KR20100108782A - 시스테인 프로테이나아제 유전자 발현의 억제에 의한 재조합 단백질 증산 방법 - Google Patents

시스테인 프로테이나아제 유전자 발현의 억제에 의한 재조합 단백질 증산 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 단백질분해효소 분비 억제조건에서의 고농도 재조합 목적 단백질의 생산 방법에 관한 것으로, 구체적으로는 식물의 현탁세포 배양 시 식물세포 밖으로 분비되는 시스테인 프로테이나아제의 분비가 억제되는 식물 현탁세포배양 조건에서 외래유전자를 높은 수준으로 발현시킴으로서 재조합 목적 단백질을 다량으로 생산할 수 있는 방법을 제공한다. 더욱 구체적으로는 시스테인 프로테이나아제 유전자의 ihpRNA를 발현하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 식물세포, 현탁세포 배양배지에 시스테인 프로테이나아제의 분비를 억제시키는 방법, 및 상기 형질전환세포 및 재조합 목적 단백질의 형질전환체를 공동 현탁배양하여 재조합 목적 단백질의 생산을 증가시키는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 방법을 이용하여 저가의 비용으로 생물학적 활성을 가진 재조합 목적 단백질을 식물세포 밖으로 분비시켜 대량 생산할 수 있다.
RNAi, ihpRNA, 단백체학, 시스테인 프로테이나아제, hGM-CSF, 벼 세포 현탁 배양, 재조합 단백질 증산

Description

시스테인 프로테이나아제 유전자 발현의 억제에 의한 재조합 단백질 증산 방법{Method for improving recombinant protein production by suppression of cysteine proteinase gene expression}
본 발명은 시스테인 프로테이나아제 유전자 침묵에 의한 재조합 목적 단백질의 증산 방법에 관한 것으로서, 구체적으로는 시스테인 프로테이나아제 유전자의 발현을 억제시키기 위해 RNAi (RNA interference) 기작을 이용하여 시스테인 프로테이나아제 유전자의 ihpRNA를 발현하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 식물세포, 현탁세포 배양배지에 시스테인 프로테이나아제의 분비를 억제시키는 방법, 및 상기 형질전환세포 및 재조합 목적 단백질의 형질전환체를 공동 현탁배양하여 재조합 목적 단백질의 생산을 증가시키는 방법에 관한 것이다.
인체 과립구 대식세포 콜로니 자극인자(human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor, hGM-CSF)는 과립구-대식세포 조상세포 집단을 자극하여 과립구, 대식세포, 및 두 중요한 백혈구가 생성되게 하는 4 개의 특정 당단백질 중의 하나이며 (Metcalf, 1985, Science 229:16-22), Lee et al. (1985, Proc Natl Acad Sci USA 82:4360-4364)에 의해 최초로 정제 및 클로닝되었다. hGM-CSF는 다수의 사이토카인 중 처음으로 분리된 것 중의 하나로 (Rasko & Gough, 1994, The cytokine Handbook. Academic Press, London, pp. 343-369), 성숙한 hGM-CSF은 127개의 아미노산으로 이루어져 있으며, 25 개의 소수성 리더서열을 포함하고 있다. 상기 사이토카인은 호중구감소증(neutropenia) 및 재생 불량성 빈혈(aplastic anemia)에 처치 시 임상적 효능이 있으며, 또한 호중성백혈구 수의 회복을 촉진하는 능력으로 인해 골수 이식과 관련된 감염 위험성을 상당히 줄인다 (Dale et al., 1995, J Infect Dis 172:1061-1075). GM-CSF는 대장균(Escherichia coli) (Libibby et al., 1987, DNA 6:221-229), 효모 (Balland et al., 1998, Eur J Biochem 251:812-820), 아스퍼질러스 니거(Aspergillus niger) (Kim et al., 2000, J Microbiol Biotechnol 10:287-29), 포유류 세포 (Chiou 및 Wu, 1990, FEBS Lett 259:249-253) 및 식물세포 (Lee et al., 1997, Mol Cells 7:783-787)를 포함한 다양한 시스템에서 발현되었으며, 현재 임상적 용도로 생산되고 있다. 특허출원된 것으로는 대한민국 특허 제86-700480호의 인체 과립구 대식 세포 및 호산성 세포 성장 인자 활성을 나타내는 폴리펩티드 및 재조합벡터, 제1989-10594호의 스트렙토마이세스 속으로부터 생체활성 인 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자(hGM-CSF) 및 기타 이종 단백질 분비를 위한 발현계, 제1989- 700478호의 사람의 과립구대식 세포 콜로니 자극 인자 및 이의 뮤테인, 제1990-21308호의 인간 과립성 백혈구 거식 세포- 군체 자극 인자 유전자가 있다.
최근에, 형질전환 식물세포 현탁 배양계가 항체, 효소, 호르몬, 생장인자, 및 사이토카인을 포함하여 이종 재조합 단백질 생산에 사용되고 있다 (Hellwig et al., 2004, Nat Biotechnol 22:1415-1422). 그러나 상기와 같이 식물에 외래 유전자의 도입을 통하여 외래 단백질을 생산하고자 하는 시도는 많이 있었으나 연구결과의 대부분이 식물의 세포 내에 외래 단백질을 축적시키는데 지나지 않았고, 외래 단백질의 축적비율도 대부분 1 %를 넘기지 못하고 있다. 또한, 식물현탁세포 배양을 이용하여 외래 단백질을 식물세포 밖으로 분비시켜 생산하는 경우에도 생산효율은 매우 낮아 일반적으로 식물세포 밖으로 분비되어 생산되는 재조합 단백질의 수율은 총 세포외 분비 단백질의 0.05 내지 0.5 %에 불과하여 생산량 역시 매우 낮은 실정이다 (James et al., 2000, Protein Expr. Purif. 19:131-138).
식물세포배양을 이용하여 외래 단백질을 생산하고자 할 때에 공통적으로 생산수율이 낮은 점이 식물세포배양 시스템의 문제점으로 지적되고 있다. 이러한 낮은 생산수율은 일반적으로 식물세포 밖으로 배출된 단백질이 배지 내의 pH, 염분농도 등과 같은 물리적인 요인에 의하여 변성이 일어나거나 단백질분해효소에 의하여 분해되어 단백질의 활성이 떨어지는 것으로 알려져 있다. 이러한 문제점을 극복하기 위한 방안으로서 생산된 단백질의 분해를 억제하고 단백질의 안정성을 증가시키기 위하여 단백질 안정제의 효과에 대하여 활발한 연구가 진행되고 있다. 일반적으로 식물세포 밖으로 분비된 단백질이 단백질분해효소에 의하여 분해되는 것을 방지하기 위하여 단백질 안정제를 사용하여 생산수율의 증가를 확인하고 있으나, 상기 단백질 안정제는 단백질의 종류에 따라서 안정화 정도에 큰 차이를 보이고, 식물세포배양 초기에만 효과가 있을 뿐 일반적으로 식물세포배양 5일 이후부터는 생산된 외래 단백질의 분해가 발생된다. 또한 단백질 안정제의 고농도 첨가에 의하여 식물세포의 생육이 억제되며, 일부 단백질 안정제의 첨가로 인해 외래단백질의 분리정제과정이 복잡해져 생산비의 상승이 초래된다.
상기 식물세포 배양계는 포유류 바이러스성, 발암성 및 세균성 독소 오염에 대한 위험성의 감소, 정제의 용이성, 저가의 식물 배양 배지, 및 생물학적으로 활성인 단백질 생산 및 항체를 포함한 다중결합 단백질 조립능을 포함하여 몇 가지 이점을 가진다 (Fischer et al., 1999, Biol Chem 380:825-839). 식물발현시스템은 유용한 외래 단백질의 발현에 있어서, 원핵세포 발현체계나 동물세포 발현체계 이상의 장점을 가진다 (Doran, 2000, Curr. Opin. Biotech. 11:199-204). 예를 들면, 식물세포는 저가의 비용으로 대량 배양할 수 있고, 식물세포에서 해독 후 수식(post-transitional modification)이 원핵세포에 비해 동물세포시스템에 매우 유사하다. 또한 식물세포배양으로 생산되는 단백질은 원핵세포시스템 또는 인체 과립구 대식세포 콜로니에 비하여 안전하고, 특히 사람의 질병치료에 사용되는 단백질의 생산에 있어서는 더욱 안전성이 입증되었다 (Doran, 2000, Curr. Opin. Biotech. 11:199-204). 따라서, 식물 배양계는 고가, 고순도, 특별한 재조합 단백질의 소량 내지 중간량 생산을 위한 최적 수단이다. 그러나, 단백질 분해가 식물세포 현탁 배양에 있어 외래 단백질의 고 수준 생산에 대한 제한인자였다. 식물세포 현탁 배양에 있어 이종 단백질 생산의 감소가 보고되었으며 (Schiermeyer et al., 2005, Biotechnol Bioeng 89:848-858), 끝이 잘린(truncated) 단백질 단편이 식물 단백질 추출물의 웨스턴 블럿 분석에서 검출되었다 (Russell et al., 2005, Biotechnol Bioeng 89:775-782). 이 같은 사실로, 식물세포 현탁 배양계에서 프로테아제의 분해에 대항해 분비 단백질을 보호하는, 프로테아제 활성의 저해가 결정적인 것으로 인식되었다. 따라서, 적절히 수행되기만 하면, 프로테아제 활성의 저해는 재조합 단백질 생산의 전반적인 증가를 초래한다.
