increase in the oil content as described above.
  • the oil content increase advantageously leads to an increase in the triacylglycerides (storage oils).
  • the oil content was thereby in 3 independent lines about 35% increased compared to wild-type control plants (FIG. 4).
  • the transgenic expression of yeast glycerol 3-phosphate dehydrogenase advantageously showed no adverse effects on the growth or other properties of the transformed oil plants such as the rape plants.
  • the increase in the content of triacylglycerides is advantageously achieved by an increase in G3PDH activity.
  • the glycerol-3-phosphate content in the inventive process is advantageously increased in the maturing seed of the G3PDH-expressing oil plants, preferably the transgenic Brassicaceae.
  • Glycerol-3-phosphate is an important precursor in the biosynthesis of triacylglycerides and is thus an essential precursor for increasing oil content in oil plants, especially in seeds.
  • plants or oil plants include plant cells and certain tissues, organs and parts of plants, propagation material (such as seeds, tubers and fruits) or seeds of plants, and plants in all their forms, such as anthers, fibers, Root hair, stems, leaves, embryos, ciliates, kotelydons, petioles, shoots, germs, crops, plant tissue, reproductive tissue and cell cultures derived from the actual transgenic plant and / or used to produce the transgenic plant.
  • mature plants Mature plants are to be understood as meaning plants at any developmental stage on the side of the seedling. Keimling means a young, immature plant at an early stage of development.
  • Plant includes all annuals and perennials, monocotyledonous and dicotyledonous plants and includes the above-mentioned beneficial oil plants.
  • Preferred monocotyledonous plants are in particular selected from the monocotyledonous crop plants, for example the family Poaceae such as corn.
  • dicotyledonous oil plants are advantageously used.
  • Preferred dicotyledonous plants are especially selected from the dicotyledonous crops, such as for example
  • Brassicaceae especially the genus Brassica, especially the species napus (rape), napus var. Napus or rapa ssp. oleifera (canola), juncea (sarepta mustard) Camelina sative (Leindotter) and others more,
  • Leguminosae especially the genus Glycine, especially the species max (soybean) soy or peanut and others more
  • transgenic plants containing increased oil content can be directly marketed without having to isolate the synthesized oil.
  • Plants in the process according to the invention include whole plants and all plant parts, plant organs or plant parts such as leaves, stems, seeds, roots, tubers, anthers, fibers, root hairs, stems, embryos, callosis, kotelydons, petioles, crop material, plant tissue, reproductive tissue, Cell cultures that can be derived from the transgenic plant and / or used to produce the transgenic plant.
  • the seed includes all seed parts such as the seed shells, epidermis and sperm cells, endosperm or embryonic tissue.
  • oils produced in the process according to the invention can also be isolated from the plants in the form of their oils, fat, lipids and / or free fatty acids.
  • Oils produced in the process can be obtained by harvesting the plants either from the culture in which they grow or from the field. This can be done by pressing or extraction of the plant parts, preferably the plant seeds.
  • the oils can be extracted by pressing them "cold or cold" without adding heat.To make it easier for the plant parts to digest the seeds in particular, they are first crushed, steamed or roasted.The seeds that have been pretreated can then be pressed or solvent, such as warm hexane, and then the solvent is removed, allowing more than 96% of the oils produced in the process to be isolated, and then further processing, ie, refining, the resulting products
  • the so-called degumming can be carried out enzymatically or, for example, chemically / physically by adding acid such as phosphoric acid, and then the free fatty acids can be removed by treatment with a base, for example sodium hydroxide solution It is thoroughly washed with water and dried to remove the lye remaining in the product.
  • the products are bleached with, for example, bleaching earth or activated carbon. At the end, the product is still deodorized, for example, with steam.
  • An embodiment of the invention is the use of the oils prepared by the process of the invention or obtained by mixing these oils with animal, microbial or vegetable oils, lipids or fatty acids in feed, food, cosmetics or pharmaceuticals.
  • the oils produced in the process according to the invention may be blended with other oils, lipids, fatty acids or fatty acid mixtures of animal origin, e.g. Fish oils are used. Also contained in the oils produced according to the invention, the fatty acids
  • Base treatment can be released from the oils, feed, food, cosmetics and / or pharmaceuticals in conventional amounts directly or after mixing with other oils, lipids, fatty acids or fatty acid mixtures of animal origin such. Fish oils are added.
  • oils produced in the process contain compounds such as sphingolipids,
  • Phosphoglycerides lipids, glycolipids, phospholipids, monoacylglycerols, diacylglycerides, triacylglycerides or other fatty acid esters, preferably triacylglycerides (see Table 1).
  • the saturated and unsaturated fatty acids can be released, for example via an alkali treatment, for example with aqueous KOH or NaOH or acid hydrolysis, advantageously in the presence of an alcohol, such as methanol or ethanol, or via enzymatic cleavage and isolated via, for example, phase separation and subsequent acidification over eg H 2 SO 4 .
  • the release of the fatty acids can also be carried out directly without the workup described above.
  • oil is also understood as meaning “lipids” or “fats” or “fatty acid mixtures” which contain unsaturated, saturated, preferably esterified fatty acid (s), advantageously bound in triglycerides. It is preferred that the oil.
  • the oil may contain various other saturated or unsaturated fatty acids, e.g. Palmitin, palmitoleic, stearic, oleic, linoleic or ⁇ -linolenic acid, etc. included.
  • total oil content is meant the sum of all oils, lipids, fats or fatty acid mixtures, preferably the sum of all triacylglycerides.
  • Oil includes neutral and / or polar lipids and mixtures thereof. By way of example but not by way of limitation, those listed in Table 1 should be mentioned.
  • Neutral lipids favored triacylglycerides. Both the neutral and the polar lipids may contain a wide range of different fatty acids. By way of example, but not by way of limitation, the fatty acids listed in Table 2 should be mentioned. Table 2: Overview of various fatty acids (selection) 1 Chain length: number of double bonds + occurring only in very few plant genera * not naturally occurring in higher plants
  • Oils prefers seed oils.
  • Increasing the total oil content means increasing the content of oils in a plant or part, tissue or organ thereof, preferably in the seed organs of the plant.
  • the oil content compared to a not subject to the novel process, but otherwise unchanged starting plant under otherwise identical conditions by at least 25%, preferably at least 30%, more preferably at least 35%, very particularly preferred increased at least 40%, most preferably at least 45% or more.
  • Basic conditions means all conditions relevant to the germination, cultivation or growth of the plant, such as soil, climate or light conditions, fertilization, irrigation, crop protection measures, etc.
  • the content of glycerol-3-phosphate in an oil plant is meant increasing the level in a plant or part of the plant, in tissues or organs of the same, preferably in the seed of the plant.
  • the content of glycerol-3-phosphate is at least 25, 30, 35, 40, 45 or 50 wt .-%, preferably at least 60 compared to a not subject to the inventive process, but otherwise unchanged starting plant under otherwise identical conditions 70, 80, 90 or 100%, more preferably at least 1 10, 120, 130, 140 or 150%, most preferably at least 200, 250 or 300%, most preferably at least 350 or 400% or more increased.
  • Basic conditions mean all conditions relevant to the germination, cultivation or growth of the plant, such as soil, climate or light conditions, fertilization, irrigation, crop protection measures, etc.
  • Glycerol 3-phosphate dehydrogenase from yeast (due to “yeast G3PDH”) generally means all such enzymes capable of dihydroxyacetone phosphate (DHAP) to glycerol-3-phosphate (G3P) optionally using a cosubstrate such as NADH or NADPH - and naturally expressed in a yeast.
  • DHAP dihydroxyacetone phosphate
  • G3P glycerol-3-phosphate
  • cosubstrate such as NADH or NADPH - and naturally expressed in a yeast.
  • Hefen means one of the group of unicellular fungi with pronounced cell wall and formation of pseudomyzel (in the Ggs. To molds). Their propagation is vegetative by budding and / or cleavage (Schizosaccharomyces or Saccharomyces).
  • spurious yeasts preferably the families Cryptococceae, Sporobolomycetaceae with the genera Cryptococcus, Torulopsis, Pityrosporum, Brettanomyces, Candida, Kloeckera, Trigonopsis, Trichosporon, Rhodotorula and Sporobolomyces and Bullera, and also real yeasts ( Yeasts with also sexual reproduction, Ascus), and prefers the families Endo u. Saccharomycetaceae, with the genera Saccharomyces, Debaro, Lipomyces, Hansenula, Endomycopsis, Pichia, Hanseniaspora.
  • Saccharomyces cerevisiae Pichia pastoris, Hansenula polymorpha, Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces lactis, Zygosaccharomyces rouxii, Yarrowia lipolitica, Emericella nidulans, Aspergillus nidulans, Deparymyces hansenii and Torulaspora hansenii.
  • yeast G3PDH means polypeptides which have the following properties as "essential properties":
  • sequence motif is selected from the group consisting of
  • the peptide sequence contains at least 2 or 3, most preferably at least 4 or 5, most preferably all of the sequence motifs selected from the group of sequence motifs i), ii) and iii) or selected from the group of sequence motifs iv), v) , vi), vii), viii), ix) and x.
  • sequence motifs selected from the group of sequence motifs i), ii) and iii) or selected from the group of sequence motifs iv), v) , vi), vii), viii), ix) and x.
  • a yeast G3PDH may optionally - in addition to at least one of the above sequence motifs i) to x) - further sequence motifs selected from the group consisting of
  • yeast G3PDH means the yeast protein Gpdi p according to SEQ ID NO: 2, as well as functional equivalents also functionally equivalent parts of the aforementioned.
  • Functionally equivalent parts are to be understood as sequences which are at least 51, 60, 90 or 120 bp, advantageously at least 210, 300, 330, 420 or 450 bp, particularly advantageously at least 525, 540, 570 or 600 bp, very particularly preferably at least 660 , 720, 810, 900 or 1101 bp or more.
  • Functional equivalents means, in particular, natural or artificial mutations of the yeast protein Gpdi p according to SEQ ID NO: 2 and homologous polypeptides from other yeasts which have the same essential properties of a yeast G3PDH, as defined above. Mutations include substitutions, additions, deletions, inversions or insertions of one or more amino acid residues. More preferably, the polypeptides are described by SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 38 or SEQ ID NO: 40.
  • the yeast G3PDH useful for the purposes of this invention can be obtained by database search or screening of gene or cDNA libraries - using the yeast exemplified G3PDH sequence according to SEQ ID NO: 2 or the nucleic acid sequence according to SEQ ID NO: 1 as a search sequence or probe - easily found.
  • functional equivalents have a homology of at least 50 or 60%, more preferably at least 70 or 80%, more preferably at least 85 or 90%, most preferably at least 91, 92, 93, 94, 95 or 96% or more to the protein with SEQ ID NO: 2.
  • Homology between two polypeptides is understood to mean the identity of the amino acid sequence over the entire length of the sequence, by comparison with the aid of the GAP program algorithm (Wisconsin Package Version 10.0, University of Wisconsin, Genetics Computer Group (GCG), Madison, USA) with the following parameters is calculated:
  • Gap Weight 8 Length Weight: 2
  • a sequence having a homology of at least 80% protein-based with the sequence SEQ ID NO: 2 a sequence understood that in a comparison with the sequence SEQ ID NO: 2 according to the above program algorithm with the above parameter set a homology of at least 80%.
  • Functional equivalents also include those proteins which are encoded by nucleic acid sequences having a homology of at least 60, 70 or 80%, more preferably at least 85, 87, 88, 89 or 90%, more preferably at least 91, 92, 93, 94 or 95%, most preferably at least 96, 97, 98 or 99% to the nucleic acid sequence having SEQ ID NO: 1.
  • Homology between two nucleic acid sequences is understood to mean the identity of the two nucleic acid sequences over the respective sequence length, which are compared by means of the GAP program algorithm (Wisconsin Package Version 10.0, University of Wisconsin, Genetics Computer Group (GCG), Madison, USA; Altschul et al (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3389ff) is calculated with the following parameters:
  • Gap Weight 50 Length Weight: 3
  • Functional equivalents also include those proteins which are expressed by nucleic acid Sequences are coded, which hybridize under standard conditions with one of the nucleic acid sequence described by SEQ ID NO: 1, which hybridize to this complementary nucleic acid sequence or parts of the aforementioned and have the essential properties of a yeast G3PDH.
  • Standard hybridization conditions is to be understood broadly and means stringent as well as less stringent hybridization conditions. Such hybridization conditions are described, inter alia, in Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T et al., In Molecular Cloning (A Laboratory Manual), 2nd edition, CoId Spring Harbor Laboratory Press, 1989, pages 9.31-9.57) or in Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1989), 6.3.1 -e.S.e.
  • the conditions during the wash step can be selected from the range of conditions limited by those with low stringency (with approximately 2 ⁇ SSC at 50 0 C.) and preferably at high stringency (approximately 0.2X SSC at 50 0 C at 65 ° C) (2OX SSC: 0.3M sodium citrate, 3M NaCl, pH 7.0).
  • denaturing agents such as formamide or SDS may also be used. In the presence of 50% formamide, hybridization is preferably carried out at 42 ° C.
  • the nucleic acid sequences used are advantageously introduced into a transgenic expression construct which can ensure a transgenic expression of a yeast G3PDH, in a plant or a tissue, organ, part, cell or propagation material of the plant.
  • a nucleic acid molecule coding for a yeast G3PDH is preferably in functional linkage with at least one genetic control element (for example a promoter and / or terminator) which expresses in a plant organism or a tissue, organ, part, cell or Propagating material of the same guaranteed.
  • at least one genetic control element for example a promoter and / or terminator
  • transgenic expression cassettes which contain a nucleic acid sequence coding for a glycerol-3-phosphate dehydrogenase which is selected from the group consisting of the sequences a) a sequence having SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 37 or SEQ ID NO: 39 or
  • a functional linkage is understood as meaning, for example, the sequential arrangement of a promoter with the nucleic acid sequence coding for a yeast G3PDH (for example the sequence according to SEQ ID NO: 1) and optionally further regulatory elements such as a terminator such that each the regulatory elements can fulfill its function in the transgenic expression of the nucleic acid sequence.
  • This does not necessarily require a direct link in the chemical sense.
  • Genetic control sequences such as enhancer sequences, may also exert their function on the target sequence from more distant locations or even from other DNA molecules.
  • Preference is given to arrangements in which the nucleic acid sequence to be transgenically expressed is positioned behind the sequence acting as a promoter, so that both sequences are covalently linked to one another.
  • the distance between the promoter sequence and the nucleic acid sequence to be expressed transgenically is preferably less than 200 base pairs, more preferably less than 100 base pairs, very particularly preferably less than 50 base pairs.
  • Expression cassette can be made using standard recombinant and cloning techniques as described, for example, in Maniatis T, Fritsch EF and Sambrook J (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, ColD Spring Harbor Laboratory, ColD Spring Harbor (NY), Silhavy TJ, Berman ML and Enquist LW (1984) Experiments with Gene Fusion, CoId Spring Harbor Laboratory, ColD Spring Harbor (NY), in
  • the expression cassette consisting of a linkage of promoter and nucleic acid sequence to be expressed, integrated in a vector and be inserted by, for example, transformation into a plant genome.
  • an expression cassette is also to be understood as those constructions in which the nucleic acid sequence coding for a yeast G3PDH is placed behind an endogenous promoter, which causes it to express the yeast G3PDH.
  • promoters which are functional in a plant organism or a tissue, organ, part, cell or propagation material are preferably used.
  • functional promoters in plant organisms means any promoter which can control the expression of genes, in particular foreign genes, in plants or parts of plants, cells, tissues or cultures.
  • the expression may be, for example, constitutive, inducible or developmentally dependent.
  • Constant promoters means those promoters which ensure expression in numerous, preferably all, tissues over a longer period of plant development, preferably at all times in plant development (Benfey et al. (1989) EMBO J 8: 2195-2202).
  • a plant promoter or a promoter derived from a plant virus Particularly preferred is the promoter of the 35S transcript of CaMV cauliflower mosaic virus (Franck et al., (1980) Cell 21: 285-294; Odell et al. (1985) Nature 313: 810-812; Shewmaker et al. (1985) Virology 140: 281-288; Gardner et al.
  • nucleotides 3862 to 5325 or alternatively 5342 or the promoter of a proline-rich protein from wheat (WO 91/13991), as well as further promoters of genes whose constitutive expression in plants is known to the person skilled in the art.
  • Preferred are the CaMV 35S promoter or the nitrilase-1 promoter us Arabidopsis thaliana.
  • promoters having specificities for seeds such as the promoter of phaseolin (US 5,504,200, Bustos MM et al., (1989) Plant Cell 1 (9): 839-53), 2S albumining (Joseffson LG et al. 1987) J Biol Chem 262: 12196-12201), the legume (Shirsat A et al., (1989) Mol Gen Genet 215 (2): 326-331), the USP (unknown seed protein, Baumlein H et al ) Mol Gen Genet 225 (3): 459-67), the napin gene (US 5,608,152, Stalberg K et al.
  • phaseolin US 5,504,200, Bustos MM et al., (1989) Plant Cell 1 (9): 839-53
  • 2S albumining Joseffson LG et al. 1987) J Biol Chem 262: 12196-12201
  • the legume Shirsat A et al., (1989) Mol Gen Genet 2
  • seed-specific promoters are those of the genes coding for high molecular weight glutenin (HMWG), gliadin, branching enzyme, ADP
  • Glucose pyrophosphatase (AGPase) or starch synthase. Also preferred are promoters which allow seed-specific expression in monocotyledons such as corn, barley, wheat, rye, rice, etc.
  • the promoters of the lpt2 or lpt1 gene (WO 95/15389, WO 95/23230) or the promoters described in WO 99/16890 (promoters of the hordein gene, the glutelin gene, the oryzine gene, of the Prolamin gene, the gliadin gene, the glutelin gene, the zein gene, the kasirin gene or the secalin gene).
  • the expression cassettes may also contain a chemically inducible promoter (reviewed in: Gatz et al., (1997) Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 48: 89-108), which controls the expression of the exogenous gene in the plant at a particular time ,
  • a chemically inducible promoter as e.g. the PRP1 promoter (Ward et al. (1993) Plant Mol Biol 22: 361-366), salicylic acid-inducible promoter (WO 95/19443), a benzenesulfonamide-inducible promoter (EP 0 388 186), a tetracyclic inducible promoter (Gatz et al. (1992) Plant J 2: 397-404), a scisinic acid-inducible promoter (EP 0 335 528) or an ethanol- or cyclohexanone-inducible promoter (WO
  • GST-II-27 the promoter of the glutathione-S-transferase isoform II gene (GST-II-27), which is produced by exogenously applied safeners, such as e.g. N, N-diallyl-2,2-dichloroacetamide can be activated (WO 93/01294) and is functional in numerous tissues of both monocotyledons and dicotyledons.
  • constitutive and very particularly preferably seed-specific promoters in particular the napin and the USP promoters.
  • promoters can be functionally linked to the nucleic acid sequence to be expressed, which can be expressed in further plant tissues or in other organisms, such as E. coli bacteria allow.
  • all promoters described above are suitable as plant promoters.
  • the nucleic acid sequences contained in the expression cassettes or vectors may be functionally linked to other genetic control sequences in addition to a promoter.
  • the term "genetic control sequences" is to be understood broadly and means all those sequences which have an influence on the production or the function of the expression cassette according to the invention. For example, genetic control sequences modify transcription and translation in prokaryotic or eukaryotic organisms.
  • the expression cassettes according to the invention preferably comprise a plant-specific promoter 5'-upstream of the respective transgene-to-be-expressed promoter and 3'-downstream a terminator sequence as additional genetic control sequence, and optionally further customary regulatory elements, in each case functionally linked to the nucleic acid sequence to be transgeneically expressed.
  • Genetic control sequences also include other promoters, promoter elements or minimal promoters that can modify the expression-controlling properties.
  • the tissue-specific expression can additionally take place as a function of specific stress factors.
  • Corresponding elements are exemplified by water stress, abscisic acid (Lam E and Chua NH, J Biol Chem 1991, 266 (26): 17131-17135) and heat stress (Schoffl F et al. (1989) Mol Gen Genetics 217 (2-3)). : 246-53).
  • control sequences are, for example, in the gram-positive promoters amy and SPO2, in the yeast or fungal promoters ADC1, MFa, AC, P-60, CYC1, GAPDH, TEF, rp28, ADH.
  • Genetic control sequences also include the 5 'untranslated regions n, introns or non-coding 3' region of genes such as actin-1
  • Intron or the Adh1-S introns 1, 2 and 6 (commonly: The Maize Handbook, Chapter 116, Freeling and Walbot, Eds., Springer, New York (1994)). These have been shown to play a significant role in the regulation of gene expression. It has been shown that 5'-untranslated sequences can enhance the transient expression of heterologous genes. Exemplary of translation enhancers is the 5 'leader sequence from the tobacco mosaic virus (GaINe et al. (1987) Nucl Acids Res 15: 8693-8711) and the like. They may also promote tissue specificity (Rouster J et al. (1998) Plant J 15: 435-440).
  • the expression cassette may advantageously contain one or more so-called enhancer sequences functionally linked to the promoter, which allow increased transgenic expression of the nucleic acid sequence. Also at the 3 'end of the transgenic nucleic acid sequences to be expressed additional advantageous sequences can be inserted, such as other regulatory elements or terminators.
  • the transgenic nucleic acid sequences to be expressed may be contained in one or more copies in the gene construct.
  • Polyadenylation signals suitable as control sequences are plant polyadenylation signals, preferably those which are essentially T-DNA polyadenylation signals.
  • Signals from Agrobacterium tumefaciens, in particular gene 3 of the T-DNA (octopine synthase) of the Ti plasmid pTiACHS correspond (Gielen et al. (1984) EMBO J 3: 835 ff) or functional equivalents thereof.
  • Examples of particularly suitable terminator sequences are the OCS (octopine synthase) terminator and the NOS (nopaline synthase) terminator.
  • Control sequences are furthermore to be understood as meaning those which permit homologous recombination or insertion into the genome of a host organism or permit removal from the genome.
  • the coding sequence of a particular endogenous gene can be selectively exchanged for the sequence coding for a dsRNA.
  • Methods such as the cre / lox technology allow for tissue-specific, possibly inducible removal of the expression cassette from the genome of the host organism (Sauer B (1998) Methods. 14 (4): 381-92).
