DE19547272C1 - Ein Expressionssystem für die anaerobe Genexpression in höheren Pflanzen - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Expressionssystem für die anaerobe Genexpression in höheren Pflanzen. Ein konkretes Anwendungsgebiet der Erfindung ist die Landwirtschaft, insbesondere die Resistenzzüchtung und die Steigerung der Leistungsfähigkeit von Nutzpflanzen.

Der Verlust an Erntegut durch Erkrankungen von Pflanzen ist ein weltweites Problem. Zum Beispiel führt die Erkrankung der Kartoffel an Knollennaßfäule (Verfaulen der Knolle) und Schwarzbeinigkeit (Verfaulen der unteren Stengelabschnitte), nach Infektion durch das phytopathogene Bakterium Erwinia carotovora, weltweit zu Ernteverlusten in einer geschätzten Höhe von 100 Millionen Dollar (P´rombelon und Kelman, 1980). Es gibt eine Reihe von Arbeiten, die sich mit der gentechnischen Übertragung von Resistenzfaktoren auf Pflanzen beschäftigen (Lamb et al., 1992, Bio/Technology, 10, 1436-1445; Hain und Fischer, 1994, Current Opinion in Biotechnology, 125-130; Zhu et al., 1994, Bio/Technology, 12, 807-812). Zur Resistenzsteigerung der Kartoffel gegenüber Erwinia carotovora wurde das T4 Lysozymgen des Bakteriophagen T4 in transgenen Kartoffeln exprimiert (Düring et al., 1993, Plant J. 3, 587-598).

Da sich bakterielle Erkrankungen von Pflanzen jedoch oft unter anaeroben Bedingungen ausbreiten, werden die bisher übertragenen Resistenzfaktoren für Pflanzen nur sehr eingeschränkt wirksam. Das gilt besonders für die oben erwähnte Erkrankung der Kartoffel an Knollennaßfäule und Schwarzbeinigkeit, da die Infektion durch Erwinia carotovora überwiegend unter anaeroben Bedingungen erfolgt. Verstärkt wird dieser Effekt noch durch die Bildung eines Schleims aus Bakterien und Abbauprodukten der pflanzlichen Zellwand. Für eine effektive Expression eines antibakteriellen Proteins unter optimalen Bedingungen ist deshalb die Steuerung des entsprechenden Fremdgens durch einen unter diesen Bedingungen aktiven Promotor anzustreben.

Bisher wurden 3 anaerobe Promotoren in transgenen Pflanzen getestet: Dabei handelt es sich um den Adh1 Promotor aus Mais, den Adh Promotor aus Arabidopsis thaliana und den GapC Promotor aus Arabidopsis thaliana. Der Adh1 Promotor aus Mais wurde in Tabak und Reis untersucht (Ellis et al., 1987, EMBO J. 6, 11-16; Kyozuka et al., 1991, Mol. Gen. Genet. 228, 40-48), der GapC Promotor aus Arabidopsis wurde in Tabak (Yang et al., 1993, Plant Physiol. 101, 209-210), und der Adh Promotor aus Arabidopsis wurde in Arabidopsis selber untersucht (Dolferus et al., 1994, Plant Physiol. 105, 1075-1087). Dabei stellte sich heraus, daß alle Promotoren nur eine 2 bis 81fache Induktion des Reportergens über Hintergrund vermitteln und nicht in allen Geweben aktiv sind.

Ziel der Erfindung ist es, die Expression von Resistenz­ faktoren in Nutzpflanzen zu erreichen und entsprechende transgene Pflanzen zu züchten. Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, die anaerobe Expression des T4 Lysozymgens in der Kartoffel zu erreichen und entsprechende transgene Pflanzen zu erzeugen. Eine spezifische Aufgabe besteht darin, Kartoffeln gegenüber phytopathogenen Bakterien resistent zu machen.

Die Aufgabe der Erfindung wird durch ein Expressionssystem gelöst, das den Promotor GapC4 oder Teile oder Varianten des Promotors GapC4 und ein zu exprimierendes Gen umfaßt.

Gemäß der Erfindung handelt es um Gene für ein antibakterielles Protein, insbesondere für T4-Lysozym, um Resistenzgene gegen Viren, Nematoden, Bakterien und Pilze, Gene mit insektizider Wirkung, glykolyse-steigernde Gene und gärungssteigernde Gene.