siRNA(short interfering RNA)는 작은 이중선 RNA 단편 (21-25 뉴클레오티드)으로, RNase III-패밀리 효소인 다이서(Dicer)의 활성으로 생체 내에서 더 큰 이중선 RNA(dsRNA)로부터 생성된다 (Bernstein et al., 2001, Nature 409:363-366). 상기 siRNA는 RISC (RNA-induced silencing complex)로 통합된다. RISC는 서열 특이적 방식으로 단일선 목적 RNA를 분해하는 것으로 보였으며, 그 특이성은 siRNA의 서열에 의존적이었다 (Martinez et al., 2002, Cell 110:563-574). 상기 과정을 동물에서는 RNA 간섭 (RNA interference, RNAi)이라 하고, 식물에서는 전사 후 유전자 침묵 (post-transcriptional gene silencing, PTGS)이라 한다. RNAi는 다양한 세포에서 특정 유전자의 침묵을 위한 강력한 도구로 인식되어 왔다. 최근의 연구로 유전자를 효과적으로 침묵시키기 위해 ihpRNA(intron-containing self-complementary 'hairpin' RNA)를 발현하는 구축물의 제작이 가능해졌다 (Guo et al., 2003, Plant J 34:383-392).
식물세포배양을 이용하여 외래 단백질을 생산하고자 할 때에 생산수율이 낮은 점이 식물세포배양 시스템의 문제점이다. 이러한 낮은 생산수율이 배양배지로 분비된단백질분해효소에 의하여 외래 단백질의 분해로 인해 단백질의 활성이 떨어지는 것으로 알려져 있다. 이러한 문제점을 극복하기 위해 벼 세포 현탁 배양에서 주요 단백질분해요소인 시스테인 프로테이나아제 발현을 억제하기 위해 RNAi 전략을 이용하였다. 더욱이, RNAi 전략을 통한 프로테아제의 감소가 벼 세포 현탁 배양에 있어 재조합 목적 단백질의 생산을 향상시킬 수 있는지 확인하고자 하였다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은
5'에서 3' 방향으로
(a) 식물체의 구성적 프로모터;
(b) 시스테인 프로테이나아제 유전자의 센스 서열;
(c) 알파-아밀라아제 유전자의 첫 번째 인트론;
(d) 시스테인 프로테이나아제 유전자의 안티 센스 서열; 및
(e) 3' UTR을 포함하는 식물세포 발현용 벡터를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 식물세포를 제공한다.
또한, 본 발명은 식물세포 배양배지에서 당을 결핍시킨 배지 상에서, 상기 형질전환된 식물세포를 현탁배양하는 것을 포함하는, 배양배지에 시스테인 프로테이나아제의 분비를 억제시키는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은
(a) 상기 형질전환된 식물세포 및 재조합 목적 단백질의 형질전환체를 당 결핍 배지에서 공동 현탁배양하여, 시스테인 프로테이나아제의 분비가 억제된 상태로 재조합 목적 단백질을 공동발현하는 단계; 및
(b) 공동 현탁배양한 배양물로부터 재조합 목적 단백질을 분리하는 단계;
를 포함하는 식물세포를 이용한 재조합 목적 단백질의 생산을 증가시키는 방법을 제공한다.
상기에 언급한 바와 같이, 본 발명에서는 식물세포시스템에서 시스테인 프로테이나아제 유전자 발현의 억제를 통하여 인체 과식구 대식세포 콜로니 자극인자를 생물학적 활성이 높은 형태로 생산하는 시스템을 확립하였고, 이로 인하여 저가의 비용으로 생물학적 활성이 높은 인체 과식구 대식세포 콜로니 자극인자를 대량으로 생산할 수 있으며, 상기 시스템은 재조합 단백질을 이용한 의약품의 생산 공정에 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
5'에서 3' 방향으로
(a) 식물체의 구성적 프로모터;
(b) 시스테인 프로테이나아제유전자의 센스 서열;
(c) 알파-아밀라아제 유전자의 첫 번째 인트론;
(d) 시스테인 프로테이나아제유전자의 안티 센스 서열; 및
(e) 3' UTR을 포함하는 식물세포 발현용 벡터를 제공한다.
상기 프로모터는 숙주에 천연, 동종, 외래 또는 이종일 수 있으며, 또는 천연 서열이나 합성 서열일 수 있다. 외래는, 전사 개시 영역이 도입되는 야생형 숙주에서는 발견되지 않는 전사 개시 영역을 의미한다. "기능적 프로모터"는 목적 단백질을 코딩하는 서열에 작동가능하게 연결되었을 때, 또는 저해성 뉴클레오타이드 분자(예컨대, 헤어핀 RNA, 이중 가닥 RNA, miRNA 폴리펩타이드 등)를 코딩하는 저해성 서열에 작동가능하게 연결되었을 때, 코딩된 단백질의 발현(즉, 전사 및 번역)을 추진할 수 있는 프로모터를 의미하며, 프로모터는 상기 저해성 뉴클레오타이드 분자가 발현되도록 작동가능하게 연결된 저해성 서열의 전사를 시작할 수 있다. 프로모터는 원하는 결과에 따라 선택할 수 있다. 따라서, 본 발명의 발현 카세트는 구성적인(constitutive) 식물 발현용 프로모터를 포함할 수 있다.
본 발명에 따라, 당업계에 공지된 적합한 식물 프로모터를 사용할 수 있다. 프로모터의 예는, 콜리 플로워 모자이크 바이러스(Cauliflower Mosaic Virus)의 35S 프로모터, 오핀 신테타제(opine synthetase) 프로모터(예, nos, mas, ocs 등), 유비퀴틴 프로모터, 엑틴 프로모터, 리불로스 바이포스페이트(RubP) 카르복실라제 소형 서브유닛 프로모터, 및 알코올 데하이드로게나제 프로모터가 있으나, 이로 한정되는 것은 아니다. 개구리밥 RubP 카르복실라제 소형 서브유닛 프로모터가 당업 계에 공지되어 있다 (Silverthorne et al., 1990, Plant Mol. Biol. 15:49). 식물, 바람직하기로는 벼을 감염시키는 바이러스 유래의 그외 프로모터도 적합하며, 다센 모자이크 바이러스(Dasheen mosaic virus), 콜레라 바이러스(예, 콜레라 바이러스 아데닌 메틸트랜스퍼라제 프로모터; Mitra et al., 1994, Plant Mol. Biol. 26:85), 토마토 스팟 윌트 바이러스(tomato spotted wilt virus), 담배 래틀 바이러스(tobacco rattle virus), 담배 괴사 바이러스, 담배 링 스팟 바이러스(tobacco ring spot virus), 토마토 링 스팟 바이러스, 오이 모자이크 바이러스, 땅콩 스텀프 바이러스(peanut stump virus), 알파파 모자이크 바이러스, 사탕수수 바실리형 베드나바이러스(sugarcane baciliform badnavirus) 등을 포함하지만, 이로 한정되는 것은 아니다. 바람직하게는 콜리 플로워 모자이크 바이러스(Cauliflower Mosaic Virus)의 중복된 35S 프로모터 (du 35S-p)일 수 있다.
를 포함하는 식물세포 발현용 재조합 벡터로서
상기 알파-아밀라아제는 벼의 알파-아밀라아제 3D, 벼의 알파-아밀라아제 3E 또는 벼의 알파-아밀라아제 1A일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 3'UTR 부위는 mRNA 상에서 정지코돈 이후에 단백질로 번역되지 않는 mRNA 영역을 의미한다.
본 발명의 재조합 식물 발현 벡터는 외래 유전자를 도입한 식물체 내에서 일시적으로 발현시킬 수 있는 일시적 (transient) 발현 벡터 및 외래 유전자를 도입된 식물체에서 영구적으로 발현시킬 수 있는 식물 발현 벡터로 사용할 수 있다.
본 발명에 이용될 수 있는 바이너리 벡터는 A. tumefaciens의 Ti 플라스미드 와 함께 존재 시 식물체를 형질전환시킬 수 있는 T-DNA의 RB (right border)과 LB (left border)을 함유하는 어떤 바이너리 벡터도 될 수 있으나, 바람직하게는 당업계에서 자주 사용되는 pBI101(Cat#: 6018-1, Clontech, 미국), pBIN19(Genbank 수탁번호 U09365), pBI121, pCAMBIA 벡터 등을 사용하는 것이 좋다.
용어 "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 용어 "전달체"는 흔히 "벡터"와 호환하여 사용된다. 용어 "발현 벡터"는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다. 진핵세포에서 이용가능한 프로모터, 인핸서, 종결신호 및 폴리아데닐레이션 신호는 공지되어 있다.
