CN102575257B

CN102575257B - 全种子特异性启动子

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Publication number: CN102575257B
Application number: CN201080017714.3A
Authority: CN
Inventors: H·付; J·A·布朗; K·弗朗西斯; H-S·宋
Original assignee: BASF Plant Science Co GmbH
Current assignee: BASF Plant Science Co GmbH
Priority date: 2009-04-22
Filing date: 2010-04-22
Publication date: 2014-11-05
Anticipated expiration: 2030-04-22
Also published as: AU2010240916B2; US10519458B2; BRPI1012750A2; EP2421976A1; CA2756146C; RU2561463C2; US11629353B2; US20200140876A1; CN102575257A; CA3020943A1; EP2421976B1; US20120036595A1; AU2010240916A1; BRPI1012750B1; RU2011147121A; ZA201108478B; UA109110C2; WO2010122110A1; DE112010003162T5; CA2756146A1

Abstract

本发明涉及提供用于基因表达的手段和方法。具体来说，本发明涉及一种多核苷酸，该多核苷酸包含表达控制序列，该表达控制序列允许与其可操作地连接的目的核酸在植物中种子特异性表达。此外，本发明还提供基于所述多核苷酸的载体、宿主细胞、转基因植物和表达目的核酸的方法。

Description

全种子特异性启动子

技术领域

本发明涉及提供用于基因表达的手段和方法。具体来说，本发明涉及一种多核苷酸，该多核苷酸包含表达控制序列，该控制序列允许与其可操作地连接的目的核酸在植物中进行种子特异性表达。此外，本发明还提供基于所述多核苷酸的载体、宿主细胞、转基因植物和用于表达目的核酸的方法。

背景技术

转基因植物的生产是植物生物技术的一项根本技术，并因此是用于植物基础研究、以及用于产生具有农业改良新性能的植物、用于提高人类食品质量、或产生特定化学物质或医药品所必不可少的前提条件。在植物中通过转基因表达特定基因的一个基本前提是提供植物特异性启动子。有多种植物启动子是已知的。目前在植物中主要应用的组成型启动子几乎全部是病毒启动子或从农杆菌分离出来的启动子，例如，花椰菜花叶病毒启动子CaMV35S(Odell等(1985)Nature 313：810-812)。由于产物的概念和转基因作用模式变得更加复杂，组成型表达不再是表达的最佳期望模式。例如，尽管对胁迫诱导的基因的操作可在提高植物对胁迫的耐受性中起到重要作用，但已经证实，当胁迫不存在时，胁迫诱导型基因的组成型表达对植物生长和发育具有严重的负面影响(Kasuga等(1999)NatureBiotechnology 17(3)：287-291)。因此，期望的是启动子驱动在空间上和/或在时间上进行区分的表达。

在农艺学重要的粮食作物中，种子的形成是植物发育的最终目标。种子收获后被用于食物、饲料和工业产品。这些种子的利用和其价值取决于其中的蛋白质、油分和淀粉的含量和质量。

单子叶植物种子可以被认为由两个主要区室组成：一是胚芽或胚胎，它包含将自种子发育形成的植物的祖先细胞；二是胚乳，它充当在种子萌发和早期小植物发育过程中所消耗的营养组分(特别是储存的淀粉、蛋白质和油)的贮库。双子叶植物种子大部分由胚芽部分组成，因为在发育的双子叶植物中营养功能是由种子外的营养储存物质提供的。

已经有许多能够以各种组合的空间和时间表达模式驱动转基因表达的启动子被鉴定和表征。本领域也已知一些在植物种子中控制表达的启动子。这些已知的启动子控制在植物种子的部分或整个种子中的表达。例如，已经显示，种子储存蛋白的启动子驱动主要在种子中的表达。这些启动子包括菜豆蛋白的启动子(US 5,504,200，Bustos M.M.等，Plant Cell.1989，2(9)：839-53)、2S白蛋白启动子(Joseffson L.G.等，J.Biol.Chem.1987，262：12196-12201)、豆球蛋白启动子(Shirsat A等，Mol Gen Genet.1989，215(2)：326-331)、USP启动子(未知种子蛋白质；H，等，Molecular & General Genetics 1991，225(3)：459-67)、napin启动子(Stalberg K.，等，L.Planta 1996，199：515-519)、蔗糖结合蛋白启动子(WO 00/26388)或LeB4启动子(H.等，Mol GenGenet 1991，225：121-128)。通过利用“T-DNA tagging”的方法，一种对蒴果特异的隐藏性启动子在烟草中被鉴定出来(Fobert P.R.等，PlantJournal 1994，6(4)：567-77；US 5,824,863；WO 99/53067)。

指导在整个种子中并由此在胚乳和胚两者中表达的种子特异性启动子只就双子叶植物而未就单子叶植物进行过描述。唯一可得的用于在单子叶植物中全种子表达的启动子是组成型启动子，它们确实在种子的两个主要区室中均表达，但是也驱动转基因在大多数或所有其它组织中表达。

然而，目前还没有可靠地控制目的核酸在单子叶植物的整个种子中表达的手段和方法，这些手段和方法是迫切需要的。

因此，本发明的技术问题可以被视为提供能够满足上述需求的手段和方法。该技术问题通过在权利要求书和下文中描述的实施方案而得到解决。

发明内容

据此，本发明公开了一种多核苷酸，该多核苷酸包含表达控制序列，该表达控制序列使得可以在植物中种子特异地表达与其可操作地连接的目的核酸，所述表达控制序列选自：

(a)具有SEQ ID NOs：1至3之任一所示的核酸序列的表达控制序列；

(b)具有与SEQ ID NOs：1至3之任一所示的核酸序列至少80％相同的核酸序列的表达控制序列；

(c)具有在严紧条件下与SEQ ID NOs：1至3之任一所示的核酸序列杂交的核酸序列的表达控制序列；

(d)具有与位于SEQ ID NOs：4，6或8之任一所示的开放阅读框序列上游的核酸序列杂交的核酸序列的表达控制序列；

(e)具有与位于编码SEQ ID NOs：5，7或9之任一所示的氨基酸序列的开放阅读框序列上游的核酸序列杂交的核酸序列的表达控制序列；

(f)具有与开放阅读框序列的上游核酸序列杂交的核酸序列的表达控制序列，其中所述开放阅读框序列与SEQ ID NOs：4，6或8之任一所示的开放阅读框序列至少80％相同，且其中该开放阅读框编码种子蛋白；

(g)具有与开放阅读框的上游核酸序列杂交的核酸序列的表达控制序列，其中所述开放阅读框编码与SEQ ID NOs：5，7或9之任一所示的氨基酸序列至少80％相同的氨基酸序列，其中该开放阅读框编码种子蛋白；

(h)表达控制序列，其可以自SEQ ID NOs：4，6或8之任一所示的开放阅读框序列的第一个外显子出发，在基因组DNA上，通过5′基因组步行或热不对称交错聚合酶链式反应(TAIL-PCR)获得；以及

(i)表达控制序列，其可以自开放阅读框序列的第一个外显子出发，在基因组DNA上，通过5′基因组步行或TAIL-PCR获得，其中该开放阅读框序列与SEQ ID NOs：4，6或8之任一所示的开放阅读框序列至少80％相同，且其中该开放阅读框编码种子蛋白；以及

(j)表达控制序列，其可以自开放阅读框序列的第一个外显子出发，在基因组DNA上，通过5′基因组步行或TAIL-PCR获得，其中该开放阅读框序列编码与SEQ ID NOs：5，7或9之任一所示的开放阅读框编码的氨基酸序列至少80％相同的氨基酸序列，且该开放阅读框编码种子蛋白。

本发明所使用的术语“多核苷酸”是指线性或环形核酸分子。优选地，该分子包括DNA分子。本发明的多核苷酸的特征在于，它应包含于本说明书中的其它地方定义的表达控制序列。除了表达控制序列以外，本发明的多核苷酸优选地还包含至少一个可操作地连接该表达控制序列和/或至少一个转录终止序列的目的核酸。因而，本发明的多核苷酸优选地包含用于表达至少一个目的核酸的表达盒。

代替目的核酸或除了目的核酸以外额外地，至少一个表达盒还可以包含多克隆位点和/或转录终止序列。在此情况下，多克隆位点优选地按可以使要导入到多克隆位点中的核酸可操作地与表达控制序列连接的方式来安排。除了上述组分以外，本发明的多核苷酸优选地可以包含同源重组所需的组分，即，来自目标座位的侧翼基因组序列。然而，也考虑基本上由所述表达控制序列组成的多核苷酸。

本发明所使用的术语“表达控制序列”是指能够控制与其可操作地连接的其它核酸(例如，在本说明书其它地方详细提及的目的核酸)的表达的核酸。依照本发明所提及的表达控制序列优选地包含被多肽(即转录因子)识别和结合的序列基序。所述的转录因子应在结合后募集RNA聚合酶，优选地RNA聚合酶I、II或III，更优选地RNA聚合酶II或III，最优选地RNA聚合酶II。可操作地与表达控制序列相连接的核酸的表达将因此被启动。应理解，根据待表达的核酸(即目的核酸)的类型，本文中的表达可以包括自该核酸序列的RNA多核苷酸的转录(适用于例如反义方法或RNAi方法)，或者可以包括RNA多核苷酸的转录以及其后所述RNA多核苷酸翻译成多肽(适用于例如基因表达和重组多肽生产方法)。为了控制核酸的表达，表达控制序列可以被置于紧邻需表达核酸的位置，即物理地连接到所述核酸的5′末端。可选择的是，表达控制序列可以被置于物理的附近位置。然而，在后一种情况中，表达控制序列必须被置于可与需表达的核酸发生功能性相互作用的位置。本发明所述的表达控制序列优选地包含200至5000个核苷酸长度，更优选地，包含500至2500个核苷酸，再优选地1000至1500个核苷酸。如上所述，表达控制序列优选地包含多个序列基序，这些序列基序是转录因子结合或赋予包含表达控制序列的多核苷酸某种结构所需的。序列基序有时也称作顺式调控元件，在本文中意欲包括启动子元件及增强子元件。本发明的表达控制序列允许种子特异性表达，因而其包含顺式调控元件，该顺式调控元件能够在所述的组织中招募RNA聚合酶，以使可操作地连接到所述表达控制序列的核酸进行组织特异性转录。可以包含在本发明的多核苷酸中的优选表达控制序列具有SEQ ID NOs：1至3之任一所示的核酸序列。

再优选地，本发明的多核苷酸包含的表达控制序列具有与SEQ IDNOs：4，6或8之任一所示的开放阅读框序列的上游核酸序列杂交的核酸序列，即，是变体表达控制序列。应理解，表达控制序列可以由于等位基因变异而在其序列上稍有不同。因此，本发明也涉及可以从SEQ ID NOs：1至3之任一所示的表达控制序列衍生出的表达控制序列。所述表达控制序列能够，优选在严紧条件下，与SEQ ID NOs.5，6或8之任一所示的开放阅读框的上游序列杂交，即与SEQ ID NOs：1至3之任一所示的表达控制序列杂交。本文中，严紧杂交条件优选地是指，尾随一个或多个在0.2xSSC、0.1％SDS中在53至65℃，优选在55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃或65℃，的洗涤步骤的、在6x氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中在约45℃的杂交条件。本领域技术人员知道这些杂交条件依据核酸种类以及例如是否存在有机溶剂，就温度和缓冲液的浓度而言，可以是不同的。例如，在“标准杂交条件”下，在浓度为0.1至5xSSC(pH 7.2)的水性缓冲液中，温度依据核酸种类的不同而在42℃至58℃之间变动。如果所述缓冲液中存在有机溶剂，例如50％的甲酰胺，标准杂交条件下的温度为约42℃。对于DNA：DNA杂交体，杂交条件优选地为例如0.1 x SSC以及20℃至45℃(优选为30℃至45℃)。对于DNA：RNA杂交体，杂交条件优选地为例如0.1 x SSC以及30℃至55℃(优选为45℃至55℃)。上述的杂交温度是例如针对长度约100bp(碱基对)且G+C含量为50％的核酸、在没有甲酰胺存在的条件下确定的。更优选地，此杂交表达控制序列与SEQ ID NOs：1至3之任一所示的表达控制序列具有至少70％、至少80％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的同一性。同一性百分数值优选地在整个核酸序列区域上计算。本领域技术人员可以利用一系列基于各种算法的程序来比较不同的序列。在此，采用Needleman和Wunsch的算法、或Smith和Waterman的算法可以得出尤其可靠的结果。可以采用PileUp程序(J.Mol.Evolution.，25，351-360，1987，Higgins 1989，CABIOS，5：151-153)或GCG软件包(GeneticsComputer Group，575Science Drive，Madison，Wisconsin，USA 53711version 1991)中的Gap与BestFit程序(Needleman 1970J.Mol.Biol.48；443-453and Smith 1981，Adv.Appl.Math.2；482-489)进行序列比对。上述以百分比(％)表示的序列同一性数值优选地用GAP程序在整个序列区段上利用以下参数设置来确定：空位权重为50、长度权重为3、平均匹配数为10.000、平均错配数为0.000，除非另有说明，这些设置应总是被用作进行序列比对的标准设置。

