KR20150043615A - 밀(Triticum asetivum) 유래의 TaGlu-Dx5 유전자가 형질전환된 항생제 마커프리 형질전환 벼 - Google Patents

Abstract

본 발명은 식물체 형질전환에 관한 기술로서, 구체적으로 밀의 글루테닌 유전자인 TaGlu-Dx5를 형질전환시킨 벼에 관한 것이다.
본 발명의 형질전환 벼는 종자 내에 밀 글루테닌 단백질을 대량으로 축적할 수 있는 특성을 가지는 바, 이에 따라 글루테닌을 다량 함유한 벼의 생산이 가능하여 벼의 가공적성이 개선되며, 특히 항생제 내성 선발마커 유전자를 제거함으로써 안전한 형질전환 작물의 상용화가 가능하다.

Description

밀(Triticum asetivum) 유래의 TaGlu-Dx5 유전자가 형질전환된 항생제 마커프리 형질전환 벼{Antibiotic marker-free transgenic rice with TaGlu-Dx5 gene from Triticum asetivum}

본 발명은 식물체 형질전환에 관한 기술로서, 구체적으로 밀의 글루테닌 유전자인 TaGlu-Dx5 및 밀 유래 유전자 프로모터를 포함하는 벼 종자 특이적 재조합 발현벡터, 상기 발현벡터로 형질전환시킨 벼 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

세계 4대 식량작물 중 하나인 벼는 우리나라를 포함한 아시아 지역 사람들이 주식으로 이용하는 경제성이 매우 높은 작물에 해당하지만, 국내 쌀 가공식품의 시장규모는 약 1조원 수준으로 추정되며, 이는 전체 식품 매출액의 약 2% 수준에 불과한 수준이다. 이러한 쌀 가공식품 시장의 확대를 제약하는 요인 중에는 쌀 가공식품이 밀가루 제품에 대비하여 품질, 유통경쟁력 등의 취약함을 들 수 있다. 즉, 쌀 가공식품은 밀의 글루테닌 등과 같은 가공적성이 높은 특이적인 물성이 없어 반죽, 성형, 팽화 등의 가공적성이 밀가루에 비해 낮기 때문에 가공과정이 더 복잡하고 비용이 추가로 소요된다. 또한, 쌀빵이나 떡 등은 굳어버리는 경화속도가 빨라 밀가루 제품에 비해 유통기한이 짧고, 이에 따라 효율적 재고관리의 어려움도 존재한다. 따라서 쌀의 가공적성을 향상시키기 위한 연구는 계속되었으나, 현재까지 이렇다 할 해결방안을 찾지 못한 실정이다.

한편, 벼의 수량성과 품질 개선을 위해 관행 교배육종, 분자육종 및 형질전환방법 등 다양한 육종 방법이 동원되고 있으며, 이 중 형질전환 방법은 관행의 육종방법에 비해 농업적으로 유용한 유전자를 직접 작물에 도입함으로써 유전적으로 개량된 신품종을 개발할 수 있는 장점이 있다. 즉 농업분야에서의 형질전환기술은 병충해, 가뭄, 습해, 자외선 등 다양한 생물학적, 비생물학적 스트레스에 대한 내성 등 작물의 수량성 관련 형질은 물론, 아이소플라본, 비타민 A, 철분 등 작물의 유용성분을 증가시킬 수 있도록 하는 품질관련 형질의 개선을 위해 보다 직접적이고 적극적으로 활용할 수 있는 육종법이다.

그러나 대부분의 기존의 형질전환기술은 유전자가 도입된 세포, 캘러스, 식물조직의 선발, 배양, 및 식물체 재분화를 위해 bar(Basta herbicide resistant gene), hpt(hygromycin phosphotransferase), NPTⅡ(neomycin phosphotransferase) 등의 제초제 및 항생제 저항성 유전자가 선발마커(selectable marker)로 이용된다. 선발마커 유전자는 목적유전자와 함께 동일 벡터에 탑재하여 식물조직에 형질전환 한 후 포스피노트리신 또는 하이그로마이신 B 등 항생제가 포함된 배지에서 선발 및 배양함으로써 효과적으로 형질전환 식물체를 생산하는 방법이다. 그러나 일반소비자들은 선발마커 유전자의 유해성 우려로, 형질전환작물 및 이를 원료로 한 가공식품에 대해 매우 부정적인 시각을 가지고 있어 형질전환작물의 실용화는 매우 어려운 실정이다.

이러한 배경 하에, 본 발명자들은 벼의 가공적성을 개선시키기 위하여 글루테닌을 함유한 벼를 생산할 수 있으면서도, 선발마커 유전자의 유해성으로부터 안전한 식물체를 개발하기 위하여 예의 노력한 결과, 밀 글루테닌 단백질 유전자를 벼에 형질전환시킴으로써 벼 종자에서도 상기 단백질을 발현시킬 수 있고, 이 과정에서 선발마커 유전자를 제거함으로써 형질전환 식물체의 안전성 또한 증진시킬 수 있는 밀 유래 유전자인 TaGlu-Bx7의 프로모터 및 TaGlu-Dx5 유전자를 도입한 형질전환 벼를 개발하고 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 밀(Triticum asetivum) 유래의 글루테닌 유전자 TaGlu-Bx7 프로모터 및 TaGlu-Dx5 유전자를 포함하는 벼 종자 특이적 TaGlu-Dx5 유전자 발현용 마커프리 재조합 발현벡터를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 재조합 발현벡터로 형질전환된 형질전환 벼 또는 이의 종자를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 (a) 상기 재조합 발현벡터를 제조하는 단계; (b) 상기 재조합 발현벡터를 벼에 형질전환하는 단계; 및 (c) 상기 형질전환 벼를 선발하는 단계를 포함하는, TaGlu-Bx7 프로모터 및 TaGlu-Dx5 유전자가 형질전환된 마커프리 형질전환 벼의 제조방법을 제공하는 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 밀 유래의 글루테닌 유전자 TaGlu-Bx7 프로모터 및 TaGlu-Dx5 유전자를 포함하는 벼 종자 특이적 TaGlu-Dx5 유전자 발현용 마커프리 재조합 발현벡터를 제공한다.

