JP3320064B2 - 抵抗力を増大させるための植物中のリゾチーム遺伝子構造の使用 - Google Patents

抵抗力を増大させるための植物中のリゾチーム遺伝子構造の使用

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    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、菌・かびおよび動物性有害生物に対する植
物の抵抗力を増大させるための、植物中でのリゾチーム
遺伝子構造物（以下、「構造物」を単に「構造」という
場合あり）の使用に関する。
穀物植物の世界の収穫のかなりの部分が、有害生物に
よつて常に破壊されている（1967年の潜在的生産高の損
失は35％であつた;Chemistry of Pesticides,K.H.Bch
el著、John Wiley ＆ Sonc,New York、1983年６頁参
照）。従つて、穀物植物に有害生産が繁殖するのを減少
または阻止するために適切な、全ての可能な手段を研究
し、利用すべき緊急な要求がある。
特許出願WO 89/04371には、特定のバクテリアに対す
る抵抗力を増大させるための、特定のリゾチーム遺伝子
を有する植物の形質転換が記述されている。
TRプロモーター、大麦α−アミラーゼのシグナルペプ
チド配列および１個以上（好適には１個）のキメラ遺伝
子融合物のリゾチーム遺伝子から成るか、または、これ
らのキメラ遺伝子融合物を有することを特徴とするリゾ
チームを発現する１個以上（好適には１個）のリゾチー
ム遺伝子構造を、植物のゲノム中に導入することによつ
て、菌・かびおよび動物性有害生物に対して植物の増大
した抵抗力が得られることを見い出した。
従来技術の知識では、本発明に従つて用いられる遺伝
子構造の助けで、病原に対する植物の特に際立つた抵抗
力が達成されたことは驚くべきことであり、そして、予
想ができなかつた。
リゾチームという言葉は、天然にある酵素EC3.2.1.17
の群を表わす。例として、にわとりのアルブミンリゾチ
ームおよびT4−フアージリゾチームが挙げられる。
リゾチーム遺伝子は、RNA中に転写されそしてたん白
質中に翻訳された後、リゾチームの公知の性質を有する
酵素の生成を生じる（適切な環境下で）いかなる核酸
（DNA）をも意味するとして理解されるものとする。
リゾチーム遺伝子構造もしくはそれらの構成要素は、
それらの機能を妨げないか、大きくは妨げない、他のDN
A配列を、例えば、それらの最初の部分および／または
終りの部分に、有することができる。
リゾチーム遺伝子およびリゾチーム遺伝子構造の他の
構成要素は、それらの起源となる有機体のゲノム中（リ
ゾチームを暗号化しないおよび／または非調節配列、例
えばイントロン、を含む“ゲノム的”形態）、に含まれ
るのと同様の形で、或いは、逆転写酵素／ポリメラーゼ
の助けでmRNAを通して得られる（そしてもはやイントロ
ンを含まない）cDNA（“コピー"DNA）に相当する形で、
存在することができる。
本発明に従つて用いることのできるリゾチーム遺伝子
構造において、DNA配列は、本質的に同様に作用する他
のDNA配列に置き換えることが可能である。
それらはまた、末端に、特別な遺伝子操作に適切なDN
A配列（例えば“リンカー”）を有することができる。
本発明に従つて用いることのできる好適なリゾチーム
遺伝子構造は、プラスミドpSR2−４中に存在するよう
に、リゾチーム遺伝子に加えて、TRプロモーターおよび
大麦α−アミラーゼのシグナルペプチト配列を有するキ
メラ遺伝子融合物から成るか、或いは、これらを含んで
成る。
本発明に従う好適なリゾチーム遺伝子構造は、にわと
りのアルブミンリゾチーム遺伝子および／またはT4−フ
アージリゾチーム遺伝子を有する。特にT4−フアージリ
ゾチーム遺伝子が好ましい。本発明に従つて用いられる
特に好適な遺伝子は、プラスミドpSR2−４中に存在する
ようなT4−フアージリゾチーム遺伝子、並びに、本質的
に同様に作用するDNA配列である。
TRプロモーター、大麦α−アミラーゼのシグナルペプ
チト配列およびプラスミドpSR2−４に含まれるような、
T4−フアージリゾチーム遺伝子のたん白質を暗号化する
領域のキメラ遺伝子融合物の使用が、特に強調される。
必要ならば、T4−フアージリゾチーム遺伝子、TRプロ
モーターおよび大麦α−アミラーゼのシグナルペプチト
配列から成るか、或いは、この遺伝子融合物を有すると
ころの遺伝子融合物を有する配列は、制限酵素の助けで
プラスミドpSR2−４から通常の方法で得られる。
リゾチーム遺伝子は、遺伝子構造の中に完全に存在す
ることができる、即ち、それらの自然のままの調節部分
（特にプロモーター）を有するか、或いは、たん白リゾ
チームを暗号化する構造遺伝子の形態でのみ、存在する
ことができる。
プラスミドpSR2−４を有する大腸菌株TBI pSR2−４
を、Deutsche Sammlung von Mikroorganismen［ドイツ
国微生物収集］（DSM）、Mascheroder Weg 1b、Ｄ−330
0 Braunschweig、ドイツ連邦共和国に、特許手続きの目
的のための微生物に関するブダペスト条約（the Budape
st Convention of Microorganisms for the Purpose of
Patent Proceedings）の規定に従つて、寄託し、その
受託番号はDSM5455（寄託日:1989年７月25日）である。
本発明に従えば、有害生物、特に菌・かびおよび動物
性有害生物、特に節足動物、例えば昆虫およびダニおよ
びまた線虫に対する抵抗性、或いは、増大した抵抗性、
を得ることが可能である。これに関連して特に強調すべ
きは、植物病原の菌・かびである。
有害昆虫は、特に次の種類の昆虫である： 直翅目（Orthoptera）、ハサミムシ目（Dermapter
a）、シロアリ目（Isoptera）、アザミウマ目（Thysano
ptera）、半翅目（Heteroptera）、同翅目（Homopter
a）、鱗翅目（Lepidoptera）、鞘翅目（Coleoptera）、
膜翅目（Hymenoptera）および双翅目（Diptera）。
有害なダニ類は特に：ホコリダニ（Tarsonemus sp
p.）、ミカンリンゴハダニ（Panonychus spp.）および