此外，允许种子特异性表达的表达控制序列不仅仅能够在具有SEQ IDNOs.4，6或8之任一所示的核酸序列的上述开放阅读框的上游发现。而是，允许种子特异性表达的表达控制序列也能够在直系同源基因、旁系同源基因或同源基因(即，开放阅读框)的上游发现。因此，也优选，由本发明的多核苷酸包含的表达控制序列变体具有与开放阅读框序列的上游核酸序列杂交的核酸序列，其中所述开放阅读框序列与SEQ ID NOs：4，6和8之任一所示的序列至少70％、更优选地至少80％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同。所述的变体开放阅读框编码的多肽具有SEQ ID NOs：4，6和8之任一所示的开放阅读框所编码的相应多肽的生物活性。在本文中应该被提到的是SEQ ID NO：4所示的开放阅读框编码具有SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列的多肽，优选地编码种子蛋白。SEQ ID NO：6所示的开放阅读框编码具有SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列的多肽，优选地编码种子蛋白，更尤其是液泡膜内在蛋白3-1。SEQID NO：8所示的开放阅读框编码具有SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列的多肽，优选地编码种子蛋白。

同样优选地，由本发明的多核苷酸包含的变体表达控制序列是(i)自SEQ ID NOs：4，6或8之任一所示的开放阅读框序列、由5′基因组步行或TAIL-PCR可获得的，或(ii)自与SEQ ID NOs：4，6或8之任一所示的开放阅读框至少80％相同的开放阅读框序列、由5′基因组步行或TAIL-PCR可获得的。表达控制序列变体可以很容易由基因组步行技术或热不对称交错聚合酶链式反应(TAIL-PCR)获得，这些技术或TAIL-PCR可以按本文实施例中所描述的方式、利用例如可商业获得的试剂盒来进行。

本说明书中就SEQ ID NO：I所示的表达控制序列提及的变体表达控制序列优选地包含表4中所列的至少10个、至少20个、至少30个或所有的序列基序。本说明书中就SEQ ID NO：2所示的表达控制序列提及的变体表达控制序列优选地包含表9中所列的至少10个、至少20个、至少30个、至少40个、至少50个或所有的序列基序。本说明书中就SEQ ID NO：3所示的表达控制序列提及的变体表达控制序列优选地包含表10中所列的至少10个、至少20个、至少30个、至少40个、至少50个或所有的序列基序。

优选的变体表达控制序列的例子如SEQ ID NOs：120、121和122所示(SEQ ID NO：3的变体)、如SEQ ID NOs：123和124所示(SEQ ID NO：2的变体)以及如SEQ ID NOs：125、126和127所示(SEQ ID NO：1的变体)。与相应的表达控制序列相比，上述变体(如SEQ ID NOs：120至127所示)不包含起始密码子(ATG)。起始密码子被BVH取代或被BVH加上位于任何两个起始密码子之间的终止密码子取代(根据IUPAC命名法：B代表C或G或T，V代表A或C或G，H代表A或C或T)。因此，变体表达控制序列可以通过如上所描述的对推定的起始密码子进行突变而获得。表达控制序列变体的另外例子如SEQ ID NOs：129、130和131所示(SEQ ID NO：1的变体)。上述的表达控制序列不包含与毒性或变应原肽或多肽显示同源性的短开放阅读框(见实施例3)。

应理解，本发明的表达控制序列中的非必需序列可以被删除而不显著破坏所提到的特性。也可以利用例如PLACE程序(”Plant Cis-actingRegulatory DNA Elements″)(Higo K等(1999)Nucleic Acids Res 27：1，297-300)的计算机程序或BIOBASE数据库“Transfac”(BiologischeDatenbanken GmbH，Braunschweig)，将表达控制序列界定到特定的必需调控区域。利用这样的方法，上述的表达控制序列变体可以人为地产生。此外，突变核酸序列的程序为技术人员所知，它包括例如使用与需要被突变的区域相比包含一个或多个突变(例如，在位点特异性诱变的框架内)的寡核苷酸。典型地是利用具有约15至75或更多个核苷酸的引物，其中优选约10至约25或更多个核苷酸残基位于待修饰序列的两侧。所述的诱变方法的具体细节和操作程序为技术人员所熟知(Kunkel等(1987)Methods Enzymol 154：367-382；Tomic等(1990)Nucl Acids Res12：1656；Upender等(1995)Biotechniques 18(1)：29-30；U.S.Pat.No.4,237,224)。诱变也可以通过用例如羟胺等诱变剂处理例如包含本发明表达控制序列的载体而实现。诱变也导致上述的本发明多核苷酸变体的产生。

本发明的多核苷酸包含的表达控制序列允许种子特异性表达。特别地，所述表达控制序列允许发生在种子的胚和胚乳中并因而在整个种子中的特异性表达。因此，本发明中的“种子”优选地是指胚乳和胚性组织。优选地，依据本发明的表达控制序列允许在种子发育的所有阶段(例如，在授粉后35至40天的玉米种子中，见实施例)的种子特异性表达。此外，表达控制序列也可以允许在花粉中的表达(见实施例)。本发明中“特异性”意指，当存在于植物中时，可操作地连接本发明所述表达控制序列的目的核酸将优势地(即优选地)在所述及的组织或细胞中表达。可以理解的是，通过组织特异性启动子通常并不能实现在组织中的专一表达。更确切地，组织特异性启动子似乎优选地在某些组织中开启，但在其他组织中仍然具有一些背景活性。这种现象被称为渗漏表达。然而，本发明中特异性表达是指在所提及的植物组织中占优势的表达。这里所说的优势表达的特征是：相对于其它植物组织来说，在所述的组织或细胞中具有统计上显著更高量的可检测转录。统计上显著更高水平的表达优选地是指，该表达量至少2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、100倍、500倍或1000倍于在具有可检测转录的至少一种其它组织中的表达量。或者，其是指在所述的组织或细胞中的表达，其中在其它组织或细胞中的表达水平低于总体(整株植物)表达水平的1％、2％、3％、4％、5％、10％或最优选地15％。表达水平与存在于细胞或组织中的转录本(即RNA)的量、或转录本编码的多肽的量直接相关。基于RNA或多肽测定转录的合适技术为技术人员所熟知。作为上述的替代或者优选地补充，组织或细胞特异性意指表达限于或几乎限于所述的组织或细胞，即在其它组织中基本上检测不到转录。这里所说的“几乎限于”是指非特异性表达在少于10种、少于5种、少于4种、少于3种、少于2种或1种其它组织中能够检测到。

种子特异性表达能够被确定，例如通过在以下组织和发育阶段中，比较可操作地连接到表达控制序列上的目的核酸(例如，β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)报告基因)的表达：1)5叶期的根和叶，2)V-7期的茎，3)开花期的叶、谷壳(husk)和穗丝(silk)，4)授粉时的小穗(spikelets)/雄花穗(tassel)，5)授粉后5、10、15、20和25天的谷穗(ear)或籽粒(kernel)(参见实施例)。优选地，目的核酸的表达可以在授粉后5、10、15、20和25天的穗或籽粒中在附图所示的分析试验中测定。目的核酸的表达可以通过各种熟知的技术被测定，例如通过WO 02/102970中所描述的Northern印迹或原位杂交技术测定，优选地按附于本发明的实施例所述的方法测定。用于分析种子特异性表达的转基因植物也能够通过技术人员所熟知、并在本说明书其它地方讨论的技术产生。

术语“目的核酸”是指应在本发明所述表达控制序列的控制下被表达的核酸。优选地，目的核酸编码多肽，其中该多肽在本发明所述的细胞或植物这，特别是植物种子中的存在是期望的。此多肽可以是在种子中积累、和/或其表达后对植物或种子产生有利影响的任何功能活性或惰性蛋白质。应理解的是，如果目的核酸编码多肽，可能需要该核酸转录成RNA以及转录后的RNA翻译成多肽。同样优选地，目的核酸包括生物学活性RNA分子，更优选地，反义RNA、核酶、microRNA或siRNA。所述的生物活性RNA分子能够用于改变存在于细胞或植物中的靶标多肽的量。例如，种子中不期望的酶活性能够由于种子特异性表达反义RNA、核酶、microRNA或siRNA而减少。上述生物活性RNA分子所基于的生物学作用原理为技术人员所熟知。此外，技术人员熟知怎样去获得编码这种生物活性RNA分子的核酸。可以理解的是，生物活性RNA分子可以通过目的核酸的转录而直接获得，即不需要翻译成多肽。优选地，至少一个在本发明的表达控制序列的控制下待表达的目的核酸和所述的表达控制序列是异源的，即该核酸非天然地受所述的表达控制序列控制，所述的控制是以非天然地方式(例如通过遗传工程的方法)而产生的。

本发明所使用的术语“可操作地连接”意思是本发明的表达控制序列和目的核酸被连接起来，以使表达能够被所述的表达控制序列所控制，即表达控制序列应被功能性连接到所述的需表达的核酸序列上。因此，表达控制序列和需表达的核酸序列可以被物理上相互连接，例如通过将表达控制序列插入到需表达核酸序列的5′末端。或者，表达控制序列和需表达的核酸序列可以只是物理上相邻，以使表达控制序列能够控制至少一个目的核酸序列的表达。优选地，表达控制序列和需表达的核酸间隔不超过700bp、500bp、300bp、100bp、80bp、60bp、40bp、20bp、10bp或5bp。

有利的是，在构成本发明基础的研究中已经发现，(全)种子特异性表达目的核酸可以通过在来自玉米的表达控制序列或上述的变体表达控制序列(见例如表4A、11和12)的控制下表达所述目的核酸而可靠地实现。由于有了本发明，就可以(i)特异地操作种子组织中的生化过程，例如通过表达上述异源酶或生物活性RNA，或(ii)在上述种子组织中产生异源蛋白。原则上，本发明还涉及多核苷酸、载体、宿主细胞或植物用于表达目的核酸的的用途。在现有技术中所描述的种子特异性启动子仅能赋予在单子叶植物种子的胚或胚乳而不是整个种子中的表达。

本发明也涉及包含本发明多核苷酸的载体。

术语“载体”，优选地包括质粒、表达载体、T-DNA载体以及人工染色体(例如细菌或酵母人工染色体)。此外，该术语也涉及打靶构建体，该构建体允许打靶构建体随机或定点整合到基因组DNA中。优选地，该打靶构建体包含长度足够用于进行如下所详细描述的同源或异源重组的DNA。包含本发明多核苷酸的载体优选地进一步包含用于在宿主中进行扩增和/或选择的选择标记。载体可以用技术人员熟知的各种技术导入到宿主细胞中。如果被导入到宿主细胞中，载体可以存在于细胞质中或可以整合到基因组中。在后一情况中，可以理解的是，载体可以进一步包含允许进行同源重组或异源插入的核酸序列。载体可以利用常规的转化或转染技术被导入到真核或原核细胞中。本文中所使用的术语“转化”与“转染”以及接合与转导，旨在包括将外源核酸(例如DNA)导入到宿主细胞中的多种现有技术，包括磷酸钙或氯化铷或氯化钙共沉淀、DEAE-葡聚糖介导的转染、脂转染、天然感受态、碳基簇、化学介导的转移、电穿孔或微粒轰击(例如“基因枪”)。宿主细胞(包括植物细胞)转化或转染的合适方法能够在Sambrook等(Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2nded.，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，NY，1989)和其它实验手册(例如Methodsin Molecular Biology，1995，Vol.44，Agrobacterium protocols，Ed.：Gartland and Davey，Humana Press，Totowa，New Jersey)中找到。