  • certain flanking sequences are added to the target gene (lox sequences), which later enable removal by means of the cre recombinase.
  • an expression cassette and the vectors derived from it can contain further functional elements.
  • the term functional element is to be understood broadly and means all those elements which have an influence on the production, multiplication or function of the expression cassettes, vectors or transgenic organisms according to the invention.
  • functional element is to be understood broadly and means all those elements which have an influence on the production, multiplication or function of the expression cassettes, vectors or transgenic organisms according to the invention.
  • Selection markers which confer resistance to a metabolism inhibitor such as 2-deoxyglucose-6-phosphate (WO 98/45456), antibiotics or biocides, preferably herbicides such as kanamycin, G 418, bleomycin, hygromycin or phosphinotricin etc.
  • herbicides such as kanamycin, G 418, bleomycin, hygromycin or phosphinotricin etc.
  • Particularly preferred selection markers are those which confer resistance to herbicides. Examples include:
  • Reporter genes which code for easily quantifiable proteins and ensure an evaluation of the transformation efficiency or of the expression site or time point via intrinsic color or enzyme activity. Very particular preference is given to reporter proteins (Schenborn E, Groskreutz D. Mol Biotechnol 1999, 13 (1): 29-44), such as the "green fluorescence protein” (GFP) (Sheen et al. (1995) Plant Journal 8 (5): 777-784), chloramphenicol transferase, a luciferase (Ow et al. (1986) Science 234: 856-859), the aequorin gene (Prasher et al.
  • GFP green fluorescence protein
  • Replication origins that ensure an increase of the expression cassettes or vectors according to the invention in, for example, E. coli.
  • Replication origins include ORI (origin of DNA replication), the pBR322 ori or the P15A oh
  • the transgenic expression cassette or the expression vectors may contain further nucleic acid sequences which do not code for a yeast G3PDH and whose transgenic expression leads to an additional increase in fatty acid biosynthesis (as a result of pro-OL).
  • This additional transgenically expressed proOIL nucleic acid sequence may be selected by way of example but not limitation from nucleic acids encoding acetyl-CoA carboxylase (ACCase), glycerol-3-phosphate acyltransferase (GPAT), lysophosphatidate acyltransferase (LPAT), diacylglycerol acyltransferase (DAGAT) and Phospholipid: diacylglycerol acyltransferase (PDAT).
  • ACCase acetyl-CoA carboxylase
  • GPAT glycerol-3-phosphate acyltransferase
  • LPAT lysophosphatidate acyltransferase
  • DGAT diacylglycerol acyltransferase
  • PDAT Phospholipid: diacylglycerol acyltransferase
  • an expression cassette according to the invention into an organism or cells, tissues, organs, parts or seeds thereof (preferably in plants or plant cells, tissues, organs, parts or seeds) can advantageously be realized using vectors in which the Expression cassettes are included.
  • a further subject of the invention therefore relates to said transgenic vectors comprising a transgenic expression cassette for a yeast G3PDH.
  • Vectors may be, for example, plasmids, cosmids, phages, viruses or else agrobacteria.
  • the expression cassette can be introduced into the vector (preferably a plasmid vector) via a suitable restriction site.
  • the resulting vector is first introduced into E. coli. Correctly transformed E. coli are selected, grown and the recombinant vector obtained by methods familiar to those skilled in the art. Restriction analysis and sequencing can serve to test the cloning step. Preference is given to those vectors which enable a stable integration of the expression cassette into the host genome.
  • the production of a corresponding transgenic plant organism takes place, for example, by means of transformation or transfection using the corresponding proteins or nucleic acids.
  • the production of a transformed organism requires that the appropriate DNA (eg the expression vector), RNA or protein be introduced into the corresponding host cell.
  • transformation or transfection
  • DNA or RNA can be directly injected by microinjection or by bombardment with DNA-coated microtubes. Particles are introduced.
  • the cell can be permeabilized chemically, for example with polyethylene glycol, so that the DNA can enter the cell by diffusion.
  • the DNA can also be made by protoplast fusion with other DNA-containing moieties such as minicells, cells, lysosomes or liposomes. Electroporation is another suitable method for introducing DNA, in which the cells are reversibly permeabilized by an electrical pulse. Also possible are the swelling of plant parts in DNA solutions as well as pollen or pollen tube transformation. Corresponding methods have been described (for example, Bilang et al., (1991) Gene 100: 247-250, Scheid et al (1991) Mol Gen Gen 228: 104-112, Guerche et al (1987) Plant Science 52: 11 Neuhaus et al. (1987) Theor Appl Genet 75: 30-36; Klein et al.
  • Suitable methods are in particular the protoplast transformation by polyethylene glycol-induced DNA uptake, the biolistic method with the gene gun, the so-called particle bombardment method, the electroporation, the incubation of dry embryos in DNA-containing solution and the microinjection.
  • transformation can also be performed by bacterial infection by Agrobacterium tumefaciens or Agrobacterium rhizogenes and transfer of corresponding recombinant Ti plasmids or Ri plasmids by or through infection with transgenic plant viruses.
  • Agrobacterium-mediated transformation is best suited for dicotyledonous plant cells. The methods are described, for example, in Horsch RB et al. (1985) Science 225: 1229f).
  • the expression cassette is to be integrated into special plasmids, either into an intermediate vector (shuttle or intermediate vector) or a binary vector. If a Ti or Ri plasmid is to be used for transformation, at least the right boundary, but most often the right and left borders of the Ti or Ri plasmid T-DNA as flanking region connected to the expression cassette to be introduced.
  • binary vectors are used.
  • Binary vectors can replicate in both E. coli and Agrobacterium. They usually contain a selection marker gene and a linker or polylinker flanked by the right and left T-DNA restriction sequence. They can be transformed directly into Agrobacterium (Holsters et al., (1978) Mol Gen Genet 163: 181-187).
  • the selection marker gene allows selection of transformed Agrobacteria and is, for example, the nptll gene conferring resistance to kanamycin.
  • the Agrobacterium acting as a host organism in this case should already contain a plasmid with the vir region. This is required for the transfer of T-DNA to the plant cell.
  • Such transformed Agrobacterium can be used to transform plant cells.
  • T-DNA for the transformation of plant cells has been extensively studied and described (EP 120 516, Hoekema, In: The Binary Planet Vector System, Offsetdrukkerij Kanters BV, Alblasserdam, Chapter V, An et al., (1985) EMBO J 4 : 277-287).
  • Various binary vectors are known and partially commercially available such as pBI101.2 or pBIN19 (Clontech Laboratories, Inc. USA).
  • Direct transformation techniques are suitable for every organism and cell type.
  • no special requirements are placed on the plasmid used.
  • Simple plasmids such as the pUC series can be used. Should be complete
  • Plants are regenerated from the transformed cells, it is necessary that there is an additional selectable marker gene on the plasmid.
  • Stably transformed cells ie those containing the introduced DNA integrated into the DNA of the host cell, can be selected from untransformed if a selectable marker is part of the introduced DNA.
  • a selectable marker is part of the introduced DNA.
  • any gene which can confer resistance to antibiotics or herbicides such as kanamycin, G 418, bleomycin, hygromycin or phosphinotricin, etc.
  • Transformed cells expressing such a marker gene are in able to survive in the presence of concentrations of a corresponding antibiotic or herbicide that kill an untransformed wild type. Examples are mentioned above and preferably include the bar gene that confers resistance to the herbicide phosphinotricin (Rathore KS et al. (1993) Plant Mol Biol 21 (5): 871-884), the nptll gene that confers resistance to kanamycin, the hpt gene, that
  • the selection marker allows the selection of transformed cells from transformed (McCormick et al. (1986) Plant Cell Reports 5: 81-84). The resulting plants can be grown and crossed in the usual way. Two or more generations should be cultured to ensure that genomic integration is stable and hereditary.
  • the construct to be expressed is cloned into a vector suitable for transforming Agrobacterium tumefaciens, for example pBin19 (Bevan et al. (1984) Nucl Acids Res 12: 8711f).
  • a complete plant can be obtained using methods known to those skilled in the art. This is an example of callus cultures. From these still undifferentiated cell masses, the formation of shoot and root can be induced in a known manner. The obtained sprouts can be planted out and bred.
  • transgene or “recombinant” is meant, for example, a nucleic acid sequence, an expression cassette or a vector containing said nucleic acid sequence or an organism transformed with said nucleic acid sequence, expression cassette or vector any such constructions resulting from genetic engineering in which either a) the nucleic acid sequence encoding a yeast G3PDH, or
  • Natural genetic environment means the natural chromosome locus in the organism of origin or the presence in a genomic library. In the case of a genomic library, the natural genetic environment of the nucleic acid sequence is preferably at least partially conserved. The environment flanks the nucleic acid sequence at least on one side and has a sequence length of at least 50 bp, preferably at least 500 bp, more preferably at least 1000 bp, most preferably at least 5000 bp.
  • a naturally occurring expression cassette for example the naturally occurring combination of the promoter of a gene encoding a yeast G3PDH, becomes a transgenic expression cassette when modified by non-natural, synthetic ("artificial") methods such as mutagenization.
  • non-natural, synthetic methods such as mutagenization.
  • Preferred host or starting organisms as transgenic organisms are, in particular, plants as defined above. Included within the scope of the invention are all genera and species of monocotyledonous and dicotyledonous plants of the plant kingdom, in particular plants used for the production of oils, such as, for example, oilseed rape, sunflower, sesame, safflower, olive tree, soya, maize and nut species. Also included are the mature plants, seeds, sprouts and seedlings, as well as derived parts, propagation material and cultures, for example cell cultures. Mature plants means plants to any developmental stage beyond the seedling. Keimling means a young, immature plant at an early stage of development.
  • transgenic plants can be carried out by the methods described above to transform or transfect organisms.
  • Another object of the invention relates to the direct use of the transgenic plants according to the invention and the cells derived from them, cell cultures, parts - such as in transgenic plants roots, leaves, etc.-, and transgenic propagation material such as seeds or fruits, for the production of food or feed, cosmetics or pharmaceuticals, in particular of oils, fats, fatty acids or derivatives of the abovementioned.
  • the plants or plant parts are added to food, feed, cosmetics, pharmaceuticals or products with industrial applications in conventional amounts.
  • the oils and / or optionally free fatty acids can be obtained and added to the foodstuffs, feedstuffs, cosmetics, pharmaceuticals or products with industrial applications in conventional amounts.
  • transgenic expression of a yeast G3PDH in plants can mediate further beneficial effects, such as increased stress resistance, e.g. against osmotic stress.
  • the yeast G3PDH provides protection against such stress via elevated glycerol levels by acting as an osmoprotective agent.
  • osmotic stress occurs, for example, in saline soils and water and is an increasing problem in agriculture.
  • An increased stress tolerance offers, for example, the possibility of agricultural use of land in which conventional crops can not thrive.
  • the transgenic expression of the yeast G3PDH can influence the NADH level and thus the REDOX balance in the plant organism.
  • Stress such as dryness, heat, cold, UV light, etc. can increase NADH
  • the transgenic expression of the yeast G3PDH can degrade an excess of NADH under said stress conditions, thus stabilizing the REDOX balance and mitigating the effects of stress.
  • SEQ ID NO: 8 Nucleic acid sequence encoding Schizosaccharomyces pombe G3PDH
  • SEQ ID NO: 18 oligonucleotide primer OPNI ö'-ACTAGTATGTCTGCTGCTGCTGATAG-S '
  • SEQ ID NO: 19 oligonucleotide primer OPN2 ⁇ '-CTCGAGATCTTCATGTAGATCT AATT-3 1
  • SEQ ID NO: 20 oligonucleotide primer OPN3 5'-GCGGCCGCCATGTCTGCTGCTGCTGATAG-S '
  • SEQ ID NO: 21 oligonucleotide primer OPN4 5'-GCGGCCGCATCTTCATGTAGATCTAATT-S '
  • SEQ ID NOs: 22-35 SEQ ID NOs: 22-35: Sequence motifs for yeast G3PDHs indicating possible sequence variations (see above). The variations of a single motif can occur individually but also in different combinations with each other.
  • Expression vector pGPTV-gpd1 based on pGPTV-Napin for S. cerevisiae G3PDH (Gpdip, insert gdp1 of bp 11962-13137, nos terminator: 13154-13408, napin promoter: 10807-11951).
  • SEQ ID NO: 37 Nucleic acid sequence encoding Emericella nidulans G3PDH
  • FIG. 1 Northern blot. Proof of transcription of the yeast GPD1 gene in ripening seeds of transgenic rapeseed lines (8, 6, 9 and 3). As a comparison, the same detection has been carried out with wild-type (WT) plants. In lines 8, 6 and 9, the GPD1 transcript could be detected. In line 3 there was no expression of the GPD1 gene.
  • WT wild-type
  • FIG. 2 Glycerol-3-phosphate amount in maturing seeds (40 days after flowering DAF) of transgenic GPD1 rape lines 8, 6 and 9 (black bars).
  • WT untransformed Wilt type plants
  • T non-expressing transgenic line 3
  • FIG. 3 Glycerol-3-phosphate dehydrogenase activity in maturing seeds (40
  • Figure 4 Total amount of lipid in the seeds of transgenic GPD1 p-rapeseed lines
  • FIG. 5 shows a sequence comparison of homologs of G3PDH from other yeasts.
  • oligonucleotides can be carried out, for example, in a known manner by the phosphoamidite method (Voet, Voet, 2nd edition, Wiley Press New York, pages 896-897).
  • the carried out in the context of the present invention cloning steps such.
  • B. restriction cleavage, agarose gel electrophoresis, purification of DNA fragments, transfer of nucleic acids to nitrocellulose and nylon membranes, linking DNA fragments, transformation of E. coli cells, bacterial growth, propagation of phages and sequence analysis of recombinant DNA are as in Sambrook et al. (1989) CoId Sprig ng Harbor
  • the sequencing of recombinant DNA molecules is carried out with a laser fluorescence DNA sequencer from the company ABI according to the method of Sanger (Sanger et al. (1977) Proc Natl Acad Sci USA 74: 5463-5467).
  • Genomic DNA from Saccharomyces cerevisiae S288C (Mat alpha SUC2 times mel gal2 CUP1 flo1 Flo8-1, Invitrogen, Karlsuhe, Germany) was isolated according to the following protocol:
  • a 100 ml culture was grown to an optical density of 1.0 at 30 ° C. Of these, 60 ml were centrifuged off at 3000 xg for 3 min. The pellet was resuspended in 6 ml of double-distilled H 2 O and distributed to 1.5 ml vials, spun down and the supernatant discarded. The pellets were resuspended by vortexing with 200 ⁇ l solution A, 200 ⁇ l phenol / chloroform (1: 1) and 0.3 g glass beads and lysed. After addition of 200 ⁇ l of TE buffer pH 8.0, centrifugation was carried out for 5 minutes. The supernatant was subjected to ethanol precipitation with 1 ml of ethanol.
  • the resulting pellet after precipitation was dissolved in 400 ⁇ L TE buffer pH 8.0 + 30 ⁇ g / mL RnaseA. After incubation for 5 min at 37 0 C 18 ⁇ l_ 3 M sodium acetate solution pH 4.8 and 1 mL ethanol were added and the precipitated DNA was pelleted by centrifugation. The DNA pellet was dissolved in 25 ⁇ l of double distilled H 2 O. The concentration of genomic DNA was determined by its absorbance at 260 nm.
  • the isolated yeast DNA was used in a PCR reaction with the oligonucleotide primers ONP1 and ONP2.
  • Sequence primer pair 1 ⁇ '-ACTAGTATGTCTGCTGCTGCTGATAG
  • Sequence primer pair 2 ⁇ '-CTCGAGATCTTCATGTAGATCTAATT
  • yeast genomic DNA 5.00 ⁇ L 10x buffer (Advantage polymerase) + 25 mM MgCl 2 5.00 ⁇ L 2 mM dNTP 1.25 ⁇ L per primer (10 pmol / ⁇ L) 0.50 ⁇ L Advantage polymerase
  • the PCR product was cloned into the pCR2.1-TOPO vector (Invitrogen) according to the manufacturer's instructions, resulting in the vector pCR2.1-gpd1 and the sequence was checked by sequencing.
  • pGPTV 0.5 ⁇ g of the agrotransformation vector
  • Vector pCR2.1-gpd1 with the restriction enzyme Xhol (New England Biolabs) for 2 hours and then incubated for 15 min with Klenow fragment (New England Biolabs). After incubation with Spei for 2 hours, the DNA fragments were separated by gel selector phoresis. The 1185 bp fragment of the gpd1 sequence next to the vector (3.9 kb) was excised from the gel and mixed with the restriction enzyme Xhol (New England Biolabs) for 2 hours and then incubated for 15 min with Klenow fragment (New England Biolabs). After incubation with Spei for 2 hours, the DNA fragments were separated by gel selector phoresis. The 1185 bp fragment of the gpd1 sequence next to the vector (3.9 kb) was excised from the gel and mixed with the
  • Vector pGPTV were ligated overnight at 16 ° C (T4 ligase from New England Biolabs). The ligation products are then transformed into TOP10 cells (Stratagene) according to the manufacturer's instructions and selected accordingly, resulting in the vector pGPTV-gpd1. Positive clones are verified with primers 1 and 2 by PCR and sequencing.
  • a PCR of the vector pCR2.1-gpd1 was performed with primers 3 and 4.
  • the ligation products are then transformed into TOP 10 cells (Stratagene) according to the manufacturer's instructions and classified according to selection, resulting in the vector pSUN-USP-gpd1. Positive clones are verified with primers 3 and 4 by PCR and sequencing.
  • binary vectors such as pBinAR can be used (Hofgen and Willmitzer (1990) Plant Science 66: 221-230).
  • the construction of the binary vectors can be done by ligation of the cDNA in sense or antisense orientation into T-DNA. 5 'of the cDNA, a plant promoter activates the transcription of the cDNA.
  • a polyadenylation sequence is 3 'to the cDNA.
  • tissue-specific expression can be achieved using a tissue-specific promoter.
  • seed-specific expression can be achieved by cloning in the napin or LeB4 or the USP promoter 5 'of the cDNA. Any other seed-specific promoter element can also be used.
  • the CaMV 35S promoter can be used for constitutive expression throughout the plant.
  • Another example of a binary vector is the vector pSUN-USP and pGPTV-Napin in which the fragments of the fragment from Example 2 were cloned.
  • the vector pSUN-USP contains the USP promoter and the OCS terminator.
  • the vector pGPTV-napin contains a truncated version of the napin promoter and the nos terminator.
  • Example 2 The fragments of Example 2 were cloned into the multiple cloning site of the vector pSUN-USP and pGPTV-napin, respectively, to allow for seed-specific expression of the GPD1 gene.
  • the corresponding construct pSUN-USP-gpd1 is described by SEQ ID NO: 16
  • the construct of G3PDH in pGPTV-Napin is described by SEQ ID NO: 36.
  • Example 3 Transformation of Agrobacterium
  • the Agrobacterium -mediated plant transformation can be carried out, for example, using the Agrobacterium tumefaciens strains GV3101 (pM P90) (Koncz and Schell (1986) Mol Gen Genet 204: 383-396) or LBA4404 (Clontech).
  • the transformation can be performed by standard transformation techniques (Deblaere et al., (1984) Nucl Acids Res 13: 4777-4788).
  • Agrobacterium-mediated plant transformation was performed using standard transformation and regeneration techniques (Gelvin, Stanton B., Schilperoort, Robert A., Plant Molecular Biology Manual, 2nd ed., Dordrecht: Kluwer Academic Publ., 1995, in Sect., Ringbuc Central Signature: BT11-P ISBN 0-7923-2731-4; Glick, Bernard R., Thompson, Joh n E., Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Boca Raton: CRC Press, 1993, 360 pp ., ISBN 0-8493-5164-2).
  • Rapeseed was transformed by cotyledon or hypocotyl transformation (Moloney et al., Plant Cell Report 8 (1989) 238-242; De Block et al., Plant Physiol. 91 (1989) 694-701).
  • the use of antibiotics for Agrobacterium and plant selection depends on the binary vector and Agrobacterium strain used for the transformation. Rapeseed selection was performed using kanamycin as a selectable plant marker.
  • the Agrobacterium-mediated gene transfer in flax can be determined using, for example, one of Mlynarova et al. (1994) Plant Cell Report 13: 282-285.
  • Transformation of soy may be accomplished using, for example, a technique described in EP-A-0 0424 047 (Pioneer Hi-Bred International) or in EP-A-0 039 7 687, US 5,376,543, US 5,169,770 (University Toledo).
  • a suitable method for determining the amount of transcription of the gene is the performance of a Northern blot as set forth below (for reference, see Ausubel et al. 1988) Current Protocols in Molecular Biology, Wiley: New York, or the Example part mentioned above), wherein a primer designed to bind to the gene of interest is labeled with a detectable label (usually radioactive or chemiluminescent) such that when the total RNA of a culture of the organism is extracted, separated on a gel, transferred to a stable matrix and incubated with this probe, the binding and extent of binding of the probe determines the presence as well as the amount of mRNA for indicating this gene.
  • a detectable label usually radioactive or chemiluminescent
  • Total cellular RNA may be prepared from cells, tissues or organs by a variety of methods, all known in the art, such as that described by Bormann, E.R., et al. (1992) Mol. Microbiol. 6: 317-326.
  • RNA hybridization 20 ⁇ g of total RNA or 1 ⁇ g of poly (A) + RNA were purified by gel electrophoresis in 1.25% strength agarose gels using formaldehyde as described in Amasino (1986, Anal. Biochem 152, 304), transferred by capillary attraction using 10 ⁇ SSC to positively charged nylon membranes (Hybond N +, Amersham, Braunschweig), immobilized by UV light and incubated for 3 hours at 68 ° C. using hybridization buffer (10%). Dextran sulfate, w / v, 1 M NaCl, 1% SDS, 100 mg herring sperm DNA).
  • Standard techniques such as western blotting, can be used to study the presence or relative amount of protein translated from this mRNA (see, for example, Ausubel et al., (1988) Current Protocols in Molecular Biology, Wiley: New York).
  • the total cellular proteins are extracted, separated by gel electrophoresis, on a matrix, such as
  • This probe is usually provided with a chemiluminescent or colorimetric label that is easily detected. The presence and amount of label observed indicates the presence and amount of the desired mutant protein present in the cell.