Das Expressionssystem wird für die anaerobe Genexpression in höheren Pflanzen angewendet. Bevorzugt kommt es in Kulturpflanzen wie Kartoffeln, Reis, Getreide, Mais, Tomaten, Brassicaceen und Möhren zur Anwendung.

Die Erfindung betrifft auch transgene Eukaryonten wie höhere Pflanzen, vorzugsweise transgene Kulturpflanzen wie Kartoffeln, Reis, Getreide, Mais, Tomaten, Brassicaceen und Möhren, die das Expressionssystem enthalten.

Von besonderer Bedeutung sind transgene Kartoffeln, die ein Expressionssystem aus Promotor GapC4 und dem Gen für T4-Lysozym enthalten.

Der große Vorteil des eingesetzten Promotors GapC4 (GenBank Accession Nr. L40803) besteht darin, daß er ein für die Zielstellung hervorragend geeignetes Induktionsprofil hat. Die anaerobe Expression erreicht die Stärke des unter aeroben Bedingungen für die Expression von Fremdgenen häufig verwendeten 35S Promotors des Blumenkohl Mosaikvirus (35S CaMV). Weiterhin ist der Promotor in allen Geweben, wie Blüte, Blatt und Wurzel, aktiv. Bisher wurde die Isolierung des GapC4 Gens sowie die anaerobe Induktion des GapC4 Promotors in einem transienten Expressionssystem in Mais Suspensionskulturzellen veröffentlicht (Kersanach et al., 1994, Nature 367: 387-389).

Überraschenderweise ist der Promotor besonders in der Kulturpflanze Kartoffel aktiv.

Ein weiteres Problem sind besonders in feuchtem Klima zeitweise Überflutungen von Feldern, die zu Ernteausfällen führen können. Als aerobe Organismen können Pflanzen längere Perioden großer Feuchtigkeit, die zur Abnahme des für die Pflanze verfügbaren Sauerstoffs führt, nicht überleben (Perata und Alpi, 1993, Plant Sci. 93, 1-17). Die Toleranz von Pflanzen gegenüber unzureichender Sauerstoffversorgung ist für einzelne Arten recht unterschiedlich. So keimt der Embryo in der Reis-Karyopse auch unter solchen Bedingungen ohne Schwierigkeiten, wohingegen Maiskeimlinge nur ca. 24 Stunden ohne Sauerstoff überleben. Eine generelle Anpassungsstrategie höherer Pflanzen an anaerobe Bedingungen ist die Steigerung der Glykolyse sowie das Anschalten von Gärvorgängen. Um die Toleranz von Pflanzen gegenüber unzureichender Sauerstoffversorgung zu erhöhen, können die Gene, die bei der Glykolyse sowie bei der Gärung beteiligt sind unter die Kontrolle eines anaerob induzierbaren Promotors gebracht werden. Diese Gene werden dann bei unzureichender Sauerstoffversorgung exprimiert.

Das Expressionssystem wird nachfolgend an Ausführungsbeispielen näher erläutert.

Ausführungsbeispiel

Um zu untersuchen, ob der GapC4 Promotor bei der Kartoffel anaerob, sowie nach Infektion mit Erwinia carotovora induziert wird, werden GapC4 Promotor-Reportergenkonstrukte in die Kartoffel transformiert. Nach Infektion der transgenen Kartoffel mit Erwinia carotovora, sowie nach Inkubation von Geweben der transgenen Kartoffel unter anaeroben Bedingungen kann die Reportergenexpression gemessen werden. Das Reportergen kann dann in vitro durch das T4 Lysozymgen ersetzt werden und in die Kartoffel transformiert werden. Die transgenen Kartoffeln werden anschließend auf erhöhte Resistenz gegen Erwinia carotovora untersucht.