优选地，本发明所述载体适合作为克隆载体，即在微生物系统中可以复制。这样的载体可以确保在细菌、优选地在酵母或真菌中的有效克隆，和使得植物稳定转化成为可能。“克隆载体”典型地包含限制性核酸内切酶识别位点(外源DNA序列可以以可确定的方式插入到该识别位点而不使载体失去其基本生物学功能)，以及适用于鉴定和筛选转化了克隆载体的细胞的标记基因。标记基因典型地包括可以提供例如卡那霉素抗性、链霉素抗性、壮观霉素抗性、四环素抗性、潮霉素抗性或氨苄青霉素抗性的基因。

必须提到的载体系统尤其是各种适合于进行T-DNA介导的转化的双元和共整合载体系统。这样的载体系统通常具有这样的特征：它们至少包含农杆菌介导的转化所需要的vir基因、以及界定T-DNA的序列(T-DNA边界序列)。优选地，这些载体系统也进一步包含顺式调控区域(例如启动子、终止子)和/或用于鉴别合适的已转化的宿主细胞或生物体的选择标记。共整合载体系统具有位于相同载体中的vir基因和T-DNA序列，而双元系统基于至少两个载体，其中一个载体包含vir基因但没有T-DNA，而另一载体包含T-DNA但没有vir基因。其结果是，后面述及的载体相对较小、易于操作并能在大肠杆菌和农杆菌两者中复制。这些双元载体包括来自pBIB-HYG、pPZP、pBecks、pGreen系列的载体。依照本发明优选使用的是pBin19、pBI101、pBinAR、pGPTV、pSUN、pPZP和pCAMBIA。关于双元载体及其使用的综述见Hellens等，Trends in Plant Science(2000)5，446-451。此外，通过使用合适的克隆载体，本发明的多核苷酸能够被导入到宿主细胞和/或植物中从而被用于转化植物，例如在以下文献中公布和引用的那些：Plant Molecular Biology and Biotechnology(CRC Press，Boca Raton，Florida)，chapter 6/7，pp.71-119(1993)；F.F.White，Vectors for Gene Transfer in Higher Plants；in：TransgenicPlants，vol.1，Engineering and Utilization，Ed.：Kung and R.Wu，Academic Press，1993，15-38；B.Jenes等，Techniques for Gene Transfer，in：Transgenic Plants，vol.1，Engineering and Utilization，Ed.：Kung andR.Wu，Academic Press(1993)，128-143；Potrykus，Annu.Rev.PlantPhysiol.Plant Molec.Biol.42(1991)，205 225。

植物表达载体的例子包括如下文献中详细描述的那些载体：Becker，D.，Kemper，E.，Schell，J.，和Masterson，R.(1992)“New plant binaryvectors with selectable markers located proximal to the left border”，PlantMol.Biol.20：1195-1197；和Bevan，M.W.(1984)“Binary Agrobacteriumvectors for plant transformation”，Nucl.Acids Res.12：8711-8721；Vectorsfor Gene Transfer in Higher Plants；in：Transgenic Plants，Vol.1，Engineering and Utilization，Ed.：Kung and R.Wu，Academic Press，1993，p.15-38。植物表达盒优选地包含调控序列，该调控序列能够控制基因在植物细胞中的表达，并以每个序列均能行使其功能(例如转录终止，例如多聚腺苷酸化信号)的方式功能性连接。优选的多聚腺苷酸化信号是源自根癌农杆菌T-DNA，例如Ti质粒pTiACH5基因3(该基因被称作章鱼碱合酶(Gielen等，EMBO J.3(1984)835et seq.)的多聚腺苷酸化信号或其功能等价物，然而所有其它在植物中具有功能活性的终止子也是合适的。由于植物基因表达通常不限于转录水平，植物表达盒优选地包含其它功能性连接的序列，例如翻译增强子，例如，包含增加蛋白质/RNA比率的5’非翻译烟草花叶病毒前导序列的超驱动序列(Gallie等，1987，Nucl.AcidsResearch 15：8693-8711)。其它用于功能性连接在植物表达盒中的优选序列有打靶序列，打靶序列为将目的核酸的基因产物定位到其相关细胞区室所需要的(其综述见Kermode，Crit.Rev.Plant Sci.15，4(1996)285-423及其引用的参考文献)，例如定位到液泡、细胞核、所有类型的质体(例如造粉体和色质体)、胞外间隙、线粒体、内质网、油体、过氧物酶体以及其它植物细胞区室。

可以理解的是，双元载体或任何其它载体均可以通过常规DNA重组技术进行改造、在大肠杆菌中增殖、以及利用例如电穿孔或其它转化技术导入到农杆菌中(Mozo and Hooykaas，Plant MoI.Biol.16：917-918(1991))。

本发明也涉及包含本发明的多核苷酸或载体的宿主细胞。

优选地，宿主细胞为来源于植物的转基因细胞或细胞系。更优选地，所述的宿主细胞来源于单子叶植物。优选的单子叶植物在本文其它地方进行了描述。来源于植物的宿主细胞涵盖某些植物组织、器官和部分的所有表型形式(例如花药、纤维、根毛、茎秆、胚、愈伤组织、子叶、叶柄、收获材料、植物组织、繁殖组织、以及来源于实际转基因植物和/或能被利用于产生转基因植物的细胞培养物)的细胞。

可以理解，依据本发明的多核苷酸或载体也可以存在于原核或真核单细胞生物(也被称为微生物)中，尤其是为了克隆目的(例如在大肠杆菌中)和为了植物转化(例如在农杆菌中)。因此，优选地，术语“宿主细胞”也涵盖原核或真核单细胞生物(也被称为微生物)。在本发明的说明书中尤其被考虑的原核宿主细胞是根瘤菌科(Rhizobiaceae)细胞，尤其是农杆菌属(Agrobacterium)细胞。优选的农杆菌细胞为根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)细胞和发根农杆菌(Agrobacteriumrhizogenes)细胞。

农杆菌是土传植物病原体，能够将一段DNA(T-DNA)整合到植物基因组中(Chilton，等，1977Cell 11：263-271；Hoekema，等，1985Nature303：179-180；Bevan，1984Nucleic Acids Res.12：8711-8721；Sheng andCitovsky，1996The Plant Cell，Vol.8.1699-1710)。优选地，农杆菌细胞/菌株已被卸甲，即缺乏介导冠瘿病的特性或缺乏介导发根病的特性，但是提供感染植物的功能。优选地，本发明中农杆菌细胞选自LBA4404、GV2260、GV3600、EHA101、EHA105、AGL-1、LBA9402、GV3101、COR341、COR356、UIA143、pCH32、BIBAC2、C58C1、pMP90和AGT121。在一个优选的实施方案中农杆菌细胞选自C58C1、EHA101、pMP90和LBA4404。

怎样培养上述农杆菌物种为本领域技术人员所熟知。

本发明也涉及包含本发明的多核苷酸或载体的转基因植物或其种子。

多核苷酸或载体可以存在于所述转基因植物或其种子的细胞的细胞质中。优选地，多核苷酸或载体稳定地整合到所述植物或植物种子所包含的细胞的基因组中。怎样稳定地将多核苷酸或载体(尤其是T-DNA载体)整合到植物细胞的基因组中，是本领域技术人员所熟知的，并在本文其它地方进行了描述。在本发明中尤其考虑的是，多核苷酸或载体通过农杆菌介导的转化，应稳定地整合到基因组中。

依照本发明用于转基因植物的优选植物为单子叶植物。

优选地，在此使用的“单子叶植物”是指在种子中具有一片子叶的开花植物。特别优选的单子叶植物(在本文中也称作单子叶monocots)为：玉米、小麦、稻、大麦、燕麦、黑麦、高粱、稷(millet)、tricalate、香蕉、黑麦草或薏苡(coix)。优选地，术语“单子叶植物”包括以下亚科的属的植物：须芒草亚科(Andropogonoideae)(特别是，甘蔗属(Saccharum)、高粱属(Sorghum)、或玉蜀黍属(Zea))、芦竹亚科(Arundineae)(特别是，芦苇属(Phragmites))、稻亚科(Oryzoideae)(特别是，稻属(Oryza))、稷亚科(Panicoideae)、以及更优选地早熟禾亚科(Pooideae，Festuciadeae)(特别是早熟禾属(Poa)、羊茅属(Festuca)、黑麦草属(Lolium)、三毛草属(Trisetum)、剪股颖属(Agrostis)、梯牧草属(Phleum)、鸭茅属(Dactylis)、看麦娘属(Alopecurus)、燕麦属(Avena)、小麦属(Triticum)、黑麦属(Secale)和大麦属(Hordeum))。优选的单子叶植物为：Avena sativa(燕麦)、Saccharum officinarum(甘蔗)、Triticum dicoccum(二粒小麦，Emmerwheat)、Triticum monococcum(一粒小麦，Einkon wheat)、Triticum spelta(斯卑尔脱小麦)、Triticum durum(硬粒小麦，wheat)、Triticum turgidum(圆锥小麦)、Triticum aestivum(普通小麦，wheat)、Zea mays(玉米，maize/co rn)、Panicum miliaceum(稷，common millet)、Pennisetumthiphoides(芦苇粟，Bulrush millet)、Hordeum vulgare或H.sativum(大麦，barley)、Oryza sativa(稻，rice)、Zizania aquatica(菰)(野生稻，wildrice)、Secale cereale(黑麦，rye)、Sorghum bicolor(S.vulgare)(两色蜀黍，高粱)。更优选小麦(小麦属物种)、稻(稻属物种)、大麦(大麦属物种)、燕麦(燕麦属物种)、黑麦(黑麦属物种)、玉米(玉蜀黍)、高粱和稷(狼尾草属物种(Pennisettum spp.))。

最优选地，单子叶植物为玉蜀黍。

本发明还涉及所述单子叶植物的某些组织、器官、和部分的所有表型形式，例如花药、纤维、根毛、茎秆、胚、愈伤组织、子叶、叶柄、收获材料、植物组织、繁殖组织、以及来源于该实际转基因植物和/或能被利用于产生该转基因植物的细胞培养物。

依据本发明的转基因植物或转基因宿主细胞可以通过在以下出版物中发表和引用的转化技术获得：Plant Molecular Biology and Biotechnology(CRC Press，Boca Raton，Florida)，6/7章，pp.71-119(1993)；F.F.White，Vectors for Gene Transfer in Higher Plants；in：TransgenicPlants，vol.1，Engineering and Utilization，Ed.：Kung and R.Wu，Academic Press，1993，15-38；B.Jenes等，Techniq ues for Gene Transfer，in：Transgenic Plants，vol.1，Engineering and Utilization，Ed.：Kung andR.Wu，Academic Press(1993)，128-143；Potrykus，Annu.Rev.PlantPhysiol.Plant Molec.Biol.42(1991)，205-225；Transgenic Plants：Methods and Protocols Editor：Leandro Instituto Valenciano deInvestigaciones Agrarias，Valencia Spain Series：Methods in MolecularBiology，286卷(2004)或WO2006/133983。优选地，转基因植物可以通过T-DNA介导的转化获得。通常，该载体系统的特征是它们至少包含农杆菌介导的转化所需要的vir基因、以及界定T-DNA的序列(T-DNA边界序列)。本说明书其它地方对合适的载体进行了详细的描述。

本发明也涉及在宿主细胞中表达目的核酸的方法，包括：

(a)将本发明的多核苷酸或载体导入到宿主细胞中；以及

(b)在所述宿主细胞中表达至少一个目的核酸。

本发明的多核苷酸或载体能够通过利用本说明书其它地方详细描述的合适转染或转化技术，而导入到宿主细胞中。目的核酸将于合适的条件下在宿主细胞中表达。为此，将宿主细胞培养在原则上允许核酸转录的条件下。此外，优选地，宿主细胞包含利用表达控制序列表达目的核酸所需要的外源提供的或内源存在的转录机器。优选地，所述的宿主细胞为单子叶植物的细胞。

