DE10212893A1

DE10212893A1 - Verfahren zum Erhöhen des Ölgehaltes in Pflanzen

Info

Publication number: DE10212893A1
Application number: DE2002112893
Authority: DE
Inventors: Joerg Bauer
Original assignee: BASF Plant Science GmbH
Current assignee: BASF Plant Science GmbH
Priority date: 2002-03-20
Filing date: 2002-03-20
Publication date: 2003-10-16
Also published as: WO2003077643A3; AU2003209737A1; WO2003077643A2; AU2003209737A8; DE10212893A9

Abstract

Die Erfindung betrifft Verfahren zum Erhöhen des Ölgehaltes in Pflanzen durch Verminderung eines oder mehrerer Speicherproteine. Die Erfindung betrifft ferner die Verwendung von Pflanzen mit einem verminderten Speicherproteingehalt zur Herstellung von Nahrungs-, Futtermitteln, Saatgut, Pharmazeutika oder Feinchemikalien, insbesondere zur Herstellung von Ölen.

Description

Die Erfindung betrifft Verfahren zum Erhöhen des Ölgehaltes in Pflanzen durch Verminderung eines oder mehrerer Speicherproteine. Die Erfindung betrifft ferner die Verwendung von Pflanzen mit einer verminderten Speicherproteingehalt zur Herstellung von Nahrungs-, Futtermitteln, Saatgut, Pharmazeutika oder Feinchemikalien, insbesondere zur Herstellung von Ölen.
Die Erhöhung des Ölgehalts in Pflanzen und insbesondere in Pflanzensamen ist für die klassische wie für die modernen Pflanzenzüchtung und insbesondere die pflanzliche Biotechnologie von großem Interessen. Bedingt durch den steigenden Verbrauch von Pflanzenölen für Ernährung bzw. industrielle Anwendungen sind Möglichkeiten zur Steigerung bzw. Modifikation von Pflanzenölen zunehmend Gegenstand aktueller Forschung (z. B. Töpfer et al. (1995) Science 268: 681-686). Ziel ist dabei insbesondere die Erhöhung des Gehaltes an Fettsäuren in Samenölen.
Auch die aus den pflanzlichen Ölen erhältlichen Fettsäuren sind von besonderem Interesse. Sie kommen beispielsweise als Grundstoffe für Weichmacher, Schmierstoffe, Tenside, Kosmetika usw. zum Einsatz oder werden in der Lebens- und Futtermittelindustrie als wertvoll Grundstoffe eingesetzt. So ist beispielsweise die Bereitstellung von Rapsölen mit Fettsäuren mittlerer Kettenlänge von besonderem Interesse, da diese besonderes in der Tensidherstellung begehrt sind.
Durch die gezielte Modulation pflanzlicher Stoffwechselwege mittels gentechnische Verfahren kann der pflanzlichen Metabolismus in einer Weise vorteilhaft verändert werden, die durch klassische Züchtungsmethoden nur über langwierige Schritte bzw. überhaupt nicht zu erreichen wären. So werden ungewöhnliche Fettsäuren, beispielsweise bestimmte polyungesättigte Fettsäuren, nur in bestimmten Pflanzen bzw. überhaupt nicht in Pflanzen synthetisiert und können deshalb nur nur durch Expression des entsprechenden Enzyms in transgenen Pflanzen hergestellt werden (z. B. Millar et al. (2000) Trends Plant Sci 5: 95-101).
Lipide werden aus Fettsäuren synthetisiert und ihre Synthese kann in zwei Teilmechanismen unterteilt werden, einen quasi "prokaryotischen" und einen quasi "eukaryotischen" (Browse et al. (1986) Biochemical J 235: 25-31; Ohlrogge & Browse (1995) Plant Cell 7: 957-970). Der prokaryotische Mechanismus ist in den Plastiden lokalisiert und umfasst die Biosynthese der freien Fettsäuren, die in das Cytosol exportiert werden, wo sie als Fettsäureacyl-CoA-Ester in den eukaryotischen Mechanismus eingehen und mit Glycerol-3-phosphat zu Phosphatidsäure (PA) verestert werden. PA ist der Ausgangspunkt für die Synthese von neutralen und polaren Lipiden. Die neutralen Lipide werden dabei über den Kennedy-Weg synthetisiert (Voelker (1996) Genetic Engineering ed.: Setlow 18: 111-113; Shankline & Cahoon (1998) Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 49: 611-649; Frentzen (1998) Lipids 100: 161-166).
Samen sind insbesondere darauf angewiesen Energie und Grundbausteine zu speichern, um z. B. eine spätere Keimung zu gewährleisten. Die Speicherung erfolgt in Form von Speicherlipiden, Speicherproteinen oder Stärke (Speicherkohlenhydrat). Je nach Pflanze variieren dabei die Verhältnisse der drei Speichermoleküle zueinander. So enthalten Rapssorten durchschnittlich etwa 48% Speicherlipide, 19% Stärke und 21% Speicherproteine, während Sojabohne 22% Lipide, 12% Stärke und 37% Proteine (jeweils bezogen auf die Trockenmasse) enthält (Biochemistry & Molecular Biology of the Plant ed. Buchanan, Gruissem, Jones 2000, American Society of Plant Physiologists). Die Speichermoleküle werden während der Embryoentwicklung des Samen akkumuliert.
Speicherproteine (infolge auch SP) im Embryo dienen zur Speicherung von Kohlenstoff, Stickstoff und Schwefel, die für das schnelle heterotrophe Wachstum bei Keimung von Samen oder Pollen benötigt werden. Sie haben meist keine enzymatische Aktivität. Diese Proteine werden dabei nur im Embryo während der Samenentwicklung synthetisiert. SP akkumulieren dabei zum einen in Proteinspeichervakuolen (PSV) von unterschiedlich differenzierten Zellen im Embryo bzw. Endosperm. Als weitere Form können sie auch als Proteinkörper assoziiert mit den endoplasmatischen Retikulum (ER) vorliegen (Herman & Larkins (1999) Plant Cell 11: 601-613). Dabei werden alle Speicherproteine ursprünglich am rauen ER synthetisiert (Bollini & Chrispeels (1979) Planta 146: 487-501). Sie können im ER verbleiben oder können über den Golgiapparat zu anderen Kompartimenten in der Zelle transportiert werden. Im ER erfolgt die Prozessierung und korrekte Faltung der Speicherproteine, sowie deren Oligomerisierung (Vitale & Denecke (1999) Plant Cell 11: 615-628). Speicherproteine in Samen wurden historisch gesehen auf Grund ihrer verschiedenen Löslichkeiten eingeordnet. Proteine wurden dabei sequentiell mit verschiedenen Lösungsmitteln aus den Samen extrahiert. Wasserlösliche Proteine wurden dabei als Albumine bezeichnet. Proteine, die in einer Salzlösung löslich sind, wurden als Globuline, und Proteine, die in einem Ethanol-Wasser- Gemisch löslich sind, wurden als Prolamine bezeichnet. Gluteline, die letzte Gruppe, können nur durch Behandlung mit verdünnten Säuren extrahiert werden (Biochemistry & Molecular Biology of the Plant ed. Buchanan, Gruissem, Jones 2000, American Society of Plant Physiologists). Prolamine kommen dabei spezifisch nur im Endosperm von Gräsern (Poaceae) vor, wo sie die Hauptspeicherproteine darstellen (Ausnahmen sind Reis und Hafer, wo Glutelin- ähnliche und Globuline überwiegen). In Dikotyledonen dominieren dagegen Globuline.
Insgesamt können vier große Genfamilien für Speicherproteine aufgrund ihrer Sequenzen zugeordnet werden: 2S-Albumine (Napin- ähnlich), 7S-Globuline (Phaseolin-ähnlich), 11S/12S-Globuline (Legumin-/Cruciferin-ähnlich) und die Zein-Prolamine.
2S Albumine sind weit verbreitet in Samen von Dikotyledonen, einschließlich wichtiger kommerzieller Pflanzenfamilien wie Fabaceae (z. B. Sojabohne), Brassicaceae (z. B. Raps), Euphorbiaceae (z. B. Rizinus) oder Asteraceae (z. B. Sonnenblume). 2S Albumine sind kompakte globuläre Proteine mit konservierten Cysteinresten, die oft Heterodimere bilden.
7S-Globuline liegen in trimerer Form vor und enthalten keine Cysteinreste. Nach ihrer Synthese werden sie wie die 2S-Albumine in kleinere Fragmente gespalten und glykosyliert. Trotz Unterschiede in der Polypeptidgröße sind die verschiedenen 7S-Globuline hoch konserviert und gehen vermutlich wie die 2S-Albumine auf einen gemeinsames Vorläuferprotein zurück. Die 7S-Globuline sind nur in geringen Mengen in Monokotyledonen vorhanden. In Dikotyledonen ist ihr Anteil immer kleiner verglichen mit den 11S/12S-Globulinen.
11S/12S-Globuline stellen neben den 2S-Albuminen die Hauptfraktion der Speicherproteine in Dikotyledonen. Die hohe Ähnlichkeit der verschiedenen 11S-Globuline aus verschiedenen Pflanzengattungen lassen wiederum auf einen gemeinsames Vorläuferprotein in der Evolution schließen.
Alle Speichermoleküle in Samen werden direkt oder indirekt aus Kohlenhydrat-Vorstufen gebildet. Dabei ist Saccharose die Primärquelle von Kohlenstoff und Energie welche von den Blättern in die sich entwickelnden Samen transportiert wird. So wird z. B. Saccharose zu Glucose-6-phosphat und Pyruvat umgesetzt, die in die Plastiden transportiert und dort zur Synthese von Acetyl-CoA dienen, welches das Ausgangsprodukt für die Synthese der Fettsäuren ist.
Wie in den einzelnen Pflanzen das Gleichgewicht zwischen den einzelnen Speichermolekülen reguliert wird, ist nicht im einzelnen bekannt. So führt die Reduktion der Lipidsynthese zur Erhöhung der Speicherproteine (O'Hara et al. (2000) Trans Biochem Soc 613-615).
EP-A 0 591 530 beschreibt die Verminderung der Expression eines Speicherproteins in Samen, insbesondere des Speicherproteins Glutelin in Reis, mit dem Ziel die Verwertbarkeit von Reis in Fermentationsprozessen zur Herstellung alkoholischer Getränke zu optimieren. In diesen Prozessen sind Proteine als solche hinderlich. Eine Auswirkung der Verminderung auf den Gehalt anderen pflanzlicher Inhaltstoffe ist nicht beschrieben.
WO 87/47731 beschreibt die Verminderung von einem oder mehreren Speicherproteinen im Samen von Sojabohnen durch Antisense- Technologie. Weiterhin beschrieben ist ein Verfahren, wobei neben dem Speicherprotein noch die Expression eines Gen der Fettsäurebiosynthese (mikrosomale Δ-12 Desaturase [Fad 2-1] Gene) vermindert wird. In Beispiel 2 (S. 25/Z. 4-9) geschieht dies durch Cosuppression. Es resultieren transgene Sojabohnenpflanzen mit verminderten Gehalt eines Speicherproteins und einem Gehalt an Ölsäure an der Gesamtmenge von Fettsäuren, das im Verhältnis zu anderen Fettsäuren relativ höher ist als in nicht transgenen Sojabohnenpflanzen. Die Veränderung im Fettsäureprofil ist auf die Suppression des Fad2-1 Gens und nicht des Speicherproteins zurückzuführen. Auch wird keine Veränderung im Gesamtgehalt der Fettsäuren beschrieben.
WO 97/35023 beschreibt Speicherproteine und Verfahren zur Erhöhung des Gehaltes bestimmter Aminosäuren in Pflanzen durch Expression besagter Speicherproteine. Eine Beschreibung der Auswirkung auf andere pflanzliche Metaboliten ist nicht offenbart. WO 97/41239 beschreibt ähnliche Verfahren bezogen auf schwefelreiche Speicherproteine.
WO 98/26064 beschreibt Verfahren zur Verminderung eines oder mehrerer Speicherproteine, bevorzugt in Mais. Beschrieben sind ferner Pflanzen mit einem erhöhten oder veränderten Gehalt an Aminosäuren oder Stärke. Eine Auswirkung auf den Ölgehalt ist nicht beschrieben.
WO 99/15004 beschreibt die Modifikation des Gehaltes von Metaboliten in den Speicherorganen von Pflanzen durch Expression von schwefelreichen Proteinen mit mehr als 10% schwefelhaltigen Aminosäuren, insbesondere dem Samenalbumin der Sonnenblume (SSA; sunflower seed albumin). Dabei bewirkt die Expression in Lupine eine Erhöhung des Ölgehaltes (Beispiel 1; S. 28/Z. 4-5, 17). Umgekehrt bewirkt die Expression des gleichen Gen in Erbse (Pisum sativum) eine Erniedrigung (Beispiels 2; S. 32/Z. 21).
EP-A 0 620 281 beschreibt eine Veränderung in der Lipidzusammensetzung (Fettsäuremuster) in Raps durch Verminderung der Expression eines Speicherproteins (Napin) mittels Antisense- Technologie. Beispiel 6 (S. 11/Z. 12-15) beschreibt, dass sich lediglich das Verhältnis der einzelnen Fettsäuren dahingehend veränderte, dass der Gehalt an Ölsäure sank und der Gehalt an Linol- und Linolensäure stieg. Es wird explizit daraufhin gewiesen, dass der Gesamtgehalt an Fettsäure unverändert blieb. Entsprechende Daten sind auch in der korrespondierenden Veröffentlichung der Erfinder offenbart (Kohno-Murase J et al. (1994) Plant Mol Biol 26(4): 1115-1124).
WO 01/81604 beschreibt transgene Pflanzen die eine zytosolische Acetyl-CoA-carboxylase (ACCase) exprimieren und einen gegenüber dem untransformierten Wildtyp erhöhten Ölgehalt aufweisen.
Es stellte sich daher die Aufgabe alternative Verfahren zur Erhöhung des Ölgehaltes in Pflanzen bereitzustellen.
Diese Aufgabe wird durch die vorliegende Erfindung gelöst. Ein erster Gegenstand der Erfindung umfasst ein Verfahren zum Erhöhen des Gesamtölgehalt in pflanzlichen Organismen, dadurch gekennzeichnet, dass nachfolgende Arbeitsschritte umfasst sind

a) Verminderung der Proteinmenge eines oder mehrerer Speicherproteine in einem pflanzlichen Organismus oder einem Gewebe, Organ, Teil oder Zelle des besagten pflanzlichen Organismus und
b) Auswahl von pflanzlichen Organismen, bei denen - im Unterschied oder Vergleich zur Ausgangsorganismus - der Gesamtölgehalt in dem besagten pflanzlichen Organismus oder einem Gewebe, Organ, Teil oder Zelle des besagten pflanzlichen Organismus erhöht ist.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann im Prinzip auf alle Pflanzenarten angewendet werden. Bevorzugt auf solche in denen natürlicherweise ein Speicherprotein exprimiert wird. Die zu den im Rahmen dieser Erfindung offenbarten Speicherproteinsequenzen homologen Sequenzen aus anderen Pflanzen können z. B. durch Datenbanksuche oder Durchmustern von Gen-Banken leicht aufgefunden werden.
"Pflanzlicher Organismus oder von diesem abgeleitete Zellen" meint allgemein jede Zelle, Gewebe, Teile oder Vermehrungsgut (wie Samen oder Früchte) eines Organismus, der zur Photosynthese befähigt ist. Eingeschlossen sind im Rahmen der Erfindung alle Gattungen und Arten höherer und niederer Pflanzen des Pflanzenreiches. Einjährige, mehrjährige, monocotyledone und dicotyledone Pflanzen sind bevorzugt. Eingeschlossen sind reife Pflanze, Saatgut, Sprosse und Keimlinge, sowie davon abgeleitete Teile, Vermehrungsgut (zum Beispiel Knollen, Samen oder Früchte) und Kulturen, zum Beispiel Zell- oder Kalluskulturen. Reife Pflanzen meint Pflanzen zu jedem beliebigen Entwicklungsstadium jenseits des Keimlings. Keimling meint eine junge, unreife Pflanze in einem frühen Entwicklungsstadium.
"Pflanze" im Rahmen der Erfindung meint alle Gattungen und Arten höherer und niederer Pflanzen des Pflanzenreiches. Eingeschlossen unter dem Begriff sind die reifen Pflanzen, Saatgut, Sprossen und Keimlinge, sowie davon abgeleitete Teile, Vermehrungsgut, Pflanzenorgane, Gewebe, Protoplasten, Kallus und andere Kulturen, zum Beispiel Zellkulturen, sowie alle anderen Arten von Gruppierungen von Pflanzenzellen zu funktionellen oder strukturellen Einheiten. Reife Pflanzen meint Pflanzen zu jedem beliebigen Entwicklungsstadium jenseits des Keimlings. Keimling meint eine junge, unreife Pflanze in einem frühen Entwicklungsstadium. "Pflanze" umfasst alle einjährigen und mehrjährige, monokotyledonen und dikotyledonen Pflanzen und schließt beispielhaft jedoch nicht einschränkend solche der Gattungen Cucurbita, Rosa, Vitis, Juglans, Fragaria, Lotus, Medicago, Onobrychis, Trifolium, Trigonella, Vigna, Citrus, Linum, Geranium, Manihot, Daucus, Arabidopsis, Brassica, Raphanus, Sinapis, Atropa, Capsicum, Datura, Hyoscyamus, Lycopersicon, Nicotiana, Solarium, Petunia, Digitalis, Majorana, Ciahorium, Helianthus, Lactuca, Bromus, Asparagus, Antirrhinum, Heterocallis, Nemesis, Pelargonium, Panieum, Pennisetum, Ranunculus, Senecio, Salpiglossis, Cucumis, Browaalia, Glycine, Pisum, Phaseolus, Lolium, Oryza, Zea, Avena, Hordeum, Secale, Triticum, Sorghum, Picea und Populus ein.
Bevorzugt sind Pflanzen nachfolgender Pflanzenfamilien: Amaranthaceae, Asteraceae, Brassicaceae, Carophyllaceae, Chenopodiaceae, Compositae, Cruciferae, Cucurbitaceae, Labiatae, Leguminosae, Papilionoideae, Liliaceae, Linaceae, Malvaceae, Rosaceae, Rubiaceae, Saxifragaceae, Scrophulariaceae, Solanacea, Sterculiaceae, Tetragoniacea, Theaceae, Umbelliferae.
Bevorzugte monokotyle Pflanzen sind insbesondere ausgewählt aus den monokotylen Kulturpflanzen, wie zum Beispiel der Familie der Gramineae wie Reis, Mais, Weizen oder andere Getreidearten wie Gerste, Hirse, Roggen, Triticale oder Hafer sowie dem Zuckerrohr sowie alle Arten von Gräsern.
Die Erfindung wird ganz besonders bevorzugt aus dikotyledone pflanzliche Organismen angewendet. Bevorzugte dikotyle Pflanzen sind insbesondere ausgewählt aus den dikotylen Kulturpflanzen, wie zum Beispiel

- Asteraceae wie Sonnenblume, Tagetes oder Calendula und andere mehr,
- Compositae, besonders die Gattung Lactuca, ganz besonders die Art sativa (Salat) und andere mehr,
- Cruciferae, besonders die Gattung Brassica, ganz besonders die Arten napus (Raps), campestris (Rübe), oleracea cv Tastie (Kohl), oleracea cv Snowball Y (Blumenkohl) und oleracea cv Emperor (Broccoli) und weitere Kohlarten; und der Gattung Arabidopsis, ganz besonders die Art thaliana sowie Kresse oder Canola und andere mehr,
- Cucurbitaceae wie Melone, Kürbis oder Zucchini und andere mehr,
- Leguminosae besonders die Gattung Glycine, ganz besonders die Art max (Sojabohne) Soja sowie Alfalfa, Erbse, Bohnengewächsen oder Erdnuss und andere mehr
- Rubiaceae, bevorzugt der Unterklasse Lamiidae wie beispielsweise Coffea arabica oder Coffea liberica (Kaffeestrauch) und andere mehr,
- Solanaceae besonders die Gattung Lycopersicon, ganz besonders die Art esculentum (Tomate) und die Gattung Solanum, ganz besonders die Art tuberosum (Kartoffel) und melongena (Aubergine) sowie Tabak oder Paprika und andere mehr,
- Sterculiaceae, bevorzugt der Unterklasse Dilleniidae wie beispielsweise Theobroma cacao (Kakaostrauch) und andere mehr,
- Theaceae, bevorzugt der Unterklasse Dilleniidae wie beispielsweise Camellia sinensis oder Thea sinensis (Teestrauch) und andere mehr,
- Umbelliferae, besonders die Gattung Daucus (ganz besonders die Art carota (Karrotte)) und Apium (ganz besonders die Art graveolens dulce (Selarie)) und andere mehr; und die Gattung Capsicum, ganz besonders die Art annum (Pfeffer) und andere mehr,

Umfasst sind ferner Schmuckpflanzen, Nutz- oder Zierbäume, Blumen, Schnittblumen, Sträucher oder Rasen. Beispielhaft aber nicht einschränkend seien zu nennen Angiospermen, Bryophyten wie zum Beispiel Hepaticae (Leberblümchen) und Musci (Moose); Pteridophyten wie Farne, Schachtelhalm und Lycopoden; Gymnospermen wie Koniferen, Cycaden, Ginkgo und Gnetalen, die Familien der Rosaceae wie Rose, Ericaceae wie Rhododendrons und Azaleen, Euphorbiaceae wie Weihnachtssterne und Kroton, Caryophyllaceae wie Nelken, Solanaceae wie Petunien, Gesneriaceae wie das Usambaraveilchen, Balsaminaceae wie das Springkraut, Orchidaceae wie Orchideen, Iridaceae wie Gladiolen, Iris, Freesie und Krokus, Compositae wie Ringelblume, Geraniaceae wie Geranien, Liliaceae wie der Drachenbaum, Moraceae wie Ficus, Araceae wie Philodendron und andere mehr.
Pflanzliche Organismen im Sinne der Erfindung sind weiterhin weitere photosynthetisch aktive befähigte Organismen, wie zum Beispiel Algen, Cyanobakterien sowie Moose. Bevorzugte Algen sind Grünalgen, wie beispielsweise Algen der Gattung Haematococcus, Phaedactylum tricornatum, Volvox oder Dunaliella. Insbesondere bevorzugt ist Synechocystis.
Am meisten bevorzugt sind Pflanzen, die zur Ölproduktion geeignet sind, wie beispielsweise Arabidopsis, Raps, Sonnenblume, Sesam, Färberdistel, Ölbaum, Soja, Mais, Weizen oder verschiedene Nussarten wie beispielsweise Walnuss Mandel. Unter diesen wieder besonders bevorzugt sind die dikotyledonen Pflanzen, insbesondere Raps, Soja und Sonnenblume.
"Öle" umfasst neutrale und/oder polare Lipiden und Mischungen derselben. Beispielhaft jedoch nicht einschränkend seien die in Tabelle 1 aufgeführten zu nennen. Tabelle 1 Pflanzliche Lipidklassen
Neutrale Lipide meint bevorzugt Triacylglyceride. Sowohl die neutralen als auch die polaren Lipide können ein breites Spektrum an verschiedenen Fettsäuren enthalten. Beispielhaft jedoch nicht einschränkend seien die in Tabelle 2 aufgeführten Fettsäuren zu nennen. Tabelle 2 Übersicht über verschiedene Fettsäuren (Auswahl)

¹ Kettenlänge: Anzahl der Doppelbindungen
* nicht natürlicherweise in Pflanzen vorkommend
Öle meint bevorzugt Samenöle.
"Ölgehalt" meint die Summe aller Öle nach obiger Definition, bevorzugt die Summe die Triacylglyceride.
"Erhöhung" des Ölgehaltes meint die Steigerung des Gehaltes an Ölen in einer Pflanze oder einem Teil, Gewebe oder Organ derselben, bevorzugt in den Samenorganen der Pflanze. Dabei ist der Ölgehalt im Vergleich zu einer nicht dem erfindungsgemäßen Verfahren unterworfenen, aber ansonsten unveränderten Ausgangspflanze unter ansonsten gleichen Rahmenbedingungen um mindestens 5%, bevorzugt mindestens 10%, besonders bevorzugt mindestens 15%, ganz besonders bevorzugt mindestens 20%, am meisten bevorzugt mindestens 25% erhöht. Rahmenbedingungen meint dabei alle für die Keimung, Kultivierung oder Wachstum der Pflanze relevanten Bedingungen wir Boden-, Klima- oder Lichtverhältnisse, Düngung, Bewässerung, Pflanzenschutzmaßnahmen usw.
"Speicherprotein" meint allgemein ein Protein, das mindestens eine der nachfolgenden wesentlichen Eigenschaften aufweist:

a) Speicherproteine werden im wesentlichen nur im Embryo während der Samenentwicklung exprimiert. "Im wesentlichen" bedeutet dabei, dass in dem besagten Stadium mindestens 50%, bevorzugt mindestens 70%, ganz besonders bevorzugt mindestens 90%, am meisten bevorzugt mindestens 95% der Gesamtexpression über die Lebensdauer einer Pflanze hinweg stattfindet.
b) Speicherproteine werden während der Keimung des Samen wieder abgebaut. Dabei beträgt der Abbau während der Keimung mindestens 20%, bevorzugt mindestens 50%, ganz besonders bevorzugt mindestens 80%.
c) Speicherproteine machen einen wesentlichen Anteil am Gesamtproteingehalt des nicht-keimenden Samens aus. Bevorzugt macht das Speicherprotein in dem nicht-keimenden Samen der Wildtyp- Pflanze mehr als 5 Gew.-% des Gesamtproteins aus, besonders bevorzugt mindestens 10 Gew.-%, ganz besonders bevorzugt mindestens 20 Gew.-%, am meisten bevorzugt mindestens 30 Gew.-%.