Die Reportergenkonstrukte wurden wie im folgenden beschrieben konstruiert:
Alle Agrobakterium T-DNA Konstrukte basieren auf dem binären Vektor pOCA28 (Honma et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 6242-6246; Olszewski et al., 1988, Nucleic Acids Res 16, 10765-10782). Für T-DNA Konstrukte wurden Plasmide pUK443 und pUK444, die 785 bzw. 461 Basenpaare des GapC4 Promotors, das erste Intron des GapC4 Gens sowie das β-Glucuronidase Reportergen tragen, eingesetzt. Um mögliche negative Effekte des GapC4 Introns aus Mais in transgenen Tabakpflanzen und Kartoffeln auszuschließen, wurde das Intron durch Restriktionsverdau mit den Enzymen XhoI und NcoI aus den Plasmiden pUK443 und pUK444 herausgeschnitten. Nach einer Auffüllrekation der durch Restriktionsverdau entstandenen Enden wurden die intronlosen Plasmide pUK403 und pUK404 erzeugt. Die Promotor-Reportergenfragmente dieser Plasmide wurden durch einen PvuII Verdau herausgeschnitten und in die SmaI Schnittstelle von pOCA28 kloniert. Die daraus resultierenden pOCA28 Derivate, pUK4030, 4040 und 4041 tragen das GapC4 Promotor-Reportergenkonstrukt. Als Kontrolle wurde das promotorlose β-Glucuronidase Reportergen in pOCA28 kloniert. pUK4030 und 4040 tragen die Reportergenkonstrukte mit dem Promotor proximal zur rechten T-DNA Bordersequenz. In pUK4041 liegt das Reportergen in der anderen Orientierung vor.

Alle rekombinanten DNA Techniken werden nach Standardprotokollen durchgeführt (Sambrook et al., 1989, Molecular cloning. A laboratory manual. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press).

Für die Klonierung des T4-Lysozymgens, kann das β-Glucuronidase Reportergen aus den Plasmiden pUK403 oder 404 durch Restriktionsverdau entfernt und an seine Stelle das T4-Lysozymgen hineinkloniert werden. Das durch den GapC4 Promotor kontrollierte T4 Lysozymgen wird in einen Agrobakterium T-DNA Vektor umkloniert. Alle Konstrukte werden nach Einführung in Agrobacterium tumefaciens gemäß Standardprotokollen in die Kartoffel transformiert (Düring et al., 1993, Plant J. 3, 587-598; Fladung, 1990, Plants Breeding 104, 295-304). Transgene Kartoffeln werden mit Hilfe eines Antibiotikaresistenzgens auf der T-DNA selektiert und werden auf Expression des eingeführten β-Glucuronidase Reportergens und des T4 Lysozymgens unter anaeroben Bedingungen sowie nach Infektion mit Erwinia carotovora untersucht.

Zur anaeroben Induktion wird pflanzliches Gewebe in einem luftdichten Glasbehälter (Merck) zusammen mit Anaerocult A (Merck) für ca. mindestens 12 Stunden inkubiert. Für den fluorimetrischen GUS assay wird das Pflanzenmaterial homogenisiert und mit dem β-Glucuronidase Substrat 4-Methylumbelliferyl-β-D-Glucuronid (MUG) bei 37°C inkubiert. Quantifizierungen der Fluoreszenz wird nach Jefferson et al., EMBO J. 6, 3901-3907 (1987) durchgeführt und Proteinkon­ zentrationen werden nach Bradford, Anal. Biochem. 7, 248-254 (1976) bestimmt. Um die Gewebespezifität der Reportergenexpression zu messen wird das intakte anaerob induzierte Pflanzenmaterial mit einer Lösung 1 mM X-Gluc (5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl-β-D-Glucuronsäure) vakuuminfiltriert und über Nacht bei 37°C inkubiert. Zur besseren Sichtbarmachung der Anfärbung wird das Chlorophyll mit 70% Ethanol extrahiert (Jefferson s. o.).

Um die Expression des T4 Lysozymgens zu messen, werden nach anaerober Inkubation des Gewebes Northern blot Analysen mit einer T4-Lysozym spezifischen Sonde durchgeführt. Gesamt RNA wird mit dem RNeasy Kit isoliert (Qiagen). Die Konzentration der RNA wird photometrisch bestimmt und 10 mg der RNA wird in eine Spur auf ein 1% Agarosegel gegeben, welches Formaldehyd enthält. Nach Elektrophorese wird die RNA aus dem Gel mit 0,05 N NaOH als Transferpuffer auf Nitrozellulose oder Nylonmembranen (Amersham) geblottet (Sambrook et al. s. o.). Markierung und Hybridisierung der T4 Lysozym spezifischen Sonde mit dem RNA Filter erfolgt nach Standardbedingungen (Sambrook et al. s. o., Düring et al., s. o.).