ナミハダニ（Tetranychus spp）である。
有害な線虫類は特に：プラチレンカス（Pratylenchus
spp.,）、ヘテドデラ（Heterodera spp.）およびメロ
イドギネ（Meloidogyne spp.）である。
植物病原の菌・かびは特に：プラスモジオフオロミセ
テス（Plasmodiophoromycetes）、卵菌類（Oomycete
s）、キトリジオミセテス（Chytridiomycetes）、接合
菌類（Zygomycetes）、嚢子菌類（Ascomycetes）、担子
菌類（Basidiomycetes）および不完全菌類（Deuteromyc
etes）である。
上に示した属名の範中に含まれる菌・かびによる病気
の原因となるいくつかの病原菌を例示するが、これによ
つて限定されるものではない： ピチウム（Pythium）種、例えば苗立ち枯れ病（Pythi
um ultimum）； フイトフトラ（Phytophthola）種、例えば疫病（Phyt
ophthora infestans）； プソイドペロノスポラ（Pseodoperonospora）種、例
えばべと病（Psedoperonospora humuli又はPseuせdoper
onospora cubense）； プラスモパラ（Plasmopara）種、例えばべと病（Plas
mopara viticola）； ツユカビ（Peronospora）種、例えばべと病（Peronos
pora pisi又はPeronospora brassicae）； エリシフエ（Erysiphe）種、例えばうどんこ病（Erys
iphe graminis）； スフアエロテカ（Sphaerotheca）種、例えばうどんこ
病（Sphaero−theca fuliginea）； ポドスフエラ（Podosphaera）種、例えばうどんこ病
（Podosphaera leucotricha）； ベンチユリア（Venturia）種、例えば黒星病（Ventur
ia inaequalis）； ピレノホラ（Pyrenophora）種、例えば網斑病（Pyren
ophora teres又はPyrenophora graminea）（分生胞子器
型:Drechslera、同義:Helminthosporium）； コクリオボルス（Cochliobolus）種、例えば斑点病
（Cochliobolus sativus）（分生胞子器型:Drechsler
a、同義:Helminthosporium）； ウロミセス（Uromyces）種、例えばさび病（Uromyces
appendiculatus）； プシニア（Puccinia）種、例えば赤さび病（Puccinia
recondita）； ふすべ菌属（Tilletia）種、例えば網なまぐさ黒穂病
（Tilletia caries）； 黒穂病（Ustilago）種、例えば裸黒穂病（Ustilago n
uda又はUstilago avenae）； ペリキユラリア（Pellicularia）種、例えば紋枯病
（Pellicularia sasakii）； ピリキユラリア（Pyricularia）種、例えばいもち病
（Pyricularia oryzae）； フーザリウム（Fusarium）種、例えばフーザリウム・
クルモルム（Fusarium culmorum）； 灰色かび属（Botrytis）種、例えば灰色かび病（Botr
ytis cinerea）； セプトリア（Septoria）種、例えばふ枯病（Septoria
nodorum）； レプトスフエリア（Leptosphaeria）種、例えばレプ
トスフエリア・ノドルム（Leptosphaeria nodorum）； セルコスポラ（Cercospora）種、例えばセルコスポラ
・カネセンス（Cercospora canescens）； アルテルナリア（Alternaria）種、例えば黒斑病（Al
ternaria brassicae）及び プソイドセルコスポレラ（Pseudocercosporella）
種、例えばプソイドセルコスポレラ・ヘルポトリコイデ
ス（Pseudocercosporella herpotrichoides）。
更にヘルミンチトスポリウム カルボナム（Helminth
osporium carbonum）が挙げられる。
本発明に従えば、実質的にすべての植物に上記の有害
生物に対する抵抗力もしくは増大した抵抗力を与えるこ
とが可能である。当然のことながら、穀物植物中、例え
ば、もみの木類、えぞ松類、ドーグラシアス（douglasi
as）、松類、から松類、ぶな類およびオーク類のような
森林植物、並びに例えば穀物類（特に小麦、ライ麦、大
麦、からす麦、きび、米およびとうもろこし）、じやが
いも類、豆類、大豆類、落花生類、野菜類（特にキヤベ
ツ種およびトマト類）、くだもの（特にりんご、西洋な
し、さくらんぼ、ぶどう、かんきつ類、パイナツプルお
よびバナナ）、油やし、紅茶、ココアおよびコーヒー低
木、タバコ、サイザル麻および綿のような食料品および
原料を作り出す植物中、そして例えばラウオルフイア
（Rauwolfia）およびジギタリスのような薬用植物中
に、抵抗力を作り出すことへの特別な要求がある。
既に提案したように、リゾチーム遺伝子構造が、本発
明に従つて、１個以上のコピーで（ゲノムの同じ座、或
いは、違つた座に）、天然植物ゲノム中に導入される。
既にリゾチーム合成可能な植物では、１個以上の追加
的、選択的“異質の”リゾチーム遺伝子を導入すること
によつて、著しく増大した抵抗作用が生じ得る。
既に記述したように、本発明に従つて形質転換された
植物細胞および植物の増大した抵抗力は、農業および林
業、観賞用植物および薬用植物の生産、そして植物の品
種改良において、重要である。例えば、薬学的に有用な
物質を得る目的で植物細胞を培養する時に、特に菌・か
びに対して増大した抵抗性を有する植物細胞を利用でき
るのはまた、優位である。
本発明はそれ故また、 （ａ） TRプロモーター、大麦α−アミラーゼのシグナ
ルペプチド配列および１個以上のリゾチーム遺伝子のキ
メラ遺伝子融合物から成るか、または、これらのキメラ
遺伝子融合物を含んで成る１個以上のリゾチーム遺伝子
構造が、植物細胞（原形質体を含む）のゲノム中に導入
され、そして、適宜、 （ｂ） 完全に形質転換された植物が、形質転換された
