KR101574554B1

KR101574554B1 - 벼 현탁 배양을 이용한 재조합 인간 트립신의 생산방법

Info

Publication number: KR101574554B1
Application number: KR1020140043197A
Authority: KR
Inventors: 신윤지; 권태호; 두홍수
Original assignee: 재단법인 전주농생명소재연구원; (주)엔비엠
Priority date: 2014-04-10
Filing date: 2014-04-10
Publication date: 2015-12-09
Also published as: KR20150117777A

Abstract

본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 벼 유래의 α-아밀라제(RAmy3D) 프로모터 및 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 인간 트립신 단백질 코딩 유전자가 작동가능하게 연결된 벼 형질전환용 재조합 벡터, 상기 벡터로 형질전환되어 재조합 인간 트립신 단백질을 생산하는 벼 캘러스, 상기 형질전환된 벼 캘러스를 현탁 배양하여 재조합 인간 트립신을 생산하는 방법 및 상기 방법에 의해 생산된 재조합 인간 트립신에 관한 것으로, 본 발명의 재조합 벡터, 형질전환 벼 캘러스 및 인간 트립신을 생산하는 방법은 바이오산업 등에 유용하게 이용될 수 있을 것이다.

Description

벼 현탁 배양을 이용한 재조합 인간 트립신의 생산방법{Method for producing recombinant human trypsin using rice suspension culture}

본 발명은 벼 현탁 배양을 이용한 재조합 인간 트립신의 생산방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 벼 유래의 α-아밀라제(RAmy3D) 프로모터 및 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 인간 트립신 단백질 코딩 유전자가 작동가능하게 연결된 벼 형질전환용 재조합 벡터, 상기 벡터로 형질전환되어 재조합 인간 트립신을 생산하는 벼 캘러스, 상기 형질전환된 벼 캘러스를 현탁 배양하여 재조합 인간 트립신을 생산하는 방법 및 상기 방법에 의해 생산된 재조합 인간 트립신에 관한 것이다.

효소는 이미 오래전부터 특정 기질에 선택적으로 반응하는 특징으로 인해 음료수 제조, 육가공, 유가공, 양조, 제빵, 유지 산업과 효소 센서 등 다양한 산업 현장에서 유용하게 이용되고 있다.

현재, 산업적으로 활용되는 효소 중에서도 단백질분해효소는 청국장, 새우젓, 제빵, 치즈 등의 식품, 소화제, 소염제 등의 의약품과 세제를 만드는 등 여러 분야에서 산업적으로 중요한 역할을 하고 있다. 특히, 단백질분해효소 중에서도 다양한 기질에 대하여 효소반응성을 나타내는 트립신은 산업적으로 유용하게 활용되고 있다. 그러나, 세포 내부 및 세포 외부에서 모든 단백질을 무작위적으로 분해하는 트립신의 특성으로 인하여 트립신 유전자를 대장균에 도입하여 발현시킬 경우, 발현된 트립신에 의하여 숙주세포의 효소가 분해되고 이로 인하여 숙주세포가 사멸되어 대장균을 이용한 재조합 트립신의 생산은 불가능한 실정이다. 또한 트립신 유전자를 동물세포에 도입하여 발현시킨 후에 발현된 재조합 트립신을 세포 밖으로 분비시켜 생산하고자 하는 경우에도, 분비된 트립신에 의하여 동물세포를 이루고 있는 세포막의 막 단백질의 분해가 이루어져 숙주세포가 사멸하여, 동물세포를 이용한 재조합 트립신의 생산도 불가능한 실정이다. 이러한 이유로 인하여 지금까지도 대부분의 트립신은 여전히 소나 돼지 및 양 등과 같은 동물의 도축과정에서 확보한 췌장에서 직접 추출하여 사용하고 있다. 그러나, 최근 빈번하게 발생하는 광우병 등과 같은 치명적인 인수공통전염병으로 인하여 소 등을 비롯한 동물의 췌장에서 추출한 트립신의 사용을 대신할 재조합 트립신의 생산이 강하게 요구되고 있는 실정이다.

이러한 사회적인 문제를 해결하고자 본 발명자들은, 식물세포를 이용하여 재조합 트립신을 생산하도록 인간 트립신 유전자를 벼 세포에 도입하였으며, 생산된 재조합 인간 트립신은 벼 세포 밖으로 분비되도록 하였다. 식물세포는 동물세포와는 달리 셀룰로스 등으로 구성된 세포벽이 있어 분비된 트립신에 의하여 숙주세포의 사멸이 없이 안전하게 재조합 인간 트립신을 생산할 수 있다.