此外，本发明包括在植物中表达目的核酸的方法，包括：

(a)将本发明的多核苷酸或载体导入到植物中；以及

(b)在所述植物中表达至少一个目的核酸。

本发明的多核苷酸或载体能够通过利用本说明书其它地方详细描述的合适技术，而导入到植物中。

同样，本发明也涉及在植物中种子特异性表达目的核酸的方法，包括：

(a)将本发明的多核苷酸或载体导入到植物中；以及

(b)在所述植物中表达至少一个目的核酸。

下文更详细地描述了本发明的一些优选实施方案。

在一个优选的实施方案中，本发明的多核苷酸还包含另外的遗传控制序列。依据本发明提及的遗传控制序列应作广义理解，是指所有可以对本发明的转基因表达盒的功能的实现产生影响的序列。遗传控制序列可以改变例如真核生物中的表达和翻译。优选地，本发明的表达盒还包含一个本发明的启动子(在待转基因表达的该特定核酸序列的5’上游)和终止子序列(3’下游)、以及在合适的情况下其他常见调控元件，作为额外遗传控制序列，其中这些遗传控制序列每一个都与待转基因表达的核酸序列功能性连接。

遗传控制序列也包括其它启动子、启动子元件或能够改变表达控制特性的最小启动子。由此，可以例如通过遗传控制序列，使组织特异性表达额外地还依赖于特定胁迫因素而发生。相应的元件已有描述，例如对于水胁迫、脱落酸(Lam E and Chua N H，(1991)J Biol Chem 266(26)：17131-17135)和热胁迫(等(1989)Mol Gen Genetics217(2-3)：246-53)。再一可能方案是，将允许在其它植物组织或其它生物例如大肠杆菌中发生表达的其它启动子与需表达的核酸序列功能性连接。合适的植物启动子原则上为上述所有启动子。可以想到的是，例如，可以使一个特定的核酸序列通过一个启动子(例如本发明的启动子之一)在一种植物组织中转录为有义RNA并翻译成相应的蛋白质，而利用具有不同特异性的另一启动子使同样的核酸序列在不同的组织中转录成反义RNA并下调相应的蛋白质。这可以利用本发明的表达盒，通过将一个启动子置于需转基因表达的核酸序列的前面、而将另一个启动子置于需表达的核酸序列的后面来实现。

已经证实，非翻译区在基因表达调控中可以发挥显著作用。已经证实，5′非翻译序列可以增强异源基因的瞬时表达。它们可以进一步促进组织特异性(Rouster J等(1998)Plant J.15：435-440.)。相反地，opaque-2基因的5′非翻译区抑制表达。该基因的此相应区段的缺失会导致基因活性的增加(Lohmer S等(1993)Plant Cell 5：65-73)。具有表达促进功能的其他5′非翻译序列和内含子为技术人员所知。McElroy及其同事(McElroy等(1991)Mol Gen Genet 231(1)：150-160)报道了用于单子叶植物转化的基于稻肌动蛋白1(Act1)启动子的构建体。在转基因稻细胞中组合使用Act1内含子和35S启动子，导致了表达速率相比于分离的35S启动子增加10倍。通过优化报告基因β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)基因的翻译起始位点的序列环境，导致了在转化的稻细胞中GUS表达的4倍增加。组合优化的翻译起始位点和Act1内含子使转化了的水稻细胞中由CaMV35S启动子驱动的GUS表达增加了40倍；类似的结果也已经在转化的玉米细胞中得到。总地来说，从以上所描述的研究中已经得出这样的结论，基于Act1启动子的表达载体适于控制外源DNA在转化的单子叶植物细胞中的足够强的组成型表达。

此外，本发明的表达控制区域的表达谱可以通过利用表达增强性内含子和/或转录终止序列而增强。

因此，在一个优选的实施方案中，本发明的多核苷酸包含至少一个额外的元件，该元件选自：a)5′非翻译区，b)内含子编码序列，以及c)转录终止序列。

优选地，“内含子编码序列”是指来自单子叶植物的编码表达增强性内含子的内含子。更优选地，内含子编码序列是来自泛素、肌动蛋白或醇脱氢酶基因的内含子。最优选地，内含子编码序列为编码金属硫蛋白1多肽(MET1)、金属硫蛋白样多肽(MET-like)或其功能等同物或直系同源物的植物基因的第一内含子。

优选的编码金属硫蛋白样多肽(或其功能等同物或同源物)的植物基因的第一内含子在WO2006/094976和WO2008/099013中公开，这些专利文献在此作为参考文献而被引用。优选地，所述第一内含子来自单子叶植物的MET样基因。更优选地，所述第一内含子来自稻(见实施例)。再更优选地，第一内含子来自编码SEQ ID NO：118所示的多肽的MET样基因。最优选地，该编码金属硫蛋白1的植物基因的第一内含子具有SEQ IDNO：119所示的序列。

也考虑，内含子编码区是编码金属硫蛋白样蛋白的植物基因的第一内含子的变体，特别是，具有如SEQ ID NO：120所示序列的第一内含子的变体。优选地，该变体和所述第一内含子具有至少70％、至少80％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的同一性。怎样确定同一性的程度在本文其它地方进行了描述。

优选地，内含子编码序列被插入到表达构建体中应表达的目的核酸的5′非翻译区(即，在表达控制序列和蛋白编码序列(开放阅读框)或目的核酸之间)。

有利地，已经证实，在本发明中，Met1-1内含子增强本发明的表达控制序列在种子组织中的表达。

表达盒可以还包含一个或多个功能性连接到启动子上的所谓增强子序列，所述增强子序列可以增强核酸序列的转基因表达。也可以在要转基因表达的核酸序列的3′末端插入其它有利序列，例如其它调控元件或终止子。

控制序列还指，允许同源重组或插入到宿主生物的基因组中的那些序列、或允许从基因组进行缺失的那些序列。例如可以通过同源重组，将特定基因的天然启动子用本发明的一个启动子取代。例如cre/lox技术等方法可以用来从宿主生物的基因组中组织特异性地(在一些情况下可诱导的)缺失表达盒(Sauer B.(1998)Methods.14(4)：381-92)。在这种情况中，特异的侧翼序列(lox序列)被附到靶基因上，随后可以利用cre重组酶进行缺失。可以通过将待引入的启动子与DNA序列(例如，和靶基因阅读框前的内源序列同源的序列)连接，通过同源重组，将该待引入的启动子放置在待转基因表达的靶基因前面。该序列被视为遗传控制序列。在细胞被转化了适当的DNA构建体后，两个同源序列可以相互作用，从而将启动子序列置于靶基因前面的期望位点上，结果，启动子序列以功能性方式连接到靶基因上，构成本发明的表达盒。同源序列的选择可以决定启动子的插入位点。在该情况下，表达盒可以利用单一或双重交互重组，通过同源重组而构建。在单一交互重组中，仅使用单一一个重组序列，插入该整个的导入DNA。在双重交互重组中，待导入的DNA两端有侧翼同源序列，该侧翼区被插入。后一程序适用于如上所述的以本发明的一个启动子取代特定基因的天然启动子从而改变基因表达的位置和时间。此功能性连接构成本发明的表达盒。为了选择成功进行了同源重组或转化的细胞，通常需要另外导入选择标记。以下将会提到各种选择标记。选择标记可以用来从未转化细胞中选择转化细胞。同源重组在高等真核生物，特别是植物中是相对很少见的事件。占优势的是在宿主基因组中的随机整合。删除随机整合的序列并由此富集包含正确同源重组的细胞克隆的一个可行方案是使用US 6,110,736中所描述的序列特异性重组系统。

适于作为遗传控制序列的多聚腺苷酸化信号为植物多聚腺苷酸化信号，优选地，来自根癌农杆菌。

在一个特别优选的实施方案中，表达盒包含在植物中具有功能的终止子序列。在植物中具有功能的终止子序列是指，一般地，该序列能够在植物中导致DNA序列的转录的终止。合适的终止子序列的例子是OCS(章鱼碱合酶)终止子和NOS(胭脂碱合酶)终止子。然而，尤其优选的是植物终止子序列。植物终止子序列是指，一般地，作为天然植物基因的组成部分的序列。在此方面，特别优选的是马铃薯组织蛋白酶D抑制剂基因(GenBank登录号X74985)或蚕豆储存蛋白基因VfLEIB3(GenBank登录号Z26489)的终止子。这些终止子至少与本领域所描述的病毒或T-DNA终止子相当。

本领域技术人员也知道大量的这样的核酸和蛋白质，所述核酸和蛋白质在本发明表达盒的控制下或在本发明方法下的重组表达将是有利的。下面将会提到一些其表达将产生期望的有利效果的目的核酸的例子。

本领域技术人员也知道大量的这样的基因，通过表达合适的反义RNA阻抑或关闭该基因，同样可以获得有利效果。可以提到的有利效果的非限制性例子是：促进转基因生物的产生(例如通过表达选择标记)，获得对非生物胁迫因子(热、冷、贫瘠、增加的湿度、干旱、环境毒素、紫外辐射)的抗性，获得对生物胁迫因子(病原体、病毒、昆虫和病害)的抗性，改善人或动物食物性质，提高生长速率或产率。优选地，生物胁迫因子为种传病害(主要是真菌病害，例如，腥黑粉穗病(小麦腥黑粉菌(Tilletiatritici))；叶条纹病(麦类核腔菌(Pyrenophora graminea))和主要在大麦中发生的散黑粉病(裸黑粉菌(Ustilago nuda))。

此外，籽粒、尤其是玉米粒，的最大用途是用作饲料或食物。导入会改变籽粒组成的基因可以极大地提高饲料或食物的价值。籽粒的主要组分是淀粉、蛋白质和油。籽粒的这些主要组分每一都可以通过改变其水平或组成而被改善(即，可以改变各个组分的构件的营养价值或者油和淀粉的相应结构，以提高其营养含量)。

许多谷粒中的蛋白质对作为饲料和食物目的、特别是作为猪、家禽和人类的食物时不是最合适的。该蛋白质缺乏在这些物种的食谱中所必需的几种氨基酸，从而需要向谷粒中添加补充物。限制性必需氨基酸可包括赖氨酸、甲硫氨酸、色氨酸、苏氨酸、缬氨酸、精氨酸和组氨酸。种子和谷粒中这些必需氨基酸的含量可以通过如下机制而得到提高，所述机制包括导入基因以增加所述氨基酸的生物合成、减少所述氨基酸的降解、提高所述氨基酸在蛋白质中的储存、或增进所述氨基酸向种子或谷粒中的转运。

用来增加氨基酸生物合成的一个机制是导入可以对氨基酸生物合成路径去调控的基因，以使植物不再能充分地控制生产水平。这可以通过去调控或绕过在氨基酸生物合成路径中正常受该路径的氨基酸终产物水平调控的步骤来实现。实例包括，导入编码去调控型的天冬氨酸激酶或二氢吡啶二羧酸(DHDP)合成酶的基因来增加赖氨酸和苏氨酸的产生，以及导入编码去调控型的邻氨基苯甲酸合成酶的基因来增加色氨酸产生。降低氨基酸的分解代谢可以通过导入如下DNA序列来实现，所述DNA序列能降低或消除催化分解代谢途径中的步骤的酶(例如赖氨酸-酮戊二酸还原酶)的编码基因的表达。