植物細胞（原形質体を含む）から再生され、そして適
宜、 （ｃ） 植物（種子を含む）の所望の部分が、結果とし
て得られる形質転換された植物もしくはそれらの子孫か
ら得られる、 ことを特徴とする、菌・かびおよび動物性有害生物に対
して増大された抵抗力を有する形質転換された植物細胞
（原形質体を含む）および植物（種子および植物の部分
を含む）を作り出す方法に関する。
菌・かびおよび動物性有害生物に対する増大した抵抗
力を有し、１個以上のリゾチーム遺伝子構造を有する、
形質転換した植物細胞（原形質体を含む）および植物
（種子および植物の部分を含む）、並びに、上記の方法
により得ることができるこれらの形質転換された植物細
胞および植物は、また、本発明の主題である。
本発明の部分はまた （ａ） TRプロモーター、大麦α−アミラーゼのシグナ
ルペプチド配列および１個以上のリゾチーム遺伝子のキ
メラ遺伝子融合物から成るか、これらのキメラ遺伝子融
合物を含んで成るリゾチーム遺伝子構造の使用、およ
び、菌・かびおよび動物性有害生物に対して増大した抵
抗力をもたらすところの植物細胞（原形質体を含む）お
よび植物（種子および植物の部分を含む）を形質転換す
るための、ベクター、および、リゾチーム遺伝子構造を
含む、本発明に従う形質転換された微生物の使用、並び
に、 （ｂ） 増殖物質を作り出すため、新規な植物およびそ
の増殖物質を作り出すための、本発明による形質転換さ
れた植物細胞（プロトプラストを含む）および植物（種
子および植物の部分を含む）の使用および、当然のこと
ながら、 （ｃ） 特別な抵抗性を増大させることによる、菌・か
びおよび動物性有害生物を駆除し、制御するためのリゾ
チーム遺伝子構造の使用。
リゾチーム遺伝子構造を植物の遺伝物質、または植物
細胞、の中に導入するために利用できる、数多くの種々
の方法がある。遺伝子は、一般的な通常の公知の方法で
移すことが可能で、そして、本技術を収得する人によつ
て、各場合とも難なく、この方法は適切であることがわ
かる。
アグロバクテリウム ツメフアシエンス（Agrobacter
ium tumefaciences）のTi−プラスミドは、異質なDNA
を、双子葉植物および単子葉植物のゲノム中に移すため
に、特に好適でそして広く用いられるベクターとして利
用され得る。リゾチーム遺伝子構造が、適切なTi−プラ
スミドのＴ−DNA中に導入（例えばZanbryski他、1983
年）され、そして、植物を感染させるか、葉盤を感染さ
せるか、或いは、アグロバクテリウムトユームフアシエ
ンスとプロトプラストとを共培養することによつて、移
される。
別法として、リゾチーム遺伝子構造を、多陽イオン、
或いは、カルシウム塩類とポリエチレングリコールの存
在下で、プロトプラスト質体と一緒に培養することがで
きる（例えばDavey他、1980年;Hain他、1985年;Krens
他、1982年;Paszkowski他、1984年）。
DNAの取込みは、また電場（エレクトロポレーシヨ
ン）によつて追加的に促進され得る（例えばFromm他、1
986年）。
DNAはまた、物理的に加速したDNAを有する粒子で、花
粉に衝撃を与えることによつて、植物の花粉から公知の
方法で導入され得る（EP−A 0.270,356参照）。
植物は、適切な培養基の助けで公知の方法によつて再
生される（例えばNagyおよびMaliga、1976年）。
例えば、通常の方法（例えばVan Haute他、1983年）
で、プラスミドpSR2−４は、例えばpGV3850;もしくはそ
れらの誘導体（Zambryski他、1983年）を有するアグロ
バクテリウム ツメフアシエンスに移され得る。形質転
換の成功は、ノパリン（nopalin）もしくはNPT（II）を
検出することによつて調べることができる。また、リゾ
チーム遺伝子構造はバイナリーベクター（例えばKoncz
およびSchell、1986年）中で無性生殖させられ、上述の
ように適切なアグロバクテリウム種に移される（Koncz
およびSchell、1986年）。植物に移すことができる形態
となつたリゾチーム遺伝子構造を有するところの結果と
して得られるアグロバクテリウム種は、植物を形質転換
するために更に用いられる。
好適な具体例として、単離されたプラスミドpSR2−４
が、直接的遺伝子転移による通常の方法で植物原形質体
に転移される（例えばHain他、1985年）。この方法で
は、プラスミドは、環状、しかし好適には直線状、の形
態で存在できる。
プラスミドpSR2−４が、レポーター遺伝子と共に用い
られる場合、カナマイシン耐性プロトプラストが、リゾ
チーム表現のために試験される。
形質転換（遺伝子導入）した植物、もしくは植物細胞
は、例えば葉盤形質転換（例えばHorsch他1985年）、再
生する植物プロトラストもしくは細胞培養をアグロバク
テリウム ツメフアシエンスと共培養すること（例えば
Marton他1979年、Hain他1985年）、或いは、直接DNA−
トランスフエクシヨンすること、による公知の方法で調
製される。結果として得られる形質転換された植物は、
例えば、試験管中でのカナマイシンスルフエートのリン
酸化（Reis他、1984年;Schreier他1985年）によつて、
レポーター遺伝子表現に選択されることによるか、或い
は、ノパリン（nopalin）シンターゼの表現（Aerts他、
1983年に従う）によるか、または、ノーザンブロツト分
析とウエスターンブロツト分析によるリゾチームの表現
によつて、検出される。形質転換した植物のリゾチーム
は、特別な抗体を用いる公知の方法で検出することも可
能である。
形質転換された植物細胞は、特に適切な培養基の助け
で、一般通常の方法を用いて完全な植物に培養され、再
生される。
形質転換された植物細胞、並びに、リゾチームを有す
る形質転換された植物は、植物病原の菌・かびおよび動
物性有害生物、特に昆虫、だに、および線虫、に対して
相当に改良された抵抗力を示す。
本発明に関して“植物”という言葉は、完全な植物ば
かりでなく植物の部分、例えば葉、種子、塊茎、切り枝
などを示す。“植物細胞”は、原形質体、細胞系、植物
カルスなどを含む。“増殖物質”は、形質転換させた植
物および植物細胞を繁殖させるために用いられる植物お
よび植物細胞を示す。
本文中“本質的に同様に作用するDNA配列”という言
葉は、本発明にはまた、リゾチーム遺伝子もしくはその
