DE112010003162T5

DE112010003162T5 - Gesamtsamen-spezifischer Promotor

Info

Publication number: DE112010003162T5
Application number: DE112010003162T
Authority: DE
Inventors: Huihua Fu; Jeffrey A. Brown; Kirk Francis; Hee-Sook Song
Original assignee: BASF Plant Science Co GmbH
Current assignee: BASF Plant Science Co GmbH
Priority date: 2009-04-22
Filing date: 2010-04-22
Publication date: 2012-08-16
Also published as: AU2010240916B2; US10519458B2; BRPI1012750A2; EP2421976A1; CA2756146C; RU2561463C2; US11629353B2; US20200140876A1; CN102575257A; CA3020943A1; EP2421976B1; US20120036595A1; AU2010240916A1; BRPI1012750B1; CN102575257B; RU2011147121A; ZA201108478B; UA109110C2; WO2010122110A1; CA2756146A1

Abstract

Die vorliegende Erfindung beschäftigt sich mit der Bereitstellung von Mitteln und Verfahren zur Genexpression. Im Genaueren betrifft sie ein Palynukleotid, das eine Expressionssteuerungssequenz umfasst, welche die samenspezifische Expression einer interessierenden Nukleinsäure, die funktionsfähig daran gebunden ist, in Pflanzen erlaubt. Ferner werden Vektoren, Wirtszellen, transgene Pflanzen und Verfahren zum Exprimieren von interessierenden Nukleinsäuren bereitgestellt, welche auf dem Polynukleotid basieren.

Description

Die vorliegende Erfindung beschäftigt sich mit der Bereitstellung von Mitteln und Verfahren zur Genexpression. Im Genaueren betrifft sie ein Polynukleotid, das eine Expressionssteuerungssequenz umfasst, welche die samenspezifische Expression einer interessierenden Nukleinsäure, die funktionsfähig daran gebunden ist, in Pflanzen erlaubt. Ferner werden Vektoren, Wirtszellen, transgene Pflanzen und Verfahren zum Exprimieren von interessierenden Nukleinsäuren bereitgestellt, welche auf dem Polynukleotid basieren.
Die Herstellung von transgenen Pflanzen ist eine fundamentale Technik der Pflanzenbiotechnologie und, somit, eine unverzichtbare Voraussetzung für die Grundlagenforschung an Pflanzen und für die Herstellung von Pflanzen mit verbesserten, neuen Eigenschaften für die Landwirtschaft, für die Erhöhung der Qualität von Lebensmitteln für Menschen oder für die Herstellung bestimmter Chemikalien oder Pharmazeutika. Eine grundsätzliche Vorbedingung für die transgene Expression bestimmter Gene in Pflanzen ist die Bereitstellung pflanzenspezifischer Promotoren. Es sind verschiedene Pflanzenpromotoren bekannt. Die konstitutiven Promotoren, welche derzeitig vorwiegend bei Pflanzen verwendet werden, sind fast ausschließlich virale Promotoren oder Promotoren, die aus Agrobacterium isoliert wurden, wie etwa der Blumenkohlmosaikvirus-Promotor CaMV355 (Odell et al. (1985) Nature 313: 810–812). Da Produktkonzepte und Transgen-Wirkungsweisen komplexer werden, ist die konstitutive Expression nicht länger das optimale gewünschte Expressionsmuster. Während z. B. die Manipulation von Stress-induzierten Genen eine wichtige Rolle bei der Verbesserung der Pflanzentoleranz gegenüber Stressformen spielen kann, ist es gezeigt worden, dass die konstitutive Expression von Stress-induzierbaren Genen eine erhebliche negative Auswirkung auf Pflanzenwachstum und -entwicklung hat, wenn der Stress nicht vorhanden ist (Kasuga et al., (1999) Nature Biotechnology 17 (3): 287–291). Deshalb werden Promotoren gewünscht, welche eine Expression antreiben, die zeitlich und/oder räumlich differenziert ist.
Bei Getreidenutzpflanzen von landwirtschaftlicher Bedeutung ist die Samenbildung das letztendliche Ziel der Pflanzenentwicklung. Samen werden zur Verwendung in Lebensmittel-, Futtermittel- und Industrieprodukten geerntet. Die Nützlichkeit und der Wert dieser Samen werden durch die Quantität und Qualität von Protein, Öl und Stärke, welche darin enthalten sind, bestimmt.
Samen monokotyler Pflanzen können als aus zwei Hauptkompartimenten aufgebaut betrachtet werden: dem Keim oder Embryo, der die Vorläufer- bzw. Progenitorzellen der Pflanze, welche sich aus dem Samen entwickeln wird, umfasst, und dem Endosperm, das als ein Speicher von Nährkomponenten dient (insbesondere gespeicherte Stärke, Proteine und Öl), welche während der Samenkeimung und Frühentwicklung des Pflänzchens aufgebraucht werden. Samen dikotyler Pflanzen sind großteils aus dem Keimanteil aufgebaut, da die nutritive Funktion in sich entwickelnden dikotylen Pflanzen aus Nährstoffspeichern außerhalb des Samens bereitgestellt wird.
Viele Promotoren sind identifiziert und charakterisiert worden, welche zum Antreiben der Transgenexpression in verschiedenen Kombinationen von räumlichen und zeitlichen Expressionsmustern in der Lage sind. Auch sind einige Promotoren, welche die Expression in Pflanzensamen regeln, im Fachgebiet bekannt. Die bekannten Promotoren lenken die Expression in Teilen von Pflanzensamen oder im gesamten Samen. Zum Beispiel wurde bei Promotoren von Samenspeicherproteinen gezeigt, dass sie die Expression im Samen zentral steuern. Zu diesen zählen Promotoren von Phaseolinen ( US 5 504 200 , Bustos M. M. et al., Plant Cell. 1989, 2 (9): 839–53), 25-Albumin (Joseffson L. G. et al., J. Biol. Chem. 1987, 262: 12196–12201), Legumin (Shirsat A et al., Mol Gen Genet. 1989, 215 (2): 326–331), USP (unbekanntes Samen-Protein; Bäumlein H, et al., Molecular & General Genetics 1991, 225 (3): 459–67), Napin (Stalberg K., et al., L. Planta 1996, 199: 515–519), Saccharose-Eindungs-Protein ( WO 00/26388 ) oder LeB4 (Baumlein H. et al., Mol Gen Genet 1991, 225: 121–128). Ein kryptischer Promotor mit Spezifität für die Kapsel wurde in Tabak mittels ”T-DNA-Tagging” identifiziert (Fobert P. R. et al., Plant Journal 1994, 6 (4): 567–77; US 5 824 863 ; WO 99153067 ).
Samenspezifische Promotoren, welche die Expression im gesamten Samen, und somit sowohl im Endosperm als auch im Embryo, lenken, sind nur für Dikotyle, und nicht für Monokotyle, beschrieben worden. Die einzigen verfügbaren Promotoren für Gesamtsamen-Expression bei Monokotylen sind konstitutive Promotoren, welche in beiden Haupt-Samenkompartimenten exprimieren, aber auch die Transgenexpression in den meisten oder allen anderen Geweben antreiben.
Hingegen sind Mittel und Verfahren für eine zuverlässig geregelte Expression von interessierenden Nukleinsäuren im Gesamtsamen von Monokotylen noch nicht verfügbar und sind in hohem Maße erwünscht.
Das dieser Erfindung zugrundeliegende technische Problem kann somit als die Bereitstellung von Mitteln und Verfahren angesehen werden, welche es erlauben, den oben erwähnten Anforderungen zu genügen. Das technische Problem wird durch die in den Ansprüchen und hierin nachstehend charakterisierten Ausführungsformen gelöst.
Demgemäß betrifft die vorliegende Erfindung ein Polynukleotid, das eine Expressionssteuerungssequenz umfasst, welche die samenspezifische Expression einer interessierenden Nukleinsäure, die funktionsfähig daran gebunden ist, in Pflanzen erlaubt, wobei die Expressionssteuerungssequenz aus der Gruppe gewählt ist, die aus Folgendem besteht:

(a) einer Expressionssteuerungssequenz mit einer Nukleinsäuresequenz, wie in einer beliebigen von SEQ ID Nr: 1 bis 3 gezeigt;
(b) einer Expressionssteuerungssequenz mit einer Nukleinsäuresequenz, welche mindestens 80% identisch zu einer Nukleinsäuresequenz ist, die in einer beliebigen von SEQ ID Nr: 1 bis 3 gezeigt ist;
(c) einer Expressionssteuerungssequenz mit einer Nukleinsäuresequenz, welche unter stringenten Bedingungen an eine Nukleinsäuresequenz, wie in einer beliebigen von SEQ ID Nr: 1 bis 3 gezeigt, hybridisiert;
(d) einer Expressionssteuerungssequenz mit einer Nukleinsäuresequenz, welche an eine Nukleinsäuresequenz hybridisiert, die stromaufwärts einer offenen Leserahmen-Sequenz, die in einer beliebigen von SEQ ID Nr: 4, 6 oder 8 gezeigt ist, lokalisiert ist;
(e) einer Expressionssteuerungssequenz mit einer Nukleinsäuresequenz, welche an eine Nukleinsäuresequenz hybridisiert, die stromaufwärts einer offenen Leserahmen-Sequenz lokalisiert ist, welche eine Aminosäuresequenz, wie in einer beliebigen von SEQ ID Nr: 5, 7 oder 9 gezeigt, codiert;
(f) einer Expressionssteuerungssequenz mit einer Nukleinsäuresequenz, welche an eine Nukleinsäuresequenz hybridisiert, die stromaufwärts einer offenen Leserahmen-Sequenz lokalisiert ist, welche mindestens 80% identisch zu einer offenen Leserahmen-Sequenz ist, wie in einer beliebigen von SEQ ID Nr: 4, 6 oder 8 gezeigt, wobei der offene Leserahmen ein Samenprotein codiert;
(g) einer Expressionssteuerungssequenz mit einer Nukleinsäuresequenz, welche an eine Nukleinsäuresequenz(en) hybridisiert, die stromaufwärts eines offenen Leserahmens lokalisiert ist, der eine Aminosäuresequenz codiert, welche mindestens 80% identisch zu einer Aminosäuresequenz ist, wie in einer beliebigen von SEQ ID Nr: 5, 7 oder 9 gezeigt, wobei der offene Leserahmen ein Samenprotein codiert;
(h) einer Expressionssteuerungssequenz, erhältlich durch 5'-Genom-Walking oder durch ”thermische asymmetrische verschachtelte” bzw. ”Thermal asymmetric interlaced” Polymerasekettenreaktion (TAIL-PCR) auf genomischer DNA aus dem ersten Exon einer offenen Leserahmen-Sequenz, wie in einer beliebigen von SEQ ID Nr: 4, 6 oder 8 gezeigt; und
(i) einer Expressionssteuerungssequenz, erhältlich durch 5'-Genom-Walking oder TAIL-PCR auf genomischer DNA aus dem ersten Exon einer offenen Leserahmen-Sequenz, welche mindestens 80% identisch zu einem offenen Leserahmen ist, wie in einer beliebigen von SEQ ID Nr: 4, 6 oder 8 gezeigt, wobei der offene Leserahmen ein Samenprotein codiert; und
(j) einer Expressionssteuerungssequenz, erhältlich durch 5'-Genom-Walking oder TAIL-PCR auf genomischer DNA aus dem ersten Exon einer offenen Leserahmen-Sequenz, welche eine Aminosäuresequenz codiert, die mindestens 80% identisch zu einer von einem offenen Leserahmen codierten Aminosäuresequenz ist, wie in einer beliebigen von SEQ ID Nr: 5, 7 oder 9 gezeigt, wobei der offene Leserahmen ein Samenprotein codiert.