  • FIG. 1 shows the results of the Northern blot of 4 independent transgenic rapeseed lines and of the wild-type.
  • the plants of lines 6, 8 and 9 show a strong detection signal on the Northern blot.
  • the plants consequently express the GPD1 gene in ripening seeds.
  • the transcription of the GPD1 gene was not detected in the semen sample of line 3 and served as an additional control in addition to the wild type.
  • line 3 shows that the expression of the transferred gene, depending on the place of integration into the genome of Brassica napus not always succeed.
  • Example 6 Analysis of the effect of the recombinant proteins on the production of the desired product
  • the effect of genetic modification in plants or on the production of a desired compound may be determined by cultivating the modified plant under appropriate conditions (such as those described above) and the medium and / or cellular components the increased production of the desired product (ie lipids or a fatty acid) is examined.
  • a desired compound such as a fatty acid
  • These analytical techniques are known to the person skilled in the art and include spectroscopy, thin-layer chromatography, staining methods of various types, enzymatic and microbiological methods as well as analytical chromatography, such as high-performance liquid chromatography (see, for example, Ullman, Encyclopedia of Industrial Chemistry, Volume A2, pages 89-90 and Pp.
  • FAME fatty acid methyl ester
  • GC-MS gas-liquid chromatography-mass spectrometry
  • TAG triacylglycerol
  • TLC thin-layer chromatography
  • the unambiguous evidence for the presence of fatty acid products can be obtained by analysis of recombinant organisms by standard analytical methods: GC, GC-MS or TLC as variously described by Christie and the references therein (1997, in: Advances on Lipid Methodology, Fourth Edition. Christie, Oliver Press, Dundee, 119-169; 1998, Gas Chromatography Mass Spectrometry Method, Lipids 33: 343-353).
  • the material to be analyzed may be broken up by sonication, milling in the glass mill, liquid nitrogen and milling or other applicable methods.
  • the material must be centrifuged after rupture.
  • the sediment is distilled in aqua. resuspended, heated at 100 ° C. for 10 minutes, cooled on ice and recentrifuged, followed by extraction into 0.5 M sulfuric acid in methanol with 2% dimethoxypropane for 1 hour at 90 ° C., resulting in hydrolyzed oil and lipid compounds that produce transmethylated lipids.
  • fatty acid methyl esters are extracted in petroleum ether and finally subjected to GC analysis using a capillary column (Chrompack, WCOT fused silica, CP-Wax-52 CB, 25 microm, 0.32 mm) at a temperature gradient between 170 0 C and 240 ° C for 20 min and 5 min at 240 0 C subjected.
  • Chropack Chrompack, WCOT fused silica, CP-Wax-52 CB, 25 microm, 0.32 mm
  • the identity of the resulting fatty acid methyl esters must be defined using standards available from commercial sources (ie Sigma).
  • Plant material is first mechanically homogenized by mortars to make it more accessible to extraction.
  • the extraction of the lipids from seeds is carried out according to the method of Bligh & Dyer (1959) Can J Biochem Physiol 37:91 1.
  • 5 mg Arabidopsis Brassica seeds are weighed in 1.2 ml Qiagen microtubes (Qiagen, Hilden) on a Sartorius (Göttingen) microbalance.
  • the seed material is homogenized with 1 ml of chloroform / methanol (1: 1, Sigma's mono-C17-glycerol as internal standard) in the Röschmühle MM300 from Retsch (Haan) and incubated for 20 min at RT.
  • the supernatant was transferred to a new vessel and the sediment extracted again with 1 ml of chloroform / methanol (1: 1). The supernatants were combined and concentrated to dryness.
  • the derivatization of the fatty acid was carried out by acid methanolysis. For this purpose, the extracted lipids were treated with 0.5 M sulfuric acid in methanol and 2% (v / v) dimethoxypropane and for 60 min. incubated at 80 0 C. This was followed by extracting twice with petroleum ether, followed by washing steps with 100 mM sodium bicarbonate and water. The fatty acid methyl esters thus prepared were concentrated to dryness and in a defined
  • FIG. 4 shows, by way of example, the results for the quantitative determination of the oil contents in T3 seeds of 3 independent transgenic rape lines as well as a non-expressing control line and the untransformed wild-type plants. From the seed pools of each line, five independent extractions were performed and the extracts measured independently. Out The mean and standard deviation were calculated for the three independent measurements.
  • the lipid content in the wild type and in the control line 3 was in contrast only about 15%. This corresponds to a total increase in oil content of 33% or approx. 47%.
  • the fatty acid composition was not altered by GPD1 expression (see Table 1).
  • Table 1 shows the fatty acid composition in the T3 seeds of the transgenic
  • glycerol-3-phosphate For the extraction of glycerol-3-phosphate from ripening rapeseed they are homogenized in a vibrating mill (Retsch) and mixed with 500 .mu.l of cold 16% (w / v) TCA / diethyl ether and incubated on ice for 20 minutes. Subsequently, 800 ⁇ l of cold 16% TCA / H2O, 5 mM EGTA are added and incubated on ice for 3 hours. By centrifugation, the sedimentation of non-soluble components takes place. The liquid upper phases are transferred to a new vessel and washed with 500 .mu.l of cold, water-saturated diethyl ether at 4 0 C and centrifuged again.
  • the hydrophilic lower phase is subjected to 3 more washes and the pH is adjusted to 6-7 with 5 M KOH / 1 M TEA.
  • the hydrophilic phase is flash frozen in liquid nitrogen, dried in a lyophilizer (lyophilizer, Christ) and then dissolved in 800 ⁇ l H2O.
  • Example 8 Determination of glycerol-3-phosphate (G3P) amount The determination of the amount of G3P is carried out by the enzymic cycling assay (Gibon et al., 2002). To this end, 10 .mu.l of the hydrophilic phase (s. Above) or G3PDH replication te (s. Below) with 46 .mu.l Tricine / KOH (pH 7.8 200 mM) / 10 mM MgCl 2 was added and 20 minutes at 95 0 C to to destroy the dihydroxyacetone phosphate.
  • the samples are briefly centrifuged and the supernatant with 45 ul reaction mixture (2 u glycerol-3-phosphate oxidase, 0.4 u glycerol-3-phosphate dehydrogenase, 13 O u catalase, 0.12 .mu.mol NADH) was added.
  • the reaction results in a net consumption of NADH, which can be monitored directly on the photometer by decreasing the absorbance at 340 nm.
  • the calculation of the G3P quantity takes place via a calibration line of different G3P concentrations.
  • the ripening seeds are isolated from frozen pods, weighed with a fine balance and homogenized by means of a vibrating mill (Retsch). The samples are then frozen again in liquid nitrogen.
  • 10 ⁇ l of the protein extracts are pipetted with 90 ⁇ l of reaction mixture (4 mM dihydroxyacetone phosphate, 0.2 mM NADH in 50 mM HEPES pH 7.4) and for 30 minutes incubated at 24 0 C. Thereafter, the termination of the reaction by heating to 95 ° C for 20 minutes.
  • reaction mixture 4 mM dihydroxyacetone phosphate, 0.2 mM NADH in 50 mM HEPES pH 7.4
  • G3PDH activity From each sample, 3 replicates are used for the determination of G3PDH activity whereby a sample is heated directly and serves as a blank sample. The amount of glycerol-3-phosphate (G3P) formed is then measured by the method of Gibon et al. 2002 (see above).
  • transgenic lines 6, 8 and 9 which were positive for transcription, showed a significant increase in glycerol-3-phosphate dehydrogenase activity in the maturing seeds (40 DAF) compared to the wild-type or non-expressing control line 3.
  • an activity of up to about 400 nmol G3P / g fresh mass per minute could be detected.
  • the activity was only about 250 nmol G3P / g fresh mass and minute. This shows that GPD1 is seed-specific at both RNA level and enzyme level in lines 6, 8 and 9.

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Abstract

Die Erfindung betrifft Verfahren zur Erhöhung des Gesamtölgehaltes und/oder des Gehalts an Glycerol-3-Phosphat in transgenen Ölpflanzen, die mindestens 20 Gew-% Ölsäure bezogen auf den Gesamtfettsäuregehalt enthalten, bevorzugt in pflanzlichen Samen, durch Expression von Glycerol-3-phosphatdehydrogenasen (G3PDH) aus Hefen, bevorzugt aus Saccharomyces cerevisiae. Vorteilhaft wird das im Verfahren gewonnene Öl und/oder die freien Fettsäure Polymeren, Nahrungsmitteln, Futtermitteln, Kosmetika, Pharmazeutika oder Produkten mit industriellen Anwendungen zugesetzt.

Description

Verfahren zur Erhöhung des Gesamtölgehaltes in Ölpflanzen
Beschreibung
Die Erfindung betrifft Verfahren zur Erhöhung des Gesamtölgehaltes und/oder des Gehalts and Glycerol-3-Phosphat in transgenen Ölpflanzen, die mindestens 20 Gew-% Ölsäure bezogen auf den Gesamtfettsäuregehalt enthalten, bevorzugt in pflanzlichen Samen, durch Expression von Glycerol-3-phosphatdehydrogenasen (G3PDH) aus Hefen, bevorzugt aus Saccharomyces cerevisiae. Vorteilhaft wird das im Verfahren gewonnene Öl und/oder die freien Fettsäuren Polymeren, Nahrungsmitteln, Futtermitteln, Kosmetika, Pharmazeutika oder Produkten mit industriellen Anwendungen zugesetzt.
Die Erhöhung des Gesamtölgehalts und/oder des Glycerol-3-Phosphatgehalts in transgenen Ölpflanzen und insbesondere in Pflanzensamen ist für die klassische wie für die moderne Pflanzenzüchtung und insbesondere die pflanzliche Biotechnologie von großem Interessen. Bedingt durch den steigenden Verbrauch von Pflanzenölen für Ernährung bzw. industrielle Anwendungen sind Möglichkeiten zur Steigerung bzw. Modifikation von Pflanzenölen zunehmend Gegenstand aktueller Forschung [z.B. Töpfer et al. (1995) Science 268:681-686]. Ziel ist dabei insbesondere die Erhöhung des Gehaltes an Fettsäuren in Samenölen.
Auch die aus den pflanzlichen Ölen erhältlichen Fettsäuren sind von besonderem Interesse. Sie kommen beispielsweise als Grund-stoffe für Weichmacher, Schmierstoffe, Tenside, Kosmetika usw. zum Einsatz oder werden in der Lebens- und Futtermittelindustrie als wertvoll Grundstoffe eingesetzt. So ist beispielsweise die Bereitstellung von Rapsölen mit Fettsäuren mittlerer Kettenlänge von besonderem Interesse, da diese besonderes in der Tensid-herstellung begehrt sind.
Durch die gezielte Modulation pflanzlicher Stoffwechselwege mittels gentechnischer Verfahren kann der pflanzlichen Metabolismus in einer Weise vorteilhaft verändert werden, die durch klassische Züchtungsmethoden nur über langwierige Schritte bzw. überhaupt nicht zu erreichen wären. So werden ungewöhnliche Fettsäuren, beispielsweise bestimmte polyungesättigte Fettsäuren, nur in bestimmten Pflanzen bzw. überhaupt nicht in Pflanzen synthetisiert und können deshalb nur nur durch Expression des entsprechenden Enzyms in transgenen Pflanzen hergestellt werden [z.B. Miliar et al. (2000) Trends Plant Sei 5:95-101]. Triacylgylceride und andere Lipide werden aus Fettsäuren synthetisiert. Die Fettsäure- und Triacylglyceridbiosynthese lassen sich aufgrund der Kompartimentierung als getrennte Biosynthesewege, jedoch im Hinblick auf das Endprodukt, als ein Biosyntheseweg ansehen. Die Lipidsynthese kann dabei in zwei Teilmechanismen unterteilt werden, einen quasi "prokaryotischen" und einen quasi "eukaryotischen" [Browse et al. (1986) Biochemical J 235:25-31 ; Ohlrogge & Browse (1995) Plant Cell 7:957-970]. Der prokaryotische Mechanismus der Synthese ist dabei in den Piastiden lokalisiert und umfasst die Biosynthese der freien Fettsäuren, die in das Cytosol exportiert werden, wo sie als Fettsäureacyl-CoA-Ester in den eukaryotischen Mechan ismus eingehen und mit Glycerin-3-phosphat (G3P, Glycerol-3-Phosphat) zu Phosphatidsäure (PA) verestert werden. PA ist der Ausgangspunkt für die Synthese von neutralen und polaren Lipiden. Die neutralen Lipide werden dabei über u. a. den Kennedy-Weg am Endoplasmatischen Reticulum synthetisiert [Voelker (1996) Genetic Engineering, Setlow (ed.) 18:1 11-1 13; Shankline & Cahoon (1998) Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 49:611-649; Frentzen (1998) Lipids 100:161-166]. Neben der Biosynthese Triacylglyceriden dient G3P auch der Synthese von Glycerol (z.B. zur Osmoregulation und gegen Kältestress).
Das für die Synthese wesentliche G3P wird dabei durch Reduktion von Dihydroxyace- tonphosphat (DHAP) mittels der Glycerin-3-Phosphat-Dehydrogenase (G3PDH), auch als Dihydroxyacetonphosphatreduktase bezeichnet, synthetisiert. Dabei fungiert in der Regel NADH als reduzierendes Cosubstrat (EC 1.1 .1.8.). Eine weitere Klasse von Glycerin-3-Phosphat-Dehydrogenasen (EC 1.1.99.5) verwendet FAD als Cosubstrat. Die Enzyme dieser Klasse katalysieren die Reaktion von DHAP zu G3PDH. In eukaryontischen Zellen sind die beiden Enzymklassen in unterschiedlichen Komparti- menten verteilt, wobei die NAD-abhängigen cytosolisch und die FAD-abhängigen mitochondriell lokalisiert sind (für Saccharomyces cerevisiae siehe z.B. Larsson et al. , 1998, Yeast 14:347-357).
EP-A 0 353 049 beschreibt eine NAD-unabhängige G3PDH aus Bacillus sp. Auch in Saccharomyces cerevisiae wurde eine NAD- unabhängige G3PDH identifiziert [Miyata K, Nagahisa M (1969) Plant Cell Physiol 10 (3):635-643].
G3PDH ist ein essentielles Enzym in Prokaryoten und Eukaryoten, das neben der Funktion in der Lipidbiosynthese auch für die Aufrechterhaltung des zellulären Re- doxstatus durch den Einfluß auf das NAD+/NADH Verhältnis mitverantwortlich ist. Die Deletion des GPD2 Gens in Saccharomyces cerevisae (eine von zwei Isoformen der G3PDH in dieser Hefe) hat ein vermindertes Wachstum unter anaeroben Beding ungen zur Folge. Darüberhinaus scheint die G3PDH eine Rolle in d er Stressantwort der Hefe v.a. gegen osmotischen Stress zu spielen. Die Deletion des GPD1 Gens bedingt in Saccharomyces cerevisae eine Hypersensitivität gegen Salz.
Weiterhin wurden Sequenzen für G3PDHs für Insekten (Drosophila melanogaster, Drosophila virilis), Pflanzen (Arabidopsis thaliana, Cuphea lanceolata), Säugern (Homo sapiens, Mus musculus, Sus scrofa, Rattus norvegicus), Fischen (Salmo salar, Osmerus mordax), Vögeln (Ovis aries), Amphibien (Xenopus laevis), Namatoden (Caenorhabditis elegans), Algen und Bakterien beschrieben.
Pflanzliche Zellen weisen mindestens zwei Isoformen der G3PDH auf, eine cytoplas- matische und eine plastidäre [Gee RW et al. (1988) Plant Physiol 86:98-103; Gee RW et al. (1988) Plant Physiol 87:379-383]. Die enzymatische Aktivität der Glycerin-3- Phosphat-Dehydrogenase wurde bei Pflanzen erstmals in Kartoffelknollen festgestellt [Santora GT et al. (1979) Arch Biochem Biophys 196:403-411]. Weitere cytosolisch und plastidär lokalisierte G3PDH Aktivitäten wurden in Pflanzen wie Erbse, Mais oder Soja detektiert [Gee RW et al. (1988) PLANT PHYSIOL 86(1 ): 98-103]. Beschrieben sind ferner G3PDHs aus Algen wie z.B. zwei plastidäre und einer cytosolische G3PDH- Isoform aus Dunaliella tertiolecta [Gee R et al.(1993) Plant Physiol 103(1 ):243-249; Gee R et al. (1989) PLANT PHYSIOL 91 (1 ):345-351]. Für die pflanzliche G3PDH aus Cuphea lanceolata wurde vorgeschlagen, durch Überexpression in Pflanzen eine Erhöhung des Ölgehaltes oder eine Verschiebung des Fettsäuremusters zu erreichen (WO 95/06733). Entsprechende Effekte konnten jedoch nicht belegt werden.
Bakterielle G3PDHs und ihre Funktion sind beschrieben in Hsu und Fox [(1970) J Bacteriol 103:410-416] und Bell [1974) J Bacteriol 117:1065-1076].
WO 01/21820 beschreibt die heterologe Expression einer mutierten E. coli G3PDH für erhöhte Stresstoleranz und Änderung der Fettsäurezusammensetzung in Speicherölen. Die mutierte E. coli G3PDH (gpsA2FR) weist einen einzelnen Aminosäureaustausch auf, der eine verminderte Inhibition durch G3P bedingt. Die heterologe Expres- sion der gpsA2FR Mutante führt zu Glycerolipiden mit einem erhöhten Anteil an C16- Fettsäuren und einem einhergehend en verminderten Anteil an C18-Fettsäuren. Die Veränderungen im Fettsäuremuster sind relativ gering: Ein Anstieg von 2 bis 5 % an 16:0 Fettsäuren und 1 ,5 bis 3,5 % bei 16:3 Fettsäuren, sowie eine Verminderung an 18:2 und 18:3 Fettsäuren um 2 bis 5% wurde beobachtet. Der Gesamtgehalt als Glycerolipiden blieb unbeeinflusst.
In WO 03/095655 wird die Expression des Hefeproteins Gpd i p in Arabidopsis beschrieben. Der ölgehalt der analysierten Arabidopsis Pflanzen konnte um etwa 22% gesteigert werden. Einzelne Samen einer einzigen transgenen Linie zeigten verglichen mit Wildtyp-Kontrollpflanzen eine Steigerung um 41 %. Von Nachteil bei diesem Verfahren ist, dass Arabidopsis eine Modellpflanze ist, die aufgrund ihrer agronomischen Eigenschaften für die kommerzielle Produktion von ölen ungeeignet ist. Außerdem akkumuliert Arabidopsis signifikante Mengen von Eicosaensäure (20:1 ), welche einen Einsatz des Öls in Nahrungsmittel oder Pharmazeutika verbietet.
Beschrieben sind ferner G3PDH aus Hefen (Ascomyceten) wie
a) Schizosaccharomyces pombe [Pidoux AL et al. (1990) Nucleic Acids Res 18 (23): 7145; GenBank Acc.-No.: X56162; Ohmiya R et al. (1995) Mol Microbiol 18(5):963-73; GenBank Acc.-No.: D50796, D50797],
b) Yarrowia lipolytica (GenBank Acc.-No.: AJ250328)
c) Zygosaccharomyces rouxii [Iwaki T et al. Yeast (2001 ) 18(8):737-44; GenBank Acc.-No: AB047394, AB047395, AB047397] oder
d) Saccharomyces cerevisiae [Albertyn J et al. (1994) Mol Cell Biol 14(6):4135-44; Albertyn J et al. (1992) FEBS LETT 308(2):130-132; Merkel JR et al. (1982) Anal Biochem 122 (1 ):180-185; Wang HT et al. (1994) J Bacteriol. 176(22):7091 -5; E- riksson P et al. (1995) Mol Microbiol. 17(1 ):95-107; GenBank Acc.-No.: U04621 , X76859, Z35169].
e) Emericella nidulans (GenBank Acc.-No.: AF228340)
f) Debaryomyces hansenii (GenBank Acc.-No.: AF210060)
Keines der bisher beschriebenen Verfahren zur Erhöhung des Ölgehalts in transgenen Pflanzen führt zu einer für ein technisches Verfahren ausreichenden Erhöhung des Ölgehalts in kultivierbaren Pflanzen. Es besteht daher nach wie vor ein großer Bedarf zur Erhöhung des Gesamtölgehalts in transgenen kultivierbaren Pflanzen, bevorzugt im Samen dieser Pflanzen. Ein solches Verfahren sollte folgende Kriterien erfüllen: • Zur Erhöhung des Gesamtölgehalts in den transgenen Pflanzen sollten so wenig wie möglich Gene in die Pflanze eingebracht werden.
• Das Verfahren sollte möglichst einfach und preiswert sein.
• Um eine möglichst hohe ölausbeute zu haben sollten Pflanzen verwendet werden, die einen hohen ölgehalt besitzen.
• Mit den verwendeten Pflanzen sollte ein hoher Ernteertrag an öl erzielt werden.
• Gesättigte C14 - Ci8- Fettsäuren sollten in so geringen, wie möglichen Mengen im produzierten Öl vorhanden sein.
• Das Fettsäureprofil sollte zwischen dem Wildtyp und der transgenen Pflanze möglichst nicht oder nur wenig verä ndert sein.
• Weiterhin sollten im Verfahren eventuelle Engpässe in den Vorprodukten der Öl- bzw. Fettsäuresynthese beseitigt werden.
Es stellte sich daher die Aufgabe ein Verfahren zur Erhöhung des Gesamtölgehaltes in Kulturpflanzen zu entwickeln, dass möglichst viele der vorgenannten Eigenschaften aufweist.
Diese Aufgabe wurde durch ein Verfahren zur Erhöhung des Gesamtölgehalts in transgenen Ölpflanzen gelöst, dadurch gekennzeichnet, dass die transgenen Ölpflanzen mindestens 20 Gew-% Ölsäure bezogen auf den Gesamtfettsäuregehalt enthalten und das folgende Verfahrensschritte umfassend
a) Einbringen einer Nukleinsäuresequenz, die für eine Glycerol-3-phosphat Dehydrogenase a us einer Hefe codiert, in die Ölpflanze, und
b) Expression der durch die Nukleinsäure codierten Glycerol-3-phosphat Dehydrogenase in der Ölpflanze, und
c) Auswahl der Ölpflanzen, bei denen der Gesamtölgehalt u m mindestens 25 Gew- % in der Pflanze im Vergleich gegenüber der nicht transgenen Pflanze erhöht ist.