谷粒的蛋白质组成可以用各种方法来改变以改善氨基酸的平衡，这些方法包括提升天然蛋白质的表达、降低那些具有不良组成的蛋白质的表达、改变天然蛋白质的组成、或导入编码具有优良组成的全新蛋白质的基因。可以导入能降低储存蛋白中的玉米醇溶蛋白家族成员的表达的DNA。该DNA可以编码核酶或反义序列定向地降低玉米醇溶蛋白的表达或降低玉米醇溶蛋白表达的调控物(例如opaque-2基因产物)的表达。谷粒的蛋白质组成可以通过共抑制现象来改变，即，通过表达经转化导入的、与内源基因一样的结构基因或基因片段来抑制内源基因的表达。此外，所导入的DNA可以编码降解玉米醇溶蛋白的酶。玉米醇溶蛋白表达的降低可伴随着具有更期望的氨基酸组成的蛋白质的增加或其它主要种子组分例如淀粉的增加。或者，可以导入嵌合基因，该嵌合基因包含编码具有合适氨基酸组成的天然蛋白质(例如一种球蛋白或玉米的10kD玉米醇溶蛋白)的序列和启动子或设计用于增加所述蛋白质表达的其它调控序列。所述基因的编码序列可以包括编码必需氨基酸的额外密码子或置换密码子。此外，可以使用来源于其它物种的编码序列、或部分或完全合成的序列，其中所述序列编码设计用于增强种子的氨基酸组成的完全独特的肽序列。

导入改变谷粒的油含量的基因，可能是有价值的。油含量的增加可以导致用于饲料和食物的种子的可代谢能量的含量和密度的增加。所导入的基因可以编码除去或降低脂肪酸或脂质生物合成中的限速或调节步骤的酶。这样的基因为例如，编码乙酰辅酶A羧化酶、ACP-酰基转移酶、β-酮脂酰-ACP合成酶以及其它熟知的脂肪酸生物合成活性的基因。

可以导入基因以增加谷粒中淀粉组分的营养价值，例如通过增加淀粉的分支度，延缓淀粉的代谢从而改进淀粉在母牛中的利用。

包含一些谷粒的饲料或食物具有不足量的维生素，因而必须加以补充以提供充分的营养价值。可以考虑导入增加种子中维生素的生物合成(包括例如维生素A、E、B₁₂、胆碱等)的基因。

可以通过改变直链淀粉与支链淀粉的比率、淀粉分子的大小、或淀粉的分支模式，对淀粉的特性进行有利的改变。通过这些改变，许多特性可以被改良，这些特性包括例如糊化温度、糊化热、膜和糊的透明度。为了实现这些特性改变，可以单独或以组合的方式导入编码颗粒结合性或可溶性淀粉合酶活性或分支酶活性的基因。也可以用DNA例如反义构建体来降低这些酶的内源性活性水平。

此外，一些用于饲料和食物应用的谷粒具有不足量的维生素，因而必须加以补充以提供充分的营养价值。可以考虑导入增加种子中维生素的生物合成(包括例如维生素A、E、B₁₂、胆碱等)的基因。

再有，还可以考虑，使用植物生产或制备在该植物中原先根本不产生或不以相同水平产生的有用生物学化合物。可以利用转化方法导入并表达基因来制备产生这些化合物的新型植物。化合物可以包括，例如，目前由任何生物生产的任何生物学化合物，例如蛋白质、核酸、初级和中间代谢物、碳水化合物聚合物等。化合物可以由植物产生，在收获和/或加工后进行提取，并用于任何目前公认的用途，例如作为药品、香料、工业用酶等。

优选地，能与本发明的表达控制序列组合的有用目的核酸序列包括，编码种子储存蛋白、脂肪酸途径酶、生育酚生物合成酶、氨基酸生物合成酶、以及淀粉分支酶的基因。

依据本发明的表达控制序列可以用于表达在食品-饲料业中使用的代谢酶，例如植酸酶和纤维素酶。特别优选编码微生物植酸酶(GenBank登录号A19451)或其功能等同物的核酸，例如人工cDNA。可导致例如生育酚、生育三烯酚(tocotrienols)或类胡萝卜素等精细化学品积累的基因表达。一个可以提及的例子是八氢番茄红素去饱和酶。优选编码黄水仙(Narcissus pseudonarcissus)八氢番茄红素去饱和酶(GenBank登录号X78815)或其功能等同物的核酸。

依据本发明的表达控制序列可以被用来表达改变油生产(US6,444,876)、高油生产(U.S.Pat.Nos.5,608,149和6,476,295)、或改变脂肪酸含量(US 6,537,750)的目的核酸。优选的脂肪酸途径酶包括硫酯酶(U.S.Pat.Nos.5,512,482；5,530,186；5,945,585；5,639,790；5,807,893；5,955,650；5,955,329；5,759,829；5,147,792；5,304,481；5,298,421；5,344,771；和5,760,206)、甘油二酯酰基转移酶(美国专利公布20030115632A1和20030028923A1)、和去饱和酶(U.S.Pat.Nos.5,689,050；5,663,068；5,614,393；5,856,157；6,117,677；6,043,411；6,194,167；5,705,391；5,663,068；5,552,306；6,075,183；6,051,754；5,689,050；5,789,220；5,057,419；5,654,402；5,659,645；6,100,091；5,760,206；6,172,106；5,952,544；5,866,789；5,443,974；和5,093,249)，所有文献均在此作为参考文献被引用。

可以生产营养药(neutraceuticals)，例如通过表达脂肪酸延长酶和/或去饱和酶，产生例如花生四烯酸、EP(二十碳五烯酸)、或DHA(二十二碳六烯酸)等多不饱和脂肪酸，或生产具有改进营养价值的蛋白质，例如具有高含量的必需氨基酸的蛋白质(例如巴西坚果中富甲硫氨酸2S白蛋白的基因)。优选的核酸为编码以下的核酸：巴西栗(Bertholletia excelsa)的富甲硫氨酸2S白蛋白(GenBank登录号AB044391)、展叶剑叶藓(Physcomitrella patens)的δ-6-酰基脂质去饱和酶(GenBank登录号AJ222980；Girke等(1998)Plant J 15：3948)、高山被孢霉(Mortierellaalpina)的δ-6-去饱和酶(Sakuradani等(1999)Gene 238：445-453)、秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)的δ-5-去饱和酶(Michaelson等1998，FEBS Letters 439：215-218)、秀丽隐杆线虫的δ-5-脂肪酸去饱和酶(des-5)(GenBank登录号AF078796)、高山被孢霉的δ-5-去饱和酶(Michaelson等J Biol Chem 273：19055-19059)，秀丽隐杆线虫的δ-6-延长酶(Beaudoin等(2000)Proc Natl.Acad Sci USA 97：6421-6426)、展叶剑叶藓的δ-6-延长酶(Zank等(2000)Biochemical Society Transactions 28：654-657)，或它们的功能等同物。

可以例如通过表达乙酰辅酶A羧化酶，提高在正常情况下包含极少储存蛋白或脂质的细胞的储存能力，以增加这些物质的产量。优选的核酸为编码紫花苜蓿的乙酰辅酶A羧化酶(accase)(GenBank Acc.No.：L25042)或其功能等同物的核酸。关于有利基因的更多实例在例如Dunwell J M(2000)J Exp Bot.51 Spec No：487-96中提到。作为选择，储存蛋白含量的增加可能有利于高蛋白产品的生产。优选的种子储存蛋白包括玉米醇溶蛋白。

目的核酸也可以赋予对病毒、细菌、真菌、昆虫(例如通过表达合适的Bt基因)和线虫所引起的种子相关疾病的抗性。

例如，目的核酸可以赋予对已知影响贮藏种子的真菌的抗性，这些真菌例如曲霉属(Aspergillus)、青霉属(Penicillium)、或镰孢霉属(Fusarium)(特别是，串珠镰孢(Fusarium moniliformere))的真菌。优选地，对镰孢霉的抗性可以通过可操作地连接依据本发明的表达控制序列到编码可以赋予镰孢霉抗性的Cry-1A(b)或任何其它Cry变体的核酸序列上而获得。

此外，目的核酸可以赋予对小麦粒线虫(Anguina tritici)的抗性，该线虫能导致一粒小麦(Triticum monococcum)、黑麦(Secale cereale)、斯卑尔脱小麦和普通小麦(T.aestivum)显著的农作物损失。

目的核酸还可以赋予对云卷蛾属物种(Cnephasia)的抗性，特别是对谷物卷蛾(cereal tortrix，Cnephasia pumicana)的抗性，以及对例如杂食云卷蛾(Cnephasia longana)等卷叶蛾的抗性。

还可以考虑，目的核酸可以赋予对例如网纹蛞蝓(Derocerasreticulatum)或野缨蛞蝓(Deroceras agreste)等麦蛞蝓(grey field slugs)的抗性。

对病毒的抗性可以通过表达新型基因而获得。例如，已经证实在转基因植物中表达病毒衣壳蛋白能够赋予植物对该病毒所引起的感染的抗性、以及可能地对其他密切相关病毒所引起的感染的抗性。可以想到，通过表达靶向基本病毒功能的反义基因可以赋予对该病毒的抗性。例如，靶向负责病毒核酸复制的基因的反义基因可以抑制该复制并导致对该病毒的抗性。据信，通过使用反义基因干扰其它病毒功能也可以提高对病毒的抗性。

在本发明启动子控制下的核酸表达可以发生在任何期望的细胞区室(例如内膜系统、液泡和叶绿体)中。通过对分泌途径的利用，可以获得所需的糖基化反应(特别是折叠等)。也可以将靶蛋白分泌到细胞表面或分泌到培养基中，例如在使用悬浮培养的细胞或原生质体时。因而实现该目的所必需的靶序列可以被考虑在单独的载体变量中，并且可以通过使用合适的克隆策略而与待被克隆的靶基因一起导入到载体中。可以利用基因内在序列(如果存在的话)或异源序列作为靶序列。其它优选用于功能性连接的异源序列包括，但不限于：可以确保亚细胞定位到质外体、液泡、质体、线粒体、内质网(ER)、细胞核、油质体或其它细胞区室中的其它导向序列；以及翻译增强子，例如来自烟草花叶病毒的5’前导序列(Gallie等(1987)Nucl Acids Res 158693-8711)等。将本身不定位在质体中的蛋白质以靶向的方式转运到质体中的方法已经有描述(Klosgen R B &Weil J H(1991)Mol Gen Genet 225(2)：297-304；Van Breusegem F等(1998)Plant Mol Biol 38(3)：491-496)。

优选的序列为：

a)来源于豌豆、玉米和向日葵的核酮糖二磷酸羧化酶的小亚基(SSU)(Rubisco ssu)；

b)衍生自植物脂肪酸生物合成中的基因的转运肽，例如质体酰基载体蛋白(ACP)、硬脂酰-ACP去饱和酶、β-酮酰基-ACP合成酶或酰基-ACP硫酯酶的转运肽；

c)GBSSI(淀粉颗粒结合性淀粉合酶1)的转运肽；

d)LHCP II基因。

靶序列可以被连接到与这些转运肽编码序列不同的其它靶向序列上，以确保亚细胞定位到质外体、液泡、质体、线粒体、内质网(ER)、细胞核、油质体或其它细胞区室中。还可以利用翻译增强子，例如来自烟草花叶病毒的5′前导序列(Gallie等(1987)Nucl Acids Res 15：8693-8711)等。

本领域技术人员也将明了，其无需直接地使用编码上述基因的核酸序列来表达上述基因，或例如通过反义的方法来阻抑上述基因。他也可以利用例如锌指蛋白类的人工转录因子(Beerli R R等(2000)Proc NatlAcad Sci USA 97(4)：1495-500)。这些转录因子结合在需表达或抑制的内源基因的调控区域中，并取决于该因子的设计，导致内源基因的表达或抑制。因此，也可以通过在本发明启动子之一的控制下表达合适的锌指转录因子，获得这些期望效果。

本发明的表达盒也可以通过基因沉默，用于种子特异性抑制或减少靶基因的复制或/和翻译。

本发明的表达盒还可以被用于种子特异性地表达核酸，其中所述核酸介导所谓的反义效应并由此能够例如降低靶蛋白的表达。

关于其阻抑是有利表型的条件的优选基因和蛋白质，包括例如，但不限于：

a)例如在Tada Y等(1996)FEBS Lett 391(3)：341-345或Nakamura R(1996)Biosci Biotechnol Biochem 60(8)：1215-1221中描述的变应原蛋白的表达的降低；

b)通过抑制负责α-1，6-葡糖苷键的分支酶Q来改变淀粉中直链淀粉/支链淀粉含量。相应的程序已得到了描述(例如在Schwall G P等(2000)Nat Biotechnol 18(5)：551-554中)。优选用于该目的的核酸序列为例如马铃薯淀粉分支酶II(GenBank Acc.No.：AR123356；U.S.Pat.No.6,169,226)或来源于其它属和种的该分支酶的同源物的核酸序列。