Nach Bestätigung der anaeroben Induktion des Reportergens sowie des T4-Lysozymgens wird untersucht, ob beide Gene auch nach Infektion mit dem phytopathogenen Bakterium Erwinia carotovora induziert werden, bzw. ob das T4 Lysozym-Gen unter der Kontrolle des GapC4-Promotors so aktiviert wird, daß es Resistenz vermittelt. Die Induktion des Reportergens und des T4 Lysozym-Gens wird wie oben beschrieben bestimmt. Dafür wird das unter dem mazerierten Gewebe liegende Knollenmaterial genutzt.

Der Infektionstest wird mit einem pathogenen Stamm von Erwinia carotovora ssp. atroseptica oder ssp. carotovora in Plastikbehältern unter Luftabschluß durchgeführt. Aus Kartoffelknollen werden Scheiben definierter Größe hergestellt und in frisch geschnittenem Zustand mit einer definierten Anzahl von Bakterienzellen in einem kleinen Volumen in der Mitte inokuliert. Die Inkubation erfolgt in Plastikbehältern mit einer Wasserschicht auf dem Boden auf einem durchnäßten Filterpapier. Dadurch wird gesättigte Luftfeuchtigkeit erreicht. Das Bakterienwachstum wird anhand der Gewebemazeration und des entstehenden Bakterienschleims nachverfolgt. Durch den sich bildenden Bakterienschleim erfolgt eine luftabschließende Abdeckung der Kartoffelzellen. In Abhängigkeit von der Inokulumsdichte wird nach einer definierten Zeit das Ausmaß der Mazeration bestimmt. Durch Vergleich mit Kontrollexplantaten kann der relative Rückgang der Suszeptibilität festgestellt werden.

Alternativ können mit Bakterien infizierte Augenstecklinge unter feuchten Bedingungen im Gewächshaus ausgepflanzt und kultiviert werden. Durch Verschlämmung der Erde kommt es zu Sauerstoffarmut, die die Vermehrung der Bakterien begünstigt. Die Anzahl aufgelaufener, gesunder Sprosse wird im Vergleich zu Kontrollexplantaten bestimmt. Dadurch ist das Ausmaß der reduzierten Suszeptibilität bestimmbar.

Claims (15)

1. Expressionssystem für die anaerobe Genexpression in höheren Pflanzen umfassend den Promotor GapC4 und ein zu exprimierendes Gen.

2. Expressionssystem nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch Teile oder Varianten des Promotors GapC4.

3. Expressionssystem nach Anspruch 1 und 2, gekennzeichnet durch ein Gen für ein antibakterielles Protein.

4. Expressionssystem nach Anspruch 3, gekennzeichnet durch ein Gen für T4-Lysozym.

5. Expressionssystem nach Anspruch 1 und 2, gekennzeichnet durch Resistenzgene gegen Viren, Nematoden, Bakterien und Pilze.

6. Expressionssystem nach Anspruch 1 und 2, gekennzeichnet durch Gene mit insektizider Wirkung.

7. Expressionssystem nach Anspruch 1 und 2, gekennzeichnet durch glykolysesteigernde Gene.

8. Expressionssystem nach Anspruch 1 und 2, gekennzeichnet durch gärungssteigernde Gene.

9. Expressionssystem nach Anspruch 1 bis 8 zur Anwendung in allen höheren Pflanzen.

10. Expressionssystem nach Anspruch 1 bis 8 zur Anwendung in Kulturpflanzen.

11. Expressionssystem nach Anspruch 10 zur Anwendung in Kartoffeln, Reis, Getreide, Mais, Tomaten, Brassicaceen und Möhren.

12. Transgene Eukaryonten, enthaltend ein Expressionssystem nach einem der Ansprüche 1 bis 11.

13. Transgene höhere Pflanzen nach Anspruch 12.

14. Transgene Kulturpflanzen nach Anspruch 12.

15. Transgene Kartoffeln enthaltend ein Expressionssystem aus Promotor GapC4 und dem Gen für T4-Lysozym.