Der begriff ”Polynukleotid”, wie hierin verwendet, bezieht sich auf ein lineares oder zirkuläres Nukleinsäuremolekül. Er beinhaltet vorzugsweise DNA-Moleküle. Das Polynukleotid der vorliegenden Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, dass es eine Expressionssteuerungssequenz umfassen soll, wie andernorts in dieser Patentbeschreibung definiert. Zusätzlich zu der Expressionssteuerungssequenz umfasst das Polynukleotid der vorliegenden Erfindung vorzugsweise ferner mindestens eine Nukleinsäure von Interesse, welche funktionsfähig an die Expressionssteuerungssequenz und/oder mindestens eine Terminationssequenz für Transkription verknüpft ist. Somit umfasst das Polynukleotid der vorliegenden Erfindung vorzugsweise eine Expressionskassette für die Expression mindestens einer Nukleinsäure von Interesse.
Anstatt einer Nukleinsäure von Interesse oder zusätzlich zur Nukleinsäure von Interesse, kann mindestens eine Expressionskassette auch eine Mehrfachklonierungsstelle und/oder eine Terminationssequenz für Transkription umfassen. In einem derartigen Fall ist die Mehrfachklonierungsstelle vorzugsweise auf eine solche Weise angeordnet, dass die funktionsfähige Verknüpfung einer in die Mehrfachklonierungsstelle einzubringenden Nukleinsäure mit der Expressionssteuerungssequenz gestattet wird. Zusätzlich zu den oben erwähnten Komponenten könnte das Polynukleotid der vorliegenden Erfindung vorzugsweise Komponenten umfassen, welche für eine homologe Rekombination erforderlich sind, d. h. flankierende genomische Sequenzen aus einem Ziel-Genort. Allerdings wird auch ein Polynukleotid in Betracht gezogen, das im Wesentlichen aus der Expressionssteuerungssequenz besteht.
Der Begriff ”Expressionssteuerungssequenz”, wie hierin verwendet, bezieht sich auf eine Nukleinsäure, welche zum Regeln der Expression einer anderen Nukleinsäure, die funktionsfähig daran verknüpft ist, in der Lage ist, z. B. einer interessierenden Nukleinsäure, auf die an anderer Stelle in dieser Beschreibung ausführlich Bezug genommen wird. Eine Expressionssteuerungssequenz, wie in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung darauf Bezug genommen wird, umfasst vorzugsweise Sequenzmotive, welche von Polypeptiden, d. h. Transkriptionsfaktoren, erkannt und gebunden werden. Die Transkriptionsfaktoren sollen nach dem Binden RNA-Polymerasen rekrutieren bzw. anziehen, vorzugsweise RNA-Polymerase I, II oder III, weiter bevorzugt RNA-Polymerase II oder III, und am meisten bevorzugt RNA-Polymerase II. Dadurch wird die Expression einer funktionsfähig an die Expressionssteuerungssequenz verknüpften Nukleinsäure initiiert. Es versteht sich, dass abhängig vom Typ der zu exprimierenden Nukleinsäure, d. h. der Nukleinsäure von Interesse, Expression, wie hierin gemeint, die Transkription von RNA-Polynukleotiden aus der Nukleinsäuresequenz umfassen kann (wie z. B. geeignet für Antisense-Vorgehensweisen oder RNAi-Vorgehensweisen) oder die Transkription von RNA-Polynukleotiden, gefolgt von Translation der RNA-Polynukleotide in Polypeptide, umfassen kann (wie z. B. geeignet für Genexpression und rekombinante Polypeptidherstellungs-Vorgehensweisen). Um die Expression einer Nukleinsäure zu lenken, kann die Expressionssteuerungssequenz unmittelbar benachbart der zu exprimierenden Nukleinsäure lokalisiert sein, d. h. mit der Nukleinsäure an ihrem 5'-Ende physikalisch verknüpft sein. Alternativ dazu kann sie in physikalischer Nähe lokalisiert sein. Im letzteren Falle muss die Sequenz jedoch so lokalisiert sein, dass eine funktionelle Wechselwirkung mit der zu exprimierenden Nukleinsäure zugelassen wird. Eine Expressionssteuerungssequenz, auf die hierin Bezug genommen wird, umfasst vorzugsweise eine Länge von zwischen 200 und 5000 Nukleotiden. Weiter bevorzugt umfasst sie zwischen 500 und 2500 Nukleotide und, noch bevorzugter, zwischen 1000 und 1500 Nukleotide. Wie zuvor erwähnt, umfasst eine Expressionssteuerungssequenz vorzugsweise eine Vielzahl von Sequenzmotiven, welche für die Transkriptionsfaktor-Bindung oder zur Verleihung einer bestimmten Struktur an das Polynukleotid, welches die Expressionssteuerungssequenz umfasst, erforderlich sind. Sequenzmotive werden manchmal auch als cis-regulatorische Elemente bezeichnet und schließen, wie hierin gemeint, Promotorelemente sowie Enhancer-Elemente ein. Die Expressionssteuerungssequenz der vorliegenden Erfindung erlaubt samenspezifische Expression und umfasst daher cis-regulatorische Elemente, welche RNA-Polymerasen in dem Gewebe rekrutieren können, so dass eine gewebespezifische Transkription von Nukleinsäuren ermöglicht wird, welche funktionsfähig an die Expressionssteuerungssequenz verknüpft sind. Bevorzugte Expressionssteuerungssequenzen, die in ein Polynukleotid der vorliegenden Erfindung eingeschlossen werden sollen, besitzen eine Nukleinsäuresequenz, wie in einer beliebigen von SEQ ID Nr: 1 bis 3 gezeigt.
Weiter bevorzugt, weist eine Expressionssteuerungssequenz, die von einem Polynukleotid der vorliegenden Erfindung enthalten wird, eine Nukleinsäuresequenz auf, die an eine Nukleinsäuresequenz(en) hybridisiert, die stromaufwärts einer offenen Leserahmen-Sequenz lokalisiert ist, welche in einer beliebigen von SEQ ID Nr: 4, 6 oder 8 gezeigt ist, d. h. eine Varianten-Expressionssteuerungssequenz ist. Es versteht sich, dass Expressionssteuerungssequenzen aufgrund allelischer Variationen hinsichtlich ihrer Sequenzen geringfügig unterschiedlich sein können. Folglich betrachtet die vorliegende Erfindung auch eine Expressionssteuerungssequenz, welche aus einer Expressionssteuerungssequenz abgeleitet sein kann, wie in einer beliebigen von SEQ ID Nr: 1 bis 3 gezeigt. Die Expressionssteuerungssequenzen sind in der Lage zur Hybridisierung, vorzugsweise unter stringenten Bedingungen, an die Stromaufwärts-Sequenzen der offenen Leserahmen, die in einer beliebigen von SEQ ID Nr. 5, 6 oder 8 gezeigt sind, d. h. an die Expressionssteuerungssequenzen, die in einer beliebigen von SEQ ID Nr.: 1 bis 3 gezeigt sind. Stringente Hybridisierungsbedingungen, wie hierin gemeint, sind vorzugsweise Hybridisierungsbedingungen in 6 × Natriumchlorid/Natriumcitrat (SSC) bei ungefähr 45°C, gefolgt von einem oder mehreren Waschschritten in 0,2 × SSC, 0,1% SDS bei 53 bis 65°C, vorzugsweise bei 55°C, 56°C, 57°C, 58°C, 59°C, 60°C, 61°C, 62°C, 63°C, 64°C oder 65°C. Der Fachmann weiss, dass diese Hybridisierungsbedingungen abhängig vom Typ der Nukleinsäure, und beispielsweise beim Vorhandensein organischer Lösungsmittel, in Hinsicht auf die Temperatur und Konzentration des Puffers abweichen. Zum Beispiel variiert unter ”Standard-Hybridisierungsbedingungen” die Temperatur abhängig vom Typ der Nukleinsäure zwischen 42°C und 58°C in wässrigem Puffer bei einer Konzentration von 0,1 bis 5 × SSC (pH 7,2). Wenn organisches Lösungsmittel in dem oben erwähnten Puffer vorhanden ist, zum Beispiel 50% Formamid, beträgt die Temperatur unter Standardbedingungen ungefähr 42°C. Die Hybridisierungsbedingungen für DNA:DNA-Hybride sind vorzugsweise zum Beispiel 0,1 × SSC und 20°C bis 45°C, vorzugsweise zwischen 30°C und 45°C. Die Hybridisierungsbedingungen für DNA:RNA-Hybride sind vorzugsweise zum Beispiel 0,1 × SSC und 30°C bis 55°C, vorzugsweise zwischen 45°C und 55°C. Die oben erwähnten Hybridisierungstemperaturen werden zum Beispiel für eine Nukleinsäure mit ungefähr 100 bp (Basenpaaren) Länge und einem G + C-Gehalt von 50% in Abwesenheit von Formamid bestimmt. Derartige hybridisierenden Expressionssteuerungssequenzen sind weiter bevorzugt mindestens 70%, mindestens 80%, mindestens 90%, mindestens 91%, mindestens 92%, mindestens 93%, mindestens 94%, mindestens 95%, mindestens 96%, mindestens 97%, mindestens 98% oder mindestens 99% identisch zu den Expressionssteuerungssequenzen, wie in einer beliebigen von SEQ ID Nr.: 1 bis 3 gezeigt. Die prozentualen Identitätswerte werden vorzugsweise über die gesamte Nukleinsäuresequenzregion hinweg berechnet. Eine Reihe von Programmen, die auf einer Vielzahl an Algorithmen basiert, steht dem Fachmann für das Vergleichen verschiedener Sequenzen zur Verfügung. In diesem Kontext ergeben die Algorithmen von Needleman und Wunsch oder Smith und Waterman besonders zuverlässige Ergebnisse. Zur Ausführung der Sequenzalignments sind das Programm PileUp (J. Mol. Evolution., 25, 351–360, 1987, Higgins 1989, CABIOS, 5: 151–153) oder die Programme Gap und BestFit (Needleman 1970 J. Mol. Biol. 48; 443–453 und Smith 1981, Adv. Appl. Math. 2; 482–489), welche Teil des GCG-Softwarepakets (Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711 Version 1991) sind, zu verwenden. Die oben in Prozentsätzen (%) aufgeführten Sequenzidentitätswerte sollen vorzugsweise mit Hilfe des Programms GAP über die gesamte Sequenzregion hinweg mit den folgenden Einstellungen bestimmt werden: Lücken-Gewichtung: 50, Längen-Gewichtung: 3, Mittelwert Übereinstimmung: 10,000 und Mittelwert Fehlpaarung: 0,000, welche als Standardeinstellungen für Sequenzalignments immer zu verwenden sind, außer es ist anderslautend angegeben.
Zudem können Expressionssteuerungssequenzen, welche eine samenspezifische Expression erlauben, nicht nur stromaufwärts der oben erwähnten offenen Leserahmen mit einer Nukleinsäuresequenz, wie in einer beliebigen von SEQ ID Nr. 4, 6 oder 8 gezeigt, gefunden werden. Vielmehr können Expressionssteuerungssequenzen, welche eine samenspezifische Expression erlauben, auch stromaufwärts von orthologen, paralogen oder homologen Genen (d. h. offenen Leserahmen) gefunden werden. Somit weist, ebenfalls vorzugsweise, eine Varianten-Expressionssteuerungssequenz, welche von einem Polynukleotid der vorliegenden Erfindung beinhaltet wird, eine Nukleinsäuresequenz auf, welche an eine Nukleinsäuresequenz hybridisiert, die stromaufwärts einer offenen Leserahmen-Sequenz lokalisiert ist, die mindestens 70%, weiter bevorzugt mindestens 80%, mindestens 90%, mindestens 91%, mindestens 92%, mindestens 93%, mindestens 94% mindestens 95%, mindestens 96%, mindestens 97%, mindestens 98% oder mindestens 99% identisch zu einer Sequenz ist, wie in einer beliebigen von SEQ ID Nr: 4, 6 oder 8 gezeigt. Der variante offene Leserahmen soll ein Polypeptid codieren, das die biologische Aktivität des entsprechenden Polypeptids besitzt, welches von dem offenen Leserahmen codiert wird, der in einer beliebigen von SEQ ID Nr.: 4, 6 oder 8 gezeigt ist. In diesem Kontext sollte erwähnt werden, dass der in SEQ ID NR: 4 gezeigte offene Leserahmen ein Polypeptid mit der in SEQ ID NR: 5 gezeigten Aminosäuresequenz codiert und vorzugsweise ein Samenprotein codiert. Der in SEQ ID NR: 6 gezeigte offene Leserahmen codiert ein Polypeptid mit der in SEQ ID NR: 7 gezeigten Aminosäuresequenz und codiert vorzugsweise ein Samenprotein, genauer gesagt ein Tonoplasten-Intrinsisches-Protein 3-1. Der in SEQ ID NR: 8 gezeigte offene Leserahmen codiert ein Polypeptid mit der in SEQ ID NR: 9 gezeigten Aminosäuresequenz und codiert vorzugsweise ein Samenprotein.
Gleichfalls bevorzugt ist eine Varianten-Expressionssteuerungssequenz, die von einem Polynukleotid der vorliegenden Erfindung enthalten wird, (i) durch 5'-Genom-Walking oder TAIL-PCR von einer offenen Leserahmen-Sequenz aus, wie in einer beliebigen von SEQ ID Nr: 4, 6 oder 8 gezeigt, erhältlich oder (ii) durch 5'-Genom-Walking oder TAIL-PCR von einer offenen Leserahmen-Sequenz aus erhältlich, die mindestens 80% identisch zu einein offenen Leserahmen ist, wie in einer beliebigen von SEQ ID Nr: 4, 6 oder 8 gezeigt. Varianten-Expressionssteuerungssequenzen sind ohne weitere Umstände durch die Genom-Walking-Technologie oder durch ”Thermal asymmetric interlaced”-Polymerasekettenreaktion (TAIL-PCR) erhältlich, welche wie in den begleitenden Beispielen beschrieben, z. B. unter Verwendung kommerziell verfügbarer Kits, durchgeführt werden kann.
Varianten-Expressionssteuerungssequenzen, auf die in dieser Beschreibung Bezug genommen wird, für die in SEQ ID NR: 1 gezeigte Expressionssteuerungssequenz umfassen vorzugsweise mindestens 10, mindestens 20, mindestens 30 oder alle der in Tabelle 4 aufgeführten Sequenzmotive. Varianten-Expressionssteuerungssequenzen, auf die in dieser Beschreibung Bezug genommen wird, für die in SEQ ID NR: 2 gezeigte Expressionssteuerungssequenz umfassen vorzugsweise mindestens 10, mindestens 20, mindestens 30, mindestens 40, mindestens 50 oder alle der in Tabelle 9 aufgeführten Sequenzmotive. Varianten-Expressionssteuerungssequenzen, auf die in dieser Beschreibung Bezug genommen wird, für die in SEQ ID NR: 3 gezeigte Expressionssteuerungssequenz umfassen vorzugsweise mindestens 10, mindestens 20, mindestens 30, mindestens 40, mindestens 50 oder alle der in Tabelle 10 aufgeführten Sequenzmotive.
Beispiele für bevorzugte Varianten-Expressionssteuerungssequenzen sind in SEQ ID Nr: 120, 121 und 122 (Varianten von SEQ ID NR: 3), in SEQ ID Nr: 123 und 124 (Varianten von SEQ ID NR: 2), und in den SEQ ID Nr: 125, 126 und 127 (Varianten von SEQ ID NR: 1) gezeigt. Im Vergleich zu den entsprechenden Expressionssteuerungssequenzen, umfassen die oben genannten Varianten (wie in SEQ ID Nr 120 bis 127 gezeigt) keine Startcodons (ATG). Die Startcodons sind entweder ersetzt durch BVH oder durch BVH plus einem Stopcodon zwischen beliebigen zwei Startcodons (gemäß der IUPAC-Nomenklatur: B steht für C oder G oder T, V steht für A oder C oder G, und H steht für A oder C oder T). Somit kann eine Varianten-Expressionssteuerungssequenz durch Mutieren von putativen Startcodons, wie oben beschrieben, erhalten werden. Weitere Beispiele für Varianten-Expressionssteuerungssequenzen sind in den SEQ ID Nr: 129, 130 und 131 (Varianten von SEQ ID NR: 1) gezeigt. Die oben erwähnten Expressionssteuerungssequenzen umfassen keine kurzen offenen Leserahmen, die Homologie zu toxischen oder allergenen Peptiden oder Polypeptiden aufzeigen (siehe Beispiel 3).
Es ist zu verstehen, dass nicht-essentielle Sequenzen der Expressionssteuerungssequenz der Erfindung ohne signifikante Beeinträchtigung der erwähnten Eigenschaften deletiert werden können. Die Eingrenzung der Expressionssteuerungssequenz auf besondere, essentielle regulatorische Regionen kann ebenfalls mit Hilfe eines Computerprogramms, wie dem PLACE-Programm (”Plant Cis-acting Regulatory DNA Elements”) (Higo K et al. (1999) Nucleic Acids Res 27: 1, 297–300) oder der BIOBASE-Datenbank ”Transfac” (Biologische Datenbanken GmbH, Braunschweig) vorgenommen werden. Durch derartige Maßnahmen können Varianten-Expressionssteuerungssequenzen, wie oben angegeben, künstlich erzeugt werden. Darüber hinaus sind dem Fachmann Verfahren zum Mutagenisieren von Nukleinsäuresequenzen bekannt und schließen z. B. die Verwendung von Oligonukleotiden mit einer oder mehreren Mutationen im Vergleich zu der zu mutierenden Region (z. B. innerhalb des Rahmens einer ortsspezifischen Mutagenese) ein. Primer von ungefähr 15 bis ungefähr 75 Nukleotiden, oder mehr, werden typischerweise verwendet, wobei vorzugsweise etwa 10 bis etwa 25 oder mehr Nukleotidreste auf beiden Seiten einer zu modifizierenden Sequenz lokalisiert sind. Einzelheiten und Vorgehensweise für die Mutagenese-Verfahren sind dem Fachmann vertraut (Kunkel et al. (1987) Methods Enzymol 154: 367–382; Tomic et al. (1990) Nucl Acids Res 12: 1656; Upender et al. (1995) Biotechniques 18 (1): 29–30; U. S. Pat. Nr. 4 237 224 ). Eine Mutagenese kann auch durch Behandlung von, zum Beispiel, Vektoren, welche die Expressionssteuerungssequenz der Erfindung umfassen, mit mutagenisierenden Agentien, wie Hydroxylamin, erreicht werden. Auch Mutagenese ergibt Varianten-Polynukleotide der Erfindung, wie oben beschrieben.
Die von dem Polynukleotid der vorliegenden Erfindung enthaltene Expressionssteuerungssequenz erlaubt eine samenspezifische Expression. Insbesondere erlaubt die Expressionssteuerungssequenz die spezifische Expression sowohl im Embryo als auch dem Endosperm des Samens und somit im gesamten Samen. Daher bezieht sich ”Samen”, wie hierin verwendet, vorzugsweise auf Endosperm und embryonale Gewebe. Vorzugsweise erlaubt die Expressionssteuerungssequenz gemäß der vorliegenden Erfindung die samenspezifische Expression bei allen Stadien der Samenentwicklung (z. B. in Maissamen bis zu 35 bis 40 Tage nach Bestäubung, siehe Beispiele). Außerdem kann die Expressionssteuerungssequenz auch eine Expression in Pollen erlauben (siehe Beispiele). ”Spezifisch” im Sinne der Erfindung bedeutet, dass die Nukleinsäuren von Interesse, welche funktionsfähig mit der hierin erläuterten Expressionssteuerungssequenz verknüpft sind, hauptsächlich (d. h. bevorzugt) in den angegebenen Geweben oder Zellen exprimiert werden, wenn sie in einer Pflanze vorliegen. Es versteht sich, dass üblicherweise eine ausschließliche Expression in einem Gewebe von einem gewebespezifischen Promotor nicht erreicht wird. Vielmehr scheint ein gewebespezifischer Promotor in manchen Geweben bevorzugt angeschaltet zu werden, während er nichtsdestoweniger noch eine gewisse Hintergrundaktivität in anderen Geweben aufweist. Dieses Phänomenon ist als Leckexpression bekannt. Allerdings ist mit spezifischer Expression in dieser Erfindung die überwiegende Expression in dem hierin angegebenen Pflanzengewebe gemeint. Eine überwiegende Expression, wie hierin gemeint, ist durch eine statistisch signifikant höhere Menge an nachweisbarer Transkription in dem Gewebe oder den Zellen im Hinblick auf andere Pflanzengewebe gekennzeichnet. Ein statistisch signifikanter höherer Expressionsspiegel ist vorzugsweise eine Menge, die mindestens das zweifache, dreifache, vierfache, fünffache, zehnfache, hundertfache, fünfhundertfache oder tausendfache des Spiegels ist, der in mindestens einem der anderen Gewebe mit nachweisbarer Transkription gefunden wird. Alternativ dazu ist sie eine Expression in dem angegebenen Gewebe oder der angegebenen Zelle, wodurch der Spiegel der Expression in anderen Geweben oder Zellen geringer als 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10% oder, am meisten bevorzugt, 15% des insgesamten (ganze Pflanze) Spiegels der Expression ist. Der Spiegel der Expression ist direkt mit der Menge an Transkripten (d. h. RNA) oder von den Transkripten codierten Polypeptiden korreliert, welche in einer Zelle oder einem Gewebe vorhanden ist. Geeignete Techniken zur Messung der Transkription entweder auf Basis von RNA oder Polypeptiden sind im Fachgebiet allgemein bekannt. Gewebe- oder Zellspezifität bedeutet, alternativ und vorzugsweise zusätzlich zum oben genannten, dass die Expression auf das angegebene Gewebe oder die angegebenen Zellen begrenzt oder beinahe begrenzt ist, d. h. es gibt im Wesentlichen keine nachweisbare Transkription in anderen Geweben. Beinahe begrenzt, wie hierin gemeint, bedeutet, dass unspezifische Expression in weniger als zehn, weniger als fünf, weniger als vier, weniger als drei, weniger als zwei oder einem anderen Gewebe(n) nachweisbar ist.
Samenspezifische Expression kann zum Beispiel durch Vergleichen der Expression einer Nukleinsäure von Interesse, z. B. eines Reportergens, wie [beta]-Glucuronidase (GUS), das funktionsfähig mit der Expressionssteuerungssequenz verknüpft ist, in den folgenden Geweben und Entwicklungsstadien bestimmt werden: 1) Wurzeln und Blätter im 5-Blatt-Stadium, 2) Stengel im V-7-Stadium, 3) Blätter, Spelze bzw. Hülse und Seidenfädenbart im Blütestadium, 4) Ährchen/Quaste bei Bestäubung, 5) Ähre oder Körner nach 5, 10, 15, 20 und 25 Tagen nach der Bestäubung (siehe auch Beispiele). Vorzugsweise kann die Expression der interessierenden Nukleinsäure in der Ähre oder den Körnern bei 5, 10, 15, 20 und 25 Tagen nach der Bestäubung in dem Assay bestimmt werden, wie in den begleitenden Figuren gezeigt. Die Expression der Nukleinsäure von Interesse kann durch verschiedene gut bekannte Techniken, z. B. durch Northern-Blut oder In-situ-Hybridisierungstechniken, wie in WO 02/102970 beschrieben, und vorzugsweise wie in den begleitenden Beispielen beschrieben, bestimmt werden. Transgene Pflanzen für das Analysieren der samenspezifischen Expression können auch durch Techniken, die dem Fachmann auf dem Gebiet allgemein bekannt sind, und wie andernorts in dieser Patentschrift erörtert erzeugt werden.
Der Begriff ”interessierende Nukleinsäure” bezieht sich auf eine Nukleinsäure, welche unter der Steuerung der Expressionssteuerungssequenz exprimiert werden soll, auf die hierin Bezug genommen wird. Vorzugsweise codiert eine interessierende Nukleinsäure ein Polypeptid, dessen Gegenwart in einer Zelle oder Pflanze, wie hierin darauf Bezug genommen wird, und, insbesondere, in einem Pflanzensamen, erwünscht ist. Ein derartiges Polypeptid könnte ein beliebiges funktionell aktiv oder inertes Protein sein, welches sich im Samen akkumuliert und/oder nach seiner Expression einen nutzbringenden Effekt an die Pflanze oder den Samen verleiht. Es versteht sich, dass wenn die Nukleinsäure von Interesse ein Polypeptid codiert, die Transkription der Nukleinsäure in RNA und die Translation der transkribierten RNA in das Polypeptid erforderlich sein können. Eine Nukleinsäure von Interesse schließt ebenso bevorzugt biologisch aktive RNA-Moleküle und weiter bevorzugt Antisense-RNAs, Ribozyme, Mikro-RNAs oder siRNAs ein. Die biologisch aktiven RNA-Moleküle können verwendet werden, um die Menge eines Zielpolypeptids, das in einer Zelle oder Pflanze vorhanden ist, zu modifizieren. Zum Beispiel kann eine unerwünschte enzymatische Aktivität in einem Samen aufgrund der samenspezifischen Expression von Antisense-RNAs, Ribozymen, MikroRNAs oder siRNAs verringert werden. Die zugrundeliegenden biologischen Wirkungsprinzipien der oben erwähnten biologisch aktiven RNA-Moleküle sind im Fachgebiet allgemein bekannt. Außerdem weiß der Fachmann auf dem Gebiet durchaus, wie man Nukleinsäuren erhält, welche solche biologisch aktiven RNA-Moleküle codieren. Es versteht sich, dass die biologisch aktiven RNA-Moleküle direkt durch Transkription der interessierenden Nukleinsäure, d. h. ohne Translation in ein Polypeptid, erhalten werden können. Vorzugsweise ist mindestens eine interessierende Nukleinsäure, die unter der Steuerung der Expressionssteuerungssequenz der vorliegenden Erfindung exprimiert werden soll, heterolog bezüglich der Expressionssteuerungssequenz, d. h. sie steht nicht von Natur aus unter der Steuerung derselben, sondern die Steuerung ist auf eine nicht-natürliche Weise erzeugt worden (zum Beispiel durch gentechnische Verfahren).
Der Begriff ”funktionsfähig verknüpft”, wie hierin verwendet, bedeutet, dass die Expressionssteuerungssequenz der vorliegenden Erfindung und eine Nukleinsäure von Interesse so verknüpft sind, dass die Expression von der Expressionssteuerungssequenz gelenkt werden kann, d. h. die Expressionssteuerungssequenz soll funktionell mit der zu exprimierenden Nukleinsäuresequenz verknüpft sein. Demgemäß können die Expressionssteuerungssequenz und die zu exprimierende Nukleinsäuresequenz physikalisch aneinander verknüpft sein, z. B. durch Inserieren der Expressionssteuerungssequenz am 5'-Ende der zu exprimierenden Nukleinsäuresequenz. Alternativ dazu, können die Expressionssteuerungssequenz und die zu exprimierende Nukleinsäure lediglich in physikalischer Nähe vorliegen, so dass die Expressionssteuerungssequenz zum Regeln der Expression von mindestens einer Nukleinsäuresequenz von Interesse in der Lage ist. Die Expressionssteuerungssequenz und die zu exprimierende Nukleinsäure sind vorzugsweise durch nicht mehr als 700 bp, 500 bp, 300 bp, 100 bp, 80 bp, 60 bp, 40 bp, 20 bp, 10 bp oder 5 bp getrennt.
In den der vorliegenden Erfindung zugrundeliegenden Untersuchungen ist es in vorteilhafter Weise festgestellt worden, dass eine (gesamt)samenspezifische Expression einer Nukleinsäure von Interesse zuverlässig durch Exprimieren der Nukleinsäuren von Interesse unter der Steuerung einer Expressionssteuerungssequenz aus Mais oder einer Varianten-Expressionssteuerungssequenz, wie oben beschrieben, erreicht werden kann (siehe z. B. Tabellen 4A, 11 und 12). Dank der vorliegenden Erfindung ist es möglich, (i) biochemische Prozesse in Samengeweben spezifisch zu manipulieren, z. B. durch Exprimieren heterologer Enzyme oder biologisch aktiver RNAs, wie oben angegeben, oder (ii) heterologe Proteine in den Samengeweben zu produzieren. Im Prinzip betrachtet die vorliegende Erfindung die Verwendung des Polynukleotids, des Vektors, der Wirtszelle oder der Pflanze für die Expression einer Nukleinsäure von Interesse. Im Stand der Technik beschriebene samenspezifische Promotoren vermitteln nur eine Expression in dem Embryo oder dem Endosperm des Samens einer Monokotylen anstatt im gesamten Samen.
Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls einen Vektor, der das Polynukleotid der vorliegenden Erfindung umfasst.
Der Begriff ”Vektor” beinhaltet vorzugsweise Plasmide, Expressionsvektoren, T-DNA-Vektoren sowie künstliche Chromosomen, wie etwa künstliche Bakterien- oder Hefe-Chromosomen. Darüber hinaus betrifft der Begriff auch Targeting-Konstrukte, welche die zufallsmäßige oder ortsgerichtete Integration des Targeting-Konstrukts in genomische DNA erlauben. Derartige Targeting-Konstrukte umfassen vorzugsweise DNA von ausreichender Länge für entweder homologe oder heterologe Rekombination, wie nachstehend ausführlich beschrieben. Der Vektor, welcher die Polynukleotide der vorliegenden Erfindung beinhaltet, umfasst vorzugsweise ferner selektierbare Marker für die Vermehrung und/oder Selektion in einem Wirt. Der Vektor kann durch verschiedene im Fachgebiet allgemein bekannte Verfahren in eine Wirtszelle eingebracht werden. Wenn er in eine Wirtszelle eingebracht wurde, kann der Vektor im Cytoplasma vorliegen oder kann in das Genom eingebaut werden. Im letztgenannten Fall versteht es sich, dass der Vektor ferner Nukleinsäuresequenzen umfassen kann, welche eine homologe Rekombination oder heterologe Insertion erlauben. Vektoren können in prokaryotische oder eukaryotische Zellen durch herkömmliche Transformations- oder Transfektionstechniken eingebracht werden. Die Begriffe ”Transformation” und ”Transfektion”, Konjugation und Transduktion, wie im vorliegenden Kontext verwendet, umfassen beabsichtigtermaßen eine Vielzahl von Verfahren des Stands der Technik zur Einbringung von Fremdnukleinsäure (zum Beispiel DNA) in eine Wirtszelle, einschließlich Calciumphosphat-, Rubidiumchlorid- oder Calciumchlorid-Copräzipitation, DEAE-Dextran-vermittelter Transfektion, Lipofektion, natürlicher Kompetenz, Kohlenstoff-basierten Clusters, chemisch vermitteltem Transfer, Elektroporation oder Partikelbeschuß (z. B. ”Gen-Kanone”). Geeignete Verfahren zur Transformation oder Transfektion von Wirtszellen, einschließlich Pflanzenzellen, können in Sambrook et al. ("Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) und anderen Laboratoriums-Handbüchern, wie Methods in Molecular Biology, 1995, Bd. 44, "Agrobacterium protocols", Hrsg.: Gartland und Davey, Humana Press, Totowa, New Jersey, gefunden werden.
Vorzugsweise ist der Vektor, auf den hierin Bezug genommen wird, als ein Klonierungsvektor geeignet, d. h. in mikrobiellen Systemen replizierbar. Derartige Vektoren gewähren eine effiziente Klonierung in Bakterien und, vorzugsweise, Hefen oder Pilzen und machen die stabile Transformation von Pflanzen möglich. ”Klonierungsvektoren” enthalten typischerweise Restriktionsendonuklease-Erkennungsstellen, an denen Fremd-DNA-Sequenzen in einer bestimmbaren Weise ohne Verlust der essentiellen biologischen Funktion des Vektors inseriert werden können, sowie ein Markergen, das zur Verwendung bei der Identifizierung und Selektion von Zellen, die mit dem Klonierungsvektor transformiert sind, geeignet ist. Markergene schließen typischerweise Gene ein, welche z. B. Kanamycin-Resistenz, Streptomycin-Resistenz, Spectinomycin-Resistenz, Tetracyclin-Resistenz, Hygromycin-Resistenz oder Ampicillin-Resistenz bereitstellen.
Diejenigen Vektorsysteme, die erwähnt werden müssen, sind insbesondere verschiedene binäre und co-integrierte Vektorsysteme, welche für die T-DNA-vermittelte Transformation geeignet sind. Solche Vektorsysteme sind, in der Regel, dadurch gekennzeichnet, dass sie mindestens die vir-Gene, welche für the Agrobacterium-vermittelte Transformation erforderlich sind, und die Sequenzen, welche die T-DNA umgrenzen (T-DNA-Border), enthalten. Diese Vektorsysteme umfassen vorzugsweise ebenfalls weitere cis-regulatorische Regionen, wie Promotoren und Terminatoren, und/oder Selektionsmarker, mit denen geeignete transformierte Wirtszellen oder -organismen identifiziert werden können. Während bei co-integrierten Vektorsystemen vir-Gene und T-DNA-Sequenzen auf demselben Vektor angeordnet sind, basieren binäre Systeme auf mindestens zwei Vektoren, von denen einer vir-Gene aber keine T-DNA trägt, während ein zweiter T-DNA aber keine vir-Gene trägt. Als Konsequenz sind die zuletzt erwähnten Vektoren relativ klein, leicht zu manipulieren und können sowohl in E. coli als auch in Agrobacterium repliziert werden. Diese binären Vektoren schließen Vektoren aus den pBIB-HYG-, pPZP-, pBecks, pGreen-Serien ein. In Übereinstimmung mit der Erfindung werden vorzugsweise pBin19, pB1101, pBinAR, pGPTV, pSUN, pPZP und pCAMBIA verwendet. Eine Übersicht über binäre Vektoren und ihre Anwendung kann in Hellens et al., Trends in Plant Science (2000) 5, 446–451, gefunden werden. Ferner kann durch Verwendung passender Klonierungsvektoren das Polynukleotid der Erfindung in Wirtszellen und/oder Pflanzen eingeführt werden und, somit bei der Transformation von Pflanzen verwendet werden, wie jenen, welche veröffentlicht und zitiert sind, in: Plant Molecular Biology and Biotechnology (CRC Press, Boca Raton, Florida), Kapitel 6/7, S. 71–119 (1993); F. F. White, Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; in: Transgenic Plants, Bd. 1, Engineering and Utilization, Hrsg.: Kung und R. Wu, Academic Press, 1993, 15–38; B. Jenes et al., Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Bd. 1, Engineering and Utilization, Hrsg.: Kung und R. Wu, Academic Press (1993), 128–143; Potrykus, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42 (1991), 205–225.
Beispiele von Pflanzenexpressionsvektoren umfassen diejenigen, welche ausführlich beschrieben sind in: Becker, D., Kemper, E., Schell, J., und Masterson, R. (1992) "New plant binary vectors with selectable markers located proximal to the left border", Plant Mol. Biol. 20: 1195–1197; und Bevan, M. W. (1984) "Binary Agrobacterium vectors for plant transformation", Nucl. Acids Res. 12: 8711–8721; Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; in: Transgenic Plants, Bd. 1, Engineering and Utilization, Hrsg.: Kung und R. Wu, Academic Press, 1993, S. 15–38. Eine Pflanzenexpressionskassette umfasst vorzugsweise regulatorische Sequenzen, welche zum Steuern der Genexpression in Pflanzenzellen in der Lage sind und welche funktionell so verknüpft sind, dass jede Sequenz ihre Funktion, wie etwa transkriptionelle Termination, erfüllen kann, zum Beispiel Polyadenylierungssignale. Bevorzugte Polyadenylierungssignale sind diejenigen, die aus Agrobacterium tumefaciens-T-DNA, wie dem Gen 3 des Ti-Plasmids pTiACH5, welches als Octopin-Synthase bekannt ist (Gielen et al., EMBO J. 3 (1984) 835 ff.), abgeleitet sind, oder funktionelle Äquivalente von diesen, wobei jedoch alle anderen Terminatoren, die in Pflanzen funktionell aktiv sind, ebenfalls geeignet sind. Da die Pflanzengenexpression sehr oft nicht auf transkriptionelle Spiegel beschränkt ist, umfasst eine Pflanzenexpressionskassette vorzugsweise andere funktionell verknüpfte Sequenzen, wie Translationsenhancer, zum Beispiel die ”Overdrive”-Sequenz, welche die 5'-untranslatierte Tabakmosaikvirus-Leadersequenz umfasst, die das Protein/RNA-Verhältnis erhöht (Gallie et al., 1987, Nucl. Acids Research 15: 8693–8711). Andere bevorzugte Sequenzen zur Verwendung in funktioneller Verknüpfung in Pflanzen-Genexpressionskassetten sind Targeting-Sequenzen, welche für das Targeting bzw. den gezielten Transport des Genprodukts der interessierenden Nukleinsäure in sein relevantes Zellkompartment (für einen Überblickartikel siehe Kermode, Crit. Rev. Plant Sci. 15, 4 (1996) 285–423 und darin zitierte Bezugsstellen), zum Beispiel in die Vakuole, den Zellkern, alle Typen von Plastiden, wie Amyloplasten, Chromoplasten, den extrazellulären Raum, die Mitochondrien, das endoplasmatische Retikulum, Ölkörperchen, Peroxisomen und andere Kompartimente von Pflanzenzellen, erforderlich sind.
Es versteht sich, dass ein binärer Vektor oder jedweder andere Vektor durch gewöhnliche DNA-Rekombinationstechniken modifiziert, in E. coli vermehrt, und in Agrobacterium z. B. durch Elektroporation oder andere Transformationstechniken eingebracht (Mozo und Hooykaas, Plant Mol. Biol. 16: 917–918 (1991)) werden können.
Die vorliegende Erfindung betrachtet auch eine Wirtszelle, welche das Polynukleotid oder den Vektor der vorliegenden Erfindung umfasst.
Wirtszellen sind vorzugsweise transgene Zellen oder Zelllinien, die aus Pflanzen abgeleitet sind. Weiter bevorzugt sind die Wirtszellen aus monokotylen Pflanzen abgeleitet. Bevorzugte monokotyle Pflanzen sind an anderer Stelle hierin beschrieben. Die aus Pflanzen abgeleiteten Wirtszellen umfassen Zellen von bestimmten Geweben, Organen und Teilen von Pflanzen in allen ihren phänotypischen Formen, wie Antheren, Fasern, Wurzelhaaren, Stielen bzw. Stengeln, Embryonen, Kalli, Kotyledonen, Petiolen, geerntetem Material, Pflanzengewebe, Reproduktionsgewebe und Zellkulturen, welche aus der eigentlichen transgenen Pflanze abgeleitet sind und/oder zur Hervorbringung der transgenen Pflanze verwendet werden können.
Es versteht sich, dass das Polynukleotid oder der Vektor gemäß der vorliegenden Erfindung auch in einem prokaryotischen oder eukaryotischen Einzelzellorganismus (ebenfalls bezeichnet als Mikroorganismen), insbesondere für Klonierungszwecke (zum Beispiel in E. coli) und zur Pflanzentransformation (zum Beispiel in Agrobacterium) vorhanden sein kann. Somit beinhaltet der Begriff ”Wirtszelle” vorzugsweise auch prokaryotische oder eukaryotische Einzelzellorganismen (ebenfalls bezeichnet als Mikroorganismen). Als prokaryotische Wirtszellen im Kontext der vorliegenden Erfindung werden im Besonderen Rhizobiaceae-Zellen, insbesondere aus der Gattung Agrobacterium, in Betracht gezogen. Bevorzugte Agrobacterium-Zellen sind Agrobacterium tumefaciens- und Agrobacterium rhizogenes-Zellen.
Agrobacterium ist ein bodenbärtiges Phytopathogen, welches ein Stück DNA (T-DNA) in das Genom einer Pflanze integriert (Chilton, et al., 1977 Cell 11: 263–271; Hoekema, et al., 1985 Nature 303: 179–180; Bevan, 1984 Nucleic Acids Res. 12: 8711–8721; Sheng und Citovsky, 1996 The Plant Cell, Bd. 8. 1699–1710). Vorzugsweise sind die Agrobacterium-Zellen/Stämme entschärft, d. h. ihnen fehlen die Wurzelhalsgallen-Krankheit vermittelnden Eigenschaften oder ihnen fehlen die Wurzelhaar-Krankheit vermittelnden Eigenschaften, wobei sie ansonsten aber die Funktionen für eine Pflanzeninfektion bereitstellen. Agrobacterium-Zellen werden im Kontext der vorliegenden Erfindung vorzugsweise aus LBA4404, GV2260, GV3600, EHA101, EHA105, AGL-1, LBA9402, GV3101, COR341, COR356, UTA143, pCH32, BIBAC2, C58C1, pMP90 und AGT121 ausgewählt. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Agrobacterium-Zelle aus der Gruppe gewählt, die aus C58C1, EHA101, pMP90 und LBA4404 besteht.
Wie man die oben erwähnten Agrobacterium-Spezies kultiviert, ist dem Fachmann auf dem Gebiet allgemein bekannt.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch eine transgene Pflanze oder Samen davon, welche das Polynukleotid oder den Vektor der vorliegenden Erfindung umfassen.
Das Polynukleotid oder der Vektor können im Zytoplasma von Zellen der Pflanze oder des Samens davon vorhanden sein. Vorzugsweise ist das Polynukleotid oder der Vektor in das Genom von Zeilen stabil integriert, welche von der Pflanze oder dem Pflanzensamen enthalten werden. Wie man ein Polynukleotid oder einen Vektor (insbesondere einen T-DNA-Vektor) stabil in das Genom einer Pflanzenzelle integriert, ist im Fachgebiet allgemein bekannt und hierin an anderer Stelle beschrieben. Im Kontext der vorliegenden Erfindung wird es insbesondere in Betracht gezogen, dass das Polynukleotid oder der Vektor durch Agrobacterium-vermittelte Transformation stabil in das Genom integriert werden soll.
Bevorzugte Pflanzen, die für transgene Pflanzen gemäß der vorliegenden Erfindung zu verwenden sind, sind monokotyle Pflanzen.
Eine ”monokotyle Pflanze”, wie hierin verwendet, bezieht sich vorzugsweise auf eine Blütenpflanze mit einem Kotyledon im Samen. Besonders bevorzugte monokotyle Pflanzen (hierin ebenfalls als Monokotyle bezeichnet) sind Mais, Weizen, Reis, Gerste, Hafer, Roggen, Sorghum, Hirse, Tricalat bzw. Triticale, Banane, Ryegras oder Coix. Der Begriff ”monokotyle Pflanze” schließt vorzugsweise Pflanzen der Gattungen der Unterfamilien Andropogonoideae (insbesondere die Gattungen Saccharum, Sorghum, oder Zea), Arundineae (insbesondere die Gattung Phragmites), Oryzoideae (insbesondere die Gattung Oryza), Panicoideae, und, weiter bevorzugt, Pooideae (Festuciadeae) (insbesondere die Gattungen Poa, Festuca, Lolium, Trisetum, Agrostis, Phleum, Dactylis, Alopecurus, Avena, Triticum, Secale und Hordeum) ein. Bevorzugte monokotyle Pflanzen sind Avena sativa (Hafer), Saccharum officinarum (Zuckerrohr), Triticum dicoccum (Emmer-Weizen), Triticum monococcum (Einkorn-Weizen), Triticum spelta (Dinkel-Weizen), Triticum durum (Weizen), Triticum turgidum, Triticum aestivum (Weizen), Zea mays (Mais), Panicum miliaceum (Echte Hirse), Pennisetum thiphoides (Perlhirse), Hordeum vulgare oder H. sativum (Gerste), Oryza sativa (Reis), Zizania aquatica (Wildreis), Secale cereale (Roggen), Sorghum bicolor (S. vulgare) (Sorghum). Noch bevorzugter sind Weizen (Triticum spp.), Reis (Oryza spp.), Gerste (Hordeum spp.), Hafer (Avena spp.), Roggen (Secale spp.), Mais (Zea mays), Sorghum und Hirse (Pennisettum spp).
Am meisten bevorzugt ist die monokotyle Pflanze Zea mays.
Ferner werden von der vorliegenden Erfindung bestimmte Gewebe, Organe und Teile der monokotylen Pflanze in allen ihren phänotypischen Formen in Betracht gezogen, wie Antheren, Fasern, Wurzelhaare, Stiele, Embryonen, Kolli, Kotyledonen, Petiolen, geerntetes Material, Pflanzengewebe, Reproduktionsgewebe und Zellkulturen, welche aus der eigentlichen transgenen Pflanze abgeleitet sind und/oder zur Hervorbringung der transgenen Pflanze verwendet werden können.
Transgene Pflanzen oder transgene Wirtszellen gemäß der vorliegenden Erfindung können durch Transformationstechniken erhalten werden, wie veröffentlicht und zitiert in: Plant Molecular Biology and Biotechnology (CRC Press, Boca Raton, Florida), Kapitel 6/7, S. 71–119 (1993); F. F. White, Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; in: Transgenic Plants, Bd. 1, Engineering and Utilization, Hrsg.: Kung und R. Wu, Academic Press, 1993, 15–38; B. Jenes et al., Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Bd. 1, Engineering and Utilization, Hrsg.: Kung und R. Wu, Academic Press (1993), 128–143; Potrykus, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42 (1991), 205–225; Transgenic Plants: Methods and Protocols, Herausgeber: Leandro Peña, Instituto Valenciano de Investigaciones Agrarias, Valencia Spain Series: Methods in Molecular Biology, Band 286 (2004) oder in WO2006/133983 . Vorzugsweise können transgene Pflanzen durch T-DNA-vermittelte Transformation erhalten werden. Derartige Vektorsysteme sind in der Regel dadurch gekennzeichnet, dass sie mindestens die vir-Gene, welche für die Agrobacterium-vermittelte Transformation erforderlich sind, und die Sequenzen, welche die T-DNA begrenzen (T-DNA-Border), enthalten. Geeignete Vektoren sind andernorts in der Spezifikation ausführlich beschrieben.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zum Exprimieren einer interessierenden Nukleinsäure in einer Wirtszelle, umfassend