벼에는 글루테닌이 존재하지 않으나, 본 발명에서 밀 가공적성에 관련된 TaGlu-Dx5 유전자를 TaGlu-Bx7 프로모터와 함께 벼에 형질전환시킴으로써, 벼의 가공적성을 향상시킬 수 있다. 특히 본 발명의 형질전환 벼에 도입되는 상기 재조합 발현벡터는 벼 종자에서 특이적으로 상기 유전자를 발현시킴과 동시에, 항생제 내성 선발마커 유전자가 제거되어 형질전환 작물에 대한 안전성을 증진시킬 수 있다.

구체적으로, 밀 유래의 글루테닌 유전자 TaGlu-Bx7 프로모터 및 TaGlu-Dx5 유전자를 벡터에 도입하고, 항생제 내성 유전자를 제거함으로써 본 발명의 재조합 발현벡터를 수득할 수 있다.

본 발명에서 용어, “밀(Triticum asetivum)”은 주로 온대지방에 분포하는 외떡잎식물로서, 소맥(小麥)이라고도 한다. 쌀과 함께 세계 4대 식량 작물로서, 90% 이상이 제분되어 제면·제빵·제과용 등으로 사용될 수 있다. 국내 품종으로는 수원85호, 수원86호를 비롯하여, 영광·장광·진광·진풍·조경·조광·내밀·다홍밀·청계밀·그루밀·올밀·수원215호 등의 품종이 보급되고 있으며, 바람직하게는 조경밀일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 용어, “글루테닌”은 밀에 함유된 단백질의 일종으로, 곁가지 사이의 상호작용으로 생긴 다리결합 때문에 공모양을 하고 있는 구형단백질 중의 하나이며, 물, 중성인 염의 용액, 묽은 에탄올에 녹지 않고 묽은 산이나 묽은 알칼리 용액에 쉽게 용해될 수 있다. 곡물에 들어 있는 비교적 단순한 단백질인 글루텔린(glutelin) 류에 속하며, 빵의 질감에 큰 영향을 미치는 단백질 혼합물인 글루텐(gluten)의 한 성분일 수 있다. 글루테닌은 고분자(96 내지 136 kDa) 및 저분자(36 내지 44 kDa)의 서브유닛으로 구성될 수 있다. 상기 고분자 글루테닌 서브유닛은 Glu-A1, Glu-B1 및 Glu-D1 유전자에 의해 암호화될 수 있으며, 아미노산 서열에 따라서 x-타입 및 y-타입으로 구분될 수 있다. 한편, 저분자 글루테닌 서브유닛은 Glu-A3, Glu-B3 및 Glu-D3 유전자에 의해 암호화될 수 있다.

본 발명에서 용어, “TaGlu-Dx5"은 밀에 존재하는 고분자 글루테닌 유전자 서브유닛 중의 하나로서, 밀가루의 반죽강화(dough strength)와 관련된 유전자로 알려져 있다. 바람직하게는 상기 TaGlu-Dx5 유전자는 서열번호 1의 서열을 가질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 “유전자”에는 DNA, RNA 등이 포함될 수 있다. DNA에는 유전체 DNA(gemonic DNA), cDNA 등을 포함할 수 있으며, RNA에는 mRNA 등을 포함할 수 있다. 본 발명의 유전자는 오픈리딩프레임(open reading frame)은 물론, TATA 박스나 폴리-A-tail 서열 등의 비번역 부위(UTR) 등을 모두 포함할 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 용어, “프로모터”는 일반적으로 전사를 개시하는 지점을 포함하는 암호화 부위의 상류 쪽에 위치하는 유전자 부위로, 흔히 유전자 발현을 조절하는 TATA 박스, CAAT 박스 부위, 외부 자극에 반응하여 유전자 발현에 영향을 주는 부위 및 위치와 방향에 상관없이 거의 모든 유전자의 발현을 촉진하는 인핸서(enhancer) 등으로 이루어져 있다. 바람직하게는 상기 TaGlu-Bx7 프로모터의 서열은 서열번호 2의 서열일 수 있으며, 여기서 TaGlu-Bx7 또한 밀에 존재하는 고분자 글루테닌 유전자 서브유닛 중의 하나에 해당한다.

본 발명과 관련하여 구체적으로, 종래에는 유전자변형 식물체(GMO)를 제작할 때 가장 많이 사용하는, 바이러스 유래의 CaMV35S 프로모터를 일반적으로 사용하여 왔으나, 본 발명에서는 상기 프로모터 대신에 TaGlu-Bx7 프로모터를 도입하여 형질전환시킬 수 있으며, 이로써 벼 종자에서 특이적으로 발현되는 형질전환 벼를 수득할 수 있다.

즉, 상기 프로모터 중에는 모든 조직에서 상시적으로 발현을 유도하는 프로모터 및 시간 또는 위치 특이적으로 발현을 유도하는 프로모터가 있으며, 바람직하게 본 발명에 따른 프로모터는 위치 특이적으로 발현을 유도하는 프로모터로서, 구체적으로 벼 종자에서 특이적으로 발현되는 TaGlu-Bx7의 프로모터일 수 있다. 본 발명에서 언급하는 "벼 종자 특이적 프로모터"는 상기 프로모터의 3' 위치에 연결되어 발현이 조절되는 유전자를 벼 종자 내에서 특이적으로 발현시키는 프로모터를 의미하며, 벼 종자 이외의 식물 조직에서는 상기 유전자의 발현이 거의 이루어지지 않는 것을 의미한다. 즉, 벼 종자 특이적 발현의 특성을 갖는 TaGlu-Bx7의 프로모터를 재조합 발현벡터에 함께 도입함으로써, TaGlu-Dx5 유전자의 종자 특이적 발현 형질전환용 벡터를 제조할 수 있다.