部分の機能がリゾチームをもはや形成しないか、或い
は、調節遺伝子部分がもはや有効でなくなる程には影響
を受けないような、修正も含まれることを意味してい
る。適当な修正は、DNA配列、個々のコドンおよび／ま
たは個々の核酸を置き換えるか、加えるか、および／ま
たは除くかすることで行なわれ得る。
本発明に従つて用いられる微生物における“突然変異
体”は、本発明を実行するに必須な特徴をまだ有してい
る修正された微生物、特に特定のプラスミド、を示す。
下記の例示する具体例は、本発明を詳細に説明するこ
とを意図したものである。
1.用いたプラスミド構造pSR2−４に関する記述（第１図
参照） プラスミドpSR2−４は、TRプロモーター（A.ツメフア
シエンスのTiプラスミド中に存在し、転写開始を調節す
る上で重要な役割を有するDNA配列であって、具体的に
は、Velten他、“The EMBO Journal"vol.3,pp.2723−27
30,1984"特に、図６参照）、大麦α−アミラーゼのシグ
ナルペプチド配列およびT4−フアージリゾチーム遺伝子
のたん白質を暗号化する領域（K.Dring、博士論文、C
ologne大学、1988年）からの、表現ベクターpAP2034（V
eltenおよびSchell、1985年）中に組み込まれたキメラ
遺伝子融合物を有する。プラスミドpSR2−４の大きさは
9.3Kbである。
第１図 プラスミドpSR2−４（9.3Kb）は下記のように示され
る： pTR＝A.ツメフアシエンスからのデユアル植物プロモ
ーター ocs pA＝オクトピンシンターゼのポリアデニレーシヨ
ン配列領域 KmR＝カナマイシン耐性遺伝子、植物中で活性 g7pA＝アグロバクテリウム遺伝子７のポリアデニレー
シヨン領域 CbR＝カルブペニシリン耐性遺伝子 SmR＝ストレプトマイシン耐性遺伝子 SpR＝スペクトマイシン耐性遺伝子 線影の部分＝大麦α−アミラーゼのシグナルペプチド
配列 lys＝T4−フアージリゾチームのための暗号化する配
列 以下に記述する方法に従つて、リゾチーム遺伝子構造
を、例えばタバコおよびじやがいも中に移植した。
既に上に説明したように、容易に単離され得る形態
で、プラスミドpSR2−４を有する大腸菌株TBI pSR2−４
がDeutsche Sammlung von Mikroorganismen（ドイツ国
微生物収集）に寄託されている。
2.タバコの形質転換 ａ）タバコ苗条培養およびタバコプロトプラストの単
離： ニコチアナタバキユム（Nicotiana tabacum）（Petit
Havanna SR1）は、ホルモンの入つていないLS培地（Li
nsmaier and Skoog 1965年）上に苗条無菌培養として増
殖させる。苗条培養は、約６〜８週間の間隔で新鮮なLS
培地に移植する。苗条培養を24〜26℃、12時間光（1000
〜3000ルツクス）で、成長キヤビネツト中に保存した。
葉のプロトプラストを単離するために、約2gの葉（長さ
約３〜5cm）を、新しいかみそりの刃を使用して、小片
に切断する。この葉の物質を、K3培地（Nagy and Malig
a 1976年）、0.4mサツカロース、pH5.6、２％のゼルラ
ーゼ（Zellulase）R10（Servaによる）および0.5％のマ
セロチム（Macerozym）R10（Servaによる）を含有する
酵素溶液20m中、室温で14〜16時間培養する。この
後、原形質体を0.30mmと0.1mmのスチール製ふるい上で
濾過することによつて、細胞の断片から分離する。濾液
を10分間100×ｇで遠心分離する。この遠心分離中、損
傷を受けていないプロトプラストが浮遊し、そして酵素
溶液の上部の端に帯状に集まる。細胞の破片のペレツト
および酵素溶液をガラスキヤピラリーで吸引することに
よつて除去する。予め洗浄したプロトプラストを、新鮮
なK3培地（浸透性の活性剤として0.4Mサツカロース）で
10mとし、再び浮遊させる。洗浄培地を除去し、培養
または引き続くアグロバクテリアによる感染（コカルチ
ヤー）のため１−２×105/mに希釈する。原形質体濃
度を血球計算盤中で測定する。
ｂ）アグロバクテリウム ツメフアシエンスとのコカル
チヤーによる再生タバコプロトプラストの形質転換： 以下では、Marton他、1979年の方法を若干修正した方
法を用いた。プロトプラストを上述したように単離し、
K3培地（0.4Mサツカロース、0.1mg/1 NAA、0.2mgのキネ
チン）中１−２×105/mの密度で、暗所で２日間そし
て26℃で弱い光（500ルツクス）の下、１〜２日間培養
する。最初の原形質分裂が生じるとすぐ、最少Ａ（Am）
培地中のアグロバクテリウム懸濁液（密度、約109アグ
ロバクテリア/m）の30μを、3mの再生プロトプラ
ストに加える。コカルチヤーの期間は、暗所で20℃、３
〜４日である。この後、たばこ細胞を12mの遠心分離
管に移し、海水（600mOsm/kg）で10mに希釈し、60×
ｇで10分間ペレツト状にした。この洗浄工程を１〜２回
更に繰り返して、ほとんどのアグロバクテリアを除去す
る。細胞懸濁液を５×104/mの密度で、1mg/ NAA
（ナフチル−１−酢酸）、0.2mg/ケネチン、および50
0mg/のセフアロスポリン抗生物質のセフオタキシム
（Cefotaxime）と共に、K3培地（0.3mサツカロース）中
で培養する。各週、細胞懸濁液を新鮮なK3培地で希釈
し、培地の浸透価を、コカルチヤー後２〜３週間、週当
りサツカロースを0.05m（約60mOsm/kg）づつ徐々に減ら
し、カナマイシンを用いた希釈（100mg/カナマイシン
サルフエート）（Sigmaによる）、660mg/gの活性カナマ
イシン）をアグロース−ビード−タイプ培養（Shillito
他、1983年）中で開始する。カナマイシン−耐性のコロ
ニーが、背景の遅れたコロニーからの選択が始まつた後
３〜４週間で、区別される。
ｃ）DNAを用いたタバコプロトプラストの直接形質転
換、硝酸カルシウム/PEG形質転換 180μのK3培地中の約106プロトプラストを、ペトリ
皿中でμ当り0.5μｇのpSR2−４を含有するONA水溶液
20μと一緒に注意深く混合する。200μの融合溶液
（0.1Mの硝酸カルシウム、0.45Mのマンニトールおよび2
5％のポリエチレングリコール（PEG6000）、pH9）を、