(a) das Einbringen des Polynukleotids oder des Vektors der vorliegenden Erfindung in die Wirtszelle; und
(b) das Exprimieren mindestens einer interessierenden Nukleinsäure in der Wirtszelle.

Das Polynukleotid oder der Vektor der vorliegenden Erfindung kann durch geeignete Transfektions- oder Transformationstechniken in die Wirtszelle eingebracht werden, wie an anderer Stelle in dieser Beschreibung angegeben. Die interessierende Nukleinsäure wird in der Wirtszelle unter geeigneten Bedingungen exprimiert. Zu diesem Zweck wird die Wirtszelle unter Bedingungen kultiviert, welche im Prinzip die Transkription von Nukleinsäuren erlauben. Darüber hinaus umfasst die Wirtszelle vorzugsweise die exogen zugeführte oder endogen vorhandene Transkriptionsmaschinerie, welche zum Exprimieren einer interessierenden Nukleinsäure durch die Expressionssteuerungssequenz erforderlich ist. Vorzugsweise ist die Wirtszelle eine Zelle einer monokotylen Pflanze.
Außerdem beinhaltet die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Exprimieren einer interessierenden Nukleinsäure in einer Pflanze, das Folgendes umfasst

(a) Einbringen des Polynukleotids oder des Vektors der vorliegenden Erfindung in die Pflanze; und
(b) Exprimieren mindestens einer interessierenden Nukleinsäure in der Pflanze.

Das Polynukleotid oder der Vektor der vorliegenden Erfindung kann durch geeignete Techniken in die Pflanze eingebracht werden, wie an anderer Stelle in dieser Beschreibung angegeben.
Außerdem betrifft die vorliegende Erfindung ebenfalls ein Verfahren für die samenspezifische Expression einer interessierenden Nukleinsäure in einer Pflanze, das Folgendes umfasst