Vorteilhaft enthalten die transgenen Ölpflanzen mindestens 21 , 22, 23, 24 oder 25 Gew-% Ölsäure, vorteilhaft mindestens 26, 27, 28, 29 oder 30 Gew-% Ölsäure bezogen auf den Gesamtfettsäuregehalt, besonders vorteilhaft mindestens 35, 40, 45, 50, 55 oder 60 Gew-% Ölsäure bezogen auf den Gesamtfettsäuregehalt, ganz besonders vorteilhaft mindestens 61 , 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69 oder 70 Gew-% Ölsäure bezogen auf den Gesamtfettsäuregehalt oder mehr. Für das erfindungsgemä- ße Verfahren vorteilhafte Pflanzen weisen außerdem einen bevorzugten Palmitinsäu- regehalt von maximal 30, 29, 28, 27 oder 26 Gew.-%, vorteilhaft von 25, 24, 23, 22, 21 oder 20 Gew-%, besonders vorteilhaft von 15, 14, 13, 12, 1 1 , 10 oder 9 Gew-% bezogen auf den Gesamtfettsäuregehalt. Weitere vorteilhafte Pflanzen weisen einen Linolsäuregehalt von mindestens 20, 25, 30, 35, 40, 45 oder 50 Gew-%, vorteilhaft von 55, 60, 65 oder 70 Gew-% bezogen auf den Gesamtfettsäuregehalt auf. Vorteilhafte Pflanzen können auch Kombination der vorgenannten Fettsäuren aufweisen, wobei der Gesamtfettsäuregehalt 100 Gew-% beträgt.
Durch das Verfahren wird der Gesamtölgehalt in den transgenen Ölplfanzen um mindestens 26, 27, 28, 29 oder 30 Gew-%, vorteilhaft um mindestens 31 , 32, 33, 34 oder 35 Gew-%, besonders vorteilhaft um mindestens 36, 37, 38, 39 oder 40 Gew-%, ganz besonders vorteilhaft um mindestens 41 , 42, 43, 44 oder 45 Gew-% erhöht.
Bevorzugte im Verfahren verwendete Ö lpflanzen weisen einen hohen Ölgehalt im Samen auf. Vorteilhafte Pflanzen haben einen Ölgehalt von mindestens 20, 25, 30, 35 oder 40 Gew.-%, vorteilhaft von mindestens 41 , 42, 43, 44 oder 45 Gew.-%, besonders vorteilhaft von mindestens 46, 47, 48, 49 oder 50 Gew.-% oder mehr.
Im Verfahren bevorzugte Ölpflanzen produzieren Öle, Lipide und/oder freie Fettsäuren, die weniger als 4, 3, 2 oder 1 Gew.-%, vorteilhaft weniger als 0,9; 0,8; 0,7; 0,6 oder 0,5 Gew.-%, besonders vorteilhaft weniger als 0,4; 0,3; 0,2; 0,1 oder 0,09 Gew.-% oder weniger Myristinsäure enthalten. Weitere vorteilhafte Ölpflanzen enthalten weniger als 5, 4 oder 3 Gew.-% Palmitinsäure und/oder weniger als 2; 1 ,5 oder 1 Gew.-% Stearinsäure.
Vorteilhafte Ölpflanzen sollten neben einem hohen Ölgehalt im Samen auch einen geringen Proteinanteil im Samen haben. Dieser Proteinanteil sollte möglichst geringer als 30, 25 oder 20 Gew.-%, vorteilhaft geringer als 19, 18, 17, 16 oder 15 Gew.-% sein.
Die im Verfahren bevorzugten Ölpflanzen weisen vorteilhaft nach Einbringen der für die G3PDH codierenden Nu kleinsäuresequenzen keine signifikante Veränderung im Fettsäureprofil der Fettsäuren C16:0, C16:3, C18:0, C18:1 , C18:2, C18:3 und C20:0 auf, das heißt die relativen Prozentwerte der einzelnen genannten Fettsäuren am Gesamtfettsäuregehalt in Gewichtsprozent bleibt im wesentlichen gleich. Im wesentlichen gleich bedeutet, dass die Schwankungen in den Pozentwerten der Fettsäuren um weniger als 5 Pozentpunkte voneinander abweichen.
Vorteilhafte im Verfahren verwendete Pflanzen weisen einen hohen Ernteertrag an öl pro Hektar auf. Dieser Ölernteertrag liegt bei mindestens 100, 110, 120, 130, 140 oder 150 kg Öl/ha, vorteilhaft bei mindestens 250, 300, 350, 400, 450 oder 500 kg Öl/ha, bevorzugt bei mindestens 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900 oder 950 kg öl/ha, besonders bevorzugt bei mindestens 1000 kg Öl/ha oder mehr.
Für das erfindungsgemäße Verfahren sind prinzipiell alle kultivierbaren Ölpflanzen geeignet. Bevorzugt werden für das erfindungsgemäße Verfahren Ölpflanzen ausgewählt aus der Gruppe der Pflanzen bestehend aus den Familien Anacardiaceae, Arecaceae, Asteraceae, Brassicaceae, Cannabaceae, Euphorbiaceae, Fabaceae, Juglandaceae, Linaceae, Lythraceae, Oleaceae, Poaceae und Rosaceae angewendet, die bereits natürlicherweise einen hohen Ölgehalt aufweisen und/oder zu industriellen Gewinnung von Ölen verwendet werden.
Besonders vorteilhaft werden die im Verfahren verwendeten Pflanzen ausgewählt aus der Gruppe der Ölpflanzen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den Gattungen und Arten Anacardium occidentale, Arachis hypogaea, Borago officinalis, Brassica campestris, Brassica napus, Brassica rapa, Brassica juncea, Camelina sativa, Canna- bis sativa, Carthamus tinctorius, Cocos nucifera, Crambe abyssinica, Cuphea ciliata, Elaeis guineensis, Glycine max, Gossypium hirsitum, Gossypium barbadense, Gossypium herbaceum, Helianthus annus, Linum usitatissimum, Oenothera biennis, Olea europaea, Ricinus communis, Zea mays, Juglans regia und Prunus dulcis, besonders bevorzugt aus den Gattungen und Arten Brassica campestris, Brassica napus, Brassica rapa, Brassica juncea, Camelina sativa, Helianthus annus, Linum usitatissimum und Carthamus tinctorius, ganz besonders bevorzugt Brassica campestris, Brassica napus, Brassica rapa, Brassica juncea und Camelina sativa.
Im vorliegenden Verfahren führt die samenspezifische, heterologe Expression des Hefe gpdi p Gens in der bevorzugten Pflanzenfamilie der Brassicaceae z.B. in Brassica napus und speziell im Samen zu einer signifikanten Erhöhung des Ölgehalts wie oben beschrieben. Vorteilhaft erfolgt die Ölgehaltserhöhung zu einer Erhöhung der Tria- cylglyceride (Speicheröle). Der Ölgehalt wurde dabei in 3 unabhängigen Linien um etwa 35 % verglichen mit Wildtyp-Kontrollpflanzen gesteigert (Figur 4). Die transgene Expression der Glycerol 3-phosphat Dehydrogenase aus Hefe zeigte vorteilhaft keine nachteiligen Effekte auf das Wachstum oder andere Eigenschaften der transformierten Ölpflanzen wie den Rapspflanzen.
Es konnte gezeigt werden, dass die Erhöhung des Gehalts vorteilhaft an Triacylglyce- riden (Speicherölen) durch eine Steigerung der G3PDH -Aktivität erzielt wird. Vorteilhaft wird im erfindungsgemäßen Verfahren neben dem ölgehalt auch der Glycerol-3- phosphat Gehalt vorteilhaft im reifenden Samen der G3PDH exprimierenden Ölpflanzen bevorzugt der transgenen Brassicaceae erhöht. Glycerol-3-phosphat ist eine wichtige Vorstufe bei der Biosynthese der Triacylglyceriden und ist somit eine essentielle Vorstufe für die Erhöhung des Ölgehalts in Ölfpflanzen speziell in Samen.
Zu den Pflanzen bzw. Ölpflanzen im Sinne der Erfindung gehören Pflanzenzellen und bestimmte Gewebe, Organe und Teile von Pflanzen, Vermehrungsgut (wie Samen, Knollen und Früchte) oder Saatgut von Pflanzen, sowie Pflanzen in all ihren Erschei- nungsformen, wie Antheren, Fasern, Wurzelhaare, Stängel, Blätter, Embryos, KaIIi, Kotelydonen, Petiolen, Sprosse, Keim linge, Erntematerial, pflanzliches Gewebe, reproduktives Gewebe und Zellkulturen, das von der eigentlichen transgenen Pflanze abgeleitet ist und/oder dazu verwendet werden kann, die transgene Pflanze hervorzubringen. Eingeschlossen sind auch reife Pflanzen. Unter reifen Pflanzen sind Pflanzen zu jedem beliebigen Entwicklungsstadium j enseits des Keimlings zu verstehen. Keimling meint eine junge, unreife Pflanze in einem frühen Entwicklungsstadium.
"Pflanze" umfasst alle einjährigen und mehrjährige, monokotyledonen und dikotyledo- nen Pflanzen und schließt die oben genannten vorteilhaften Ölpflanzen ein.
Bevorzugte monokotyle Pflanzen sind insbesondere ausgewählt aus den monokotylen Kulturpflanzen, wie zum Beispiel der Familie der Poaceae wie Mais.
Im erfindungsgemäßen Verfahren werden vorteilhaft dikotyledone Ölpflanzen verwendet. Bevorzugte dikotyle Pflanzen sind insbesondere ausgewählt aus den dikotylen Kulturpflanzen, wie zum Beispiel
Asteraceae wie Sonnenblume, Tagetes oder Calendula u nd andere mehr,
- Brassicaceae, besonders die Gattung Brassica, ganz besonders die Arten napus (Raps), napus var. napus oder rapa ssp. oleifera (Canola), juncea (Sarepta-Senf) Camelina sative (Leindotter) und andere mehr,
Leguminosae besonders die Gattung Glycine, ganz besonders die Art max (Sojabohne) Soja oder Erdnuss und andere mehr
sowie Lein, Soja, Baumwolle oder Hanf.
Transgene Pflanzen, die einen erhöhten ölgehalt enthalten, können vorteilhaft direkt vermarktet werden ohne dass das synthetisierte Öl isoliert werden muss. Unter Pflanzen im erfindungsgemäßen Verfahren sind ganze Pflanzen sowie alle Pflanzenteile, Pflanzenorgane oder Pflanzenteile wie Blatt, Stiel, Samen, Wurzel, Knollen, Antheren, Fasern, Wurzelhaare, Stängel, Embryos, KaIIi, Kotelydonen, Petiolen, Erntematerial, pflanzliches Gewebe, reproduktives Gewebe, Zellkulturen, die sich von der transgenen Pflanze abgeleiten und/oder dazu verwendet werden können, die transgene Pflanze hervorzubringen. Der Samen umfasst dabei alle Samenteile wie die Samenhüllen, Epidermis- und Samenzellen, Endosperm oder Embyrogewebe. Die im erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Öle können aber auch aus den Pflanzen in Form ihrer Öle, Fett, Lipide und/oder freien Fettsäuren isoliert werden. Im Verfahren hergestellte Öle lassen sich durch Ernten der Pflanzen entweder aus der Kultur, in der sie wachsen, oder vom Feld geerntet, gewinnen. Dies kann über Pressen oder Extraktion der Pflanzenteile bevorzugt der Pflanzensamen erfolgen. Da bei können die Öle durch sogenanntes „kalt schlagen oder kalt pressen" ohne Zuführung von Wärme durch Pressen gewonnen werden. Damit sich die Pflanzenteile speziell die Samen leichter aufschließen lassen, werden sie vorher zerkleinert, gedämpft oder geröstet. Die so vorbehandelten Samen können anschließend gepresst werden oder mit Lösungsmittel wie warmen Hexan extrahiert werden. Anschließend wird das Lösungsmittel wieder entfernt. Auf diese Weise können mehr als 96 % der im Verfahren hergestellten Öle isoliert werden. Anschließend werden die so erhaltenen Produkte weiter bearbeitet, das heißt raffiniert. Dabei werden zunächst beispielsweise die Pflanzenschleime und Trübstoffe entfernt. Die sogenannte Entschleimung kann enzymatisch oder beispielsweise che misch/physikalisch durch Zugabe von Säure wie Phosphorsäure erfolgen. Anschließend können die freien Fettsäuren durch Behand- lung mit einer Base beispielsweise Natronlauge entfernt. Das erhaltene Produkt wird zur Entfernung der im Produkt verbliebenen Lauge mit Wasser gründlich gewaschen und getrocknet. Um die noch im Produkt enthaltenen Farbstoffe zu entfernen werden die Produkte einer Bleichung mit beispielsweise Bleicherde oder Aktivkohle unterzo- gen. Zum Schluss wird das Produkt noch beispielsweise mit Wasserdampf noch desodoriert.
Eine erfindungsgemäße Ausführungsform ist die Verwendung der öle, die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt wurden oder die durch Mischung dieser öle mit mit tierischen, mikrobiellen oder pflanzlichen ölen, Lipiden oder Fettsäuren erhalten wurden, in Futtermitteln, Nahrungsmitteln, Kosmetika oder Pharmazeutika. Die im erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Öle können in der dem Fachmann bekannten Weise zur Abmischung mit anderen Ölen, Lipiden, Fettsäuren oder Fettsäuregemischen tierischen Ursprungs wie z.B. Fischölen verwendet werden. Auch die in den erfindungsgemäß hergestellten ölen enthaltenen Fettsäuren, die nach
Basenbehandlung aus den ölen freigesetzt wurden , können Futtermittel, Nahrungsmittel, Kosmetika und/oder Pharmazeutika in üblichen Mengen direkt oder nach Abmischung mit anderen Ölen, Lipiden, Fettsäuren oder Fettsäuregemischen tierischen Ursprungs wie z.B. Fischölen zugesetzt werden.
Bei den im Verfahren hergestellten Öle enthalten Verbindungen wie Sphingolipide,
Phosphoglyceride, Lipide, Glycolipide, Phospholipide, Monoacylglyceride, Diacylglyce- ride, Triacylglyceride oder sonstige Fettsäureester, bevorzugt Triacylglyceride (siehe Tabelle 1 ).
Aus den so im erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Ölen lassen sich die enthaltenden gesättigten und ungesättigten Fettsäuren beispielsweise über eine Alkalibehandlung beispielsweise mit wäßriger KOH oder NaOH oder saure Hydrolyse vorteilhaft in Gegenwart eines Alkohols wie Methanol oder Ethanol oder über eine enzymatische Abspaltung freisetzen und isolieren über beispielsweise Phasentrennung und anschließender Ansäuerung über z.B. H2SO4. Die Freisetzung der Fettsäuren kann auch direkt ohne die vorhergehend beschriebene Aufarbeitung erfolgen.
Unter dem Begriff "Öl" werden auch "Lipide" oder "Fette" oder "Fettsäuregemische" verstanden, die ungesättigte, gesättigte, vorzugsweise veresterte Fettsäure(n), vorteilhaft in Triglyceride gebunden, enthalten. Bevorzugt ist, dass das Öl. Das Öl kann verschiedene andere gesättigte oder ungesättigte Fettsäuren wie z.B. Palmitin-, Palmitolein-, Stearin-, Ölsäure, Linolsäure oder α-Linolensäure etc., enthalten.
Insbesondere kann je nach Ausgangspflanze der Anteil der verschiedenen Fettsäuren in dem öl schwanken. Unter "Gesamtölgehalt" ist die Summe aller Öle, Lipide, Fette oder Fettsäuregemische zu verstehen, bevorzugt die Summe aller Triacylglyceride.
"öle" umfasst neutrale und/oder polare Lipiden und Mischungen derselben. Beispielhaft jedoch nicht einschränkend seien die in Tabelle 1 aufgeführten zu nennen.
Tab. 1 : Pflanzliche Lipidklassen
Figure imgf000012_0001
Neutrale Lipide meint bevo rzugt Triacylglyceride. Sowohl die neutralen als auch d ie polaren Lipide kön nen ein breites Spektrum an verschiedenen Fettsäuren enthalten. Beispielhaft jedoch nicht einschränkend seien die in Tabelle 2 aufgeführten Fettsäuren zu nennen. Tab. 2: Übersicht über verschiedene Fettsäuren (Auswahl) 1 Kettenlänge:Anzahl der Doppelbindungen + nur in sehr wenigen Pflanzengattungen vorkommend * nicht natürlicherweise in höheren Pflanzen vorkommend
Figure imgf000013_0001
Öle meint bevorzugt Samenöle.
"Erhöhung" des Gesamtölgehaltes meint die Steigerung des Gehaltes an Ölen in einer Pflanze oder einem Teil, Gewebe oder Organ derselben, bevorzugt in den Samenorganen der Pflanze. Dabei ist der Ölgehalt im Vergleich zu einer nicht dem erfindungsgemäßen Verfahren unterworfenen, aber ansonsten unveränderten Ausgangspflanze unter ansonsten gleichen Rahmenbedingungen um mindestens 25 %, bevorzugt mindestens 30 %, besonders bevorzugt mindestens 35 %, ganz besonders bevorzugt mindestens 40 %, am meisten bevorzugt mindestens 45 % oder mehr erhöht. Rahmenbedingungen meint dabei alle für die Keimung, Kultivierung oder Wachstum der Pflanze relevanten Bedingungen wir Boden-, Klima- oder Lichtverhältnisse, Düngung, Bewässerung, Pflanzenschutzmaßnahmen usw.
Unter Erhöhung des Gehalts an Glycerin-3-Phosphat in einer Ölpflanze ist die Steigerung des Gehalts in einer Pflanze oder einem Teil der Pflanze, in Geweben oder Organen der selben, bevorzugt im Samen der Pflanze zu verstehen. Dabei ist der Gehalt an Glycerin-3-Phosphat im Vergleich zu einer nicht dem erfindungsgemäßen Verfahren unterworfenen, aber ansonsten unveränderten Ausgangspflanze unter ansonsten gleichen Rahmenbedingungen um mindestens 25, 30, 35, 40, 45 oder 50 Gew.-%, bevorzugt mindestens 60, 70, 80, 90 oder 100 %, besonders bevorzugt mindestens 1 10, 120, 130, 140 oder 150 %, ganz besonders bevorzugt mindestens 200, 250 oder 300 %, am meisten bevorzugt mindestens 350 oder 400 % oder mehr erhöht. Rahmenbedingungen meint dabei alle für die Keimung, Kultivierung oder Wachstum der Pflanze relevanten Bedingu ngen wir Boden-, Klima- oder Lichtverhältnisse, Düngung, Bewässerung, Pflanzenschutzmaßnahmen usw.
"Glycerol 3-phosphat Dehydrogenase aus Hefe" (infolge "Hefe G3PDH") meint allgemein alle solche Enzyme, die in der Lage sind, Dihydroxyaceton phosphat (DHAP) zu Glycerol-3-phosphat (G3P) - gegebenenfalls unter Verwendung eines Cosubstrates wie NADH oder NADPH - umzusetzen und natürlicherweise in einer Hefe exprimiert werden.
Hefen meint eine die Gruppe einzelliger Pilze mit ausgeprägter Zellwand und Bildung von Pseudomyzel (im Ggs. zu Schimmelpilzen). Ihre Vermehrung erfolgt vegetativ durch Sprossung und/oder Spaltung (Schizosaccharomyces bzw. Saccharomycodes).
Umfasst sind sogenannte unechte Hefen, und zwar bevorzugt die Familien Cryptococ- caceae, Sporobolomycetaceae mit den Gattungen Cryptococcus, Torulopsis, Pity- rosporum, Brettanomyces, Candida, Kloeckera, Trigonopsis, Trichosporon, Rhodotoru- Ia bzw. Sporobolomyces und Bullera, sowie echte Hefen (Hefen mit auch geschlechtlicher Vermehrung; Ascus), und zwar bevorzugt die Familien Endo- u. Saccharomyceta- ceae, mit den Gattungen Saccharo-, Debaro-, Lipomyces, Hansenula, Endomycopsis, Pichia, Hanseniaspora. Am meisten bevorzugt sind d ie Arten Saccharomyces cerevisi- ae, Pichia pastoris, Hansenula polymorpha, Schizosaccharomyces pombe, Kluyvero- myces lactis, Zygosaccharomyces rouxii, Yarrowia lipolitica, Emericella nidulans, Aspergillus nidulans, Deparymyces hansenii und Torulaspora hansenii.
Hefe G3PDH meint insbsondere Polypeptide die als "wesentlichen Eigenschaften" nachfolgende Eigenschaften aufweisen:
a) die Umsetzung von Dihydroxyacetonph osphat zu Glycerin-3-phosphat unter Verwendung von NADH als Cosubstrat (EC 1.1.1.8), und
b) eine Peptidsequenz umfassend mindestes ein Sequenzmotiv ausgewählt aus der Gruppe von Sequenzmotiven bestehend aus
c) GSGNWGT(A/T)IAK (SEQ ID NO : 22)
d) CG(V/A)LSGAN(L/I/V)AXE(V/I)A (SEQ ID NO : 26)
e) (UV)FXRPYFXV (SEQ ID NO : 27)
bevorzug ist das Sequenzmotiv ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus
f) GSGN WGTTI AKV(V/I)AEN (SEQ ID NO : 29)
g) NT(K/R)HQNVKYLP (SEQ ID NO : 30)
h) D(I/V)LVFN(I/V)PHQFL (SEQ ID NO : 31 )
i) RA( 1/V)SCLKGF E (SEQ ID NO : 32)
j) CGALSGANLA(P/T)EVA (SEQ ID NO : 33)
k) LFHRPYFHV (SEQ ID NO : 34)
I) GLGEII(K/R)FG (SEQ ID NO : 35)
besonders bevorzug enthält die Peptidsequenz mindestens 2 oder 3, ganz besonders bevorzugt mindestens 4 oder 5, am meisen bevorzugt allde der Sequenzmotive ausgewählt aus der Gruppe der Sequenzmotive i), ii) und iii) oder ausgewählt aus der Gruppe der Sequenzmotive iv), v), vi), vii), viii), ix) und x. (Angabe in Klammern meinen alternativ mögliche Aminosäuren an dieser Position; z.B. meint (V/l), dass an dieser Position VaNn oder Isoleucin möglich ist. Im Sequenzprotokoll ist jeweils nur eine der möglichen Varianten wiedergegeben.). Weiterhin kann eine Hefe G3PDH optional - zusätzlich zu mindesten einem der oben genannten Sequenzmotive i) bis x) - weitere Sequenzmotive umfassend ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus
m) H(E/Q)NVKYL (SEQ ID NO : 23)
n) (0/N)(IZV)(LZI)V(FZW)(VZN)(LZIZV)PHQF)(VZL/!) (SEQ ID NO : 24)
o) (A/G)(IZV)SC(LZI)KG (SEQ ID NO : 25)
p) G(LZM)(LZG)E(MZI)(IZQ)(RZKZN)F(GZSZA) (SEQ ID NO : 28)
Am meisten bevorzugt meint Hefe G3PDH das Hefeproteins Gpdi p gemäß SEQ ID NO: 2, sowie funktionelle Äquivalente also auch funktionell äquivalente Teile der vorgenannten. Unter funktionell äquivalenten Teilen sind Sequenzen zu verstehen, die mindestens 51 , 60, 90 oder 120 bp, vorteilhaft mindestens 210, 300, 330, 420 oder 450 bp, besonders vorteilhaft mindestens 525, 540, 570 oder 600 bp, ganz besonders vorteilhaft mindestens 660, 720, 810, 900 oder 1101 bp oder mehr lang sind.