“反义”核酸主要是指，完全或部分地与所述的靶蛋白质的有义链的至少部分互补的核酸序列。本领域技术人员知道可以利用cDNA或相应的基因作为构建相应反义构建体的起始模板。优选地，反义核酸与靶蛋白的编码区或其部分互补。然而，反义核酸也可以与非编码区或其部分互补。从靶蛋白的序列信息开始，反义核酸可以采用技术人员所熟悉的方式、考虑Watson和Crick碱基配对原则来设计。反义核酸可以与靶蛋白的核酸序列的全部或部分互补。在一个优选的实施方案中，反义核酸为长度例如15、20、25、30、35、40、45或50个核苷酸的寡核苷酸。

在一个优选的实施方案中，反义核酸包括α-异头物核酸分子。α-异头物核酸分子与互补RNA形成特别是双链杂交体，其中两条链走向互相平行，这和正常的β单位是不同的(Gaultier等(1987)Nucleic Acids Res15：6625-6641)。本发明也涵盖以有义方向利用以上所描述的序列，并且该应用可以，如本领域技术人员所熟悉的，产生共抑制。内源基因的有义RNA的表达可以降低或关闭该基因的表达，这和反义方法中所描述的相似(Goring等(1991)Proc Natl Acad Sci USA 88：1770-1774；Smith等(1990)Mol Gen Genet 224：447-481；Napoli等(1990)Plant Cell2：279-289；Van der Krol等(1990)Plant Cell 2：291-299)。所引入的构建体也可以完全或仅部分地是待减少的基因。但不需要其能够翻译。

同样也非常优选的是使用例如通过双链RNA进行基因调控(双链RNA干涉)的方法。相应的程序为技术人员所知并已得到了详细的描述(例如Matzke M A等(2000)Plant Mol Biol 43：401-415；Fire A.et al(1998)Nature 391：806-811；WO 99/32619；WO 99/53050；WO00/68374；WO 00/44914；WO 00/44895；WO 00/49035；WO 00/63364)。明确参考上述文献中描述的程序和方法。在此可以通过同时导入正义链及互补链，实现天然基因的高效抑制。

可以并且有利的是，将反义策略和核酶方法相结合。核酶是有催化活性的RNA序列，它和反义序列结合，催化切割靶序列(Tanner N K.FEMSMicrobiol Rev.1999；23(3)：257-75)。这可以提高反义策略的效率。用于减少特定蛋白质的核酶的表达为技术人员所知并在例如EP-A1 0 291533，EP-A1 0 321 201和EP-A1 0 360 257中得到了描述。合适的靶序列和核酶可以按Steinecke(Ribozymes，Methods in Cell Biology 50，Galbraith等eds.Academic Press，Inc.(1995)，449-460)所描述的方法、通过计算核酶RNA和靶RNA的二级结构以及它们之间的相互作用(Bayley C C等，Plant Mol Biol.1992；18(2)：353-361；Lloyd A M andDavis R W等，Mol Gen Genet.1994 March；242(6)：653-657)，而确定。应该被提到的例子是锤头核酶(Haselhoff and Gerlach(1988)Nature334：585-591)。优选的核酶基于四膜虫L-19IVS RNA的衍生物(U.S.Pat.No.4,987,071；U.S.Pat.No.5,116,742)。可以选择对L119mRNA具有选择性的其它核酶(Bartel D and Szostak J W(1993)Science261：1411-1418)。

在再一实施方案中，靶蛋白质的表达可以通过利用和靶蛋白质基因的调控元件互补的核酸序列来降低，其中该核酸和调控元件形成一个三螺旋结构从而阻止了基因的转录(Helene C(1991)Anticancer Drug Des.6(6)：569-84；Helene C等(1992)Ann NY Acad Sci 660：27-36；MaherL J(1992)Bioassays 14(12)：807-815)。

本发明的表达盒和由此衍生的载体可以包含其它功能元件。术语“功能元件”应作广义理解，意指对本发明的表达盒或由此衍生的载体或生物体的产生、扩增或功能具有影响的所有元件。可以提到的例子包括但不限于：

a)报告基因或蛋白，它们编码可以容易地定量的蛋白质，并可以通过固有的颜色或酶活性来保证对转化效率或表达的部位或时间的评价(Schenborn E，Groskreutz D(1999)Mol Biotechnol 13(1)：2944)。可以提到的例子包括：

绿色荧光蛋白(GFP)(Chui W L等，Curr Biol 1996，6：325-330；Leffel S M等，Biotechniques.23(5)：912-8，1997；Sheen等(1995)Plant Journal 8(5)：777-784；Haseloff等(1997)Proc Natl Acad SciUSA 94(6)：2122-2127；Reichel等(1996)Proc Natl Acad Sci USA 93(12)：5888-5893；Tian等(1997)Plant Cell Rep 16：267-271；WO97/41228)；氯霉素转移酶(Fromm等(1985)Proc Natl Acad Sci USA82：5824-5828)；萤光素酶(Millar等(1992)Plant Mol Biol Rep10：324-414；Ow等(1986)Science，234：856-859)，其允许对生物发光进行检测；β-半乳糖苷酶，其编码的酶可以作用于多种可得的显色底物；β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)(Jefferson等(1987)EMBO J 6：3901-3907)或uidA基因，其编码可以作用于多种显色底物的酶；R-基因座基因产物蛋白质，其可以调控植物组织中花色素苷色素(红色)的产生，从而可以直接分析启动子的活性而不需要添加额外的辅助剂或显色底物(Dellaporta等，In：Chromosome Structure and Function：Impact of NewConcepts，18th Stadler Genetics Symposium 11：263-282，1988)；β-内酰胺酶(Sutcliffe(1978)Proc Natl Acad Sci USA 75：3737-3741)，其是可以作用于多种显色底物(例如PADAC，一种显色的头孢菌素)的酶；xyIE基因产物(Zukowsky等(1983)Proc Natl Acad Sci USA80：1101-1105)；儿茶酚双加氧酶，其能转化显色的儿茶酚；α-淀粉酶(Ikuta等(1990)Biol Technol.8：241-242)；酪氨酸酶(Katz等(1983)JGen Microbiol 129：2703-2714)，其是将酪氨酸氧化成DOPA和多巴醌(随后形成可以容易地检测的黑色素)的酶；水母发光蛋白(Prasher等(1985)Biochem Biophys Res Commun 126(3)：1259-1268)，其能用于钙-敏感的生物发光检测。

b)复制起点，其确保本发明的表达盒或载体在例如大肠杆菌中扩增。可以提到的例子为ORI(DNA复制起点)、pBR322 ori或P15A ori(Sambrook等：Molecular Cloning.A Laboratory Manual，2nd ed.ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1989)。

c)通过其可以实现农杆菌介导的向植物细胞的转移以及在植物基因组中的整合的元件，例如“边界序列”，例如T-DNA的右或左边界或vir区等。

d)允许和利于一个或多个核酸序列插入的多克隆位点区(MCS)。

本领域技术人员知道获取本发明表达盒的各种方法。本发明表达盒可以通过例如以下方法产生：将一个本发明的表达控制序列与待表达的目的核酸序列融合，如果合适的话和编码转运肽的序列融合(优选地该转运肽编码序列位于启动子和相应核酸序列之间)、以及和终止子或多聚腺苷酸化信号融合。常规的重组和克隆技术可用于该目的(如以上所描述)。

类似地，还可以将待转基因表达的核酸序列，例如通过同源重组，置于内源的天然启动子后面，从而产生本发明的表达盒，该表达盒可以控制该待转基因表达的核酸序列的表达。

原则上，本发明也涉及源自上述转基因生物的细胞、细胞培养物、部分——在转基因植物生物的情况下例如，根、叶、种子等——以及转基因繁殖材料，例如种子或果实。

能被人类和动物食用的本发明遗传修饰植物也可以例如直接地或在以本身已知的方式加工后用作人类食物或动物食物。

本发明的再一方面因此涉及上述本发明转基因生物以及源自其的细胞、细胞培养物、部分——在转基因植物生物的情况下例如，根、叶、种子等——以及转基因繁殖材料例如种子或果实的用途，用于生产人类或动物的食物、药品或精细化学品。

还优选的是在宿主生物体中重组生产药品或精细化学品的方法，在该方法中，用上述的一个表达盒或载体转化宿主生物(该表达盒包含一个或多个结构基因，所述结构基因编码所需的精细化学品或催化所需的精细化学品的生物合成)，对转化的宿主生物进行培养，和从培养基中提取所需的精细化学品。该方法可以广泛应用于各种精细化学品，例如酶、维生素、氨基酸、糖、脂肪酸、天然和合成的调味剂、芳化剂和色素。尤其优选的是生育酚、生育三烯酚和类胡萝卜素的产生。可以用技术人员已知的方法对转化的宿主生物进行培养、以及从宿主生物或培养基中进行分离。关于抗体或疫苗等药品的产生，参见Hood E E，Jilka J M(1999).Curr OpinBiotechnol 10(4)：382-6；Ma J K，Vine N D(1999).Curr Top MicrobiolImmunol 236：275-92。

本说明书所引用的所有参考文献，就其全部公开内容以及在本说明书中特别提到的公开内容，而特此并入本文作为参考。

附图说明

图1、KG_Fragment 86的序列(SEQ ID NO：10)

图2、62260557.f_o13_1Maize的序列(SEQ ID NO：11)

图3、q-RT-PCR结果，显示62260557.f_o13_1Maize的全种子特异性表达。[根_dv：授粉后5、15、30天(DAP，授粉后的天数)的根的混合物；叶_dv：5、15、30DAP的叶的混合物；穗：5和10DAP的穗的混合物；全种子：15、20、30DAP的全种子的混合物；胚乳：15、20、30DAP的胚乳的混合物；胚：15、20、30DAP的胚的混合物；根_V2+V4：V2和V4阶段的根的混合物；枝条/叶_V2+V4：V2枝条和V4叶的混合物；花_GS：花和萌发种子的混合物]

图4、KG_Fragment 86的相应CDS序列(SEQ ID NO：4)

图5、KG_Fragment 86的相应基因的推定蛋白质的氨基酸序列(SEQID NO：5)

图6、AZM5_7833的序列(SEQ ID NO：128)，它包含预测的CDS序列和上游启动子区域。5’UTR(127bp)通过将基因组序列与玉米EST序列相比较来确定并显示为斜体，预测的开放阅读框以加下划线表示，用于分离启动子区域的引物以加粗表示。

图7、启动子KG86(p-KG86)的序列(SEQ ID NO：1)

图8、载体RKF126的示意图

图9、RKF126的序列(SEQ ID NO：56)

图10、使用RKF126在转基因玉米中由p-KG86驱动的GUS在不同组织中在不同发育阶段的表达

图11、A)ZM1s61973481的序列(SEQ ID NO：57)，B)ZM1s61221800的序列(SEQ ID NO：58)，以及C)ZM1s62042561的序列(SEQ ID NO：59)

图12、q-RT-PCR结果，显示MAWS42的全种子特异性表达。[根_dv：授粉后5、15、30天(DAP)的根的混合物；叶_dv：授粉后5、15、30天的叶的混合物；穗：授粉后5和10天的穗的混合物；全种子：授粉后15、20、30天的全种子的混合物；胚乳：授粉后15、20、30天的胚乳的混合物；胚：授粉后15、20、30天的胚的混合物；根_V2+V4：V2和V4阶段的根的混合物；枝条/叶_V2+V4：V2枝条和V4叶的混合物；花_GS：花和萌发种子的混合物]

图13、q-RT-PCR结果，显示MAWS45的全种子特异性表达。[根_dv：授粉后5、15、30天(DAP)的根的混合物；叶_dv：授粉后5、15、30天的叶的混合物；穗：授粉后5和10天的穗的混合物；全种子：授粉后15、20、30天的全种子的混合物；胚乳：授粉后15、20、30天的胚乳的混合物；胚：授粉后15、20、30天的胚的混合物；根_V2+V4：V2和V4阶段的根的混合物；枝条/叶_V2+V4：V2枝条和V4叶的混合物；花_GS：花和萌发种子的混合物]