Bevorzugt weisen Speicherproteine 2 oder alle der oben genannten wesentlichen Eigenschaften a), b) oder c) auf.
Speicherproteine können in Untergruppen entsprechend weiterer charakteristischer Eigenschaften, wie beispielsweise ihrem Sedimentationskoeffizienten oder der Löslichkeit in verschiedenen Lösungen (Wasser, Salzlösung, Alkohol) aufgeteilt werden. Die Bestimmung des Sedimentationskoeffizienten kann in der dem Fachmann vertrauten Weise mittels Ultrazentrifugation durchgeführt werden (z. B. beschrieben bei Correia JJ (2000) Methods in Enzymology 321: 81-100).
Bevorzugt ist das Speicherprotein ausgewählt aus den Klassen der 2S-Albumine (Napin-ähnlich), 7S-Globuline (Phaseolin-ähnlich), 11S/12S-Globuline (Legumin-/Cruciferin-ähnlich) oder Zein-Prolamine.
Besonders bevorzugte 2S-Albumine umfassen

a) 2S-Albumine aus Arabidopsis, ganz besonders bevorzugt die 2S-Albumine mit der SEQ ID NO: 2, 4, 6 oder 8, am meisten bevorzugt die durch die Nukleinsäuren gemäß SEQ ID NO: 1, 3, 5 oder 7 kodierten Proteine,
b) 2S-Albumine aus Arten der Gattung Brassica, wie beispielsweise Brassica napus, Brassica nigra, Brassica juncea, Brassica oleracea oder Sinapis alba, ganz besonders bevorzugt die 2S-Albumine mit der SEQ ID NO: 32, 34, 36, 38, 40, 46 oder 48, am meisten bevorzugt die durch die Nukleinsäuren gemäß SEQ ID NO: 31, 33, 35, 37, 39, 45 oder 47 kodierten Proteine,
c) 2S-Albumine aus Soja, ganz besonders bevorzugt die 2S-Albumine mit der SEQ ID NO: 42 oder 44, am meisten bevorzugt die durch die Nukleinsäuren gemäß SEQ ID NO: 41 oder 43 kodierten Proteine,
d) 2S-Albumine aus Sonnenblume (Helianthus annus), ganz besonders bevorzugt die 2S-Albumine mit der SEQ ID NO: 50 oder 52, am meisten bevorzugt die durch die Nukleinsäuren gemäß SEQ ID NO: 49 oder 51 kodierten Proteine,

Funktionelle Äquivalente der 2S-Albumine haben in einer weiteren bevorzugten Ausführungsform eine Homologie von mindestens 60%, bevorzugt mindestens 80%, ganz besonders bevorzugt mindestens 90%, am meisten bevorzugt mindestens 95% zu einer der Proteinsequenzen mit der SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50 oder 52 wobei die Homologie sich bevorzugt über eine Länge von mindestens 30 Aminosäuren, bevorzugt mindestens 50 Aminosäuren besonders bevorzugt über 100 Aminosäuren, am meisten bevorzugt über die gesamte Länge der jeweiligen Proteine erstreckt, und weisen die gleichen wesentlichen Eigenschaften eines Speicherproteins und - bevorzugt - die charakteristischen Eigenschaften eines 2S-Speicherproteins auf.
Weiterhin bevorzugte funktionelle Äquivalente enthalten in den für sie kodierenden Nukleinsäuresequenzen mindestens eins, bevorzugt zwei, besonders bevorzugt 3, am meisten bevorzugt alle der Sequenzmotive ausgewählt aus jeweils einer bestimmten der nachfolgenden Gruppen I, II, III oder IV: Gruppe I

Gruppe II

Gruppe III

Gruppe IV
Besonders bevorzugt weisen die funktionelle Äquivalente in ihren Nukleinsäuresequenzen mindestens eines der nachfolgenden Sequenzmotive ausgewählt aus einer bestimmten der nachfolgenden Gruppen V, VI, VII oder VIII auf: Gruppe V

Gruppe VI

Gruppe VII

Gruppe VIII
Besonders bevorzugte 7S-Globuline umfassen solche aus Arabidopsis oder Soja, ganz besonders bevorzugt die Proteine mit der SEQ ID NO: 155 oder 157, am meisten bevorzugt die durch die Nukleinsäuren gemäß SEQ ID NO: 154 oder 156 kodierten Proteine. Funktionelle Äquivalente zeichnen sich bevorzugt neben den oben genannten wesentlichen Eigenschaften durch charakteristische Eigenschaften wie einen 7S-Sedimentationskoeffizienten und/oder durch eine Löslichkeit in Salzlösung aus. Als weitere charakteristische Eigenschaft können 7S-Globuline keine Cysteinreste enthalten.
Funktionelle Äquivalente der 7S-Globuline haben in einer weiteren bevorzugten Ausführungsform eine Homologie von mindestens 60%, bevorzugt mindestens 80%, ganz besonders bevorzugt mindestens 90%, am meisten bevorzugt mindestens 95% zu einer der Proteinsequenzen mit der SEQ ID No: 155 oder 157 wobei die Homologie sich bevorzugt über eine Länge von mindestens 30 Aminosäuren, bevorzugt mindestens 50 Aminosäuren besonders bevorzugt über 100 Aminosäuren, am meisten bevorzugt über die gesamte Länge der jeweiligen Proteine erstreckt, und weisen die gleichen wesentlichen Eigenschaften eines Speicherproteins und - bevorzugt - die charakteristischen Eigenschaften eines 75-Speicherproteins auf.
Besonders bevorzugte 11S/12S-Globuline umfassen bevorzugt 11S- Globuline aus Raps, Soja und Arabidopsis insbesondere

a) 11S-Globuline aus Raps mit der SEQ ID NO: 10, 12, 14, 16 oder 18, am meisten bevorzugt die durch die Nukleinsäuren gemäß SEQ ID NO: 9, 11, 13, 15 oder 17 kodierten Proteine,
b) die 11S-Globuline aus Soja mit der SEQ ID NO: 20, 22, 24, 26 oder 28, am meisten bevorzugt die durch die Nukleinsäuren gemäß SEQ ID NO: 19, 21, 23, 25 oder 27 kodierten Proteine,
c) die 11S-Globuline aus Arabidopsis thaliana mit der SEQ ID NO: 112, 114, 116, 118, 120 oder 122 am meisten bevorzugt die durch die Nukleinsäuren gemäß SEQ ID NO: 111, 113, 115, 117, 119 oder 121 kodierten Proteine,

Funktionelle Äquivalente der 11S- oder 12S Albumine haben in einer weiteren bevorzugten Ausführungsform eine Homologie von mindestens 60%, bevorzugt mindestens 80%, ganz besonders bevorzugt mindestens 90%, am meisten bevorzugt mindestens 95% zu einer der Proteinsequenzen mit der SEQ ID NO: 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 112, 114, 116, 118, 120 oder 122 wobei die Homologie sich bevorzugt über eine Länge von mindestens 30 Aminosäuren, bevorzugt mindestens 50 Aminosäuren besonders bevorzugt über 100 Aminosäuren, am meisten bevorzugt über die gesamte Länge der jeweiligen Proteine erstreckt, und weisen die gleichen wesentlichen Eigenschaften eines Speicherproteins und - bevorzugt - die charakteristischen Eigenschaften eines 11S- oder 12S-Speicherproteins auf.
Weiterhin bevorzugte funktionelle Äquivalente der Raps 11S/12S- Speicherproteine enthalten in den für sie kodierenden Nukleinsäuresequenzen mindestens eins, bevorzugt zwei, besonders bevorzugt 3 der Sequenzmotive ausgewählt aus der Gruppe IX oder ausgewählt aus der Gruppe X: Gruppe IX

Gruppe X
Besonders bevorzugt weisen die funktionelle Äquivalente der Raps 11S-Speicherproteine in ihren Nukleinsäuresequenzen ein Sequenzmotive mit der SEQ ID NO: 93 auf:
Weiterhin bevorzugte funktionelle Äquivalente der Soja 11S/12S- Speicherproteine enthalten in den für sie kodierenden Nukleinsäuresequenzen mindestens eins, bevorzugt zwei, besonders bevorzugt 3, am meisten bevorzugt 4, 5 oder 6 der Sequenzmotive ausgewählt aus der Gruppe XI oder ausgewählt aus der Gruppe XII: Gruppe XI

Gruppe XII
Weiterhin bevorzugte funktionelle Äquivalente der Arabidopsis thaliana 11S/12S-Speicherproteine enthalten in den für sie kodierenden Nukleinsäuresequenzen mindestens eins, bevorzugt zwei, besonders bevorzugt 3, am meisten bevorzugt 4, 5 oder 6 der Sequenzmotive ausgewählt aus der Gruppe XIII: Gruppe XIII
Besonders bevorzugt weisen die funktionelle Äquivalente der Arabidopsis 11S/12S-Speicherproteine in ihren Nukleinsäuresequenzen ein Sequenzmotive mit der SEQ ID NO: 129 auf:
Besonders bevorzugte Zein-Prolamine umfassen bevorzugt solche aus monokotyledonen Pflanzen, insbesondere Mais, Rais, Hafer, Gerste oder Weizen. Ganz besonders bevorzugt sind die Mais Zein-Prolamine beschrieben durch SEQ ID NO: 159, 161, 163 oder 165 - insbesondere die durch SEQ ID NO 158, 160, 162 oder 164 kodierten Protein -, das Reis Prolamin gemäß SEQ ID NO: 167 - insbesondere das durch SEQ ID NO 166 kodierte Protein -, das Hafer Prolamin gemäß SEQ ID NO: 169 - insbesondere das durch SEQ ID NO 168 kodierte Proteine -, das Gerste Prolamin gemäß SEQ ID NO: 171 und/oder 172 - insbesondere das durch SEQ ID NO: 170 kodierte Protein - und das das Weizen Prolamin gemäß SEQ ID NO: 174 - insbesondere das durch SEQ ID NO 173 kodierte Protein. Funktionelle Äquivalente zeichnen sich bevorzugt durch eine Löslichkeit in 70%iger ethanolischer Lösung und eine schlechte Löslichkeit in Wasser oder Salzlösung aus.
Funktionelle Äquivalente der Zein-Prolamine haben in einer weiteren bevorzugten Ausführungsform eine Homologie von mindestens 60%, bevorzugt mindestens 80%, ganz besonders bevorzugt mindestens 90%, am meisten bevorzugt mindestens 95% zu einer der Proteinsequenzen mit der SEQ ID NO: 159, 161, 163, 165, 167, 169, 171, 172 oder 174 wobei die Homologie sich bevorzugt über eine Länge von mindestens 30 Aminosäuren, bevorzugt mindestens 50 Aminosäuren besonders bevorzugt über 100 Aminosäuren, am meisten bevorzugt über die gesamte Länge der jeweiligen Proteine erstreckt, und weisen die gleichen wesentlichen Eigenschaften eines Speicherproteins und - bevorzugt - die charakteristischen Eigenschaften eines Zein-Prolamine auf.
Dabei haben die einzelnen Buchstaben in den genannten Sequenzen nachfolgende dem Fachmann vertraute Bedeutung:
Funktionelle Äquivalente meint insbesondere natürliche oder künstliche Mutationen der obengenannten Speicherproteine sowie homologe Polypeptide aus anderen Pflanzen, die die gleichen wesentlichen und - bevorzugt - charakteristischen Eigenschaften aufweisen. Bevorzugt sind homologe Polypeptide aus oben beschriebenen bevorzugten Pflanzen. Die zu den im Rahmen dieser Erfindung offenbarten Speicherproteinen homologen Sequenzen aus anderen Pflanzen - beispielsweise solchen deren genomische Sequenz ganz oder teilweise bekannt ist, wie beispielsweise aus Arabidopsis thaliana, Brassica napus, Nicotiana tabacum oder Solanum tuberosum - durch Homologievergleiche aus Datenbanken auffinden, können z. B. durch Datenbanksuche oder Durchmustern von Gen-Banken - unter Verwendung der beispielhaft aufgeführten Speicherprotein-Sequenzen als Suchsequenz bzw. Sonde - leicht aufgefunden werden.
Mutationen umfassen Substitutionen, Additionen, Deletionen, Inversion oder Insertionen eines oder mehrerer Aminosäurereste.
Unter Homologie zwischen zwei Nukleinsäuresequenzen wird die Identität der Nukleinsäuresequenz über die jeweils gesamte Sequenzlänge verstanden, die durch Vergleich mit Hilfe des Programmalgorithmus GAP (Wisconsin Package Version 10.0, University of Wisconsin, Genetics Computer Group (GCG), Madison, USA; Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3389ff) unter Einstellung folgender Parameter berechnet wird:
Beispielhaft wird unter einer Sequenz, die eine Homologie von mindestens 80% auf Nukleinsäurebasis mit der Sequenz SEQ ID NO: 1 aufweist, eine Sequenz verstanden, die bei einem Vergleich mit der Sequenz SEQ ID NO: 1 nach obigem Programmalgorithmus mit obigem Parametersatz eine Homologie von mindestens 80% aufweist.
Unter Homologie zwischen zwei Polypeptiden wird die Identität der Aminosäuresequenz über die jeweils gesamte Sequenzlänge verstanden, die durch Vergleich mit Hilfe des Programmalgorithmus GAP (Wisconsin Package Version 10.0, University of Wisconsin, Genetics Computer Group (GCG), Madison, USA) unter Einstellung folgender Parameter berechnet wird:
Beispielhaft wird unter einer Sequenz, die eine Homologie von mindestens 80% auf Proteinbasis mit der Sequenz SEQ ID NO: 2 aufweist, eine Sequenz verstanden, die bei einem Vergleich mit der Sequenz SEQ ID NO: 2 nach obigem Programmalgorithmus mit obigem Parametersatz eine Homologie von mindestens 80% aufweist.
Funktionelle Äquivalente umfasst auch solche Proteine, die durch Nukleinsäuresequenzen kodiert werden, die unter Standardbedingungen mit einer der durch SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 132, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170 oder 173 beschriebenen, für ein Speicherproteine kodierenden Nukleinsäuresequenz, der zu dieser komplementären Nukleinsäuresequenz oder Teilen der vorgenannten hybridisieren und die wesentlichen Eigenschaften eines Speicherproteins und - bevorzugt - weitere charakteristische Eigenschaften aufweisen.
"Standardhybridisierungsbedingungen" ist breit zu verstehen und meint stringente als auch weniger stringente Hybridisierungsbedingungen. Solche Hybridisierungsbedingungen sind unter anderem bei Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T et al., in Molecular Cloning (A Laboratory Manual), 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, Seiten 9.31-9.57) oder in Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley &Sons, N. Y. (1989), 6.3.1-6.3.6. beschrieben.
Beispielhaft können die Bedingungen während des Waschschrittes ausgewählt sein aus dem Bereich von Bedingungen begrenzt von solchen mit geringer Stringenz (mit ungefähr 2 × SSC bei 50°C) und solchen mit hoher Stringenz (mit ungefähr 0,2 × SSC bei 50°C bevorzugt bei 65°C) (20 × SSC: 0,3 M Natriumcitrat, 3 M NaCl, pH 7,0). Darüberhinaus kann die Temperatur während des Waschschrittes von niedrig stringenten Bedingungen bei Raumtemperatur, ungefähr 22°C, bis zu stärker stringenten Bedingungen bei ungefähr 65°C angehoben werden. Beide Parameter, Salzkonzentration und Temperatur, können gleichzeitig variiert werden, auch kann einer der beiden Parameter konstant gehalten und nur der andere variiert werden. Während der Hybridisierung können auch denaturierende Agenzien wie zum Beispiel Formamid oder SDS eingesetzt werden. In Gegenwart von 50% Formamid wird die Hybridisierung bevorzugt bei 42°C ausgeführt. Einige beispielhafte Bedingungen für Hybridisierung und Waschschritt sind infolge gegeben:

1. Hybridisierungbedingungen zum Beispiel aus nachfolgenden Bedingungen ausgewählt sein:
- a) 4 × SSC bei 65°C,
- b) 6 × SSC bei 45°C,
- c) 6 × SSC, 100 µg/ml denaturierter, fragmentierte Fischsperma-DNA bei 68°C,
- d) 50% Formamid, 4 × SSC bei 42°C,
- e) 2 × oder 4 × SSC bei 50°C (schwach stringente Bedingung),
- f) 30 bis 40% Formamid, 2 × oder 4 × SSC bei 42°C (schwach stringente Bedingung).
2. Waschschritte können zum Beispiel aus nachfolgenden Bedingungen ausgewählt sein:
- a) 0,015 M NaCl/0,0015 M Natriumcitrat/0,1% SDS bei 50°C.
- b) 0,1 × SSC bei 65°C.
- c) 0,1 × SSC, 0,5% SDS bei 68°C.
- d) 0,1 × SSC, 0,5% SDS, 50% Formamid bei 42°C.
- e) 0,2 × SSC, 0,1% SDS bei 42°C.
- f) 2 × SSC bei 65°C (schwach stringente Bedingung).

Die Verminderung der Expression eines Speicherproteins kann auf vielfältige Art und Weise realisiert werden.
"Proteinmenge" meinte die Menge eines Speicherprotein-Polypeptides in einem Organismus, einem Gewebe, einer Zelle oder einem Zellkompartiment. Bevorzugt meint Proteinmenge die Menge eines bestimmten Speicherproteins im Samen einer Pflanze.
"Verminderung" der Proteinmenge meint die mengenmäßige Verminderung der Menge eines Speicherproteins in einem Organismus, einem Gewebe, einer Zelle oder einem Zellkompartiment - beispielsweise durch eines der unten beschriebenen Verfahren - im Vergleich zu dem Wildtyp derselben Gattung und Art auf den dieses Verfahren nicht angewendet wurde, unter ansonst gleichen Rahmenbedingungen (wie beispielsweise Kulturbedingungen, Alter der Pflanzen etc.). Bevorzugt meint Verminderung die Verminderung der Proteinmenge im Samen einer Pflanze.
Der Verminderung beträgt dabei mindestens 10%, bevorzugt mindestens 10% oder mindestens 20%, besonders bevorzugt um mindestens 40% oder 60%, ganz besonders bevorzugt um mindestens 70% oder 80%, am meisten bevorzugt um mindestens 90% oder 95%. Verfahren zur Bestimmung der Proteinmenge sind dem Fachmann bekannt. Beispielhaft seien zu nennen: Das Mikro-Biuret Verfahren (Goa J (1953) Scand J Clin Lab Invest 5: 218-222), die Folin-Ciocalteu-Methode (Lowry OH et al. (1951) J Biol Chem 193: 265-275) oder die Messung der Adsorption von CBB G-250 (Bradford mm (1976) Analyt Biochem 72: 248-254). Bevorzugt erfolgt die Verminderung des oder der Speicherproteine und/oder die Erhöhung der Ölproduktion im Samen einer Pflanze.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird die Proteinmenge von mehr als einem Speicherprotein vermindert. Dabei können die verminderten Speicherproteine der gleichen oder unterschiedlichen Klassen, wie 2S-Albuminen, 7S-Globulinen, 11S/12S- Globulinen oder Zein-Prolaminen, angehören. Bevorzugt werden Speicherproteine aus mehr als einer dieser Klassen gleichzeitig in ihrer Proteinmenge vermindert. Die zu vermindernden Speicherproteine können stark homolog oder weniger stark homolog zu einander sein. Bevorzugt haben mindesten zwei der in ihrer Proteinmenge verminderten Speicherproteine eine Homologie geringer als 90%, bevorzugt geringer als 70%, besonders bevorzugt geringer als 60%, ganz besonders bevorzugt geringer als 50%.
"Verminderung" oder "vermindern" ist im Zusammenhang mit einem Speicherprotein (bzw. der Menge eines Speicherprotein oder der für dieses kodierende mRNA Menge) weit auszulegen und umfasst die teilweise oder im wesentlichen vollständige, auf unterschiedliche semasiologische Mechanismen beruhende Unterbindung oder Blockierung der Expression eines Speicherproteins in einer Pflanze oder einem davon abgeleiteten Teil, Gewebe, Organ, Zellen oder Samen.
Eine Verminderung im Sinne der Erfindung umfasst die mengenmäßige Verringerung eines Speicherproteins bis hin zu einem im wesentlichen vollständigen Fehlen des Speicherproteins (d. h. fehlende immunologische Nachweisbarkeit des Speicherproteins). Dabei wird die Expression eines bestimmten Speicherproteins in einer Zelle oder einem Organismus bevorzugt um mehr als 50%, besonders bevorzugt um mehr als 80%, ganz besonders bevorzugt um mehr als 90% vermindert.
Erfindungsgemäß sind verschiedene Strategien zur Verminderung der Expression eines Speicherproteins umfasst. Der Fachmann erkennt, dass eine Reihe verschiedener Methoden zur Verfügung stehen, um die Expression eines Speicherproteins in gewünschter Weise zu beeinflussen. Eine Verminderung der Speicherproteinmenge kann beispielsweise jedoch nicht einschränkend unter Verwendung nachfolgender Verfahren realisiert werden:

a) Einbringung einer doppelsträngigen RNA-Nukleinsäuresequenz (infolge "SP-dsRNA"), wobei die doppelsträngige RNA-Sequenz nachfolgende Elemente umfasst
- a) mindestens eine "sense"-Ribonukleotidsequenz, die im wesentlichen identisch ist zu mindestens einem Teil des "sense"-RNA-Transkriptes einer Speicherprotein-Nukleinsäuresequenz und
- b) "antisense"-Ribonukleotidsequenzen, die zu besagten "sense"-Ribonukleotidsequenzen unter i) im wesentlichen komplementären sind oder einer die SP-dsRNA Expression gewährleistenden Expressionskassette oder Expressionskassetten;
b) Einbringung einer Speicherprotein antisense-RNA-Nukleinsäuresequenzen oder einer deren Expression gewährleistenden Expressionskassette, wobei die Speicherprotein antisense- RNA-Nukleinsäuresequenz im wesentlichen komplementär ist zu mindestens einem Teil des "sense"-RNA-Transkriptes einer Speicherprotein-Nukleinsäuresequenz. Umfasst sind solche Verfahren bei denen die antisense-RNA-Nukleinsäuresequenz gegen ein Speicherprotein-Gen (also genomische DNA-Sequenzen) oder ein Speicherprotein-Gentranskript (also RNA-Sequenzen) gerichtet ist. Umfasst sind auch α-anomere Nukleinsäuresequenzen.
c) Einbringung einer Speicherprotein antisense-Nukleinsäuresequenzen kombiniert mit einem Ribozym oder einer deren Expression gewährleistenden Expressionskassette
d) Einbringung von Speicherprotein sense-Nukleinsäuresequenzen zur Induktion einer Kosuppression oder einer deren Expression gewährleistenden Expressionskassette und Verminderung der Expression über eine Cosuppression, wobei die Speicherprotein sense-RNA-Nukleinsäuresequenz im wesentlichen identisch ist zu mindestens einem Teil des "sense"-RNA-Transkriptes einer Speicherprotein-Nukleinsäuresequenz
e) Einbringung DNA-bindender Faktoren gegen Speicherprotein-Gene oder -RNAs oder einer deren Expression gewährleistenden Expressionskassette
f) Einbringung von den Speicherprotein RNA-Abbau bewirkende virale Nukleinsäuresequenzen und Expressionskonstrukten oder einer deren Expression gewährleistenden Expressionskassette
g) Einbringung von Konstrukten zur Induktion einer homologen Rekombination an endogenen Speicherprotein-Genen beispielsweise zur Erzeugung von Knockout-Mutanten.
h) Einführung von Mutationen in endogenen Speicherprotein-Gene zur Erzeugung eines Funktionsverlustes (z. B. Generierung von Stopp-Kodons, Verschiebungen im Leseraster etc.)