Funktionelle Äquivalente meint insbesondere natürliche oder künstliche Mutationen des Hefeproteins Gpdi p gemäß SEQ ID NO: 2 sowie homologe Polype ptide aus anderen Hefen, die die gleichen wesentlichen Eigenschaften einer Hefe G3PDH, entsprechend oben gegebener Definition, aufweisen. Mutationen umfassen Substitutionen, Additionen, Deletionen, Inversion oder Insertionen eines oder mehrerer Aminosäurereste. Insbsondere bevorzugt sind die Polypeptide beschrieben durch SEQ ID N O: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 , SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 38 oder SEQ ID NO: 40.
Die zu den im Rahmen dieser Erfindung vortreilhaft einzusetzenden Hefe G3PDH können durch Datenbanksuche oder Durchmustern von Gen- oder cDNA-Bibliotheken - unter Verwendung der beispielhaft aufgeführten Hefe G3PDH-Sequenz gemäß SEQ ID NO: 2 oder der für dieses kodierenden Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1 als Suchsequenz bzw. Sonde - leicht aufgefunden werden.
Bevorzugt haben funktionelle Äquivalente eine Homologie von mindestens 50 oder 60 %, besonders bevorzugt mindestens 70 oder 80 %, besonders bevorzugt mindestens 85 oder 90 %, am meisten bevorzugt mindestens 91 , 92, 93, 94, 95 oder 96 % oder mehr zu dem Protein mit der SEQ ID NO: 2. Unter Homologie zwischen zwei Polypeptiden wird die Identität der Aminosäuresequenz über die gesamte Sequenzlänge verstanden, die durch Vergleich mit Hilfe des Program malgorithmus GAP (Wisconsin Package Version 10.0, University of Wisconsin, Genetics Computer Group (GCG), Madison, USA) unter Einstellung folgender Parameter berechnet wird:
Gap Weight: 8 Length Weight: 2
Average Match: 2,912 Average Mismatch: -2,003
Beispielhaft wird unter einer Sequenz, die eine Homologie von mindestens 80 % auf Proteinbasis mit der Sequenz SEQ ID NO: 2 aufweist, eine Sequenz verstanden, die bei einem Vergleich mit der Sequenz SEQ ID NO: 2 nach obigem Programmalgorithmus mit obigem Parametersatz eine Homologie von mindestens 80 % aufweist. Funktionelle Äquivalente umfasst auch solche Proteine, die durch Nukleinsäure- sequenzen kodiert werden, die eine Homologie von mindestens 60 , 70 oder 80 %, besonders bevorzugt mindestens 85, 87, 88, 89 oder 90 %, besonders bevorzugt mindestens 91 , 92, 93, 94 oder 95 %, am meisten bevorzugt mindestens 96, 97, 98 oder 99 % zu der Nukleinsäuresequenz mit der SEQ ID NO: 1 haben.
Unter Homologie zwischen zwei Nukleinsäuresequenzen wird die Identität der beiden Nukleinsäuresequezen über die jeweilige Sequenzlänge verstanden, die durch Vergleich mit Hilfe des Program malgorithmus GAP (Wisconsin Package Version 10.0, University of Wisconsin, Genetics Computer Group (GCG), Madison, USA; Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389ff) unter Einstellung folgender Parameter berechnet wird:
Gap Weight: 50 Length Weight: 3
Average Match: 10 Average MismatdrO
Beispielhaft wird unter einer Sequenz, die eine Homologie von mindestens 80 % auf Nukleinsäurebasis mit der Sequenz SEQ ID NO: 1 aufweist, eine Seq uenz verstanden, die bei einem Vergleich mit der Sequenz SEQ ID NO: 1 nach obigem Programmalgorithmus mit obigem Parametersatz eine Homologie von mindestens 80 % aufweist.
Funktionelle Äquivalente umfasst auch solche Proteine, die durch Nukleinsäure- Sequenzen kodiert werden, die unter Standardbedingungen mit einer der durch SEQ ID NO: 1 beschriebenen Nukleinsäuresequenz, der zu dieser komplementären Nuklein- säuresequenz oder Teilen der vorgenannten hybridisieren und die wesentlichen Eigenschaften einer Hefe G3PDH aufweisen .
"Standardhybridisierungsbedingungen" ist breit zu verstehen und meint stringente als auch weniger stringente Hybridisierungsbedingungen. Solche Hybridisierungsbedin- gungen sind unter anderem bei Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T et al., in Molecular Cloning (A Laboratory Manual), 2. Auflage, CoId Spring Harbor Laboratory Press, 1989, Seiten 9.31-9.57) oder in Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1 -e.S.e.beschrieben.
Beispielhaft können die Bedingungen während des Wasch Schrittes ausgewählt sein aus dem Bereich von Bedingungenbegrenzt von solchen mit geringer Stringenz (mit ungefähr 2X SSC bei 500C) und solchen mit hoher Stringenz (mit ungefähr 0,2X SSC bei 500C bevorzugt bei 65°C) (2OX SSC: 0,3 M Natriumeitrat, 3 M NaCI, pH 7,0). Während der Hybridisierung können auch denaturierende Agenzien wie zum Beispiel Formamid oder SDS eingesetzt werden. In Gegenwart von 50 % Formamid wird die Hybridisierung bevorzugt bei 42°C ausgeführt.
Im erfindungsgemäßen Verfahren werden die verwendeten Nukleinsäuresequenzen vorteilhaft in ein transgenes Expressionskonstrukt eingebracht, die eine transgene Expression einer Hefe G3PDH, in einer Pflanze oder einem Gewebe, Organ, Teil, Zelle oder Vermehrungsmaterial der Pflanze gewährleisten kann.
In den Expressionskonstrukten steht dabei ein Nukleinsäuremolekül kodierend für eine Hefe G3PDH bevorzugt in funktioneller Verknüpfung mit mindestens einem genetischen Kontrollelement (beispielsweise einem Promotor und/oder Terminator), das eine Expression in einem pflanzlichen Orga nismus oder einem Gewebe, O rgan, Teil, Zelle oder Vermehrungsmaterial desselben gewährleistet.
Insbesonders bevorzugt werden transgene Expressionskassetten verwendet, die eine Nukleinsäuresequenz kodierend für eine Glycerol-3-phosphate Dehydrogenase enthalten, die ausgewählt ist aus der Gruppe der Sequenzen bestehend aus a) eine Sequenz mit der SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 37 oder SEQ ID NO: 39 oder
b) eine Sequenz, die sich entsprechend dem degenerierten genetischen Code von einer Sequenz mit der in SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 6, SEQ ID
NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 37 oder SEQ ID NO: 39 dargestellten Sequenz, ableitet, oder
eine Sequenz, die eine Identität von mindestens 60 % zu der Sequenz mit der SEQ ID NO: 1 aufweist.
Unter einer funktionellen Verknüpfung versteht man zum Beispiel die sequentielle Anordnung eines Promotors mit der zu exprimierenden Nukleinsäuresequenz kodierend für eine Hefe G3PDH (zum Beispiel der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 1 ) und ggf. weiterer regulativer Elemente wie zum Beispiel einem Terminator derart, dass jedes der regulativen Elemente seine Funktion bei der transgenen Expression der Nuklein- säuresequenz erfüllen kann. Dazu ist nicht unbedingt eine direkte Verknüpfung im chemischen Sinne erforderlich. Genetische Kontrollsequenzen, wie zum Beispiel Enhancer-Sequenzen, können ihre Funktion auch von weiter entfernten Positionen oder gar von anderen DNA-Molekülen aus auf die Zielsequenz ausüben. Bevorzugt sind Anordnungen, in denen die transgen zu exprimierende Nukleinsäuresequenz hinter der als Promoter fungierenden Sequenz positioniert wird, so dass beide Sequenzen kovalent miteinander verbunden sind. Bevorzugt ist dabei der Abstand zwischen der Promotorsequenz und der transgen zu exprimierende Nukleinsäuresequenz geringer als 200 Basenpaare, besonders bevorzugt kleiner als 100 Basenpaare, ganz besonders bevorzugt kleiner als 50 Basenpaare.
Die Herstellung einer funktionellen Verknüpfung als auch die Herstellung einer
Expressionskassette kann mittels gängiger Rekombinations- und Klonierungstechniken realisiert werden, wie sie beispielsweise in Maniatis T , Fritsch EF und Sambrook J (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, CoId Spring Harbor Laboratory, CoId Spring Harbor (NY), in Silhavy TJ, Berman ML und Enquist LW (1984) Experiments with Gene Fusions, CoId Spring Harbor Laboratory, CoId Spring Harbor (NY), in
Ausubel FM et al. (1987) Current Protocols in Molecular B iology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience und bei Gelvin et al. (1990) In: Plant Molecular Biology Manual beschrieben sind. Zwischen beide Sequenzen können aber auch weitere Sequenzen positioniert werden, die zum Beispiel die Funktion eines Linkers mit bestimmten Restriktionsenzymschnittstellen oder eines Signalpeptides haben. Auch kann die Insertion von Sequenzen zur Expression von Fusionsproteinen führen. Bevorzugt kann die Expressionskassette, bestehend aus einer Verknüpfung von Promoter und zu exprimierender Nukleinsäuresequenz, integriert in einem Vektor vorliegen und durch zum Beispiel Transformation in ein pflanzliches Genom insertiert werden.
Unter einer Expressionskassette sind aber auch solche Konstruktionen zu verstehen, bei denen die Nukleinsäuresequenz kodierend für eine Hefe G3PDH so hinter einen endogenen Promotor platziert wird, das dieser die Expression der Hefe G3PDH bewirkt.
Bevorzugt werden in den transgenen Expressionskassetten Promotoren eingesetzt, die in einem pflanzlichen Organismus oder einem Gewebe, Organ, Teil, Zelle oder Vermehrungsmaterial desselben funktionell sind. In pflanzlichen Organismen funktio- nelle Promotoren meint grundsätzlich jeden Promotor, der die Expression von Genen, insbesondere Fremdgenen, in Pflanzen oder Pflanzenteilen, -zellen, -geweben, - kulturen steuern kann. Dabei kann die Expression beispielsweise konstitutiv, induzierbar oder entwicklungsabhängig sein.
Bevorzugt sind:
a) Konstitutive Promotoren
"Konstitutive" Promotoren meint solche Promotoren, die eine Expression in zahlreichen, bevorzugt allen, Geweben über einen größeren Zeitraum der Pflanzenentwicklung, bevorzugt zu allen Zeitpunkten der Pflanzenentwicklung, gewährleisten (Benfey et al.(1989) EMBO J 8:2195-2202). Vorzugsweise verwendet man insbesondere einen pflanzlichen Promotor oder einen Promotor, der einem Pflanzenvirus entstammt. Insbesondere bevorzugt ist der Promotor des 35S-Transkriptes des CaMV Blumenkohlmosaikvirus (Franck et al. (1980) Cell 21 :285-294; Odell et al. (1985) Natu re 313:810-812; Shewmaker et al. (1985) Virology 140:281-288; Gardner et al. (1986) Plant Mol Biol 6:221- 228) oder der 19S CaMV Promotor (US 5,352,605; WO 84/02913; Benfey et al. (1989) EMBO J 8:2195-2202). Ein weiterer geeigneter konstitutiver Promotor ist der "Rubisco small subunit (SSU)"-Promotor (US 4,962,028), der LeguminB-Promotor (GenBank Acc.-Nr. X03677), der Promotor der Nopalinsyn- thase aus Agrobacterium, der TR-Doppelpromotor, der OCS (Octopin Synthase) Promotor aus Agrobacterium, der Ubiquitin Promotor (Holtorf S et al. (1995) Plant Mol Biol 29:637-649), den Ubiquitin 1 Promotor (Christensen et al. (1992) Plant Mol Biol 18:675-689; Bruce et al. (1989) Proc Natl Acad Sei USA 86:9692-9696), den Smas Promotor, den Cinnamylalkoholdehydrogenase-Promotor (US 5,683,439), die Promotoren der vakuolärer ATPase Untereinheiten, den Promotrer des Nitrilase-1 Gens aus Arabidopsis thaliana (GenBank Acc.-No.: U38846), Nukleotide 3862 bis 5325 oder alternativ 5342) oder der Promotor eines prolinreichen Proteins aus Weizen (WO 91/13991 ), sowie weitere Promotoren von Genen, deren konstitutive Expression in Pflanzen dem Fachmann bekannt ist. Bevorzugt sind der CaMV 35S-Promoter oder der Nitrilase-1 Promoter us Arabidopsis thaliana.
b) Gewebespezifische Promotoren
Bevorzugt sind ferner Promotoren mit Spezifitäten für Samen, wie zum Beispiel der Promotor des Phaseolins (US 5,504,200; Bustos MM et al. (1989) Plant Cell 1 (9):839- 53), des 2S Albumingens (Joseffson LG et al. (1987) J Biol Chem 262:12196-12201 ), des Legumins (Shirsat A et al. (1989) Mol Gen Genet 215(2): 326-331 ), des USP (unknown seed protein; Bäumlein H et al. (1991 ) Mol Gen Genet 225(3):459-67), des Napin Gens (US 5,608,152; Stalberg K et al. (1996) L Planta 199:515-519), des Saccharosebindeproteins (WO 00/26388) oder der Legumin B4-Promotor (LeB4; Bäumlein H et al. (1991 ) Mol Gen Genet 225: 121-128; Baeumlein et al. (1992) Plant Journal 2(2):233-9; Fiedler U et al. (1995) B iotechnology (NY) 13(10):1090f), der Oleosin-Promoter aus Arabidopsis (WO 98/45461 ), der Bce4-Promoter aus Brassica (WO 91/13980).
Weitere geeignete samenspezifische Promotoren sind die der Gene kodierend für das "High Molecular Weight Glutenin" (HMWG), Gliadin, Verzweigungsenzym, ADP
Glucose Pyrophosphatase (AGPase) oder die Stärkesynthase. Bevorzugt sind ferner Promotoren, die eine samenspezifische Expression in Monokotyledonen wie Mais, Gerste, Weizen, Roggen, Reis etc. erlauben. Vorteilhaft eingesetzt werden können der Promoter des lpt2 oder lpt1 -Gen (WO 95/15389, WO 95/23230) oder die Promotoren beschrieben in WO 99/16890 (Promotoren des Hordein-Gens, des Glutelin-Gens, des Oryzin-Gens, des Prolamin-Gens, des Gliadin-Gens, des Glutelin-Gens, des Zein- Gens, des Kasirin-Gens oder des Secalin-Gens). c) Chemisch induzierbare Promotoren
Die Expressionskassetten können auch einen chemisch induzierbaren Promotor enthalten (Übersichtsartikel: Gatz et al. (1997) Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 48:89-108), durch den die Expression des exogenen Gens in der Pflanze zu einem bestimmten Zeitpunkt gesteuert werden kann. Derartige Promotoren, wie z.B. der PRP1 Promotor (Ward et al. (1993) Plant Mol Biol 22:361 -366), durch Salicylsäure induzierbarer Promotor (WO 95/19443), ein durch Benzolsulfo namid-induzierbarer Promotor (EP 0 388 186), ein durch Tetrazyklin-induzierbarer Promotor (Gatz et al. (1992) Plant J 2:397-404), ein durch Abscisinsäure induzierbarer Promotor (EP 0 335 528) bzw. ein durch Ethanol- oder Cyclohexanon-induzierbarer Promotor (WO
93/21334) können ebenfalls verwendet werden. Ferber geeignet ist der Promoter des Glutathion-S-transferase Isoform Il Gens (GST-ll-27), der durch exogen applizierter Safener wie z.B. N,N-Diallyl-2,2,-dichloroacetamid aktiviert werden kann (WO 93/01294) und in zahlreichen Geweben von sowohl Monokotyledonen als auch Dikotyledonen funktionell ist.
Besonders bevorzugt sind konstitutive sowie ganz besonders bevorzugt samenspezifische Promotoren, insbesondere der Napin- und der USP-Promoter.
Es können ferner weitere Promotoren funktionell mit der zu exprimierenden Nuklein- säuresequenz verknüpft sein, die eine Expression in weiteren Pflanzengeweben oder in anderen Organismen, wie zum Beispiel E . coli Bakterien ermöglichen. Als Pflanzen Promotoren kommen im Prinzip alle oben beschriebenen Promotoren in Frage.
Die in den Expressionskassetten oder Vektoren enthaltenen Nukleinsäuresequenzen können mit weiteren genetischen Kontrollsequenzen neben einem Promoter funktionell verknüpft sein. Der Begriff der genetischen Kontrollsequenzen ist breit zu verstehen und meint all solche Sequenzen, die einen Einfluss auf das Zustandekommen oder die Funktion der erfindungsgemäßen Expressionskassette haben. Genetische Kontrollsequenzen modifizieren zum Beispiel die Transkription und Translation in prokaryoti- schen oder eukaryotischen Organismen. Vorzugsweise umfassen die erfindungsgemäßen Expressionskassetten 5'-stromaufwärts von der jeweiligen transgen zu exprimierenden Nukleinsäuresequenz einen pflanzenspezifischen Promoter und 3'- stromabwärts eine Terminatorsequenz als zusätzliche genetische Kontrollsequenz, sowie gegebenenfalls weitere übliche regulative Elemente, und zwar jeweils funktionell verknüpft mit der transgen zu exprimierenden Nukleinsäuresequenz. Genetische Kontrollsequenzen umfassen auch weitere Promotoren, Promotorelemente oder Minimalpromotoren, die die expressionsteuernden Eigenschaften modifizieren können. So kann durch genetische Kontrollsequenzen zum Beispiel die gewebespezifische Expression zusätzlich abhängig von bestimmten Stressfaktoren erfolgen. Entsprechende Elemente sind zum Beispiel für Wasserstress, Abscisinsäure (Lam E und Chua NH, J Biol Chem 1991 ; 266(26): 17131 -17135) und Hitzestress (Schoffl F et al. (1989) Mol Gen Genetics 217(2-3):246-53) beschrieben.
Weitere vorteilhafte Kontrollsequenzen sind beispielsweise in den gram-positiven Promotoren amy und SPO2, in den Hefe- oder Pilzpromotoren ADC1 , MFa, AC, P-60, CYC1 , GAPDH, TEF, rp28, ADH.
Prinzipiell können alle natürlichen Promotoren mit ihren Regulationssequenzen wie die oben genannten für das erfindungsgemäße Verfahren verwendet werden. Darüberhi- naus können auch synthetische Promotoren vorteilhaft verwendet werden.
Genetische Kontrollsequenzen umfassen ferner auch die 5'-untranslatierte Regione n, Introns oder nichtkodierende 3'-Region von Genen wie beipielsweise das Actin-1
Intron, oder die Adh1-S Introns 1 , 2 und 6 (allgemein: The Maize Handbook, Chapter 116, Freeling and Walbot, Eds., Springer, New York (1994)). Es ist gezeigt worden, dass diese eine signifikante Funktionen bei der Regulation der Genexpression spielen können. So wurde gezeigt, dass 5'-untranslatierte Sequenzen die transiente Expressi- on heterologer Gene verstärken können. Beispielhaft für Translationsverstärker sei die 5'-Leadersequenz aus dem Tabak-Mosaik-Virus zu nennen (GaINe et al. (1987) Nucl Acids Res 15:8693-8711 ) und dergleichen. Sie können ferner die Gewebsspezifität fördern (Rouster J et al. (1998) Plant J 15:435-440).
Die Expressionskassette kann vorteilhafterweise eine oder mehrere sogenannte "enhancer Sequenzen" funktionell verknüpft mit dem Promoter enthalten, die eine erhöhte transgene Expression der Nukleinsäuresequenz ermöglichen. Auch am 3'- Ende der transgen zu exprimierenden Nukleinsäuresequenzen können zusätzliche vorteilhafte Sequenzen inseriert werden, wie weitere regulatorische Elemente oder Terminatoren. Die transgen zu exprimierenden Nukleinsäuresequenzen können in einer oder mehreren Kopien im Genkonstrukt enthalten sein.
Als Kontrollsequenzen geeignete Polyadenylieru ngssignale sind pflanzliche Polyadeny- lierungssignale, vorzugsweise solche, die im wesentlichen T-DNA Polyadenylierungs- Signale aus Agrobacterium tumefaciens, insbesondere des Gens 3 der T-DNA (Octopin Synthase) des Ti-Plasmids pTiACHS entsprechen (Gielen et al. (1984) EMBO J 3:835 ff) oder funktionelle Äquivalente davon. Beispiele für besonders geeignete Terminatorsequenzen sind der OCS (Octopin-Synthase)-Terminator und der NOS (Nopalin- Synthase)-Terminator.