图14、MAWS42的相应CDS序列(SEQ ID NO：6)

图15、MAWS42的相应基因的ZmTIP3-1的氨基酸序列(SEQ ID NO：7)

图16、MAWS45的相应CDS序列(SEQ ID NO：8)

图17、MAWS45的相应基因的氢基酸序列(SEQ ID NO：9)

图18、AZM5_17960的序列(SEQ ID NO：70)以及AZM5_6324的序列(SEQ ID NO：71)，它们包含预测的CDS序列(ATG以加粗和下划线表示)、预测的5’UTR(斜体)、以及额外的推定启动子序列。5’UTR序列通过将基因组序列与玉米EST相比较来确定。

图19、启动子MAWS42(p-MAWS42)的序列SEQ ID NO：2以及启动子MAWS45(p-MAWS45)的序列SEQ ID NO：3

图20、RTP1052的示意图

图21、RTP1052的序列(SEQ ID NO：116)

图22、RTP1057的示意图

图23、RTP1057的序列(SEQ ID NO：117)

图24、使用RTP1052在转基因玉米中由p-MAWS42驱动的GUS在不同组织在不同发育阶段的表达

图25、使用RTP1057在转基因玉米中由p-MAWS45驱动的GUS在不同组织在不同发育阶段的表达

实施例

现用以下实施例对本发明进行举例说明，这些实施例不旨在以任何方式对本发明的范围构成限制。

实施例1：玉米全种子启动子KG86的鉴定与验证

鉴定KG86的转录本

采用商业提供的AFLP比较表达技术(Keygene N.V.，P.O.Box 216，6700AE Wageningen，The Netherlands)，对BASF制备的来自23个玉米组织的一系列RNA样品，进行了玉米基因表达谱分析(表1)。命名为“KG_Fragment 86”的231bp片段在被鉴定为具有全种子特异性表达的AFLP条带中。KG_Fragment 86的序列如图1所示。

鉴定相应于KG_Fragment 86的基因

以KG_Fragment 86的序列作为查询序列，BLASTN搜索BASF的内部数据库HySeq All EST。与KG_Fragment 86显示97％同一性的登录号62260557.f_o13_1Maize被鉴定为与KG_Fragment 86具有最高同源性。62260557.f_o13_1Maize的序列如图2所示。

利用定量反转录聚合酶链式反应(qRT-PCR)确证62260557.f_o13_1Maize的表达模式。

为了证实62260557.f_o13_1Maize的天然表达模式，从用于AFLP表达谱分析的相同材料(表1)中提取总RNA，进行定量反转录聚合酶链式反应(qRT-PCR)。

基于62260557.f_o13_1Maize和KG_Fragment 86的序列、使用VectorNTI软件包(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)设计qRT-PCR引物。用两套引物进行62260557.f_o13_1Maize的PCR扩增(表2)。以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)基因作为对照用于标化目的。

表2、q-RT-PCR引物序列

引物	序列(SEQ ID NO)
		62260557_正向_1	CAGCTAGCGGCTTAGTCT (12)
62260557_反向_1	CTCTTCGCCTGGAGGTTC (13)
		62260557_正向_2	TGGTTTCATTGGATGCAGC (14)
62260557_反向_2	TGCAGTGCGAGTCAGAGA(15)
		GAPDH_正向	GTAAAGTTCTTCCTGATCTGAAT (16)
GAPDH_反向	TCGGAAGCAGCCTTAATA (17)

使用SuperScript III反转录酶(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)和SYBR Green QPCR Master Mix(Eurogentec，San Diego，CA，USA)、在ABI Prism 7000序列检测系统上进行q-RT-PCR。使用20ul体积中2-3μg总RNA和1μl反转录酶，合成cDNA。将cDNA稀释成一系列浓度(15-20ng/μl)。在30ul体积中使用30-40ng cDNA、以SYBR Green QPCRMaster Mix按厂商的说明书进行定量PCR(qPCR)。热循环条件为：50℃保温2分钟，95℃变性10分钟，95℃、15秒和60℃、1分钟进行40个循环用于扩增。在扩增的最后一个循环后，进行解离曲线分析以证实扩增特异性地发生以及在扩增过程中没有产生引物二聚体产物。以持家基因甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH，其引物序列见表2)作为内源参考基因，采用比较Ct(阈值循环数)值的方法，对计算值进行标化。以候选基因(62260557.f_o13_1Maize)的Ct值减去GAPDH基因的Ct值得到ΔCT值，候选基因的相对转录量(表达水平)表示为2^-ΔCT。q-RT-PCR结果汇总于图3。以两套引物得到了类似的表达模式，该模式与从AFLP数据中得到的表达模式相当。

KG_Fragment 86的注释

基于以EST 62260557.f_o13_1Maize序列BLASTX搜索GenBank蛋白质数据库(nr)获得的芯片(in silico)结果、以及使用Vector NTI软件包对序列进行芯片翻译的结果，对KG_Fragment 86的编码序列进行注释。EST 62260557.f_o13_1Maize序列编码与注释为假定蛋白质OsI_025737(GenBank登录号：EAZ04505.1)的稻基因具有最高同源性的部分蛋白质。通过BlastX查询鉴定出的同源性最高15个序列列于表3。

表3、玉米EST 62260557.f_o13_1的BLASTX搜索结果

KG_Fragment 86的CDS序列如图4所示，推定的氨基酸序列如图5所示。

鉴定启动子区域

为了鉴定启动子，将预测的KG_Fragment 86基因的起始密码子上游的序列定义为启动子p-KG86。为了鉴定该启动子区域，将62260557.f_o13_1的序列相对于BASF Plant Science的私有基因组DNA序列数据库PUB_tigr_maize_genomic_partial_5.0.nt进行作图。鉴定到一个玉米基因组DNA序列AZM5_7833(5084bp)。该5084bp序列包含KG_Fragment 86的CDS以及该基因起始密码子ATG上游的2kb多序列(图6)。

PCR扩增分离启动子区域

使用以下序列特异性引物进行基因组PCR，分离了该推定的启动子区域：

正向引物：tcccgtgtccgtcaatgtgata(SEQ ID NO：18)

反向引物：Ggactcacgagctgaggctcgg(SEQ ID NO：19)

预期的1198bp片段从玉米基因组DNA中被扩增出来，并注释为启动子KG86(p-KG86)。p-KG86的序列如图7所示。

启动子KG86的PLACE分析

使用植物顺式作用调控DNA元件数据库PLACE(a database of PlantCis-acting Regulatory DNA Elements)、以数据库软件包Genomatix鉴定了1198bp的KG86启动子区域中的顺式作用基序。结果如表4所示。尽管从正向链中没有鉴定出推定的共有TATA框，但在正向链上在核苷酸位置701-705处找到了CAAT框基序。

构建双元载体进行玉米转化以评价p-KG86的功能

为了便于亚克隆，通过在其5′末端添加一个PacI限制性酶切位点以及在其3′末端添加一个BsiWI限制性酶切位点，对1198bp启动子片段进行修饰。PacI-pKG86-BsiWI启动子片段经酶切消化后连接到经PacI和BsiWI酶切消化的BPS基础双元载体HF84上。HF84包含一个植物选择标记表达盒(p-Ubi::c-EcEsdA::t-NOS)以及一个启动子评价盒，该评价盒包括：用于通过PacI和BsiWI插入推定启动子的多克隆位点、在单子叶植物细胞中提供内含子介导的增强作用的稻MET1-1内含子、GUS报告基因和NOS终止子。所获得的包含p-KG86::i-MET1::GUS::t-NOS表达盒的双元载体被命名为RKF126，并用于评价由p-KG86启动子驱动的表达模式。图8为RKF126的示意图。双元载体RKF126的序列如图9所示。

使用RKF126在转基因玉米中评价启动子

采用GUS组织化学分析，按本领域的操作程序(Jefferson 1987)，测定了p-KG86启动子驱动的表达模式和表达水平。采用农杆菌介导的转化系统进行玉米的转化。对于T0和T1植物，选择了10个和5个单拷贝事件用于启动子分析。在以下各发育阶段进行GUS表达的测定：

1)5叶期的根和叶

2)V-7期的茎

3)开花期(穗丝的最初出现)的叶、谷壳和穗丝

4)小穗/雄花穗(授粉时)

5)授粉后5、10、15、20和25天(DAP)的穗或籽粒

结果显示，RKF126的启动子p-KG86在花粉和全种子中特异地表达(图10)。

实施例2：玉米全种子启动子MAWS42和MAWS45的鉴定和验证

MAWS42和MAWS45的转录本的鉴定

使用与表1中所示相同的一组玉米RNA样品、利用微阵列分析，鉴定全种子特异性表达的转录本。将这些玉米组织的23个经标记的RNA分别与23个定制的BPS 米Affymetrix芯片杂交，按Affymetrix表达分析技术手册的指导，以荧光链霉亲和素抗体标记，洗片，进行染色和扫描。

采用Genedata Specialist软件分析芯片杂交数据，基于每种组织的杂交信号强度确定相对表达水平。

选择了该BPS玉米芯片探针组中显示在全种子中比在其它组织中高3-8倍的表达的3个探针作为候选转录本：ZM1s61973481_at，ZM1s61221800_s_at 和ZM1s62042561_at。ZM1s61973481_at，ZM1s61221800_s_at和ZM1s62042561_at的共有序列如图11所示。

初步的序列分析显示，ZM1s61221800包含于ZM1s62042561中，因此，ZM1s61221800和ZM1s62042561被认为代表相同的基因；对该基因的进一步研究基于ZM1s62042561进行。为了表述方便，将ZM1s61973481命名为候选者MAWS42，将ZM1s62042561命名为候选者MAWS45。

采用定量反转录聚合酶链式反应(q-RT-PCR)对MAWS42和MAWS45的表达模式进行验证

从与芯片研究所用相同的材料(表1)中分离总RNA，采用定量反转录PCR(q-RT-PCR)对MAWS42和MAWS45的天然表达模式进行验证。

针对MAWS42基于ZM1s61973481的序列和针对MAWS45基于ZM1s62042561的序列，以Vector NTI软件包设计用于qRT-PCR的引物。每个基因使用两组引物进行PCR扩增。引物的序列列于表5中。以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)基因作为对照进行标化。

表5、q-RT-PCR引物序列

引物	序列(SEQ ID NO)
		MAWS42_正向_1	CTGGCCGTGGGCTTCCTGCT (60)
MAWS42_反向_1	AAGGGCCCAGCCAGTACACCCA (61)
		MAWS42_正向_2	TGGAGGCACCACTGGGTGTACTGG (62)
MAWS42_反向_2	GCTAGTAGTCCTCTGGCGCGAGCG (63)
		MAWS45_正向_1	GCCAACTCTTCCATTTCGCCAAGG (64)
MAWS45_反向_1	GGAGGATTGGCGGTGACAGTCTCA (65)
		MAWS45_正向_2	AGGAAAAAATGGCGGCTCGCTGG (66)
MAWS45_反向_2	CCATGCAAATGGAGGATTGGCGG (67)
		GAPDH_正向	GTAAAGTTCTTCCTGATCTGAAT (68)
GAPDH_反向	TCGGAAGCAGCCTTAATA (69)

使用SuperScriptIII反转录酶(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)和SYBR Green QPCR Master Mix(Eurogentec，San Diego，CA，USA)、在ABI Prism 7000序列检测系统上进行q-RT-PCR。使用20ul体积中2-3ug总RNA和1ul反转录酶，合成cDNA。将cDNA稀释成一系列浓度(15-20ng/ul)。30ul体积中使用30-40ng cDNA、以SYBR Green QPCRMaster Mix按厂商的说明书进行定量PCR(qPCR)。热循环条件为：50℃保温2分钟，95℃变性10分钟，95℃、15秒和60℃、1分钟进行40个循环用于扩增。在扩增的最后一个循环后，进行解离曲线分析以证实扩增特异性地发生以及在扩增过程中没有产生引物二聚体产物。以持家基因甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH，引物序列见表2)作为内源参考基因、采用比较Ct(阈值循环数)值的方法，对计算值进行标化。以候选基因的Ct值减去GAPDH的Ct值得到ΔCT值，候选基因的相对转录量(表达水平)表示为2-ΔCT。q-RT-PCR结果汇总于图12和图13。两套引物都得到了与微阵列研究中得到的表达模式类似的表达模式。