Dabei kann jedes einzelne dieser Verfahren eine Verminderung der Speicherprotein-Expression im Sinne der Erfindung bewirken. Auch eine kombinierte Anwendung ist denkbar. Weitere Methoden sind dem Fachmann bekannt und können die Behinderung oder Unterbindung der Prozessierung des Speicherproteins, des Transports des Speicherproteins oder dessen mRNA, Hemmung der Ribosomenanlagerung, Hemmung des RNA-Spleißens, Induktion eines Speicherprotein-RNA abbauenden Enzyms und/oder Hemmung der Translationselongation oder -termination umfassen.
Die einzelnen bevorzugten Verfahren seien infolge kurz beschrieben:

a) Einbringung einer doppelsträngigen Speicherprotein RNA- Nukleinsäuresequenz (SP-dSRNA)

Das Verfahren der Genregulation mittels doppelsträngiger RNA ("double-stranded RNA interference"; dSRNAi) ist vielfach in tierischen und pflanzlichen Organismen beschrieben (z. B. Matzke MA et al. (2000) Plant Mol Biol 43: 401-415; Fire A. et al (1998) Nature 391: 806-811; WO 99/32619; wo 99/53050; WO 00/68374; Wo 00/44914; wo 00/44895; WO 00/49035; WO 00/63364). Auf die in den angegebenen Zitaten beschriebenen Verfahren und Methoden wird ausdrücklich Bezug genommen. Eine effiziente Gensuppression kann auch bei transienter Expression oder nach transienter Transformation beispielsweise infolge einer biolistischen Transformation gezeigt werden (Schweizer P et al. (2000) Plant J 2000 24: 895-903). dsRNAi-Verfahren beruhen auf dem Phänomen, dass durch gleichzeitiges Einbringen von komplementären Strang- und Gegenstrang eines Gentranskriptes eine hocheffiziente Unterdrückung der Expression des entsprechenden Gens bewirkt wird bewirkt wird. Der bewirkte Phänotyp kommt dem einer entsprechenden knock-out Mutanten sehr ähnlich (Waterhouse PM et al. (1998) Proc Natl Acad Sci USA 95: 13959-64).
Das dsRNAi-Verfahren hat sich bei der Verminderung der Speicherprotein-Expression als besonders effizient und vorteilhaft erwiesen. Wie u. a. in WO 99/32619 beschrieben sind dsRNAi-Ansätze klassischen antisense-Ansätzen deutlich überlegen.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung bezieht sich daher auf doppelsträngige RNA-Moleküle (dSRNA-Moleküle), die bei Einführung in eine Pflanze (oder eine davon abgeleitete Zelle, Gewebe, Organ oder Samen) die Verminderung eines Speicherprotein bewirken.
Das doppelsträngiges RNA-Molekül zur Verminderung der Expression eines Speicherprotein Proteins ist dadurch gekennzeichnet, dass es enthält

a) mindestens eine "sense"-Ribonukleotidsequenz, die im wesentlichen identisch ist zu mindestens einem Teil des "sense"-RNA-Transkriptes einer Speicherprotein-Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 132, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170 oder 173 und
b) "antisense"-Ribonukleotidsequenzen, die zu den "sense"-Ribonukleotidsequenz unter a) im wesentlichen - bevorzugt vollständig - komplementären sind.

"Im wesentlichen identisch" meint, dass die dsRNA Sequenz auch Insertionen, Deletionen sowie einzelne Punktmutationen im Vergleich zu der Speicherprotein Zielsequenz aufweisen kann und dennoch eine effizient Verminderung der Expression bewirken. Bevorzugt beträgt die Homologie nach obiger Definition mindestens 65%, bevorzugt mindestens 75%, ganz besonders bevorzugt mindestens 90%, am meisten bevorzugt 95% zwischen der "sense"-Ribonukleotidsequenz einer dsRNA und mindestens einem Teil des "sense"-RNA-Transkriptes einer Speicherprotein-Nukleinsäuresequenz.
"Teil des "sense"-RNA-Transkriptes einer Speicherprotein- Nukleinsäuresequenz" meint Fragmente einer RNA oder mRNA transkribiert von einer für ein Speicherprotein kodierenden Nukleinsäuresequenz, bevorzugt von einem Speicherprotein-Gen. Dabei haben die Fragmente bevorzugt eine Sequenzlänge von mindestens 20 Basen, bevorzugt mindestens 50 Basen, besonders bevorzugt mindestens 100 Basen, ganz besonders bevorzugt mindestens 200 Basen, am meisten bevorzugt mindestens 500 Basen. Umfasst ist auch die vollständige transkribierte RNA oder mRNA.
"Im wesentlichen komplementär" meint, dass die "antisense"- Ribonukleotidsequenz auch Insertionen, Deletionen sowie einzelne Punktmutationen im Vergleich zu dem Komplement der "sense"-Ribonukleotidsequenz aufweisen kann. Bevorzugt beträgt die Homologie mindestens 80%, bevorzugt mindestens 90%, ganz besonders bevorzugt mindestens 95%, am meisten bevorzugt 100% zwischen der "antisense"-Ribonukleotidsequenz und dem Komplement der "sense"-Ribonukleotidsequenz.
Alternativ, kann eine "im wesentlichen identische" dsRNA auch als Nukleinsäuresequenz definiert werden, die befähigt ist, mit einem Teil eines Speicherprotein Gentranskriptes zu hybridisieren (z. B. in 400 mM NaCl, 40 mM PIPES pH 6,4, 1 mM EDTA bei 50°C oder 70°C für 12 bis 16 h).
Eine 100%ige Sequenzidentität zwischen dsRNA und dem Speicherprotein Gentranskript ist nicht zwingend erforderlich, um eine effiziente Verminderung der Speicherprotein Expression zu bewirken. Das Verfahren ist demnach tolerant gegenüber Sequenzabweichungen, wie sie infolge genetischer Mutationen, Polymorphismen oder evolutionärer Divergenzen vorliegen können. So ist es beispielsweise möglich mit einer einzigen dsRNA, die ausgehend von einer bestimmten Speicherprotein Sequenz eines Organismus generiert wurde, die Expression weiterer homologer Speicherproteine des gleichen Organismus oder aber auch die Expression von Speicherproteinen in anderen verwandten Arten zu unterdrücken. Zu diesem Zweck umfasst die dsRNA bevorzugt Sequenzbereich von Speicherprotein-Gentranskripten, die konservierten Bereichen der einzelnen Speicherproteinfamilien entsprechen. Besagte konservierte Bereiche können aus Sequenzvergleichen abgeleitet werden (vgl. Fig. 1a-7d). Bevorzugt enthält die dsRNA in ihrer "sense"-Ribonukleotidsequenz mindestens eines der Sequenzmotive ausgewählt aus einer der oben definierten Gruppen von Sequenzmotiven I, II, III, IV, V, VI, VII, VIII, IX, X, XI oder XII oder den Sequenzmotiven mit der SEQ ID NO: 93 oder 129.
Am meisten bevorzugt sind doppelsträngige RNA Moleküle beschrieben durch die Ribonukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 106, 108 oder 110.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform enthält die dsRNA mehrere Sequenzabschnitte, die eine gleichzeitige Suppression mehrerer Speicherproteine, bevorzugt von Speicherproteinen aus verschiedenen Klassen - wie beispielsweise einem 2S-Albumin, 7S-Globuline, 11S/12S-Globulin oder die Zein-Prolamine - bewirken. Dazu umfasst die dsRNA bevorzugt

a) mindestens zwei "sense"-Ribonukleotidsequenzen, wobei jede dieser "sense"-Ribonukleotidsequenzen im wesentlichen identisch ist zu mindestens einem Teil des "sense"-RNA-Transkriptes einer Speicherprotein-Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 132, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170 oder 173 und wobei zumindest zwei der Speicherprotein-Nukleinsäuresequenzen, zu deren "sense"-RNA-Transkript die besagte "sense"-Ribonukleotidsequenzen im wesentlichen identisch sind, untereinander eine Homologie von unter 90%, bevorzugt unter 80%, ganz besonders bevorzugt unter 60% am meisten bevorzugt unter 50% über die gesamte Länge ihrer kodierenden Nukleotidsequenz haben, und
b) "antisense"-Ribonukleotidsequenzen, die zu besagten "sense"-Ribonukleotidsequenzen unter a) im wesentlichen - bevorzugt vollständig - komplementären sind.

Wie oben beschrieben, können die "sense"-Ribonukleotidsequenzen und "antisense"-Ribonukleotidsequenzen als separate Moleküle oder - bevorzugt - als ein einzelnes, selbstkomplementäres RNA Molekül vorliegen, wobei im letzteren Fall die beiden Stränge bevorzugt über eine verbindende Sequenz ("Linker"), die ganz besonders bevorzugt ein Intron darstellt, miteinander verbunden sind.
Am meisten bevorzugt sind doppelsträngige RNA Moleküle beschrieben durch die Ribonukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 145 oder 147.
Natürlich können, um den gleichen Zweck zu erreichen, auch mehrere individuelle dsRNA Moleküle, die jeweils einen der oben definierten Ribonukleotidsequenzabschnitte umfassen, in die Zelle oder den Organismus eingebracht werden.
Die dsRNA kann aus einem oder mehr Strängen polymerisierter Ribonukleotide bestehen. Es können ferner Modifikationen sowohl des Zucker-Phosphat-Gerüstes als auch der Nukleoside vorliegen. Beispielsweise können die Phosphodiesterbindungen der natürlichen RNA dahingehend modifiziert sein, dass sie zumindest ein Stickstoff oder Schwefel-Heteroatom umfassen. Basen können dahingehend modifiziert werden, dass die Aktivität beispielsweise von Adenosindeaminase eingeschränkt wird. Solche und weitere Modifikationen sind weiter unten bei den Verfahren zur Stabilisierung von antisense-RNA beschrieben.
Die dsRNA kann enzymatisch oder ganz oder teilweise chemisch- synthetisch hergestellt werden.
Die doppelsträngige dsRNA Struktur kann ausgehend von zwei komplementären, separaten RNA-Strängen oder - bevorzugt - ausgehend von einem einzelnen, selbstkomplementären RNA- Strang gebildet werden.
Sollen die zwei separaten RNA-Stränge der dsRNA in einer Zelle oder Pflanze zusammengebracht werden, so kann dies auf verschiedene Art geschehen:

a) Transformation der Zelle oder Pflanze mit einem Vektor, der beide Expressionskassetten umfasst,
b) Kotransformation der Zelle oder Pflanze mit zwei Vektoren, wobei der eine die Expressionskassetten mit der "sense"-Ribonukleotidsequenz, der andere die Expressionskassetten mit der "antisense"-Ribonukleotidsequenzen umfasst,
c) Kreuzung von zwei Pflanzen, die mit jeweils einem Vektor transformiert wurden, wobei der eine die Expressionskassetten mit der "sense"-Ribonukleotidsequenz, der andere die Expressionskassetten mit der "antisense"-Ribonukleotidsequenz umfasst.

In der bevorzugten Ausführungsform wird die dSRNA-Struktur durch einem einzelnen, selbstkomplementären RNA-Strang gebildet. Hier können "sense"- und "antisense"-Ribonukleotidsequenzen durch eine verbindende Sequenz ("Linker") verknüpft sein und beispielsweise eine Haarnadelstruktur ausbilden. Bevorzugt ist die verbindende Sequenz ein Intron.
Die Nukleinsäuresequenz kodierend für eine dsRNA kann weitere Elemente beinhalten, wie beispielsweise Transkriptionsterminationssignale oder Polyadenylierungssignale.
Die Bildung der RNA Duplex kann entweder außerhalb der Zelle oder innerhalb derselben initiiert werden. Wie in WO 99/53050 kann die dsRNA auch eine Haarnadelstruktur umfassen, indem "sense"- und "antisense"-Strang durch einen "Linker" (beispielsweise ein Intron) verbunden werden. Die selbstkomplementären dSRNA-Strukturen sind bevorzugt, da sie lediglich die Expression eines Konstruktes erfordern und die komplementären Stränge stets in einem äquimolaren Verhältnis umfassen.
Die Expressionskassetten kodierend für den "antisense"- oder "sense"-Strang einer dsRNA oder für den selbstkomplementären-Strang der dSRNA, werden bevorzugt in einen Vektor insertiert und mit den unten beschriebenen Verfahren stabil (beispielsweise unter Verwendung von Selektionsmarkern) in das Genom einer Pflanze insertiert, um eine dauerhafte Expression der dsRNA zu gewährleisten.
Die dsRNA kann unter Verwendung einer Menge eingeführt werden, die zumindest ein Kopie pro Zelle ermöglicht. Höhere Mengen (z. B. mindestens 5, 10, 100, 500 oder 1000 Kopien pro Zelle) können ggf. eine effizienter Verminderung bewirken.
Die dsRNA kann entweder in vivo oder in vitro synthetisiert werden. Dazu kann eine DNA-Sequenz kodierend für eine dsRNA in eine Expressionskassette unter Kontrolle mindestens eines genetischen Kontrollelementes (wie beispielsweise Promotor, Enhancer, Silencer, Splice-Donor oder -Akzeptor, Polyadenylierungssignal) gebracht werden. Entsprechend vorteilhafte Konstruktionen sind weiter unten beschrieb. Eine Polyadenylierung ist nicht erforderlich, ebenso müssen keine Elemente zur Initiierung einer Translation vorhanden sein.
Eine dsRNA kann chemisch oder enzymatisch synthetisiert werden. Dazu können zellulare RNA Polymerasen oder Bakteriophagen RNA Polymerasen (wie z. B. T3-, T7- oder SP6 RNA- Polymerase) verwendet werden. Entsprechende Verfahren zu in vitro Expression von RNA sind beschrieben (WO 97/32016; US 5,593,874; US 5,698,425, US 5,712,135, US 5,789,214, US 5,804,693). Eine chemisch oder enzymatisch in vitro synthetisierte dsRNA kann vor der Einführung in eine Zelle, Gewebe oder Organismus aus dem Reaktionsgemisch beispielsweise durch Extraktion, Präzipitation, Elektrophorese, Chromatographie oder Kombinationen dieser Verfahren ganz oder teilweise aufgereinigt werden. Die dsRNA kann unmittelbar in die Zelle eingeführt werden oder aber auch extrazellulär (z. B. in den interstitialen Raum) appliziert werden.
Bevorzugt wird die Pflanze jedoch stabil mit einem Expressionskonstrukt, das die Expression der dsRNA realisiert, transformiert. Entsprechende Verfahren sind weiter unten beschrieben.

b) Einbringung einer Speicherprotein antisense-Nukleinsäuresequenz

Verfahren zur Suppression eines bestimmten Proteins durch Verhinderung der Akkumulation seiner mRNA durch die "antisense"-Technologie sind vielfach - auch in Pflanzen - beschrieben (Sheehy et al. (1988) Proc Natl Acad Sci USA 85: 8805-8809; US 4,801,340; Mol JN et al. (1990) FEBS Lett 268(2): 427-430). Das antisense Nukleinsäuremolekül hybridisiert bzw. bindet mit der zellulären mRNA und/oder genomischen DNA kodierend für das zu supprimierende Speicherprotein-Zielprotein. Dadurch wird die Transkription und/oder Translation des Zielproteins unterdrückt. Die Hybridisierung kann auf konventionelle Art über die Bildung einer stabilen Duplex oder - im Fall von genomischer DNA - durch Bindung des antisense Nukleinsäuremoleküls mit der Duplex der genomischen DNA durch spezifische Wechselwirkung in der großen Furche der DNA-Helix entstehen.
Eine antisense Nukleinsäuresequenz geeignet zur Verminderung eines Speicherproteins enthält einen "antisense"-RNA-Strang umfassend mindestens eine Ribonukleotidsequenz, die im wesentlichen komplementär ist zu mindestens einem Teil des "sense"-RNA-Transkriptes einer Speicherprotein-Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 132, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170 oder 173.
"Im wesentlichen komplementär" meint, dass die antisense-RNA Sequenz auch Insertionen, Deletionen sowie einzelne Punktmutationen im Vergleich zu dem Komplement der Speicherprotein Zielsequenz aufweisen kann. Bevorzugt beträgt die Homologie nach obiger Definition mindestens 75%, bevorzugt mindestens 85%, ganz besonders bevorzugt mindestens 95%, am meisten bevorzugt 98% zwischen dem "antisense"-RNA-Molekül und dem Komplement mindestens eines Teil des "sense"-RNA-Transkriptes einer Speicherprotein-Nukleinsäuresequenz. Das Komplement kann entsprechend den Basenpaarregeln von Watson und Crick in der dem Fachmann geläufigen Weise aus den entsprechenden Sequenzen abgeleitet werden.
"Teil des "sense"-RNA-Transkriptes einer Speicherprotein- Nukleinsäuresequenz" meint Fragmente einer RNA oder mRNA transkribiert von einer für ein Speicherprotein kodierenden Nukleinsäuresequenz, bevorzugt von einem Speicherprotein-Gen. Dabei haben die Fragmente bevorzugt eine Sequenzlänge von mindestens 20 Basen, bevorzugt mindestens 50 Basen, besonders bevorzugt mindestens 100 Basen, ganz besonders bevorzugt mindestens 200 Basen, am meisten bevorzugt mindestens 500 Basen. Umfasst ist auch die vollständige transkribierte RNA oder mRNA.
Die antisense Nukleinsäuresequenz kann zu der gesamten transkribierten mRNA des besagten Proteins komplementär sein, sich auf die kodierende Region beschränken oder nur aus einem Oligonukleotid bestehen, das zu einem Teil der kodierenden oder nicht-kodierenden Sequenz der mRNA komplementär ist. So kann das Oligonukleotid beispielsweise komplementär zu der Region sein, die den Translationsstart für das besagte Protein umfasst. Antisense-Nukleinsäuresequenzen können eine Länge von zum Beispiel 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 oder 50 Nukleotide haben, können aber auch länger sein und mindestens 100, 200, 500, 1000, 2000 oder 5000 Nukleotide umfassen. Antisense-Nukleinsäuresequenzen können rekombinant exprimiert oder chemisch bzw. enzymatisch unter Verwendung von dem Fachmann bekannten Verfahren synthetisiert werden. Bei der chemischen Synthese können natürlich oder modifizierte Nukleotide verwendet werden.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform kann die Expression eines Speicherproteins durch Nukleotidsequenzen inhibiert werden, die komplementär zu der regulatorischen Region eines Speicherprotein-Gens (z. B. einem Speicherprotein Promoter und/oder Enhancer) sind und triple-helikale Strukturen mit der dortigen DNA-Doppelhelix ausbilden, so dass die Transkription des Speicherprotein-Gens vermindert wird. Entsprechende Verfahren sind beschrieben (Helene C (1991) Anticancer Drug Res 6(6): 569-84; Helene C et al. (1992) Ann NY Acad Sci 660: 27-36; Maher LJ (1992) Bioassays 14(12): 807-815).
In einer weiteren Ausführungsform kann das antisense Nukleinsäuremolekül eine α-anomere Nukleinsäure sein. Derartige α-anomere Nukleinsäuremoleküle bilden spezifische doppelsträngige Hybride mit komplementärer RNA in denen - im Unterschied zu den konventionellen β-Nukleinsäuren - die beiden Stränge parallel zueinander verlaufen (Gautier C et al. (1987) Nucleic Acids Res 15: 6625-6641). Das antisense Nukleinsäuremolekül kann ferner auch 2'-O-Methylribonukleotide (Inoue et al. (1987) Nucleic Acids Res 15: 6131-6148) oder chimäre RNA-DNA Analoge beinhalten (Inoue et al. (1987) FEBS Lett 215: 327-330).

c) Einbringung einer Speicherprotein antisense-Nukleinsäuresequenz kombiniert mit einem Ribozym

Vorteilhaft kann die oben beschriebene antisense-Strategie mit einem Ribozym-Verfahren gekoppelt werden. Katalytische RNA-Moleküle oder Ribozyme können an jede beliebige Ziel-RNA angepasst werden und spalten das Phosphodiester-Gerüst an spezifischen Positionen, wodurch die Ziel-RNA funktionell deaktiviert wird (Tanner NK (1999) FEMS Microbiol Rev 23(3): 257-275). Das Ribozym wird dadurch nicht selber modifiziert, sondern ist in der Lage, weitere Ziel-RNA-Moleküle analog zu spalten, wodurch es die Eigenschaften eines Enzyms erhält. Der Einbau von Ribozymsequenzen in "antisense"-RNAs verleiht eben diesen "antisense"-RNAs diese enzymähnliche, RNA-spaltende Eigenschaft und steigert so deren Effizienz bei der Inaktivierung der Ziel-RNA. Die Herstellung und Verwendung entsprechender Ribozym-"antisense"-RNA-Moleküle ist beispielsweise beschrieben bei Haseloff et al. (1988) Nature 334: 585-591.
Auf diese Art können Ribozyme (z. B. "Hammerhead"-Ribozyme; Haselhoff und Gerlach (1988) Nature 334: 585-591) verwendet werden, um die mRNA eines zu supprimierenden Enzyms - z. B. Speicherprotein - katalytisch zu spalten und die Translation zu verhindern. Die Ribozym-Technologie kann die Effizienz einer antisense-Strategie erhöhen. Verfahren zur Expression von Ribozymen zur Verminderung bestimmter Proteine sind beschrieben in (EP 0 291 533, EP 0 321 201, EP 0 360 257). In pflanzlichen Zellen ist eine Ribozym-Expression ebenfalls beschrieben (Steinecke P et al. (1992) EMBO J 11(4): 1525-1530; de Feyter R et al. (1996) Mol Gen Genet. 250(3): 329-338). Geeignete Zielsequenzen und Ribozyme können zum Beispiel wie bei "Steinecke P, Ribozymes, Methods in Cell Biology 50, Galbraith et al. eds, Academic Press, Inc. (1995), S. 449-460" beschrieben, durch Sekundärstrukturberechnungen von Ribozym- und Ziel-RNA sowie durch deren Interaktion bestimmt werden (Bayley CC et al. (1992) Plant Mol Biol 18(2): 353-361; Lloyd AM and Davis RW et al. (1994) Mol Gen Genet 242(6): 653-657). Beispielsweise können Derivate der Tetrahymena L-19 IVS RNA konstruiert werden, die komplementäre Bereiche zu der mRNA des zu supprimierenden Speicherprotein Proteins aufweisen (siehe auch US 4,987,071 und US 5,116,742). Alternativ können solche Ribozyme auch über einen Selektionsprozess aus einer Bibliothek diverser Ribozyme identifiziert werden (Bartel D und Szostak JW (1993) Science 261: 1411-1418).

d) Einbringung einer Speicherprotein sense-Nukleinsäuresequenz zur Induktion eines Kosuppression

Die Expression einer Speicherprotein Nukleinsäuresequenz - oder eines teils derselben - in sense-Orientierung kann zu einer Kosuppression des entsprechenden homologen, endogenen Gens führen. Die Expression von sense-RNA mit Homologie zu einem endogenen Gen kann die Expression desselben vermindern oder ausschalten, ähnlich wie es für antisense Ansätze beschrieben wurde (Jorgensen et al. (1996) Plant Mol Biol 31(5): 957-973; Goring et al. (1991) Proc Natl Acad Sci USA 88: 1770-1774; Smith et al. (1990) Mol Gen Genet 224: 447-481; Napoli et al. (1990) Plant Cell 2: 279-289; Van der Krol et al. (1990) Plant Cell 2: 291-99). Dabei kann das eingeführte Konstrukt das zu vermindernde, homologe Gen ganz oder nur teilweise repräsentieren. Die Möglichkeit zur Translation ist nicht erforderlich. Die Anwendung dieser Technologie auf Pflanzen ist beispielsweise beschrieben bei Napoli et al. (1990) The Plant Cell 2: 279-289 und in US 5,034,323.
Eine "sense"-Nukleinsäuresequenz geeignet zur Verminderung eines Speicherproteins enthält einen "sense"-RNA-Strang umfassend mindestens eine Ribonukleotidsequenz, die im wesentlichen identisch ist zu mindestens einem Teil des "sense"-RNA-Transkript einer Speicherprotein-Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 132, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170 oder 173.
"Im wesentlichen identisch" meint, dass die sense-RNA Sequenz auch Insertionen, Deletionen sowie einzelne Punktmutationen im Vergleich zu dem Komplement der Speicherprotein Zielsequenz aufweisen kann. Bevorzugt beträgt die Homologie nach obiger Definition mindestens 65%, bevorzugt mindestens 75%, ganz besonders bevorzugt mindestens 90%, am meisten bevorzugt 95% zwischen dem "sense"-RNA-Molekül und dem "sense"-RNA-Transkript mindestens eines Teils einer Speicherprotein-Nukleinsäuresequenz.
"Teil des "sense"-RNA-Transkriptes einer Speicherprotein- Nukleinsäuresequenz" meint Fragmente einer RNA oder mRNA transkribiert von einer für ein Speicherprotein kodierenden Nukleinsäuresequenz, bevorzugt von einem Speicherprotein-Gen. Dabei haben die Fragmente bevorzugt eine Sequenzlänge von mindestens 20 Basen, bevorzugt mindestens 50 Basen, besonders bevorzugt mindestens 100 Basen, ganz besonders bevorzugt mindestens 200 Basen, am meisten bevorzugt mindestens 500 Basen. Umfasst ist auch die vollständige transkribierte RNA oder mRNA.