Als Kontrollsequenzen sind weiterhin solche zu verstehen, die eine homologe Rekombination bzw. Insertion in das Genom eines Wirtsorganismus ermöglichen oder die Entfernung aus dem Genom erlauben. Bei der homologen Rekombination kann zum Beispiel die kodierende Sequenz eines bestimmten endogenen Gens gegen die für eine dsRNA kodierende Sequenz gezielt ausgetauscht werden . Methoden wie die cre/lox-Technologie erlauben eine gewebespezifische, unter Umständen induzierbare Entfernung der Expressionskassette aus dem Genom des Wirtsorganismus (Sauer B (1998) Methods. 14(4):381-92). Hier werden bestimmte flankierende Sequenzen dem Zielgen angefügt (lox-Sequenzen), die später eine Entfernung mittels der cre- Rekombinase ermöglichen.
Eine Expressionskassetten und die von ihr abgeleiteten Vektoren können weitere Funktionselemente enthalten. Der Begriff Funktionselement ist breit zu verstehen und meint all solche Elemente, die einen Einfluss auf Herstellung, Vermehrung oder Funktion der erfindungsgemäßen Expressionskassetten, Vektoren oder transgenen Organismen haben. Beispielhaft aber nicht einschränkend seien zu nennen:
a) Selektionsmarker, die eine Resistenz gegen einen Metabolismusinhibitor wie 2- Desoxyglucose-6-phosphat (WO 98/45456), Antibiotika oder Biozide, bevorzugt Herbizide, wie zum Beispiel Kanamycin, G 418, Bleomycin, Hygromycin, oder Phosphinotricin etc. verleihen. Besonders bevorzugte Selektionsmarker sind sol- che die eine Resistenz gegen Herbizide verleihen. Beispielhaft seien genannt:
DNA Sequenzen, die für Phosphinothricinacetyltransferasen (PAT) kodieren und Glutaminsynthaseinhibitoren inaktivieren (bar und pat Gen), 5- Enolpyruvylshikimat-3-phosphatsynthasegene (EPSP Synthasegene), die eine Resistenz gegen Glyphosat® (N-(phosphonomethyl)glycin) verleihen, das für das Glyphosat® degradierende Enzyme kodierende gox Gen (Glyphosatoxidoreduk- tase), das deh Gen (kodierend für eine Dehalogenase, die Dalapon inaktiviert), Sulfonylurea- und Imidazolinon inaktivierende Acetolactatsynthasen sowie bxn Gene, die für Bromoxynil degradierende Nitrilaseenzyme kodieren, das aasa- Gen, das eine Resistenz gegen das Antibiotikum Apectinomycin verleih, das Streptomycinphosphotransferase (SPT) Gen, das eine Resistenz gegen Strep- tomycin gewährt, das Neomycinphosphotransferas (NPTII) Gen, das eine Resistenz gegen Kanamycin oder Geneticidin verleiht, das Hygromycinphosphotrans- ferase (HPT) Gen, das eine Resistenz gegen Hygromycin vermittelt, das Aceto- lactatsynthas Gen (ALS), das eine Resistenz gegen Sulfonylharnstoff-Herbizide verleiht (z.B. mutierte ALS-Varianten mit z.B. der S4 und/oder Hra Mutation).
b) Reportergene, die für leicht quantifizierbare Proteine kodieren und über Eigenfarbe oder Enzymaktivität eine Bewertung der Transformationseffizienz oder des Expressionsortes oder -Zeitpunktes gewährleisten. Ganz besonders bevorzugt sind dabei Reporter-Proteine (Schenborn E, Groskreutz D. Mol Biotechnol. 1999; 13(1 ):29-44) wie das "green fluorescence protein" (GFP) (Sheen et al.(1995) Plant Journal 8(5):777-784), die Chloramphenicoltransferase, eine Luziferase (Ow et al. (1986) Science 234:856-859), das Aequorin-Gen (Prasher et al. (1985) Biochem Biophys Res Commun 126(3):1259-1268), die -Galactosidase, ganz besonders bevorzugt ist die ß-Glucuronidase (Jefferson et al. (1987) EMBO J 6:3901-3907).
c) Replikationsursprünge, die eine Vermehrung der erfindungsgemäßen Expressionskassetten oder Vektoren in zum Beispiel E. coli gewährleisten. Beispielhaft seien genannt ORI (origin of DNA replication), der pBR322 ori oder der P15A oh
(Sambrook et al.: Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2nd ed. CoId Spring Harbor Laboratory Press, CoId Spring Harbor, NY, 1989).
d) Elemente, die für eine Agrobakterium vermittelte Pflanzentransformation erforderlich sind, wie zum Beispiel die rechte oder linke Begrenzung der T-DNA oder die vir-Region.
Zur Selektion erfolgreich homolog rekombinierter oder auch transformierter Zellen ist es in der Regel erforderlich, einen Selektion ierbaren Marker zusätzlich einzuführen, der den erfolgreich rekombinierten Zellen eine Resistenz gegen ein Biozid (zum Beispiel ein Herbizid), einen Metabolismusinhibitor wie 2-Desoxyglucose-6-phosphat (WO 98/45456) oder ein Antibiotikum verleiht. Der Selektionsmarker erlaubt die Selektion der transformierten Zellen von untransformierten (McCormick et al. (1986) Plant Cell Reports 5:81 -84). Zusätzlich kann die transgene Expressionskassette oder die Expressionsvektoren weitere Nukleinsäuresequenzen enthalten, die nicht für eine Hefe G3PDH kodieren, und deren transgene Expression zu einer zusätzlichen Steigerung der Fettsäure- Biosynthese führt (infolge proOlL). Diese zusätzlich transgen exprimierte proOIL Nukleinsäuresequenz kann beispielhaft aber nicht einschränkend ausgewählt sein aus Nukleinsäuren kodierend für Acetyl-CoA-Carboxylase (ACCase), Glycerol-3-Phosphat Acyltransferase (GPAT), Lysophosphatidat-Acyltransferase (LPAT), Diacylglycerol- Acyltransferase (DAGAT) und Phospholipid:diacylglycerol-acyltransferase (PDAT). Entsprechende Sequenzen sind dem Fachmann bekannt und aus Datenbanken oder entsprechenden cDNA-Banken der jeweiligen Pflanzen leicht zugänglich.
Die Einführung einer erfindungsgemäßen Expressionskassette in einen Organismus oder Zellen, Geweben, Organe, Teile bzw. Samen desselben (bevorzugt in Pflanzen bzw. pflanzliche Zellen, Gewebe, Organe, Teile oder Samen), kann vorteilhaft unter Verwendung von Vektoren realisiert werden, in denen die Expressionskassetten enthalten sind. Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft daher besagte transgene Vektoren, die eine transgene Expressionskassete für eine Hefe G3PDH umfassen.
Vektoren können beispielhaft Plasmide, Cosmide, Phagen, Viren oder auch Agrobacte- rien sein. Die Expressionskassette kann in den Vektor (bevorzugt ein Plasmidvektor) über eine geeignete Restriktionsschnittstelle eingeführt werden. Der entstandene Vektor wird zunächst in E. coli eingeführt. Korrekt transformierte E. coli werden selektio- niert, gezüchtet und der rekombinante Vektor mit dem Fachmann geläufigen Methoden gewonnen. Restriktionsanalyse und Sequenzierung können dazu dienen, den Klonie- rungsschritt zu prüfen. Bevorzugt sind solche Vektoren, die eine stabile Integration der Expressionskassette in das Wirtsgenom ermöglichen.
Die Herstellung eines entsprechenden transgenen pflanzlichen Organismus erfolgt z.B. mittels Transformation oder Transfektion mittels der entsprechenden Proteine oder Nukleinsäuren. Die Herstellung eines transformierten Organismus (bzw. einer transformierten Zelle oder Gewebes) erfordert, dass die entsprechende DNA (z.B. der Expressionsvektor), RNA oder Protein in die entsprechende Wirtszelle eingebracht wird. Für diesen Vorgang, der als Transformation (oder Transduktion bzw. Transfektion) bezeichnet wird, steht eine Vielzahl von Methoden zur Verfügung (Keown et al. (1990) Methods in Enzymology 185:527-537). So kann die DNA oder RNA beispielhaft direkt durch Mikroinjektion oder durch Bombardierung mit DNA-beschichteten Mikro- Partikeln eingeführt werden. Auch kann die Zelle chemisch, zum Beispiel mit Polyethy- lenglycol, permeabilisiert werden, so dass die DNA durch Diffusion in die Zelle gelangen kann. Die DNA kann auch durch Protoplastenfusion mit anderen DNA- enthaltenden Einheiten wie Minicells, Zellen, Lysosomen oder Liposomen erfolgen. Elektroporation ist eine weitere geeignete Methode zur Einführung von DNA, bei der die Zellen reversibel durch einen elektrischen Impuls permeabilisert werden. Möglich sind ferner das Quellen von Pflanzenteilen in DNA-Lösungen sowie Pollen- oder Pollenschlauchtransformation. Entsprechende Verfahren sind beschrieben (beispielsweise bei Bilang et al. (1991 ) Gene 100:247-250; Scheid et al. (1991 ) Mol Gen Genet 228:104-112; Guerche et al. (1987) Plant Science 52:1 11-1 16; Neuhause et al. (1987) Theor Appl Genet 75:30-36; Klein et al. (1987) Nature 327:70-73 ; Howell et al. (1980) Science 208:1265; Horsch et al.(1985) Science 227:1229-1231 ; DeBlock et al. (1989) Plant Physiology 91 :694-701 ; Methods for Plant Molecular Biology (Weissbach and Weissbach, eds.) Academic Press Inc. (1988); and Methods in Plant Molecular Biology (Schuler and Zielinski, eds.) Academic Press Inc. (1989)).
Bei Pflanzen werden dabei die beschriebenen Methoden zur Transformation und Regeneration von Pflanzen aus Pflanzengeweben oder Pflanzenzellen zur transienten oder stabilen Transformation genutzt. Geeignete Methoden sind vor allem die Pro- toplastentransformation durch Polyethylenglykol-induzierte DNA- Aufnahme, das biolistische Verfahren mit der Genkanone, die sogenannte "particle bombardment" Methode, die Elektroporation, die Inkubation trockener Embryonen in DNA-haltiger Lösung und die Mikroinjektion.
Neben diesen "direkten" Transformationstechniken kann eine Transformation auch durch bakterielle Infektion mittels Agrobacterium tumefaciens oder Agrobacterium rhizogenes und Übertragung von entsprechenden rekombinanten Ti-Plasmiden oder Ri-Plasmiden durch oder durch Infektion mit transgenen Pflanzenviren durchgeführt werden. Die Agrobacterium-vermittelte Transformation ist am besten für dicotyle- done Pflanzenzellen geeignet. Die Verfahren sind beispielsweise beschrieben bei Horsch RB et al. (1985) Science 225: 1229f).
Werden Agrobacterien verwendet, so ist die Expressionskassette in spezielle Plasmide zu integrieren, entweder in einen Zwischenvektor (englisch: Shuttle or intermediate vector) oder einen binären Vektor. Wird ein Ti oder Ri Plasmid zur Transformation verwendet werden soll, ist zumindest die rechte Begrenzung, meistens jedoch die rechte und die linke Begrenzung der Ti oder Ri Plasmid T-DNA als flankierende Region mit der einzuführenden Expressionskassette verbunden.
Bevorzugt werden binäre Vektoren verwendet. Binäre Vektoren können sowohl in E. coli als auch in Agrobacterium replizieren. Sie enthalten in der Regel ein Selektions- markergen und einen Linker oder Polylinker flankiert von der rechten und linken T- DNA Begrenzungssequenz. Sie können direkt in Agrobacterium transformiert werden (Holsters et al. (1978) Mol Gen Genet 163:181-187). Das Selektionsmarkergen erlaubt eine Selektion transformierter Agrobakteria und ist zum Beispiel das nptll Gen, das eine Resistenz gegen Kanamycin verleiht. Das in diesem Fall als Wirtsorganismus fungierende Agrobacterium sollte bereits ein Plasmid mit der vir-Region enthalten. Diese ist für die Übertragung der T-DNA auf die pflanzliche Zelle erforderlich. Ein so transformiertes Agrobacterium kann zur Transformation pflanzlicher Zellen verwendet werden. Die Verwendung von T-DNA zur Transformation pflanzlicher Zellen ist intensiv untersucht und beschrieben (EP 120 516; Hoekema, In: The Binary P lant Vector System, Offsetdrukkerij Kanters B.V., Alblasserdam, Chapter V; An et al. (1985) EMBO J 4:277-287). Verschiedene binäre Vektoren sind bekannt und teilweise kommerziell erhältlich wie zum Beispiel pBI101.2 oder pBIN19 (Clontech Laboratories, Inc. USA).
Weitere zur Expression in Pflanzen geeignet Promotoren sind beschrieben (Rogers et al. (1987) Meth in Enzymol 153:253-277; Schardl et al. (1987) Gene 61 :1-11 ; Berger et al. (1989) Proc Natl Acad Sei USA 86:8402-8406).
Direkte Transformationstechniken eignen sich für jeden Organismus und Zelltyp. Im Falle von Injektion oder Elektroporation von DNA bzw. RNA in pflanzliche Zellen sind keine besonderen Anforderungen an das verwendete Plasmid gestellt. Einfache Plasmide wie die der pUC-Reihe können verwendet werden. Sollen vollständige
Pflanzen aus den transformierten Zellen regeneriert werden, so ist er erforderlich, das sich auf dem Plasmid ein zusätzliches selektionierbares Markergen befindet.
Stabil transformierte Zellen d.h. solche, die die eingeführte DNA integriert in die DNA der Wirtszelle enthalten, können von untransformierten selektioniert werden, wenn ein selektionierbarer Marker Bestandteil der eingeführten DNA ist. Als Marker kann beispielhaft jedes Gen fungieren, dass eine Resistenz gegen Antibiotika oder Herbizide (wie Kanamycin, G 418, Bleomycin, Hygromycin oder Phosphinotricin etc.) zu verleihen vermag (s.o.). Transformierte Zellen, die ein solches Markergen exprimieren, sind in der Lage, in der Gegenwart von Konzentrationen eines entsprechenden Antibiotikums oder Herbizides zu überleben, die einen untransformierten Wildtyp abtöten. Beispiel sind oben genannt und umfassen bevorzugt das bar Gen, dass Resistenz gegen das Herbizid Phosphinotricin verleiht (Rathore KS et al. (1993) Plant Mol Biol 21 (5):871- 884), das nptll Gen, dass Resistenz gegen Kanamycin verleiht, das hpt Gen, das
Resistenz gegen Hygromycin verleiht, oder das EPSP-Gen, das Resistenz gegen das Herbizid Glyphosat verleiht. Der Selektionsmarker erlaubt die Selektion von transformierten Zellen von u ntransformierten (McCormick et al. (1986) Plant Cell Reports 5:81- 84). Die erhaltenen Pflanzen können in üblicher weise gezüchtet und gekreuzt werden. Zwei oder mehr Generationen sollten kultiviert werden, um sicherzustellen, dass die genomische Integration stabil und vererblich ist.
Die oben genannten Verfahren sind beispielsweise beschrieben in Jenes B et al.(1993) Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Vol. 1 , Engineering and Utilizati- on, herausgegeben von SD Kung und R Wu, Academic Press, S.128-143 sowie in Potrykus (1991 ) Annu Rev Plant Physiol P lant Molec Biol 42:205-225) . Vorzugsweise wird das zu exprimierende Konstrukt in einen Vektor kloniert, der geeignet ist, Agrobac- terium tumefaciens zu transformieren, beispielsweise pBin19 (B evan et al. (1984) Nucl Acids Res 12:8711f).
Sobald eine transformierte Pflanzenzelle hergestellt wurde, kann eine vollständige Pflanze unter Verwendung von dem Fachmann bekannten Verfahren erhalten werden. Hierbei geht man beispielhaft von Kalluskulturen aus. Aus diesen noch undifferenzierten Zellmassen kann die Bildung von Spross und Wurzel in bekannter Weise induziert werden. Die erhaltenen Sprösslinge können ausgepflanzt und gezüchtet werden.
Dem Fachmann sind such Verfahren bekannt, um aus Pflanzenzellen, Pflanzenteile und ganze Pflanzen zu regenerieren. Beispielsweise werden hierzu Verfahren beschrieben von Fennell et al. (1992) Plant Cell Rep. 11 : 567-570; Stoeger et al ( 1995) Plant Cell Rep. 14 :273-278; Jahne et al. (1994) Theor Appl Genet 89:525-533 verwendet.
"Transgen" oder "recombinant" meint bezüglich zum Beispiel einer Nukleinsäurese- quenz, einer Expressionskassette oder einem Vektor enthaltend besagte Nukleinsäu- resequenz oder einem Organismus transformiert mit besagter Nukleinsäuresequenz, Expressionskassette oder Vektor alle solche durch gentechnische Methoden zustandegekommene Konstruktionen, in denen sich entweder a) die Nukleinsäuresequenz kodierend für eine Hefe G3PDH, oder
b) eine mit besagter Nukleinsäuresequenz unter a) funktionell verknüpfte genetische Kontroll sequenz, zum Beispiel ein in pflanzlichen Organismus funktioneller Promotor, oder
c) (a) und (b)
sich nicht in ihrer natürlichen, genetischen Umgebung befinden oder durch gentechnische Methoden modifiziert wurden, wobei die Modifikation beispielhaft eine Substitutionen, Additionen, Deletionen, Inversion oder Insertionen eines oder mehrerer Nukleo- tidreste sein kann. Natürliche genetische Umgebung meint den natürlichen chromoso- malen Locus in dem Herkunftsorganismus oder das Vorliegen in einer genomischen Bibliothek. Im Fall einer genomischen Bibliothek ist die natürliche, genetische Umgebung der Nukleinsäuresequenz bevorzugt zumindest noch teilweise erhalten. Die Umgebung flankiert die Nukleinsäuresequenz zumindest an einer Seite und hat eine Sequenzlänge von mindestens 50 bp, bevorzugt mindestens 500 bp, besonders bevorzugt mindestens 1000 bp, ganz besonders bevorzugt mindestens 5000 bp. Eine natürlich vorkommende Expressionskassette - beispielsweise die natürlich vorkommende Kombination des Promotors eines Gens kodierend für eine Hefe G3PDH wird zu einer transgenen Expressionskassette, wenn diese durch nicht-natürliche, synthetische ("künstliche") Verfahren wie beispielsweise einer Mutagenisierung geändert wird. Entsprechende Verfahren sind beschrieben (US 5,565,350; WO 00/15815; siehe auch oben).
Als transgene Organismen bevorzugte Wirts- oder Ausgangsorganismen sind vor allem Pflanzen gemäß der oben genannten Definition. Eingeschlossen sind im Rahmen der Erfindung alle Gattungen und Arten monokotyler und dikotyler Pflanzen des Pflanzen- reiches, insbesondere Pflanzen, die für die Gewinnung von ölen verwendet werden wie beispielsweise Raps, Sonnenblume, Sesam, Färberdistel, Ölbaum, Soja, Mais und Nussarten. Eingeschlossen sind ferner die reifen Pflanzen, Saatgut, Sprossen und Keimlinge, sowie davon abgeleitete Teile, Vermehrungsgut und Kulturen, zum Beispiel Zellkulturen. Reife Pflanzen meint Pflanzen zu jedem beliebigen Entwicklungsstadiu m jenseits des Keimlings. Keimling meint eine junge, unreife Pflanze in einem frühen Entwicklungsstadium.
Die Herstellung der transgenen Pflanzen kann mit den oben beschriebenen Verfahren zur Transformation oder Transfektion von Organismen realisiert werden.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft die direkte Verwendung der erfindungsgemäßen, transgenen Pflanzen und der von ihnen abgeleitete Zellen, Zellkulturen, Teile - wie zum Beispiel bei transgenen Pflanzen Wurzeln, Blätter etc.- , und transge- nes Vermehrungsgut wie Saaten oder Früchte, zur Herstellung von Nahrungs- oder Futtermitteln, Kosmetika oder Pharmazeutika, insbesondere von ölen, Fetten, Fettsäuren oder Derivaten der vorgenannten. Hierzu werden die Pflanzen oder Pflanzenteile den Nahrungs-, Futtermitteln, Kosmetika, Pharmazeutika oder Produkten mit industriellen Anwendungen in üblichen Mengen zugefügt. Auch können aus den Pflanzen vorzugsweise a us den Samen, wie oben beschrieben, die öle und/oder ggf. freien Fettsäuren gewonnen werden und den Nahrungs-, Futtermitteln, Kosmetika, Pharmazeutika oder Produkten mit industriellen Anwendungen in üblichen Mengen zugesetzt werden.
Neben der Beeinflussung des ölgehaltes kann die transgene Expression einer Hefe G3PDH in Pflanzen noch weitere vorteilhafte Effekte vermitteln, wie beispielsweise eine erhöhte Stressresistanz z.B. gegen osmotischen Stress. Die Hefe G3PDH vermittelt über erhöhte Glycerolspiegel einen Schutz gegen derartigen Stres, indem Glycerol als Osmoprotektivum wirkt. Derartiger osmotischer Stress tritt beispielsweise bei salzhaltigen Böden und Wasser auf und ist ein zunehmendes Problem in der Landwirtschaft. Eine erhöhte Stresstoleranz bietet hier beispielsweise die Möglichkeit zur landwirtschaftlichen Nutzung von Flächen, in denen übliche Ackerpflanzen nicht gedeihen können.
Ferner kann die transgene Expression der Hefe G3PDH den NADH Spiegel und so das REDOX-Gleichgewicht in dem pflanzlichen Organismus beeinflussen. Stress, wie beispielsweise Trockenheit, Hitze, Kälte, UV Licht etc. kann zu erhöhten NADH
Spiegeln und zu einer vermehrten Bildung von reaktivem Sauerstoff (ROS) führen. Die transgene Expression der Hefe G3PDH kann einen unter besagten Stressbedingungen anfallenden NADH Überschuss abbauen, so das REDOX-Gleichgewicht stabilisieren und die Auswirkungen des Stress mildern.