본 발명에서 용어, “재조합 발현벡터”란 본 발명의 프로모터 및 상기 프로모터와 작동가능하게 연결되어 있는 목적 단백질을 암호화하는 유전자 서열이 삽입 또는 도입될 수 있는 당분야에 공지된 플라스미드, 바이러스 또는 기타 매개체를 의미한다. 구체적으로, 밀 글루테닌 유전자 TaGlu-Dx5의 발현 프로모터 및 상기 프로모터와 작동가능하게 연결되어 있는 밀 글루테닌 단백질을 암호화하는 TaGlu-Dx5 유전자 서열은 발현 조절 서열에 작동 가능하게 연결될 수 있으며, 상기 작동가능하게 연결된 유전자 서열과 발현 조절 서열은 선발마커 및 복제 개시점(replication origin)을 같이 포함하고 있는 하나의 재조합 발현벡터 내에 포함될 수 있다. 상기에서 용어, "작동 가능하게 연결(operably linked)"된다는 것은 적절한 분자가 발현 조절 서열에 결합될 때 유전자 발현을 가능하게 하는 방식으로 연결되는 것을 의미한다. 또한, 상기 용어, "발현 조절 서열(expression control sequence)"이란, 특정한 숙주 세포에서 작동 가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드 서열의 발현을 조절하는 DNA 서열을 의미한다. 상기 조절 서열은 전사를 실시하기 위한 프로모터, 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 재조합 발현벡터는, 단백질 발현에 사용되는 기존의 벡터를 기본 골격으로 하여 본 발명의 TaGlu-Bx7의 프로모터를 삽입하고 상기 프로모터의 하류(downstream)쪽으로 TaGlu-Dx5를 암호화하는 염기서열을 삽입함으로써 제조할 수 있다. 따라서 본 발명에 사용될 수 있는 벡터로 식물 바이러스 벡터 등이 있으며, 구체적 예로서 pCHF3, pPZP, pGA, pCAMBIA 및 pBTEX 계열과 같은 바이너리벡터를 사용할 수 있다. 그러나 당업자라면 본 발명의 프로모터 및 상기 프로모터와 작동가능하게 연결되어 있는 목적 단백질을 암호화하는 염기서열을 숙주 세포내로 도입할 수 있는 벡터라면 어떠한 벡터라도 모두 사용할 수 있다. 바람직하게는 pBTEX 벡터를 사용할 수 있으며, 본 발명에서 pBTEX 벡터는 pCAMBIA1300 벡터에 있는 MCS 부분을 제한효소 EcoRI과 HindⅢ를 처리하여 MCS 부분을 제거하고 새롭게 35S promoter와 제한효소 위치 및 OCS teminater(Octopine synthase terminator)를 삽입하여 제작할 수 있다.

한편, 발현벡터에 존재하는 항생제 저항성 유전자 및/또는 이의 프로모터를 제거하고 난 후, 남은 부분을 재결합(ligation)시킴으로써 상기 항생제 저항성 유전자 및/또는 이의 프로모터가 없는 마커프리 벡터를 제조할 수 있다.

본 발명에서 용어, “마커프리”는 항생제 내성 유전자가 없는 또는 항생제 내성 유전자를 제거한 것을 의미할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 용어, 항생제는 미생물 등이 생산하는 대사산물로서, 소량으로 다른 미생물의 발육을 억제하거나 사멸시키는 물질을 의미한다. 항생제의 종류에는 페니실린류, 세팔로스포린류, 아미노글리코사이드류, 테트라사이클린류, 클로람페니콜, 폴리펩티드류, 퀴놀론류 등이 존재하며, 바람직하게는 아미노글리코사이드류일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 하이그로마이신일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 재조합 발현벡터는 항생제 내성 유전자 및 이의 프로모터를 포함하지 않는다. 식물체의 형질전환에 있어, 배양세포에 외래유전자를 도입할 때 각 유전자산물을 모두 해석하지 않고도 외래유전자가 도입된 세포만을 선발할 수 있도록 선발마커(selectable marker)를 사용할 수 있으며, 일반적으로 항생제 내성 유전자를 선발마커로 하여 항생제 함유된 배지에서 배양시킴으로써 형질전환체만을 선발할 수 있도록 할 수 있다. 하지만, 바이오 안전성을 증진시키기 위하여 본 발명에서는 항생제 내성 유전자를 제거한 마커프리 형질전환 벼를 제공하기 위하여, 상기 재조합 발현벡터에서 항생제 내성 유전자 및 이의 프로모터를 제거하였다.

본 발명의 일 실시예에서는 pBTEX 벡터에 제한효소 EcoRI 및 KpnI을 처리함으로써, CaMV35S 프로모터를 제거하고, 밀 유래의 글루테닌 유전자인 TaGlu-Bx7의 프로모터를 삽입하였고, 이후 제한효소 XhoI과 EcoRI을 처리하여 하이그로마이신 저항성 유전자(HPTⅡ) 및 하이그로마이신 발현 프로모터를 제거하고 DNA 엑소뉴클레아제(DNA exonuclease)를 처리하여 잘려진 벡터 양쪽 말단(N-terminal, C-terminal)부위에 각각 남아 있는 XhoI과 EcoRI 부위를 평활말단(blunt-end)으로 만든 후 양쪽 말단을 자가결합(self-ligation)시킴으로써, 마커프리 벡터를 제조하였다. 이후 상기 마커프리 벡터에 TaGlu-Dx5 유전자를 제한효소 KpnI 및 XbaI 위치에 맞게 삽입함으로써, 밀 TaGlu-Dx5 유전자의 종자 특이적 발현 형질전환용 벡터를 제조하였다(실시예 1-1 내지 1-3).

또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 재조합 발현벡터로 형질전환된 형질전환 벼 또는 이의 종자를 제공한다.

본 발명에서 용어, “형질전환”은 일반적으로 DNA를 숙주로 도입하여 DNA가 염색체외 인자로서 또는 염색체 통합완성에 의해 복제가능하게 되는 것을 의미할 수 있다. 상기 형질전환은 당 분야에서 공지된 바와 같이 숙주 세포에 따라 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있으며, 바람직하게는 식물 병원균 아그로박테리움을 이용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 아그로박테리움은 그들의 Ti(종양 유도성, tumor-inducing) 또는 Ri(뿌리 유도성, root-inducing) 플라스미드 DNA 중 일부(T-DNA)를 감염된 식물 세포 내로 전이 이식시키는 능력을 지니고 있다. 따라서 목적 유전자를 T-DNA 내에 재조합한 후 이를 보유한 균과 식물체를 공동 배양하면 식물 세포의 형질전환이 가능해진다.