続いて注意深く加える。15分後、5mの洗浄溶液（0.27
5Mの硝酸カルシウム、pH6）を加え、そして、更に５分
後、遠心分離管にプロトプラストを移し、60×ｇでペレ
ツト状にする。このペレツトを少量のK3培地中に摂取
し、次章に記述するように培養する。二者択一的に、プ
ロトプラストはHain他、1985年の方法で形質転換され得
る。
ｄ）DNAで培養したプロトプラストの培養およびカナマ
イシン−耐性のカルスの選択 修正“ビード−タイプ培養”技術（Shilito他1983
年）をこの培養に用い、カナマイシン耐性コロニーの選
択を下記に示す。DNAでプロトプラストを処理した後１
週間後（Ｃ参照）、この細胞懸濁液3mを、5cmのペト
リ皿中で、3mのK3培地（0.3Mのサツカロース＋ホルモ
ン類;1.2％の（Seaplaque）LMT Agarose（低融点のアガ
ロース、Marine Colloidsによる）と一緒に混合する。
この目的のため、乾燥アガロースを加圧滅菌し、K3培地
を加えた後、この混合物を極超短波中で短時間沸騰させ
る。アガロースが固化した後、アガロース盤（ビード）
を包埋したタバコミクロカルスと一緒に、次の培養およ
び選択のために10cmのペトリ皿に移し、各場合共、10m
のK3培地（0.3Mのサツカロース、1mg/のNAA、0.2mg
/のキネチンおよび100mg/のカナマイシンスルフエ
ート、Sigmaによる）を加える。この液状の培地を毎週
交換する。この処置の間に、培地の浸透価は次第に降下
する。交換培地（K3＋km）を毎週サツカロース0.05M
（約60mOsm）づつ減らす。
ｅ）カナマイシン耐性植物の再生 カナマイシン耐性コロニーが直径約0.5cmに達すると
すぐ、それらの半分を再生培地（LS培地、２％のサツカ
ロース、0.5mg/のベンジルアミノプーリンBAP）に移
し、24℃で12時光（3000〜5000ルツクス）の成長チヤン
バ中に保存する。他方の半分は、1mg/のNAA、0.2mg/
のキネチン、0.1mg/のBAPおよび100mg/のカナマ
イシンスルフエートを有するLS培地上で、カルス培養と
して繁殖させる。再生した苗条が約1cmの大きさになつ
た時、それらを切り取り、根をはらせるために、成長調
整剤を含有しない1/2LS培地（１％のサツカロース、0.8
％の寒天）に移す。100mg/のカナマイシンスルフエー
トを有する1/2MS培地上に、この苗条を根づかせた後、
土壌に移植する。
ｆ）アグロバクテリウム ツメフアシエンスによる葉盤
の形質転換 葉盤の形質転換のため（Horsch他1985年）、無菌苗条
培養の葉、約２〜3cmの長さのもの、を直径1cmの盤上に
打ち抜き、この盤を、Am培地中に適切なアグロバクテリ
ア（約109/m）（ｂ参照）の懸濁液を用いて、約５分
間培養する（以下を参照）。この感染させた葉の断片
を、ホルモン類の入つていないMS培地（以下を参照）上
に、約24℃で３〜４日間保存する。
この間、アグロバクテリウムは葉の断片上に成育す
る。その後、この葉を断片をMS培地（0.5mg/mのBAP、
0.1mg/mのNAA）中で洗浄し、500μg/mのセフオタキ
シム（Claforan）および100μg/mのカナマイシンスル
フエート（Sigmaによる）を含有する同様の培地（0.8％
の寒天）上に置く。この培地は２週間後新しくするもの
とする。プロトプラストした苗条は、更に２〜３週間
後、見えるようになる。苗条の再生は選択圧なしでも平
行して行なうものとする。再生した苗条は、例えばノパ
リンシンターゼもしくはスチルベンシンターゼ活性のた
めの、生物学的試験によつて、形質転換に関して試験す
るものとする。この方法において、１〜10％の形質転換
した苗条が得られる。
形質転換に関する生化学的検出方法 植物組織中のノパリンの検出： ノパリンは下記に示すように、OttenおよびSchilpero
ort（1978年）およびAerts他、（1979年）によつて示さ
れる方法で検出される。植物物質（カルスもしくは葉の
断片）50mgを0.1Mのアルギニンを有するLS培地中のエツ
ペンドルフ（Eppendorf）管中、室温で一晩培養する。
その後植物物質を吸収性の紙でプロツトし、ガラス棒を
用いて新しいエツペンドルフ遠心分離管中でホモジナイ
ズさせ、このホモジナイズした液を、エツペンドルフ遠
心分離中で２分間遠心分離する。２μの上澄み液を電
気泳動のための適切な紙（Whatman3MM紙）（20×40cm）
上に点として塗布し、乾燥する。この紙を可動相（５％
のぎ酸、15％の酢酸、80％の水、pH1.8）で飽和させ、4
00Vで45分間、電気泳動を行なつた。ノパリンは陰極に
向かつて移動する。その後、この紙を熱風中で乾燥し、
フエナントレンキノン染料を通して、移動する方向に通
過させる（エタノール中の0.02％のフエナントレンキノ
ンと60％濃度エタノール中の10％のNaOHを同量）。乾燥
した紙を長波長のUV光下で検査し、写真をとる。この試
薬で、アルギニンおよびアルギニンの誘導体は蛍光性の
黄色に着色する。
ネオマイシンホスホトランスフエラーゼ（NPT II）酵素
検定： 植物組織中のNPT II活性は、Keisis他（1984年）によ
つて記述される方法、およびSchreier他（1985年）によ
つて修正された方法で、カナマイシンのイン・サイチユ
ー法リン酸化によつて検出される。50mgの植物組織を、
ガラス粉末を添加した50μの抽出緩衝液（10％のグリ
セロール、５％の２−メルカプトエタノール、0.1％のS
DS、0.025％のブロモフエノール・ブルー、62.5mMトリ
スpH6.8）中、氷上でホモジナイズさせ、この混合物を
４℃で10分間エツペンドルフ遠心分離器中で遠心分離す
る。50μの上澄み液を、天然ポリアクリルアミドゲル
（145×110×1.2mm;分離ゲル:10％アクリルアミド、0.3
3％のビスアクリルアミド、0.375MトリスpH8.8、収集す
るゲル:5％のアクリルアミド、0.165％のビスアクリル
アミド、0.125MトリスpH6.8）に移し、４℃60Vで一晩電
気泳動を行なつた。ブロモフエノール・ブルー標識がゲ
ルから出て移動し始めるとすぐ、このゲルを10分間蒸留
水で２回、30分間反応緩衝液（67mMトリスマレイン酸
塩、pH7.1、42mM MgCl2、400mM塩化アンモニウム）で１