식물 발현 벡터의 바람직한 예는 아그로박테리움 투머파시엔스와 같은 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부, 소위 T-영역을 식물 세포로 전이시킬 수 있는 Ti-플라스미드 벡터이다. 다른 유형의 Ti-플라스미드 벡터(EP 0 116 718 B1호 참조)는 현재 식물 세포, 또는 잡종 DNA를 식물의 게놈 내에 적당하게 삽입시키는 새로운 식물이 생산될 수 있는 원형질체로 잡종 DNA 서열을 전이시키는데 이용되고 있다. Ti-플라스미드 벡터의 특히 바람직한 형태는 EP 0 120 516 B1호 및 미국 특허 제4,940,838호에 청구된 바와 같은 소위 바이너리(binary) 벡터이다. 본 발명에 따른 유전자를 식물 숙주에 도입시키는데 이용될 수 있는 다른 적합한 벡터는 이중 가닥 식물 바이러스(예를 들면, CaMV) 및 단일 가닥 바이러스, 게미니 바이러스 등으로부터 유래될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터, 예를 들면 비완전성 식물 바이 러스 벡터로부터 선택될 수 있다. 그러한 벡터의 사용은 특히 식물 숙주를 적당하게 형질전환 하는 것이 어려울 때 유리할 수 있다.
발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함한다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 글리포세이트(glyphosate) 또는 포스피노트리신과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신, G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페니콜(chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 식물 발현 벡터에서, 터미네이터는 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 노팔린 신타아제(NOS), 벼 α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 파세올린(phaseoline) 터미네이터, 아그로박테리움 튜머파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)의 옥토파인(Octopine) 유전자의 터미네이터 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
더욱 구체적으로, 본 발명의 벡터는 도2에 기재된 pMYP108 또는 pMYP109인 식물발현용 재조합 벡터이다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 본 발명의 재조합 식물 발현 벡터로 형질전환된 대장균(E. coli) 또는 아그로박테리움 튜머파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens)를 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 본 발명의 재조합 식물 발현 벡터로 형질전환된 식물체를 제공한다.
본 발명의 재조합 식물 발현 벡터는 쌍자엽 혹은 단자엽 식물에 상관없이 어떤 식물체도 형질전환시킬 수 있으나, 본 발명에서는 벼 (Oryza sativa L. cv. Dongin)에서 형질전환을 실시하였다. 본 발명의 일 구현예에 따른 상기 식물체는 예컨대 담배, 벼, 감자, 토마토, 상추 또는 고구마를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
식물의 형질전환은 DNA를 식물에 전이시키는 임의의 방법을 의미한다. 그러한 형질전환 방법은 반드시 재생 및(또는) 조직 배양 기간을 가질 필요는 없다. 식물 종의 형질전환은 이제는 쌍자엽 식물뿐만 아니라 단자엽 식물 양자를 포함한 식물 종에 대해 일반적이다. 원칙적으로, 임의의 형질전환 방법은 본 발명에 따른 잡종 DNA를 적당한 선조 세포로 도입시키는데 이용될 수 있다. 방법은 원형질체에 대한 칼슘/폴리에틸렌 글리콜 방법 (Krens et al., 1982, Nature 296:72-74; Negrutiu et al., 1987, Plant Mol. Biol. 8:363-373), 원형질체의 전기천공 법(Shillito et al., 1985, Bio/Technol. 3:1099-1102), 식물 요소로의 현미주사법 (Crossway et al., 1986, Mol. Gen. Genet. 202:179-185), 각종 식물 요소의 (DNA 또는 RNA-코팅된) 입자 충격법(Klein et al., 1987, Nature 327:70), 식물의 침윤 또는 성숙 화분 또는 소포자의 형질전환에 의한 아그로박테리움 튜머파시엔스 매개된 유전자 전이에서 (비완전성) 바이러스에 의한 감염(EP 0 301 316호) 등으로부터 적당하게 선택될 수 있다. 본 발명에 따른 바람직한 방법은 입자 충격법을 이용한 DNA 전달을 포함한다.
식물의 형질전환에 이용되는 "식물 세포"는 어떤 식물 세포도 된다. 식물 세포는 배양 세포, 배양 조직, 배양 기관 또는 전체 식물, 바람직하게는 배양 세포, 배양 조직 또는 배양 기관 및 더욱 바람직하게는 배양 세포의 어떤 형태도 된다.
"식물 조직"은 분화된 또는 미분화된 식물의 조직, 예를 들면 이에 한정되진 않으나, 열매, 줄기, 잎, 꽃가루, 종자, 암 조직 및 배양에 이용되는 다양한 형태의 세포들, 즉 단일 세포, 원형질체(protoplast), 싹 및 캘러스 조직을 포함한다. 식물 조직은 인 플란타(in planta)이거나 기관 배양, 조직 배양 또는 세포 배양 상태일 수 있다.
형질전환된 식물체는 식물세포를 캘러스 상태로 증식시켜 현탁배양에 이용하거나, 식물세포로부터 조직 또는 식물체로 분화시킨 후 분화된 조직 또는 식물체로부터 캘러스를 유도하여 형질전환된 식물세포를 수득하고 이를 현탁배양에 이용할 수 있다. 상기 당이 결핍된 배지는 통상의 식물세포 현탁배양용 배지일 수 있으며, 예컨대 N6 배지, SH 배지, MS 배지, AA 배지 및 LS 배지로 이루어진 군으로부터 선택된 1종의 배지에 당을 제외한 조성일 수 있다. 바람직하게는 자당이 포함된 배지에서 형질전환체를 배양하여 현탁세포를 생장시킨 후 자연적인 배지 내 자당 고갈로 재조합 단백질이 발현되도록 하거나, 자당이 포함된 배지에서 균체 생장 후 자당이 결핍된 배지로 교체하여 배양하는 것이 좋다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 식물세포 배양배지에서 당을 결핍시킨 배지 상에서, 상기 형질전환된 식물세포를 현탁배양하는 것을 포함하는, 배양배지에 알파-아밀라아제의 분비를 억제시키는 방법을 제공한다.
상기 당은, 슈크로즈, 글루코스 및 프록토스일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 현탁배양배지는 통상의 식물세포 배양을 위한 액체배지로, 일 예로 N6 배지 (Chu et al., 1975, Scienta Sinica 18:659-664), SH 배지 (Schenk et al., 1972, Can. J. Bot. 50:199-206), MS 배지 (Murashige et al., 1962, Physiol. Plant 15:473-479), AA 배지 (Thompson et al., 1986, Plant Sci. 47:123-133) 및 LS 배지 (Linsmaier et al., 1965, 18:100-107)가 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 식물세포는 통상의 모든 종류의 식물세포일 수 있으며, 예컨대 담배, 벼, 감자, 토마토, 상추 또는 고구마를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
(a) 상기 형질전환된 식물세포 및 재조합 목적 단백질의 형질전환체를 당 결핍 배지에서 공동 현탁배양하여, 시스테인 프로테이나아제의 분비가 억제된 상태로 재조합 목적 단백질을 공동발현하는 단계; 및
(b) 공동 현탁배양한 배양물로부터 재조합 목적 단백질을 분리하는 단계;
를 포함하는 식물세포를 이용한 재조합 목적 단백질의 생산을 증가시키는 방법을 제공한다.
상기 당, 현탁배양배지 및 식물세포는 상기 언급한 바와 같다.
본 발명에서의 상기 목적 단백질은 인체 과립구 대식세포 콜로니 자극인자(human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor, hGM-CSF, hGM-CSF)이나 이에 한정되지 않으며, 예컨대 GM-CSF, hIL-12, hIL-18, G-CSF, t-PA, EGF, GH, BMP-2, BMP-7, OPG 및 항체가 포함되나 이에 한정되는 것은 아니다.
"분비"는 본원에서 숙주 세포의 세포막(plasma membrane) 및 세포벽 양자를 통과하는 폴리펩타이드의 전좌를 의미한다. 용어 "억제"는 본원에서 발현 또는 기능의 임의의 상대적인 감소 및 타겟 유전자 산물의 발현 또는 기능의 완전한 저지 등의, 타겟 유전자 산물의 발현 또는 기능의 임의 감소를 의미한다. 용어 "발현"은, 본원에서 유전자 산물 측면에서 유전자 산물의 전사 및/또는 번역 및/또는 조합 등의 유전자 산물의 생합성을 의미한다. 타겟 유전자(즉, 원하는 유전자 산물) 산물의 발현 또는 기능의 억제는, 임의의 2 종의 식물들 간의 비교 측면에서, 예컨대 유전자 변형된 식물에서의 타겟 유전자 산물의 발현 또는 기능 대 대응되는 야생형 식물에서의 타겟 유전자 산물의 발현 또는 기능일 수 있다. 다른 예로, 타겟 유전자 산물의 발현 또는 기능의 억제는 동일한 식물내, 또는 식물들간의 식물 세포, 세포 기관(organelle), 기관(organ), 조직 또는 식물의 일부분의 비교일 수 있으며, 동일 식물내에서나 또는 식물들 간의 발생 단계 또는 시기적 단계 비교를 포함한다. 전사 또는 번역 수준에서 타겟 유전자 산물의 발현을 하향 조절하거나, 또는 타겟 유전자 산물의 기능적 활성을 하향 조절하는 임의 방법 또는 조성물을 사용하여, 타겟 유전자 산물의 발현 또는 기능의 억제를 달성할 수 있다.