한편, 한국공개특허 제1996-0031601호에는 '효모로부터 재조합 인간 안티트립신-알파-1 단백질을 발현 분비시키기 위한 벡터'가 개시되어 있고, 한국등록특허 제10549167호에는 '식물세포 현탁 배양을 이용한 생물학적으로 활성 인터루킨-12의 생산'이 개시되어 있으나, 본 발명의 벼 현탁 배양을 이용한 재조합 인간 트립신의 생산방법에 대해서는 기재된 바가 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 인간 유래 트립신 단백질 코딩 유전자를 벼 유전체에 맞춰 코돈 최적화하여 합성하고 이를 벡터에 도입하여 벼 형질전환용 재조합 벡터를 제조하였다. 제조된 재조합 벡터로 벼 캘러스를 형질전환하고, 형질전환된 벼 캘러스를 현탁 배양하여 배양 배지로부터 재조합 인간 트립신을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 벼 유래의 α-아밀라제(RAmy3D) 프로모터 및 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 인간 트립신 단백질 코딩 유전자가 작동가능하게 연결된 벼 형질전환용 재조합 벡터를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환되어 재조합 인간 트립신을 생산하는 벼 캘러스를 제공한다.

또한, 본 발명은 벼 유래의 α-아밀라제 프로모터 및 인간 트립신 단백질 코딩 유전자가 작동가능하게 연결된 벼 형질전환용 재조합 벡터로 형질전환된 벼 캘러스를 현탁 배양하여 재조합 인간 트립신을 생산하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 생산된 재조합 인간 트립신을 제공한다.

본 발명에 따르면, 본 발명의 인간 트립신 생산방법은 간단한 공정으로 대량의 인간 트립신을 생산할 수 있으며, 본 발명의 방법을 통해 생산된 인간 트립신은 기존의 인수공통전염병 등의 오명 가능성이 있는 동물 췌장에서 추출한 트립신을 대채할 수 있는 비동물성 재조합 트립신 생산방법으로 바이오산업 등에 유용하게 이용될 수 있을 것이다.

도 1은 본 발명에서 사용된 인간 트립신 단백질 코딩 유전자를 포함하는 벼 형질전환용 재조합 벡터의 모식도이다. RAmy3D-p, 벼 유래의 α-아밀라제 3D(RAmy3D) 프로모터; shTrypsin, 합성한 인간 트립신 유전자; 3'UTR, 벼 유래의 α-아밀라제의 3'비번역 구역; RB, T-DNA 우측 보더(right border); 35S-p, CaMV35S 프로모터; HPT, 하이그로마이신 포스포트랜스퍼라제; 35S polyA, 35S 유전자의 터미네이터; LB, T-DNA 좌측 보더(left border).
도 2는 형질전환된 벼 캘러스의 인간 트립신(hTypsin) 유전자의 mRNA 발현 수준을 PCR로 확인한 결과이다.
도 3은 형질전환 벼 캘러스 세포주의 재조합 인간 트립신 단백질의 발현을 (A) SDS-PAGE, (B) 웨스턴 블럿 및 (C) ELISA를 통해 확인한 결과이다. M, 마커(PageRuler TM Protein Ladder Fermentas); PC, 양성 대조구(밀 배아 발현 시스템을 이용하여 인공적으로 합성한 인간 트립신); NC, 음성 대조구(형질전환된 벼 캘러스를 포함하지 않은 배지); 숫자 3, 5, 9, 11, 22 및 25, 형질전환된 벼 캘러스 고유 번호.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 벼 유래의 α-아밀라제(RAmy3D) 프로모터 및 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 인간 트립신 단백질 코딩 유전자가 작동가능하게 연결된 벼 형질전환용 재조합 벡터를 제공한다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 벼 형질전환용 재조합 벡터에서, 프로모터로는 벼에서 인간 트립신의 대량생산에 적합하며, 당 결핍 배지에서 상기 트립신을 생산할 수 있는 벼 유래의 α-아밀라제 3D(RAmy3D) 프로모터가 사용될 수 있으며, 본 발명에 따른 α-아밀라제 프로모터를 코딩하는 유전자는 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 포함할 수 있다. 또한, 상기 염기서열의 상동체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 1의 염기서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열을 포함하는 프로모터가 사용될 수 있다. 여기서 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 유전자 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 인간 트립신 단백질을 암호화하는 유전자를 제공한다. 유전자은행(GeneBank)의 인간 트립신 유전자의 염기서열(assession number NM_002769)을 바탕으로 하고, 컴퓨터 분석을 통하여 인간 트립신 유전자의 mRNA의 안정성에 영향을 주는 염기서열을 분석하였다. 인간 트립신 유전자의 코돈을 벼의 고빈도 사용 코돈으로 치환하기 위하여 KDRI(Kazusa DNA Research Institute)의 코돈 사용 데이터(http://www.kazusa.or.jp/codon/index.html)를 이용하여 트립신 유전자에 나타난 벼의 코돈 사용 빈도를 확인하였다. 그리고, 이를 바탕으로 인간 트립신 유전자의 코돈 사용을 최적화하였다. 인간 트립신 유전자의 247개의 코돈 중에서 벼에서 낮은 빈도로 사용되고 있는 코돈은 97개로서 약 39%의 코돈이 벼의 코돈으로서는 부적절한 것으로 확인되었으며, 이러한 컴퓨터 분석 결과를 바탕으로 최적의 인간 트립신 유전자의 염기서열(이하, 인간 유래 트립신 유전자: 서열번호 2)을 설계하였다. 또한, 상기 염기 서열의 상동체가 본 발명의 범위 내에 포함되는데, 구체적으로는 전술한 바와 같다.