본 발명에서 용어, “벼(Oryza sativa)”는 외떡잎식물 벼목 화본과의 한해살이풀 식용작물로서, 열매를 찧은 것을 쌀이라고 하며, 전세계 인구의 40% 정도가 쌀을 주식량으로 한다. 벼속에 속하는 식물로는 20여 종(種) 이상이 알려져 있으나 실제로 재배되고 있는 것은 벼(O. sativa)가 대부분이다. 본 발명의 형질전환 대상으로서, 구체적으로 풍옥, 수성, 팔굉, 팔달, 진흥, 재건, 팔금, 농백, 낙동, 관악, 진주, 설악, 동진 등이 있으나, 벼목에 속하는 식물체라면 이에 제한되지 않으며, 바람직하게는 동진벼일 수 있다.

본 발명의 형질전환 벼는 밀 글루테닌 TaGlu-Dx5 유전자가 발현된 또는 발현될 수 있는 상태로 세포 내에 존재하는 벼의 형질전환 세포일 수 있다. 또한, 본 발명의 형질전환 벼는 상기 유전자가 도입된 형질전환세포를 포함한 벼의 식물체 전체 또는 일부 기관 등을 모두 포함할 수 있으며, 상기 유전자가 도입된 식물체의 유성생식 또는 무성생식에 의해 얻어질 수 있는 종자, 식물체 및 이의 조직이나 기관의 일부도 포함될 수 있다. 바람직하게는 본 발명의 형질전환 벼는 기탁번호 KACC98024P인 것인 형질전환 벼 또는 이의 종자일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 실시예에서는, 재조합벡터를 도입하기 위하여 아그로박테리움 매개 동시 형질전환법(Agrobacterium-mediated co-transformation)을 사용하였으며, 구체적으로 마커프리 벡터만을 포함하는 아그로박테리움 및 공벡터만을 포함하는 아그로박테리움을 3:1 비율로 동시에 벼 캘러스에 접종시켰다(실시예 2).

또 하나의 양태로서, 본 발명은 (a) 상기 재조합 발현벡터를 제조하는 단계; (b) 상기 재조합 발현벡터를 벼에 형질전환하는 단계; 및 (c) 상기 형질전환 벼를 선발하는 단계를 포함하는, TaGlu-Bx7 프로모터 및 TaGlu-Dx5 유전자가 형질전환된 항생제 마커프리 형질전환 벼의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 (a) 단계는 상기 재조합 발현벡터를 제조하는 단계로서, 상기에서 설명한 바와 같다.

본 발명의 (b) 단계는 상기 재조합 발현벡터를 벼에 형질전환하는 단계로서, 구체적으로 상기 (a) 단계를 통해 제조된, TaGlu-Bx7 프로모터 및 TaGlu-Dx5 유전자를 포함하는 항생제 마커프리 발현벡터를 아그로박테리움 균주에 도입시키는 단계에 해당하며, 상기 발현벡터, 아그로박테리움 및 이를 이용한 형질전환에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다. 본 발명의 (b) 단계에서는 형질전환 벼 생산을 위해 LBA4404, AGL1 및 EHA105 등 다양한 아그로박테리움이 제한없이 이용될 수 있으며, 도입방법 역시 통상적인 아그로박테리움의 도입방법이 적용될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는 마커프리 벡터만을 포함하는 아그로박테리움 및 공벡터만을 포함하는 아그로박테리움을 3:1 비율로 동시에 벼 캘러스에 접종시켰다(실시예 3).

본 발명의 (c) 단계는 상기 형질전환 벼를 선발하는 단계로서, 구체적으로 상기 재조합 발현벡터가 도입된 아그로박테리움을 벼 또는 벼의 조직과 배양하여 형질전환 벼를 선발하는 단계를 의미한다.

보다 구체적으로, 상기 (a) 단계에서 제조된 발현벡터가 도입된 아그로박테리움을 벼 또는 벼의 조직과의 배양을 통해 벼의 조직을 형질전환시킬 수 있는데, 이 때 벼의 조직은 배발생 캘러스일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 이후 항생제 함유 배지 및 목적 유전자 특이적 프라이머를 이용하여 형질전환된 벼를 선발할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는, TaGlu-Dx5가 형질전환된 벼를 선발하기 위하여 1차적으로 항생제(하이그로마이신)를 함유한 배지를 이용하였고(실시예 3-1), 이후 상기 1차 선발된 개체를 대상으로, TaGlu-Dx5 유전자에 특이적인 프라이머를 사용하여 중합효소연쇄반응(PCR)을 통하여 2차 선발하였다(실시예 3-2).

본 발명의 형질전환 벼는 종자 내에 밀 글루테닌 단백질을 대량으로 축적할 수 있는 특성을 가지는 바, 이에 따라 글루테닌을 다량 함유한 벼의 생산이 가능하여 벼의 가공적성이 개선되며, 특히 항생제 내성 선발마커 유전자를 제거함으로써 안전한 형질전환 작물의 상용화가 가능하다.

도 1a는 pCAMBIA1300의 개열지도를 나타낸 도이다.
도 1b는 pCAMBIA1300의 MCS 부분을 나타낸 도이다.
도 1c는 pCAMBIA1300을 변형시켜 만든 pBTEX 벡터의 유전자 발현 부분을 나타낸 도이다.
도 2a는 프로모터 교체 및 TaGlu-Dx5 유전자 삽입 마커프리 형질전환 벡터의 모식도이다.
도 2b는 하이그로마이신 유전자가 삽입된 형질전환 벡터의 모식도이다.
도 3은 벼 캘러스 유기단계부터 형질전환 벼(T₀)의 선발, 재분화 및 양성에 이르기까지의 과정을 나타낸 사진이다.
도 4는 TaGlu-Dx5 형질전환 식물체의 PCR를 이용한 2차 선발 과정에서의 전기영동 결과를 나타낸 도이다.
도 5는 종자 내 TaGlu-Dx5 유전자의 발현을 나타낸 도이다.
도 6은 2차 선발을 거친 27개체의 유전자 군별 형질전환 식물체(T₀)의 유전자의 삽입 수를 나타낸 도이다.
도 7은 선발된 형질전환 종자(T₁) 내 글루테닌 단백질의 발현량을 나타낸 도이다.
도 8은 세대진전을 통한 마커프리 형질전환 벼를 선발하기 위하여 TaGlu-Dx5와 HPTⅡ의 유전자가 분리되는 현상을 나타낸 도이다.