Im Folgenden werden einige bevorzugte Ausführungsformen, welche die vorliegende Erfindung betreffen, in größerer Ausführlichkeit beschrieben.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Polynukleotid der vorliegenden Erfindung ebenfalls weitere genetische Steuerungssequenzen. Eine genetische Steuerungssequenz, wie gemäß der vorliegenden Erfindung darauf Bezug genommen wird, ist im breiten Sinne zu verstehen und bedeutet alle Sequenzen mit einem Einfluß auf das Zustandekommen der Funktion der transgenen Expressionskassette der Erfindung. Genetische Steuerungssequenzen modifizieren zum Beispiel die Transkription und Translation in eukaryotischen Organismen. Die Expressionskassetten der Erfindung umfassen vorzugsweise, als zusätzliche genetische Steuerungssequenz, einen der Promotoren der Erfindung 5'-stromaufwärts der jeweiligen transgenisch zu exprimierenden Nukleinsäuresequenz, und eine Terminatorsequenz 3'-stromabwärts, und, falls zutreffend, weitere gewöhnliche regulatorische Elemente, die in jedem Fall funktionell mit der transgenisch zu exprimierenden Nukleinsäuresequenz verknüpft sind.
Genetische Steuerungssequenzen umfassen auch weitere Promotoren, Promotorelemente oder Minimalpromotoren, welche in der Lage sind, die Expressions-steuerenden Eigenschaften zu modifizieren. Es ist daher, zum Beispiel durch genetische Steuerungssequenzen, möglich, dass eine gewebespezifische Expression zusätzlich in Abhängigkeit von bestimmten Stressfaktoren stattfindet. Entsprechende Elemente sind zum Beispiel für Wasserstress, Abszisinsäure (Lam E und Chua N H, (1991) J Biol Chem 266 (26): 17131–17135) und Hitzestress (Schöffl F et al. (1989) Mol Gen Genetics 217 (2–3): 246–53) beschrieben. Eine weitere Möglichkeit besteht darin, dass weitere Promotoren, welche die Expression in weiteren Pflanzengeweben oder in anderen Organismen, wie zum Beispiel E.coli-Bakterien, möglich machen, funktionell an die zu exprimierende Nukleinsäuresequenz verknüpft werden. Geeignete Pflanzenpromotoren sind im Prinzip alle oben beschriebenen Promotoren. Es ist zum Beispiel denkbar, dass eine bestimmte Nukleinsäuresequenz durch einen Promotor (zum Beispiel einen der Promotoren der Erfindung) in einem Pflanzengewebe als Sense-RNA transkribiert und in das entsprechende Protein translatiert wird, während die gleiche Nukleinsäuresequenz durch einen anderen Promotor mit einer anderen Spezifität in einem anderen Gewebe in Antisense-RNA transkribiert wird, und das entsprechende Protein herunterreguliert wird. Dies kann durch eine Expressionskassette der Erfindung implementiert werden, indem der eine Promotor vor der transgenisch zu exprimierenden Nukleinsäuresequenz, und der andere Promotor dahinter positioniert wird.
Es ist gezeigt worden, dass untranslatierte Regionen bedeutende Funktionen bei der Regulierung der Genexpression haben können. So ist es gezeigt worden, dass 5'-untranslatierte Sequenzen die transiente Expression von heterologen Genen steigern können. Sie können außerdem die Gewebespezifität fördern (Rouster J et al. (1998) Plant J. 15: 435–440.). Umgekehrt unterdrückt die 5'-untranslatierte Region des Opaque-2-Gens die Expression. Die Deletion der entsprechenden Region dieses Gens führt zu einer Erhöhung der Genaktivität (Lohmer S et al. (1993) Plant Cell 5: 65–73). Weitere 5'-untranslatierte Sequenzen und Introns mit expressionsfördernder Funktion sind dem Fachmann bekannt. McElroy und Mitarbeiter (McElroy et al. (1991) Mol Gen Genet 231 (1): 150–160) berichteten über ein auf dem Reis-Aktin-1(Act1)-Promotor basierendes Konstrukt zum Transformieren monokotyler Pflanzen. Die Verwendung des Act1-Introns in Kombination mit dem 35S-Promotor in transgenen Reiszellen führte zu einer Expressionsrate, welche im Vergleich zum isolierten 35S-Promotor zehnfach erhöht war. Die Optimierung der Sequenzumgebung der Translationsinitiations-Stelle des Reportergens [beta]-Glucuronidase (GUS) führte zu einer vierfachen Erhöhung der GUS-Expression in transformierten Reiszellen. Die Kombination der optimierten Translationsinitiations-Stelle und des Act1-Introns führte zu einer 40-fachen Erhöhung der GUS-Expression durch den CaMV35S-Promotor in transformierten Reiszellen; ähnliche Ergebnisse sind mit transformierten Maiszellen erhalten worden. Insgesamt wurde aus den oben beschriebenen Untersuchungen schlußgefolgert, dass die auf dem Act1-Promotor basierenden Expressionsvektoren zum Steuern einer ausreichend starken und konstitutiven Expression von Fremd-DNA in transformierten Zellen von monokotylen Pflanzen geeignet sind.
Darüber hinaus kann das Expressionsprofil der Expressionssteuerungsregion der Erfindung mit Expressions-verstärkenden Introns und/oder Transkriptionsterminations-Sequenzen gesteigert werden.
So umfasst das Polynukleotid der Erfindung, in einer bevorzugten Ausführungsform, mindestens ein zusätzliches Element, ausgewählt aus der Gruppe, die aus a) 5'-untranslatierten Regionen, und b) Intron-codierenden Sequenzen, und c) Transkriptionsterminations-Sequenzen besteht.
Die ”Intron-codierende Sequenz” ist vorzugsweise ein Intron, das ein Expressionsverstärkendes Intron aus einer monokotylen Pflanze codiert. Weiter bevorzugt ist die Intron-codierende Sequenz ein Intron aus einem Ubiquitin-, Aktin- oder Alkoholdehydrogenase-Gen. Am meisten bevorzugt, ist die Intron-codierende Sequenz ein erstes Intron eines Pflanzengens, das ein Metallothionin-1-Polypeptid (MET1), ein Metallothioneinähnliches Polypeptid (MET-like) oder ein funktionales Äquivalent oder Ortholog davon codiert.
Bevorzugte erste Introns aus einem pflanzlichen Gen, das ein Metallothionein-ähnliches Polypeptid codiert (oder von einem funktionellen Äquivalent oder Homolog davon) sind in WO2006/094976 und WO2008/099013 offenbart, welche hierin durch den Bezug darauf einbezogen sind. Vorzugsweise ist das erste Intron aus einem MET-like-Gen aus einer monokotylen Pflanze abgeleitet. Weiter bevorzugt ist das erste Intron aus Oryza sativa abgeleitet (siehe Beispiele). Noch weiter bevorzugt, ist das erste Intron aus einem MET-like-Gen abgeleitet, das ein Polypeptid codiert, wie in SEQ ID NR: 118 gezeigt. Am meisten bevorzugt, weist das erste Intron eines Pflanzengens, das ein Metallothionin 1 codiert, eine Sequenz auf, wie in SEQ ID NR: 119 gezeigt.
Es wird ebenfalls in Betracht gezogen, dass die Intron-codierende Region eine Variante eines ersten Introns eines Pflanzengens ist, das ein Metallothionin-ähnliches Protein codiert, insbesondere eine Variante eines ersten Introns mit einer Sequenz, wie in SEQ ID NR: 120 gezeigt. Eine solche Variante ist vorzugsweise mindestens 70%, mindestens 80%, mindestens 90%, mindestens 91%, mindestens 92%, mindestens 93%, mindestens 94%, mindestens 95%, mindestens 96%, mindestens 97%, mindestens 98% oder mindestens 99% identisch zu dem ersten Intron. Wie man den Grad der Identität ermittelt, ist hierin an anderer Stelle beschrieben.
Vorzugsweise ist die Intron-codierende Sequenz in dem Expressionskonstrukt in der 5'-untranslatierten Region der Nukleinsäure von Interesse inseriert, welche exprimiert werden sollte (d. h. zwischen der Expressionssteuerungssequenz und der Protein codierenden Sequenz (offener Leserahmen) der Nukleinsäure von Interesse).
Günstigerweise ist es im Kontext der vorliegenden Erfindung gezeigt worden, dass das Met1-1-Intron die Expression von den Expressionssteuerungssequenzen gemäß der vorliegenden Erfindung in Samengewebe steigert.
Die Expressionskassette kann ebenfalls eine oder mehrere, funktionell an den Promotor geknüpfte, sogenannte Enhancersequenzen umfassen, welche die erhöhte transgenische Expression der Nukleinsäuresequenz möglich machen. Es ist ebenfalls möglich, zusätzliche vorteilhafte Sequenzen, wie weitere regulatorische Elemente oder Terminatoren, am 3'-Ende der Nukleinsäuresequenzen, welche transgen exprimiert werden sollen, zu inserieren.
Steuerungssequenzen bedeuten weiterhin diejenigen, welche eine homologe Rekombination oder Insertion in das Genom eines Wirtsorganismus möglich machen oder welche die Deletion aus dem Genom erlauben. So ist es bei der homologen Rekombination zum Beispiel möglich, den natürlichen Promotor eines bestimmten Gens durch einen der Promotoren der Erfindung zu ersetzen. Verfahren, wie etwa die cre/lox-Technologie, erlauben die gewebespezifische Deletion, welche unter gewissen Umständen induzierbar ist, der Expressionskassette aus dem Genom des Wirtsorganismus (Sauer B. (1998) Methods. 14 (4): 381–92). In diesem Fall sind bestimmte flankierende Sequenzen (lox-Sequenzen) an das Zielgen angefügt und ermöglichen anschließend eine Deletion mittels der cre-Rekombinase Der einzuführende Promotor kann mittels homologer Rekombination vor dem Zielgen, das transgenisch exprimiert werden soll, platziert werden, indem der Promotor an DNA-Sequenzen geknüpft wird, welche beispielsweise homolog zu endogenen Sequenzen sind, die dem Leserahmen des Zielgens vorangehen. Solche Sequenzen sind als genetische Steuerungssequenzen anzusehen. Nachdem eine Zelle mit dem passenden DNA-Konstrukt transformiert worden ist, können die zwei homologen Sequenzen Wechselwirken und somit die Promotorsequenz an der gewünschten Stelle vor dem Zielgen platzieren, so dass die Promotorsequenz nun funktionell mit dem Zielgen verknüpft ist und eine Expressionskassette der Erfindung bildet. Die Auswahl der homologen Sequenzen bestimmt die Promotorinsertionsstelle. Es ist in diesem Fall möglich, dass die Expressionskassette durch homologe Rekombination mittels einzelner oder doppelter reziproker Rekombination erzeugt wird. Bei der einzelnen reziproken Rekombination wird Verwendung von nur einer einzelnen Rekombinationssequenz gemacht, und die vollständige eingeführte DNA wird inseriert. In der doppelt reziproken Rekombination wird die einzuführende DNA von zwei homologen Sequenzen flankiert, und die flankierende Region wird inseriert. Das letztgenannte Verfahren ist geeignet zum Ersetzen, wie oben beschrieben, des natürlichen Promotors eines bestimmten Gens durch einen der Promotoren der Erfindung und damit zum Modifzieren der Lokalisierung und Zeitgebung der Genexpression. Diese funktionelle Verknüpfung repräsentiert eine Expressionskassette der Erfindung. Um erfolgreich homolog rekombinierte oder anderweitig transformierte Zellen zu selektieren, ist es üblicherweise notwendig, zusätzlich einen selektierbaren Marker einzubringen. Verschiedene geeignete Marker sind nachstehend erwähnt. Der Selektionsmarker erlaubt die Selektion von transformierten gegenüber untransformierten Zellen. Homologe Rekombination ist ein relativ seltenes Ereignis in höheren Eukaryoten, speziell in Pflanzen. Überwiegend kommen Zufallsintegrationen in das Wirtsgenom vor. Eine Möglichkeit zum Deletieren zufallsmäßig integrierter Sequenzen und somit zum Anreichern von Zellklonen mit einer korrekten homologen Rekombination besteht in der Verwendung eines sequenzspezifischen Rekombinationssystems, wie in US 6 110 736 beschrieben.
Polyadenylierungssignale, die als genetische Steuerungssequenzen geeignet sind, sind pflanzliche Polyadenylierungssignale und vorzugsweise diejenigen aus Agrobacterium tumefaciens.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform umfasst die Expressionskassette eine Terminatorsequenz, welche in Pflanzen funktionsfähig ist. Terminatorsequenzen, welche in Pflanzen funktional sind, bedeuten im Allgemeinen Sequenzen, die in der Lage sind, die Termination der Transkription einer DNA-Sequenz in Pflanzen herbeizuführen. Beispiele von geeigneten Terminatorsequenzen sind der OCS(Octopinsynthase)-Terminator und der NOS(Nopalinsynthase)-Terminator. Allerdings werden pflanzliche Terminatorsequenzen besonders bevorzugt. Pflanzliche Terminatorsequenzen bedeuten im Allgemeinen Sequenzen, welche ein Bestandteil eines natürlichen Pflanzengens sind. Besondere Bevorzugung wird in diesem Zusammenhang dem Terminator des Kartoffel-Cathepsin D-Inhibitor-Gens (GenBank Zugangs-Nr.: X74985) oder dem Terminator des Ackerbohnen-Speicherprotein-Gens VfLEIB3 (GeriBank Zugangs-Nr.: Z26489) gegeben.
Diese Terminatoren sind zumindest äquivalent zu den viralen oder T-DNA-Terminatoren, die im Fachgebiet beschrieben sind.
Der Fachmann kennt ebenfalls eine große Zahl von Nukleinsäuren und Proteinen, deren rekombinante Expression unter der Steuerung der Expressionskassetten oder Verfahren der Erfindung vorteilhaft ist. Einige Beispiele von interessierenden Nukleinsäuren, deren Expression die gewünschten vorteilhaften Effekte bereitstellt, sind nachstehend erwähnt.
Ferner kennt der Fachmann eine große Zahl von Genen, durch deren Repression oder Abschaltung mittels Expression einer entsprechenden Antisense-RNA es gleichfalls möglich ist, vorteilhafte Effekte zu erreichen. Nicht-einschränkende Beispiele von vorteilhaften Effekten, welche erwähnt werden können, sind: erleichterte Produktion eines transgenen Organismus, zum Beispiel durch die Expression von Selektionsmarkern, Erzielung von Resistenz gegenüber abiotischen Stressfaktoren (Hitze, Kälte, Aridität, erhöhte Feuchtigkeit, Dürre, Umweltgifte, UV-Strahlung), Erzielung von Resistenz gegenüber biotischen Stressfaktoren (Pathogene, Viren, Insekten und Krankheiten), Verbesserung der Eigenschaften von Nahrung für Mensch oder Tier, Verbesserung der Wachstumsrate der Ernte bzw. des Ertrags. Vorzugsweise ist der biotische Stressfaktor eine samenbürtige Krankheit (hauptsächlich Pilzkrankheiten z. B. Steinbrand (Tilletia tritici); Streifenkrankheit (Pyrenophora graminea) und Flugbrand (Ustilago nuda) hauptsächlich in Gerste).
Darüber hinaus ist die größte Verwendung von Korn, insbesondere von Mais-Korn, jene für Futter- oder Nahrungsmittel. Die Einbringung von Genen, welche die Zusammensetzung des Korns verändern, kann den Futter- oder Nahrungswert in großem Maße steigern. Die primären Komponenten von Korn sind Stärke, Protein und Öl. Jede dieser primären Komponenten von Korn kann durch Verändern ihres Spiegels oder ihrer Zusammensetzung verbessert werden. Die primären Komponenten von Korn sind Stärke, Protein und Öl. Jede dieser primären Komponenten von Korn kann durch Verändern ihres Spiegels oder ihrer Zusammensetzung verbessert werden (was heißt, dass der Nährwert der Bausteine für jede Komponente, oder alternativ die jeweiligen Strukturen von Ölen und Stärken, so modifiziert werden können, dass ihr Nährstoffgehalt verbessert wird).
Das Protein vieler Getreidekörner ist suboptimal für Futter- und Nahrungszwecke, insbesondere bei Verfütterung an Schweine, Geflügel und Verzehr durch den Menschen. Dem Protein fehlen mehrere Aminosäuren, welche in der Nahrung dieser Spezies essentiell sind, was die Zugabe von Ergänzungen zum Korn notwendig macht. Limitierende essentielle Aminosäuren können Lysin, Methionin, Tryptophan, Threonin, Valin, Arginin und Histidin einschließen. Die Spiegel dieser essentieller Aminosäuren in Samen und Korn können durch Mechanismen erhöht werden, welche die Einbringung von Genen beinhalten, um die Biosynthese der Aminosäuren zu erhöhen, den Abbau der Aminosäuren zu verringern, die Speicherung der Aminosäuren in Proteinen zu erhöhen, oder den Transport der Aminosäuren zu den Samen oder zum Korn zu erhöhen.
Ein Mechanismus zur Erhöhung der Biosynthese der Aminosäuren besteht darin, Gene einzubringen, welche die Aminosäure-Biosynthesewege deregulieren, so dass die Pflanze die Spiegel, welche produziert werden, nicht länger adäquat steuern kann. Dies kann durch Deregulieren oder Umgehen von Schritten im Aminosäure-Biosyntheseweg vorgenommen werden, welche normalerweise durch die Spiegel des Aminosäureendprodukts des Weges reguliert werden. Beispiele schließen die Einbringung von Genen ein, welche deregulierte Versionen der Enzyme Aspartokinase oder Dihydrodipicolinsäure(DHDP)-Synthase zur Erhöhung der Lysin- und Threoninproduktion, und Anthranilat-Synthase zur Erhöhung der Tryptophanproduktion, codieren. Die Verminderung des Katabolismus der Aminosäuren kann durch Einbringung von DNA-Sequenzen bewirkt werden, welche die Expression von Genen verringern oder eliminieren, welche Enzyme codieren, die Schritte in den katabolischen Wegen katalysieren, wie etwa das Enzym Lysin-Ketoglutarat-Reduktase.
Die Proteinzusammensetzung des Korns kann zur Verbesserung der Balance der Aminosäuren auf vielerlei Weise verändert werden, einschließlich Erhöhen der Expression von nativen Proteinen, Verringern der Expression von solchen mit schlechter Zusammensetzung, Ändern der Zusammensetzung von nativen Proteinen oder Einbringen von Genen, die vollkommen neue Proteine codieren, welche eine höherwertige Zusammensetzung besitzen. DNA kann eingebracht werden, welche die Expression von Mitgliedern der Zein-Speicherproteinfamilie verringert. Diese DNA kann Ribozyme oder Antisense-Sequenzen codieren, welche auf die Beeinträchtigung der Expression von Zein-Proteinen oder der Expression von Regulatoren der Zein-Expression, wie dem Opaque-2-Genprodukt, gerichtet sind. Die Proteinzusammensetzung des Korns kann durch das Phänomen der Cosuppression, d. h. Inhibition der Expression eines endogenen Gens durch die Expression eines identischen Strukturgens oder Genfragments, das durch Transformation eingebracht wurde, modifiziert werden. Zusätzlich dazu kann die eingebrachte DNA Enzyme codieren, welche Zeine abbauen. Die Verringerungen in der Zein-Expression, welche erzielt werden, können von Zuwächsen hinsichtlich Proteinen mit erwünschterer Aminosäurezusammensetzung oder Erhöhungen bei anderen Haupt-Samenbestandteilen, wie Stärke, begleitet werden. Alternativ dazu kann ein chimäres Gen eingebracht werden, das eine codierende Sequenz für ein natives Protein mit adäquater Aminosäurezusammensetzung, wie für eines der Globulin-Proteine oder 10-kD-Zein von Mais, und einen Promotor oder eine sonstige regulatorische Sequenz umfasst, welche(r) zur Erhöhung der Expression des Proteins entworfen ist. Die codierende Sequenz des Gens kann Zusatz- oder Ersatz-Codons für essentielle Aminosäuren einschließen. Ferner kann eine codierende Sequenz, die aus einer anderen Spezies erhalten wurde, oder eine teilweise oder vollständig synthetische Sequenz, die eine vollkommen einzigartige Peptidsequenz codiert, entworfen zur Verbesserung der Aminosäurezusammensetzung des Samens, verwendet werden.
Die Einbringung von Genen, welche den Ölgehalt des Korns verändern, kann von Nutzen sein. Erhöhungen im Ölgehalt können zu Erhöhungen in Gehalt und Dichte der metabolisierbaren Energie der Samen für Anwendungen bei Futter- und Nahrungsmitteln führen. Die eingebrachten Gene können Enzyme codieren, welche Geschwindigkeitsbeschränkungen oder regulierte Schritte in der Fettsäure- oder Lipid-Biosynthese entfernen oder vermindern. Derartige Gene sind z. B. diejenigen, welche Acetyl-CoA-Carboxylase, ACP-Acyltransferase, beta-Ketoacyl-ACP-Synthase sowie andere allgemein bekannte Fettsäurebiosynthese-Aktivitäten codieren.
Gene können eingebracht werden, welche den Nährwert der Stärkekomponente des Korns steigern, zum Beispiel durch Erhöhen des Grads der Verzweigung, was zur verbesserten Verwertung der Stärke in Kühen durch Verzögern ihrer Verstoffwechselung führt.
Futter oder Nahrung, welche gewisse Getreidekörner umfassen, besitzen ungenügende Mengen an Vitaminen und müssen ergänzt werden, um einen adäquaten Nährwert bereitzustellen. Die Einbringung von Genen, welche die Vitaminbiosynthese in Samen steigern, kann in Betracht gezogen werden, einschließlich zum Beispiel der Vitamine A, E, B₁₂, Cholin und dergleichen.
Die Eigenschaften von Stärke können durch Ändern des Verhältnisses von Amylose zu Amylopectin, der Größe der Stärkemoleküle oder ihres Verzeigungsmusters vorteilhaft verändert werden. Mittels dieser Änderungen kann ein breites Spektrum an Eigenschaften modifiziert werden, welche z. B. Gelatinierungstemperatur, Wärme der Gelatinierung, Klarkeit von Filmen und Pasten einschließen. Zur Bewirkung dieser Änderungen bei Eigenschaften können Gene, welche granulär-gebundene oder lösliche Stärkesynthase-Aktivität oder Verzweigungsenzym-Aktivität codieron, allein oder in Kombination eingebracht werden. Man kann ebenfalls DNA, wie Antisense-Konstrukte, verwenden, um Spiegel der endogenen Aktivität dieser Enzyme zu verringern.
Darüber hinaus besitzen manche Getreidekörner, die in Futter- und Nahrungs-Anwendungen verwendet werden, ungenügende Mengen an Vitaminen und müssen ergänzt werden, um einen adäquaten Nährwert bereitzustellen; Die Einbringung von Genen, welche die Vitaminbiosynthese in Samen steigern, kann in Betracht gezogen werden, einschließlich zum Beispiel der Vitamine A, E, B₁₂, Cholin und dergleichen.
Zusätzlich dazu kann es ferner in Betracht gezogen werden, dass die Pflanze für die Produktion oder Herstellung von nützlichen biologischen Verbindungen verwendet wird, welche davor in der Pflanze entweder überhaupt nicht produziert oder nicht bei dem gleichen Spiegel produziert wurden. Die neuen Pflanzen, welche diese Verbindungen herstellen, werden durch die Einbringung und Expression von Genen durch Transformationsverfahren möglich gemacht. Die Möglichkeiten schließen z. B. jedwede biologische Verbindung ein, welche derzeitig durch einen beliebigen Organismus produziert wird, wie Proteine, Nukleinsäuren, primäre und intermediäre Metabolite, Kohlenhydrat-Polymere, etc. Die Verbindungen können von der Pflanze hergestellt, nach der Ernte und/oder Verarbeitung extrahiert, und für jedweden derzeit erkannten nütrlichen Zweck, wie Pharmazeutika, Duftstoffe, industrielle Enzyme, um nur einige zu nennen, verwendet werden.
Nützliche Nukleinsäuresequenzen von Interesse, welche mit der Expressionssteuerungssequenz der vorliegenden Erfindung kombiniert werden können, schließen vorzugsweise jene ein, welche Samen-Speicherproteine, Fettsäure-Weg-Enzyme, Tocopherol-Biosynthese-Enzyme, Aminosäure-Biosynthese-Enzyme und Stärke-Verzweigungs-Enzyme codieren.
Die Expressionssteuerungssequenzen gemäß der vorliegenden Erfindung können zur Expression von metabolischen Enzymen für die Verwendung im Nahrungs-und-Futter-Sektor, zum Beispiel von Phytasen und Cellulasen, verwendet werden. Besonders bevorzugt werden Nukleinsäuren, wie etwa die künstliche cDNA, welche eine mikrobielle Phytase (GenBank Zugangs-Nr.: A19451) oder funktionelle Äquivalente davon codiert, sowie die Expression von Genen, welche eine Akkumulation von Feinchemikalien hervorbringen, wie von Tocopherolen, Tocotrienolen oder Carotinoiden. Ein Beispiel, das erwähnt werden kann, ist Phytoen-Desaturase. Es werden Nukleinsäuren bevorzugt, welche die Photoen-Desaturase aus Narcissus pseudonarcissus (GenBank Zugangs-Nr.: X78815) oder funktionelle Äquivalente davon codieren.
Die Expressionssteuerungssequenzen gemäß der vorliegenden Erfindung können verwendet werden für die Expression von interessierenden Nukleinsäuren, welche die Produktion von Ölen modifizierten ( US 6 444 876 ), hohe Öl-Produktion ( U. S.-Pat. Nr. 5 608 149 und 6 476 295 ) oder den Fettsäuregehalt modifizierten ( US 6 537 750 ). Bevorzugte Fettsäureweg-Enzyme schließen Thioesterasen ( U. S.-Pat. Nr. 5 512 482 ; 5 530 186 ; 5 945 585 ; 5 639 790 ; 5 807 893 ; 5 955 650 ; 5 955 329 ; 5 759 829 ; 5 147 792 ; 5 304 481 ; 5 298 421 ; 5 344 771 und 5 760 206 ), Diacylglycerol-Acyl-Transferasen ( U. S.-Patentveröffentlichungen 20030115632A1 und 20030028923A1 ), und Desaturasen ( U. S.-Pat. Nr. 5 689 050 ; 5 663 068 ; 5 614 393 ; 5 856 157 ; 6 117 677 ; 6 043 411 ; 6 194 167 ; 5 705 391 ; 5 663 068 ; 5 552 306 ; 6 075 183 ; 6 051 754 ; 5 689 050 ; 5 789 220 ; 5 057 419 ; 5 654 402 ; 5 659 645 ; 6 100 091 ; 5 760 206 ; 6 172 106 ; 5 952 544 ; 5 866 789 ; 5 443 974 ; und 5 093 249 ) ein, von denen alle hierin durch den Bezug darauf einbezogen sind.
Die Produktion von Neutraceuticals, wie zum Beispiel mehrfach ungesättigten Fettsäuren, wie zum Beispiel, Arachidonsäure oder EP (Eicosapentaensäure) oder DHA (Docosahexaensäure), durch Expression von Fettsäure-Elongasen und/oder Desaturasen, oder die Produktion von Proteinen mit einem verbesserten Nährwert, wie zum Beispiel mit einem hohen Gehalt an essentiellen Aminosäuren (z. B. das Methioninreiche 2S-Albumin-Gen der Paranuss). Bevorzugte Nukleinsäuren sind diejenigen, welche für das Methionin-reiche 2S-Albumin aus Bertholletia excelsa (GenBank Zugangs.-Nr.: AB044391), die [Delta]6-Acyllipid-Desaturase aus Physcomitrella patens (GenBank Zugangs.-Nr.: AJ222980; Girke et al. (1998) Plant J 15: 3948), die [Delta]6-Desaturase aus Mortierelia alpina (Sakuradani et al. (1999) Gene 238: 445–453), die [Delta]5-Desaturase aus Caenorhabditis elegans (Michaelson et al. 1998, FEBS Letters 439: 215–218), die [Delta]5-Fettsäure-Desaturase (des-5) aus Caenorhabditis elegans (GenBank Zugangs.-Nr.: AF078796), die [Delta]5-desaturase aus Mortierella alpina (Michaelson et al. J Biol Chem 273: 19055–19059), die [Delta]6-Elongase aus Caenorhabditis elegans (Beaudoin et al. (2000) Proc Natl. Acad Sci USA 97: 6421–6426), die [Delta]6-Elongase aus Physcomitrella patens (Zank et al. (2000) Biochemical Society Transactions 28: 654–657) oder funktionelle Äquivalente davon codieren.
Das Erzielen eines erhöhten Speichervermögens in Zellen, welche normalerweise wenig Speicherproteine oder -lipide umfassen, mit dem Zweck der Erhöhung des Ertrags dieser Substanzen, zum Beispiel durch Expression einer Acetyl-CoA-Carboxylase. Bevorzugte Nukleinsäuren sind diejenigen, welche für die Acetyl-CoA-Carboxylase (Accase) aus Medicago sativa (GenBank Zugangs-Nr.: 125042) oder funktionelle Äquivalente davon codieren. Weitere Beispiele von vorteilhaften Genen sind zum Beispiel in Dunwell J M (2000) J Exp Bot. 51 Spec No: 487–96 erwähnt. Alternativ dazu könnte ein erhöhter Speicherproteingehalt vorteilhaft für die Hochprotein-Produkt-Herstellung sein. Bevorzugte Samenspeicherproteine schließen Zeine ein.
Die Nukleinsäure von Interesse kann auch Resistenz gegenüber mit Samen zusammenhängenden Krankheiten vermitteln, welche durch Viren, Bakterien, Pilze, Insekten (z. B. durch Exprimieren eines geeigneten Bt-Gens) und Nematoden verursacht werden.
Zum Beispiel kann die Nukleinsäure von Interesse Resistenz gegen Pilze verleihen, die bekanntermaßen gelagerte Samen befallen, wie Pilze der Gattung Aspergillus, Penicillium oder Fusarium (insbesondere Fusarium moniliformere). Resistenz gegen Fusarium kann vorzugsweise durch funktionsfähiges Verknüpfen der Expressionssteuerungssequenzen gemäß der vorliegenden Erfindung an eine Nukleinsäuresequenz, welche Cry-1A(b) oder eine beliebige andere Cry-Variante codiert, die Resistenz gegen Fusarium vermitteln, erzielt werden.
Darüber hinaus kann die Nukleinsäure von Interesse Resistenz gegen die Nematode Anguina tritici verleihen, welche signifikanten Ernteverlust bei Emmer (Triticum monococcum), Roggen (Secale cereale), Dinkel (T. spelta) und Weizen (T. aestivum) verursachen kann.
Ebenfalls kann die Nukleinsäure von Interesse Resistenz gegen Cnephasia-Spezies, insbesondere gegen Getreidewickler (Cnephasia pumicana) und Blattroller, wie Cnephasia longana, verleihen
Es wird ebenfalls in Betracht gezogen, dass die Nukleinsäure von Interesse Resistenz gegen graue Ackerschnecken, wie Deroceras reticulatum oder Deroceras agreste, verleihen kann.
Resistenz gegen Viren kann durch die Expression neuer Gene herbeigeführt werden. Zum Beispiel ist es gezeigt worden, dass die Expression eines viralen Hüllproteins in einer transgenen Pflanze Resistenz gegen Infektion der Pflanze durch dieses Virus und möglicherweise andere nah verwandte Viren verleihen kann. Es wird in Betracht gezogen, dass die Expression von Antisense-Genen, die auf essentielle virale Funktionen abzielen, Resistenz gegen das Virus verleihen kann. Zum Beispiel kann ein Antisense-Gen, das auf das Gen zielt, welches für die Replikation von viraler Nukleinsäure verantwortlich ist, die Replikation inhibieren und zur Resistenz gegen das Virus führen. Es wird angenommen, dass die Störung anderer viraler Funktionen durch die Verwendung von Antisense-Genen ebenfalls die Resistenz gegen Viren erhöhen kann.
Eine Expression der Nukleinsäure unter der Steuerung der Promotoren der Erfindung ist in jedem gewünschten Zellkompartiment möglich, wie zum Beispiel dem Endomembransystem, der Vakuole und den Chloroplasten. Erwünschte Glykosylierungsreaktionen, insbesondere Faltungen und dergleichen, sind durch Nutzung des sekretorischen Wegs möglich. Die Sekretion des Zielproteins zur Zelloberfläche oder die Sekretion in das Kulturmedium, zum Beispiel bei Verwendung von in Suspension kultivierten Zellen oder Protoplasten, ist ebenfalls möglich. Die für diesen Zweck notwendigen Targetingsequenzen können daher bei individuellen Vektorvariationen berücksichtigt werden und, zusammen mit dem zu klonierenden Zielgen, durch Anwenden einer geeigneten Klonierungsstrategie in den Vektor eingebracht werden. Es ist möglich, als Targetingsequenzen sowohl gen-intrinsische, falls vorhanden, als auch heterologe Sequenzen zu verwenden. Zusätzliche heterologe Sequenzen, welche für die funktionelle Verknüpfung bevorzugt werden, sind, ohne Einschränkung darauf, weitere Targetingsequenzen, um die subzelluläre Lokalisierung in Apoplasten, in der Vakuole, in Plastiden, im Mitochondrion, im endoplasmatischen Retikulum (ER), im Zellkern, in Elaioplasten oder anderen Kompartimenten zu gewähren; und Translations-Enhancer, wie die 5'-Leader-Sequenz aus Tabakmosaikvirus (Gallie et al. (1987) Nucl Acids Res 15 8693–8711) und dergleichen. Das Verfahren zum Transportieren von Proteinen, welche nicht per se in den Plastiden verortet sind, in einer gezielten Weise in die Plastiden hinein ist beschrieben worden (Klosgen R B & Weil J H (1991) Mol Gen Genet 225 (2): 297–304; Van Breusegem F et al. (1998) Plant Mol Biol 38 (3): 491–496).
Bevorzugte Sequenzen sind die folgenden