본 발명의 벼 형질전환용 재조합 벡터는 상기 벼 유래의 α-아밀라제 3D 프로모터에 인간 트립신 단백질 코딩 유전자가 전사방향으로 작동가능하게 연결되도록 구성된다.

여기서 '작동가능하게 연결된(operatively linked)'은 유전자 발현 조절 서열(예: 프로모터, 시그널 서열, 또는 전사조절인자 결합 위치의 어레이)과 다른 유전자 서열(예컨대, 인간 트립신 코딩 유전자) 사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 다른 유전자 서열의 전사 및/또는 해독 과정을 조절하게 된다.

용어 "재조합"은 세포가 이종의 유전자를 복제하거나, 상기 유전자를 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 유전자에 의해 암호된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로써 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.

용어 "벡터"는 DNA 단편(들), 유전자 분자를 세포 내로 전달할 수 있는 수단을 지칭할 때 사용된다. 벡터는 숙주세포에서 독립적으로 DNA를 복제시키고, 재생산될 수 있다. 용어 "전달체"는 흔히 "벡터"와 호환하여 사용된다. 용어 "발현 벡터"는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 유전자 서열을 포함하는 재조합 벡터를 의미한다. 진핵세포에서 이용 가능한, 이와 같은 발현유전자 서열인 프로모터, 인핸서, 종결신호 및 폴리아데닐레이션 신호는 공지되어 있다.

"프로모터"란 용어는 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림의 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 폴리머라아제가 결합하는 DNA 분자를 말한다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다.

본 발명의 일 구현 예에서 사용되는 프로모터인 α-아밀라제 3D(RAmy3D) 프로모터는 외래 유전자의 발현량이 높아, 인간 트립신의 대량생산의 목적 달성에 적합하다. 또한, 당이 고갈된 상태에서 단백질 분해 효소 활성이 현저히 낮으므로, 당 고갈 상태에서 강력하게 발현되는 프로모터가 발현된 인간 트립신의 분해 가능성을 낮출 수 있어 바람직한데, 본 발명의 일 구현 예에서 사용되는 프로모터인 α-아밀라제 3D 프로모터는 당이 고갈된 상태에서 강력하게 발현되므로, 본 발명의 목적 달성에 바람직하다. 만일, 통상의 식물체 형질전환에 사용되는 CaMV 35S, 액틴, 유비퀴틴, pEMU, MAS 또는 히스톤 프로모터를 사용하는 경우 발현되는 인간 트립신의 분해 속도가 높아, 목적하는 인간 트립신의 축적을 기대할 수 없다.