본 발명은 분리되거나 또는 실질적으로 정제된 폴리뉴클레오타이드 또는 단백질 조성물을 포함한다. "분리된" 또는 "정제된" 폴리뉴클레오타이드 또는 단백질, 또는 이의 생물학적으로 활성인 부분은, 이의 자연적으로 생성되는 환경에서 발견되는 폴리뉴클레오타이드나 단백질을 정상적으로 수반하거나 이와 상호작용하는 구성 요소가 실질적으로 또는 본질적으로 결여되어 있다. 따라서, 분리된 또는 정제된 폴리뉴클레오타이드 또는 단백질은 재조합 기법에 의해 생산되었을 때 다른 세포성 물질이나 배양 배지가 실질적으로 결여되어 있거나, 또는 화학적으로 합성하였을 때 화학적 전구체나 다른 화합물이 실질적으로 결여되어 있다. 선택적으로, "분리된" 폴리 뉴클레오타이드는 상기 폴리뉴클레오타이드가 유래된 유기체의 게놈 DNA에서 천연적으로 상기 폴리뉴클레오타이드에 측면에 위치한 서열(선택적으로는 단백질 코딩 서열)(즉, 상기 폴리뉴클레오타이드의 5' 및 3' 말단에 있는 서열)이 없는 상태이다. 예컨대, 다양한 예로, 분리된 폴리뉴클레오타이드는 상기 폴리뉴클레오타이드가 유래된 세포의 게놈 DNA에서 천연적으로 상기 폴리뉴클레오타이드의 측면으로 위치하던 뉴클레오타이드 서열 보다 약 5 kb, 4 kb, 3kb, 2 kb, 1 kb, 0.5 kb 또는 0.1 kb 미만으로 짧은 서열을 포함할 수 있다. 실질적으로 세포성 물질이 결여된 단백질은 오염 단백질이 약 30%, 20%, 10%, 5%, 또는 1%(건조 중량) 미만으로 있는 단백질 조제물을 포함한다. 본 발명의 단백질 또는 이의 생물학적으로 활성인 부분을 재조합으로 생산하는 경우, 최적으로는, 배양 배지는 화학적 전구체나 원하는 단백질 이외의 화합물(non-protein-of-interest chemical)을 약 30%, 20%, 10%, 5%, 또는 1%(건조 중량) 미만으로 나타낸다.
본 발명의 식물세포를 이용한 재조합 단백질 생산방법은, 또한 형질전환체로부터 발현 및 분비된 재조합 단백질은, 현탁배양한 배양액으로부터 통상의 방법, 즉 원심분리, 투석, 크로마토그래피 등의 방법으로 분리 및 정제할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
재료 및 방법
1. 세포 현탁 배양
벼 캘러스는 회전 교반기를 사용하여 회전 속도 110 rpm으로 28℃, 암소에서 배양되었다. 세포 라인 유지를 위해, 세포 현탁액은 2 mg/ℓ 2,4-디클로르페녹시아세트산 (2,4-dichlorophenoxy acetic acid, 2,4-D), 0.02 mg/ℓ 키네틴, 및 3% 서당이 함유된 N6 배지 (Thompson et al., 1986, Plant Sci 47:123-133)를 사용하여 300 ㎖ 플라스크에서 배양되었다. 10 ㎖ 접종물을 9일 마다 계대배양하였다. Ramy3D 프로모터의 통제 하에 트랜스진 발현을 유도하기 위해, 세포 현탁액으로부터 흡입으로 N6 배지를 제거하고, 세포를 새 N6(S-) 배지(서당이 없는)에 10% (젖은 세포 중량/배지 용량) 용량이 되게 옮겼다.
2. 단백질 침전
세포 현탁 배양액 내의 총 분비 단백질을 페놀 추출법 (Saravanan 및 Rose, 2004, Proteomics 4:2522-2532)으로 준비했다. 벼 현탁 배양 배지를 미라크로스(Miracloth) (Calbiochem, La Jolla, CA)로 여과 및 수집하여, 물로 포화된 페놀 (pH 8.0) 동량으로 추출하였다. 단백질 추출물을 페놀로부터 수집하여, -20℃, 메탄올에서 100 mM 포화 암모늄 아세테이트 5 배로 30 분간 침전시켰다. 단백질 펠렛 을 80% 냉 아세톤으로 수세하고, 2-5 분간 기건하여, 용해 버퍼 (우레아(urea) 0.54 g, 10% nonidet P-40 200 ㎕, 2 M DTT 60 ㎕, 40% 양성전해질, pH 3-10, 75 ㎕, 최종 용량 1 ㎖)에 용해하였다. 총 단백질의 농도는 Non-Interfering Protein Assay Kit (Upstate, Lake Placid, NY)를 사용하여 제조자의 지침에 따라 결정되었다.
3. 이차원 겔 전기영동 (2- DE )
단백질은 O'Farrell (1997, J Biol Chem 250:4007-4021)을 약간 변형한 방법에 따라 2-DE로 분리되었다. 단백질은 제조자의 지침에 따라 IEF (Mini Protein II Tube Cell, Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)로 일차원으로 분리되었다. 겔은 9.5 M 우레아(urea), 2% (v/v) nonidet P-40, 4% (총 모노머) 아크릴아마이드 : 비스(bis), 2% (v/v) 양성전해질 (pH 3-10), 0.015% 암모늄 퍼슐페이트 및 0.125% TEMED를 함유한다. 시료 (단백질 800 ㎍)를 EF 겔의 산성 말단에 로딩하여, 5 M 우레아(urea)를 덮었다. 일차원은 400 V에서 20 시간 동안 수행되었다. 각 포커싱 된(focused) 겔을 5 ㎖ 평형 버퍼 [10% (v/v) 글리세롤(glycerol), 2.5% (w/v) SDS, 125 mM TrisHCl (pH 6.8), 5% (v/v) 베타-머캅토에탄올(β-mercaptoethanol), 및 0.1 mg/㎖ 브로모페놀블루(bromophenol blue)]에 두었다. 단백질은 Laemmli (1970, Nature 227:680-685)의 기재에 따라 SDS-PAGE(dodecylsulfonate polyacrylamide gel electrophoresis)로 이차원 분리되었다. 2-DE 겔은 0.25% (w/v) 쿠마씨(Coomassie brilliant blue) R-250로 염색되었다.
4. 트립신 분해
염색된 단백질 반점의 겔 내(in-gel) 단백질 분해를 위해, 반점을 잘라내어 pH 8.0, 50 mM 암모늄 바이카보네이트(ammonium bicarbonate)에서 50% 아세토니트릴(acetonitrile)로 탈염하여, 완전히 탈수시켰다. 연이어, 겔 조각은 DTT로 환원되어 아이오도아세트아마이드(iodoacetamide)로 알킬화되었다. 겔 조각은 트립신 (Promega, Madison, WI) 1 ㎍/반점이 함유된 3 ㎕ 분해 버퍼 (50 mM ammonium bicarbonate, pH 8.0)에서 팽창되었다. 얼음에 45 분 배양 후, 효소가 없는 분해 버퍼 10 ㎕를 단백질 반점에 첨가하여, 시료를 30℃에서 16 시간 두었다. 겔 조각은 물에서 0.1% TFA로 20 분간 2 회 추출 후, 가용성 부분을 모아 0.1% TFA에서 50% 아세토니트릴(acetonitrile)로 2 회 추출하였다. 해당 부분을 모아 건조시켰다. 최종 펠렛(pellet)은 대부분의 트립신 펩티드(tryptic peptide)를 함유하며, 연이은 LC/MS/MS 분석에 사용되었다.
5. 시료 LC / MS / MS 분석
이온이 제거된 물 및 HPLC 급 아세토니트릴(acetonitrile)이 eluents의 준비에 사용되었다. NanoLC 1D system (Eksigent Technologies, Livermore, CA)으로 크로마토그래프 분리가 수행되었다. 시료 (6 ㎕)를 150 ㎛ x 150 mm column (Vydac 218MS5, 1515, Grace Vydac, Hesperia, CA)에 직접 주입하여, 100% 아세토니트릴(acetonitrile) (0.1% formic acid)의 linear gradient로 120 분간 용출하였다. 개별 분해물 각각으로부터의 반점을 Q-TOF 질량분석기 (QSTAR XL, Applied Biosystems/MDS Sciex, Foster City, CA)를 사용하여 이중 질량분석 (MS/MS)으로 분석하였다. 손으로 만든 초미립화(Nanospray) source가 시료의 이온화에 사용되었다. 분사 바늘(spray needle) (15 ㎛ PicoTip, New Objective, Inc., Woburn, MA)이 초미립화에 사용되었으며, 이온화를 위해 2,000 V의 전류가 적용되었다. 시료는 100-2,000의 m/z 범위에서 분석되었으며, MS/MS 분석에 2-4 개의 양전하를 띤 펩티드가 사용되었다. 'Rolling Collision Energy'의 자동 결정을 위해 내장된 IDA 방법이 사용되었다. 상기의 경우, 소프트웨어는 사전 정의된 것으로서, 정상적인 트립신 펩티드의 단편화에 최적화된 것이다. 단백질 동정을 위해, Pro ID (MDS SCIEX, Ontario, CA)가 사용되었다. NCBI FASTA 서열 데이타베이스 파일을 컴퓨터에 다운로드 받아, 해독 변형 펩티드를 검출하기 위해 질문 검색 데이터베이스를 만들었다.