e) Einbringung DNA-bindende Faktoren gegen Speicherprotein Gene oder RNAs

Eine Verminderung einer Speicherprotein Genexpression ist auch mit spezifischen DNA-bindenden Faktoren z. B. mit Faktoren vom Typus der Zinkfingertranskriptionsfaktoren möglich. Diese Faktoren lagern sich an die genomische Sequenz des endogenen Zielgens, bevorzugt in den regulatorischen Bereichen, an und bewirken eine Repression des endogenen Gens. Die Verwendung eines solchen Verfahrens ermöglicht die Verminderung der Expression eines endogenen Speicherprotein Gens, ohne dass dessen Sequenz gentechnisch manipuliert werden muss. Entsprechende Verfahren zur Herstellung entsprechender Faktoren sind beschrieben (Dreier B et al. (2001) J Biol Chem 276(31): 29466-78; Dreier B et al. (2000) J Mol Biol 303(4): 489-502; Beerli RR et al. (2000) Proc Natl Acad Sci USA 97(4): 1495-1500; Beerli RR et al. (2000) J Biol Chem 275(42): 32617-32627; Segal DJ and Barbas CF 3rd. (2000) Curr Opin Chem Biol 4(1): 34-39; Kang JS and Kim JS (2000) J Biol Chem 275(12): 8742-8748; Beerli RR et al. (1998) Proc Natl Acad Sci USA 95(25): 14628-14633; Kim JS et al. (1997) Proc Natl Acad Sci USA 94(8): 3616-3620; Klug A (1999) J Mol Biol 293(2): 215-218; Tsai SY et al. (1998) Adv Drug Deliv Rev 30(1-3): 23-31; Mapp AK et al. (2000) Proc Natl Acad Sci USA 97(8): 3930-3935; Sharrocks AD et al. (1997) Int J Biochem Cell Biol 29(12): 1371-1387; Zhang L et al. (2000) J Biol Chem 275(43): 33850-33860).
Die Selektion dieser Faktoren kann unter Verwendung eines beliebigen Stückes eines Speicherprotein-Gens erfolgen. Bevorzugt liegt dieser Abschnitt in einem innerhalb der Speicherproteine konservierten Sequenzbereichen oder im Bereich der Promotorregion. Für eine Genunterdrückung kann er aber auch im Bereich der kodierenden Exons oder Introns liegen.
Die DNA-bindenden Faktoren können beispielsweise gegen Sequenzen gerichtet sein, die in verschiedenen Speicherprotein-Genen konserviert vorliegen. Bevorzugt enthält ist der DNA-bindende Faktor gegen ein Sequenzmotive ausgewählt aus einer der oben definierten Gruppen von Sequenzmotiven I, II, III, IV, V, VI, VII, VIII, IX, X, XI oder XII oder den Sequenzmotiven mit der SEQ ID NO: 93 oder 129 gerichtet. Ferner können aber auch Sequenzen im Promotorbereich genutzt werden, die bei vielen Speicherproteinen auftreten. Beispielhaft jedoch nicht einschränkend seinen nachfolgende Sequenzen zu nennen:
Weitere geeignete Abschnitte sind für den Fachmann mittels Datenbankabfrage aus der Genbank oder - ausgehend von einer Speicherprotein cDNA, deren Gen nicht in der Genbank vorhanden ist, durch Durchmusterung einer genomischen Bibliothek nach korrespondierenden genomischen Klonen erhältlich.
Die Genexpression kann auch durch maßgeschneiderte, niedermolekulare synthetische Verbindungen unterdrückt werden, beispielsweise vom Polyamid-Typ (Dervan PB und Bürli RW (1999) Current Opinion in Chemical Biology 3: 688-693; Gottesfeld JM et al. (2000) Gene Expr 9(1-2): 77-91). Diese Oligomere bestehen aus den Bausteinen 3-(Dimethylamino)propylamin, N-Methyl-3-hydroxypyrrol, N-Methylimidazol und N-Methylpyrrole und können an jedes Stück doppelsträngiger DNA so angepasst werden, dass sie sequenzspezifisch in die große Furche binden und die Expression der dortigen Gensequenzen blockieren. Entsprechende verfahren sind beschrieben (siehe unter anderem Bremer RE et al. (2001) Bioorg Med Chem. 9(8): 2093-103; Ansari AZ et al. (2001) Chem Biol. 8(6): 583-92; Gottesfeld JM et al. (2001) J Mol Biol 309(3): 615-29; Wurtz NR et al. (2001) Org Lett 3(8): 1201-3; Wang CC et al. (2001) Bioorg Med Chem 9(3): 653-7; Urbach AR und Dervan PB (2001) Proc Natl Acad Sci USA 98(8): 4343-8; Chiang SY et al. (2000) J Biol Chem 275(32): 24246-54).

g) Einbringung von den Speicherprotein RNA-Abbau bewirkende virale Nukleinsäuresequenzen und Expressionskonstrukten

Die Speicherprotein Expression kann effektiv auch durch Induktion des spezifischen Speicherprotein RNA-Abbaus durch die Pflanze mit Hilfe eines viralen Expressionssystems (Amplikon) (Angell SM et al. (1999) Plant J 20(3): 357-362) realisiert werden. Diese Systeme - auch als "VIGS" (viral induced gene silencing) bezeichnet - bringen Nukleinsäuresequenzen mit Homologie zu den zu supprimierenden Transkripten mittels viraler Vektoren in die Pflanze ein. Die Transkription wird sodann - vermutlich vermittelt durch pflanzliche Abwehrmechanismen gegen Viren - abgeschaltet. Vermutlich sind die zugrunde liegenden Mechanismen denen der durch doppelsträngige RNA bewirkten Effekten ähnlich. Entsprechende Techniken und Verfahren sind beschrieben (Ratcliff F et al. (2001) Plant J 25(2): 237-45; Fagard M und Vaucheret H (2000) Plant Mol Biol 43(2-3): 285-93; Anandalakshmi R et al. (1998) Proc Natl Acad Sci USA 95(22): 13079-84; Ruiz MT (1998) Plant Cell 10(6): 937-46). Für die Auswahl der entsprechenden Sequenzen gelten die gleichen Regeln wie für die Bestimmung des "sense"-Stranges bei doppelsträngiger RNA oder der Cosuppression (s. o.).
Entsprechend geeignete Systeme zur Suppression der Genexpression unter Verwendung viraler Expressionssysteme sind beispielsweise beschrieben in WO 99/15682 und WO 98/36083.

h) Einbringung von Konstrukten zur Induktion einer homologen Rekombination an endogenen Speicherprotein-Genen beispielsweise zur Erzeugung von Knockout-Mutanten

Zur Herstellung eines homolog rekombinanten Organismus mit verminderter Speicherprotein-Aktivität verwendet man beispielsweise ein Nukleinsäurekonstrukt, das zumindest einen Teil eines endogenen Speicherprotein Gens enthält, das durch eine Deletion, Addition oder Substitution mindestens eines Nukleotids so verändert wird, so dass die Funktionalität vermindert oder gänzlich aufgehoben wird. Die Veränderung kann auch die regulativen Elemente (z. B. den Promotor) des Gens betreffen, so dass die kodierende Sequenz unverändert bleibt, eine Expression (Transkription und/oder Translation) jedoch unterbleibt und vermindert wird.
Bei der konventionellen homologen Rekombination ist die veränderte Region an ihrem 5'- und 3'-Ende von weiteren Nukleinsäuresequenzen flankiert, die eine ausreichende Länge für die Ermöglichung der Rekombination aufweisen müssen. Die Länge liegt in der Regel in einem Bereich von mehreren einhundert Basen bis zu mehreren Kilobasen (Thomas KR und Capecchi MR (1987) Cell 51: 503; Strepp et al. (1998) Proc Natl Acad Sci USA 95(8): 4368-4373). Für die homologe Rekombination wird der Wirtsorganismus - zum Beispiel eine Pflanze - mit dem Rekombinationskonstrukt unter Verwendung der unten beschriebenen Verfahren transformiert und erfolgreich rekombinierte Klone unter Verwendung zum Beispiel einer Antibiotika- oder Herbizidresistenz selektioniert.
Homologe Rekombination ist ein relativ seltenes Ereignis in höheren Eukaryoten, vor allem in Pflanzen. Zufällige Integrationen in das Wirtsgenom überwiegen. Eine Möglichkeit die zufällig integrierten Sequenzen zu entfernen und so Zellklone mit einer korrekten homologen Rekombination anzureichern, besteht in der Verwendung eines sequenzspezifischen Rekombinationssystems wie in US 6,110,736 beschrieben, durch welche unspezifisch integrierte Sequenzen wieder deletiert werden können, was die Selektion erfolgreich über homologe Rekombination integrierter Ereignisse erleichtert. Eine Vielzahl von sequenzspezifischen Rekombinationssystemen kann verwendet werden, beispielhaft sind das Cre/lox-System des Bacteriophagen P1, das FLP/FRT System der Hefe, die Gin Rekombinase des Mu Phagen, die Pin Rekombinase aus E. coli und das R/RS System des pSR1 Plasmids genannt. Bevorzugt sind das Bacteriophagen P1 Cre/lox und das Hefe FLP/FRT System. Das FLP/FRT und cre/lox Rekombinasesystem wurde bereits in pflanzlichen Systemen angewendet (Odell et al. (1990) Mol Gen Genet 223: 369-378)

i) Einführung von Mutationen in endogenen Speicherprotein Gene zur Erzeugung eines Funktionsverlustes (z. B. Generierung von Stopp-Kodons, Verschiebungen im Leseraster etc.)

Weitere geeignete Methoden zur Verminderung der Speicherprotein-Aktivität sind die Einführung von Nonsense-Mutationen in endogene Speicherprotein Gene zum Beispiel mittels Einführung von RNA/DNA-Oligonukleotiden in die Pflanze (Zhu et al. (2000) Nat Biotechnol 18(5): 555-558) sowie die Generierung von Knockout-Mutanten mit Hilfe von z. B. T-DNA-Mutagenese (Koncz et al. (1992) Plant Mol Biol 20(5): 963-976), ENU-(N-Ethyl-N-nitrosoharnstoff)-Mutagenese oder homolger Rekombination (Hohn B und Puchta (1999) H Proc Natl Acad Sci USA 96: 8321-8323.). Punktmutationen können auch mittels DNA-RNA Hybriden erzeugt werden, die auch als "chimeraplasty" bekannt sind (Cole-Strauss et al. (1999) Nucl Acids Res 27(5): 1323-1330; Kmiec (1999) Gene therapy American Scientist 87(3): 240-247).
Die Methoden der dSRNAi, der Kosuppression mittels sense-RNA und der "VIGS" ("virus induced gene silencing") werden auch als "post-transcriptional gene silencing" (PTGS) bezeichnet. PTGS- Verfahren sind besonders vorteilhaft, weil die Anforderungen an die Homologie zwischen dem zu supprimierenden endogenem Gen und der transgen exprimierten sense- oder dsRNA-Nukleinsäuresequenz (bzw. zwischen dem endogenen Gen und seiner dominant-negativen Variante) geringer sind als beispielsweise bei einem klassischen antisense-Ansatz. Entsprechende Homologie-Kriterien sind bei der Beschreibung des dsRNAI-Verfahrens genannt und allgemein für PTGS-Verfahren oder dominant-negative Ansätze übertragbar. Aufgrund der hohen Homologie zwischen den pflanzlichen Speicherproteinen (s. Fig. 1a bis 7d) kann man voraussichtlich unter Verwendung einer bestimmten Speicherprotein-Nukleinsäuresequenzen auch die Expression von homologen Speicherproteinen in der gleichen oder anderen Arten effektiv supprimieren, ohne dass die Isolierung, Strukturaufklärung und Konstruktion entsprechender Suppressionskonstrukte für dort vorkommenden Speicherprotein- Homologen zwingend erforderlich wäre. Dies erleichtert erheblich den Arbeitsaufwand.
Alle Substanzen und Verbindungen die direkt oder indirekt eine Verminderung der Proteinmenge, RNA-Menge oder Genaktivität zumindest eines Speicherproteins bewirken, und so direkt oder indirekt eine Verminderung der Proteinmenge zumindest eines Speicherproteins bewirken, seien infolge unter der Bezeichnung "anti-SP"-Verbindungen zusammengefasst. Der Begriff "anti-SP"-Verbindung schließt explizit die in den oben beschriebenen Verfahren zum Einsatz kommenden Nukleinsäuresequenzen, Peptide, Proteine oder andere Faktoren ein.
"Einbringung" umfasst im Rahmen der Erfindung alle Verfahren, die dazu geeignet eine "anti-SP"-Verbindung, direkt oder indirekt, in eine Pflanze oder eine Zelle, Kompartiment, Gewebe, Organ oder Samen derselben einzuführen oder dort zu generieren. Direkte und indirekte Verfahren sind umfasst. Die Einbringung kann zu einer vorübergehenden (transienten) Präsenz einer "anti-SP"-Verbindung (beispielsweise einer dsRNA) führen oder aber auch zu einer dauerhaften (stabilen).
Gemäß der unterschiedlichen Natur der oben beschriebenen Ansätze kann die "anti-SP"-Verbindung ihre Funktion direkt ausüben (zum Beispiel durch Insertion in ein endogenes Speicherprotein Gen). Die Funktion kann aber auch indirekt nach Transkription in eine RNA (zum Beispiel bei antisense Ansätzen) oder nach Transkription und Translation in ein Protein (zum Beispiel bei Bindungsfaktoren) ausgeübt werden. Sowohl direkte als auch indirekt wirkende "anti-SP"-Verbindungen sind erfindungsgemäß umfasst.
Einführen umfasst beispielsweise Verfahren wie Transfektion, Transduktion oder Transformation.
"anti-SP" Verbindungen umfasst somit beispielsweise auch rekombinante Expressionskonstrukte, die eine Expression (d. h. Transkription und ggf. Translation) beispielsweise einer Speicherprotein dsRNA oder einer Speicherprotein "antisense"- RNA - bevorzugt in einer Pflanze oder einem Teil, Gewebe, Organ oder Samen derselben - bedingen.
In besagten Expressionskonstrukten steht ein Nukleinsäuremolekül, dessen Expression (Transkription und ggf. Translation) eine "anti-SP"-Verbindung generiert, bevorzugt in funktioneller Verknüpfung mit mindestens einem genetischen Kontrollelement (beispielsweise einem Promotor), das eine Expression in einem Organismus, bevorzugt in Pflanzen, gewährleistet. Soll das Expressionskonstrukt direkt in die Pflanze eingeführt und die "anti-SP"-Verbindung (beispielsweise die Speicherprotein dsRNA) dort in plantae erzeugt werden, so sind pflanzenspezifische genetische Kontrollelemente (beispielsweise Promotoren) bevorzugt. Die "anti-SP"-Verbindung kann jedoch auch in anderen Organismen oder in vitro erzeugt und dann in die Pflanze eingebracht werden. In diesem sind all prokaryotischen oder eukaryotischen genetischen Kontrollelemente (beispielsweise Promotoren) bevorzugt, die die Expression in den jeweils für die Herstellung gewählten Organismus erlauben.
Unter einer funktionellen Verknüpfung versteht man zum Beispiel die sequentielle Anordnung eines Promotors mit der zu exprimierenden Nukleinsäuresequenz (zum Beispiel einer "anti-SP"-Verbindung) und ggf. weiterer regulativer Elemente wie zum Beispiel einem Terminator derart, dass jedes der regulativen Elemente seine Funktion bei der transgenen Expression der Nukleinsäuresequenz, je nach Anordnung der Nukleinsäuresequenzen zu sense oder antisense RNA, erfüllen kann. Dazu ist nicht unbedingt eine direkte Verknüpfung im chemischen Sinne erforderlich. Genetische Kontrollsequenzen, wie zum Beispiel Enhancer-Sequenzen, können ihre Funktion auch von weiter entfernten Positionen oder gar von anderen DNA-Molekülen aus auf die Zielsequenz ausüben. Bevorzugt sind Anordnungen, in denen die transgen zu exprimierende Nukleinsäuresequenz hinter der als Promoter fungierenden Sequenz positioniert wird, so dass beide Sequenzen kovalent miteinander verbunden sind. Bevorzugt ist dabei der Abstand zwischen der Promotorsequenz und der transgen zu exprimierende Nukleinsäuresequenz geringer als 200 Basenpaare, besonders bevorzugt kleiner als 100 Basenpaare, ganz besonders bevorzugt kleiner als 50 Basenpaare.
Die Herstellung einer funktionellen Verknüpfung als auch die Herstellung einer Expressionskassette kann mittels gängiger Rekombinations- und Klonierungstechniken realisiert werden, wie sie beispielsweise in Maniatis T, Fritsch EF und Sambrook J (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor (NY), in Silhavy TJ, Berman ML und Enquist LW (1984) Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor (NY), in Ausubel FM et al. (1987) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience und bei Gelvin et al. (1990) In: Plant Molecular Biology Manual beschrieben sind. Zwischen beide Sequenzen können aber auch weitere Sequenzen positioniert werden, die zum Beispiel die Funktion eines Linkers mit bestimmten Restriktionsenzymschnittstellen oder eines Signalpeptides haben. Auch kann die Insertion von Sequenzen zur Expression von Fusionsproteinen führen. Bevorzugt kann die Expressionskassette, bestehend aus einer Verknüpfung von Promoter und zu exprimierender Nukleinsäuresequenz, integriert in einem Vektor vorliegen und durch zum Beispiel Transformation in ein pflanzliches Genom insertiert werden.
Unter einer Expressionskassette sind aber auch solche Konstruktionen zu verstehen, bei denen ein Promoter - zum Beispiel durch eine homologe Rekombination - hinter ein endogenes Speicherprotein-Gen platziert wird, und durch Expression einer antisense Speicherprotein-RNA die erfindungsgemäße Verminderung eines Speicherproteins bewirkt wird. Analog kann auch eine "anti-SP" Verbindung (zum Beispiel eine Nukleinsäuresequenz kodierend für eines Speicherprotein dsRNA oder eine Speicherprotein antisense RNA) derart hinter einen endogenen Promotor platziert werden, dass der gleiche Effekt auftritt. Beide Ansätze führen zu Expressionskassetten im Sinne der Erfindung.
Pflanzenspezifische Promotoren meint grundsätzlich jeden Promotor, der die Expression von Genen, insbesondere Fremdgenen, in Pflanzen oder Pflanzenteilen, -zellen, -geweben, -kulturen steuern kann. Dabei kann die Expression beispielsweise konstitutiv, induzierbar oder entwicklungsabhängig sein.
Bevorzugt sind:

a) Konstitutive Promotoren

"Konstitutive" Promotoren meint solche Promotoren, die eine Expression in zahlreichen, bevorzugt allen, Geweben über einen größeren Zeitraum der Pflanzenentwicklung, bevorzugt zu allen Zeitpunkten der Pflanzenentwicklung, gewährleisten (Benfey et al. (1989) EMBO J 8: 2195-2202). Vorzugsweise verwendet man insbesondere einen pflanzlichen Promotor oder einen Promotor, der einem Pflanzenvirus entstammt. Insbesondere bevorzugt ist der Promotor des 35S-Transkriptes des CaMV Blumenkohlmosaikvirus (Franck et al. (1980) Cell 21: 285-294; Odell et al. (1985) Nature 313: 810-812; Shewmaker et al. (1985) Virology 140: 281-288; Gardner et al. (1986) Plant Mol Biol 6: 221-228) oder der 19S CaMV Promotor (US 5,352,605; WO 84/02913; Benfey et al. (1989) EMBO J 8: 2195-2202). Ein weiterer geeigneter konstitutiver Promotor ist der "Rubisco small subunit (SSU)"-Promotor (US 4,962,028), der LeguminB-Promotor (GenBank Acc.-Nr. X03677), der Promotor der Nopalinsynthase aus Agrobacterium, der TR- Doppelpromotor, der OCS (Octopin Synthase) Promotor aus Agrobacterium, der Ubiquitin Promotor (Holtorf S et al. (1995) Plant Mol Biol 29: 637-649), den Ubiquitin 1 Promotor (Christensen et al. (1992) Plant Mol Biol 18: 675-689; Bruce et al. (1989) Proc Natl Acad Sci USA 86: 9692-9696), den Smas Promotor, den Cinnamylalkoholdehydrogenase-Promotor (US 5,683,439), die Promotoren der vakuolärer ATPase Untereinheiten oder der Promotor eines prolinreichen Proteins aus Weizen (WO 91/13991), sowie weitere Promotoren von Genen, deren konstitutive Expression in Pflanzen dem Fachmann bekannt ist.

b) Gewebespezifische Promotoren

Bevorzugt sind ferner Promotoren mit Spezifitäten für Samen, wie zum Beispiel der Promotor des Phaseolins (US 5,504,200; Bustos MM et al. (1989) Plant Cell 1(9): 839-53), des 2S Albumingens (Joseffson LG et al. (1987) J Biol Chem 262: 12196-12201), des Legumins (Shirsat A et al. (1989) Mol Gen Genet 215(2): 326-331), des USP (unknown seed protein; Bäumlein H et al. (1991) Mol Gen Genet 225(3): 459-67), des Napin Gens (US 5,608,152; Stalberg K et al. (1996) L Planta 199: 515-519), des Saccharosebindeproteins (WO 00/26388) oder der Legumin B4-Promotor (LeB4; Bäumlein H et al. (1991) Mol Gen Genet 225: 121-128; Baeumlein et al. (1992) Plant Journal 2(2): 233-9; Fiedler U et al. (1995) Biotechnology (NY) 13(10): 1090f), der Oleosin-Promoter aus Arabidopsis (WO 98/45461), der Bce4-Promoter aus Brassica (WO 91/13980). Weitere geeignete samenspezifische Promotoren sind die der Gene kodierend für das "High Molecular Weight Glutenin" (HMWG), Gliadin, Verzweigungsenzym, ADP Glucose Pyrophosphatase (AGPase) oder die Stärkesynthase. Bevorzugt sind ferner Promotoren, die eine samenspezifische Expression in Monokotyledonen wie Mais, Gerste, Weizen, Roggen, Reis etc. erlauben. Vorteilhaft eingesetzt werden können der Promoter des lpt2 oder lpt1-Gen (WO 95/15389, WO 95/23230) oder die Promotoren beschrieben in WO 99/16890 (Promotoren des Hordein-Gens, des Glutelin-Gens, des Oryzin-Gens, des Prolamin-Gens, des Gliadin-Gens, des Glutelin-Gens, des Zein-Gens, des Kasirin-Gens oder des Secalin-Gens).