본 발명에서, 인간 트립신 단백질을 코딩하는 DNA를 벼 캘러스에 도입시키는데 이용될 수 있는 식물 발현 벡터의 바람직한 예는 아그로박테리움 투머파시엔스와 같은 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부, 소위 T-영역을 식물 세포로 전이시킬 수 있는 Ti-플라스미드 벡터이다. 다른 유형의 Ti-플라스미드 벡터(EP 0 116 718 B1호 참조)는 현재 식물 세포, 또는 잡종 DNA를 식물의 게놈 내에 적당하게 삽입시키는 새로운 식물이 생산될 수 있는 원형질체로 잡종 DNA 서열을 전이시키는데 이용되고 있다. Ti-플라스미드 벡터의 특히 바람직한 형태는 EP 0 120 516 B1호 및 미국 특허 제4,940,838호에 청구된 바와 같은 소위 바이너리(binary) 벡터일 수 있다. 본 발명에서 이용될 수 있는 다른 적합한 벡터는 이중 가닥 식물 바이러스(예를 들면, CaMV) 및 단일 가닥 바이러스, 게미니 바이러스 등으로부터 유래될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터, 예를 들면 비완전성 식물 바이러스 벡터로부터 선택될 수 있다.

본 발명의 발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함한다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 유전자 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자 서열이 이에 해당된다. 그 예로는 글리포세이트(glyphosate) 또는 포스피노트리신 (phosphinothricin)과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신(Kanamycin), G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페니콜(chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

한편, 본 발명의 벼 형질전환용 재조합 벡터는 터미네이터를 포함할 수 있다. 상기 터미네이터는, 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 노팔린 신타아제(NOS), 벼 α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 파세올린(phaseoline) 터미네이터, 아그로박테리움 투메파시엔스(agrobacterium tumefaciens)의 옥토파인 (Octopine) 유전자의 터미네이터 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 터미네이터의 필요성에 관하여, 그러한 영역이 식물 세포에서의 전사의 확실성 및 효율을 증가시키는 것으로 일반적으로 알려져 있다. 그러므로, 터미네이터의 사용은 본 발명의 내용에서 바람직할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 벼 유래의 α-아밀라제(RAmy3D) 프로모터 및 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 인간 트립신 단백질 코딩 유전자가 작동가능하게 연결된 벼 형질전환용 재조합 벡터로 형질전환되어 재조합 인간 트립신을 생산하는 벼 캘러스를 제공한다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 상기 인간 트립신 단백질을 생산하는 벼 캘러스는 도 1의 재조합 벡터 pJKS133으로 벼 캘러스를 형질전환하여 제조하였고, 형질전환된 벼 캘러스를 현탁 배양하여 인간 트립신 단백질의 생산 수준을 확인하여 선별하였다. 선별된 형질전환 벼 캘러스 세포주 중 배지 1ℓ당 20㎎ 이상의 인간 트립신을 생산하는 세포주가 확인되어, 상기 세포주를 pJKS133-22 (Oryza sativa L(cv. Dongjin)/pJKS133)로 명명하고, 한국생명공학연구원 미생물자원센터에 2014년 3월 28일자로 기탁하였다 (기탁번호: KCTC 18276P).

식물의 형질전환은 유전자(DNA)를 식물에 전이시켜 이루어진다. 그러한 형질전환 방법은 반드시 재생 및 (또는) 조직 배양 기간을 가질 필요는 없다. 식물 종의 형질전환은 이제는 쌍자엽 식물뿐만 아니라 단자엽 식물 양자를 포함한 식물 종에 대해 일반적이다. 원칙적으로, 임의의 형질전환 방법은 본 발명에 따른 잡종 유전자를 적당한 선조 세포로 도입시키는데 이용될 수 있다. 방법은 원형질체에 대한 칼슘/폴리에틸렌 글리콜 방법(Krens, F.A. et al., 1982, Nature 296, 72-74; Negrutiu I. et al., June 1987, Plant Mol. Biol. 8, 363-373), 원형질체의 전기천공법(Shillito R.D. et al., 1985 Bio/Technol. 3, 1099-1102), 식물 요소로의 현미주사법 (Crossway A. et al., 1986, Mol. Gen. Genet. 202, 179-185), 각종 식물 요소의 (DNA 또는 RNA-코팅된) 입자 충격법(Klein T.M. et al., 1987, Nature 327, 70), 식물의 침윤 또는 성숙 화분 또는 소포자의 형질전환에 의한 아그로박테리움 투머파시엔스 매개된 유전자 전이에서 (비완전성) 바이러스에 의한 감염(EP 0 301 316호) 등으로부터 적당하게 선택될 수 있다.