6. CysP 유전자의 클로닝 및 식물 벡터 구축
CysP 유전자를 클로닝하기 위해, 총 RNA를 제조자의 지침에 따라 TRIzol 시약 (Invitrogen, Carlsbad, CA)을 사용하여 AA 배지 (질소 없이) (Ho et al., 2000, Plant Physiol 122:57-66)에서 키운 벼 현탁 세포로부터 분리하였다. CysP cDNA (GeneBank accession no. AB004819)의 증폭을 위해 역 전사 PCR (RT-PCR)을 하기의 특정 프라이머: RCP F2 프라이머 5'-GCA GCT GGA GGG TTC TTG CGG TGG TGG CTG-3' (서열 번호 1) 및 RCP R2 프라이머 5'-AGG CGG GCA CGT GTA CGG CGG AGA TG-3' (서열 번호 2)로 수행하였다. 생성된 1.2-kb PCR 산물은 pGEM-T Easy 벡터 (Promega, Madison, WI)로 클로닝 되었다. 상기 플라스미드가 DNA RNAi 트리거 1 (센스 스트랜드) 및 2 (안티 센스 스트랜드) 생성을 위한 주형으로 사용되었으며, 하기 프라이머가 사용되었다: 정방향 프라이머 트리거 1, RCP F3 5'-GGA TCC GCA GAG AGG AGT TCC GCG CCA CGT TC-3' (서열 번호 3), 정방향 프라이머 트리거 2, RCP F4 5'-GGT ACC GCA GAG AGG AGT TCC GCG CCA CGT TC-3' (서열 번호 4), 및 역방향 프라이머 트리거 1 및 2, RCP R2-1 5'-CCA TGG CGA TGC CGC AGA GGC CGC-3' (서열 번호 5). BamHI, KpnI, 및 NcoI (밑줄 침) 제한효소 절단부위가 트리거 1 및 2의 각 프라이머에 포함되었다. 트리거 1 또는 2를 포함하는 740 bp PCR 산물이 pGEM-T Easy 벡터로 클로닝되었다. 벼 알파-아밀라아제 3D 유전자의 첫 번째 인트론이 인트론 함유 중간물 구축용으로 선정되어, 하기 두 프라이머 (3D 링커-F1 5'-CCA TGG AGG TAC GTA GTA CTC TAC TAC CCA TCA C-3' (서열 번호 6) 및 3D 링커-R1 5'-CCA TGG CCC TGC ATG ATG CAT GTT ATA AGT AGG TAA G-3' (서열 번호 7))를 사용하여 PCR 증폭되었다. NcoI (밑줄 침) 제한효소 절단부위가 프라이머에 포함되었다. 140 bp PCR 단편이 pGEM-T Easy 벡터로 클로닝 되었다.
식물세포에서 CysP의 ihpRNA의 발현을 위한 구축물을 제작하기 위해, 트리거 1 단편 (740 bp)을 트리거 2에 NcoI 제한효소를 사용하여 라이게이션하고, Ramy 3D 첫 번째 인트론 (140 bp)을 링커로서 트리거 1 및 2 사이 NcoI 제한효소 부위에 삽입하였다 (도 2). CysP의 ihpRNA를 발현하는 유전자를 포함하는 상기 생성된 DNA 단편을 BamHI 및 KpnI로 절단하여, 중복 CaMV 35S 프로모터 및 종료암호로서 3'UTR 하에 있는 식물 발현 벡터, pCAMBIA1300 (Hajdukiewicz et al., 1994, Plant Mol Biol 25:989-994)의 동일한 부위에 도입하였다. 상기 식물 발현 벡터를 pMYP108라 하며, 이에는 식물 형질전환을 위한 선발 표지로서 하이그로마이신 포스포트란스퍼라아제 유전자 (hygromycin phosphotransferase gene, hpt)가 포함되어 있다 (도 2).
7. 벼 형질전환
벼 캘러스 (Oryza sativa L. cv. Dongin)를 준비하여 입자 충격 매개된 형질전환(particle bombardment-mediated transformation)(Chen et al., 1998, Nat Biotechnol 16:1060-1064)으로 형질전환하였다. 식물 발현 벡터, pMYP108로 충격 후, 캘러스를 선발 N6 배지 (Chu et al., 1975, Sci Sin 18:659-668)로 옮겨, 매 2-3 주마다 2 mg/ℓ 2,4-D, 30 g/ℓ 서당, 및 50 mg/ℓ 하이그로마이신 B를 보충하였다. hGM-CSF (Shin et al., 2003, Biotechnol Bioeng 82:778-783)를 발현하는 형질전환 벼 캘러스는 pMYP109로 형질전환되었으며, 하이그로마이신 B 및 포스피노트리신 (phosphinothricin, PPT)이 함유된 선발 배지에서 선발되었다.
형질전환 캘러스는 상기 ''1. 세포 현탁 배양''에 기재된 방법과 동일하게 현탁 배양되었다. 형질전환 세포 현탁 배양에서 트랜스진의 발현을 유도하기 위해, 배양 배지의 형질전환 벼 세포를 흡입으로 수집하여, 5 g의 벼 세포를 50 ㎖의 새 N6(S-) 배지에 접종하였다.
8. 프로테아제 활성
프로테아제 활성 분석은 Lee et al. (2002, J Biotechnol 96:205-211)의 기재에 따라 수행하였다. 배양 상등액 총 200 ㎕를 0.2 M TrisHCl, pH 5.8에서 1% 카제인 가수분해물 (USB, Cleveland, OH) 200 ㎕와 배양하고, 28℃에서 1 시간 배양하였다. 반응은 0.4 M 냉 TCA(trichloroacetic acid) 600 ㎕를 첨가하여 종결시켰다. 이어서, 4℃에서 5 분 배양하여, 침전 단백질을 15,000 X g에서 5 분 원심분리하여 제거하고, TCA-가용성 부분의 광학 밀도를 280 nm에서 측정하였다. 1 unit의 활성은 본 발명에 사용된 분석 조건 하에서 280 nm에서 흡수도 0.01의 증가에 필요한 효소의 양으로 정의되었다.
9. 시스테인 프로테이나아제 활성
특정 시스테인 프로테이나아제 (CysP) 기질, Z-Arg-Arg-ρ-NAㆍ2HCl (Z=Cbz=Benzyloxycarbonyl; ρ-NA=ρ-nitroanilide) (BachemBioscience Inc., King Prussia, PA)이 Barret 및 Kirschke (1981, Methods Enzymol 80:535-561)의 기재에 따라 CysP 활성 결정에 사용되었다. 기질, Z-Arg-Arg-ρ-NAㆍ2HCl이 ρ-NA의 유리를 위해 가수분해되었으며, 이는 410 nm에서의 흡수도로 정량화될 수 있다. 프로테아제 활성을 측정하기 위해 서당 결핍 유도 6일 후 채취한 벼 현탁 배양 상등액 (100 ㎍/200 ㎕)으로의 총 분비 단백질의 양을 조정하기 위해, 배양 배지는 Centricon YM-10 Centrifugal Unit (Millipore, Billerica, MA)를 사용하여 농축되었다. 총 200 ㎕ 배양 상등액(총 분비 단백질 100 ㎍)에 100 ㎕ 프로테이나아제 반 응 버퍼 (340 mM sodium acetate, 60 mM 초산, 4 mM disodium EDTA, 및 8 mM DTT)를 첨가하였다. 온도 평형 및 효소 활성화를 위해, 용액을 30℃에서 1 분간 가열하였다. 평형 후, 디메틸 술폭사이드(dimethyl sulfoxide)에 CysP 기질 Z-Arg-Arg-ρ-NAㆍ2HCl의 20 μM 용액 100 ㎕를 첨가하였다. 30℃에서 10 분 후, 400 ㎕ 중지액 (100 mM sodium trichloroacetate, 30 mM sodium acetate, 70 mM 초산, pH 4.3)을 첨가하였다. ρ-NA의 유리를 지속적으로 분광광도계 (Shimadzu Corp., Japan)로 410 nm에서 10-60 초 동안 추적하였다.