MAWS42和MAWS45的注释

基于以ZM1s61973481和ZM1s62042561的芯片共有序列进行BLASTX搜索GenBank蛋白质数据库(nr)所得到的芯片结果、以及使用Vector NTI软件包的翻译程序得到的结果，对相应于MAWS42和MAWS45基因的编码序列进行了注释。ZM1s61973481部分地编码玉米液泡膜内在蛋白3-1(ZmTIP3)。ZmTIP3-1的CDS(GenBank登录号：NP_0011050321)如图14所示，翻译的氨基酸序列如图15所示，通过BLASTX查询鉴定出的同源性最高的15个序列列于表6。

表6、玉米ZM1s61973481(MAWS42)的BLASTX搜索结果

ZM1s62042561(MAWS45)编码与玉米未知蛋白质(GenBank登录号：ACF84237.1)具有最高同源性的部分蛋白。该基因的CDS如图16所示，翻译的氨基酸序列如图17所示，通过BLASTX查询鉴定出的同源性最高的15个序列列于表7。

表7、玉米ZM1s62042561(MAWS45)的BLASTX搜索结果

登录号	描述	分值	E值
				ACF84237.1	未知[玉蜀黍]	536	e-152
ACG56678.1	色氨酸氨基转移酶[玉蜀黍]	534	e-151
				NP_001054761.1	Os05g0169300[粳稻]	239	e-100
EAY96695.1	假定的蛋白质OsI_017928[籼稻]	239	e-100
				EAY96696.1	假定的蛋白质OsI_017929[籼稻]	233	4e-98
EAY72702.1	假定的蛋白质OsI_000549[籼稻]	167	9e-85
				BAD68317.1	推定的蒜氨酸酶前体[粳稻]	167	9e-85
EAZ10701.1	假定的蛋白质OsJ_000526[粳稻]	167	9e-85
				ACF80703.1	未知[玉蜀黍]	204	2e-79
EAZ33023.1	假定的蛋白质OsJ_016506[粳稻]	158	3e-75
				AAM69848.1	推定的蒜氨酸裂合酶[节节麦(Aegilops tauschii)]	265	1e-73
NP_001042135.1	Os01g0169800[粳稻]	167	7e-73
				CAO64270.1	未命名的蛋白质产物[葡萄]	221	5e-71
CAN80923.1	假定的蛋白质[葡萄]	221	7e-71
				CAO16122.1	未命名的蛋白质产物[葡萄]	157	1e-61

启动子区域的鉴定

将MAWS42和MAWS45对应基因的起始密码子上游的序列定义为推定的启动子p-MAWS42和p-MAWS45。为了鉴定这些推定的启动子区域，将ZM1s61973481和ZM1s62042561的序列相对于BASF Plant Science私有的基因组DNA序列数据库PUB_tigr_maize_genomic_partial_5.0.nt进行作图。鉴定到两个玉米基因组DNA序列，分别为AZM5_17960(3985bp)和AZM5_6324(4565bp)。AZM5_17960的序列具有MAWS42对应基因的预测CDS上游的约1kb序列、AZM5_6324的序列具有MAWS45对应基因的预测CDS上游的约1.5kb序列。这些上游序列被认为是推定的启动子MAWS42(p-MAWS42)和启动子MAWS45(p-MAWS45)。AZM5_17960和AZM5_6324的序列如图18所示。

PCR扩增分离启动子区域

通过使用表8中所示的序列特异性引物进行基因组PCR，分离了推定的启动子序列。从玉米基因组DNA中扩增到AZM5_17960的1008bp的片段和AZM5_6324的1492bp的片段。这些片段分别被命名为启动子MAWS42(p-MAWS42)和启动子MAWS45(p-MAWS45)。p-MAWS42和p-MAWS45的序列如图19所示。

表8、用于pMAWS42和p-MAWS45的PCR克隆的引物

引物	序列(SEQ ID NO)
		p-MAWS42_正向	taactcatatccggttagata(72)
p-MAWS42_反向	gtcgtcgccaaataaaaacctacc(73)
		p-MAWS45_正向	atttaaatgtgttggataatct(74)
p-MAWS45_反向	ctcctcctcctcctcctcctcct(75)

启动子MAWS42和MAWS45的PLACE分析

使用植物顺式作用调控DNA元件数据库PLACE(Plant Cis-actingRegulatory DNA Elements)、以数据库软件包Genomatix，鉴定了1008bp的p-MAWS42启动子区域和1492bp的p-MAWS45启动子区域中的顺式-作用基序。结果如表9和表10所示。

构建双元载体进行玉米转化以评价MAWS42和p-MAWS45的功能

PCR扩增p-MAWS42的1008bp启动子片段，在其5′末端掺入一个SwaI限制性酶切位点以及在其3′末端掺入一个BsiWI位点。所得到的片段经酶切消化后连接到经SwaI和BsiWI酶切消化的BPS基础双元载体CB1006上。质粒CB1006是一个植物转化载体，它包含一个植物选择标记表达盒(p-Ubi::c-ZmAHASL2::t-NOS)以及一个启动子评价盒，该评价盒包括：用于通过SwaI和BsiWI位点插入推定启动子的多克隆位点、在单子叶植物细胞中提供内含子介导的增强作用的稻MET1-1内含子、GUS报告基因和NOS终止子。所获得的包含p-MAWS42::i-MET1::GUS::t-NOS表达盒的双元载体被命名为RTP1052，并用于评价由p-MAWS42启动子驱动的表达模式。图20为RTP1052的示意图。双元载体RTP1052的序列如图21所示。

PCR扩增p-MAWS45的1492bp启动子片段，在其5′末端掺入一个SwaI限制性酶切位点以及在其3′末端掺入一个BsiWI位点。所得到的片段经酶切消化后连接到经SwaI和BsiWI酶切消化的BPS基础双元载体CB1006上。质粒CB1006是一个植物转化载体，它包含一个植物选择标记表达盒(p-Ubi::c-ZmAHASL2::t-NOS)以及一个启动子评价盒，该评价盒包括：用于通过SwaI和BsiWI位点插入推定启动子的多克隆位点、在单子叶植物细胞中提供内含子介导的增强作用的稻MET1-1内含子、GUS报告基因和NOS终止子。所获得的包含p-MAWS45::i-MET1::GUS::t-NOS表达盒的双元载体被命名为RTP1057，并用于评价由p-MAWS45启动子驱动的表达模式。图22为RTP1057的示意图。双元载体RTP1057的序列如图23所示。

使用RTP1052或RTP1057在转基因玉米中评价启动子

采用GUS组织化学分析，按本领域的操作程序(Jefferson 1987)测定由p-MAWS42或p-MAWS45启动子驱动的表达模式和表达水平。采用农杆菌介导的转化系统，进行了玉米的转化。对于T0和T1植物，选择了10个和5个单拷贝事件用于启动子分析。在以下各发育阶段进行GUS表达的测定：

1)5叶期的根和叶

2)V-7期的茎

3)开花期(穗丝的最初出现)的叶、壳和穗丝

4)小穗/雄花穗(授粉时)

5)授粉后5、10、15、20和25天(DAP)的穗或籽粒

结果显示，RTP1052的启动子p-MAWS42以及RTP1057的启动子p-MAWS45都在花粉和全种子中特异性表达(图24和25)。

实施例3：

以pKG86启动子的序列(SEQ ID NO：1)在包含引起变应原的和毒性的肽和多肽的数据库中搜索可以赋予变应原性或毒性的短开放阅读框。鉴定到与上述数据库中的肽或多肽显示同源性的短开放阅读框。为了避免可能是毒性或变应原性的肽的表达，对pKG86的序列进行了修饰。所得到的启动子pKG86_12A(SEQ ID NO：129)、pKG86_14A(SEQ ID NO：130)和pKG86_15A(SEQ ID NO：131)被可操作地连接到报告基因上并被转化到玉米中以进行表达分析。

Claims

1.一种多核苷酸，该多核苷酸包含表达控制序列，该表达控制序列允许可操作地与其连接的目的核酸在植物中种子特异性地表达，所述表达控制序列选自：

（a）SEQ ID NOs:1和3之任一所示的核酸序列的表达控制序列；

（b）表达控制序列，其可以自SEQ ID NOs:4或8之任一所示的开放阅读框序列的第一外显子出发，在基因组DNA上，通过5′基因组步行或热不对称交错聚合酶链式反应（TAIL-PCR）获得；以及

（c）表达控制序列，其可以自开放阅读框序列的第一外显子出发，在基因组DNA上，通过5′基因组步行或TAIL-PCR获得，其中该开放阅读框序列编码SEQ ID NOs:5或9之任一所示的开放阅读框编码的氨基酸序列，且该开放阅读框编码种子蛋白;

其中所述多核苷酸还包含可操作地连接到表达控制序列上的至少一个目的核酸,

其中所述目的核酸与表达控制序列异源。

2.权利要求1的多核苷酸，其中所述多核苷酸还包含编码金属硫蛋白1多肽的植物基因的第一内含子。

3.包含权利要求1至2的任何一项的多核苷酸的载体。

4.权利要求3的载体，其中所述的载体为T-DNA载体。

5.包含权利要求1至2的任何一项的多核苷酸或权利要求3或4的载体的宿主细胞，其中所述宿主细胞是微生物细胞。

6.权利要求5的宿主细胞，其中所述的宿主细胞为农杆菌细胞或大肠杆菌细胞。

7.表达控制序列用于在单子叶植物中种子特异性地表达目的核酸中的用途，其中所述目的核酸与所述表达控制序列可操作地连接，其中所述表达控制序列选自：

（a）SEQ ID NOs:2所示的核酸序列的表达控制序列；

（b）表达控制序列，其可以自SEQ ID NOs:6所示的开放阅读框序列的第一外显子出发，在基因组DNA上，通过5′基因组步行或热不对称交错聚合酶链式反应（TAIL-PCR）获得；以及

（c）表达控制序列，其可以自开放阅读框序列的第一外显子出发，在基因组DNA上，通过5′基因组步行或TAIL-PCR获得，其中该开放阅读框序列编码SEQ ID NOs:7所示的开放阅读框编码的氨基酸序列，且该开放阅读框编码种子蛋白;

其中所述目的核酸与表达控制序列异源。

8.产生包含权利要求1至2的任何一项的多核苷酸或权利要求3或4的载体的宿主细胞的方法，其中所述的宿主细胞为植物细胞，所述方法包括将所述多核苷酸或载体通过转染或转化而导入到宿主细胞中。

9.产生包含权利要求1至2的任何一项的多核苷酸或权利要求3或4的载体的转基因植物或植物种子的方法，包括将权利要求1至2的任何一项的多核苷酸或权利要求3或4的载体导入到所述植物或其种子中。

10.权利要求9的方法，其中所述转基因植物或植物种子为单子叶植物或单子叶植物的植物种子。

11.在宿主细胞中表达目的核酸的方法，包括:

（a）将权利要求1至2的任何一项的多核苷酸或权利要求3或4的载体导入到宿主细胞中；以及

（b）在所述的宿主细胞中表达至少一个目的核酸。

12.权利要求11的方法，其中所述的宿主细胞是植物细胞。

13.在植物或其种子中表达目的核酸的方法，包括:

（a）将权利要求1至2的任何一项的多核苷酸或权利要求3或4的载体导入到所述植物或其种子中；以及

（b）在所述植物或其种子中表达至少一个目的核酸。

14.权利要求13的方法，其中所述的植物为单子叶植物。

15.权利要求1至2的任何一项的多核苷酸、权利要求3或4的载体、包含权利要求1至2的任何一项的多核苷酸或权利要求3或4的载体的宿主细胞、或包含权利要求1至2的任何一项的多核苷酸或权利要求3或4的载体的植物或其种子用于表达目的核酸的用途。