c) Chemisch induzierbare Promotoren

Die Expressionskassetten können auch einen chemisch induzierbaren Promotor enthalten (Übersichtsartikel: Gatz et al. (1997) Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 48: 89-108), durch den die Expression des exogenen Gens in der Pflanze zu einem bestimmten Zeitpunkt gesteuert werden kann. Derartige Promotoren, wie z. B. der PRP1 Promotor (Ward et al. (1993) Plant Mol Biol 22: 361-366), durch Salicylsäure induzierbarer Promotor (WO 95/19443), ein durch Benzolsulfonamid-induzierbarer Promotor (EP 0 388 186), ein durch Tetrazyklin- induzierbarer Promotor (Gatz et al. (1992) Plant J 2: 397-404), ein durch Abscisinsäure induzierbarer Promotor (EP 0 335 528) bzw. ein durch Ethanol- oder Cyclohexanoninduzierbarer Promotor (WO 93/21334) können ebenfalls verwendet werden.
Besonders bevorzugt sind konstitutive sowie samenspezifische Promotoren.
Es können ferner weitere Promotoren funktionell mit der zu exprimierenden Nukleinsäuresequenz verknüpft sein, die eine Expression in weiteren Pflanzengeweben oder in anderen Organismen, wie zum Beispiel E. coli Bakterien ermöglichen. Als Pflanzen Promotoren kommen im Prinzip alle oben beschriebenen Promotoren in Frage.
Die in den erfindungsgemäßen Expressionskassetten oder Vektoren enthaltenen Nukleinsäuresequenzen können mit weiteren genetischen Kontrollsequenzen neben einem Promoter funktionell verknüpft sein. Der Begriff der genetischen Kontrollsequenzen ist breit zu verstehen und meint all solche Sequenzen, die einen Einfluss auf das Zustandekommen oder die Funktion der erfindungsgemäßen Expressionskassette haben. Genetische Kontrollsequenzen modifizieren zum Beispiel die Transkription und Translation in prokaryotischen oder eukaryotischen Organismen. Vorzugsweise umfassen die erfindungsgemäßen Expressionskassetten 5'-stromaufwärts von der jeweiligen transgen zu exprimierenden Nukleinsäuresequenz einen pflanzenspezifischen Promoter und 3'-stromabwärts eine Terminatorsequenz als zusätzliche genetische Kontrollsequenz, sowie gegebenenfalls weitere übliche regulative Elemente, und zwar jeweils funktionell verknüpft mit der transgen zu exprimierenden Nukleinsäuresequenz.
Genetische Kontrollsequenzen umfassen auch weitere Promotoren, Promotorelemente oder Minimalpromotoren, die die expressionsteuernden Eigenschaften modifizieren können. So kann durch genetische Kontrollsequenzen zum Beispiel die gewebespezifische Expression zusätzlich abhängig von bestimmten Stressfaktoren erfolgen. Entsprechende Elemente sind zum Beispiel für Wasserstress, Abscisinsäure (Lam E und Chua NH, J Biol Chem 1991; 266(26): 17131-17135) und Hitzestress (Schoffl F et al. (1989) Mol Gen Genetics 217(2-3): 246-53) beschrieben.
Weitere vorteilhafte Kontrollsequenzen sind beispielsweise in den gram-positiven Promotoren amy und SPO2, in den Hefe- oder Pilzpromotoren ADC1, MFa, AC, P-60, CYC1, GAPDH, TEF, rp28, ADH.
Prinzipiell können alle natürlichen Promotoren mit ihren Regulationssequenzen wie die oben genannten für das erfindungsgemäße Verfahren verwendet werden. Darüberhinaus können auch synthetische Promotoren vorteilhaft verwendet werden.
Genetische Kontrollsequenzen umfassen ferner auch die 5'-untranslatierte Regionen, Introns oder nichtkodierende 3'-Region von Genen wie beipielsweise das Actin-1 Intron, oder die Adh1-S Introns 1, 2 und 6 (allgemein: The Maize Handbook, Chapter 116, Freeling and Walbot, Eds., Springer, New York (1994)). Es ist gezeigt worden, dass diese eine signifikante Funktionen bei der Regulation der Genexpression spielen können. So wurde gezeigt, dass 5'-untranslatierte Sequenzen die transiente Expression heterologer Gene verstärken können. Beispielhaft für Translationsverstärker sei die 5'-Leadersequenz aus dem Tabak- Mosaik-Virus zu nennen (Gallie et al. (1987) Nucl Acids Res 15: 8693-8711) und dergleichen. Sie können ferner die Gewebsspezifität fördern (Rouster J et al. (1998) Plant J 15: 435-440).
Die Expressionskassette kann vorteilhafterweise eine oder mehrere sogenannte "enhancer Sequenzen" funktionell verknüpft mit dem Promoter enthalten, die eine erhöhte transgene Expression der Nukleinsäuresequenz ermöglichen. Auch am 3'-Ende der transgen zu exprimierenden Nukleinsäuresequenzen können zusätzliche vorteilhafte Sequenzen inseriert werden, wie weitere regulatorische Elemente oder Terminatoren. Die transgen zu exprimierenden Nukleinsäuresequenzen können in einer oder mehreren Kopien im Genkonstrukt enthalten sein.
Als Kontrollsequenzen geeignete Polyadenylierungssignale sind pflanzliche Polyadenylierungssignale, vorzugsweise solche, die im wesentlichen T-DNA Polyadenylierungssignale aus Agrobacterium tumefaciens, insbesondere des Gens 3 der T-DNA (Octopin Synthase) des Ti-Plasmids pTiACHS entsprechen (Gielen et al. (1984) EMBO J 3: 835 ff) oder funktionelle Äquivalente davon. Beispiele für besonders geeignete Terminatorsequenzen sind der OCS (Octopin- Synthase)-Terminator und der NOS (Nopalin-Synthase)-Terminator.
Als Kontrollsequenzen sind weiterhin solche zu verstehen, die eine homologe Rekombination bzw. Insertion in das Genom eines Wirtsorganismus ermöglichen oder die Entfernung aus dem Genom erlauben. Bei der homologen Rekombination kann zum Beispiel die kodierende Sequenz eines bestimmten endogenen Gens gegen die für eine dsRNA kodierende Sequenz gezielt ausgetauscht werden. Methoden wie die cre/lox-Technologie erlauben eine gewebespezifische, unter Umständen induzierbare Entfernung der Expressionskassette aus dem Genom des Wirtsorganismus (Sauer B (1998) Methods. 14(4): 381-92). Hier werden bestimmte flankierende Sequenzen dem Zielgen angefügt (lox-Sequenzen), die später eine Entfernung mittels der cre-Rekombinase ermöglichen.
Eine Expressionskassetten und die von ihr abgeleiteten Vektoren können weitere Funktionselemente enthalten. Der Begriff Funktionselement ist breit zu verstehen und meint all solche Elemente, die einen Einfluss auf Herstellung, Vermehrung oder Funktion der erfindungsgemäßen Expressionskassetten, Vektoren oder transgenen Organismen haben. Beispielhaft aber nicht einschränkend seien zu nennen:

a) Selektionsmarker, die eine Resistenz gegen einen Metabolismusinhibitor wie 2-Desoxyglucose-6-phosphat (WO 98/45456), Antibiotika oder Biozide, bevorzugt Herbizide, wie zum Beispiel Kanamycin, G 418, Bleomycin, Hygromycin, oder Phosphinotricin etc. verleihen. Besonders bevorzugte Selektionsmarker sind solche die eine Resistenz gegen Herbizide verleihen. Beispielhaft seien genannt: DNA Sequenzen, die für Phosphinothricinacetyltransferasen (PAT) kodieren und Glutaminsynthaseinhibitoren inaktivieren (bar und pat Gen), 5-Enolpyruvylshikimat-3-phosphatsynthasegene (EPSP Synthasegene), die eine Resistenz gegen Glyphosat® (N-(phosphonomethyl)glycin) verleihen, das für das Glyphosat® degradierende Enzyme kodierende gox Gen (Glyphosatoxidoreduktase), das deh Gen (kodierend für eine Dehalogenase, die Dalapon inaktiviert), Sulfonylurea- und Imidazolinon inaktivierende Acetolactatsynthasen sowie bxn Gene, die für Bromoxynil degradierende Nitrilaseenzyme kodieren, das aasa-Gen, das eine Resistenz gegen das Antibiotikum Apectinomycin verleih, das Streptomycinphosphotransferase (SPT) Gen, das eine Resistenz gegen Streptomycin gewährt, das Neomycinphosphotransferas (NPTII) Gen, das eine Resistenz gegen Kanamycin oder Geneticidin verleiht, das Hygromycinphosphotransferase (HPT) Gen, das eine Resistenz gegen Hygromycin vermittelt, das Acetolactatsynthas Gen (ALS), das eine Resistenz gegen Sulfonylharnstoff-Herbizide verleiht (z. B. mutierte ALS-Varianten mit z. B. der S4 und/oder Hra Mutation).
b) Reportergene, die für leicht quantifizierbare Proteine kodieren und über Eigenfarbe oder Enzymaktivität eine Bewertung der Transformationseffizienz oder des Expressionsortes oder -zeitpunktes gewährleisten. Ganz besonders bevorzugt sind dabei Reporter-Proteine (Schenborn E, Groskreutz D. Mol Biotechnol. 1999; 13(1): 29-44) wie das "green fluorescence protein" (GFP) (Sheen et al. (1995) Plant Journal 8(5): 777-784), die Chloramphenicoltransferase, eine Luziferase (Ow et al. (1986) Science 234: 856-859), das Aequorin-Gen (Prasher et al. (1985) Biochem Biophys Res Commun 126(3): 1259-1268), die β-Galactosidase, ganz besonders bevorzugt ist die β-Glucuronidase (Jefferson et al. (1987) EMBO J 6: 3901-3907).
c) Replikationsursprünge, die eine Vermehrung der erfindungsgemäßen Expressionskassetten oder Vektoren in zum Beispiel E. coli gewährleisten. Beispielhaft seien genannt ORI (origin of DNA replication), der pBR322 ori oder der P15A ori (Sambrook et al.: Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2^nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989).
d) Elemente, die für eine Agrobakterium vermittelte Pflanzentransformation erforderlich sind, wie zum Beispiel die rechte oder linke Begrenzung der T-DNA oder die vir-Region.

Zur Selektion erfolgreich homolog rekombinierter oder auch transformierter Zellen ist es in der Regel erforderlich, einen selektionierbaren Marker zusätzlich einzuführen, der den erfolgreich rekombinierten Zellen eine Resistenz gegen ein Biozid (zum Beispiel ein Herbizid), einen Metabolismusinhibitor wie 2-Desoxyglucose-6-phosphat (WO 98/45456) oder ein Antibiotikum verleiht. Der Selektionsmarker erlaubt die Selektion der transformierten Zellen von untransformierten (McCormick et al. (1986) Plant Cell Reports 5: 81-84).
Zusätzlich kann besagte transgene Expressionskassette oder Expressionsvektoren Nukleinsäuresequenzen enthalten, die nicht zu einer Verminderung mindestens eines Speicherproteins führen, und deren transgene Expression zu einer zusätzlichen Steigerung der Fettsäure-Biosynthese führt (infolge proOIL). Diese zusätzlich transgen exprimierte proOIL Nukleinsäuresequenz kann beispielhaft aber nicht einschränkend ausgewählt sein aus Nukleinsäuren kodierend für Acetyl-CoA-Carboxylase (ACCase), Glycerol- 3-Phosphat Acyltransferase (GPAT), Lysophosphatidat-Acyltransferase (LPAT), Diacylglycerol-Acyltransferase (DAGAT) und Phospholipid:diacylglycerol-acyltransferase (PDAT). Entsprechende Sequenzen sind dem Fachmann bekannt und aus Datenbanken oder entsprechenden cDNA-Banken der jeweiligen Pflanzen leicht zugänglich.
Die Einführung einer erfindungsgemäßen Expressionskassette in einen Organismus oder Zellen, Geweben, Organe, Teile bzw. Samen desselben (bevorzugt in Pflanzen bzw. pflanzliche Zellen, Gewebe, Organe, Teile oder Samen), kann vorteilhaft unter Verwendung von Vektoren realisiert werden, in denen die Expressionskassetten enthalten sind. Vektoren können beispielhaft Plasmide, Cosmide, Phagen, Viren oder auch Agrobacterien sein. Die Expressionskassette kann in den Vektor (bevorzugt ein Plasmidvektor) über eine geeignete Restriktionsschnittstelle eingeführt werden. Der entstandene Vektor wird zunächst in E. coli eingeführt. Korrekt transformierte E. coli werden selektioniert, gezüchtet und der rekombinante Vektor mit dem Fachmann geläufigen Methoden gewonnen. Restriktionsanalyse und Sequenzierung können dazu dienen, den Klonierungsschritt zu prüfen. Bevorzugt sind solche Vektoren, die eine stabile Integration der Expressionskassette in das Wirtsgenom ermöglichen.
Die Herstellung eines transformierten Organismus (bzw. einer transformierten Zelle oder Gewebes) erfordert, dass die entsprechende DNA (z. B. der Expressionsvektor), RNA oder Protein in die entsprechende Wirtszelle eingebracht wird. Für diesen Vorgang, der als Transformation (oder Transduktion bzw. Transfektion) bezeichnet wird, steht eine Vielzahl von Methoden zur Verfügung (Keown et al. (1990) Methods in Enzymology 185: 527-537). So kann die DNA oder RNA beispielhaft direkt durch Mikroinjektion oder durch Bombardierung mit DNA-beschichteten Mikropartikeln eingeführt werden. Auch kann die Zelle chemisch, zum Beispiel mit Polyethylenglycol, permeabilisiert werden, so dass die DNA durch Diffusion in die Zelle gelangen kann. Die DNA kann auch durch Protoplastenfusion mit anderen DNA-enthaltenden Einheiten wie Minicells, Zellen, Lysosomen oder Liposomen erfolgen. Elektroporation ist eine weitere geeignete Methode zur Einführung von DNA, bei der die Zellen reversibel durch einen elektrischen Impuls permeabilisert werden. Entsprechende Verfahren sind beschrieben (beispielsweise bei Bilang et al. (1991) Gene 100: 247-250; Scheid et al. (1991) Mol Gen Genet 228: 104-112; Guerche et al. (1987) Plant Science 52: 111-116; Neuhause et al. (1987) Theor Appl Genet 75: 30-36; Klein et al. (1987) Nature 327: 70-73; Howell et al. (1980) Science 208: 1265; Horsch et al. (1985) Science 227: 1229-1231; DeBlock et al. (1989) Plant Physiology 91: 694-701; Methods for Plant Molecular Biology (Weissbach and Weissbach, eds.) Academic Press Inc. (1988); and Methods in Plant Molecular Biology (Schuler and Zielinski, eds.) Academic Press Inc. (1989)).
Bei Pflanzen werden dabei die beschriebenen Methoden zur Transformation und Regeneration von Pflanzen aus Pflanzengeweben oder Pflanzenzellen zur transienten oder stabilen Transformation genutzt. Geeignete Methoden sind vor allem die Protoplastentransformation durch Polyethylenglykol-induzierte DNA-Aufnahme, das biolistische Verfahren mit der Genkanone, die sogenannte "particle bombardment" Methode, die Elektroporation, die Inkubation trockener Embryonen in DNA-haltiger Lösung und die Mikroinjektion.
Neben diesen "direkten" Transformationstechniken kann eine Transformation auch durch bakterielle Infektion mittels Agrobacterium tumefaciens oder Agrobacterium rhizogenes durchgeführt werden. Die Agrobacterium-vermittelte Transformation ist am besten für dicotyledone Pflanzenzellen geeignet. Die Verfahren sind beispielsweise beschrieben bei Horsch RB et al. (1985) Science 225: 1229 f).
Werden Agrobacterien verwendet, so ist die Expressionskassette in spezielle Plasmide zu integrieren, entweder in einen Zwischenvektor (englisch: shuttle or intermediate vector) oder einen binären Vektor. Wird ein Ti oder Ri Plasmid zur Transformation verwendet werden soll, ist zumindest die rechte Begrenzung, meistens jedoch die rechte und die linke Begrenzung der Ti oder Ri Plasmid T-DNA als flankierende Region mit der einzuführenden Expressionskassette verbunden.
Bevorzugt werden binäre Vektoren verwendet. Binäre Vektoren können sowohl in E. coli als auch in Agrobacterium replizieren. Sie enthalten in der Regel ein Selektionsmarkergen und einen Linker oder Polylinker flankiert von der rechten und linken T-DNA Begrenzungssequenz. Sie können direkt in Agrobacterium transformiert werden (Holsters et al. (1978) Mol Gen Genet 163: 181-187). Das Selektionsmarkergen erlaubt eine Selektion transformierter Agrobakteria und ist zum Beispiel das nptII Gen, das eine Resistenz gegen Kanamycin verleiht. Das in diesem Fall als Wirtsorganismus fungierende Agrobacterium sollte bereits ein Plasmid mit der vir-Region enthalten. Diese ist für die Übertragung der T-DNA auf die pflanzliche Zelle erforderlich. Ein so transformiertes Agrobacterium kann zur Transformation pflanzlicher Zellen verwendet werden. Die Verwendung von T-DNA zur Transformation pflanzlicher Zellen ist intensiv untersucht und beschrieben (EP 120 516; Hoekema, In: The Binary Plant Vector System, Offsetdrukkerij Kanters B. V., Alblasserdam, Chapter V; An et al. (1985) EMBO J 4: 277-287). Verschiedene binäre Vektoren sind bekannt und teilweise kommerziell erhältlich wie zum Beispiel pBI101.2 oder pBIN19 (Clontech Laboratories, Inc. USA).
Weitere zur Expression in Pflanzen geeignet Promotoren sind beschrieben (Rogers et al. (1987) Meth in Enzymol 153: 253-277; Schardl et al. (1987) Gene 61: 1-11; Berger et al. (1989) Proc Natl Acad Sci USA 86: 8402-8406).
Direkte Transformationstechniken eignen sich für jeden Organismus und Zelltyp. Im Falle von Injektion oder Elektroporation von DNA bzw. RNA in pflanzliche Zellen sind keine besonderen Anforderungen an das verwendete Plasmid gestellt. Einfache Plasmide wie die der pUC-Reihe können verwendet werden. Sollen vollständige Pflanzen aus den transformierten Zellen regeneriert werden, so ist er erforderlich, das sich auf dem Plasmid ein zusätzliches selektionierbares Markergen befindet.
Stabil transformierte Zellen d. h. solche, die die eingeführte DNA integriert in die DNA der Wirtszelle enthalten, können von untransformierten selektioniert werden, wenn ein selektionierbarer Marker Bestandteil der eingeführten DNA ist. Als Marker kann beispielhaft jedes Gen fungieren, dass eine Resistenz gegen Antibiotika oder Herbizide (wie Kanamycin, G 418, Bleomycin, Hygromycin oder Phosphinotricin etc.) zu verleihen vermag (s. o.). Transformierte Zellen, die ein solches Markergen exprimieren, sind in der Lage, in der Gegenwart von Konzentrationen eines entsprechenden Antibiotikums oder Herbizides zu überleben, die einen untransformierten Wildtyp abtöten. Beispiel sind oben genannt und umfassen bevorzugt das bar Gen, dass Resistenz gegen das Herbizid Phosphinotricin verleiht (Rathore KS et al. (1993) Plant Mol Biol 21(5): 871-884), das nptII Gen, dass Resistenz gegen Kanamycin verleiht, das hpt Gen, das Resistenz gegen Hygromycin verleiht, oder das EPSP-Gen, das Resistenz gegen das Herbizid Glyphosat verleiht. Der Selektionsmarker erlaubt die Selektion von transformierten Zellen von untransformierten (McCormick et al. (1986) Plant Cell Reports 5: 81-84). Die erhaltenen Pflanzen können in üblicher Weise gezüchtet und gekreuzt werden. Zwei oder mehr Generationen sollten kultiviert werden, um sicherzustellen, dass die genomische Integration stabil und vererblich ist.
Die oben genannten Verfahren sind beispielsweise beschrieben in Jenes B et al. (1993) Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, herausgegeben von SD Kung und R Wu, Academic Press, S. 128-143 sowie in Potrykus (1991) Annu Rev Plant Physiol Plant Molec Biol 42: 205-225). Vorzugsweise wird das zu exprimierende Konstrukt in einen Vektor kloniert, der geeignet ist, Agrobacterium tumefaciens zu transformieren, beispielsweise pBin19 (Bevan et al. (1984) Nucl Acids Res 12: 8711f).
Sobald eine transformierte Pflanzenzelle hergestellt wurde, kann eine vollständige Pflanze unter Verwendung von dem Fachmann bekannten Verfahren erhalten werden. Hierbei geht man beispielhaft von Kalluskulturen aus. Aus diesen noch undifferenzierten Zellmassen kann die Bildung von Spross und Wurzel in bekannter Weise induziert werden. Die erhaltenen Sprösslinge können ausgepflanzt und gezüchtet werden.
Dem Fachmann sind such Verfahren bekannt, um aus Pflanzenzellen, Pflanzenteile und ganze Pflanzen zu regenerieren. Beispielsweise werden hierzu Verfahren beschrieben von Fennell et al. (1992) Plant Cell Rep. 11: 567-570; Stoeger et al (1995) Plant Cell Rep. 14: 273-278; Jahne et al. (1994) Theor Appl Genet 89: 525-533 verwendet.
"Transgen" meint bezüglich zum Beispiel einer Nukleinsäuresequenz, einer Expressionskassette oder einem Vektor enthaltend besagte Nukleinsäuresequenz oder einem Organismus transformiert mit besagter Nukleinsäuresequenz, Expressionskassette oder Vektor alle solche durch gentechnische Methoden zustandegekommene Konstruktionen, in denen sich entweder

a) die Speicherprotein Nukleinsäuresequenz, oder
b) eine mit der Speicherprotein Nukleinsäuresequenz funktionell verknüpfte genetische Kontrollsequenz, zum Beispiel ein Promotor, oder
c) (a) und (b)

Als transgene Organismen bevorzugte Wirts- oder Ausgangsorganismen sind vor allem Pflanzen gemäß der oben genannten Definition. Eingeschlossen sind im Rahmen der Erfindung alle Gattungen und Arten höherer und niedrigerer Pflanzen des Pflanzenreiches, insbesondere Pflanzen, die für die Gewinnung von Ölen verwendet werden wie beispielsweise Raps, Sonnenblume, Sesam, Färberdistel, Ölbaum, Soja, Mais, Weizen und Nussarten. Eingeschlossen sind ferner die reifen Pflanzen, Saatgut, Sprossen und Keimlinge, sowie davon abgeleitete Teile, Vermehrungsgut und Kulturen, zum Beispiel Zellkulturen. Reife Pflanzen meint Pflanzen zu jedem beliebigen Entwicklungsstadium jenseits des Keimlings. Keimling meint eine junge, unreife Pflanze in einem frühen Entwicklungsstadium.
Die Herstellung der transgenen Organismen kann mit den oben beschriebenen Verfahren zur Transformation oder Transfektion von Organismen realisiert werden.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft die Verwendung der erfindungsgemäßen, transgenen Organismen und der von ihnen abgeleitete Zellen, Zellkulturen, Teile - wie zum Beispiel bei transgenen pflanzlichen Organismen Wurzeln, Blätter etc. -, und transgenes Vermehrungsgut wie Saaten oder Früchte, zur Herstellung von Nahrungs- oder Futtermitteln, Pharmazeutika oder Feinchemikalien, insbesondere von Ölen, Fetten, Fettsäuren oder Derivaten der vorgenannten.