이하, 하기 예에 의하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 그러나, 하기 예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로 이들만으로 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 유전자 발현 프로모터 교체 및 마커프리 벡터 제작

실시예 1-1: 밀 글루테닌 유전자 프로모터로의 교체

밀 글루테닌 유전자 TaGlu-Dx5의 발현이 보다 잘 일어나게 하기 위하여, CaMV35S 프로모터를 밀 유래의 TaGlu-Bx7 유전자의 프로모터로 교체하였다.

구체적으로, pCAMBIA1300에서 변형된 pBTEX 벡터를 사용하였으며, 상기 pBTEX벡터는 pCAMBIA1300벡터에 있는 MCS 부분을 제한효소 EcoRI과 HindⅢ를 처리하여 MCS 부분을 제거하고 새롭게 35S promoter와 제한효소 위치 및 OCS teminater(Octopine synthase terminator)를 삽입하여 pBTEX 벡터를 제작하였다(도 1a 내지 도 1c).

상기 pBTEX 벡터에 제한효소 EcoRI 및 KpnI(New England Biolab, 영국)을 각각 1 U(unit, 1U는 37℃에서 DNA 1 ㎍을 자를 수 있는 양)을 처리함으로써, CaMV35S 프로모터를 제거하고, 밀 유래의 TaGlu-Bx7 유전자의 프로모터를 삽입하였다.

실시예 1-2: 마커프리 벡터의 제조

형질전환 벼의 안전성 증진을 위해 항생제 내성 유전자 및 이의 프로모터를 제거한 마커프리 벡터를 제조하였다.

구체적으로, 상기 실시예 1-1에 따라 프로모터가 교체된 벡터를 제한효소 XhoI과 EcoRI(New England Biolab, 영국)을 각각 1 U을 처리하여 하이그로마이신 저항성 유전자(HPTⅡ) 및 하이그로마이신 발현 프로모터를 제거하였다. 이후, DNA 엑소뉴클레아제(DNA exonuclease, TAKARA, 일본)를 처리하여 잘려진 벡터 양쪽 말단(N-terminal, C-terminal) 부위에 각각 남아 있는 XhoI과 EcoRI 부위를 평활말단으로 만들었으며, 이들 양쪽 말단을 서로 자체 결합(self-ligation)시켰다.

그 결과, 항생제인 하이그로마이신 저항성 유전자(HPTⅡ) 유전자 및 하이그로마이신 발현 프로모터가 제거된 마커프리 벡터가 제조되었다.

실시예 1-3: 밀 유래의 TaGlu - Dx5 유전자 형질전환용 벡터의 제조

밀 유래의 TaGlu-Dx5 유전자 및 TaGlu-Bx7의 프로모터를 포함한 형질전환 벼를 제조하기 위하여, 형질전환을 위한 재조합벡터를 제조하였다.

구체적으로, 밀 Seri82 품종으로부터 양쪽 말단에 제한효소 KpnI 및 XbaI(New England Biolab, 영국)의 절단 위치를 붙여 TaGlu-Dx5 유전자를 증폭하였다. 이후, 상기 증폭된 유전자를 pGEM T easy(Promega) 벡터에 클로닝하였다.

	forward primer	reverse primer
Dx5	5'-AGGGTACCGAGATGGCTAAGCGCCTGG-3' (서열번호 3)	5'-GATCTAGATCACTGCCTGGTCGACAATG-3’ (서열번호 4)

상기 표 1의 정방향 프라이머(forward primer)는 KpnI 위치를 포함하고 있고, 역방향 프라이머(reverse primer)는 XbaI 위치를 포함하고 있다.

그 후, 상기 실시예 1-2에서 제작된 마커프리 벡터에 상기 유전자를 제한효소 KpnI 및 XbaI(New England Biolab, 영국) 위치에 맞게 삽입함으로써, 밀 TaGlu-Dx5 유전자의 종자 특이적 발현 형질전환용 벡터를 제조하였다.

상기와 같이 제작된 밀 유래의 TaGlu-Dx5 유전자의 형질전환용 벡터의 모식도는 도 2a에 도시된 바와 같다.

실시예 2: 밀 유래의 TaGlu - Dx5 유전자의 형질전환

상기 실시예 1에 따라 제조한 형질전환용 벡터를 이용하여, 기존에 밀 글루테닌을 발현하지 않는 이종식물인 벼에 형질전환함으로써 형질전환 벼를 제조하고자 하였다.

구체적으로 상기 재조합벡터를 도입하기 위하여, 아그로박테리움 매개 동시 형질전환법(Agrobacterium-mediated co-transformation)을 사용하였다.

상기 실시예 1에서 제조한 TaGlu-Dx5 유전자가 삽입된 마커프리 벡터와 하이그로마이신(HPTⅡ) 저항성 유전자만으로 구성된 공벡터를 독립적으로 아그로박테리움 EHA105에 도입하였고, TaGlu-Dx5 유전자가 삽입된 마커프리 벡터와 공벡터가 삽입된 아그로박테리움을 카나마이신 항생제가 포함된 YEP media에서 28℃에서 3일간 증식하였다. 동진벼 캘러스는 동진벼 현미를 캘러스 유기배지(N6 salts with vitamins, 2.5 g/ℓ proline, 2 mg/ℓ 2,4-D, 0.5 g/ℓ casamino acid, 30 g/ℓ sucrose and 2 g/ℓ gelrite, pH 5.7)에 치상하고 25℃, 21일간 암상태에서 유기하였다.