본 발명에 따른 바람직한 방법은 아그로박테리움 매개된 유전자 전달을 포함한다. 특히 바람직한 것은 EP A 120 516호 및 미국 특허 제4,940,838호에 기재된 바와 같은 소위 이원 벡터 기술을 이용하는 것이나 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 본 발명은

(a) 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 벼 유래의 α-아밀라제(RAmy3D) 프로모터 및 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 인간 트립신 단백질 코딩 유전자가 작동가능하게 연결된 벼 형질전환용 재조합 벡터를 벼 캘러스에 형질전환하는 단계; 및

(b) 상기 (a) 단계의 형질전환된 벼 캘러스를 현탁 배양 배지에서 배양하여 인간 트립신을 생산하는 단계를 포함하는 재조합 인간 트립신의 생산방법을 제공한다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에 있어서, 상기 (a) 단계는 인간 트립신 단백질 코딩 유전자를 합성하는 단계를 수행하며, 본 발명에서는 오버랩 PCR 방법을 이용하였지만, 이에 제한되는 것은 아니며 다양한 공지의 방법을 통해 인간 트립신 단백질 코딩 유전자를 합성할 수 있다.

또한, 본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에 있어서, 상기 (b) 단계의 형질전환된 벼 캘러스는 pJKS133-22 (기탁번호: KCTC 18276P)일 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 상기 형질전환된 벼의 배양 방법은 분비되는 외래 단백질을 용이하게 정제할 수 있는 현탁 배양 방법일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명의 인간 트립신을 생산하기 위한 상기 현탁 배양 조건은 당이 결핍된 조건일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

재료 및 방법

인간 트립신 코딩 유전자의 합성

유전자은행(GeneBank)의 인간 트립신 유전자의 염기서열(assession number NM_002769)을 바탕으로 하고, 컴퓨터 분석을 통하여 인간 트립신 유전자의 mRNA의 안정성에 영향을 주는 염기서열을 분석하였다.

인간 트립신 유전자의 코돈을 벼의 고빈도 사용 코돈으로 치환하기 위하여 KDRI(Kazusa DNA Research Institute)의 코돈 사용 데이터(http://www.kazusa.or.jp/codon/index.html)를 이용하여 트립신 유전자에 나타난 벼의 코돈 사용 빈도를 확인하였다. 그리고, 이를 바탕으로 인간 트립신 유전자의 코돈 사용을 최적화하였다. 유전자 분석프로그램인 DNASIS 프로그램(Hitachi Software Engineering, 일본)을 이용하여 인간 트립신 유전자의 코돈 사용을 분석하고 벼의 코돈 사용과 비교하였다. 인간 트립신 유전자의 247개의 코돈 중에서 벼에서 낮은 빈도로 사용되고 있는 코돈은 97개로서 약 39%의 코돈이 벼의 코돈으로서는 부적절한 것으로 확인되었으며, 이러한 컴퓨터 분석 결과를 바탕으로 최적의 인간 트립신 유전자의 염기서열(이하, 인간 유래 트립신 유전자: 서열번호 2)을 설계하였다.

벼에서 유전자 발현이 잘 되도록 벼의 코돈으로 최적화된 인간 트립신 유전자 정보를 ㈜바이오니아에 제공하여 817bp의 인간 트립신 유전자를 합성하였다.

벼 형질전환용 재조합 벡터

상기에서 합성한 인간 트립신 코딩 유전자를, 항생제 하이그로마이신에 내성을 나타내는 선발 마커인 하이그로마이신 포스포트랜스퍼라제를 포함하며, 벼 유래 α-아밀라제 3D(RAmy3D) 프로모터와 3' UTR 터미네이터가 삽입되어 있는 식물발현 벡터 pMYN44 (한국등록특허 제0640193호)에 SacI과 XbaI 제한효소 자리를 이용하여 도입하여 pJKS133를 수득하였다.

벼 캘러스 형질전환

벼(품종 '동진') 종자를 1% 클로락스 및 0.01% 트리톤 X-100 용액에 넣어 5분간 살균한 다음 멸균된 증류수로 세 번 씻은 후, 2㎎/ℓ의 2,4-디클로로페녹시아세트산(2,4-dichlorophenoxyacetic acid, 이하 2,4-D), 0,02㎎/ℓ의 키네틴 및 3%의 수크로스를 포함하는 캘러스 유도용 N6 배지에 치상하여 28℃의 생장상에서 캘러스를 유도하였다. 그리고, 캘러스 유도 후 3주에서 4주 째의 배반 유래 캘러스를 형질전환에 이용하였다.