Sequenzen

1. SEQ ID NO: 1
Nukleinsäuresequenz kodierend für A. thaliana Albumin 2S subunit 1 (GenBank Acc.-No.: M22032)
2. SEQ ID NO: 2
Proteinsequenz kodierend für A. thaliana Albumin 2S subunit 1
3. SEQ ID NO: 3
Nukleinsäuresequenz kodierend für A. thaliana Albumin 2S subunit 3 (GenBank Acc.-No.: M22035)
4. SEQ ID NO: 4
Proteinsequenz kodierend für A. thaliana Albumin 2S subunit 3
5. SEQ ID NO: 5
Nukleinsäuresequenz kodierend für A. thaliana Albumin 2S subunit 2 (GenBank Acc.-No.: M22034)
6. SEQ ID NO: 6
Proteinsequenz kodierend für A. thaliana Albumin 2S subunit 2
7. SEQ ID NO: 7
Nukleinsäuresequenz kodierend für A. thaliana Albumin 2S subunit 4 (GenBank Acc.-No.: M22033)
8. SEQ ID NO: 8
Proteinsequenz kodierend für A. thaliana Albumin 2S subunit 4
9. SEQ ID NO: 9
Nukleinsäuresequenz kodierend für B. napus Cruciferin Speicherprotein (GenBank Acc.-No.: X59294)
10. SEQ ID NO: 10
Proteinsequenz kodierend für B. napus Cruciferin Speicherprotein
11. SEQ ID NO: 11
Nukleinsäuresequenz kodierend für Brassica napus Cruciferin (GenBank Acc.-No.: X14555)
12. SEQ ID NO: 12
Proteinsequenz kodierend für Brassica napus Cruciferin
13. SEQ ID NO: 13
Nukleinsäuresequenz kodierend für B. napus BnC2 Cruciferin Speicherprotein (GenBank Acc.-No.: X59295)
14. SEQ ID NO: 14
Proteinsequenz kodierend für B. napus BnC2 Cruciferin Speicherprotein
15. SEQ ID NO: 15
partielle Nukleinsäuresequenz kodierend für B. napus Cruciferin cru4 subunit (GenBank Acc.-No.: X57848)
16. SEQ ID NO: 16
partielle Proteinsequenz kodierend für B. napus Cruciferin cru4 subunit
17. SEQ ID NO: 17
Nukleinsäuresequenz kodierend für B. napus cru1 Cruciferin subunit (GenBank Acc.-No.: X62120)
18. SEQ ID NO: 18
Proteinsequenz kodierend für B. napus cru1 Cruciferin subunit
19. SEQ ID NO: 19
Nukleinsäuresequenz kodierend für Glycinin A-1a-B-x subunit aus des Sojabohne (GenBank Acc.-No.: M36686)
20. SEQ ID NO: 20
Proteinsequenz kodierend für Glycinin A-1a-B-x subunit aus des Sojabohne
21. SEQ ID NO: 21
Nukleinsäuresequenz kodierend für Sojabohne Glycinin subunit G2 (GenBank Acc.-No.: X15122)
22. SEQ ID NO: 22
Proteinsequenz kodierend für Sojabohne Glycinin subunit G2
23. SEQ ID NO: 23
Nukleinsäuresequenz kodierend für Sojabohne A5A4B3 Glycinin subunits (GenBank Acc.-No.: X02626)
24. SEQ ID NO: 24
Proteinsequenz kodierend für Sojabohne A5A4B3 Glycinin subunits
25. SEQ ID NO: 25
Nukleinsäuresequenz kodierend für Sojabohne (G. max) Glycinin Speicherprotein subunit A3-B4 (GenBank Acc.-No.: M10962)
26. SEQ ID NO: 26
Proteinsequenz kodierend für Sojabohne (G. max) Glycinin Speicherprotein subunit A3-B4
27. SEQ ID NO: 27
Nukleinsäuresequenz kodierend für Sojabohne Glycinin subunit G3 (GenBank Acc.-No.: X15123)
28. SEQ ID NO: 28
Proteinsequenz kodierend für Sojabohne Glycinin subunit G3
29. SEQ ID NO: 29
Nukleinsäuresequenz kodierend für Sonnenblume 11S Speicherprotein (G3-D1) (GenBank Acc.-No.: M28832)
30. SEQ ID NO: 30
Proteinsequenz kodierend für Sonnenblume 11S Speicherprotein (G3-D1)
31. SEQ ID NO: 31
Nukleinsäuresequenz kodierend für Raps (B. napus) Napin (GenBank Acc.-No.: J02586)
32. SEQ ID NO: 32
Proteinsequenz kodierend für Raps (B. napus) Napin
33. SEQ ID NO: 33
Nukleinsäuresequenz kodierend für Brassica juncea 2S Speicherprotein (GenBank Acc.-No.: X65040)
34. SEQ ID NO: 34
Proteinsequenz kodierend für Brassica juncea 2S Speicherprotein
35. SEQ ID NO: 35
Nukleinsäuresequenz kodierend für Brassica oleracea 2S Speicherprotein (GenBank Acc.-No.: X65038)
36. SEQ ID NO: 36
Proteinsequenz kodierend für Brassica oleracea 2S Speicherprotein
37. SEQ ID NO: 37
Nukleinsäuresequenz kodierend für Brassica napus cv. Topas Napin (GenBank Acc.-No.: U04945)
38. SEQ ID NO: 38
Proteinsequenz kodierend für Brassica napus cv. Topas Napin
39. SEQ ID NO: 39
partielle Nukleinsäuresequenz kodierend für Sinapis alba sin1 Speicherprotein (GenBank Acc.-No.: X91799)
40. SEQ ID NO: 40
partielle Proteinsequenz kodierend für Sinapis alba sin1 Speicherprotein
41. SEQ ID NO: 41
Nukleinsäuresequenz kodierend für Sojabohne (Glycine max) napin-type 2S Albumin 1 (GenBank Acc.-No.: U71194)
42. SEQ ID NO: 42
Proteinsequenz kodierend für Sojabohne (Glycine max) napin- type 2S Albumin 1
43. SEQ ID NO: 43
Nukleinsäuresequenz kodierend für Sojabohne (Glycine max) 2S Albumin (GenBank Acc.-No.: AF005030)
44. SEQ ID NO: 44
Proteinsequenz kodierend für Sojabohne (Glycine max) 2S Albumin
45. SEQ ID NO: 45
Nukleinsäuresequenz kodierend für Brassica nigra 2S Speicherprotein (GenBank Acc.-No.: X65039)
46. SEQ ID NO: 46
Proteinsequenz kodierend für Brassica nigra 2S Speicherprotein
47. SEQ ID NO: 47
Nukleinsäuresequenz kodierend für Sinapis alba sin5 Speicherprotein (GenBank Acc.-No.: X91798)
48. SEQ ID NO: 48
Proteinsequenz kodierend für Sinapis alba sin5 Speicherprotein
49. SEQ ID NO: 49
Nukleinsäuresequenz kodierend für Sonnenblume HaG5 2S Albumin (GenBank Acc.-No.: X06410)
50. SEQ ID NO: 50
proteinsequenz kodierend für Sonnenblume HaG5 2S Albumin
51. SEQ ID NO: 51
partielle Nukleinsäuresequenz kodierend für Sonnenblume (Helianthus annuus) 2S Albumin (GenBank Acc.-No.: X76101)
52. SEQ ID NO: 52
partielle Proteinsequenz kodierend für Sonnenblume (Helianthus annuus) 2S Albumin
53. SEQ ID NO: 51-104 Sequenzmotive aus verschiedenen Speicherproteinklassen
54. SEQ ID NO: 105
Nukleinsäuresequenz kodierend für dsRNA zur Suppression von Arabidopsis thaliana 12S Speicherprotein AtCru3 (Insert von Vektor pCR2.1-AtCRU3-RNAi)
55. SEQ ID NO: 106
Ribonukleinsäuresequenz kodierend für dsRNA zur Suppression von Arabidopsis thaliana 12S Speicherprotein AtCru3
56. SEQ ID NO: 107
Nukleinsäuresequenz kodierend für dsRNA zur Suppression von Arabidopsis thaliana 12S Speicherprotein AtCra1
57. SEQ ID NO: 108
Ribonukleinsäuresequenz kodierend für dsRNA zur Suppression von Arabidopsis thaliana 12S Speicherprotein AtCra1
58. SEQ ID NO: 109
Nukleinsäuresequenz kodierend für dsRNA zur Suppression von Arabidopsis thaliana 2S Speicherprotein At2S2
59. SEQ ID NO: 110
Ribonukleinsäuresequenz kodierend für dsRNA zur Suppression von Arabidopsis thaliana 2S Speicherprotein At2S2
60. SEQ ID NO: 111
Nukleinsäuresequenz kodierend für Arabidopsis thaliana 12S Cruciferin Speicherprotein (ATCRU3; GenBank Acc.-No.: U66916)
61. SEQ ID NO: 112
Proteinsequenz kodierend für Arabidopsis thaliana 12S Cruciferin Speicherprotein (ATCRU3)
62. SEQ ID NO: 113
Nukleinsäuresequenz kodierend für A. thaliana 12S Speicherprotein (CRA1; GenBank Acc.-No.: M37247)
63. SEQ ID NO: 114
Proteinsequenz kodierend für A. thaliana 12S Speicherprotein (CRA1)
64. SEQ ID NO: 115
Nukleinsäuresequenz kodierend für Arabidopsis thaliana 12S Speicherprotein AT5g44120/MLN1_4 (GenBank Acc.-No.: AY070730)
65. SEQ ID NO: 116
Proteinsequenz kodierend für Arabidopsis thaliana 12S Speicherprotein AT5g44120/MLN1_4
66. SEQ ID NO: 117
Nukleinsäuresequenz kodierend für Arabidopsis 12S Speicherprotein (CRB; GenBank Acc.-No.: X14313; M37248)
67. SEQ ID NO: 118
Proteinsequenz kodierend für Arabidopsis 12S Speicherprotein (CRB)
68. SEQ ID NO: 119
Nukleinsäuresequenz kodierend für Arabidopsis thaliana putatives 12S Speicherprotein (aus GenBank Acc.-No.: AC003027)
69. SEQ ID NO: 120
Proteinsequenz kodierend für Arabidopsis thaliana putatives Speicherprotein (Protein_id = "AAD10679.1)
70. SEQ ID NO: 121
Nukleinsäuresequenz kodierend für Arabidopsis thaliana Cruciferin 12S Spwicherprotein (At1g03890) (GenBank Acc.-No.: AY065432)
71. SEQ ID NO: 122
Proteinsequenz kodierend für Arabidopsis thaliana Cruciferin 12S Speicherprotein (At1g03890)
72. SEQ ID NO: 123-131 Sequenzmotive aus Nukleinsäuresequenzen verschiedener Speicherproteinklassen
73. SEQ ID NO: 132
Nukleinsäuresequenz kodierend für Arabidopsis thaliana Prohibitin 1 (Atphb1) (GenBank Acc.-No.: U66594)
74. SEQ ID NO: 133
Proteinsequenz kodierend für Arabidopsis thaliana Prohibitin 1 (Atphb1)
75. SEQ ID NO: 134 Oligonukleotidprimer OPN1
76. SEQ ID NO: 135 Oligonukleotidprimer OPN2
77. SEQ ID NO: 136 Oligonukleotidprimer OPN3
78. SEQ ID NO: 137 Oligonukleotidprimer OPN4
79. SEQ ID NO: 138 Oligonukleotidprimer OPN5
80. SEQ ID NO: 139 Oligonukleotidprimer OPN6
81. SEQ ID NO: 140 Oligonukleotidprimer OPN7
82. SEQ ID NO: 141 Oligonukleotidprimer OPN8
83. SEQ ID NO: 142 Oligonukleotidprimer OPN9
84. SEQ ID NO: 143 Oligonukleotidprimer OPN10
85. SEQ ID NO: 144
Nukleinsäuresequenz kodierend für sRNAi4-dsRNA zur Suppression mehrerer Speicherproteine
86. SEQ ID NO: 145
Ribonukleinsäuresequenz kodierend für sRNAi4-dsRNA zur Suppression mehrerer Speicherproteine
87. SEQ ID NO: 146
Nukleinsäuresequenz kodierend für sRNAi8-dsRNA zur Suppression mehrerer Speicherproteine
88. SEQ ID NO: 147
Ribonukleinsäuresequenz kodierend für sRNAi8-dsRNA zur Suppression mehrerer Speicherproteine
89. SEQ ID NO: 148 Oligonukleotidprimer OPN11
90. SEQ ID NO: 149 Oligonukleotidprimer OP12
91. SEQ ID NO: 150 Oligonukleotidprimer OPN13
92. SEQ ID NO: 151 Oligonukleotidprimer OPN15
93. SEQ ID NO: 152 Oligonukleotidprimer OPN16
94. SEQ ID NO: 153 Oligonukleotidprimer OPN17
95. SEQ ID NO: 154
Nukleinsäuresequenz kodierend für Arabidopsis thaliana "globulin-like protein" (GenBank Acc.-No.: NM_119834)
96. SEQ ID NO: 155
Proteinsequenz kodierend für Arabidopsis thaliana "globulin- like protein" (Protein_id = "NP_195388.1)
97. SEQ ID NO: 156
Nukleinsäuresequenz kodierend für Glycine max 7S Samenglobulin (GenBank Acc.-No.: U59425)
98. SEQ ID NO: 157
Proteinsequenz kodierend für für Glycine max 7S Samenglobulin
99. SEQ ID NO: 158
Nukleinsäuresequenz kodierend für Zea mays 19 kD Zein (GenBank Acc.-No.: E01144)
100. SEQ ID NO: 159
Proteinsequenz kodierend für Zea mays 19 kD Zein
101. SEQ ID NO: 160
Nukleinsäuresequenz kodierend für Zea mays 19 kD alpha Zein B1 (GenBank Acc.-No.: AF371269)
102. SEQ ID NO: 161
Proteinsequenz kodierend für Zea mays 19 kD alpha Zein B1
103. SEQ ID NO: 162
Nukleinsäuresequenz kodierend für Zea mays 19 kD alpha Zein B2 (GenBank Acc.-No.: AF371270)
104. SEQ ID NO: 163
Proteinsequenz kodierend für Zea mays 19 kD alpha Zein B2
105. SEQ ID NO: 164
Nukleinsäuresequenz kodierend für Zea mays 22 kD alpha-zein (GenBank Acc.-No.: X61085)
106. SEQ ID NO: 165
Proteinsequenz kodierend für Zea mays 22 kD alpha-zein
107. SEQ ID NO: 166
Nukleinsäuresequenz kodierend für Oryza sativa Prolamin (GenBank Acc.-No.: AB016503)
108. SEQ ID NO: 167
Proteinsequenz kodierend für Oryza sativa Prolamin
109. SEQ ID NO: 168
Nukleinsäuresequenz kodierend für A. sativa Avenin (GenBank Acc.-No.: M38446)
110. SEQ ID NO: 169
Proteinsequenz kodierend für A. sativa Avenin
111. SEQ ID NO: 170
Nukleinsäuresequenz kodierend für Hordeum vulgare C-Hordein (GenBank Acc.-No.: M36941)
112. SEQ ID NO: 171
Proteinsequenz Teil 1 kodierend für Hordeum vulgare C-Hordein
113. SEQ ID NO: 172
Proteinsequenz Teil 2 kodierend für Hordeum vulgare C-Hordein
114. SEQ ID NO: 173
Nukleinsäuresequenz kodierend für Triticum aestivum LMW Glutenin-1D1 (GenBank Acc.-No.: X13306)
115. SEQ ID NO: 174
Proteinsequenz kodierend für Triticum aestivum LKW Glutenin-1D1
116. SEQ ID NO: 175
Expressionskassette für Arabidosis thaliana ACCase (GenBank Acc.-No.: D34630) als Fusionsprotein mit der plastidären Signalsequenz der Transketolase aus Tabak unter Kontrolle des Napin-Promotors
117. SEQ ID NO: 176
Proteinsequenz kodierend ein Fusionsprotein aus der Arabidosis thaliana ACCase (GenBank Acc.-No.: D34630) und der plastidären Signalsequenz der Transketolase aus Tabak
118. SEQ ID NO: 177
Nukleotidsequenz kodierend für Arabidosis thaliana ACCase (GenBank Acc.-No.: D34630) als Fusionsprotein mit der plastidären Signalsequenz der Transketolase aus Tabak unter Kontrolle des Napin-Promotors
119. SEQ ID NO: 178
Binärer Expressionsvektor für Agrobakterium vermittelte Pflanzentransformation pSUN2-USP1,2,3.
120. SEQ ID NO: 179 Binärer Expressionsvektor für Agrobakterium vermittelte Pflanzentransformation pSUN2-USP.

Abbildungen

1. Fig. 1a-b Alignment von Brassica 2S Albuminen
Angegeben sind die für die einzelnen Speicherproteinen kodierenden Nukleinsäuresequenzen mit ihren jeweiligen GenBank Acc.-No.:
J02586 Brassica napus 2S Albumin (SEQ ID NO: 31)
X65040 Brassica juncea 2S Albumin (SEQ ID NO: 33)
X65038 Brassica oleracea 2S Albumin (SEQ ID NO: 35)
U04945 Brassica napus cv. Topas 2S Albumin (SEQ ID NO: 37)
X91799 Sinapis alba 2S Albumin (SEQ ID NO: 39)
2. Fig. 2 Alignment von Soja (Glycine max) 2S Albuminen
Angegeben sind die für die einzelnen Speicherproteinen kodierenden Nukleinsäuresequenzen mit ihren jeweiligen GenBank Acc.-No.:
3. Fig. 3a-b Alignment von Brassica nigra, Sinapis alba und Helianthus annuus 2S Albuminen.
Angegeben sind die für die einzelnen Speicherproteinen kodierenden Nukleinsäuresequenzen mit ihren jeweiligen GenBank Acc.-No.:
4. Fig. 4a-b Alignment von Helianthus annuus 2S Albuminen.
Angegeben sind die für die einzelnen Speicherproteinen kodierenden Nukleinsäuresequenzen mit ihren jeweiligen GenBank Acc.-No.:
5. Fig. 5 Alignment von Arabidopsis thaliana 2S Albuminen.
Angegeben sind die für die einzelnen Speicherproteinen kodierenden Nukleinsäuresequenzen mit ihren jeweiligen GenBank Acc.-No.:
6. Fig. 6a-c DNA-Alignment von Brassica napus 11S Speicherproteinen
Angegeben sind die für die einzelnen Speicherproteinen kodierenden Nukleinsäuresequenzen mit ihren jeweiligen GenBank Acc.-No.:
7. Fig. 7a-d DNA-Alignment von Soja 11S Speicherproteinen Angegeben sind die für die einzelnen Speicherproteinen kodierenden Nukleinsäuresequenzen mit ihren jeweiligen GenBank Acc.-No.:
8. Fig. 8 Ergebnisse der Messung des Lipidgehalts (TAG) in T3 Samen transgener Arabidopsis Pflanzen, die mit dem Konstrukt Napin-TK-AtACCase transformiert wurden. Samen von jeweils 10 individuellen T2 Pflanzen pro unabhängiger transgener Linie wurden wie in Beispiel 9 beschrieben gemessen. Die Menge an TAG in Prozent entspricht dem Anteil an der Gesamtmasse des Trockengewichts der Samen. Wt bezeichnet die nicht-transformierte Kontrolle, 5L, 3L, 12L und 1L sind die unabhängigen transgenen Linien. Die Federbalken beschreiben den Standardfehler aus allen gemessenen Werten.
9. Fig. 9 Schematische Darstellung der Speicherprotein-Suppressionskonstrukte.

1. A: Insert (1155 bp) aus Vektor pCR2.1-AtCRU3-RNAi (5025 bp) kodierend für eine die AtCru3-Expression supprimierende dsRNA.
2. B: Insert aus Vektor pCR2.1-sRNAi4 (1) und pCR2.1-sRNAi8 (2) kodierend für eine die AtCru3-, AtCRB und At2S3-Expression supprimierende dsRNA. In den beiden Konstrukten sind die "sense"-RNA-Stränge und "antisense"-RNA-Stränge für die einzelnen zu supprimierenden Ziele unterschiedlich angeordnet. Schraffierte Bereiche stellen Intronsequenzen (Linker) dar.

Beispiele

Allgemeine Methoden

Alle Chemikalien, wenn nicht anders erwähnt, stammen von den Firmen Fluka (Buchs), Merck (Darmstadt), Roth (Karlsruhe), Serva (Heidelberg) und Sigma (Deisenhofen). Restriktionsenzyme, DNA- modifizierende Enzyme und Molekularbiologie-Kits wurden von den Firmen Amersham-Pharmacia (Freiburg), Biometra (Göttingen), Roche (Mannheim), New England Biolabs (Schwalbach), Novagen (Madison, Wisconsin, USA), Perkin-Elmer (Weiterstadt), Qiagen (Hilden), Stratagen (Amsterdam, Niederlande), Invitrogen (Karlsruhe) und Ambion (Cambridgeshire, United Kingdom). Die verwendeten Reagenzien wurden entsprechend der Angaben des Herstellers eingesetzt.
Die chemische Synthese von Oligonukleotiden kann beispielsweise, in bekannter Weise, nach der Phosphoamiditmethode (Voet, Voet, 2. Auflage, Wiley Press New York, Seite 896-897) erfolgen. Die im Rahmen der vorliegenden Erfindung durchgeführten Klonierungsschritte wie z. B. Restriktionsspaltungen, Agarosegelelektrophorese, Reinigung von DNA-Fragmenten, Transfer von Nukleinsäuren auf Nitrozellulose und Nylonmembranen, Verknüpfen von DNA-Fragmenten, Transformation von E. coli Zellen, Anzucht von Bakterien, Vermehrung von Phagen und Sequenzanalyse rekombinanter DNA werden wie bei Sambrook et al. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press; ISBN 0-87969-309-6 beschrieben durchgeführt. Die Sequenzierung rekombinanter DNA-Moleküle erfolgt mit einem Laserfluoreszenz-DNA-Sequenzierer der Firma ABI nach der Methode von Sanger (Sanger et al. (1977) Proc Natl Acad Sci USA 74: 5463-5467).

Beispiel 1

Allgemeine Verfahren

Die Pflanze Arabidopsis thaliana repräsentiert ein Mitglied der höheren Pflanzen (Samenpflanzen). Diese Pflanze ist eng verwandt mit anderen Pflanzenarten aus der Familie der Cruciferen wie z. B. Brassica napus, aber auch mit anderen Pflanzenfamilien der Dikotyledonen. Aufgrund des hohen Grades an Homologie ihrer DNA-Sequenzen bzw. Polypeptidsequenzen kann Arabidopsis thaliana als Modellpflanze für andere Pflanzenarten eingesetzt werden.

a) Anzucht von Arabidopsis Pflanzen

Die Pflanzen werden entweder auf Murashige-Skoog Medium mit, 5% Saccharose (Ogas et al. (1997) Science 277: 91-94) oder auf Erde gezogen (Focks & Benning (1998) Plant Physiol 118: 91-101). Um einheitliche Keimungs- und Blühzeiten zu erreichen, werden die Samen nach Ausplattieren bzw. Ausstreuen auf Erde zwei Tage bei 4°C stratifiziert. Nach der Blüte werden die Schoten markiert. Entsprechend der Markierungen werden dann Schoten mit einem Alter von 6 bis 20 Tagen nach der Blüte geerntet.

b) Isolierung von total RNA und poly-A⁺ RNA aus Pflanzen

Für die Herstellung von Suppressionskonstrukten wird RNA bzw. polyA⁺ RNA isoliert. RNA wurde aus Schoten von Arabidopsis Pflanzen nach folgender Vorschrift isoliert: Schotenmaterial im Alter von 6 bis 20 Tage nach Blühte wurde geerntet und in flüssigem Stickstoff schockgefroren. Das Material wurde vor der weiteren Verwendung bei -80°C gelagert. 75 mg des Materials wurde im gekühlten Mörser zu einem feinem Pulver gemahlen und mit 200 µL des Lysis-Puffers aus dem Ambion RNA- queos-Kit versetzt. Die Isolierung der totalen RNA wurde dann nach Herstellerangaben durchgeführt. Die RNA wurde mit 50 µL Elutionspuffer (Ambion) eluiert und die Konzentration durch Absorption einer 1 zu 100 verdünnten Lösung am Photometer (Eppendorf) bei 260 nm bestimmt. 40 µg/ml RNA entspricht dabei einer Absorption von 1. Die RNA-Lösungen wurden mit RNAse freiem Wasser auf eine Konzentration von 1 µg/µL eingestellt. Die Konzentrationen wurden durch Agarosegelelektrophorese überprüft. Zur Isolierung von polyA⁺ RNA wurde oligo(dT)- Zellulose von Amersham Pharmacia nach Herstellerangaben verwendet. RNA bzw. polyA⁺ RNA wurde bei -70°C gelagert.

c) Konstruktion der cDNA-Bank

Zur Konstruktion der cDNA-Bank aus Arabidopsis Schoten-RNA wurde die Erststrangsynthese unter Verwendung von Reverser Transkriptase aus Maus-Leukämie-Virus (Clontech) und Oligo- d(T)-Primern, die Zweitstrangsynthese durch Inkubation mit DNA-Polymerase I, Klenow-Enzym und RNAse H-Spaltung bei 12°C (2 Std.), 16°C (1 Std.) und 22°C (1 Std.) erzielt. Die Reaktion wurde durch Inkubation bei 65°C (10 min) gestoppt und anschließend auf Eis überführt. Doppelsträngige DNA-Moleküle wurde mit T4-DNA-Polymerase (Roche, Mannheim) bei 37°C (30 min) mit glatten Enden versehen. Die Nukleotide wurden durch Phenol/Chloroform-Extraktion und Sephadex-G50-Zentrifugiersäulen entfernt. EcoRI/XhoI-Adapter (Pharmacia, Freiburg, Deutschland) wurden mittels T4-DNA-Ligase (Roche, 12°C, über Nacht) an die cDNA-Enden ligiert, mit XhoI nachgeschnitten und durch Inkubation mit Polynukleotidkinase (Roche, 37°C, 30 min) phosphoryliert. Dieses Gemisch wurde der Trennung auf einem Low-Melting-Agarose-Gel unterworfen. DNA-Moleküle über 300 Basenpaaren wurden aus dem Gel eluiert, Phenol-extrahiert, auf Elutip-D-Säulen (Schleicher und Schüll, Dassel, Deutschland) konzentriert und an Vektorarme ligiert und in lambda-ZAPII-Phagen oder lambda-ZAP-Express-Phagen unter Verwendung des Gigapack Gold-Kits (Stratagene, Amsterdam, Niederlande) verpackt, wobei Material des Herstellers verwendet und seine Anweisungen befolgt wurden.

d) Isolierung von genomischer DNA aus Pflanzen wie Arabidopsis thaliana oder Brassica napus (CTAB-Methode)