10. 노던 블럿 분석
총 RNA를 서당 결핍으로 유도 6일째, 제조자의 지침 따라 TRIzol 시약을 사용하여 N6 및 N6(S-) 액체 배지에서 키운 현탁 세포로부터 분리하여, 당 업계에 공지된 방법으로 포름알데하이드 함유 아가로즈 겔 상에서 전기영동으로 분리하였다. 분리된 RNA를 Hybond N+ membrane (Amersham Pharmacia Biotech RPN82B, Piscataaway, NJ)으로 옮겨, 상기 membrane을 Prime-a-Gene labeling system (Promega U1100, Madison, WI)을 사용하여 32P로 표지된 CysP 프로브와 혼성화 배양기 (FINEPCR Combi-H, Seoul, Korea)를 사용하여 65℃에서 혼성화하였다. 혼성화 후 membrane을 2x SSC 및 0.1% SDS2로 2 회 수세하고, 2x SSC 및 1% SDS로 각각 65℃에서 15 분간 2 회 수세하였다. 혼성화 밴드는 X-ray 필름 (Fuji Photo Film Co. HR-G30, Tokyo, Japan) 상에서 자기방사법으로 검출되었다.
11. siRNA 검출
CysP 특이적 siRNA를 검출하기 위해, 총 RNA를 제조자의 지침에 따라 TRIzol 시약을 사용하여 형질전환 현탁 세포로부터 추출하였다. 고분자량 핵산은 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol) (M.W., 8,000) 및 소듐 클로라이드(sodium chloride)를 최종 농도 각각 5% 및 500 mM까지 첨가하여 침전으로 제거되었다. 저분자량 핵산이 함유된 상등액은 소듐 아세테이트 에탄올(sodium acetate-ethanol) 침전으로 침전되었다. 저 분자량 핵산은 안티 센스 유전자가 포함된 선형화된 pGEM-T 플라스미드로부터 RiboMAXTM Large Scale RNA Production System-T7 (Promega, Madison, WI)을 사용하여 시험관 내(in vitro) 전사를 통해 합성된 32P 표지된 전사체로 혼성화되었다. RNase 효소 혼합물 (RNase A and RNase T1)을 첨가하여, 30℃에서 24 시간 배양하였다. 보호된 RNA 프로브는 7 M 우레아(urea)가 함유된 15% 폴리아크릴아마이드 겔에서 분리되어, X-ray필름 (Fuji Photo Film Co., HR-G30, Tokyo, Japan)에 노출되었다.
12. 재조합 hGM - CSF 의 정량적 및 웨스턴 블럿 분석
hGM-CSF 및 CysP의 ihpRNA 양자를 발현하는 형질전환 벼 세포 현탁 배양물에서 서당 결핍 조건으로 재조합 hGM-CSF 생산의 유도 후, 현탁액을 15,000 X g에서 3 분간 원심분리하였다. 배양 상등액 시료 1 ㎖를 인산염 식염수(phosphate buffered saline)에 대해 4℃에서 밤새 투석하였다. 재조합 hGM-CSF의 농도는 hGM-CSF 특이적 ELISA 키트 (Endogene, Woburn, MA)로 제조자의 지침에 따라 결정되었다.
배양 상등액 단백질 시료를 12% SDS-PAGE에서 분리하여, 분리된 밴드를 니트로셀룰로오즈 필터로 블럿하였다. 5% 탈지우유로 차단(blocking)하여, 필터를 쥐 단일클론 항-hGM-CSF 항체 (Pharmingen Inc., San Diego, CA)와 배양하고, 이차 항체로서 알칼라인 포스파타아제 (Sigma, St. Louis, MO)와 접합된 염소 항-쥐 IgG와 배양하였다. TMN 버퍼에서 BCIP/NBT (USB 102185-33-1 및 USB 2x8-83-9, Cleveland, OH)로 발색하였다.
실시예
실시예 1. 벼 현탁 배양물에서 분비 프로테아제의 동정
벼 세포 현탁 배양물에서 서당 결핍으로 유도 6일째 분비 프로테아제를 동정하기 위해 이차원 전기영동 (2-DE) 및 반점 동정을 수행하였다. PDQuest 프로그램 (Bio-rad)을 사용한 컴퓨터 이미지 분석으로 37 개의 단백질 반점을 선정하였다. pI 5.3 및 질량 44-46 kDa에 위치한 벼 알파-아밀라아제 패밀리 반점 및 pI 10에 위치한 큰 중첩된 반점은 제외되었다. 내부 아미노산 서열은 ESI/Q-TOF 질량분석으로 결정되었다. 벼 키티나아제 class I 전구체, 리셉터 유사 단백질 키나아제 추정체, 리보뉴클레아제, 앤키린(ankyrin) 반복체 단백질 패밀리 유사 단백질, 베타-1,3-글루카나아제(beta-1,3-glucanase) 추정체 및 파이토시아닌(phytocyanin) 관련 단백질 추정체가 동정되었다 (도 1). 37 개의 반점 중 8 개가 Rep1 및 EP3A에 의해 암호화되는 벼 시스테인 엔도펩티다아제 (CysP)로 동정되었다 (Table 1).
실시예 2. CysP 의 ihpRNA 를 발현하는 식물 발현 벡터 구축
CysP 유전자의 발현은 발아 종자에서는 호르몬으로, 영양조직에서는 공간적 및 시간적으로, 및 현탁세포에서는 질소에 의해 조절된다 (Ho et al., 2000, Plant Physiol 122:57-66). 벼 CysP cDNA는 현탁 배양배지 (질소 없는)에서 수집된 벼 캘러스에서 추출된 총 RNA로부터 벼 CysP 특이적 프라이머로 역전사 PCR (RT-PCR)에 의해 증폭되었다. 벼 CysP를 암호화하는 cDNA는 1.2-kb 단편이었으며, 추정 아미노산 서열은 벼 CysP의 보고된 서열과 99% 유사하였다.
CysP의 ihpRNA를 발현하는 유전자는 센스 스트랜드 (트리거 1), Ramy3D 첫 번째 인트론, 및 안티센스 스트랜드 (트리거 2)로 구성되며, 중복 CaMV 35S 프로모터 및 3'UTR 종료암호 사이에 위치한다. 당 이용성에 반응하여, mRNA 안정성의 유력한 결정자로 작용하는 (Chan 및 Yu, 1998, Plant J 15:685-695; Proc Natl Acad Sci USA 95:6543-6547) (도 2) 상기 식물 발현 벡터는 pMYP108라 하며, 선발 표지로서 하이그로마이신 포스포트란스퍼라아제(hpt) 유전자를 함유한다. 형질전환 벼에서 hGM-CSF 및 CysP의 ihpRNA의 공동발현을 위해, pMYP108로부터 CysP의 ihpRNA를 발현하는 유전자를 함유한 DNA 단편을 바이너리 벡터, pCAMBIA3300로 옮겼으며, 상기 벡터는 선발 표지로서 hpt가 아닌 바(bar)유전자를 함유하며, 상기 식물 발현 벡터를 pMYP109라 하였다. pMYP109가 hGM-CSF 및 선발 표지로서 hpt 유전자를 포함 하는 형질전환 벼 캘러스로 형질전환되었다 (Shin et al., 2003, Biotechnol Bioeng 82:778-783) (도 2).
실시예 3. CysP 의 ihpRNA 를 함유한 형질전환 벼 현탁물에 있어 프로테아제의 활성
벼 캘러스는 재조합 식물 발현 벡터, pMYP108로 입자 충격법으로 형질전환되었다. 형질전환 캘러스에서 CysP의 ihpRNA를 발현하는 유전자는 CysP 특이적 프라이머 (자료 미제시)를 사용한 게놈 DNA-PCR 분석으로 검출되었다. 서당 결핍으로 유도 6일째 현탁 배양액의 프로테아제 및 CysP 특이적 활성을 평가하기 위해 14 개의 형질전환 라인을 선발하였다. 형질전환 라인 7, 8, 9, 및 12에서 총 프로테아제의 활성 수준은 야생형에 비해 감소된 단백질 분해 활성을 보였으며, 형질전환 라인 12에서 최저 수준의 단백질 분해 활성이 관찰되었다 (도 3). 더욱이, 시스테인 (papain 유사) 프로테아제에 의해 가수분해되는 것으로 알려진 Arg 특이적 기질, Z-Arg-Arg-pNA를 CysP 활성을 추정하기 위해 사용하였다. CysP 특이적 활성의 분석은 총 프로테아제 활성 분석과 유사하였으며, 최저 수준의 CysP 활성은 형질전환 라인 12에서 관찰되었다 (도 3).