回洗浄する。このゲルを、同じ大きさのガラス板上に置
き、基質のカナマイシンスルフエート（20μg/m）お
よび20〜200uCi32pATP（Amersham）を含有する反応緩衝
液中、１％濃度のアガロース40mの層でおおつた。こ
のサンドイツチ状にしたゲルを室温で30分間培養し、そ
してホスホセルロース紙P81（Whatman）のシートを、ア
ガロースの上に置く。この上に、濾紙3MM（Whatman）４
層と２〜３枚のペーパータオルを配する。３〜４時間
後、イン・サイチユー法でりん酸化した放射性カナマイ
シンホスフエートの、P81紙への移行が停止する。このP
81紙を、プロテナーゼＫと１％ドデシル硫酸ナトリウム
（SDS）の溶液中、60℃で30分間培養した後、80℃で、1
0mMりん酸塩緩衝液pH7.5の250m中で３〜４回洗浄し、
乾燥し、そして−70℃で１〜12時間オートラジオグラフ
をとる（XAR5−フイルム、コダツク）。
T4−フアージリゾチーム遺伝子表現の検出 ａ） 細胞培養および植物からのｍ−RNAの単離 細胞培養および植物からRNAを単離するために、植物
物質1g当り0.1gの無菌石英砂、１μのβ−メルカプタ
エタノールおよび1mのHO緩衝液（0.4Mトリス/HCl pH
8、0.1M NaCl、0.04M EDTA、５％SDS、65℃）を加え、
そして、この混合物をホモジナイズした。1mのフエノ
ール／クロロホルム（1:1）を加えた後、更に約２分間
この混合物をホモジナイズした。このホモジエネートを
遠心分離管に移し、この管を激しく振とうした。遠心分
離（10′、10000×ｇ、室温）後、更に2mのフエノー
ル／クロロホルムを加え、この管を激しく振とうした
後、遠心分離した。ポリサツカロイドを除くため、1/4
の容積のエタノールを水相に加え、この混合物を氷上に
10分間置いた後、10000×ｇ、４℃で10分間遠心分離し
た。その後、核酸を２倍の容積のエタノールを用いて沈
殿させ、−70℃で保存した。沈殿したRNAをその後、2m
づつに分けた酢酸ナトリウム（3M、pH6）で２〜３回
洗浄した。このRNAを100μの無菌水に溶解した。
ｂ） RNAの電気泳動 RNA変性:RNAの電気泳動のため、6.75μのRNA（２μ
ｇ）に、３μの５倍緩衝液（0.2M MOPS、50mM酢酸ナ
トリウム、5mM EDTA pH7）、5.25μのホルムアルデヒ
ド（37％濃度）および15μのホルムアミド（脱イオン
化した）を、加えた後、56℃で15分間変性を生じさせ
た。
アガロースゲルの調製:3.5gのアガロースを200mの
水中で沸騰させ、この混合物を60℃に冷却した後、５倍
の緩衝液70mとホルムアルデヒド62mを加えた。この
溶液を水で容積350mとし、ゲル装置中に充填した。こ
の変性RNAを３μの色標識と１μのエチジユームブ
ロマイド（5mg/m）と混合した後、100Vで６時間電気
泳動を行なつた。
ｃ） ノーザンブロツテイング法： 引き続いてこのゲルを無菌水中で10分間３回洗浄し
た。このRNAを、標準ブロツテイング方法（20×SSC中３
〜４時間）を用いて、ニトロセルロースフイルター（Ma
niatis他1982年）に移した。
ｄ） ノーザンブロツト上の雑種形成： pSR2−４から単離したSal I断片100ngを、放射性標識
（比活性＞４×108cpm/μｇ）のため、ニツク翻訳を受
けさせる。ThomzikおよびHain1988年によつて記述され
る方法により、42℃で一晩雑種形成を行なつた。
この方法は、形質転換したタバコ中のT4−フアージ−
リゾチームに特異なmRNAの合成を検出するために用いら
れる。
ウエスタンブロツテイング法によるタバコ中のT4−フア
ージリゾチームの検出 タバコから全たん白質を単離するために、100mgの植
物物質を２倍に濃縮したSDSサンプル緩衝液（150mMトリ
ス/HCl pH6.8、２％SDS、20％グリセロール、0.004％ブ
ロモフエノール・ブルー、200mM DTT、5mMアスコルビン
酸および10mM CHAPS）中でホモジナイズした後、この混
合物を95℃で５分間培養した。遠心分離（10000×ｇ、
５分間）した後、整除できる数に分けた上澄み液（10〜
100μｇの全たん白質）を、15％のSDSポリアクリルアミ
ドゲルに移し、60Vで12時間電気泳動を行なつた。分離
したたん白質を、その後、移動緩衝液（25mMトリス塩
基、192mMグリシンおよび20％のメタノール）中、エレ
クトロブロツテイング（２時間、0.8〜1A）によつて、P
VDFイモビロン（Immobilon）膜へ移した。ひき続いてこ
の膜をPBA中の５％のウシ科の動物の血清アルブミン（B
SA）中で30分間培養した。PBA中の0.1％のBSAを用いて
３回洗浄した後、この膜を多クローン性T4−リゾチーム
に特異な抗体と共に２時間培養した。0.1％のBSA/PBA中
で３回洗浄（各々５分間）した後、この膜を、金で標識
した抗体（Auro ProbeR kit,Janssen Chemieからのやぎ
抗−ラビツト）を用いて、この業者によつて示されるよ
うに２時間培養した。PBA中の0.1％のBSAおよび水で洗
浄した後、この膜をエンハンサー／イニシエーター（1:
1）で着色させた。
3.ソラナムチユーベロサム（Solanum taberosum）（じ
やがいも）の形質転換 EP−A 0,242,246、14〜15頁、プラスミドpSR2−４の
リゾチーム遺伝子構造を有するTiプラスミドを有するア
グロバクテリア、に記載されるのと全く同様の方法によ
る形質転換で形質転換した。
特に規定されていない限り、上記実施例中の全ての百
分率は重量％である。
上記実施例に従つて得られた植物細胞および植物にお
いて、リゾチーム遺伝子の存在はサザンブロツト分析法
によつて確認された。リゾチーム遺伝子の表現は、特定
の抗体の助けによるノーザンブロツト分析法およびリゾ
チームで検出された。形質転換したそして形質転換して
いない植物（比較のため）に、ボトリシスシネラ（Botr
ytis cinera）およびアルテルナリアロンギペス（Alter
naria longipes）の胞子懸濁液を噴霧した後、１週間
後、菌・かびによる感染を記録した。形質転換していな
い比較植物に比べて、形質転換した植物は、菌・かびに
よる感染に対して、増大した抵抗力を示した。
増大した抵抗力の検出の実施例 菌・かびによる植物の病気に対して、植物中で合成さ