상기에서 제작한 인간 트립신 유전자 및 벼 유래 α-아밀라제 3D 프로모터 유전자를 포함하는 재조합 백터 pJKS133이 포함된 아그로박테리움 튜메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) LBA4404 균주가 OD₆₀₀값이 0.8~1.2 정도가 되도록 배양된 아세토시링원(acetosyringone)이 포함된 AA 액체배지(AA 염 및 아미노산, B5 비타민, 20g/ℓ 수크로스, 2㎎/ℓ 2,4-D, 0.2㎎/ℓ 키네틴 및 100mM 아세토시링원(pH 5.8))에 상기 캘러스를 15분간 침적시켜 혼합배양시켰다. 이와 같이, 접종된 캘러스는 멸균된 여과지로 여분의 아그로박테리움 현탁액을 제거한 후, 2N6-Co (2N6, 10g/ℓ 글루코스, 100mM 아세토시링원) 고체배지 1개당 25개의 캘러스를 치상한 다음, 3일간 24℃의 암 조건에서 아그로박테리움과 공동배양하였다.

공동배양된 캘러스로부터 아그로박테리움을 제거하기 위하여 250㎍/㎖의 카베니실린(carbenicillin)이 포함된 멸균 증류수에 캘러스를 3회 세척하였다. 세척된 캘러스를 멸균된 여과지로 여분의 물기를 제거한 후, 2N6-SE (2N6, 250㎎/ℓ 카베니실린, 50㎎/ℓ 하이그로마이신) 선발배지에 치상하였고, 27℃에서 2주 동안 암 조건에서 배양하였다. 이후 왕성하게 분열한 캘러스만 선발하여 다시 2N6-SE 배지에 옮겨준 후 2주 가량의 암 배양을 통해 증식된 캘러스만을 선발하였다.

형질전환된 벼 캘러스의 배양

상기에서 형질전환된 벼 캘러스를 로터리 교반기에서 110rpm의 속도로 교반하면서 28℃에서 암 배양하였다. 이때, 벼 캘러스 세포 현탁액은 2㎎/ℓ 2,4-D, 0.02㎎/ℓ 키네틴 및 3% 수크로스를 포함하는 N6 배지를 통해 300㎖ 플라스크에서 배양하였다. 계대 배양을 위하여 9일에 걸쳐 10㎖ 씩 접종원을 옮겼다. 그 후, 흡입을 통해 세포 현탁액으로부터 N6 배지를 제거하였고, 10%(젖은 세포 중량/배지 부피)의 새로운 당 고갈 N6 배지(수크로스가 제외된)에 벼 캘러스 세포를 옮겨, α-아밀라제 3D 프로모터의 조절하에서 인간 트립신 유전자의 발현을 유도하였다.

Myracloth(Calbiochem, 미국)의 2~3개 층을 통해 형질전환된 세포 현탁액을 부으면서 유도된 벼 캘러스 세포가 포함된 배지의 상등액을 수득하였다. 그리고, 전체 배지의 단백질은 4℃에서 10분간 18,000xg의 원심분리를 통해 찌꺼기를 제거한 후 수득하였다.

실시예 1. 인간 트립신 유전자의 도입 및 발현 확인

인간 트립신 유전자의 도입 및 안정적인 mRNA의 발현 여부를 실시한 중합효소연쇄반응(Real-time PCR)을 통해 분석하였다.

총 RNA는 형질전환된 벼 캘러스 세포의 5g을 RNeasy plant total RNA extraction kit(Qiagen, 미국)를 사용하여 추출 및 분리하였다. 실시한 PCR 분석은 인간 트립신 유전자에 특이적인 정방향 프라이머(5'-GGGGGCTACAACTGTGAAGA-3'; 서열번호 3)과 역방향 프라이머(5'-TTCCCCTCCAGGACCTCTAT-3'; 서열번호 4)를 사용하고, 동정을 위한 형광시약으로 2X SYBR kit(Quantimix SYBR)를 이용하여 수행하였다. 실시간 PCR은 40 사이클로 수행되었으며 95℃에서 1초, 60℃에서 10초 및 72℃에서 20초로 구성되었다.

실시간 PCR 결과, 하이그로마이신에 저항성을 보인 모든 형질전환 벼 캘러스에서 인간 트립신 유전자의 mRNA 발현이 확인되어 안정적으로 인간 트립신 유전자가 벼의 염색체 안으로 도입되었음을 확인하였고(도 2), 벼의 염색체에 도입된 인간 트립신 유전자는 모두 정상적으로 mRNA를 발현하고 있음을 확인하였다. 도 2의 결과에서 S133-3, S133-5, S133-9, S133-11, S133-12 및 S133-15 세포주는 인간 트립신 유전자의 mRNA 발현수준이 높게 확인되어, 상기 세포주들은 웨스턴 블롯을 위한 세포주로 선발하였다.