실시예 4. CysP mRNA 및 단백질의 감소
야생형 벼 세포에 비해 형질전환 벼 세포에서 RNAi에 의한 CysP mRNA 축적의 감소가 형질전환 벼 라인 7, 9, 및 12에서 노던 블럿 분석으로 검출되었다 (도 4의 A). CysP mRNA 축적은 형질전환 라인 12에서는 거의 검출되지 않았으며, 이는 CysP 프로테아제의 활성이 최저 수준인 것으로 증명되었다. 방해 RNA(interfering RNA)의 주요 요소인 CysP 특이적 siRNA가 형질전환 벼 라인 7, 9, 및 12에서 방사능 표지된 CysP 전사체로 수행한 RNase 보호 분석에서 검출된 (도 4의 A) 반면, 야생형에서는 검출되지 않았다. 형질전환 현탁 배양에서 CysP의 억제를 측정하기 위해 2-DE를 수행하였다. CysP로 동정된 단백질 반점은 ihpRNA-발현 형질전환 벼 현탁액에 있어 야생형에 비해 실질적으로 감소되었다 (도 4의 B).
실시예 5. hGM - CSF 및 CysP 의 ihpRNA 의 공동발현
CysP 프로테아제의 억제를 통한 hGM-CSF의 생산을 평가하기 위해 hGM-CSF (pMYN44-08)를 발현하는 형질전환 벼 캘러스를 CysP의 ihpRNA를 발현하는 유전자 및 선발 표지로서 바(bar)유전자를 포함하는 식물 발현 벡터, pMYP109로 형질전환하였다. 충격 매개된 형질전환 2 주 후, 하이그로마이신 B 및 PPT 저항성 벼 캘러스 콜로니가 생성되었다. 형질전환된 것으로 추정되는 12 개의 캘러스 라인을 선정하여 게놈 DNA PCR 분석 (자료 미제시)으로 목적 유전자가 통합되었는지를 조사하였다. 5 개의 형질전환 캘러스 라인이 PCR 분석에서 양성 신호를 보였다.
실시예 6. CysP 의 ihpRNA 및 hGM - CSF 양자를 발현하는 형질전환 벼 현탁물에서의 프로테아제 활성
단백질 분해 활성이 RNAi 기술을 사용한 CysP 유전자 침묵에 의해 감소되었 는지를 밝히기 위해 총 프로테아제 및 CysP 특이적 활성을 측정하였다. 총 프로테아제 활성 수준은 서당 결핍으로 유도 6일째 hGM-CSF 만을 발현 (pMYN44-08)하는 형질전환 벼 세포 배양물에 비해 형질전환 벼 세포 라인 6, 9, 및 12의 배양 배지에서 감소되었다 (도 5의 A). 최저 단백질 분해 활성이 형질전환 라인 9에서 검출되었다. CysP 특이적 활성에 관한 결과는 총 프로테아제 활성 분석과 유사하였으며, 최저 수준의 활성이 형질전환 라인 9에서 검출되었다 (도 5의 B). 비록 총 프로테아제 및 CysP의 활성은 대조구에 비해 감소되었지만, 양 프로테아제 활성의 축적은 연장된 배양 중에 점차 증가되었다 (도 5의 C 및 D). CysP mRNA의 축적은 형질전환 벼 라인 6, 9, 및 12에서 노던 블럿 분석으로 검출되지 않았다 (도 6). CysP 관련 siRNA는 형질전환 벼 캘러스에서 방사능 표지된 CysP 전사체로 수행한 RNase 보호 분석으로 검출된 반면 (도 6), hGM-CSF 만을 발현하는 형질전환 벼 세포 배양에서는 검출되지 않았다.
실시예 7. hGM - CSF 및 CysP 의 ihpRNA 양자를 발현하는 형질전환 벼 현탁물에 hGM-CSF의 축적
최저 수준의 프로테아제 활성 (형질전환 라인 9)을 보이는, hGM-CSF 및 CysP의 ihpRNA 양자를 발현하는 형질전환 벼 배양 배지에서 hGM-CSF의 양을 hGM-CSF 특이적 ELISA 키트로 결정하였다 (도 7). 재조합 단백질 수준은 15일에 289.1 mg/ℓ의 최대로 증가하여, hGM-CSF 만을 발현하는 형질전환 라인 (150.4 mg/ℓ)에 비해 1.9 배였다. 그러나, 배양 배지에 있어 hGM-CSF의 양은 hGM-CSF 및 CysP의 ihpRNA 양자를 발현하는 형질전환 라인에 있어서는 15일 후 감소되었다. hGM-CSF 및 CysP의 ihpRNA 양자를 발현하는 형질전환 벼 세포 배지에 축적된 hGM-CSF 분해의 양을 관찰하기 위해 웨스턴 블럿 분석을 수행하였다. 웨스턴 블럿 분석의 결과에서처럼 (도 8의 A), 넓은 범위의 밴드가 hGM-CSF 만을 발현하는 형질전환 벼 세포 현탁물에서 검출되었으며, 저 분자량 밴드가 연장된 배양 중에 증가되었다. 그러나, 고분자량 밴드는 hGM-CSF 및 CysP의 ihpRNA 양자를 발현하는 형질전환 벼 세포 현탁 배양물에 연장된 배양 중에 남아있었다 (도 8의 B).
도 1은 벼 세포 현탁 배양에 있어 분비 단백질의 이차원 겔 전기영동을 보여준다. 서당 결핍 유도 후 6일째 벼 현탁 세포 배양의 총 분비 단백질이 pH 3-10의 비선형 pH-gradient tube 겔에서, 이어서 SDS-PAGE .겔에서 분리되었다. 겔은 쿠마씨(Coomassie brilliant blue) R-250로 염색되었다.
도 2는 CysP의 ihp RNA (intron-containing self complementary'hairpin' RNA)를 발현하는 식물 발현 벡터를 보여준다. CysP의 ihpRNA를 발현하는 구축물은 중복 Cauliflower Mosaic Virus 35S 프로모터 (du 35S-p)의 통제 하에 있다. 벼 아밀라아제 첫 번째 인트론 (intron)이 센스 및 안티 센스 CysP 사이에 위치한다. CaMV 35S 프로모터 (35S-p) 및 Tnos(nopaline synthase)의 종료암호의 통제 하에 하이그로마이신 포스포트란스퍼라아제 (hpt) 또는 바(bar)유전자가 각각 하이그로마이신 B 또는 포스피노트리신 (PPT)에 대한 선발 표지로 사용되었다.
도 3은 형질전환 벼 세포 현탁 배양에 있어 분비된 총 (A) 및 시스테인 (B) 프로테아제의 활성을 보여준다. (A)는 분비된 총 프로테아제 (200 ㎕ 배양 상등액)의 활성이 Lee et al.의 (2002, J Biotechnol 96:205-211) 기재에 따라 측정된 것이다. 레인 NC, 야생형의 상등액. 레인 1-14, 형질전환 벼 세포 배양물의 상등액. 1 unit의 활성은 본 발명에 사용된 분석 조건 하에서 280 nm에서 0.01의 흡수도 증가에 필요한 효소의 양이다. (B)는 특이적 CysP 활성 (농축된 배양 상등액 200 ㎕에 100 ㎍ 분비 단백질)이 Z-Arg-Arg-pNA에 대해 측정된 것이다. p-니트로아닐라이드(p-nitroanilide)의 유리가 분광광도계로 410 nm에서 지속적으로 추적되었다. 레 인 PC, 양성 대조구로 사용된 papain (3 ㎍). 레인 NC, 음성 대조구로 사용된 야생형 벼 세포 현탁 배양 상등액. 레인 #4, 5, 7, 9, 및 12, 형질전환 벼 세포 현탁 배양의 상등액. 1 unit의 활성은 본 발명에 사용된 분석 조건 하에서 410 nm에서 0.01의 흡수도 증가에 필요한 펩티드의 양이다. 프로테아제 활성 분석은 3 회 수행되었으며, 자료는 평균±SD로 나타내었다.
도 4는 형질전환 벼 세포에서 mRNA의 감소, siRNA의 검출 및 CysP 프로테아제의 감소를 보여준다. (A)는 서당 결핍 유도 후 6일째 형질전환 벼 세포로부터 추출된 총 RNA가 포름알데하이드 함유 겔에서 전기영동으로 분리된 것이다. 분리된 RNA를 니트로셀룰로오즈 paper로 옮겨, 32P로 표지된 CysP 프로브와 혼성화하였다. 각 레인은 RNA 20 ㎍을 함유한다. rRNA는 에티듐 브로마이드(ethidium bromide) 염색으로 가시화되었다. 하부 패널은 CysP의 siRNA로, 이는 안티 센스 CysP에 해당하는 32P로 표지된 전사체와 혼성화 후 RNase 혼합물로의 분해로부터 보호되었다. 레인 NC, 음성 대조구로 사용된 야생형 세포. 레인 #7, 9, 및 12, pMYP108로 형질전환된 벼 세포. 레인 M, 방사능으로 표지된 RNA 분자량 표지 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 및 10 뉴클레오티드. 화살표는 CysP의 siRNA. (B)는 야생형 및 형질전환 벼 세포 현탁 배양물간의 분비 프로테아제 패턴을 비교한 것이다. 단백질 시료 600 ㎍이 pH 3-6의 비선형 tube 겔에 (13 cm), 및 이차원으로서 12% SDS-PAGE 겔에 로딩되었다. 겔은 쿠마씨(Coomassie brilliant blue) R-250로 가시화되었다. 상부 겔은 야생형 (Ctrl), 및 하부 겔은 pMYP108를 함유한 형질전환 벼 라인 #12의 단백질 패턴을 보여준다. 화살표는 시스테인 엔도펩티다아제의 5 개 반점을 나타낸다.