a) kleine Untereinheit (SSU) der Ribulose-Bisphosphat-Carboxylase (Rubisco ssu) aus Erbse, Mais, Sonnenblume
b) Transitpeptide, abgeleitet aus Genen der pflanzlichen Fettsäurebiosynthese, wie das Transitpeptid des plastidären Acyl-Carrierproteins (ACP), der Stearyl-ACP-Desaturase, [beta]-Ketoacyl-ACP-Synthase oder der Acyl-ACP-Thioesterase
c) das Transitpeptid für GBSSI (Stärkegranalien-gebundene Stärkesynthase 1)
d) LHCP II-Gene.

Die Zielsequenzen können an andere Ziel- bzw. Targetingsequenzen verknüpft werden, welche sich von den Transitpeptid-codierenden Sequenzen unterscheiden, um eine subzelluläre Lokalisierung im Apoplasten, in der Vakuole, in den Plastiden, im Mitochondrion, im endoplasmatischen Retikulum (ER), im Zellkern, in den Elaioplasten oder anderen Kompartimenten zu gewähren. Es ist ebenfalls möglich, Translations-Enhancer, wie die 5'-Leader-Sequenz aus Tabakmosaikvirus (Gallie et al. (1987) Nucl Acids Res 15: 8693–8711), und dergleichen, zu verwenden.
Der Fachmann weiss gleichfalls, dass er die oben beschriebenen Gene nicht direkt durch Verwendung der für diese Gene codierenden Nukleinsäuresequenzen exprimieren oder sie zum Beispiel durch Antisense reprimieren muss. Er kann zum Beispiel auch künstliche Transkriptionsfaktoren des Typs von Zinkfingerproteinen verwenden (Beerli R R et al. (2000) Proc Natl Acad Sci USA 97 (4): 1495–500). Diese Faktoren binden in den regulatorischen Regionen der endogenen Gene, welche exprimiert oder reprimiert werden sollen, und führen, abhängig von dem Entwurf des Faktors, zur Expression oder Repression des endogenen Gens. Somit können die gewünschten Effekte auch durch Expression eines passenden Zinkfinger-Transkriptionsfaktors unter der Steuerung von einem der Promotoren der Erfindung erzielt werden.
Die Expressionskassetten der Erfindung können gleichermaßen für die samenspezifische Unterdrückung oder Reduktion der Replikation und/oder Translation von Zielgenen durch Gen-Silencing verwendet werden.
Die Expressionskassetten der Erfindung können auch für die samenspezifische Expression von Nukleinsäuren verwendet werden, welche sogenannte Antisense-Effekte vermitteln, und sind somit zum Beispiel zum Verringern der Expression eines Zielproteins fähig.
Bevorzugte Gene und Proteine, deren Unterdrückung die Bedingung für einen vorteilhaften Phänotyp ist, umfassen beispielsweise, jedoch nicht-einschränkend:

a) Verringerung der Expression von allergenen Proteinen, wie zum Beispiel in Tada Y et al. (1996) FEBS Lett 391 (3): 341–345 oder Nakamura R (1996) Biosci Biotechnol Biochem 60 (8): 1215–1221, beschrieben.
b) Verschiebung des Amylose/Amylopectin-Gehalts in Stärke durch Unterdrückung des Verzweigungsenzyms Q, das für die [alpha]-1,6-glycosidische Bindung verantwortlich ist. Entsprechende Vorgehensweisen sind (zum Beispiel in Schwall G P et al. (2000) Nat Biotechnol 18 (5): 551–554) beschrieben. Für diesen Zweck werden bevorzugt Nukleinsäuresequenzen, wie jene des Stärke-Verzweigungsenzym II von Kartoffel (Gen-Bank Zugangs-Nr.: AR123356; U. S.-Pat. Nr. 6 169 226 ) oder seiner Homologen aus anderen Gattungen und Spezies, verwendet.

Eine ”Antisense”-Nukleinsäure bedeutet hauptsächlich eine Nukleinsäuresequenz, welche vollständig oder teilweise komplementär zu mindestens einem Teil des Sinn- bzw. Sense-Stranges des Zielproteins ist. Der Fachmann weiss, dass er alternativ die cDNA oder das entsprechende Gen als Start-Matrize für entsprechende Antisense-Konstrukte verwenden kann. Die Antisense-Nukleinsäure ist vorzugsweise komplementär zur codierenden Region des Zielproteins oder eines Teils davon. Die Antisense-Nukleinsäure kann jedoch auch komplementär zur nicht-codierenden Region von einem Teil davon sein. Ausgehend von der Sequenzinformation für ein Zielprotein, kann eine Antisense-Nukleinsäure in einer dem Fachmann vertrauten Weise entworfen werden, indem die Basenpaarregeln von Watson und Crick berücksichtigt werden. Eine Antisense-Nukleinsäure kann komplementär zur Gesamtheit oder einem Teil der Nukleinsäuresequenz eines Zielproteins sein. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Antisense-Nukleinsäure ein Oligonukleotid mit einer Länge von zum Beispiel 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 oder 50 Nukleotiden.
Die Antisense-Nukleinsäure umfasst in einer bevorzugten Ausführungsform [alpha]-anomere Nukleinsäuremoleküle. [alpha]-Anomere Nukleinsäuremoleküle bilden insbesondere doppelsträngige Hybride mit komplementärer RNA, in denen die Stränge parallel zueinander verlaufen, im Gegensatz zu den normalen [beta]-Einheiten (Gaultier et al. (1987) Nucleic Acids Res 15: 6625–6641). Die Verwendung der oben beschriebenen Sequenzen in Sense-Orientierung ist ebenfalls eingeschlossen und kann, wie es dem Fachmann geläufig ist, zu Cosuppression führen. Die Expression von Sense-RNA zu einem endogenen Gen kann dessen Expression verringern oder abschalten, ähnlich zu jenem, was für Antisense-Vorgehensweisen beschrieben wurde (Goring et al. (1991) Proc Natl Acad Sci USA 88: 1770–1774; Smith et al. (1990) Mol Gen Genet 224: 447–481; Napoli et al. (1990) Plant Cell 2: 279–289; Van der Krol et al. (1990) Plant Cell 2: 291–299). Ferner ist es für das eingebrachte Konstrukt angebracht, das Gen, das vermindert werden soll, vollstandig oder nur zum Teil, zu repräsentieren. Die Möglichkeit einer Translation ist nicht notwendig.
Es wird auch ganz besonders bevorzugt, Verfahren, wie Genregulation mittels doppelsträngiger RNA (doppelsträngige RNA-Interferenz), anzuwenden. Dementsprechende Verfahren sind dem Fachmann bekannt und ausführlich beschrieben (z. B. Matzke M A et al. (2000) Plant Mol Biol 43: 401–415; Fire A. et al (1998) Nature 391: 806–811; WO 99/32619 ; WO 99/53050 ; WO 00/68374 ; WO 00/44914 ; WO 00/44895 ; WO 00/49035 ; WO 00/63364 ). Es wird ausdrücklich auf die in den angegebenen Bezugsteilen beschriebenen Verfahren und Methoden verwiesen. Eine hocheffiziente Unterdrückung nativer Gene wird hier durch die gleichzeitige Einbringung von Strang und komplementären Strang herbeigeführt.
Es ist möglich und vorteilhaft, die Antisense-Strategie mit einem Ribozym-Verfahren zu koppeln. Ribozyme sind katalytisch aktive RNA-Sequenzen, welche, gekoppelt an die Antisense-Sequenzen, die Zielsequenzen katalytisch spalten (Tanner N K. FEMS Microbiol Rev. 1999; 23 (3): 257–75). Dies kann die Effizienz einer Antisense-Strategie erhöhen. Die Expression von Ribozymen zum Vermindern bestimmter Proteine ist dem Fachmann bekannt und zum Beispiel in EP-A1 0 291 533 , EP-A1 0 321 201 und EP-A1 0 360 257 beschrieben. Geeignete Zielsequenzen und Ribozyme können, wie bei Steinecke (Ribozymes, Methods in Cell Biology 50, Galbraith et al., Hrsg. Academic Press, Inc. (1995), 449–460) beschrieben, durch Sekundärstruktur-Berechnungen von Ribozym-RNA und Ziel-RNA und durch die Wechselwirkung derselben ermittelt werden (Bayley C C et al., Plant Mol Biol. 1992; 18 (2): 353–361; Lloyd AM und Davis R W et al., Mol Gen Genet., März 1994; 242 (6): 653–657). Beispiele, welche erwähnt werden sollten, sind Hammerkopf-Ribozyme (Haselhoff und Gerlach (1988) Nature 334: 585–591). Bevorzugte Ribozyme basieren auf Derivaten der Tetrahymena-L-19 IVS-RNA ( U. S.-Pat. Nr. 4 987 071 ; U. S.-Pat. Nr. 5 116 742 ). Weitere Ribozyme mit Selektivität für eine L119-mRNA können gewählt werden (Bartel D und Szostak J W (1993) Science 261: 1411–1418).
In einer weiteren Ausführungsform kann die Zielproteinexpression durch Verwenden von Nukleinsäuresequenzen verringert werden, welche komplementär zu regulatorischen Elementen der Zielproteingene sind, mit letzteren eine tripelhelikale Struktur bilden und so die Gentranskription verhindern (Helene C (1991) Anticancer Drug Des. 6 (6): 569–84; Helene C et al. (1992) Ann NY Acad Sci 660: 27–36; Maher L J (1992) Bioassays 14 (12): 807–815).
Die Expressionskassetten der Erfindung und die davon abgeleiteten Vektoren können weitere funktionelle Elemente umfassen. Der Begriff funktionelles Element soll in breitem Sinne verstanden werden und bedeutet alle Elemente, welche einen Einfluss auf Produktion, Vervielfachung oder Funktion der Expressionskassetten der Erfindung oder der davon abgeleiteten Vektoren oder Organismen aufweisen. Nicht-einschränkende Beispiele, die Erwähnung finden können, sind folgende:

a) Reportergene oder Proteine codieren leicht quantifizierbare Proteine und gewährleisten mittels einer intrinsischen Farbe oder enzymatischen Aktivität eine Bewertung der Transformationseffizienz oder der Örtlichkeit oder Zeit der Expression (Schenborn E, Groskreutz D (1999) Mol Biotechnol 13 (1): 2944). Beispiele, welche erwähnt werden sollten, sind: Grün-Fluoreszenz-Protein (GFP) (Chui W L et al., Curr Biol 1996, 6: 325–330; Leffel S M et al., Biotechniques. 23 (5): 912–8, 1997; Sheen et al. (1995) Plant Journal 8 (5): 777–784; Haseloff et al. (1997) Proc Natl Acad Sci USA 94 (6): 2122–2127; Reichel et al. (1996) Proc Natl Acad Sci USA 93 (12): 5888–5893; Tian et al. (1997) Plant Cell Rep 16: 267–271; WO 97/41228 ), Chloramphenicol-Transferase (Fromm et al. (1985) Proc Natl Acad Sci USA 82: 5824–5828), Luciferase (Millar et al. (1992) Plant Mol Biol Rep 10: 324–414; Ow et al. (1986) Science, 234: 856–859), die den Nachweis von Biolumineszenz erlaubt; [beta]-Galactosidase, die ein Enzym codiert, für das verschiedene chromogene Substrate verfügbar sind, [beta]-Glucuronidase (GUS) (Jefferson et al. (1987) EMBO J 6: 3901–3907) oder das uidA-Gen, welches ein Enzym für verschiedene chromogene Substrate codiert, R-Locus-Genprodukt-Protein, welches die Erzeugung von Anthocyanin-Pigmenten (rote Färbung) in Pflanzengeweben reguliert und somit eine direkte Analyse der Promotoraktivität ohne Zugeben zusätzlicher Hilfsstoffe oder chromogener Substrate möglich macht (Dellaporta et al., in: Chromosome Structure and Function: Impact of New Concepts, 18th Stadler Genetics Symposium 11: 263–282, 1988), [beta]-Lactamase (Sutcliffe (1978) Proc Natl Acad Sci USA 75: 3737–3741); Enzym für verschiedene chromogene Substrate (z. B. PADAC, ein chromogenes Cephalosporin); xyIE-Genprodukt (Zukowsky et al. (1983) Proc Natl Acad Sci USA 80: 1101–1105); Catechol-Dioxygenase, welche chromogene Catechole umwandeln kann; alpha-Amylase (Ikuta et al. (1990) Biol. Technol. 8: 241–242); Tyrosinase (Katz et al. (1983) J Gen Microbiol 129: 2703–2714); Enzym, das Tyrosin zu DOPA und Dopachinon oxidiert, welche anschließend das leicht nachzuweisende Melanin bilden; Aequorin (Prasher et al. (1985) Biochem Biophys Res Commun 126 (3): 1259–1268), das beim Calcium-sensitiven Biolumineszenz-Nachweis verwendet werden kann.
b) Replikationsursprünge, welche eine Vervielfachung der Expressionskassetten oder Vektoren der Erfindung zum Beispiel in E. coli gewähren. Beispiele, die erwähnt werden können, sind ORI (”Origin” der DNA-Replikation), der pBR322-ori oder der P15A-ori (Sambrook et al.: Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2. Aufl. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y., 1989).
c) Elemente, zum Beispiel ”Border-Sequenzen”, welche den Agrobakterien-vermittelten Transfer in Pflanzenzellen zur Übertragung und Integration in das Pflanzengenom möglich machen, wie zum Beispiel die rechte oder linke Border der T-DNA oder die vir-Region.
d) Mehrfach-Klonierungsregionen (MCS) gestatten und erleichtern die Insertion von einer oder mehreren Nukleinsäuresequenzen.

Der Fachmann kennt verschiedene Wege zum Erhalten einer Expressionskassette der Erfindung. Die Herstellung einer Expressionskassette der Erfindung findet zum Beispiel durch Fusionieren einer der Expressionssteuerungssequenz(en) der Erfindung mit einer zu exprimierenden Nukleinsäuresequenz von Interesse, falls angemessen mit einer für ein Transitpeptid codierenden Sequenz, welche vorzugsweise zwischen dem Promotor und der betreffenden Nukleinsäuresequenz positioniert wird, und mit einem Terminator oder Polyadenylierungssignal statt. Herkömmliche Techniken zur Rekombination und Klonierung werden für diesen Zweck angewandt (wie oben beschrieben).
Es ist analog für eine transgen zu exprimierende Nukleinsäuresequenz ebenfalls möglich, zum Beispiel durch homologe Rekombination, hinter den endogenen, natürlichen Promotor platziert zu werden, was zu einer Expressionskassette der Erfindung führt, welche die Expression der transgen zu exprimierenden Nukleinsäuresequenz steuert.
Im Prinzip betrachtet die Erfindung ebenfalls Zellen, Zellkulturen, Teile – wie zum Beispiel Wurzeln, Blätter, Samen, etc., im Fall von transgenen Pflanzenorganismen – und transgenes Fortpflanzungsmaterial, wie Samen oder Früchte, die aus den oben beschriebenen transgenen Organismen abgeleitet sind.
Genetisch modifizierte Pflanzen der Erfindung, welche von Menschen und Tieren verzehrt werden können, können auch als menschliche Nahrung oder Tiernahrung, zum Beispiel direkt oder nach einer Verarbeitung in einer per se bekannten Weise, verwendet werden.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft daher die Verwendung der oben beschriebenen transgenen Organismen der Erfindung und der Zellen, Zellkulturen, Teile – wie zum Beispiel Wurzeln, Blätter, Samen, etc., im Fall von transgenen Pflanzenorganismen – und transgenem Fortpflanzungsmaterial, wie Samen oder Früchten, die daraus abgeleitet sind, zur Herstellung von Nahrungsmitteln für Menschen oder Tiere, Pharmazeutika oder Feinchemikalien.
Ferner wird einem Verfahren für die rekombinante Herstellung von Pharmazeutika oder Feinchemikalien in Wirtsorganismen der Vorzug gegeben, in welchem ein Wirtsorganismus mit einer/m der oben beschriebenen Expressionskassetten oder Vektoren transformiert wird, und wobei diese Expressionskassette ein oder mehrere Strukturgene umfasst, welche die gewünschte Feinchemikalie codieren oder die Biosynthese der gewünschten Feinchemikalie katalysieren, der transformierte Wirtsorganismus kultiviert wird, und die gewünschte Feinchemikalie aus dem Kulturmedium isoliert wird. Dieses Verfahren ist im weiten Umfang auf Feinchemikalien, wie Enzyme, Vitamine, Aminosäuren, Zucker, Fettsäuren, natürliche und synthetische Aromastoffe, aromatisierende Substanzen und Färbemittel, anwendbar. Die Herstellung von Tocopherolen und Tocotrienolen und von Carotinoiden wird besonders bevorzugt. Die Kultivierung der transformierten Wirtsorganismen und die Isolierung aus den Wirtsorganismen oder aus dem Kulturmedium findet mittels dem Fachmann bekannten Verfahren statt. Die Herstellung von Pharmazeutika, wie zum Beispiel Antikörpern oder Impfstoffen, ist in Hood E E, Jilka J M (1999). Curr Opin Biotechnol 10 (4): 382–6; Ma J K, Vine N D (1999). Curr Top Microbiol Immunol 236: 275–92, beschrieben.
Alle in dieser Patentbeschreibung zitierten Bezugsstellen sind hiermit durch den Bezug darauf in Hinsicht auf ihren gesamten Offenbarungsgehalt und den Offenbarungsgehalt, der in dieser Patentbeschreibung spezifisch erwähnt wird, einbezogen.
FIGUREN
1. Sequenz von KG_Fragment 86 (SEQ ID NR: 10)
2. Sequenz von 62260557.f_o13_1 Mais (SEQ ID NR: 11)
3. q-RT-PCR-Ergebnisse, welche die gesamtsamenspezifische Expression von 62260557.f_o13_1 Mais zeigen [Root_dv: eine Mischung von Wurzeln bei 5, 15, 30 Tagen nach der Bestäubung (DAP); Leaf_dv: eine Mischung von Blättern bei 5, 15, 30 DAP; Ähre: eine Mischung von Ähren bei 5 und 10 DAP; Ganze Samen: eine Mischung von ganzen Samen bei 15, 20, 30 DAP; Endosperm: eine Mischung von Endosperm bei 15, 20, 30 DAP; Embryo: eine Mischung von Embryonen bei 15, 20, 30 DAP; Root_V2 + V4: eine Mischung von Wurzeln bei V2- und V4-Stadien; Shoot/leaf_V2 + V4: eine Mischung von V2-Spross und V4-Blättern; Flower_GS: eine Mischung aus Blüte und keimenden Samen].
4. Die entsprechende CDS-Sequenz von KG Fragment 86 (SEQ ID NR: 4)
5. Aminosäuresequenz des abgeleiteten Proteins von dem entsprechenden Gen von KG_Fragment 86 (SEQ ID NR: 5)
6. Die Sequenz von AZM5_7833 (SEQ ID NR: 128), enthaltend die vorausgesagte CDS-Sequenz und die Stromaufwärts-Promotor-Region. Die 5'UTR (127 bp) wurde durch Vergleichen der genomischen Sequenz mit der Mais-EST-Sequenz bestimmt und ist in Kursivdruck angegeben, der vorausgesagte offene Leserahmen ist unterstrichen, und die zum Isolieren der Promotorregion verwendeten Primer sind in Fettdruck formatiert.
7. Sequenz von Promoter KG86 (p-KG86) (SEQ ID NR: 1)
8. Diagramm des Vektors RKF126
9. Sequenz von RKF126 (SEQ ID NR: 56)
10. GUS-Expression in verschiedenen Geweben bei verschiedenen Entwicklungsstadien, angetrieben durch p-KG86 in transgenem Mais mit RKF126
11. A) Sequenzen von ZM1s61973481 (SEQ ID NR: 57), B) ZM1s61221800 (SEQ ID NR: 58) und C) ZM1s62042561 (SEQ ID NR: 59)
12. q-RT-PCR-Ergebnisse, welche die gesamtsamenspezifische Expression von MAWS42 zeigen [Root_dv: eine Mischung von Wurzeln bei 5, 15, 30 Tagen nach Bestäubung (DAP); Leaf_dv: eine Mischung von Blättern bei 5, 15, 30 DAP; Ähre: eine Mischung von Ähren bei 5 und 10 DAP; Ganze Samen: eine Mischung von ganzen Samen bei 15, 20, 30 DAP; Endosperm: eine Mischung von Endosperm bei 15, 20, 30 DAP; Embryo: eine Mischung von Embryonen bei 15, 20, 30 DAP; Root_V2 + V4: eine Mischung von Wurzeln bei V2- und V4-Stadien; Shoot/leaf_V2 + V4: eine Mischung von V2-Spross und V4-Blättern; Flower_GS: eine Mischung aus Blüte und keimenden Samen].
13. q-RT-PCR-Ergebnisse, welche die gesamtsamenspezifische Expression von MAWS45 zeigen [Root_dv: eine Mischung von Wurzeln bei 5, 15, 30 Tagen nach der Bestäubung (DAP); Leaf_dv: eine Mischung von Blättern bei 5, 15, 30 DAP; Ähre: eine Mischung von Ähren bei 5 und 10 DAP; Ganze Samen: eine Mischung von ganzen Samen bei 15, 20, 30 DAP; Endosperm: eine Mischung von Endosperm bei 15, 20, 30 DAP; Embryo: eine Mischung von Embryonen bei 15, 20, 30 DAP; Root_V2 + V4: eine Mischung von Wurzeln bei V2- und V4-Stadien; Shoot/leaf_V2 + V4: eine Mischung von V2-Spross und V4-Blättern; Flower_GS: eine Mischung aus Blüte und keimenden Samen].
14. Die entsprechende CDS-Sequenz von MAWS42 (SEQ ID NR: 6).
15. Aminosäuresequenz des ZmTIP3-1 des MAWS42 entsprechenden Gens (SEQ ID NR: 7).
16. Die entsprechende CDS-Sequenz von MAWS45 (SEQ ID NR: 8).
17. Aminosäuresequenz des MAWS45 entsprechenden Gens (SEQ ID NR: 9).
18. Die Sequenzen von AZM5_17960 (SEQ ID NR: 70) und AZM5_6324 (SEQ ID NR: 71), welche die vorhergesagte CDS-Sequenz (ATG fett unterstrichen), die vorhergesagte 5'-UTR (kursiv) und die zusätzliche putative Promotorsequenz enthalten. Die 5'-UTR-Sequenzen wurden durch Vergleichen der genomischen Sequenz mit dem Mais-EST bestimmt.
19. Sequenzen von Promotor MAWS42 (p-MAWS42), SEQ ID NR: 2, und Promotor MAWS45 (p-MAWS45), SEQ ID NR: 3
20. Diagramm von RTP1052
21. Sequenz von RTP1052 (SEQ ID NR: 116)
22. Diagramm von RTP1057
23. Sequenz von RTP1057 (SEQ ID NR: 117)
24. GUS-Expression in verschiedenen Geweben bei verschiedenen Entwicklungsstadien, angetrieben durch p-MAWS42 in transgenem Mais mit RTP1052
25. GUS-Expression in verschiedenen Geweben bei verschiedenen Entwicklungsstadien, angetrieben durch p-MAWS45 in transgenem Mais mit RTP1057
BEISPIELE
Die Erfindung wird nun durch die folgenden Beispiele veranschaulicht, welche keineswegs dazu beabsichtigt sind, den Umfang dieser Anwendung zu beschränken.
Beispiel 1: Identifizierung und Validierung des Mais-Gesamtsamen-Promotors KG86 Identifizierung des Transkripts von KG86

Eine Mais-Genexpressions-Profilerstellungs-Analyse wurde mit Hilfe eines kommerziellen Anbieters von AFLP-Technologie zum Vergleichen der Expression (Keygene N. V., P. O. Box 216, 6700 AE Wageningen, Niederlande) unter Verwendung einer Reihe von RNA-Proben aus 23 Maisgeweben, die seitens BASF erzeugt wurden (Tabelle 1), durchgeführt. Unter der AFLP-Banden, von denen festgestellt wurde, dass sie eine Gesamtsamen-spezifische Expression aufzeigten, befand sich ein 231 bp großes Fragment, das ”KG_Fragment 86” genannt wurde. Die Sequenz von KG_Fragment 86 ist in der 1 gezeigt.

Tabelle 1. Maisgewebe, verwendet für mRNA-Expression-Profllerstellungs-Experiment
Probe Nr.	Gewebe	Zeit und Anzahl von Pflanzen	Tage nach Bestäubung
1	Wurzel	9 am (4 Pflanzen)	5
2		9 am (4 Pflanzen)	15
3		9 am (4 Pflanzen)	30
4	Blatt über der Ähre	9 am (6 Pflanzen)	5
5		9 am (6 Pflanzen)	15
6		9 am (6 Pflanzen)	30
7	Ähre, vollständig	9 am (6 Pflanzen)	5
8	Ähre, vollständig	9 am (6 Pflanzen)	10
9	Gesamtsamen	9 am (6 Pflanzen)	15
10		9 am (6 Pflanzen)	20
11		9 am (6 Pflanzen)	30
12	Endosperm	9 am (6 Pflanzen)	15
13		9 am (6 Pflanzen)	20
14		9 am (6 Pflanzen)	30
15	Embryo	9 am (6 Pflanzen)	15
16		9 am (6 Pflanzen)	20
17		9 am (6 Pflanzen)	30
18	weibliche Stempelblüte	6 Pflanzen	vor Bestäubung
19	keimender Samen	20 Samen	Quellung während 3 Tagen
20	Wurzel, veg. Stufe		V2
21	Wurzel, veg. Stufe		V4
22	Blatt, veg. Stufe		V2
23	Blatt, veg. Stufe		V4

Identifizierung des Gens, welches dem KG_Fragment 86 entspricht Die Sequenz von KG_Fragment 86 wurde als Suchsequenz für eine BLASTN-Suche gegen die firmeneigene BASF-Datenbank, HySeq All EST, verwendet. Es wurde festgestellt, dass ein Eintrag, 62260557.f_o13_1 Mais, der 97%-Identitäten zum KG_Fragment 86 zeigt, die höchste Homologie zu KG_Fragment 86 aufweist. Die Sequenz von 62260557.f_o13_1 Mais ist in der 2 gezeigt.
Bestätigung des Expressionsmusters von 62260557.f_o13_1 Mais mit Hilfe von quantitativer Reverse-Transkriptase-Polymerasekettenreaktion (qRT-PCR) Um das native Expressionsmuster von 62260557.f_o13_1 Mais zu bestätigen, wurde quantitative Reverse-Transkription-PCR (q-RT-PCR) unter Verwendung von Gesamt-RNA durchgeführt, welche aus den gleichen Materialien isoliert wurde, wie sie für die AFLP-Expressions-Profilerstellung verwendet wurden (Tabelle 1).
Primer für qRT-PCR wurden basierend auf den Sequenzen von 62260557.f_o13_1 Mais und von KG_Fragment 86 mit Hilfe des Softwarepakets Vector NTI (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) entworfen. Zwei Sätze von Primern wurden zur PCR-Amplifikation von 62260557.f_o13_1 Mais verwendet (Tabelle 2). Das Glyceraldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase(GAPDH)-Gen diente als Kontrolle für Normalisierungszwecke. Tabelle 2. Primersequenzen für q-RT-PCR
Die q-RT-PCR wurde unter Verwendung von SuperScript III Reverse Transcriptase (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) und SYBR Green QPCR Master Mix (Eurogentec, San Diego, CA, USA) in einem ABI Prism 7000-Sequenznachweis-System durchgeführt. cDNA wurde unter Verwendung von 2–3 μg Gesamt-RNA und 1 μl Reverse Transkriptase in einem Volumen von 20 μl synthetisiert. Die cDNA wurde auf einen Bereich von Konzentrationen (15–20 ng/μl) verdünnt. Dreißig bis vierzig ng cDNA wurden für die quantitative PCR (qPCR) in einem Volumen von 30 μl mit SYBR Green QPCR Master Mix unter Befolgung der Anweisungen des Herstellers verwendet. Die Thermozyklierungs-Bedingungen waren wie folgt: Inkubieren bei 50°C während 2 Minuten, Denaturieren bei 95°C während 10 Minuten, und Durchführen von 40 Zyklen bei 95°C während 15 Sekunden und 60°C während 1 Minute zur Amplifikation. Nach dem letzten Zyklus der Amplifikation, wurde die Dissoziationskurven-Analyse durchgeführt, um zu bestätigen, dass die Amplifikation spezifisch stattfand und kein Primer-Dimerprodukt während des Amplifikationsverfahrens erzeugt wurde. Das Haushaltsgen Glyceraldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase (GAPDH, Primersequenzen in Tabelle 2) wurde als ein endogenes Referenzgen zum Normalisieren der Berechnung unter Anwendung der ”Comparative Ct (Cycle of threshold) value”- bzw. ”Vergleichs-Ct(Schwellenzyklus)-Wert”-Methode verwendet. Der ΔCT-Wert wurde durch Subtrahieren des Ct-Werts des GAPDH-Gens von dem Ct-Wert des Kandidatengens (62260557.f_o13_1 Mais) erhalten, und die relative Transkriptionsquantität (Expressionsspiegel) des Kandidatengens wurde als 2^–ΔCF ausgedrückt. Die q-RT-PCR-Ergebnisse sind in 3 zusammengefasst. Beide Primersätze ergaben ähnliche Expressionsmuster, welche äquivalent zu den Expressionsmustern sind, welche aus den AFLP-Daten erhalten wurden.
Annotierung bzw. Erläuterung des KG_Fragments 86

Die codierende Sequenz von KG Fragment 86 wurde basierend auf den In-silico-Ergebnissen annotiert, welche sowohl aus einer BLASTX-Durchsuchung der EST 62260557.f_o13_1 Mais-Sequenz gegen die GenBank-Proteindatenbank (nr) als auch aus dem Ergebnis einer In-silico-Translation der Sequenz mit Hilfe des Vector NTI-Softwarepakets erhalten wurden. Die EST 62260557.f_o13_1 Mais-Sequenz codiert ein partielles Protein mit der höchsten Homologie zu dem Reisgen, das als das hypothetische Protein OsI_025737 (GenBank-Eintrag: EAZ04505.1) annotiert wird. Die besten 15 homologen Sequenzen, die im BlastX-Suchlauf identifiziert wurden, sind in Tabelle 3 dargestellt. Tabelle 3. Ergebnisse der BLASTX-Suche von Mais-EST 62260557.f_o13_1