Sequenzen
1. SEQ ID NO: 1
Nukleinsäuresequenz kodierend für Saccharomyces cerevisiae G3PDH (Gpd1 p) 2. SEQ ID NO: 2
Proteinsequenz der Saccharomyces cerevisiae G3PDH (Gpdi p)
3. SEQ ID NO: 3
Nukleinsäuresequenz kodierend für Saccharomyces cerevisiae G3PDH (Gpd2p)
4. SEQ ID NO: 4
Proteinsequenz der Saccharomyces cerevisiae G3PDH (Gpd2p)
5. SEQ ID NO: 5
Proteinsequenz der Saccharomyces cerevisiae G3PDH (Gpd2p) mit zweitem, alternativem Start-Codon
6. SEQ ID NO: 6
Nukleinsäuresequenz kodierend für Schizosaccharomyces pombe G3PDH
7. SEQ ID NO: 7
Proteinsequenz der Schizosaccharomyces pombe G3PDH
8. SEQ ID NO: 8 Nukleinsäuresequenz kodierend für Schizosaccharomyces pombe G3PDH
9. SEQ ID NO: 9
Proteinsequenz der Schizosaccharomyces pombe G3PDH
10. SEQ ID NOM O
Nukleinsäuresequenz kodierend für Yarrowinia lipolytica G3PDH
11. SEQ ID NO: 1 1
Proteinsequenz der Yarrowinia lipolytica G3PDH
12. SEQ ID NO: 12
Proteinsequenz der Yarrowinia lipolytica G3PDH, mit zweitem, alternativem Start-Codon
13. SEQ ID NO: 13
Nukleinsäuresequenz kodierend fü r Zygosaccharomyces rouxii G3PDH
14. SEQ ID NO: 14
Proteinsequenz der Zygosaccharomyces rouxii G3PDH 15. SEQ ID NO: 15
Nukleinsäuresequenz kodierend für Zygosaccharomyces rouxii G3PDH
16. SEQ ID NO: 16
Proteinsequenz der Zygosaccharomyces rouxii G3PDH
17. SEQ ID NO: 17
Expressionsvektor auf Basis von pSUN-USP für S. cerevisiae G3PDH (Gpdip, Insert von bp 1017 - 2190)
18. SEQ ID NO: 18 Oligonukleotidprimer OPNI ö'-ACTAGTATGTCTGCTGCTGCTGATAG-S'
19. SEQ ID NO: 19 Oligonukleotidprimer OPN2 δ'-CTCGAGATCTTCATGTAGATCT AATT-31
20. SEQ ID NO: 20 Oligonukleotidprimer OPN3 5'-GCGGCCGCCATGTCTGCTGCTGCTGATAG-S'
21. SEQ ID NO: 21 Oligonukleotidprimer OPN4 5'-GCGGCCGCATCTTCATGTAGATCTAATT-S'
22 - 35: SEQ ID NO: 22 - 35: Sequenzmotive für Hefe G3PDHs mit Angabe von möglichen Sequenzvariationen (siehe oben). Die Variationen eines einzelnen Motives können jeweils einzeln aber auch in den unterschiedlichen Kombinationen miteinander vorkommen.
36. SEQ ID NO: 36
Expressionsvektor pGPTV-gpd1 auf Basis von pGPTV-Napin für S. cerevisiae G3PDH (Gpdip; Insert gdp1 von bp 11962 - 13137; nos-Terminator: 13154 - 13408; Napin Promotor: 10807 - 11951 ).
37. SEQ ID NO: 37 Nukleinsäuresequenz kodierend für Emericella nidulans G3PDH
38. SEQ ID NO: 38
Proteinsequenz der Emericella nidulans G3PDH 39. SEQ ID NO: 39
Nukleinsäuresequenz kodierend für Debaryomyces hansenii G3PDH (partiell)
40. SEQ ID NO: 40
Proteinsequenz der Debaryomyces hansenii G3PDH (partiell)
Abbildungen
Figur 1 : Northern Blot. Transkriptionsnachweis des Hefe GPD1-Gens in reifenden Samen transgener Rapslinien (8, 6, 9 und 3). Als Vergleich ist der gleiche Nachweis mit Wildtyp (WT) Pflanzen durchgeführt worden. In den Linien 8, 6 und 9 konnte das GPD1 -Transkript nachgewiesen werden. In den Linie 3 kam es nicht zur Expression des GPD1 Gens.
Diese Linie wurde für weitere Analysen als zusätzliche Kontrolle eingesetzt.
Figur 2: Glycerol-3-phosphat Menge in reifenden Samen (40 DAF = days after flowering; Tage nach Blüte) trangener GPD1 -Rapslinien 8, 6 und 9 (schwarze Balken). Als Vergleich ist der Gehalt in entsprechenden un- transformierten Wilttyp-Pflanzen (WT) sowie der nicht exprimierenden transgenen Linie 3 (hellere Balken) bestimmt worden. Die angegebenen Fehlerabweichungen ergeben sich aus jeweils 6 unabhängigen Messungen aller erhaltenen Samen.
Figur 3: Glycerol-3-phosphat Dehydrogenase Aktivität in reifenden Samen (40
DAF) trangener GPD1 -Rapslinien 8, 6 und 9 (schwarze Balken). Als Vergleich ist der Gehalt in entsprechenden untransformierten Wilttyp- Pflanzen (WT) sowie der nicht exprimierenden transgenen Linie 3 (hellere Balken) bestimmt worden. Die angegebenen Fehlerabweichungen ergeben sich aus jeweils 6 unabhängigen Messungen aller erhaltenen
Samen.
Figur 4: Gesamtlipidmenge in den Samen transgener GPD1 p-Rapslinien
(schwarze Balken) bezogen auf die Samenmasse. Zum Vergleich ist der Gehalt in entsprechenden untransformierten Wilttyp-Pflanzen (WT) sowie der nicht exprimierenden transgenen Linie 3 (helllere Balken) bestimmt worden. Alle 3 transgenen und exprimierenden Pflanzen zeigen eine signifikante Erhöhung der Gesamtlipidmenge in reifen Samen. Die angegebenen Fehlerabweichungen ergeben sich aus jeweils 5 unabhängigen Messungen aller erhaltenen Samen.
Figur 5 Figur 5 gibt einen Sequenzvergleich von Homologen der G3PDH aus anderen Hefen wieder.
Tabellen
Tabelle 1 :
Fettsäureprofil der Samenöle in den GPD1 p-Rapslinien 8, 6 und 9 (in mol%). Zum Vergleich ist das Fettsäureprofil in den entsprechenden untransformierten Wildtyp- Pflanzen (WT) sowie der nicht expri mierenden transgenen Linie 3 aufgezeigt.
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Allgemeine Methoden:
Alle Chemikalien, wenn nicht anders erwähnt, stammen von den Firmen Fluka (Buchs), Merck (Darmstadt), Roth (Karlsruhe), Serva (Heidelberg) und Sigma (Deisenhofen). Restriktionsenzyme, DNA-modifizierende Enzyme und Molekularbiologie-Kits wurden von den Firmen Amersham-Pharmacia (Freiburg), Biometra (Göttingen), Roche (Mannheim), New England Biolabs (Schwalbach), Novagen (Madison, Wisconsin, USA), Perkin-Elmer (Weiterstadt), Qiagen (Hilden), Strategen (Amsterdam, Niederlan- de), Invitrogen (Karlsruhe) und Ambion (Cambridgeshire, United Kingdom). Die verwendeten Reagenzien wurden entsprechend der Angaben des Herstellers eingesetzt.
Die chemische Synthese von Oligonukleotiden kann beispielsweise, in bekannter Weise, nach der Phosphoamiditmethode (Voet, Voet, 2. Auflage, Wiley Press New York, Seite 896-897) erfolgen. Die im Rahmen der vorliegenden Erfindung durchgeführten Klonierungsschritte wie z. B. Restriktionsspaltungen, Agarosegelelektrophore- se, Reinigung von DNA-Fragmenten, Transfer von Nukleinsäuren auf Nitrozellulose und Nylonmembranen, Verknüpfen von DNA-Fragmenten, Transformation von E. coli Zellen, Anzucht von Bakterien, Vermehrung von Phagen und Sequenzanalyse rekombinanter DNA werden wie bei Sambrook et al. (1989) CoId Spri ng Harbor
Laboratory Press; ISBN 0-87969-309-6 beschrieben durchgeführt. Die Sequenzierung rekombinanter DNA—Moleküle erfolgt mit einem Laserfluoreszenz-DNA- Sequenzierer der Firma ABI nach der Methode von Sanger (Sanger et al. (1977) Proc Natl Acad Sei USA 74:5463-5467).
Beispiel 1 : Klonierung des Gpd1-Gens aus Hefe
Genomische DNA aus Saccharomyces cerevisiae S288C (Mat alpha SUC2 mal mel gal2 CUP1 flo1 Flo8- 1 , Invitrogen, Karlsuhe, Deutschland) wurde nach folgendem Protokoll isoliert:
Eine 100 ml Kultur wurde bis zu einer optischen Dichte von 1 ,0 bei 30 °C angezogen. Davon wurden 60 ml abzentrifugiert bei 3000 xg für 3 min. Das Pellet wurde in 6 ml doppelt-destilliertem H2O resuspendiert und auf 1 ,5 ml Gefässe verteilt, abzentrifugiert und der Überstand verworfen. Die Pellets wurden mit 200 μl Lösung A, 200 μL Phenol/Chloroform (1 :1 ) und 0,3 g Glasskugeln durch Vortexen resuspendiert und lysiert. Nach Zugabe von 200 μl TE-PufferpH 8,0 wurde für 5 min zentrifugiert. Der Überstand wurde einer E thanolfällung mit 1 ml Ethanol unterzogen. Das erhaltene Pellet nach Fällung wurde in 400 μL TE-Puffer pH 8,0 + 30 μg/mL RnaseA gelöst. Nach Inkubation für 5 min bei 37 0C wurden 18 μl_ 3 M Natriumacetat-Lösung pH 4,8 und 1 ml_ Ethanol zugegeben und die präzipitierte DNA durch Zentrifugation pelletiert. Das DNA-Pellet wurde in 25 μl_ doppelt-destilliertem H2O gelöst. Die Konzentration der genomischen DNA wurde durch deren Absorption bei 260 nm bestimmt.
Lösung A:
2 % Trition--X100 1 % SDS 0,1 M NaCI
0,01 M Tris-HCI pH 8,0 0,001 M EDTA
Für die Klonierung des Gpd1-Gens wurde die isolierte Hefe-DNA in einer PCR- Reaktion mit den Oligonukleotidprimern ONP1 und ONP2 eingesetzt.
Sequenz Primerpaar 1 : δ'-ACTAGTATGTCTGCTGCTGCTGATAG
Sequenz Primerpaar 2: δ'-CTCGAGATCTTCATGTAGATCTAATT
Zusammensetzung des PCR-Ansatzes (50 uL):
5,00 μl_ 5 μg genomische Hefe-DNA 5,00 μL 10x Puffer (Advantage-Polymerase)+ 25mM MgCI2 5,00 μL 2mM dNTP 1 ,25 μL je Primer (10 pmol/uL) 0,50 μL Advantage-Polymerase
Die Advantage-Polymerase von Clontech wurden eingesetzt.
PCR-Programm:
Anfangsdenaturierung für 2 min bei 95°C, dann 35 Zyklen mit 45 sec 95°C, 45 sec 55°C und 2 min 72°C. Abschliessende Extension von 5 min bei 72°C.
Das PCR-Produkte wurde in den pCR2.1-TOPO Vektor (Invitrogen) gemäss Herstellerangaben kloniert, resultierend in dem Vektor pCR2.1-gpd1 und die Sequenz wurde durch Sequenzierung überprüft. Für die Klonierung in den Agrotransformationsvektor pGPTV wurden 0,5 μg des
Vektors pCR2.1-gpd1 mit den Restriktionsenzym Xhol (New England Biolabs) für 2 Stunde inkubiert und anschliessend 15 min mit Klenow-Fragment (New England Biolabs) inkubiert. Nach Inkubation für 2 Stunden mit Spei wurden die DNA-Fragmente per Gelelektorphorese aufgetrennt. Das neben dem Vektor (3,9 kb) 1185 bp grosse Fragment der gpd1 -Sequenz wurde aus dem Gel ausgeschnitten und mit dem
.Gelpurification'Kit von Qiagen nach Herstellerangaben aufgereinigt und mit 50 μl_
Elutionspuffer eluiert. 0,1 μg des Vektors pGPTV wurde zuerst für 1 Stunde mit dem
Restriktionsenzym Sacl verdaut, dann für 15 min mit Klenow-Fragment (New England Biolabs) inkubiert. 10 μl_ des Eluates des gpd1 -Fragments und 10 ng des behandelten
Vektors pGPTV wurden über Nacht bei 16°C ligiert (T4 Ligase von New England Biolabs). Die Ligationsprodukte werden dann in TOP10 Zellen (Stratagene) nach Herstellerangaben transformiert und entsprechend selektioniert, resultierend in dem Vektor pGPTV-gpd1. Positive Klone werden mit den Primern 1 und 2 durch PCR und Sequenzierung verifiziert.
Für die Herstellung des Vektors pSUN-USP-gpd1 wurde eine PCR vom Vektor pCR2.1-gpd1 m it den Primern 3 und 4 durchgeführt.
Sequenz Primer 3: 5'-GCGGCCGCCATGTCTGCTGCTGCTGATAG Sequenz Primer 4: 5'-GCGGCCGCATCTTCATGTAGATCTAATT
Zusammensetzung des PCR-Ansatzes (50 μl_):
5 ng DNA Plasmid pCR2.1-gpd1
5,00 μl_ 10x Puffer (Advantage-Polymerase)+ 25mM MgCI2
5,00 μl_ 2mM dNTP
1 ,25 μl_ je Primer (10 pmol/μL) 0,50 μl_ Advantage-Polymerase
Die Advantage-Polymerase von Clontech wurden eingesetzt.
PCR-Programm:
Anfangsdenaturierung für 2 min bei 95°C, dann 35 Zyklen mit 45 sec 95°C, 45 sec 550C und 2 min 72°C. Abschliessende Extension von 5 min bei 72°C. Das 1190 bp grosser PCR-Produkt wurde mit dem Restriktionsenzym Notl für 24 Stunden verdaut. Der Vektor pSUN-USP wurde für 2 Stunden mit Notl verdaut, dann 15 min mit alkalischer Phosphatase (New England Biolabs) inkubiert. 100 ng des vorbehandelten gpd1 -Fragments und 10 ng des behandelten Vektors pGPTV wurden über Nacht bei 16°C ligiert (T4 Ligase von New England Biolabs). Die Ligationsproduk- te werden dann in TOP 10 Zellen (Stratagene) nach Herstellerangaben transformiert und entsprechend Selektion iert, resultierend in dem Vektor pSUN-USP-gpd1 . Positive Klone werden mit den Primern 3 und 4 durch PCR und Sequenzierung verifiziert.
Beispiel 2: Plasmide für die Pflanzentransformation
Zur Pflanzentransformation können binäre Vektoren, wie pBinAR verwendet werden (Höfgen und Willmitzer (1990) Plant Science 66: 221-230). Die Konstruktion der binären Vektoren kann durch Ligation der cDNA in Sense- oderAntisense- Orientierung in T-DNA erfolgen. 5' der cDNA aktiviert ein Pflanzen promotor die Transkription der cDNA. Eine Polyadenylierungssequenz befindet sich 3' von der cDNA.
Die gewebe spezifische Expression lässt sich unter Verwendung eines gewebespezifischen Promotors erzielen. Beispielsweise kann die samenspezifische Expression erreicht werden, indem der Napin- oder der LeB4- oder der USP-Promotor 5' der cDNA einkloniert wird. Auch jedes andere samenspezifische Promotorelement kann verwendet werden. Zur konstitutiven Expression in der ganzen Pflanzen lässt sich der CaMV- 35S-Promotor verwenden.
Ein weiteres Beispiel für einen binären Vektoren ist der Vektor pSUN-USP und pGPTV- Napin inweichen welche die Fragmentedas Fragment aus Beispiel 2 kloniert wurde. Der Vektor pSUN-USP enthält den USP-Promotor sowie den OCS Terminator. Der Vektor pGPTV-Napin enthält einen verkürzte Version des Napin-Promotors und den nos-Terminator.
Die Fragmente aus Beispiel 2 wurden in die multiple Klonierungsstelle des Vektors pSUN-USP bzw. pGPTV-Napin kloniert, um die samenspezifische Expression des GPD1 Gens zu ermöglichen. Das entsprechende Konstrukt pSUN-USP-gpd1 ist mit der SEQ ID NO: 16 beschrieben, das Konstrukt von G3PDH in pGPTV-Napin ist durch SEQ ID NO: 36 beschrieben.
Beispiel 3: Transformation von Agrobacterium Die Agrobacterium-vermittelte Pflanzentransformation kann zum Beispiel unter Verwendung der Agrobacterium tumefaciens-Stämme GV3101 (pM P90) (Koncz und Schell (1986) Mol Gen Genet 204: 383- 396) oder LBA4404 (Clontech) durchgeführt werden. Die Transformation kann durch Standard-Transformationstechniken durchge- führt werden (Deblaere et al.(1984) Nucl Acids Res 13:4777-4788).
Beispiel 4: Pflanzentransformation
Die Agrobacterium-vermittelte Pflanzentransformation wurde unter Verwendung von Standard-Transformations- und Regenerationstechniken durchgeführt werden (Gelvin, Stanton B., Schilperoort, Robert A., Plant Molecular Biology Manual, 2. Aufl., Dordrecht: Kluwer Academic Publ., 1995, in Sect., Ringbuc Zentrale Signatur: BT11-P ISBN 0-7923-2731-4; Glick, Bernard R., Thompson, Joh n E., Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Boca Raton: CRC Press, 1993, 360 S., ISBN 0- 8493-5164-2).
Raps wurde mittels Kotyledonen- oder Hypokotyltransformation transformiert werden (Moloney et al., Plant Cell Report 8 (1989) 238-242; De Block et al., Plant Physiol. 91 (1989) 694-701 ). Die Verwendung von Antibiotika für die Agrobacterium- und Pflanzenselektion hängt von dem für die Transformation verwendeten binären Vektor und Agrobacterium-Stamm ab. Die Rapsselektion wurde unter Verwendung von Kanamycin als selektierbarem Pflanzenmarker durchgeführt.
Der Agrobacterium-vermittelte Gentransfer in Lein (Linum usitatissimum) lässt sich unter Verwendung von beispielsweise einer von Mlynarova et al. (1994) Plant Cell Report 13:282-285 beschriebenen Technik durchführen.
Die Transformation von Soja kann unter Verwendung von beispielsweise einer in EP- A-O 0424 047 (Pioneer Hi-Bred International) oder in EP-A-O 0397 687, US 5,376,543, US 5,169,770 (University Toledo) beschriebenen Technik durchgeführt werden.
Die Pflanzentransformation unter Verwendung von Teilchenbeschuss, Polyethylengly- col-vermittelter DNA-Aufnahme oder ü ber die Siliziumcarbonatfaser- Technik ist beispielsweise beschrieben von Freeling und Walbot "The maize handbook" (1993) ISBN 3-540-97826-7, Springer Verlag New York).
Beispiel 5: Untersuchung der Expression eines rekombinanten Genproduktes in einem transformierten Organismus
Ein geeignetes Verfahren zur Bestimmung der Menge an Transkription des Gens (ein Hinweis auf die Menge an RNA, die fü r die Translation des Genproduktes zur Verfügung steht) ist die Durchführung eines Northern-Blots wie unten ausgeführt (als Bezugsstelle siehe Ausubel et al. (1988) Current Protocols in Molecular Biology, Wiley: New York, oder den oben erwähnten Beispielteil), wobei ein Primer, der so gestaltet ist, dass er an das Gen von Interesse bindet, mit einer nachweisbaren Markierung (gewöhnlich radioaktiv oder chemilumineszent) markiert wird, so dass, wenn die Gesamt— RNA einer Kultur des Organismus extrahiert, auf einem Gel aufgetrennt, auf eine stabile Matrix transferiert und mit dieser Sonde inkubiert wird, die Bindung und das Ausmaß der Bindung der Sonde das Vorliegen und auch die Menge der mRNA für dieses Gen anzeigt. Diese Information zeigt den Grad der Transkription des transformierten Gens an. Zelluläre Gesamt-RNA kann aus Zellen, Geweben oder Organen mit mehreren Verfahren, die alle im Fachgebiet bekannt sind, wie zum Beispiel das von Bormann, E. R., et al. (1992) Mol. Microbiol. 6:317-326 beschriebene, präpariert werden.
Northem-Hybridisierung:
Für die RNA-Hybridisierung wurden 20 μg Gesamt-RNA oder 1 μg poly(A)+-RNA mittels Gelelektrophorese in Agarosegelen mit einer Stärke von 1 ,25 % unter Verwen- düng von Formaldehyd, wie beschrieben in Amasino (1986, Anal. Biochem. 152, 304) aufgetrennt, mittels Kapillaranziehung unter Verwendung von 10 x SSC auf positiv geladene Nylonmembranen (Hybond N+, Amersham, Braunschweig) übertragen, mittels UV-Licht immobilisiert und 3 Stunden bei 68°C unter Verwendung von Hybridi- sierungspuffer (10 % Dextransulfat Gew./Vol., 1 M NaCI, 1 % SDS, 100 mg Herings- sperma-DNA) vorhybridisiert. Die Markierung der DNA-Sonde mit dem Highprime DNA labeling-Kit (Roche, Mannheim, Deutschland) erfolgte während der Vorhybridisierung unter Verwendung von alpha-32 P-dCTP (Amersham Pharmacia, Braunschweig, Deutschland). Die Hybridisierung wurde nach Zugabe der markierten DNA-Sonde im gleichen Puffer bei 68°C über Nacht durchgefü hrt. Die Waschschritte wurden zweimal für 15 min unter Verwendung von 2 X SSC und zweimal für 30 min unter Verwendung von 1 X SSC, 1 % SDS, bei 68°C durchgeführt. Die Exposition der verschlossenen Filter wurde bei -700C für einen Zeitraum von 1 bis 14 T durchgeführt. Zur Untersuchung des Voriiegens oder der relativen Menge an von dieser mRNA translatiertem Protein können Standardtechniken, wie ein Western-Blot, eingesetzt werden (siehe beispielsweise Ausu bel et al. (1988) Current Protocols in Molecular Biology, Wiley: New York). Bei diesem Verfahren werden die zellulären Gesamt- Proteine extrahiert, mittels Gelelektrophorese aufgetrennt, auf eine Matrix, wie
Nitrozellulose, übertragen und mit einer Sonde, wie einem Antikörper, der spezifisch an das gewünschte Protein bindet, inkubiert. Diese Sonde ist gewöhnlich mit einer chemilumineszenten oder kolori metrischen Markierung versehen, die sich leicht nachweisen lässt. Das Vorliegen und die Menge der beobachteten Markierung zeigt das Vorliegen und die Menge des gewünschten, in der Zelle vorliegenden mutierten Proteins an.