Zur Isolierung genomischer DNA aus Pflanzen wie Arabidopsis thaliana oder Brassica napus werden ca. 0,25 g Blattmaterial junger Pflanzen im vegetativen Stadium in flüssigem Stickstoff zu feinem Pulver gemörsert. Das pulverisierte Pflanzenmaterial wird zusammen mit 1 ml 65°C-warmem CTAB I-Puffer (CTAB: Hexadecyltrimethylammoniumbromid, auch genannt Cetyltrimethylammoniumbromid; Sigma Kat.-Nr.: H6269) und 20 µl β-Mercaptoethanol in einen vorgewärmten zweiten Mörser gegeben und nach vollständiger Homogenisierung wird der Extrakt in ein 2 ml Eppendorf-Gefäß überführt und für 1 h bei 65°C unter regelmäßiger, vorsichtiger Durchmischung inkubiert. Nach Abkühlung auf Raumtemperatur wird der Ansatz mit 1 ml Chloroform/Octanol (24 : 1, mit 1 M Tris/HCl, pH 8,0 ausgeschüttelt) durch langsames Invertieren extrahiert und zur Phasentrennung für 5 min bei 8,500 rpm (7,500 × g) und Raumtemperatur zentrifugiert. Anschließend wird die wässrige Phase erneut mit 1 ml Chloroform/Octanol extrahiert, zentrifugiert und durch Invertieren mit 1/10 Volumen auf 65°C vorgewärmtem CTAB II-Puffer sorgfältig gemischt. Anschließend wird der Ansatz durch vorsichtiges Schwenken mit 1 ml Chloroform/Octanol-Gemisch (siehe oben) versetzt und zur erneuten Phasentrennung für 5 min bei 8,500 rpm (7,500 × g) und Raumtemperatur zentrifugiert. Die wässrige untere Phase wird in ein frisches Eppendorf-Gefäß überführt und die obere organische Phase wird in einem frischen Eppendorf-Gefäß erneut für 15 min bei 8,500 rpm (7,500 × g) und Raumtemperatur zentrifugiert. Die hieraus resultierende wässrige Phase wird mit der wässrigen Phase des vorherigen Zentrifugationsschrittes vereinigt und der gesamte Ansatz mit exakt demselben Volumen vorgewärmtem CTAB III-Puffer versetzt. Es folgt eine Inkubation bei 65°C, bis die DNA in Flocken ausfällt. Dies kann bis zu 1 h dauern oder durch Inkubation bei 37°C über Nacht erfolgen. Das aus dem anschließenden Zentrifugationsschritt (5 min, 2000 rpm (500 × g), 4°C) resultierende Sediment wird mit 250 µl auf 65°C vorgewärmtem CTAB IV-Puffer versetzt und für mindestens 30 min bzw. bis zur vollständigen Auflösung des Sediments bei 65°C inkubiert. Anschließend wird die Lösung zur Fällung der DNA mit 2,5 Volumina eiskaltem Ethanol vermischt und für 1 h bei -20°C inkubiert. Alternativ kann der Ansatz mit 0.6 Volumina Isopropanol vermischt und ohne weitere Inkubation sofort für 15 min bei 8,500 rpm (7,500 × g) und 4°C zentrifugiert werden. Die sedimentierte DNA wird durch Invertieren des Eppendorf-Gefäßes zweimal mit je 1 ml 80%igem eiskaltem Ethanol gewaschen, nach jedem Waschschritt erneut zentrifugiert (5 min, 8,500 rpm (7,500 × g), 4°C) und anschließend für ca. 15 min luftgetrocknet. Abschließend wird die DNA in 100 µl TE mit 100 µg/ml RNase resuspendiert und für 30 min bei Raumtemperatur inkubiert. Die DNA Lösung ist nach einer weiteren Inkubationsphase über Nacht bei 4°C homogen und kann für weiterführende Experimente verwendet werden. Lösungen für CTAB Lösung I (für 200 ml):
100 mM Tris/HCl pH 8,0 (2,42 g)
1,4 M NaCl (16,36 g)
20 mM EDTA (8,0 ml von 0,5 M Stammlösung)
2% (w/v) CTAB (4,0 g)
Jeweils vor der Verwendung werden frisch zugesetzt:
2% β-Mercaptoethanol (20 µl für 1 ml Lösung I).
Lösung II (für 200 ml):
0,7 M NaCl (8,18 g)
10% (w/v) CTAB (20 g)
Lösung III (für 200 ml):
50 mM Tris/HCl pH 8,0 (1,21 g)
10 mM EDTA (4 ml 0,5 M von 0,5 M Stammlösung)
1% (w/v) CTAB (2,0 g)
Lösung IV (High-salt TE) (für 200 ml):
10 mM Tris/HCl pH 8,0 (0,242 g)
0,1 mM EDTA (40 µl 0.5 M Stammlösung)
1 M NaCl (11,69 g)
Chloroform/Octanol (24 : 1) (für 200 ml):
192 ml Chloroform
8 ml Octanol
Die Mischung wird 2 × mit 1 M TrisHCl pH 8,0 ausgeschüttelt und vor Licht geschützt gelagert.

Beispiel 2

Herstellung von Suppressionskonstrukten

Ausgehend von der genomischer Arabidopsis thaliana DNA oder cDNA wurden über PCR mittels der aufgeführten Oligonukleotide folgende Fragmente von Speicherproteinsequenzen amplifiziert. Dabei kam nachfolgendes PCR Protokoll zum Einsatz: Zusammensetzung des PCR-Ansatzes (50 µL) 5,00 µL Template cDNA oder genomische DNA (ca. 1 µg)
5,00 µL 10 × Puffer (Advantage-Polymerase) + 25 mM MgCl₂
5,00 µL 2 mM dNTP
1,25 µL je Primer (10 pmol/µL)
0,50 µL Advantage-Polymerase (Clontech)
PCR-Programm: Anfangsdenaturierung für 2 min bei 95°C, dann 35 Zyklen mit 45 sec 95°C, 45 sec 55°C und 2 min 72°C. Abschließende Extension von 5 min bei 72°C.

a) Suppressionskonstrukt für Arabidopsis thaliana 12S Speicherprotein AtCRU3 (SEQ ID NO: 111 bzw. 112; GenBank Acc.-No: U66916)

Für die den sense-Strang der dsRNA und den Linker kodierende Sequenz wurde aus genomischer Arabidopsis thaliana DNA mit nachfolgendem Oligonukleotid-Primerpaar ein Exonbereich mit dem vollständigen anschließenden Intron einschließlich der an das Intron anschließenden Spleiß-Akzeptorsequenz (Basenpaar 1947 bis 2603 der Sequenz mit der GenBank Acc.-No: U66916) amplifiziert:
Das PCR-Produkt wurden in den pCR2.1-TOPO Vektor (Invitrogen) gemäß Herstellerangaben kloniert, resultierend in dem pCR2.1-1 Vektor und die Sequenz überprüft.
Für die den antisense-Strang der dsRNA kodierende Sequenz wurde aus Arabidopsis thaliana cDNA lediglich das gleiche Exon wie oben (Basenpaar 1947 bis 2384) mit dem nachfolgenden Primerpaar amplifiziert:
Das PCR-Produkt wurden in den pCR2.1-TOPO Vektor (Invitrogen) gemäß Herstellerangaben kloniert, resultierend in dem pCR2.1-2 Vektor und die Sequenz überprüft.
0,5 µg von Vektor pCR2.1-1 wurden mit dem Restriktionsenzym BamHI (New England Biolabs) für 2 Stunden nach Herstellerangaben inkubiert und dann für 15 min mit alkalischer Phosphatase (New England Biolabs) dephosphoryliert. Der so präparierte Vektor (1 µL) wurde dann mit dem aus Vektor pCR2.1-2 gewonnenen Fragment ligiert. Dazu wurden 0,5 µg von Vektor pCR2.1-2 2 Stunden mit BamHI (New England Biolabs) verdaut und die DNA-Fragmente per Gelelektorphorese aufgetrennt. Das neben dem Vektor (3,9 kb) entstandene 489 bp große Stück wurde aus dem Gel ausgeschnitten und mit dem "Gelpurification"-Kit (Qiagen) nach Herstellerangaben aufgereinigt und mit 50 µL Elutionspuffer eluiert. 10 µL des Eluats wurden mit Vektor pCR2.1-1 (s. o.) über Nacht bei 16°C ligiert (T4 Ligase, New England Biolabs). Die Ligationsprodukte wurden dann in TOP10 Zellen (Stratagene) nach Herstellerangaben transformiert und entsprechend selektioniert. Positive Klone wurden mit dem Primerpaar ONP1 und ONP2 durch PCR verifiziert. Der erhaltene Vektor pCR2.1-AtCRU3-RNAi wurde dann für 2 Stunden mit NotI (New England Biolabs) inkubiert, mit Klenow-Fragment "geblunted" und die DNA-Fragmente über Gelelektorphorese analysiert. Das 1155 bp große Fragment wurde dann in den mit StuI geschnittenen, dephosphorylierten binären Vektor pSUN2-USP1,2,3 (SEQ ID NO: 178; siehe Beispiel 5) ligiert. Bei dem Vektor pSUN2-USP1,2,3 handelt es sich um ein Derivat des Vektors pPZP111 ((Hajdukiewicz, P et al. 1994 Plant Mol Biol 25: 989-994), in dem drei Expressionskassetten, jeweils unter Kontrolle des USP-Promotors, vorliegen.
Vektoren mit der gewünschten Orientierung des Inserts wurden mittels Restriktionsverdau und Sequenzierung ermittelt. Das entstehende Konstrukt trägt die Bezeichnung pSUN2-USP-RNAi-a. Die für die dsRNA kodierende Nukleinsäuresequenz ist durch SEQ ID NO: 105 beschrieben.

b) Suppressionskonstrukt für Arabidopsis thaliana 12S Speicherprotein AtCRB (SEQ ID NO: 117 bzw. 118; GenBank Acc.-No: X14313; M37248)

Für die den sense-Strang und antisense-Strang der dsRNA wurde mit nachfolgendem Oligonukleotid-Primerpaar ein Exonbereich (Basenpaar 601 bis 1874 der Sequenz mit der GenBank Acc.-No: M37248) aus Arabidopsis thaliana cDNA amplifiziert:
Das PCR-Produkt wurde in den pCR2.1-TOPO Vektor (Invitrogen) gemäß Herstellerangaben kloniert, resultierend in dem pCR2.1-3 Vektor und die Sequenz überprüft.
Für den als Linker fungierenden Bereich wurde aus Arabidopsis thaliana genomischer DNA ein Intron mit den entsprechenden Spliceakzeptor und -donorsequenzen der flankierenden Exons (Basenpaar 1874 bis 2117 der Sequenz mit der GenBank Acc.-No: M37248) mit dem nachfolgenden Primerpaar amplifiziert:
Das PCR-Produkt wurden in den pCR2.1-TOPO Vektor (Invitrogen) gemäß Herstellerangaben kloniert, resultierend in dem pCR2.1-4 Vektor und die Sequenz überprüft.
Das Konstrukt für AtCRB wurde in einer ähnlichen Strategie wie für AtCRU3 erläutert, erstellt. Vektor pCR2.1-3 wurde mit mit XhoI (New England Biolabs) für 2 Stunden inkubiert und dephosphoryliert (alkalische Phosphatase, New England Biolabs). Vektor pCR2.1-4 wurde ebenfalls mit XhoI in derselben Weise inkubiert und die Gelfragmente per Gelelektrophorese aufgetrennt. Die entsprechenden Fragmente wurden in der unter AtCRU3 beschriebenen Art und Weise aufgereinigt und ligiert, resultierend nach Bakterientransformation in dem Vektor pCR2.1-AtCRB Exon/Intron. Dieser Vektor wurde für 2 Stunden mit XbaI (NEB), anschließend für 15 min mit Klenow-Fragment (NEB), dann für 2 Stunden mit SalI inkubiert und zuletzt 15 min mit alkalischer Phosphatase (NEB) behandelt. Parallel wurde der Vektor pCR2.1-3 mit BamHI (NEB), dann 15 min mit Klenow-Fragment und anschließend 2 Stunden mit XhoI (NEB) inkubiert. Das Exon-Fragment von AtCRB wurde nach Gelelektrophorese isoliert, gereinigt und zur Ligation eingesetzt. Beide Fragmente wurden dann ligiert und der Vektor pCR2.1-AtCRB-RNAi resultierte.
Der erhaltene Vektor pCR2.1-AtCRB-RNAi wurde dann für 2 Stunden mit Hindill und PvuI verdaut und 15 min mit Klenow- Fragment inkubiert (blunten). Das ausgeschnittene Fragment wurde über Gelelektorphorese isoliert und dann für die Ligation eingesetzt. Das entsprechende Fragment wurde dann in den mit EcoRV geschnittenen, dephosphorylierten Vektor pSUN2-USP-RNAi-a (siehe oben) ligiert. Vektoren mit der gewünschten Orientierung des Inserts wurden mittels Restriktionsverdau und Sequenzierung ermittelt. Das entstehende Konstrukt trägt die Bezeichnung pSUN2-USP-RNAi-b. Die für die dsRNA kodierende Nukleinsäuresequenz ist durch SEQ ID NO: 107 beschrieben.

c) Suppressionskonstrukt für Arabidopsis thaliana 2S Speicherprotein At2S3 (SEQ ID NO: 3 bzw. 4; GenBank Acc.-No: M22035)

Für die den sense-Strang und antisense-Strang der dsRNA wurde aus Arabidopsis thaliana cDNA mit nachfolgendem Oligonukleotid-Primerpaar ein Exonbereich (Basenpaar 212 bis 706 der Sequenz mit der GenBank Acc.-No: M22035) amplifiziert:
Das PCR-Produkt wurden in den pCR2.1-TOPO Vektor (Invitrogen) gemäß Herstellerangaben kloniert, resultierend in dem pCR2.1-5 Vektor und die Sequenz überprüft.
Für den als Linker fungierenden Bereich wurde das gleiche Intron wie unter b) mit den Primern OPN 7 und OPN 8 amplifiziert eingesetzt.
Das Konstrukt für At2S3 wurde in einer ähnlichen Strategie wie für AtCRU3 erläutert, erstellt. Vektor pCR2.1-5 wurde mit mit XhoI (New England Biolabs) für 2 Stunden inkubiert und dephosphoryliert (alkalische Phosphatase, New England Biolabs). Vektor pCR2.1-3 wurde ebenfalls mit XhoI in derselben Weise inkubiert und die Gelfragmente per Gelelektrophorese aufgetrennt. Die entsprechenden Fragmente wurden in der unter AtCRU3 beschriebenen Art und Weise aufgereinigt und ligiert, resultierend nach Bakterientransformation in dem Vektor pCR2.1-At2S3 Exon/Intron. Dieser Vektor wurde für 2 Stunden mit SalI (NEB), anschließend für 15 min mit Klenow-Fragment (NEB)inkubiert und zuletzt 15 min mit alkalischer Phosphatase (NEB) behandelt. Parallel wurde der Vektor pCR2.1-5 mit BamHI (NEB) und dann 15 min mit Klenow-Fragment inkubiert. Das Exon-Fragment von At2S3 wurde nach Gelelektorphorese isoliert, gereinigt und zur Ligation eingesetzt. Beide Fragmente wurden dann ligiert und der Vektor pCR2.1-At2S3-RNAi resultierte.
Der erhaltene Vektor pCR2.1-At2S3-RNAi wurde dann für 2 Stunden mit HindIII und XbaI (New England Biolabs) verdaut und 15 min mit Klenow-Fragment inkubiert (blunten). Das ausgeschnittene Fragment wurde über Gelelektorphorese isoliert und dann für die Ligation eingesetzt. Das entsprechende Fragment wurde dann in den mit SmaI verdauten und dephosphorylierten Vektor pSUN2-USP-RNAi-b (siehe oben) ligiert. Vektoren mit der gewünschten Orientierung des Inserts wurden mittels Restriktionsverdau und Sequenzierung ermittelt. Das entstehende Konstrukt trägt die Bezeichnung pSUN2-USP-RNAi1. Die für die dsRNA kodierende Nukleinsäuresequenz ist durch SEQ ID NO: 109 beschrieben.
Durch die oben erwähnten Klonierungsschritte befinden sich alle drei Konstrukte AtCRU3, AtCRB und At2S3 im binären Vektor pSUN2-USP1,2,3 jeweils unter der Kontrolle des USP-Promotors (Bäumlein et al. 1991, Mol Gen Genet 225(3): 459-67).

Beispiel 3

Plasmide für die Pflanzentransformation

Zur Pflanzentransformation können binäre Vektoren, wie pBinAR verwendet werden (Höfgen und Willmitzer (1990) Plant Science 66: 221-230). Die Konstruktion der binären Vektoren kann durch Ligation der cDNA in Sense- oder Antisense-Orientierung in T-DNA erfolgen. 5' der cDNA aktiviert ein Pflanzenpromotor die Transkription der cDNA. Eine Polyadenylierungssequenz befindet sich 3' von der cDNA.
Die gewebespezifische Expression lässt sich unter Verwendung eines gewebespezifischen Promotors erzielen. Beispielsweise kann die samenspezifische Expression erreicht werden, indem der Napin- oder der LeB4- oder der USP-Promotor 5' der cDNA einkloniert wird. Auch jedes andere samenspezifische Promotorelement kann verwendet werden. Zur konstitutiven Expression in der ganzen Pflanzen lässt sich der CaMV-35S-Promotor verwenden.
Ein weiteres Beispiel für einen binären Vektor ist der Vektor pSUN2-USP1,2,3, in welchen die Fragmente aus Beispiel 2 kloniert wurden, sowie pSUN2-USP. Der Vektor pSUN2-USP enthält den USP- Promotor sowie den OCS Terminator. pSUN2-USP1,2,3, enthält dreimal den USP-Promotor. Die Fragmente aus Beispiel 2 wurden in die multiple Klonierungsstelle der Vektors pSUN2-USP1,2,3 kloniert, um die samenspezifische Expression der Suppressionskonstrukte zu ermöglichen.

Beispiel 4

Transformation von Agrobacterium

Die Agrobacterium-vermittelte Pflanzentransformation kann zum Beispiel unter Verwendung der Agrobacterium tumefaciens-Stämme GV3101 (pMP90) (Koncz und Schell (1986) Mol Gen Genet 204: 383-396) oder LBA4404 (Clontech) durchgeführt werden. Die Transformation kann durch Standard-Transformationstechniken durchgeführt werden (Deblaere et al. (1984) Nucl Acids Res 13: 4777-4788).

Beispiel 5

Pflanzentransformation

Die Agrobacterium-vermittelte Pflanzentransformation kann unter Verwendung von Standard-Transformations- und Regenerationstechniken durchgeführt werden (Gelvin, Stanton B., Schilperoort, Robert A., Plant Molecular Biology Manual, 2. Aufl., Dordrecht: Kluwer Academic Publ., 1995, in Sect., Ringbuc Zentrale Signatur: BT11-P ISBN 0-7923-2731-4; Glick, Bernard R., Thompson, John E., Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Boca Raton: CRC Press, 1993, 360 S., ISBN 0-8493-5164-2).
Die Transformation mittels Agrobacterium von Arabidopsis thaliana wurde durch die Methode nach Bechthold et al., 1993 (C. R. Acad. Sci. Ser. III Sci. Vie., 316, 1194-1199) durchgeführt. Beispielsweise kann Raps mittels Kotyledonen- oder Hypokotyltransformation transformiert werden (Moloney et al., Plant Cell Report 8 (1989) 238-242; De Block et al., Plant Physiol. 91 (1989) 694-701). Die Verwendung von Antibiotika für die Agrobacterium- und Pflanzenselektion hängt von dem für die Transformation verwendeten binären Vektor und Agrobacterium-Stamm ab. Die Rapsselektion wird gewöhnlich unter Verwendung von Kanamycin als selektierbarem Pflanzenmarker durchgeführt.
Der Agrobacterium-vermittelte Gentransfer in Lein (Linum usitatissimum) lässt sich unter Verwendung von beispielsweise einer von Mlynarova et al. (1994) Plant Cell Report 13: 282-285 beschriebenen Technik durchführen.
Die Transformation von Soja kann unter Verwendung von beispielsweise einer in EP-A-0 0424 047 (Pioneer Hi-Bred International) oder in EP-A-0 0397 687, US 5,376,543, US 5,169,770 (University Toledo) beschriebenen Technik durchgeführt werden.
Die Pflanzentransformation unter Verwendung von Teilchenbeschuss, Polyethylenglycol-vermittelter DNA-Aufnahme oder über die Siliziumcarbonatfaser-Technik ist beispielsweise beschrieben von Freeling und Walbot "The maize handbook" (1993) ISBN 3-540-97826-7, Springer Verlag New York).

Beispiel 6

Untersuchung der Expression eines rekombinanten Genproduktes in einem transformierten Organismus

Die Aktivität eines rekombinanten Genproduktes im transformierten Wirtsorganismus wurde auf der Transkriptions- und/oder der Translationsebene gemessen.
Ein geeignetes Verfahren zur Bestimmung der Menge an Transkription des Gens (ein Hinweis auf die Menge an RNA, die für die Translation des Genproduktes zur Verfügung steht) ist die Durchführung eines Northern-Blots wie unten ausgeführt (als Bezugsstelle siehe Ausubel et al. (1988) Current Protocols in Molecular Biology, Wiley: New York, oder den oben erwähnten Beispielteil), wobei ein Primer, der so gestaltet ist, dass er an das Gen von Interesse bindet, mit einer nachweisbaren Markierung (gewöhnlich radioaktiv oder chemilumineszent) markiert wird, so dass, wenn die Gesamt-RNA einer Kultur des Organismus extrahiert, auf einem Gel aufgetrennt, auf eine stabile Matrix transferiert und mit dieser Sonde inkubiert wird, die Bindung und das Ausmaß der Bindung der Sonde das Vorliegen und auch die Menge der mRNA für dieses Gen anzeigt. Diese Information zeigt den Grad der Transkription des transformierten Gens an. Zelluläre Gesamt-RNA kann aus Zellen, Geweben oder Organen mit mehreren Verfahren, die alle im Fachgebiet bekannt sind, wie zum Beispiel das von Bormann, E. R., et al. (1992) Mol. Microbiol. 6: 317-326 beschriebene, präpariert werden.

Northern-Hybridisierung

Für die RNA-Hybridisierung wurden 20 µg Gesamt-RNA oder 1 µg poly(A)⁺-RNA mittels Gelelektrophorese in Agarosegelen mit einer Stärke von 1,25% unter Verwendung von Formaldehyd, wie beschrieben in Amasino (1986, Anal. Biochem. 152, 304) aufgetrennt, mittels Kapillaranziehung unter Verwendung von 10 × SSC auf positiv geladene Nylonmembranen (Hybond N+, Amersham, Braunschweig) übertragen, mittels UV-Licht immobilisiert und 3 Stunden bei 68°C unter Verwendung von Hybridisierungspuffer (10% Dextransulfat Gew./Vol., 1 M NaCl, 1% SDS, 100 mg Heringssperma-DNA) vorhybridisiert. Die Markierung der DNA-Sonde mit dem Highprime DNA labeling-Kit (Roche, Mannheim, Deutschland) erfolgte während der Vorhybridisierung unter Verwendung von alpha-³²P-dCTP (Amersham Pharmacia, Braunschweig, Deutschland). Die Hybridisierung wurde nach Zugabe der markierten DNA-Sonde im gleichen Puffer bei 68°C über Nacht durchgeführt. Die Waschschritte wurden zweimal für 15 min unter Verwendung von 2 × SSC und zweimal für 30 min unter Verwendung von 1 × SSC, 1% SDS, bei 68°C durchgeführt. Die Exposition der verschlossenen Filter surde bei -70°C für einen Zeitraum von 1 bis 14 T durchgeführt.
Zur Untersuchung des Vorliegens oder der relativen Menge an von dieser mRNA translatiertem Protein können Standardtechniken, wie ein Western-Blot, eingesetzt werden (siehe beispielsweise Ausubel et al. (1988) Current Protocols in Molecular Biology, Wiley: New York). Bei diesem Verfahren werden die zellulären Gesamt- Proteine extrahiert, mittels Gelelektrophorese aufgetrennt, auf eine Matrix, wie Nitrozellulose, übertragen und mit einer Sonde, wie einem Antikörper, der spezifisch an das gewünschte Protein bindet, inkubiert. Diese Sonde ist gewöhnlich mit einer chemilumineszenten oder kolorimetrischen Markierung versehen, die sich leicht nachweisen lässt. Das Vorliegen und die Menge der beobachteten Markierung zeigt das Vorliegen und die Menge des gewünschten, in der Zelle vorliegenden mutierten Proteins an.