Zugangsnummer	Beschreibung	Wertung	E-Wert
EAZO4505.1	hypothetisches Protein OsI_025737 Oryza sativa (indica Kultivar-Gruppe)]	152	8e-36
BAC22280.1	hypothetisches Protein [Oryza sativa (japonica)]	152	8e-36
EAZ40462.1	hypothetisches Protein OsJ_023945 [Oryza sativa (japonica)]	146	5e-34
CAO61483.1	unbenanntes Proteinprodukt [Vitis vinifera]	114	2e-24
ABK28018.1	unbekannt [Arabidopsis thaliana]	100	6e-20
NP_001117365.1	unbekannt [Arabidopsis thaliana]	100	6e-20
AAF99742.1	F17L21.26 [Arabidopsis thaliana]	100	6e-20
XP_001751813.1	vorhergesagtes Protein [Physcomitrella patens subsp. Patens]	75	1e-12
XP_001778474.1	vorhergesagtes Protein [Physcomitrella patens subsp. Patens]	74	5e-12
CAN72846.1	hypothetisches Protein [Vitis vinifera]	69	2e-10
XP_001763429.1	vorhergesagtes Protein [Physcomitrella patens subsp. Patens]	67	6e-10
CAO14607.1	unbenanntes Proteinprodukt [Vitis vinifera]	55	2e-06
NP_001067585.1	Os11g0241200 [Oryza sativa (japonica)]	52	1e-05
ABK28287.1	unbekannt [Arabidopsis thaliana]	51	3e-05
NP_198895.1	unbekanntes Protein [Arabidopsis thaliana]	51	3e-05

Die CDS-Sequenz von KG_Fragment 86 ist in 4 gezeigt, und die abgeleitete Aminosäuresequenz ist in der 5 gezeigt.
Identifizierung der Promotorregion
Für unsere Promotoridentifizierungs-Zwecke wurde die Sequenz stromaufwärts des Startcodons des vorhergesagten KG_Fragment 86-Gens als der Promotor p-KG86 definiert. Um diese Promotorregion zu identifizieren, wurde die Sequenz von 62260557.f_o13_1 bezüglich der proprietären genomischen DNA-Sequenzdatenbank von BASF Plant Science, PUB_tigr_maize_genomic_partial_5.0.nt, kartiert. Eine genomische Mais-DNA-Sequenz, AZM5_7833 (5084 bp), wurde identifiziert. Diese 5084 bp große Sequenz beinhaltete die CDS des KG_Fragment 86 und mehr als 2 kb Sequenz stromaufwärts des ATG-Startcodons dieses Gens (6).
Isolierung der Promotorregion durch PCR-Amplifikation
Die vermutete Promotorregion wurde durch genomische PCR unter Verwendung der folgenden sequenzspezifischen Primer isoliert:
Vorwärtsprimer: tcccgtgtccgtcaatgtgata (SEQ ID NR: 18)
Rückwärtsprimer: Ggactcacgagctgaggctcgg (SEQ ID NR: 19)
Das erwartete 1198-bp-Fragment wurde aus genomischer Mais-DNA amplifiziert und als Promotor KG86 (p-KG86) annotiert. Die Sequenz von p-KG86 wurde in 7 gezeigt.
PLACE-Analyse des Promotors KG86
Cis-wirksame Motive in der 1198 bp großen KG86-Promotorregion wurden unter Verwendung von PLACE (einer Datenbank von ”Pflanzlichen Cis-wirkenden Regulatorischen DNA-Elementen”) mit Hilfe der Genomatix-Datenbank-Suite identifiziert. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 aufgelistet. Obwohl keine vermeintliche Consensus-TATA-Box im Vorwärts-Strang identifiziert wurde, wird ein CAAT-Box-Motiv an Nukleotidposition 701–705 im Vorwärts-Strang gefunden.
Konstruktion eines binären Vektors für die Maistransformation zur Auswertung der Funktion von p-KG86
Zur Erleichterung der Subklonierung wurde das 1198-bp-Promotorfragment modifiziert durch die Zufügung einer PacI-Restriktionsenzym-Stelle an seinem 5'-Ende und einer BsiWl-Stelle an seinem 3'-Ende. Das PacI-pKG86-BsiWl-Promotorfragment wurde verdaut und in einen mit PacI und BsiWl verdauten basalen binären BPS-Vektor HF84 ligiert. HF84 umfasst eine pflanzliche selektierbare Marker-Expressionskassette (p-Ubi::c-EcEsdA::t-NOS) sowie eine Promotor-Auswertungskassette, die aus einer Mehrfachklonierungsstelle zur Insertion von putativen Promotoren über PacI und BsiWl, dem Reis-MET1-1-Intron zur Bereitstellung von Intron-vermittelter Verstärkung in Monokotylen-Zellen, dem GUS-Reportergen und dem NOS-Terminator besteht. Der resultierende binäre Vektor, der die p-KG86::i-MET1::GUS::t-NOS-Expressionskassette umfasst, wurde als RKF126 bezeichnet und wurde zur Auswertung des Expressionsmusters, das durch den p-KG86-Promotor angetrieben wird, verwendet. Die 8 ist ein Diagramm von RKF126. Die Sequenz des binären Vektors RKF126 ist in der 9 gezeigt.
Promotor-Auswertung in transgenem Mais mit RKF126
Expressionsmuster und Spiegel, welche von dem p-KG86-Promotor angetrieben werden, wurden unter Anwendung der histochemischen GUS-Analyse unter Befolgung des Protokolls des Stands der Technik (Jefferson 1987) gemessen. Die Maistransformation wurde unter Verwendung eines Agrobacterium-vermittelten Transformationssystems durchgeführt. Zehn und fünf Einzelkopie-Ereignisse für T0- und T1-Pflanzen wurden für die Promotoranalyse ausgewählt. Die GUS-Expression wurde bei verschiedenen Entwicklungsstadien gemessen:

1) Wurzeln und Blätter beim 5-Blattstadium
2) Stengel beim V-7-Stadium
2) Blätter, Spelze und Seidefäden beim Blütestadium (erste Emergenz von Seidefäden)
3) Ährchen/Quast (bei Bestäubung)
5) Ähre oder Körner bei 5, 10, 15, 20 und 25 Tagen nach der Bestäubung (DAP)

Die Ergebnisse wiesen darauf hin, dass der Promotor p-KG86 von RKF126 eine Expression spezifisch in Pollen und in ganzen Samen zeigte (10).
Beispiel 2: Identifizierung und Validierung von Mais-Gesamtsamen-Promotor MAWS42 und MAWS45
Identifizierung des Transkripts von MAWS42 und MAWS45
Eine Mikroarray-Studie wurde durchgeführt, um Transkripte mit Gesamtsamen-spezifischer Expression in Mais zu identifizieren, wobei die gleiche Auswahl an Mais-RNA-Proben, die in Tabelle 1 gezeigt sind, verwendet wird. Die dreiundzwanzig markierten RNAs dieser Maisgewebe wurden separat an 23 von unseren eigens entworfenen BPS-Mais-Affymetrix-Chips hybridisiert, mit fluoreszierendem Streptavidin-Antikörper markiert, gewaschen, gefärbt und gescannt, wie im ”Affymetrix Expression Analysis Technical Manual” vorgeschrieben.
Die Chip-Hybridisierungsdaten wurden unter Verwendung von Genedata Specialist-Software analysiert, und der relative Expressionsspiegel wurde basierend auf der Hybridisierungs-Signalintensität von jedem Gewebe bestimmt.
Drei der BPS-Mais-Chip-Sondensätze wurden als Kandidatentranskripte selektiert, welche eine 3–8fach höhere Expression in Gesamtsamen verglichen mit anderen Geweben zeigten: ZM1s61973481_at, ZM1s61221800_s_at und ZM1s62042561_at. Consensus-Sequenzen von ZM1s61973481_at, ZM1s61221800_s_at und ZM1s62042561_at sind in der 11 gezeigt.
Die vorläufige Sequenzanalyse zeigte, dass ZM1s61221800 in ZM1s62042561 enthalten ist, weshalb wir davon ausgingen, dass ZM1s61221800 und ZM1s62042561 das gleiche Gen repräsentieren; weitere Studien für dieses Gen wurden auf Basis von ZM1s62042561 durchgeführt. Zum Zweck der bequemeren Darstellung benannten wir ZM1s61973481 als Kandidat MAWS42 und ZM1s62042561 als MAWS45.
Bestätigung des Expressionsmusters von MAWS42 und MAWS45 mit Hilfe der quantitativen Reverse-Transkriptase-Polymerasekettenreaktion (q-RT-PCR) Die Bestätigung der nativen Expressionsmuster von MAWS42 und MAWS45 wurde mittels quantitativer Reverse-Transkription-PCR (q-RT-PCR) unter Verwendung von Gesamt-RNA durchgeführt, welche aus den gleichen Materialien isoliert wurde, wie sie für die Chip-Untersuchung verwendet wurden (Tabelle 1).
Primer für qRT-PCR wurden basierend auf den Sequenzen von ZM1s61973481 für MAWS42 und ZM1s62042561 für MAWS45 entworfen, wobei das Softwarepaket Vector NTI angewandt wurde. Zwei Sätze an Primern wurden für die PCR-Amplifikation jedes Gens verwendet. Die Primersequenzen sind in Tabelle 5 aufgeführt. Das Glyceraldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase(GAPDH)-Gen diente als eine Kontrolle zur Normalisierung. Tabelle 5. Primersequenzen für q-RT-PCR
Die q-RT-PCR wurde mit Hilfe von SuperScript III Reverse Transcriptase (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) und SYBR Green QPCR Master Mix (Eurogentec, San Diego, CA, USA) in einem ABI Prism 7000-Sequenz-Nachweissystem durchgeführt. cDNA wurde unter Verwendung von 2–3 μg Gesamt-RNA und 1 μl Reverse Transkriptase in einem Volumen von 20 μl synthetisiert. Die cDNA wurde auf einen Bereich von Konzentrationen (15–20 ng/μl) verdünnt. Dreißig bis vierzig ng cDNA wurden für die quantitative PCR (qPCR) in einem Volumen von 30 μl mit SYBR Green QPCR Master Mix unter Befolgung der Anweisungen des Herstellers verwendet. Die Thermozyklierungs-Bedingungen waren wie folgt: Inkubieren bei 50°C während 2 Minuten, Denaturieren bei 95°C während 10 Minuten, und Durchführen von 40 Zyklen bei 95°C während 15 Sekunden und 60°C während 1 Minute zur Amplifikation. Nach dem letzten Zyklus der Amplifikation, wurde die Dissoziationskurven-Analyse durchgeführt, um zu bestätigen, dass die Amplifikation spezifisch stattfand und kein Primer-Dimerprodukt während des Amplifikationsverfahrens erzeugt wurde. Das Haushaltsgen Glyceraldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase (GAPDH, Primersequenzen in Tabelle 2) wurde als ein endogenes Referenzgen zum Normalisieren der Berechnung unter Anwendung der ”Comparative Ct (Cycle of threshold) value”-Methode verwendet. Der ΔCT-Wert wurde durch Subtrahieren des Ct-Werts des GAPDH-Gens von dem Ct-Wert der Kandidatengene erhalten. Die relative Transkriptionsquantität (Expressionsspiegel) des Kandidatengens wurde als 2^–ΔCT ausgedrückt. Die qRT-PCR-Ergebnisse wurden in 12 und 13 zusammengefasst. Beide Primersätze ergaben ähnliche Expressionsmuster, wie sie in der Mikroarray-Studie erhalten wurden.
Annotierung von MAWS42 und MAWS45

Die codierenden Sequenzen, die den MAWS42- und MAWS45-Genen entsprechen, wurden basierend auf den In-silico-Ergebnissen annotiert, welche sowohl aus dem BLASTX der Chip-Consensus-Sequenzen von ZM1s61973481 und von ZM1s62042561 gegen die GenBank-Proteindatenbank (nr) als auch aus Ergebnissen aus dem Translationsprogramm des Vector NTI-Softwarepakets erhalten wurden. ZM1s61973481 codiert partiell ein Mais-Tonoplasten-intrinsisches Protein 3-1 (ZmTIP3). Die CDS von ZmTIP3-1 (Gen-Bank-Eintrag: NP_0011050321) ist in 14 gezeigt, die translatierte Aminosäuresequenz ist in 15 gezeigt, und die besten 15 homologen Sequenzen aus dem BLASTX-Suchlauf sind in der Tabelle 6 dargestellt. Tabelle 6. Ergebnisse der BLASTX-Suche von Mais-ZM1s61973481 (MAWS42)

Zugangsnummer	Beschreibung	Wertung	E-Wert
NP_001105032.1	TIP31_MAIZE Aquaporin TIP3-1 (Tonoplasten-intrinsisches Protein 3-1)	150	8e-73
NP_001064933.1	0s10g0492600 [Oryza sativa (japonica)]	147	4e-64
NP_001105045.1	TIP32_MAIZE Aquaporin TIP3-2 (Tonoplasten-intrinsisches Protein 3-2) (ZmTIP3-2) Membranprotein MP23-Präkursor [Cucurbita cv. Kurokawa Amakuri]	139	5e-63
BAA08107.1		98	5e-42
CAA44669.1	Tonoplasten-intrinsisches Protein [Phaseolus vulgaris]	98	4e-40
BAA08108.1	T10253 Membranprotein MP28 [Cucurbita cv. Kurokawa Amakuri]	92	6e-39
ABK22410.1	unbekannt [Picea sitchensis]	98	6e-33
ABK22242.1	unbekannt [Picea sitchensis]	94	5e-32
NP_001053371.1\|	Os04g0527900 [Oryza sativa (japonica Kultivar-Gruppe)]	85	2e-24
CAA64952.1	Tonoplasten-intrinsisches Protein [Tulipa gesneriana]	96	2e-24
EAY94920.1	hypothetisches Protein OsI_016153 [Oryza sativa (indica Kultivar-Gruppe)]	86	2e-24
CAB39758.1	Haupt-Intrinsisches-Protein [Picea abies]	111	4e-24
AAC39480.1	Aquaporin [Vernicia fordii]	87	8e-24
CAO62035.1	unbenanntes Proteinprodukt [Vitis vinifera]	110	5e-22
BAD04010.1	Tonoplasten-intrinsisches Protein [Prunus persica]	109	6e-22

ZM1s62042561 (MAWS45) codiert ein partielles Protein, das die höchste Homologie zu einem unbekannten Protein aus Mais (GenBank-Eintrag: ACF84237.1) aufweist. Die CDS dieses Gens ist in 16 gezeigt, die translatierte Aminosäuresequenz ist in der 17 gezeigt, und die besten 15 homologen Sequenzen aus dem BLASTX-Suchlauf sind in der Tabelle 7 dargestellt. Tabelle 7. Ergebnisse der BLASTX-Suche von Mais-ZM1s62042561 (MAWS45)

Zugangsnummer	Beschreibung	Wertung	E-Wert
ACF84237.1	unbekannt [Zea mays]	536	e-152
ACG56678.1	Tryptophan-Aminotransferase [Zea mays] Os05g0169300 [Oryza sativa (japonica Kultivar-	534	e-151
NP_001054761.1	Gruppe)]	239	e-100
EAY96695.1	hypothetisches Protein OsI_017928 [Oryza saliva (indica Kultivar-)]	239	e-100
EAY96696.1	hypothetisches Protein OsI_017929 [Oryza sativa (indica Kultivar-Gruppe)]	233	4e-98
EAY72702.1	hypothetisches Protein OsI_000549 [Oryza sativa (indica Kultivar-Gruppe)]	167	9e-85
BAD68317.1	putativer Alliinase-Präkursor [Oryza sativa Japonica Gruppe]	167	9e-85
EAZ10701.1	hypothetisches Protein OsJ_000526 [Oryza sativa (japonica Kultivar-Gruppe)]	167	9e-85
ACF80703.1	unbekannt [Zea mays]	204	2e-79
EAZ33023.1	hypothetisches Protein OsJ_016506 [Oryza sativa (japonica Kultivar-Gruppe)]	158	3e-75
AAM69848.1	putative Allen-Lyase [Aegilops tausche]	265	1e-73
NP_001042135.1	Os01g0169800 [Oryza sativa (japonica Kultivar-Gruppe)]	167	7e-73
CA064270.1	unbenanntes Proteinprodukt [Vitis vinifera]	221	5e-71
CAN80923.1	hypothetisches Protein [Vitis vinifera]	221	7e-71
CA016122.1	unbenanntes Proteinprodukt [Vitis vinifera]	157	1e-61

Identifizierung der Promotorregion
Die Sequenzen stromaufwärts der Startcodons der entsprechenden Gene zu MAWS42 und MAWS45 wurden als die putativen Promotoren p-MAWS42 und p-MAWS45 definiert.
Um diese putativen Promotorregionen zu identifizieren, wurden die Sequenzen von ZM1s61973481 und ZM1s62042561 bezüglich der proprietären genomischen DNA-Sequenzdatenbank PUB_tigr_maize_genamic_partial_5.0.nt von BASF Plant Science kartiert. Zwei genomische Mais-DNA-Sequenzen, AZM5_17960 (3985 bp) bzw.
AZM5_6324 (4565 bp), wurden identifiziert. Die Sequenz von AZM5_17960 weist etwa 1 kb Sequenz stromaufwärts der vorhergesagten CDS des MAWS42 entsprechenden Gens auf, und AZM5_6324 umfasst etwa 1,5 kb Sequenz stromaufwärts der vorhergesagten CDS des zu MAWS45 entsprechenden Gens. Diese Stromaufwärts-Sequenzen wurden als putativer Promotor MAWS42 (p-MAWS42) und Promotor MAWS45 (p-MAWS45) betrachtet. Die 18 zeigt Sequenzen von AZM5_17960 und die Sequenz AZM5_6324.
Isolierung der Promotorregion durch PCR-Amplifikation

Die vermeintlichen Promotorsequenzen wurden durch genomische PCR unter Verwendung der sequenzspezifischen Primer isoliert, die in Tabelle 8 aufgeführt sind. Ein Fragment von 1008 bp von AZM5_17960 und ein Fragment von 1492 bp von AZM5_6324 wurden aus genomischer Mais-DNA amplifiziert. Diese Fragmente wurden als Promotor MAWS42 (pMAWS42) bzw. Promotor MAWS45 (p-MAWS45) benannt. Sequenzen von p-MAWS42 und p-MAWS45 sind in der 19 gezeigt. Tabelle 8. Primer zur PCR-Klonierung von pMAWS42 und p-MAWS45

Primer	Sequenz (SEQ ID NR)
p-MAWS42_forward	taactcatatccggttagata (72)
p-MAWS42_reverse	gtcgtcgccaaataaaaacctacc (73)
p-MAWS45_forward	atttaaatgtgttggataatct (74)
p-MAWS45_reverse	ctcctcctcctcctcctcctcct (75)

PLACE-Analyse der Promotoren MAWS42 und MAWS45
Cis-wirksame Motive in der 1008 bp großen p-MAWS42- und 1492 bp großen p-MAWS45-Promotorregion wurden unter Verwendung von PLACE (einer Datenbank von ”Pflanzlichen Cis-wirkenden Regulatorischen DNA-Elementen”) mit Hilfe der Genomatix-Datenbank-Suite identifiziert. Die Ergebnisse sind in Tabelle 9 und Tabelle 10 aufgelistet.
Konstruktion binärer Vektoren für Maistransformation, um die Funktion von p-MAWS42 und p-MAWS45 auszuwerten
Das 1008-bp-Promotorfragment von p-MAWS42 wurde mittels PCR amplifiziert, wobei eine SwaI-Restriktionsenzym-Stelle an seinem 5'-Ende und eine BsiWl-Stelle an seinem 3'-Ende eingebaut wurden. Das resultierende Fragment wurde verdaut und in einen mit SwaI und BsiWl verdauten basalen binären BPS-Vektor CB1006 ligiert. Das Plasmid CB1006 ist ein Pflanzentransformationsvektor, der eine pflanzliche selektierbare Marker-Expressionskassette (p-Ubi::c-ZmAHASL2::t-NOS) sowie eine Promotor-Auswertungskassette umfasst, die aus einer Mehrfachklonierungsstelle zur Insertion von putativen Promotoren über SwaI- und BsiWl-Stellen, dem Reis-MET1-1-Intron zur Bereitstellung von Intron-vermittelter Verstärkung in Monokotylen-Zellen, dem GUS-Reportergen und dem NOS-Terminator besteht. Der resultierende binäre Vektor, der die p-MAWS42::i-MET1::GUS::t-NOS-Expressionskassette umfasst, wurde RTP1052 genannt und wurde zur Auswertung des Expressionsmusters, das von dem p-MAWS42-Promotor angetrieben wird, verwendet. Die 20 ist ein Diagramm von RTP1052. Die Sequenz des binären Vektors RTP1052 ist in 21 gezeigt.
Das 1492-bp-Promotorfragment von p-MAWS45 wurde mittels PCR amplifiziert, wobei eine SwaI-Restriktionsenzym-Stelle an seinem 5'-Ende und eine BsiWl-Stelle an seinem 3'-Ende eingebaut wurden. Das resultierende Fragment wurde verdaut und in einen mit SwaI und BsiWl verdauten basalen binären BPS-Vektor CB1006 ligiert. Das Plasmid CB1006 ist ein Pflanzentransformationsvektor, der eine pflanzliche selektierbare Marker-Expressionskassette (p-Ubi::c-ZmAHASL2::t-NOS) sowie eine Promotor-Auswertungskassette umfasst, die aus einer Mehrfachklonierungsstelle zur Insertion von putativen Promotoren über SwaI- und BsiWl-Stellen, dem Reis-MET1-1-Intron zur Bereitstellung von Intron-vermittelter Verstärkung in Monokotylen-Zellen, dem GUS-Reportergen und dem NOS-Terminator besteht. Der resultierende binäre Vektor, der die p-MAWS45::-MET1::GUS::t-NOS-Expressionskassette umfasst, wurde RTP1057 genannt und wurde zur Auswertung des Expressiorismusters, das von dem p-MAWS45-Promotor angetrieben wird, verwendet. Die 22 ist ein Diagramm von RTP1052. Die Sequenz des binären Vektors RTP1057 ist in 23 gezeigt.
Promotor-Auswertung in transgenem Mais mit RTP1052 oder RTP1057
Expressionsmuster und Spiegel, welche von den Promotoren p-MAWS42 oder p-MAWS45 angetrieben werden, wurden unter Anwendung der histochemischen GUS-Analyse unter Befolgung des Protokolls des Stands der Technik (Jefferson 1987) gemessen. Die Maistransformation wurde unter Verwendung eines Agrobacterium-vermittelten Transformationssystems durchgeführt. Zehn und fünf Einzelkopie-Ereignisse für T0- und T1-Pflanzen wurden für die Promotoranalyse gewählt. Die GUS-Expression wurde bei Verschiedenen Entwicklungsstadien gemessen:

1) Wurzeln und Blätter beim 5-Blattstadium
2) Stengel beim V-7-Stadium
2) Blätter, Spelze und Seidefäden beim Blütestadium (erste Emergenz von Seidefäden)
3) Ährchen/Quast (bei Bestäubung)
5) Ähre oder Körner 5, 10, 15, 20 und 25 Tage nach der Bestäubung (DAP)

Die Ergebnisse wiesen darauf hin, dass sowohl der Promotor p-MAWS42 von RTP1052 als auch der Promotor p-MAWS45 von RTP1057 eine Expression spezifisch in Pollen und in Gesamtsamen zeigten (24 und 25).
Beispiel 3:
Die Sequenz des pKG86-Promotors (SEQ ID NR: 1) wurde nach kurzen offenen Leserahmen, welche Allergenität oder Toxizität verleihen können, durchsucht, wobei man eine Datenbank verwendete, die allergene und toxische Peptide und Polypeptide umfasst. Es wurden kurze offene Leserahmen identifiziert, die Homologie zu Peptiden oder Polypeptiden zeigten, welche in der Datenbank enthalten waren. Zur Vermeidung der Expression von Peptiden, welche toxisch oder allergen sein können, wurde die Sequenz von pKG86 modifiziert. Die resultierenden Promotoren pKG86_12A (SEQ ID NR: 129), pKG86_14A (SEQ ID NR: 130) und pKG86_15A (SEQ ID NR: 131) wurden funktionsfähig an ein Reportergen verknüpft und zur Expressionsanalyse in Zea mays transformiert.