Figur 1 zeigt die Ergebnisse des Northern Blots von 4 unabhängigen transgenen Rapslinien sowie des Wildtyps. Die Pflanzen der Linien 6, 8 und 9 zeigen ein starkes Detektionssignal auf dem Northern Blot. Die Pflanzen exprimieren demzufolge das GPD1 Gen in reifenden Samen. In den Samenprobe der Linie 3 konnte dagegen keine Transkirption des GPD1 Gens nachgewiesen werden und diente neben dem Wildtyp als zusätzliche Kontrolle. Außerdem zeigt Linie 3, dass die Expression des übertragenen Gens in Abhängigkeit vom Integrationsort in das Genom von Brassica napus nicht in jedem Fall gelingt.
Beispiel 6: Analyse der Auswirkung der rekombinanten Proteine auf die Produktion des gewünschten Produktes
Die Auswirkung der genetischen Modifikation in Pflanzen oder auf die Produktion einer gewünschten Verbindung (wie einer Fettsäure) kann bestimmt werden, indem die modifizierte Pflanze unter geeigneten Bedingungen (wie den vorstehend beschriebe- nen) gezüchtet wird und das Medium und/oder die zellulären Komponenten auf die erhöhte Produktion des gewünschten Produktes (d.h. von Lipiden oder einer Fettsäure) untersucht wird. Diese Analysetechniken sind dem Fachmann bekannt und umfassen Spektroskopie, Dünnschichtchromatographie, Färbeverfahren verschiedener Art, enzymatische und mikrobiologische Verfahren sowie analytische Chromatographie, wie Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (siehe beispielsweise Ullman, Encyclope- dia of Industrial Chemistry, Bd. A2, S. 89-90 und S. 443-613, VCH: Weinheim (1985); Fallon, A., et al., (1987) "Applications of HPLC in Biochemistry" in: Laboratory Techni- ques in Biochemistry and Molecular Biology, Bd. 17; Rehm et al. (1993) Biotechnology, Bd. 3, Kapitel III: "Product recovery and purification", S. 469-714, VCH: Weinheim; Belter, P.A., et al. (1988) Bioseparations: downstream processing for Biotechnology, John Wiley and Sons; Kennedy, J. F., und Cabral, J. M. S. (1992) Recovery processes for biological Materials, John Wiley and Sons; Shaeiwitz, J.A., und Henry, J. D. (1988) Biochemical Separations, in: Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, Bd. B3; Kapitel 11 , S. 1-27, VCH: Weinheim; und Dechow, FJ. (1989) Separation and purification techniques in biotechnology, Noyes Publications).
Neben den oben erwähnten Verfahren werden Pflanzenlipide aus Pflanzenmaterial wie von Cahoon et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 96 (22):12935-12940, und Browse et al. (1986) Analytic Biochemistry 152:141-145, beschrieben extrahiert. Die qualitative und quantitative Lipid- oder Fettsäureanalyse ist beschrieben bei Christie, William W., Advances in Lipid Methodology, Ayr/Scotland: OiIy Press (OiIy Press Lipid Library; 2); Christie, William W., Gas Chromatography and Lipids. A Practical Guide - Ayr, Scotland: OiIy Press, 1989, Repr. 1992, IX, 307 S. (OiIy Press Lipid Library; 1 ); "Progress in Lipid Research, Oxford: Pergamon Press, 1 (1952) - 16 (1977) u.d.T.: Progress in the Chemistry of Fats and Other Lipids CODEN.
Ein Beispiel ist die Analyse von Fettsäuren (Abkürzungen: FAME, Fettsäuremethylester; GC-MS, Gas-Flüssigkeitschromatographie-Massenspektrometrie; TAG, Triacylgly- cerin; TLC, Dünnschichtchromatographie).
Der unzweideutige Nachweis für das Vorliegen von Fettsäureprodukten kann mittels Analyse rekombinanter Organismen nach Standard-Analyseverfahren erhalten werden: GC, GC-MS oder TLC, wie verschiedentlich beschrieben von Christie und den Literaturstellen darin (1997, in: Advances on Lipid Methodology, Vierte Aufl.: Christie, OiIy Press, Dundee, 119-169; 1998, Gaschromatographie-Massenspe ktrometrie- Verfahren, Lipide 33:343-353).
Das zu analysierende Material kann durch Ultraschallbehandlung, Mahlen in der Glasmühle, flüssigen Stickstoff und Mahlen oder über andere anwendbare Verfahren aufgebrochen werden. Das Material muss nach dem Aufbrechen zentrifugiert werden. Das Sediment wird in Aqua dest. resuspendiert, 10 min bei 1000C erhitzt, auf Eis abgekühlt und erneut zentrifugiert, gefolgt von Extraktion in 0,5 M Schwefelsäure in Methanol mit 2 % Dimethoxypropan fü r 1 Std. bei 900C, was zu hydrolysierten Öl- und Lipidverbindungen führt, die transmethylierte Lipide ergeben. Diese Fettsäuremethylester werden in Petrolether extrahiert und schließlich einer GC- Analyse unter Verwen- düng einer Kapillarsäule (Chrompack, WCOT Fused Silica, CP-Wax-52 CB, 25 mikrom, 0,32 mm) bei einem Temperaturgradienten zwischen 1700C und 240°C für 20 min und 5 min bei 2400C unterworfen. Die Identität der erhaltenen Fettsäuremethylester muss unter Verwendung von Standards, die aus kommerziellen Quellen erhältlich sind (d.h. Sigma), definiert werden.
Pflanzenmaterial wird zunächst mechanisch durch Mörsern homogenisiert, um es einer Extraktion zugänglicher zu machen.
Für die quantitative Öl-Analyse der mit dem Konstrukten Gpd1-Gen transformierten Brassica Pflanzen wurde folgen des Protokoll angewendet:
Die Extraktion der Lipide aus Samen wird nach der Methode von Bligh & Dyer (1959) Can J Biochem Physiol 37:91 1 durchgeführt. Dazu werden 5 mg Arabidopsis Brassica Samen in 1 ,2 ml Qiagen-Microtubes (Qiagen, Hilden) auf einer Sartorius (Göttingen) Mikrowaage abgewogen. Das Samenmaterial wird mit 1 ml Chloroform/Methanol (1 :1 ; enthält Mono-C17-glycerin von Sigma als internen Standard) in der Rätschmühle MM300 der Firma Retsch (Haan) homogenisiertund 20 min bei RT inkubiert. Nach Zentrifugation wurde der Überstand in ein neues Gefäß überführt und das Sediment erneut mit 1 ml Chloroform/Methanol (1 :1 ) extrahiert. Die Überstände wurden vereinigt und bis zu Trockene eingeengt. Die Derivatisierung der Fettsäure erfolgte durch saure Methanolyse. Hierzu wurden die extrahierten Lipide mit 0,5 M Schwefelsäure in Methanol und 2 % (v/v) Dimethoxypropan versetzt und für 60 min. bei 800C inkubiert. Anschließend erfolgte eine zweimalige Extraktion mit Petrolether gefolgt von Waschschritten mit 100 mM Natriumhydrogencarbonat und Wasser. Die so hergestellten Fettsäuremethylester wurden bis zur Trockene eingeengt und in einem definierten
Volumen Petrolether aufgenommen. 2 μl_ der Fettsäuremethylester-Lösung wurden schließlich gaschromatographisch (HP 6890, Agilent Technologies) auf einer Kapillarsäule (Chrompack, WCOT Fused Silica, CP-Wax-52 CB, 25 m, 0.32 mm) aufgetrennt und über einen Flamenionisationsdetektor analysiert. Die Quantifizierung des Öls erfolgte durch einen Vergleich der Signalstärken der derivatisierten Fettäuren mit denen des internen Standards Mono-C17-glycerin (Sigma). Figur 4 zeigt beispielhaft die Ergbnisse für die quantitative Bestimmung der Ölgehalte in T3 Samen von 3 unabhängigen transgenen Rapslinien sowie einer nicht-exprimierenden Kontrollinie und den untransformierten Wildtyp-Pflanzen. Von den Samenpools jeder Linie wurden fünf unabhängige Extraktionen durchgeführt und die Extrakte unabhängig gemessen. Aus den drei unabhängigen Messungen wurden der Mittelwert sowie die Standardabweichung berechnet.
In den Samenproben der transgenen Linien 6, 8, und 9 konnte eine signifikante Erhöhung des Gesamtlipidgehalts gegenüber dem Wildtyp und der nicht exprimieren- den Kontrolllinie nachgewiesen werden. Dieser lag zwische ca. 20 und 22 % des
Samengewichts. Der Lipidanteil im Wildtyp und in der Kontroll-Linie 3 lag im Gegensatz dazu nur bei ca. 15 %. Dies entspricht einer Gesamtölgehaltssteigerung um 33 % bzw. ca. 47 %. Die Fettsäurezusammensetzung wurde durch die GPD1 Expr ession dagegen nicht verändert, (siehe Tabelle 1 ).
Tabelle 1 zeigt die Fettsäurezusammensetzung in den T3 Samen der transgenen
GDH-exprimierenden Linien 8, 6 und 9, sowie einer nicht-exprimierenden Kontrollinie 3 und den untransformierten Wildtyp-Pflanzen. Von den Samenpools jeder Linie wurden fünf unabhängige Extraktionen durchgeführt und die Extrakte unabhängig gemessen. Aus den drei unabhängigen Messungen wurden der Mittelwert sowie die Standardab- weichung berechnet.
Sowohl in den transgenen und exprimierenden GDH-Linien 8, 6 und 9 als auch in der nicht exprimierenden Kontrollli nie 3 und den untransformierten Wildtyp- Pflanzen macht Ölsäure (18:1 ) mit mehr als 55 % den größten Anteil im Öl aus.
Beispiel 7: Extraktion von Glycerol-3-phosphat
Zur Extraktion von Glycerol-3-phosphat aus reifenden Rapssamen werden diese in einer Schwingmühle (Retsch) homogenisiert und mit 500 μl kaltem 16 % (w/v) TCA/Diethylether versetzt und 20 Minuten auf Eis inkubiert. Anschließend werden 800 μl kaltes 16 % TCA/H2O, 5 mM EGTA hinzugefügt und für 3 Stunden auf Eis inkubiert. Durch Zentrifugation erfolgt die Sedimentierung nichtlöslicher Komponenten. Die flüssigen Oberphasen werden in ein neues Gefäß überführt und mit 500 μl kaltem, wassergesättigtem Diethylether bei 4 0C gewaschen und erneut zentrifugiert. Die hydrophile Unterphase wird 3 weiteren Waschg ängen unterzogen und der pH Wert mit 5 M KOH / 1 M TEA auf 6 - 7 eingestellt. Die hydrophile Phase wird in flü ssigem Stickstoff schockgefroren, in einem Lyophilisator (Gefriertrocknungsanlage, Christ) getrocknet und anschließend in 800 μl H2O gelöst.
Beispiel 8: Bestimmung der Glycerol-3-phosphat (G3P) Menge Die Bestimmung der G3P Menge erfolgt durch den enzymic cycling assay (Gibon et al. 2002). Hierzu werden 10 μl der hydrophilen Phase (s. oben) oder der G3PDH Replika- te (s. unten) mit 46 μl Tricine/KOH (200 mM, pH 7.8)/10 mM MgCI2 versetzt und 20 Minuten auf 95 0C, um das Dihydroxyacetonphosphat zu zerstören. Im Anschluß werden die Proben kurz anzentrifugiert und der Überstand mit 45 μl Reaktionsansatz (2 u Glycerol-3-phosphat-Oxidase, 0,4 u Glycerol-3-phosphat-Dehydrogenase, 13 O u Katalase, 0,12 μmol NADH) versetzt. Die Reaktion führt zu einem Nettoverbrauch von NADH, der am Photometer direkt durch Abnahme der Extinktion bei 340 nm verfolgt werden kann. Die Berechnung der G3P Menge erfolgt über eine Eichgerade unter- schiedlicher G3P Konzentrationen.
Interessanterweise führte die samenspezifische Überexpression von GDP aus Saccharomyces zu einer signifikanten Erhöhung des G3P Gehalts in reifend en Samen transgener Rapspflanzen (40 DAF). Die G3P-Gehalte in den Samen (40 DAF) der Linien 6, 8 und 9 lagen zwischen ca. 350 und 420 nmol G3P / g Frischmasse. Der G3P Gehalt in den Wildtyp-Samen und den Samen der nichtexprimierenden Linie lag dagegen nu r zwischen ca. 50 und 100 nmol G3P / g Frischmasse (siehe Figur 2) .
Beispiel 9: Bestimmung der G3PDH Aktivität
Zur Bestimmung der G3PDH-Aktivität in den reifenden Rapssamen werden die reifenden Samen aus tiefgefrorenen Schoten isoliert, mit einer Feinwaage abgewogen und mittels einer Schwingmühle (Retsch) homogenisiert. Anschließend werden die Proben wieder in flüssigem Stickstoff tiefgefroren.
Fünfhundert Mikroliter eines kalten Extraktionspuffers (50 mM HEPES pH7,4, 5 mM MgCI2, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 5 mM Dithiothreitol, 10 % (v/v) Glycerol, 2 mM Benzamidin, 2 mM Capronsäure, 0,5 mM Phenylmethylsulphonylfluorid, 1 g/l Polyvi- nylpolypyrrolidon) werden zu den homogenisierten Proben gegeben, gut gemischt und 30 Minuten bei 4°C im Dunkel unter fortlaufenden Schütteln inkubiert. Anschließend werden die Proben bei 14000 rpm und 4°C für 15 Minuten zentrifugiert (Eppendorf Zentrifuge). Der die löslichen Proteine enthaltende Überstand wird in ein neues Eppendorfgefäß überführt und kann direkt für die Bestimmung der G3PDH Aktivität eingesetzt oder bei -8O0C eingesetzt werden.
Von den Proteinextrakten werden 10 μl mit 90 μl Reaktionsansatz (4 mM Dihydroxyacetonphosphat; 0,2 mM NADH in 50 mM HEPES pH 7.4) pipettiert und für 30 Minuten bei 24 0C inkubiert. Danach erfolgt der Abbruch der Reaktion durch Erhitzen auf 95°C für 20 Minuten.
Von jeder Probe werden je 3 Replikate für die Bestimmung der G3PDH Aktivität eingesetzt wobei eine Probe direkt erhitzt wird und als Nullprobe dient. Die Menge des gebildeten Glycerol-3-phosphat (G3P) erfolgt anschließend nach der Methode von Gibon et al. 2002 (s. oben).
Die auf der Transkriptionsebene positiv-getesteten, transgenen Linien 6, 8 und 9 zeigten in den reifenden Samen (40 DAF) eine signifikante erhöhte Glycerol-3- phosphate-Dehydrogenase-Aktivität im Vergleich zum Wildtyp oder zur nicht- exprimierenden Kontroll-Linie 3. In den Linien 6, 8 und 9 konnte eine Aktivität von bis zu ca. 400 nmol G3P / g Frischmasse und Minute detektiert werden. Im Wildtyp und in der nicht exprimierenden Kontroll- Linie 3 lag die Aktivität dagegen lediglich bei ca. 250 nmol G3P / g Frischmasse und Minute. Dies zeigt, dass GPD1 sowohl auf RNA-Ebene als auch auf Enzymebene in den Linien 6, 8 und 9 samenspezifische exprimiert wird.
Äquivalente:
Der Fachmann erkennt oder kann viele Äquivalente der hier beschriebenen erfindungsgemäßen spezifischen Ausführungsformen feststellen, indem er lediglich Routineexperimente verwendet. Diese Äquivalente sollen von den Patentansprüchen umfasst sein.

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Erhöhung des Gesamtölgehalts in transgenen Ölpflanzen, dadurch gekennzeichnet, dass die transgenen Ölpflanzen mindestens 20 Gew-% Ölsäure bezogen auf den Gesamtfettsäuregehalt enthalten und das folgende Verfahrens- schritte umfassend
a) Einbringen einer Nukleinsäuresequenz, die für eine Glycerol-3-phosphat Dehydrogenase aus einer Hefe codiert, in die Ölpflanze, und
b) Expression der durch die Nukleinsäure codierten Glycerol-3-phosphat Dehydrogenase in der Ölpflanze, und
c) Auswahl der Ölpflanzen, bei denen der Gesamtölgehalt um mindestens
25 Gew-% in der Pflanze im Vergleich gegenüber der nicht transgen en Pflanze erhöht ist.
2. Verfahren zur Erhöhung des Gesamtölgehalts in transgenen Ölpflanzen, dadurch gekennzeichnet, dass die transgenen Ölpflanzen mindestens 20 Gew-% Ölsäure bezogen auf den Gesamtfettsäuregehalt enthalten und bei denen der Gesamtölgehalt um mindestens 45 Gew-% in der Pflanze im Vergleich gegenüber der nicht transgenen Pflanze erhöht ist.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäuresequenz, die für die Glycerol-3-phosphat Dehydrogenase codiert, aus einer Hefe stammt, die ausgewählt ist aus der Gruppe der Gattungen Cryptococcus,
Torulopsis, Pityrosporum, Brettanomyces, Candida, Kloeckera, Trigonopsis, Th- chosporon, Rhodotorul, Sporobolomyces, Bullera, Saccharomyces, Debaromy- ces, Lipomyces, Hansenula, Endomycopsis, Pichia und Hanseniaspora.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäuresequenz, die für die Glycerol-3-phosphat Dehydrogenase codiert, aus einer Hefe stammt, die ausgewählt ist aus der Gruppe der Gattungen und Arten Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, Hansenula polymorphe, Schi- zosaccharomyces pombe, Kluyveromyces lactis, Zygosaccharomyces rouxii, Y- arrowia lipolitica, Emericella nidulans, Debaryomyces hansenii und Torulaspora hansenii.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die durch die Nukleinsäuresequenz codierte Glycerol-3-phosphat Dehydrogenase die Umsetzung von Dihydroxyacetonphosphat zu Glycerin-3-phosphat unter Verwendung von NADH oder NA DPH als Cosubstrat bewirkt und eine Peptidse- quenz aufweist, die mindestens ein Sequenzmotiv umfasst ausgewählt aus der
Gruppe von Sequenzmotiven bestehend aus
i) GSGNWGT(A/T)IAK
ii) CG(V/A)LSGAN(L/I/V)AXE(V/I)A
iii) (L/V)FXRPYFXV
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die durch die Nukleinsäuresequenz codierte Glycerol-3-phosphat Dehydrogenase die Umsetzung von Dihydroxyacetonphosphat zu Glycerin-3-phosphat unter Verwendung von NADH oder NA DPH als Cosubstrat bewirkt und eine Peptidse- quenz aufweist, die mindestens ein Sequenzmotiv umfasst ausgewählt aus der Gruppe von Sequenzmotiven bestehend aus
iv) GSGNWGTTIAKV(V/I)AEN
v) NT(K/R)HQNVKYLP
vi) D(I/V)LVFN(I/V)PHQFL
vii) RA(I/V)SCLKGFE
viii) CGALSGAN LA(P/T)EVA
ix) LFHRPYFHV
x) GLGEII(K/R)FG
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, dass die durch die Nukleinsäuresequenz codierte Glycerol-3-phosphat Dehydrogena- se zusätzlich mindestens ein Sequenzmotiv umfasst ausgewählt aus der Gruppe von Sequenzmotiven bestehend aus
xi) H(E/Q)NVKYL xii) (0/N)(IZV)(LZI)V(FZW)(VZN)(LZIZV)PHQF(VZL/!)
xiii) (AZG)(IZV)SC(LZI)KG
xiv) G(LZM)(LZG)E(MZI)(IZQ)(RZKZN)F(GZSZA)
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die durch die Nukleinsäuresequenz codierte Glycerol-3-phosphat Dehydrogenase ausgewählt ist aus der Gruppe:
a) einer Nukleinsäuresequenz mit der in SEQ ID NO: 2, 4, 5, 7, 9, 11 , 12, 14, 16, 38 oder 40 gezeigten Sequenz, oder
b) einem funktionellen Äquivalent von a) das für Proteine mit einer Identität von mindestens 60% mit der in SEQ ID NO: 2 gezeigten Sequenz codiert.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass für die Expression der Nukleinsäuresequenz gemäß Anspruch 1 (a) und (b) diese funktionell mit einem Promotor oder Terminator verbunden ist.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass der Gesamtölgehalt im Samen der Ölpflanze erhöht wird.
11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass der Samen der Ölpflanze nach Anzucht geerntet wird und gegebenenfalls das im Samen enthaltene Öl isoliert wird.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Ölpflanze ausgewählt ist aus der Gruppe der Ölpflanzen bestehend aus
Anacardium occidentale, Arachis hypogaea, Borago officinalis, Brassica cam- pestris, Brassica napus, Brassica rapa, Brassica juncea, Camelina sativa, Cannabis sativa, Curthamus tinctorius, Cocos nucifera, Crambe abyssinica, Cuphea ciliata, Elaeis guineensis, Glycine max, Gossypium hirsitum, Gossypium barbadense, Gossypium herbaceum, Helianthus a nnus, Linum usitatissimum,
Oenothera biennis, Olea europaea, Ricinus communis, Zea mays, Juglans regia und Prunus dulcis.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass zusätzlich zur Erhöhung des Gesamtölgehalts auch der Gehalt an Glyceol-3- Phosphat um mindestens 20 Gew-% in der transgenen Ölpflanze erhöht wird.
14. Verfahren nach Anspruch 11 , dadurch gekennzeichnet, dass die im Öl enthalte- nen Fettsäuren freigesetzt werden.
15. Verfahren nach Anspruch 10 oder 11 , dadurch gekennzeichnet, dass das Öl oder die freigesetzten Fettsäuren Polymeren, Nahrungsmitteln, Futtermitteln, Kosmetika, Pharmazeutika oder Produkten mit industriellen Anwendungen zugesetzt werden oder als Schmierstoffe verwendet werden.
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