실시예 2. 인간 트립신 단백질의 발현 확인

형질전환된 벼 캘러스 세포 배양액을 4℃에서 12,000rpm으로 5분간 원심분리한 후 상층액을 이용하여 12%(w/v) SDS-PAGE로 분리하고, 니트로셀룰로오스 막으로 전기적 블롯팅(electroblotting)을 수행하였다. 인간 트립신 단백질의 발현 확인은 NOVUS사(미국)의 토끼 항-트립신 단클론성 항체(Cat. No. NBP1-30135)를 사용하여 수행하였다. 이때, 밀 배아(wheat germ) 발현 시스템을 이용하여 인공적으로 합성한 Avnova사(대만)의 인간 트립신 단백질(Cat. No. H00005644-P01)을 양성 대조군으로 사용되었다. 상기 단백질을 분리한 젤은 45%의 메탄올 및 10%의 빙초산과 함께 0.25% 쿠마시 블루 R-250을 사용하여 염색하였다. 단백질의 농도는 소혈청알부민을 표준으로 사용하여 브레드포드 분석법(Bradford)에 기초하여 정량되었다.

그 결과, SDS-PAGE로 젤에서 단백질이 분리된 것을 확인하였고(도 3A), 양성 대조구로 사용된 밀 배아 발현 시스템을 이용하여 인공적으로 합성한 인간 트립신 단백질을 로딩한 레인에서는 53kDa 크기의 단백질이, 본 발명의 형질전환 벼 캘러스 세포 배양액을 로딩한 레인에서서는 인간 트립신 단백질 분자량에 해당하는 26kDa 크기의 단백질 밴드들이 확인되었다. 야생형의 현탁세포 배양액을 사용한 음성 대조구에서는 어떠한 밴드도 확인되지 않았다(도 3B). 상기의 결과들을 통해서, 재조합 인간 트립신 단백질이 벼 캘러스 세포 배양을 통해서 발현되었음을 알 수 있었다.

도 3(B)에서, 양성 대조구의 밀 배아 발현 시스템을 이용하여 인공적으로 합성한 인간 트립신과 본 발명의 벼 캘러스 세포 배양액을 통해 생산된 인간 트립신의 단백질의 크기가 다소 상이한 것은 밀 배아 발현 시스템을 이용하여 인공적으로 합성한 인간 트립신은 pre-pro peptide가 잘리지 않은 상태로 있기 때문이며, 벼 캘러스 세포 배양액을 통해 확인된 재조합 인간 트립신 단백질은 벼 세포에서 외부로 분비되는 과정에서 pre-pro peptide가 잘려지기 때문이다.

그리고, 형질전환 벼 캘러스를 당 결핍 배지에 옮겨 배양한 지 5일째의 배양액을 효소결합 면역흡착 분석법(ELISA)을 통해 분석하여, 형질전환 벼 캘러스 세포 현탁액에서의 인간 트립신의 분비량을 확인하였다.

그 결과, 형질전환된 벼 캘러스 세포 배지 내로 분비된 인간 트립신의 양이 매우 높음을 확인하였으며, 특히 22번 세포주의 경우 생산된 트립신의 양이 20㎎/ℓ 이상임이 확인되어(도 3C), 이 세포주를 인간 트립신 대량생산이 가능한 세포주로서 선발하고 한국생명공학연구원 미생물자원센터에 2014년 3월 28일에 기탁하였다(KCTC 18276P).