Es folgt ein Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25. Dieses kann von der amtlichen Veröffentlichungsplattform des DPMA heruntergeladen werden.

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
Zitierte Patentliteratur

US 5504200 [0005]
WO 00/26388 [0005]
US 5824863 [0005]
WO 99153067 [0005]
US 4237224 [0018]
WO 02/102970 [0020]
WO 2006/133983 [0041]
WO 2006/094976 [0054]
WO 2008/099013 [0054]
US 6110736 [0059]
US 6444876 [0077]
US 5608149 [0077]
US 6476295 [0077]
US 6537750 [0077]
US 5512482 [0077]
US 5530186 [0077]
US 5945585 [0077]
US 5639790 [0077]
US 5807893 [0077]
US 5955650 [0077]
US 5955329 [0077]
US 5759829 [0077]
US 5147792 [0077]
US 5304481 [0077]
US 5298421 [0077]
US 5344771 [0077]
US 5760206 [0077, 0077]
US 20030115632 A1 [0077]
US 20030028923 A1 [0077]
US 5689050 [0077, 0077]
US 5663068 [0077, 0077]
US 5614393 [0077]
US 5856157 [0077]
US 6117677 [0077]
US 6043411 [0077]
US 6194167 [0077]
US 5705391 [0077]
US 5552306 [0077]
US 6075183 [0077]
US 6051754 [0077]
US 5789220 [0077]
US 5057419 [0077]
US 5654402 [0077]
US 5659645 [0077]
US 6100091 [0077]
US 6172106 [0077]
US 5952544 [0077]
US 5866789 [0077]
US 5443974 [0077]
US 5093249 [0077]
US 6169226 [0092]
WO 99/32619 [0095]
WO 99/53050 [0095]
WO 00/68374 [0095]
WO 00/44914 [0095]
WO 00/44895 [0095]
WO 00/49035 [0095]
WO 00/63364 [0095]
EP 0291533 A1 [0096]
EP 0321201 A1 [0096]
EP 0360257 A1 [0096]
US 4987071 [0096]
US 5116742 [0096]
WO 97/41228 [0098]

Zitierte Nicht-Patentliteratur

Odell et al. (1985) Nature 313: 810–812 [0002]
Kasuga et al., (1999) Nature Biotechnology 17 (3): 287–291 [0002]
Bustos M. M. et al., Plant Cell. 1989, 2 (9): 839–53 [0005]
Joseffson L. G. et al., J. Biol. Chem. 1987, 262: 12196–12201 [0005]
Shirsat A et al., Mol Gen Genet. 1989, 215 (2): 326–331 [0005]
Bäumlein H, et al., Molecular & General Genetics 1991, 225 (3): 459–67 [0005]
Stalberg K., et al., L. Planta 1996, 199: 515–519 [0005]
Baumlein H. et al., Mol Gen Genet 1991, 225: 121–128 [0005]
Fobert P. R. et al., Plant Journal 1994, 6 (4): 567–77 [0005]
J. Mol. Evolution., 25, 351–360, 1987 [0013]
Higgins 1989, CABIOS, 5: 151–153 [0013]
Needleman 1970 J. Mol. Biol. 48; 443–453 [0013]
Smith 1981, Adv. Appl. Math. 2; 482–489 [0013]
Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711 Version 1991 [0013]
Higo K et al. (1999) Nucleic Acids Res 27: 1, 297–300 [0018]
Kunkel et al. (1987) Methods Enzymol 154: 367–382 [0018]
Tomic et al. (1990) Nucl Acids Res 12: 1656 [0018]
Upender et al. (1995) Biotechniques 18 (1): 29–30 [0018]
Sambrook et al. (”Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, 2. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) [0025]
Laboratoriums-Handbüchern, wie Methods in Molecular Biology, 1995, Bd. 44, ”Agrobacterium protocols”, Hrsg.: Gartland und Davey, Humana Press, Totowa, New Jersey [0025]
Hellens et al., Trends in Plant Science (2000) 5, 446–451 [0027]
Plant Molecular Biology and Biotechnology (CRC Press, Boca Raton, Florida), Kapitel 6/7, S. 71–119 (1993) [0027]
F. F. White, Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; in: Transgenic Plants, Bd. 1, Engineering and Utilization, Hrsg.: Kung und R. Wu, Academic Press, 1993, 15–38 [0027]
B. Jenes et al., Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Bd. 1, Engineering and Utilization, Hrsg.: Kung und R. Wu, Academic Press (1993), 128–143 [0027]
Potrykus, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42 (1991), 205–225 [0027]
Becker, D., Kemper, E., Schell, J., und Masterson, R. (1992) ”New plant binary vectors with selectable markers located proximal to the left border”, Plant Mol. Biol. 20: 1195–1197 [0028]
Bevan, M. W. (1984) ”Binary Agrobacterium vectors for plant transformation”, Nucl. Acids Res. 12: 8711–8721 [0028]
Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; in: Transgenic Plants, Bd. 1, Engineering and Utilization, Hrsg.: Kung und R. Wu, Academic Press, 1993, S. 15–38 [0028]
Gielen et al., EMBO J. 3 (1984) 835 ff. [0028]
Gallie et al., 1987, Nucl. Acids Research 15: 8693–8711 [0028]
Kermode, Crit. Rev. Plant Sci. 15, 4 (1996) 285–423 [0028]
Mozo und Hooykaas, Plant Mol. Biol. 16: 917–918 (1991) [0029]
Chilton, et al., 1977 Cell 11: 263–271 [0033]
Hoekema, et al., 1985 Nature 303: 179–180 [0033]
Bevan, 1984 Nucleic Acids Res. 12: 8711–8721 [0033]
Sheng und Citovsky, 1996 The Plant Cell, Bd. 8. 1699–1710 [0033]
Plant Molecular Biology and Biotechnology (CRC Press, Boca Raton, Florida), Kapitel 6/7, S. 71–119 (1993) [0041]
F. F. White, Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; in: Transgenic Plants, Bd. 1, Engineering and Utilization, Hrsg.: Kung und R. Wu, Academic Press, 1993, 15–38 [0041]
B. Jenes et al., Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Bd. 1, Engineering and Utilization, Hrsg.: Kung und R. Wu, Academic Press (1993), 128–143 [0041]
Potrykus, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42 (1991), 205–225 [0041]
Transgenic Plants: Methods and Protocols, Herausgeber: Leandro Peña, Instituto Valenciano de Investigaciones Agrarias, Valencia Spain Series: Methods in Molecular Biology, Band 286 (2004) [0041]
Lam E und Chua N H, (1991) J Biol Chem 266 (26): 17131–17135 [0049]
Schöffl F et al. (1989) Mol Gen Genetics 217 (2–3): 246–53 [0049]
Rouster J et al. (1998) Plant J. 15: 435–440. [0050]
Lohmer S et al. (1993) Plant Cell 5: 65–73 [0050]
McElroy et al. (1991) Mol Gen Genet 231 (1): 150–160 [0050]
Sauer B. (1998) Methods. 14 (4): 381–92 [0059]
Girke et al. (1998) Plant J 15: 3948 [0078]
Sakuradani et al. (1999) Gene 238: 445–453 [0078]
Michaelson et al. 1998, FEBS Letters 439: 215–218 [0078]
Michaelson et al. J Biol Chem 273: 19055–19059 [0078]
Beaudoin et al. (2000) Proc Natl. Acad Sci USA 97: 6421–6426 [0078]
Zank et al. (2000) Biochemical Society Transactions 28: 654–657 [0078]
Dunwell J M (2000) J Exp Bot. 51 Spec No: 487–96 [0079]
Gallie et al. (1987) Nucl Acids Res 15 8693–8711 [0086]
Klosgen R B & Weil J H (1991) Mol Gen Genet 225 (2): 297–304 [0086]
Van Breusegem F et al. (1998) Plant Mol Biol 38 (3): 491–496 [0086]
Gallie et al. (1987) Nucl Acids Res 15: 8693–8711 [0088]
Beerli R R et al. (2000) Proc Natl Acad Sci USA 97 (4): 1495–500 [0089]
Tada Y et al. (1996) FEBS Lett 391 (3): 341–345 [0092]
Nakamura R (1996) Biosci Biotechnol Biochem 60 (8): 1215–1221 [0092]
Schwall G P et al. (2000) Nat Biotechnol 18 (5): 551–554 [0092]
Gaultier et al. (1987) Nucleic Acids Res 15: 6625–6641 [0094]
Goring et al. (1991) Proc Natl Acad Sci USA 88: 1770–1774 [0094]
Smith et al. (1990) Mol Gen Genet 224: 447–481 [0094]
Napoli et al. (1990) Plant Cell 2: 279–289 [0094]
Van der Krol et al. (1990) Plant Cell 2: 291–299 [0094]
Matzke M A et al. (2000) Plant Mol Biol 43: 401–415 [0095]
Fire A. et al (1998) Nature 391: 806–811 [0095]
Tanner N K. FEMS Microbiol Rev. 1999; 23 (3): 257–75 [0096]
Ribozymes, Methods in Cell Biology 50, Galbraith et al., Hrsg. Academic Press, Inc. (1995), 449–460 [0096]
Bayley C C et al., Plant Mol Biol. 1992; 18 (2): 353–361 [0096]
Lloyd AM und Davis R W et al., Mol Gen Genet., März 1994; 242 (6): 653–657 [0096]
Haselhoff und Gerlach (1988) Nature 334: 585–591 [0096]
Helene C (1991) Anticancer Drug Des. 6 (6): 569–84 [0097]
Helene C et al. (1992) Ann NY Acad Sci 660: 27–36 [0097]
Maher L J (1992) Bioassays 14 (12): 807–815 [0097]
Schenborn E, Groskreutz D (1999) Mol Biotechnol 13 (1): 2944 [0098]
Chui W L et al., Curr Biol 1996, 6: 325–330 [0098]
Leffel S M et al., Biotechniques. 23 (5): 912–8, 1997 [0098]
Sheen et al. (1995) Plant Journal 8 (5): 777–784 [0098]
Haseloff et al. (1997) Proc Natl Acad Sci USA 94 (6): 2122–2127 [0098]
Reichel et al. (1996) Proc Natl Acad Sci USA 93 (12): 5888–5893 [0098]
Tian et al. (1997) Plant Cell Rep 16: 267–271 [0098]
Fromm et al. (1985) Proc Natl Acad Sci USA 82: 5824–5828 [0098]
Millar et al. (1992) Plant Mol Biol Rep 10: 324–414 [0098]
Ow et al. (1986) Science, 234: 856–859 [0098]
Jefferson et al. (1987) EMBO J 6: 3901–3907 [0098]
Dellaporta et al., in: Chromosome Structure and Function: Impact of New Concepts, 18th Stadler Genetics Symposium 11: 263–282, 1988 [0098]
Sutcliffe (1978) Proc Natl Acad Sci USA 75: 3737–3741 [0098]
Zukowsky et al. (1983) Proc Natl Acad Sci USA 80: 1101–1105 [0098]
Ikuta et al. (1990) Biol. Technol. 8: 241–242 [0098]
Katz et al. (1983) J Gen Microbiol 129: 2703–2714 [0098]
Prasher et al. (1985) Biochem Biophys Res Commun 126 (3): 1259–1268 [0098]
Sambrook et al.: Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2. Aufl. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y., 1989 [0098]
Hood E E, Jilka J M (1999). Curr Opin Biotechnol 10 (4): 382–6 [0104]
Ma J K, Vine N D (1999). Curr Top Microbiol Immunol 236: 275–92 [0104]

Claims

Polynukleotid, das eine Expressionssteuerungssequenz umfasst, welche die samenspezifische Expression einer interessierenden Nukleinsäure, die funktionsfähig daran gebunden ist, in Pflanzen erlaubt, wobei die Expressionssteuerungssequenz aus der Gruppe gewählt ist, die aus Folgendem besteht: (a) einer Expressionssteuerungssequenz mit einer Nukleinsäuresequenz, wie in einer beliebigen von SEQ ID NR: 1 bis 3 gezeigt; (b) einer Expressionssteuerungssequenz mit einer Nukleinsäuresequenz, welche mindestens 80% identisch zu einer Nukleinsäuresequenz ist, die in einer beliebigen von SEQ ID NR: 1 bis 3 gezeigt ist; (c) einer Expressionssteuerungssequenz mit einer Nukleinsäuresequenz, welche unter stringenten Bedingungen an eine Nukleinsäuresequenz, wie in einer beliebigen von SEQ ID NR: 1 bis 3 gezeigt, hybridisiert; (d) einer Expressionssteuerungssequenz mit einer Nukleinsäuresequenz, welche an eine Nukleinsäuresequenz hybridisiert, die stromaufwärts einer offenen Leserahmen-Sequenz, die in einer beliebigen von SEQ ID NR: 4, 6 oder 8 gezeigt ist, lokalisiert ist; (e) einer Expressionssteuerungssequenz mit einer Nukleinsäuresequenz, welche an eine Nukleinsäuresequenz hybridisiert, die stromaufwärts einer offenen Leserahmen-Sequenz lokalisiert ist, welche eine Aminosäuresequenz, wie in einer beliebigen von SEQ ID NR: 5, 7 oder 9 gezeigt, codiert; (f) einer Expressionssteuerungssequenz mit einer Nukleinsäuresequenz, welche an eine Nukleinsäuresequenz hybridisiert, die stromaufwärts einer offenen Leserahmen-Sequenz lokalisiert ist, welche mindestens 80% identisch zu einer offenen Leserahmen-Sequenz ist, wie in einer beliebigen von SEQ ID NR: 4, 6 oder 8 gezeigt, wobei der offene Leserahmen ein Samenprotein codiert; (g) einer Expressionssteuerungssequenz mit einer Nukleinsäuresequenz, welche an eine Nukleinsäuresequenz hybridisiert, die stromaufwärts eines offenen Leserahmens lokalisiert ist, der eine Aminosäuresequenz codiert, welche mindestens 80% identisch zu einer Aminosäuresequenz ist, wie in einer beliebigen von SEQ ID NR: 5, 7 oder 9 gezeigt, wobei der offene Leserahmen ein Samenprotein codiert; (h) einer Expressionssteuerungssequenz, erhältlich durch 5'-Genom-Walking oder durch ”thermische asymmetrische verschachtelte” bzw. ”Thermal asymmetric interlaced” Polymerasekettenreaktion (TAIL-PCR) auf genomischer DNA aus dem ersten Exon einer offenen Leserahmen-Sequenz, wie in einer beliebigen von SEQ ID NR: 4, 6 oder 8 gezeigt; und (i) einer Expressionssteuerungssequenz, erhältlich durch 5'-Genom-Walking oder TAIL-PCR auf genomischer DNA aus dem ersten Exon einer offenen Leserahmen-Sequenz, welche mindestens 80% identisch zu einem offenen Leserahmen ist, wie in einer beliebigen von SEQ ID NR: 4, 6 oder 8 gezeigt, wobei der offene Leserahmen ein Samenprotein codiert; und (j) einer Expressionssteuerungssequenz, erhältlich durch 5'-Genom-Walking oder TAIL-PCR auf genomischer DNA aus dem ersten Exon einer offenen Leserahmen-Sequenz, welche eine Aminosäuresequenz codiert, die mindestens 80% identisch zu einer von einem offenen Leserahmen codierten Aminosäuresequenz ist, wie in einer beliebigen von SEQ ID NR: 5, 7 oder 9 gezeigt, wobei der offene Leserahmen ein Samenprotein codiert.
Polynukleotid von Anspruch 1, wobei das Polynukleotid ferner mindestens eine interessierende Nukleinsäure umfasst, welche funktionsfähig an die Expressionssteuerungssequenz gebunden ist.
Polynukleotid von Anspruch 1 oder 2, wobei die interessierende Nukleinsäure bezüglich der Expressionssteuerungssequenz heterolog ist.
Polynukleotid von einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 3, wobei das Polynukleotid ferner ein erstes Intron eines Pflanzengens, das ein Metallothionin-1-Polypeptid codiert, umfasst.
Vektor, der das Polynukleotid von einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 4 umfasst.
Vektor von Anspruch 5, wobei der Vektor ein T-DNA-Vektor ist.
Wirtszelle, welche das Polynukleotid von einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 4 oder den Vektor von Anspruch 5 oder 6 umfasst.
Wirtszelle von Anspruch 7, wobei die Wirtszelle eine Pflanzenzelle ist.
Transgene Pflanze oder Pflanzensamen, welche(r) das Polynukleotid von einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 4 oder den Vektor von Anspruch 5 oder 6 umfasst.
Transgene Pflanze oder Pflanzensamen von Anspruch 9, wobei die transgene Pflanze oder der Pflanzensamen eine monokotyle Pflanze oder ein Pflanzensamen einer monokotylen Pflanze ist.
Verfahren zum Exprimieren einer interessierenden Nukleinsäure in einer Wirtszelle, welches Folgendes umfasst (a) Einbringen des Polynukleotids von einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 4 oder des Vektors von Anspruch 5 oder 6 in die Wirtszelle; und (b) Exprimieren mindestens einer interessierenden Nukleinsäure in der Wirtszelle.
Verfahren von Anspruch 11, wobei die Wirtszelle eine Pflanzenzelle ist.
Verfahren zum Exprimieren einer interessierenden Nukleinsäure in einer Pflanze oder einem Samen davon, welches Folgendes umfasst (a) Einbringen des Polynukleotids von einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 4 oder des Vektors von Anspruch 5 oder 6 in die Pflanze oder den Samen davon; und (b) Exprimieren mindestens einer interessierenden Nukleinsäure in der Pflanze oder dem Samen davon.
Verfahren von Anspruch 13, wobei die Pflanze eine monokotyle Pflanze ist.
Verwendung des Polynukleotids von einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 4, des Vektors von Anspruch 5 oder 6, der Wirtszelle von Anspruch 7 oder 8 oder der Pflanze oder des Samens davon von Anspruch 9 oder 10 für die Expression einer interessierenden Nukleinsäure.