れたリゾチームによつて増大された抵抗力を試験するた
めに、植物を病原と一緒に培養し、その感染の度合いを
パラメーターとして用いた。
用いた試験病原体はAlternaria longipes（Ell ＆ Ev
erh）MasonおよびBotrytis cinerea Presである。
タバコの植物を標準土壌（Balsterによる）が入つて
いるポツト（直径11cm）中に鉢植えし、実験を開始する
まで、23℃で相対湿度70〜80％の温室中で成育させる。
この植物に必要な水と栄養を与える。摂種のため、５〜
８週目の古い植物の葉に病原体の胞子懸濁液を流れ出す
まで噴霧する。引き続いて、この植物を病原体の好む条
件下、初期の相対湿度100％で21℃、で培養する。４〜
８日後、植物の健康状態を、感染させた葉の部分を基準
にして、パーセントで測定する。
表（ＩおよびII）からわかるように、実施例２に従つ
てpBR2−４で形質転換した植物は、野生種のSR1に比較
して、Alternaria longipes並びにBotrytis cinereaに
対して低い感染を示している。
植物もしくは植物細胞の形質転換に用いた培地のいく
つかを以下に示す。
Am培地 3.5g K2HPO4 1.5g KH2PO4 0.5g クエン酸 Na3 0.1g MgSO4×7H2O 1 g （NH4）2SO4 2 g グルコース １に対して タバコの無菌苗条培養用の培地 マクロ要素:MS塩の濃縮物の1/2 ミクロ要素:MS塩の濃縮物の1/2 Fe EDTA MurashigeおよびSkoog（MS） ミヨ・イノシトール 100mg/ サツカロース 10mg/ 寒天 8g/ ビタミン類 パントテン酸Ca 1mg/ ビオチン 10mg/ ニコチン酸 1mg/ ピリドキシン 1mg/ チアミン 1mg/ 加圧滅菌前のpH5.7 K3培地 Nicotiana tabacum petit Havana SRI、Nicotiana ta
bacum Wisconsin 38およびNicotiana Plumaginifolia原
形質体培養用（NogyおよびMaliga、1976年） フイルター無菌 LinsmaierおよびSkoog培地（LinsmaierおよびSkoog1965
年） 再生プロトプラスト培養用およびタバコ腫瘍およびカ
ルスの組織培養用。LinsmaierおよびSkoog（LS）培地は
下記の修正を行なつたMurashigeおよびSkoog培地（Mura
shigeおよびSkoog、1962年）である： −0.1mg/の代わりに0.4mg/の高濃度でチアミンを計
量 −グリシン、ピリドキシンおよびニコチン酸を不使用。
下記の参考文献は、植物もしくは植物細胞の形質転換
に関連しており、本発明に従つて用いられるリゾチーム
遺伝子に関連している： Aets M,Jacobs M,Hernalsteens JP,Van Montagu M,Sche
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uniaプロトプラストの形質転換。Plant Sci Lett 18:30
7−313 K.Dring、博士論文、Cologne大学、1988年:Wu
ndinduzierbare Expression und Sekretion von T4 Lys
ozym und monoklonalen Antikrpern in Nicotiana ta
bacum［創傷誘導の表現およびT4−リゾチームの分泌作
用およびNicotiana tabacum中の単クローン抗体］。
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ーシヨンによる遺伝子転移後のとうもろこしの安定形質
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の簡単一で一般的な方法。Science277:1229−1231 Krebs FH,Molendijk L.,Wullems GJ,Schilperoort RA
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験管形質転換。Nature 296:72−74 Koncz C,Schell J（1986年）TL−DNA遺伝子５のプロモ
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有する共生体的遺伝子の組織に特異な表現を制御する。
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的成長因子要求。Physiol Plant 18:100−127 Marton L,Wullems GJ,Molendijk L,Schilperoort PR（1
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bacumからの培養細胞の試験管形質転換。Nature 277:12
29−131Nagy JI,Maliga P（1976年）Nicotiana Sylvest
risの葉肉原形質体からのカルス誘導および植物再生。Z
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換に用いるための選択表現プラスミド・ベクター。NAR
13:6981−6998 Zambryski P.Joos H,Genetello C,van Montagu M,Schel
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NA導入するためのTi−プラスミド・ベクター、EMBO J 1
2:2143−2150。
Bernd Reiss,Rolf Sprengel,Hans WillおよびHeinz Sch
aller（1984年）粗細胞束中のネオマイシンホスホトラ
ンスフエラーゼの定性的および定量的検定のための新規
の鋭敏な方法、GENE1081:211−217 Peter H.Schreier,Elisabeth A.Seftor,Jozef Schellお
よびHans J.Bohnert（1985年）光調整の合成を管理する
核をコードする配列の使用、および、異質たん白質の植