3일간 증식시킨 아그로박테리움은 200 μM 아세토실링곤이 포함된 부유 배지(suspension medium, N6 salts with vitamins, 2 mg/ℓ 2,4-D, 0.5 g/ℓcasamino acid, 30 g/ℓ sucrose, and 10 g/ℓ glucose, pH 5.7)에 희석하여 TaGlu-Dx5 유전자가 삽입된 마커프리 벡터와 하이그로마이신(HPTⅡ) 저항성 유전자만으로 구성된 공벡터를 포함하는 아그로박테리움 농도를 각각 0.01(OD₆₀₀=0.01)로 만들어 동진벼 캘러스에 각각의 EHA105 아그로박테리움을 3:1 비율로 혼합하여 벼 캘러스에 접종하여 공동배양 배지(N6 salts with vitamins, 2mg/ℓ 2,4-D, 0.5g/ℓ casaminoacid, 30g/ℓ sucrose, 10g/ℓ glucose, and 2g/ℓ gelrite, pH 5.2 with 200μM acetosyringone as a final concentration)에 3일간 벼 캘러스와 아그로박테리움을 공동배양을 하였다. 3일 후 250 mg/ℓ cefotaxime 과 150 mg/ℓ timentin이 포함된 배지로 캘러스를 세척한 후 선발 배지에 치상하였다.

실시예 3: 형질전환 벼( T ₀ )의 선발

실시예 3-1: 항생제 함유 배지를 이용한 1차 선발

상기 실시예 2를 통해 형질전환 하고자 한 벼 중에서, 1차적으로 TaGlu-Dx5 유전자가 실제로 형질전환된 벼를 선발하기 위하여, 항생제(하이그로마이신)를 함유한 배지를 이용하였다.

구체적으로, 상기 아그로박테리움을 접종시킨 벼 캘러스를 항생제인 하이그로마이신을 함유한 배지에서 배양시킴으로써 형질전환 벼를 선발하였다. 2 mg/ℓ 2,4-D, 50 mg/ℓ 하이그로마이신(hygromycin)과 250 mg/ℓ 세포탁심(cefotaxime)이 함유된 선발배지에 4주간 배양하여 하이그로마이신 저항성인 캘러스를 암조건에서 선발하고 선발된 캘러스를 재분화배지(NAA 0.1 mg/ℓ, Kinetin 2 mg/ℓ, Cefotaxime 250 mg/ℓ, 50 mg/ℓ Hygromycin)에 3-4주간 빛이 있는 배양실에서 식물체를 재분화하였다.

그 결과, TaGlu-Dx5가 형질전환된 식물체 수는 총 270개체로 확인되었다. 이는 하이그로마이신을 갖고 있는 공벡터만 가지는 식물체 및 공벡터와 마커프리벡터를 모두 가진 식물체의 개체 수에 해당한다.

실시예 3-2: 글루테닌 유전자 특이적 프라이머를 이용한 2차 선발

상기 1차 선발된 270개체를 대상으로, 상기 270개체 중 공벡터만을 가지는 식물체를 제거하고, Dx5 유전자와 공벡터를 함께 포함된 식물체만을 선발하기 위해서 Dx5 유전자 특이적인 프라이머를 사용하여 중합효소연쇄반응(PCR)을 통하여 밀 글루테닌 유전자를 포함하는 벼를 2차적으로 선발하였다.

게놈 DNA(genomic DNA)의 추출을 위하여, 재분화배지에서 선발된 유모의 잎에서 0.2 g을 막자사발에 넣고 액체질소를 이용하여 파쇄한 후 퀵프랩 버퍼(200 mM Tris-HCl, 250 mM NaCl, 25 mM EDTA, 0.5% SDS) 1.5 mL과 함께 튜브에 넣은 후, 60 ℃에 1 시간동안 반응시켰다. 10,000 X g에서 10 분간 원심분리하여 상층액 400 ㎕를 새 튜브에 넣고, 아이소프로판올(isopropanol) 300 ㎕를 첨가 후 잘 섞은 후, -80 ℃에서 30 분 반응시켰다. 20,000 X g에서 10 분 원심분리하여 상층액을 제거하고, 70% 에탄올을 넣고 가볍게 씻어준 후 30 분 건조하였다. DNA 추출버퍼(10 mM NH4OAC, 0.25 mM EDTA) 150 ㎕를 첨가 후 잘 섞어주었다. 60 ℃에서 1 시간 반응 후 10,000 X g에서 10 분간 원심분리하여 상층액 100 ㎕를 새 튜브에 넣었다. 이렇게 추출한 DNA를 이용하여 본 발명에 관련된 실험을 수행하였다.

중합효소연쇄반응(PCR)은 GeneAmp system 9700(Applied Biosystems USA)를 사용하였으며, 증폭 조건으로는 추출된 각 계통의 50 ng의 게놈 DNA를 이용하여 30 ㎕의 부피(100 pM의 각 프라이머, 200 μM 각각의 dNTPs, 10 mM Tris-HCl pH 9.0, 2 mM MgCl₂, 50 mM KCl, 0.1% Triton X-100 및 0.5 U Taq 중합효소) 조건에서 94.5 ℃ 5분, 94 ℃ 1분, 56 ℃ 1분, 72 ℃ 1분 30초, 35 번 반복 반응한 후 마지막으로 72 ℃에서 10분간 반응한 후 증폭된 생산물은 1 % 아가로스 겔(agarose gel)에 EtBr 0.5 ㎍/㎖를 넣고 UV 상에서 확인하였다.

	forward primer	reverse primer
Dx5	5'-GGGACAATACGAGCAGCAAA-3’ (서열번호 5)	5'-CTTGTTCCGGTTGTTGCCAT-3’ (서열번호 6)
HPTⅡ	5'-CGCTTCTGCGGGCGATTT-3’ (서열번호 7)	5'-CCCATTCGGACCGCAAGGA-3’ (서열번호 8)

그 결과, TaGlu-Dx5가 형질전환된 식물체 수는 총 27개체로 확인되었다.

실시예 4: 종자( T ₁ ) 내 유전자 발현 확인

상기 실시예 3에서 선발한 밀 TaGlu-Dx5 유전자의 형질전환 벼가 다음 세대로까지 잘 유전될 수 있는지를 시험하기 위하여, 형질전환 식물체 T₁ 종자 내 TaGlu-Dx5 유전자의 안정적 발현 여부를 확인하였다.