도 5는 hGM-CSF 및 CysP의 ihpRNA를 공동발현하는 형질전환 벼 세포 현탁 배양물에 분비된 총 (A) 및 시스테인 (B) 프로테이나아제의 활성을 보여준다. (A)는 서당 결핍 유도 6일 후 측정된, hGM-CSF 및 CysP의 ihpRNA 양자를 공동발현하는 형질전환 벼 세포에서 분비된 총 프로테아제의 활성 (배양 상등액 200 ㎕)을 보여준다. (B)는 특정 CysP 활성 (농축된 배양 상등액 200 ㎕ 내에 분비 단백질 100 ㎍)이 Z-Arg-Arg-pNA 기질로 측정된 것이다. p-니트로아닐라이드(p-nitroanilide)의 유리는 분광광도계로 410 nm에서 지속적으로 추적되었다. 레인 PC, papain (3 ㎍). 레인 NC, 야생형 벼 세포 현탁 배양의 상등액. 레인 N44-08, hGM-CSF 만을 발현하는 형질전환 세포 라인. 레인 #1, 2, 6, 9 및 12, 형질전환 벼 세포 현탁 배양의 상등액. 분비된 총 (C) 및 시스테인 (D) 프로테이나아제 프로테아제 활성이 형질전환 벼 세포 라인 #9에서 시간 경과에 따라 측정되었으며, 최저 프로테아제 활성 (N44 + P109-09)이 보인다. 프로테아제 활성 분석은 3 회 수행되었으며, 자료는 평균±SD로 나타내었다.
도 6은 노던 블럿 분석 및 형질전환 벼 세포에서 CysP 특이적 siRNA의 검출을 보여준다. (A)는 서당 결핍으로 유도 후 6일째 hGM-CSF 및 CysP의 ihpRNA를 공동발현하는 형질전환 벼 세포로부터 추출된 총 RNA가 포름알데하이드 함유 겔 상에서 전기영동으로 분리된 것이다. 분리된 RNA는 니트로셀룰로오즈 paper로 옮겨져, 32P로 표지된 CysP 프로브와 혼성화되었다. 각 레인은 RNA 20 ㎍을 함유하며, rRNA는 에티듐 브로마이드(ethidium bromide) 염색으로 가시화되었다. 하부 패널은 CysP의 siRNA로, 이는 CysP의 안티 센스에 해당하는 32P-UTP-표지 전사체와 혼성화되었다. 레인 N44-08, 음성 대조구로서 hGM-CSF 만을 발현하는 형질전환 라인. 레인 #6, 9, 및 12, hGM-CSF 및 CysP의 ihpRNA 양자를 공동발현하는 형질전환 벼 세포 (N44 + P109). 레인 M, 방사능으로 표지된 RNA 분자량 표지 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 및 10 뉴클레오티드. 화살표는 CysP의 siRNA의 위치를 나타낸다.
도 7은 형질전환 벼 세포 라인에서 hGM-CSF의 양이 hGM-CSF 특이적 ELISA 키트로 결정된 것이다. (A)는 형질전환 벼 세포 라인 #9에서 hGM-CSF 축적이 시간경과에 따라 측정 시 최고로 발현됨을 보여준다. (B)에서의 ELISA는 3 회 수행되었으며, 자료는 평균±SD로 나타내었다.
도 8은 형질전환 벼 세포 현탁 배양에서 hGM-CSF의 웨스턴 블럿 분석을 보여준다. hGM-CSF 만을 함유하는 형질전환 세포 라인 (A) 및 hGM-CSF 및 CysP의 ihpRNA 양자를 발현하는 형질전환 세포 라인 #9 (B)의 폐배지 (30 ㎕)를 서당 결핍 (S-)으로 유도 후 3, 5, 7, 11, 및 15일에 취하여, 항 hGM-CSF 다클론 항체로 hGM-CSF 발현에 대해 분석하였다. 레인 M, 사전 염색된 분자량 표준. 레인 PC, 양성 대조구로서 E. coli 유래 hGM-CSF. 레인 NC, 음성 대조구로 사용된 야생형의 배양 배지. 화살표는 손상되지 않은 hGM-CSF 및 그의 분해 산물을 나타내는 밴드의 범위를 표시한다.
<110> INDUSTRIAL COOPERATION FOUNDATION CHONBUK NATIONAL UNIVERSITY <120> Method for improving recombinant protein production by suppression of cysteine proteinase gene expression <160> 7 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RCP F2 primer <400> 1 gcagctggag ggttcttgcg gtggtggctg 30 <210> 2 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RCP R2 primer <400> 2 aggcgggcac gtgtacggcg gagatg 26 <210> 3 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RCP F3 <400> 3 ggatccgcag agaggagttc cgcgccacgt tc 32 <210> 4 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RCP F4 <400> 4 ggtaccgcag agaggagttc cgcgccacgt tc 32 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RCP R2-1 <400> 5 ccatggcgat gccgcagagg ccgc 24 <210> 6 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3D linker-F1 <400> 6 ccatggaggt acgtagtact ctactaccca tcac 34 <210> 7 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3D linker-R1 <400> 7 ccatggccct gcatgatgca tgttataagt aggtaag 37

Claims (16)

  1. 5'에서 3' 방향으로
    (a) 식물체의 구성적 프로모터;
    (b) 시스테인 프로테이나아제 유전자의 센스 서열;
    (c) 알파-아밀라아제 유전자의 첫 번째 인트론;
    (d) 시스테인 프로테이나아제 유전자의 안티 센스 서열; 및
    (e) 3' UTR
    을 포함하는 식물세포 발현용 벡터.
  2. 제1항에 있어서, 상기 프로모터는 CaMV 35S 프로모터인 것을 특징으로 하는 벡터.
  3. 제2항에 있어서, 상기 CaMV 35S 프로모터는 중복된 CaMV 35S 프로모터 (du 35S-p)인 것을 특징으로 하는 벡터.
  4. 제1항에 있어서, 상기 3' UTR은 시스테인 프로테이나아제 유전자의 3' UTR인 것을 특징으로 하는 벡터.
  5. 제1항에 있어서, 상기 알파-아밀라아제는 벼의 알파-아밀라아제 3D, 벼의 알 파-아밀라아제 3E 및 벼의 알파-아밀라아제 1A로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 벡터.
  6. 제1항에 있어서, 상기 벡터는 도 2에 기재된 pMYP108 또는 pMYP109인 벡터.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포.
  8. 제7항에 있어서, 대장균인 것을 특징으로 하는 숙주세포.
  9. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 재조합 벡터로 형질전환된 식물세포.
  10. 제9항에 있어서, 상기 형질전환된 식물은 담배, 벼, 감자, 토마토, 상추 및 고구마로 이루어진 군으로부터 선택된 식물세포.
  11. 식물세포 배양배지에서 당을 결핍시킨 배지 상에서, 제9항에 따른 형질전환된 식물세포를 현탁배양하는 것을 포함하는, 배양배지에 시스테인 프로테이나아제의 분비를 억제시키는 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 식물세포 배양배지는 N6 배지, SH 배지, MS 배지, AA 배지 및 LS 배지로 이루어진 군으로부터 선택된 방법.
  13. (a) 제9항 또는 10항에 따른 형질전환된 식물세포 및 재조합 목적 단백질의 형질전환체를 당 결핍 배지에서 공동 현탁배양하여, 시스테인 프로테이나아제의 분비가 억제된 상태로 재조합 목적 단백질을 공동발현하는 단계; 및
    (b) 공동 현탁배양한 배양물로부터 재조합 목적 단백질을 분리하는 단계;
    를 포함하는 식물세포를 이용한 재조합 목적 단백질의 생산을 증가시키는 방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 식물세포 배양배지는 N6 배지, SH 배지, MS 배지, AA 배지 및 LS 배지로 이루어진 군으로부터 선택된 목적 단백질의 생산을 증가시키는 방법.
  15. 제13항에 있어서, 상기 재조합 목적 단백질은 GM-CSF(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor), hIL-12(human interleukin-12), hIL-18( human interleukin-18), G-CSF(granulocyte colony-stimulating factor), t-PA(tissue-Plasminogen Activator), EGF(EGF(Epidermal Growth Factor), GH(Growth Hormone), BMP-2(Bone Morphogenetic Protein-2), BMP-7(Bone Morphogenetic Protein-7), OPG(Osteoproteoerin) 또는 항체인 것을 특징으로 하는 재조합 목적 단백질의 생산을 증가시키는 방법.
  16. 제15항에 있어서, 상기 재조합 목적 단백질은 인체 과립구 대식세포 콜로니 자극인자(human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor, hGM-CSF)인 것을 특징으로 하는 재조합 목적 단백질의 생산을 증가시키는 방법.
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