한국생명공학연구원

KCTC18276P

20140328

<110> JEONJU BIOMATERIALS INSTITUTE NBM Co., Ltd <120> Method for producing recombinant human trypsin using rice suspension culture <130> PN14104 <160> 4 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1080 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 1 gatcttcaac cacctgtgct agctactcca ctgctccata ggcaatcatc aatcagtaat 60 ccgttctgaa aagaagatat aggtgtgcgc aatcaggaac gttctagttc gtgctagaaa 120 tcagcagctc ctaagttagc atctcgatga acttaaatgc tcgctgcggg cgtccggcgg 180 agatgaagtt tgtgataaac ttggtcatga cattcatata tgtgcctggt gtacggagta 240 gttcatcagc aaacatacac ctacttctac cttatccatt tggattgctc atggcggctt 300 tgatatggaa tttgtaatga acttggttat gacttatgac atactgatac tcgtaacatt 360 catagatact gacataaatt catcaactac aatagatgag atggctagtc ttagtagaac 420 agtagtctct ctttccggct tgctccattg gctgatgacg atgaacaact cggactcatt 480 gattccagca ttatctgatt ctcgcatttc gaggtccgga ttagggtctc accgagatgt 540 ggatagaatt gccatgtcag gaattgaagg aggacgagcc atatgtgcat atacatgacg 600 ggagatcaag cggccagtca agaggctaac tgcaacccta ttatatacga tcagcctgct 660 agaacacgta gcactgtctt ttttgtctga actctgaaga tgaaaggttc agagaaatgg 720 ctcgccttat ccaagccggc gatggatgga ggaggaggta gccggcgccc gcctcaggca 780 gtcgtcgcga tcacgccgcc gcatcccgtc gccttggaga ccgggccccg acgcggccga 840 cgcggcgcct acgtggccat gctttattgc cttatccata tccacgccat ttattgtggt 900 cgtctctcct gatcattctc attcccctgc cacggtgacc gtgcccccgg tgttctatat 960 atgccccccg acgtcgaggt cattcgccac gaacacatcg atcatccatc atctacaaga 1020 gatcgatcag tagtggttag cagcaactca ctatcgaaca cggtttcagc ttacacagat 1080 1080 <210> 2 <211> 817 <212> DNA <213> Artificial sequence <400> 2 ggttaattaa ggtctcaagg ttctagaatt attacatcaa aacaaaagat gaacccactc 60 ctgatcctta cctttgtggc cgctgcgctt gctgccccgt ttgatgatga tgataagatt 120 gttgggggct acaactgtga agagaatagt gttccatatc aggtgtccct gaactctggc 180 taccatttct gcggtgggtc cctcattaac gaacagtggg tggtgtcagc gggacactgt 240 tacaagtccc gcatccaggt gagactggga gagcacaaca tagaggtcct ggaggggaat 300 gagcaattca tcaatgccgc gaagattatc cggcatccgc aatatgacag gaagactctg 360 aacaatgaca taatgctaat caagctctcg tcacgcgccg taattaacgc gagggtgtcc 420 acgatctccc tgcccaccgc ccctccagcc acaggcacga aatgcctcat atcgggttgg 480 ggcaacactg ccagctctgg cgccgactac ccggacgagc ttcaatgcct ggacgctccg 540 gtgctgagcc aggctaagtg cgaagcctcg tatcctggaa agatcaccag caatatgttc 600 tgcgtagggt tcctggaagg cggcaaagat tcatgtcaag gtgactctgg tggccccgtt 660 gtctgcaatg gccagctcca gggagttgtc agttgggggg acggctgcgc tcagaagaac 720 aagcctggcg tctatacaaa ggtctataat tacgtcaagt ggattaaaaa cacgatcgcc 780 gcgaatagct gataggtacc gctttgagac cctcgag 817 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 gggggctaca actgtgaaga 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 ttcccctcca ggacctctat 20

Claims

서열번호 1의 염기서열로 이루어진 벼 유래의 α-아밀라제(RAmy3D) 프로모터 및 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 인간 트립신 단백질 코딩 유전자가 작동가능하게 연결된 벼 형질전환용 재조합 벡터.
제1항의 재조합 벡터로 형질전환되어 재조합 인간 트립신을 생산하는 벼 캘러스.
제2항에 있어서, 상기 벼 캘러스는 pJKS133-22 (기탁번호: KCTC 18276P)인 것을 특징으로 하는 벼 캘러스.
(a) 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 벼 유래의 α-아밀라제(RAmy3D) 프로모터 및 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 인간 트립신 단백질 코딩 유전자가 작동가능하게 연결된 벼 형질전환용 재조합 벡터를 벼 캘러스에 형질전환하는 단계; 및
(b) 상기 (a) 단계의 형질전환된 벼 캘러스를 현탁 배양 배지에서 배양하여 인간 트립신을 생산하는 단계를 포함하는 재조합 인간 트립신의 생산방법.
제4항에 있어서, 상기 (b) 단계의 벼 캘러스의 배양은 당 결핍 상태에서 이루어지는 것을 특징으로 하는 재조합 인간 트립신의 생산방법.
제4항에 있어서, 상기 형질전환된 벼 캘러스는 pJKS133-22 (기탁번호:KCTC 18276P)인 것을 특징으로 하는 재조합 인간 트립신의 생산방법.
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