구체적으로, 유전자 군별 형질전환 식물체(T₀)의 유전자 삽입 수 및 표현형 분석을 통하여 선발하였으며, 선발된 형질전환 T₁ 종자 내 단백질 발현량을 웨스턴 블랏 기법(x-타입 특이적 항체 사용)을 이용하여 조사하였다.

구체적으로, 벼 종자 20립을 질소와 함께 파쇄하여 토탈 단백질을 추출 버퍼(0.1 ㎖ of 50% (v/v) 1-프로판올, 0.05 M Tris-HCl, pH 8.0, containing 1% DTT)에 녹여 원심분리(13,000g) 후 상층액을 정량하여 총 단백질 40 ㎍을 10% 아크릴아마이드 겔에 전기영동하였다. 전기영동된 젤을 PVDF membrane에 단백질을 이동시켜 1차 항체 및 2차 항체를 처리한 후 ECL 키트(GE healthcare, USA)를 사용하여 필름(AGFA, Belglum)에 노출시킨 후 단백질을 확인하였다.

상기와 같이 유전자 삽입 수에 따른 단백질 발현량을 분석하였으며, 최종적으로 상기 단백질 발현이 확인된 15계통을 선발하였다.

최종 선발된 15계통의 형질전환 벼에서 밀 글루테닌 Dx5 단백질의 발현량을 확인한 결과는 도 7과 같다. 도 7에 나타난 바와 같이, 대부분의 형질전환 벼에서 밀 글루테닌 Dx5 단백질을 발현하는 것을 확인할 수 있었으며, 특히 #21, #25 및 #4의 형질전환 벼가 단백질 발현이 현저한 것을 확인할 수 있었다.

이후, 세대진전을 통해서 마커프리 벡터만을 포함하는 식물체를 얻기 위하여, 도 8에서와 같이 #25라인에서 세대진전을 통한 마커프리 형질전환 벼를 선발하였고, 그 결과 도 8의 3번, 14번 라인에서 항생제 내성 유전자(HPTⅡ) 밴드가 형성되지 않음을 확인함으로써 이들 마커프리 형질전환 벼를 선발하였다.

이에, 본 발명자들은 상기와 같이 항생제 내성 유전자(HPTⅡ) 밴드가 형성되지 않으면서 밀 글루테닌 Dx5 단백질을 가장 많이 발현하는 #25 형질전환 벼 종자를 TaGlu-Dx5로 명명하고, 2013년 8월 28일자로 농촌진흥청 농업유전자원 센터에 수탁번호 KACC98024P로 기탁하였다.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며, 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해하여야 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