Beispiel 7

Analyse der Auswirkung der rekombinanten Proteine auf die Produktion des gewünschten Produktes

Die Auswirkung der genetischen Modifikation in Pflanzen, Pilzen, Algen, Ciliaten oder auf die Produktion einer gewünschten Verbindung (wie einer Fettsäure) kann bestimmt werden, indem die modifizierten Mikroorganismen oder die modifizierte Pflanze unter geeigneten Bedingungen (wie den vorstehend beschriebenen) gezüchtet werden und das Medium und/oder die zellulären Komponenten auf die erhöhte Produktion des gewünschten Produktes (d. h. von Lipiden oder einer Fettsäure) untersucht wird. Diese Analysetechniken sind dem Fachmann bekannt und umfassen Spektroskopie, Dünnschichtchromatographie, Färbeverfahren verschiedener Art, enzymatische und mikrobiologische Verfahren sowie analytische Chromatographie, wie Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (siehe beispielsweise Ullman, Encyclopedia of Industrial Chemistry, Bd. A2, S. 89-90 und S. 443-613, VCH: Weinheim (1985); Fallon, A., et al., (1987) "Applications of HPLC in Biochemistry" in: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Bd. 17; Rehm et al. (1993) Biotechnology, Bd. 3, Kapitel III: "Product recovery and purification", S. 469-714, VCH: Weinheim; Belter, P. A., et al. (1988) Bioseparations: downstream processing for Biotechnology, John Wiley and Sons; Kennedy, J. F., und Cabral, J. M. S. (1992) Recovery processes for biological Materials, John Wiley and Sons; Shaeiwitz, J. A., und Henry, J. D. (1988) Biochemical Separations, in: Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, Bd. B3; Kapitel 11, S. 1-27, VCH: Weinheim; und Dechow, F. J. (1989) Separation and purification techniques in biotechnology, Noyes Publications).
Neben den oben erwähnten Verfahren werden Pflanzenlipide aus Pflanzenmaterial wie von Cahoon et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96 (22): 12935-12940, und Browse et al. (1986) Analytic Biochemistry 152: 141-145, beschrieben extrahiert. Die qualitative und quantitative Lipid- oder Fettsäureanalyse ist beschrieben bei Christie, William W., Advances in Lipid Methodology, Ayr/Scotland: Oily Press (Oily Press Lipid Library; 2); Christie, William W., Gas Chromatography and Lipids. A Practical Guide- Ayr, Scotland: Oily Press, 1989, Repr. 1992, IX, 307 S. (Oily Press Lipid Library; 1); "Progress in Lipid Research, Oxford: Pergamon Press, 1 (1952)-16 (1977) u. d. T.: Progress in the Chemistry of Fats and Other Lipids CODEN.
Zusätzlich zur Messung des Endproduktes der Fermentation ist es auch möglich, andere Komponenten der Stoffwechselwege zu analysieren, die zur Produktion der gewünschten Verbindung verwendet werden, wie Zwischen- und Nebenprodukte, um die Gesamteffizienz der Produktion der Verbindung zu bestimmen. Die Analyseverfahren umfassen Messungen der Nährstoffmengen im Medium (z. B. Zucker, Kohlenwasserstoffe, Stickstoffquellen, Phosphat und andere Ionen), Messungen der Biomassezusammensetzung und des Wachstums, Analyse der Produktion üblicher Metabolite von Biosynthesewegen und Messungen von Gasen, die während der Fermentation erzeugt werden. Standardverfahren für diese Messungen sind in Applied Microbial Physiology; A Practical Approach, P. M. Rhodes und P. F. Stanbury, Hrsgb., IRL Press, S. 103-129; 131-163 und 165-192 (ISBN: 0199635773) und darin angegebenen Literaturstellen beschrieben.
Ein Beispiel ist die Analyse von Fettsäuren (Abkürzungen: FAME, Fettsäuremethylester; GC-MS, Gas-Flüssigkeitschromatographie- Massenspektrometrie; TAG, Triacylglycerin; TLC, Dünnschichtchromatographie).
Der unzweideutige Nachweis für das Vorliegen von Fettsäureprodukten kann mittels Analyse rekombinanter Organismen nach Standard-Analyseverfahren erhalten werden: GC, GC-MS oder TLC, wie verschiedentlich beschrieben von Christie und den Literaturstellen darin (1997, in: Advances on Lipid Methodology, Vierte Aufl.: Christie, Oily Press, Dundee, 119-169; 1998, Gaschromatographie-Massenspektrometrie-Verfahren, Lipide 33: 343-353).
Das zu analysierende Material kann durch Ultraschallbehandlung, Mahlen in der Glasmühle, flüssigen Stickstoff und Mahlen oder über andere anwendbare Verfahren aufgebrochen werden. Das Material muss nach dem Aufbrechen zentrifugiert werden. Das Sediment wird in Aqua dest. resuspendiert, 10 min bei 100°C erhitzt, auf Eis abgekühlt und erneut zentrifugiert, gefolgt von Extraktion in 0,5 M Schwefelsäure in Methanol mit 2% Dimethoxypropan für 1 Std. bei 90°C, was zu hydrolysierten Öl- und Lipidverbindungen führt, die transmethylierte Lipide ergeben. Diese Fettsäuremethylester werden in Petrolether extrahiert und schließlich einer GC-Analyse unter Verwendung einer Kapillarsäule (Chrompack, WCOT Fused Silica, CP-Wax-52 CB, 25 mikrom, 0,32 mm) bei einem Temperaturgradienten zwischen 170°C und 240°C für 20 min und 5 min bei 240°C unterworfen. Die Identität der erhaltenen Fettsäuremethylester muss unter Verwendung von Standards, die aus kommerziellen Quellen erhältlich sind (d. h. Sigma), definiert werden.
Für die Öl-Analyse der mit den Suppressionskonstrukten transformierten Arabidopsis Pflanzen wurde folgendes Protokoll angewendet:
Die Extraktion der Lipide aus Samen wird nach der Methode von Bligh & Dyer (1959) Can J Biochem Physiol 37: 911 durchgeführt. Dazu werden 5 mg Arabidopsis Samen in 1,2 ml Qiagen-Microtubes (Qiagen, Hilden) auf einer Sartorius (Göttingen) Mikrowaage abgewogen. Das Samenmaterial wird mit 500 uL Chloroform/Methanol (2 : 1; enthält Mono-C17-glycerin von Sigma als internen Standard) in der Rätschmühle MM300 der Firma Retsch (Haan) homogenisiert und 20 min bei RT inkubiert. Nach Zugabe von 500 uL 50 mM Kaliumphosphatpuffer pH 7,5 erfolgt die Phasentrennung. Von der organischen Phase werden 50 µL abgenommen, mit 1500 uL Chloroform verdünnt und 5 µL auf die Kapillaren Chromarods SIII der Firma Iatroscan (SKS, Bechenheim) aufgetragen. Nach Auftrag der Proben werden diese für 15 min in einer Dünnschichtkammer, die gesättigt ist mit 6 : 2 : 2 Chloroform : Methanol : Toluol in einem ersten Schritt aufgetrennt. Nach Ablauf der Zeit werden die Kapillaren 4 min bei Raumtemperatur getrocknet und dann für 22 min in eine Dünnschichtkammer, die gesättigt ist mit 7 : 3 n-Hexan : Dieethylether gestellt. Nach einem weiteren Trocknungsschritt für 4 min bei Raumtemperatur werden die Proben in einem Iatroscan MK-5 (SKS, Bechenheim) entsprechend Fraser & Taggart, 1988 J. Chromatogr. 439: 404 analysiert. Folgende Parameter wurden für die Messungen eingestellt: Slice width 50 msec, Treshold 20 mV, Noise 30, Skim ratio 0. Die Quantifizierung der Daten erfolgte anhand des internen Standards Mono-C17-glycerin (Sigma) sowie einer erstellten Eichkurve mit Tri-C17-glycerin (Sigma) mittels des Programms ChromStar (SKS, Beichenheim).
Für die quantitative Bestimmung der Ölgehalte wurden Samen von jeweils 10 Pflanzen derselben unabhängigen transgenen Linie analysiert. Insgesamt wurde der Ölgehalt von 30 transgene Linien der T1 Generation, 10 transgene Linien mit je 10 Pflanzen der T2 Generation und 5 transgene Linien mit je 10 Pflanzen der T3 Linien bestimmt. Dabei zeigen die transgenen Pflanzen einen signifikant höheren Ölgehalt als entsprechend gleichbehandelte Kontrollpflanzen.

Beispiel 8

Klonierung der Super-RNAi Konstrukte für die Suppression von Speicherproteinen aus verschiedenen Klassen

a) Herstellung von Super-Suppressionskonstrukt 1

Die Vektoren pCR2.1-AtCRU3-RNAi und pCR2.1-4 (siehe Beispiel 2) werden mit den Restriktionsenzymen XhoI und SalI für 2 Stunden bei 37°C inkubiert, die DNA-Fragmente durch Agarose-Gelelektrophorese aufgetrennt und sowohl der Vektor als auch das PCR-Insert aus pCR2.1-4 ausgeschnitten und mit dem "Gelpurification"-Kit von Qiagen nach Herstellerangaben aufgereinigt und mit 50 µL Elutionspuffer eluiert. Vom Vektor wird 1 µL, vom PCR-Insert aus pCR2.1-4 8 µL der Eluate für die Ligation eingesetzt, resultierend in dem Konstrukt pCR2.1-sRNAi1. Dieser Vektor wird für 2 Stunden mit dem Restriktionsenzym XhoI und dann für 15 min mit Klenow-Fragment inkubiert. Der Vektor pCR2.1-AtCRB-RNAi (siehe Beispiel 2) wird mit dem Enzym EcoRI für 2 Stunden inkubiert und ebenfalls 15 min mit Klenow-Fragment behandelt. Beide Inkubationsansätze werden durch Gelelektrophorese aufgetrennt und jeweils der Vektor (pCR2.1-sRNAi1) bzw. das Insert (aus pCR2.1-AtCRB-RNAi) aus dem Agarosegel ausgeschnitten und die DNA-Fragmente wie oben beschrieben aufgereinigt. Für die Ligation werden 1 µL des Eluates vom Vektor und 8 µL des Eluates vom Insert eingesetzt und bei 4°C über Nacht inkubiert. Das resultierende Konstrukt wird mit pCR2.1-sRNAi2 bezeichnet. Der resultierende Vektor wird mit dem Enzym XbaI und anschließend mit Klenow-Fragment inkubiert. Der Vektor pCR2.1-4 wird mit den Enzymen EcoRV und XbaI und anschließend mit Klenow-Fragment inkubiert. Nach Gelelektrophorese und -reinigung wird das Fragment aus pCR2.1-4 mit dem Vektor pCR2.1-sRNAi2 ligiert, resultierend in dem Konstrukt pCR2.1-sRNAi3. Der resultierende Vektor wird dann mit dem Enzym Apal für 2 Stunden und dann mit Klenow-Fragment für 15 min inkubiert. Als Insert wird der Vektor pCR2.1-At2S3-RNAi mit dem Enzym EcoRI für 2 Stunden und dann mit Klenow- Fragment für 15 min inkubiert. Nach Gelelektrophorese und -reinigung werden die Eluate ligiert, resultierend in dem Vektor pCR2.1-sRNAi4. Aus diesem Vektor wird dann das sRNAi4-Fragment (SEQ ID NO: 144), kodierend für die supersupprimierende dsRNA, durch Inkubation mit Hindill und PvuI ausgeschnitten und in den binären Vektor pSUN-USP (SEQ ID NO: 179) ligiert. Das Konstrukt dient der gleichzeitigen Suppression von Arabidopsis thaliana Speicherproteinen CRB (SEQ ID NO: 4), CRU3 (SEQ ID NO: 112) und At2S3 (SEQ ID NO: 118).

b) Herstellung von Super-Suppressionskonstrukt 2

Ausgehend von Arabidopsis thaliana cDNA wird ein Fragment aus dem Speicherprotein AtCRU3 (SEQ ID NO: 111, 112) mit dem nachfolgenden Oligonukleotid-Primerpaar unter den in Beispiel 2 angegebenen PCR-Bedingungen amplifiziert:
Das erhaltene Fragment wird in den Vektor pCR2.1-TOPO Vektor (Invitrogen) gemäß Herstellerangaben kloniert, resultierend in den pCR2.1-6 und die Sequenzen überprüft.
Ausgehend von Arabidopsis thaliana cDNA wird ein Fragment aus dem Speicherprotein At2S3 (SEQ ID NO: 3, 4) mit dem nachfolgenden Oligonukleotid-Primerpaar unter den in Beispiel 2 angegebenen PCR-Bedingungen amplifiziert:
Das erhaltene Fragment wird in den Vektor pCR2.1-TOPO Vektor (Invitrogen) gemäß Herstellerangaben kloniert, resultierend in den pCR2.1-7 und die Sequenzen überprüft.
Aus den pCR2.1-3, pCR2.1-4 (siehe Beispiel 2) und pCR2.1-6 und pCR2.1-7 werden dann die Konstrukte folgendermaßen zusammen ligiert: Der Vektor pCR2.1-3 wird 2 Stunden mit EcoRV inkubiert und anschließend 15 min mit alkalischer Phosphatase dephosphoryliert. Der Vektor pCR2.1-6 wird mit den Enzymen StuI und EcoRV für 2 Stunden inkubiert und das PCR-Insert über Gelelektrophorese und -reinigung isoliert. Vektor pCR2.1-3 und Insert aus pCR2.1-6 werden dann über Nacht bei 4°C ligiert, resultierend in dem Konstrukt pCR2.1-sRNAi5. Dieser Vektor wird dann mit EcoRV inkubiert und dephosphoryliert und mit dem StuI/EcoRV inkubierten und gelaufgereinigten Fragment aus pCR2.1-7 ligiert, resultierend in dem Konstrukt pCR2.1-sRNAi6. Dieser Vektor wird dann mit XhoI inkubiert und dephosphoryliert. Der Vektor pCR2.1-4 wird mit SalI und XhoI inkubiert und das Insert aus pCR2.1-4 mit dem vorbereiteten Vektor pCR2.1-sRNAi6 ligiert, resultierend in dem Konstrukt pCR2.1-sRNAi7. Ausgehend von pCR2.1-sRNAi7 wird eine PCR mit den nachfolgenden Primerpaar unter den in Beispiel 2 gegebenen Bedingungen durchgeführt:
Das resultierende PCR-Produkt wird mit den Enzymen XhoI und SalI inkubiert. Das Fragment wird dann in den Vektor pCR2.1-sRNAi7 (inkubiert mit XhoI) ligiert, resultierend in dem Konstrukt pCR2.1-sRNAi8. Aus diesem Vektor wird dann das sRNAi8-Fragment (SEQ ID NO: 146), kodierend für die super-supprimierende dSRNA, durch Inkubation mit HindIII und XbaI ausgeschnitten und in den binären Vektor pSUN-USP (SEQ ID NO: 179) ligiert. Das Konstrukt dient der gleichzeitigen Suppression von Arabidopsis thaliana Speicherproteinen CRB (SEQ ID NO: 4), CRU3 (SEQ ID NO: 112) und At2S3 (SEQ ID NO: 118).

Vergleichsversuch 1

Die Auswirkung der transgenen Expression der cytosolischer, nicht-lichtregulierten Arabidopsis thaliana ACCase (GenBank Acc.- No.: D34630) als Fusionsprotein mit mit Signalsequenz für Transport in Chloroplasten aus der Transketolase aus Tabak (Henkes S et al. (2001) Plant Cell 13(3): 535-51) auf den Ölgehalt der Pflanzen wurde untersucht. Dazu wurde das Fusionsprotein (vgl. SEQ ID NO: 176, 177) unter Kontrolle des Napin-Promotors in Arabidopsis thaliana Pflanzen exprimiert. Die für dieses Expressionskonstrukt kodierende Nukleinsäuresequenz ist durch SEQ ID NO: 175 beschrieben. Die Herstellung und Untersuchung der Pflanzen erfolgte mit den oben genannten Verfahren. Es konnte keine signifikante Änderung des Ölgehaltes in Samen verglichen mit Wildtypkontrollpflanzen festgestellt werden (siehe Fig. 8).

Claims

1. Verfahren zum Erhöhen des Gesamtölgehalt in einem pflanzlichen Organismus, dadurch gekennzeichnet, dass nachfolgende Arbeitsschritte umfasst sind

a) Verminderung der Proteinemenge eines oder mehrerer Speicherproteine in einem pflanzlichen Organismus oder einem Gewebe, Organ, Teil oder Zelle des besagten pflanzlichen Organismus und

b) Auswahl von pflanzlichen Organismen, bei denen - im Unterschied oder Vergleich zur Ausgangsorganismus - der Gesamtölgehalt in dem besagten pflanzlichen Organismus oder einem Gewebe, Organ, Teil oder Zelle des besagten pflanzlichen Organismus erhöht ist.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Gesamtölgehalt im Samen einer Pflanze erhöht wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Speicherprotein ausgewählt ist aus den Speicherprotein-Klassen der 2S-Albumine, 7S-Globuline, 11S/12S- Globuline oder Zein-Prolamine.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Speicherprotein ausgewählt ist aus

a) der Gruppe der Polypeptid gemäß SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 133, 155, 157, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 171, 172 oder 174 oder

b) einem funktionellen Äquivalent eines der Polypeptide unter a) mit einer Homologie zu diesem von mindestens 65%.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Proteinmenge von mindestens zwei Speicherproteinen vermindert wird, wobei die Homologie von mindestens zwei der in ihrer Proteinmenge verminderten Speicherproteine untereinander geringer als 90% ist.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens zwei der zu vermindernden Speicherproteine zu unterschiedlichen Klassen ausgewählt aus der Gruppe der Klassen der 2S-Albumine, 7S-Globuline, 11S/12S- Globuline oder Zein-Prolamine zählen.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch kennzeichnet, dass die Verminderung der Proteinemenge mindestens eines Speicherproteins gewährleistet wird durch Anwendung eines Verfahrens ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus

a) Einbringung einer doppelsträngigen RNA-Nukleinsäuresequenz oder einer deren Expression gewährleistenden Expressionskassette oder Expressionskassetten, wobei die doppelsträngige RNA-Sequenz nachfolgende Elemente umfasst

a) mindestens eine "sense"-Ribonukleotidsequenz, die im wesentlichen identisch ist zu mindestens einem Teil des "sense"-RNA-Transkriptes einer Speicherprotein- Nukleinsäuresequenz und

b) "antisense"-Ribonukleotidsequenzen, die zu besagten "sense"-Ribonukleotidsequenz unter i) im wesentlichen komplementären sind

b) Einbringung einer Speicherprotein antisense-RNA-Nukleinsäuresequenz oder einer deren Expression gewährleistenden Expressionskassette, wobei die Speicherprotein antisense- RNA-Nukleinsäuresequenz im wesentlichen komplementär ist zu mindestens einem Teil des "sense"-RNA-Transkriptes einer Speicherprotein-Nukleinsäuresequenz

c) Einbringung einer Speicherprotein antisense-RNA-Nukleinsäuresequenz kombiniert mit einem Ribozym oder einer deren Expression gewährleistenden Expressionskassette,

d) Einbringung von Speicherprotein sense-RNA-Nukleinsäuresequenzen zur Induktion einer Kosuppression oder einer deren Expression gewährleistenden Expressionskassette, wobei die Speicherprotein sense-RNA-Nukleinsäuresequenz im wesentlichen identisch ist zu mindestens einem Teil des "sense"-RNA-Transkriptes einer Speicherprotein- Nukleinsäuresequenz

e) Einbringung DNA-bindende Faktoren gegen Speicherprotein -Gene oder -RNAs oder einer deren Expression gewährleistenden Expressionskassette,

f) Einbringung von den Speicherprotein RNA-Abbau bewirkende virale Nukleinsäuresequenzen und Expressionskonstrukten oder einer deren Expression gewährleistenden Expressionskassette,

g) Einbringung von Konstrukten zur Induktion einer homologen Rekombination an endogenen Speicherprotein-Genen und

h) Einführung von Mutationen in ein endogenes Speicherprotein Gen.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, umfassend

A) die stabile Transformation einer pflanzlichen Zelle mit einer rekombinanten Expressionskassette enthaltend in funktioneller Verknüpfung mit einem in Pflanzen aktiven Promotor eine Nukleinsäuresequenz kodierend für

a) eine doppelsträngigen Speicherprotein RNA-Nukleinsäuresequenz, wobei die doppelsträngige RNA-Sequenz nachfolgende Elemente umfasst

b) mindestens eine "sense"-Ribonukleotidsequenz, die im wesentlichen identisch ist zu mindestens einem Teil des "sense"-RNA-Transkriptes einer Speicherprotein-Nukleinsäuresequenz und

c) "antisense"-Ribonukleotidsequenzen, die zu besagten "sense"-Ribonukleotidsequenzen unter i) im wesentlichen komplementären sind,
oder

d) eine Speicherprotein antisense-RNA-Nukleinsäuresequenz, wobei die Speicherprotein antisense-RNA- Nukleinsäuresequenz im wesentlichen komplementär ist zu mindestens einem Teil des "sense"-RNA-Transkriptes einer Speicherprotein-Nukleinsäuresequenz, oder

e) eine Speicherprotein antisense-Nukleinsäuresequenz kombiniert mit einem Ribozym oder

f) eine Speicherprotein sense-Nukleinsäuresequenzen zur Induktion einer Kosuppression, wobei die Speicherprotein sense-RNA-Nukleinsäuresequenz im wesentlichen identisch ist zu mindestens einem Teil des "sense"-RNA-Transkriptes einer Speicherprotein- Nukleinsäuresequenz, oder

g) DNA-bindende Faktoren gegen Speicherprotein-Gene oder -RNAs

h) den Speicherprotein RNA-Abbau bewirkende virale Nukleinsäuresequenzen

B) Regeneration der Pflanze aus der pflanzlichen Zelle, und

C) Expression besagter Nukleinsäuresequenz in einer Menge und für eine Zeit hinreichend um den Gesamtölgehalt in besagter Pflanze zu erhöhen.

9. Doppelsträngiges RNA-Molekül, umfassend

a) mindestens eine "sense"-Ribonukleotidsequenz, die im wesentlichen identisch ist zu mindestens einem Teil des "sense"-RNA-Transkriptes einer Speicherprotein-Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 132, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170 oder 173 und

b) "antisense"-Ribonukleotidsequenzen, die zu besagten "sense"-Ribonukleotidsequenzen unter a) im wesentlichen komplementären sind.

10. Doppelsträngiges RNA-Molekül nach Anspruch 9, umfassend

a) mindestens zwei "sense"-Ribonukleotidsequenen, wobei

a) jede dieser "sense"-Ribonukleotidsequenzen im wesentlichen identisch ist zu mindestens einem Teil des "sense"-RNA-Transkriptes einer Speicherprotein-Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 132, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170 oder 173 und wobei

b) zumindest zwei der Speicherprotein-Nukleinsäuresequenzen, zu deren "sense"-RNA-Transkript die besagten "sense"-Ribonukleotidsequenzen im wesentlichen identisch sind, untereinander eine Homologie von unter 90% haben, und

11. Doppelsträngiges RNA-Molekül nach Anspruch 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, dass zumindest zwei der Speicherprotein-Nukleinsäuresequenzen, zu deren "sense"-RNA- Transkript die besagten "sense"-Ribonukleotidsequenzen im wesentlichen identisch sind, zu zwei unterschiedlichen Klassen von Speicherproteinen zählen ausgewählt aus der Gruppe von Speicherproteinklassen bestehend aus 2S-Albuminen, 7S-Globulinen, 11S/12S-Globulinen und Zein-Prolaminen.

12. Doppelsträngiges RNA-Molekül nach Anspruch einem der Ansprüche 9 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass die "sense"-Ribonukleotidsequenzen und die "antisense"-Ribonukleotidsequenzen kovalent miteinander verbunden sind.

13. Transgene Expressionskassette enthalten in funktioneller Verknüpfung mit einem Promotor eine Nukleinsäuresequenz kodierend für doppelsträngiges RNA-Molekül gemäß einem der Ansprüche 9 bis 12.

14. Transgenes Expressionssystem enthaltend

a) in funktioneller Verknüpfung mit einem Promotor eine Nukleinsäuresequenz kodierend für "sense"-Ribonukleotidsequenzen eines doppelsträngigen RNA-Molekül gemäß einem der Ansprüche 9 bis 11 und

b) in funktioneller Verknüpfung mit einem Promotor eine Nukleinsäuresequenz kodierend für "antisense"-Ribonukleotidsequenzen eines doppelsträngigen RNA-Molekül gemäß einem der Ansprüche 9 bis 11,

wobei die Promotoren so gewählt sind, das in einem bestimmten Organismus die gleichzeitige Expression von "sense"-Ribonukleotidsequenzen und "antisense"-Ribonukleotidsequenzen gewährleistet ist.

15. Transgener Vektor enthaltend eine transgene Expressionskassette gemäß Anspruch 13 oder ein transgenes Expressionssystem gemäß Anspruch 14.

16. Transgener Organismus enthaltend eine transgene Expressionskassette gemäß Anspruch 13 oder ein transgenes Expressionssystem gemäß Anspruch 14 oder einen transgenen Vektor gemäß Anspruch 15.

17. Transgener Organismus nach Anspruch 16 ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Bakterien, Hefen, nicht-menschlichen Tieren und Pflanzen.

18. Transgener Organismus nach Anspruche 17, dadurch gekennzeichnet, dass die Pflanze ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Arabidopsis, Raps, Sonnenblume, Sesam, Färberdistel, Ölbaum, Soja, Mais, Weizen und Nussarten.

19. Verwendung eines transgenen Organismus nach einem der Ansprüche 16 bis 18 zur Herstellung von Ölen, Fetten, freien Fettsäuren oder Derivaten der vorgenannten.