物クロロプラスト中への輪送、ENBO J Vol.4、No.1:25
−32。
下記の公開された特許出願も示す。
ヨーロツパ特許公開−Ａ 116,718 ヨーロツパ特許公開−Ａ 159,418 ヨーロツパ特許公開−Ａ 120,515 ヨーロツパ特許公開−Ａ 120,516 ヨーロツパ特許公開−Ａ 172,112 ヨーロツパ特許公開−Ａ 140,556 ヨーロツパ特許公開−Ａ 174,166 ヨーロツパ特許公開−Ａ 122,791 ヨーロツパ特許公開−Ａ 126,546 ヨーロツパ特許公開−Ａ 164,597 ヨーロツパ特許公開−Ａ 175,966 PCT特許 84/02913 PCT特許 84/02919 PCT特許 84/02920 PCT特許 83/01176 ヨーロツパ特許公開−Ａ 0,270,356
【図面の簡単な説明】
第１図は、本発明の実施例におけるプラスミドpSR2−４
における各遺伝子の配置を示す概略図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (73)特許権者 591063187 Ｄ−51368 Ｌｅｖｅｒｋｕｓｅｎ，Ｇ ｅｒｍａｎｙ (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 15/09 A01N 63/00 ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (10)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】菌・かびおよび動物性有害生物に対して双
    子葉植物の抵抗力を増大させるためのリゾチームを発現
    するリゾチーム遺伝子構造物の使用方法であって、該遺
    伝子構造物が、Tiプラスミド由来のTRプロモーター、大
    麦α−アミラーゼのシグナルペプチド配列および１個以
    上のリゾチーム遺伝子のキメラ遺伝子融合物から成るか
    または該キメラ遺伝子融合物を含んで成ることを特徴と
    する方法。
  2. 【請求項２】菌・かびおよび動物性有害生物に対して増
    大した抵抗力を有する双子葉植物を作出すためのリゾチ
    ームを発現するリゾチーム遺伝子構造物の使用方法であ
    って、該遺伝子構造物が、Tiプラスミド由来のTRプロモ
    ーター、大麦α−アミラーゼのシグナルペプチド配列お
    よび１個以上のリゾチーム遺伝子のキメラ遺伝子融合物
    から成るか、または該キメラ遺伝子融合物を含んで成る
    ことを特徴とする方法。
  3. 【請求項３】リゾチーム遺伝子構造物が非植物性起源の
    リゾチーム遺伝子を有する請求項１または２記載の方
    法。
  4. 【請求項４】リゾチーム遺伝子構造物がにわとりのアル
    ブミンリゾチーム遺伝子および／またはT4−フアージリ
    ゾチーム遺伝子を有する請求項１または２記載の方法。
  5. 【請求項５】リゾチーム遺伝子構造物がプラスミドpSR2
    −４上に存在するものであるか或いは、本質的にそれと
    同様に作用するそのDNA配列を有する請求項１〜４のい
    ずれかに記載の方法。
  6. 【請求項６】菌・かびおよび動物性有害生物に対する抵
    抗力を増大させるためにプロトプラストを包含する双子
    葉植物の細胞または種子および該植物の部分を包含する
    双子葉植物を形質転換するためのリゾチームを発現する
    リゾチーム遺伝子構造物の使用方法であって、該構造物
    が、Tiプラスミド由来のTRプロモーター、大麦α−アミ
    ラーゼのシグナルペプチド配列および１個以上のリゾチ
    ーム遺伝子のキメラ遺伝子融合物から成るかまたは該キ
    メラ遺伝子融合物を含んで成ることを特徴とする方法。
  7. 【請求項７】菌・かびおよび動物性有害生物に対する増
    大した抵抗力を有し、そしてゲノム中に１個以上のリゾ
    チーム遺伝子構造物を担持する形質転換されたプロトプ
    ラストを包含する双子葉植物の細胞あるいは種子および
    植物の部分を包含する双子葉植物であって、該遺伝子構
    造物がTiプラスミド由来のTRプロモーター、大麦α−ア
    ミラーゼのシグナルペプチド配列および１個以上のリゾ
    チーム遺伝子のキメラ遺伝子融合物から成るか、または
    該遺伝子融合物を含んで成ることを特徴とする双子葉植
    物。
  8. 【請求項８】（ａ）Tiプラスミド由来のTRプロモータ
    ー、大麦α−アミラーゼのシグナルペプチド配列および
    １個以上のリゾチーム遺伝子のキメラ遺伝子融合物から
    成るか、または、これらのキメラ遺伝子融合物を含んで
    成ることを特徴とする、１個以上のリゾチーム遺伝子構
    造物がプロトプラストを包含する双子葉植物の細胞のゲ
    ノム中に導入され、そして、適宜、 （ｂ）完全に形質転換された該植物が、形質転換された
    プロトプラストを包含する該植物細胞から再生され、そ
    して適宜、 （ｃ）種子を包含する該植物の所望の部分が結果として
    得られる形質転換された該植物もしくはそれらの子孫か
    ら得られる、 ことを特徴とする、請求項７記載の、菌・かびおよび動
    物性有害生物に対して増大した抵抗力を有する形質転換
    されたプロトプラストを包含する双子葉植物の細胞また
    は種子および植物の部分を包含する双子葉植物の作出方
    法。
  9. 【請求項９】菌・かびおよび動物性有害生物に対して増
    大した抵抗力を有する双子葉植物の種子、枝条または台
    芽を作出すため、あるいは、新規な該植物またはそれら
    の双子葉植物の種子、枝条または台芽を作出すための、
    請求項７記載の、形質転換したプロトプラストを包含す
    る双子葉植物の細胞または種子および植物の部分を包含
    する双子葉植物の使用方法。
  10. 【請求項１０】請求項７記載の形質転換した双子葉植物
    の細胞あるいは該植物を繁殖させることによって得るこ
    とのできる、菌・かびおよび動物性有害生物に対して増
    大した抵抗力を有する、双子葉植物の種子、枝条または
    台芽。
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