국립농업과학원 농업유전자원센터 KACC98024P 20130830

<110> REPUBLIC OF KOREA(MANAGEMENT : RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION) <120> Antibiotic marker-free transgenic rice with TaGlu-Dx5 gene from Triticum asetivum <130> PA130642/KR <160> 8 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 2520 <212> DNA <213> Triticum asetivum Glu-Dx5 <400> 1 atggctaagc ggttagtcct ctttgtggcg gtagtcgtcg ccctcgtggc tctcaccgtc 60 gctgaaggtg aggcctctga gcaactacag tgtgagcgcg agctccagga gctccaggag 120 cgcgagctca aggcatgcca gcaggtcatg gaccaacagc tccgagacat tagccccgag 180 tgccaccccg tcgtcgtcag cccggtcgcg ggacaatacg agcagcaaat cgtggtgccg 240 cccaagggcg gatctttcta ccccggcgag accacgccac cgcagcaact ccaacaacgt 300 atattttggg gaatacctgc actactaaaa aggtattacc caagtgtaac ttgtccgcag 360 caggtttcat actatccagg ccaagcttct ccgcaacggc caggacaagg tcagcagcca 420 ggacaaggac aacaagggta ctacccaact tctccgcaac agccaggaca atggcaacaa 480 ccggaacaag ggcaacaagg gtactaccca acttctccgc agcagccagg acaattgcaa 540 caaccagcac aagggcagca accaggacaa gggcaacaag gtcagcagcc aggacaaggg 600 caaccagggt actacccaac ttcttcgcag ctgcagccag gacaattgca acaaccagca 660 caagggcaac aagggcagca accaggacaa gcgcaacaag gtcaacagcc aggacaaggg 720 caacaaccag gacaaggaca acaaggtcaa cagccaggac aagggcaaca accaggacaa 780 gggcaacaag gtcagcagct cggacaagga caacaagggt actacccaac ttctctgcaa 840 cagtcgggac aagggcaacc agggtactac ccaacttctc tgcagcagct aggacaaggg 900 caatcagggt actacccaac ttctccgcag caaccaggac aagggcagca gccaggacaa 960 ttgcaacaac cagcacaagg gcagcaacca ggacaagggc aacaaggtca gcagccagga 1020 caagggcaac aaggccagca gccaggacaa gggcagcaac cgggacaagg gcaaccaggg 1080 tactacccaa cttctccgca gcagtcagga caagggcaac cagggtacta cccaacttct 1140 tcgcagcagc caacacaatc gcagcaacca ggacaagggc aacaaggtca gcaggtagga 1200 caagggcaac aagctcagca gccaggacaa gggcagcaac cgggacaagg gcagccaggg 1260 tactacccaa cttctccgca gcagtcagga caagggcaac cagggtacta cctaacttct 1320 ccgcagcagt caggacaagg gcagcagcca ggacaattgc aacaatcagc acaagggcaa 1380 aaaggacagc aaccaggaca aggtcaacag ccagggcaag ggcaacaagg tcagcagcca 1440 ggacaagggc aacaaggtca gcaaccgggg caagggcagc cagggtacta cccaacttct 1500 ccgcagcaat caggacaagg gcaacagcca ggacaatggc aacaaccagg acaagggcaa 1560 ccaggatact acccaacttc tccgttgcag ccaggacaag ggcaaccagg gtacgaccca 1620 acttctccgc aacagccagg acaagggcag caaccaggac aattgcaaca accagcacaa 1680 gggcaacaag ggcagcaact agcacaaggg caacaagggc agcaaccagc acaagtgcaa 1740 caagggcagc agccagcaca agggcaacaa ggtcagcagc taggacaagg gcaacaaggt 1800 cagcagccag gacaagggca acaagggcag caaccagcac aagggcaaca aggtcagcag 1860 ccaggacaag ggcaacacgg tcagcagcca ggacaagggc aacaaggtca gcagccagga 1920 caagggcagc aaccgggaca agggcagcca tggtactacc caacttctcc gcaggagtca 1980 ggacaagggc aacagccagg acaatggcaa caaccaggac aagggcaacc agggtactac 2040 ctaactttct ccgttgcagc taggacaggg caacaagggt actacccaac ttctctgcaa 2100 caaccaggac aagggcagca accaggacaa tggcaacaat cgggacaagg gcaacattgg 2160 tactacccaa cttctccgaa gctgtcagga caagggcaac ggccaggaca atggctgcaa 2220 ccaggacaag ggcaacaagg gtactaccca acttctccgc aacagccacc acaagggcaa 2280 caactaggac aatggctgca accaggacaa gggcaacaag ggtactaccc aacttctctg 2340 caacagacag gacaagggca gcaatcagga caagggcaac aaggctacta cagctcatac 2400 catgttagcg tggagcacca ggcggccagc ctaaaggtgg caaaggcgca gcagctcgcg 2460 gcacagctgc cggcaatgtg ccggctggag ggcggcgacg cattgtcggc cagccagtga 2520 2520 <210> 2 <211> 1358 <212> DNA <213> Triticum asetivum Glu-Bx7 promoter <400> 2 ctgcccagca aagcgcgctc aactcttcta gtctaaataa ctagcatcca ctaacacatt 60 tctcccgaca tgcaagcacg tcacctatga aaatgcccac ctcaatatgc aaccatgcat 120 agaagaaagc tcacctcagc atgcaaacat gcagcataat ttccatttta cttggctatt 180 tatgtttgat aaatatttca caaatataca ataatcaaaa acaataaatt atatgtgttt 240 ttagttttag ttctcatatc caaatataca tgtttcatac aaccaaatct catttaaata 300 tattgtaaaa tattccggca acaacttgtg gggtacatct agttacagtg gaatattagt 360 gatggcgtga gcaagcgata aggccaacga gagaagaagt gcgtcgtcta tggaggccag 420 ggaaagacaa tggacatgca aagaggtagg ggcagggaag aaacacttgg agatcataga 480 agaacataag aggttaaaca taggagggca taatggacaa ttaaatctac attaattgaa 540 ctcatttggg aagtaaacaa aatccatatt ctggtgtaaa tcaaactatt tgacgcggat 600 ttactaagat cctatgttaa ttttagacat gactggccaa aggtttcagt tagttcattt 660 gtcacggaaa ggtgttttca taagtccaaa actctaccaa cttttttgca cgtcatagca 720 tagatagatg ttgtgagtca ttggatagat attgtgagtc agcatggatt tgtgttgcct 780 ggaaatccaa ctaaatgaca agcatcaaaa cctgaaatgg gctttaggag agatggttta 840 tcaatttaca tgttccatgc aggctacctt ccactactcg acatggttag aagttttgag 900 tgccgcatat ttgcggaagc aatggcacta ctcgacatgg ttagaagttt tgagtgccgc 960 atatttgcgg aagcaatggc taacagatac atattctgcc aaaccccaag agggataatc 1020 actcctctta gataaaaaga acagaccaat gtacaaacat ccacacttct gcaaacaata 1080 caccagaact aggattaagc ccattacgtg gctttagcag accgtccaaa aatctgtttt 1140 gcaagcacca attgctcctt acttatccag cttcttttgt gttggcaaac tgcccttttc 1200 caaccgattt tgttcttctc acgctttctt cataggctaa actaacctcg gcgtgcacac 1260 aaccatgtcc tgaaccttca cctcgtccct ataaaagccc atccaacctt cacaatctca 1320 tcatcaccca caacaccgag caccccaatc tacagatc 1358 <210> 3 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TaGlu-Dx5 forward primer <400> 3 agggtaccga gatggctaag cgcctgg 27 <210> 4 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TaGlu-Dx5 reverse primer <400> 4 gatctagatc actgcctggt cgacaatg 28 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Dx5 forward primer <400> 5 gggacaatac gagcagcaaa 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Dx5 reverse primer <400> 6 cttgttccgg ttgttgccat 20 <210> 7 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPTII forward primer <400> 7 cgcttctgcg ggcgattt 18 <210> 8 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPTII reverse primer <400> 8 cccattcgga ccgcaagga 19

Claims (10)

1. 밀(Triticum asetivum) 유래의 글루테닌 유전자 TaGlu-Bx7 프로모터 및 TaGlu-Dx5 유전자를 포함하는 벼 종자 특이적 TaGlu-Dx5 유전자 발현용 마커프리 재조합 발현벡터.
   
2. 제1항에 있어서, 상기 TaGlu-Dx5 유전자는 서열번호 1의 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 재조합 발현벡터.
   
3. 제1항에 있어서, 상기 TaGlu-Bx7 프로모터는 서열번호 2의 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 재조합 발현벡터.
   
4. 제1항에 있어서, 상기 발현벡터는 항생제 내성 유전자 및 이의 프로모터가 없는 것을 특징으로 하는 것인 재조합 발현벡터.
   
5. 제4항에 있어서, 상기 항생제는 하이그로마이신인 것인 재조합 발현벡터.
   
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 재조합 발현벡터로 형질전환된 형질전환 벼 또는 이의 종자.
   
7. 제6항에 있어서, 상기 형질전환은 아그로박테리움을 매개로 한 것인 형질전환 벼 또는 이의 종자.
   
8. 제6항에 있어서, 상기 벼는 동진벼인 것인 형질전환 벼 또는 이의 종자.
   
9. 제6항에 있어서, 상기 형질전환 벼의 종자는 기탁번호 KACC98024P로 기탁된 것인 형질전환 벼 또는 이의 종자.
   
10. (a) 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 재조합 발현벡터를 제조하는 단계;
    (b) 상기 재조합 발현벡터를 벼에 형질전환하는 단계; 및
    (c) 상기 형질전환 벼를 선발하는 단계를 포함하는, TaGlu-Bx7 프로모터 및 TaGlu-Dx5 유전자가 형질전환된 마커프리 형질전환 벼의 제조방법.
    

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