DE10024740A1 - Verfahren zur gesteuerten Eliminierung gewünschter DNA-Sequenzen in Wirtsorganismen - Google Patents

Abstract

Beschrieben wird ein auf einem Ligandenbindungsdomäne-Rekombinase-Fusionsprotein (Rec-LBD) basierenden Verfahren zur gesteuerten Eliminierung einer gewünschten DNA-Sequenz in einem Wirtsorganismus, vorzugsweise einer transgenen Pflanze, wobei die Eliminierung der gewünschten DNA-Sequenz erst nach Expression des aktiven Rec-LBD durch Aktivierung des induzierbaren Promotors, unter dessen Kontrolle das Rec-LBD kodierende Gen steht, und Zugabe des spezifisch an das Rec-LBD bindenden Liganden erfolgt. Vorzugsweise kodiert die zu eliminierende DNA-Sequenz für ein Markergen oder wirkt als Transkriptions- bzw. Translationsstop-Sequenz. Beschrieben werden auch für das erfindungsgemäße Verfahren geeignete Vektoren und Wirtsorganismen, wobei es sich vorzugsweise um transgene Pflanzen handelt.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur gesteuerten Eliminierung einer gewünschten DNA-Sequenz in einem Wirtsorganismus, vorzugsweise einer transgenen Pflanze, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt (I) der Wirtsorganismus mit (a) der später zu eliminierenden, 5' und 3' von Rekombinations-DNA-Sequenzen flankierten DNA-Sequenz und (b) einer diese Rekombinations-DNA-Sequenzen erkennenden Ligandenbindungsdomäne-Rekombinase-Fusionsprotein (Rec-LBD) kodierenden, unter der Kontrolle eines induzierbaren Promotors stehenden DNA-Sequenz unter Bedingungen transformiert wird, unter denen der induzierbare Promotor reprimiert wird, wobei der spezifisch an Rec-LBD bindende Ligand abwesend ist; und in Schritt (II) die Eliminierung der zu eliminierenden DNA- Sequenz über die Expression von Rec-LBD durch Aktivierung des induzierbaren Promotors und die Aktivierung von Rec-LBD durch Zugabe des spezifisch an Rec-LBD bindenden Liganden zum gewünschten Zeitpunkt erfolgt. In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens kodiert die zu eliminierende DNA-Sequenz für ein Markergen oder wirkt als Transkriptions- bzw. Translationsstop-Sequenz. Die vorliegende Erfindung betrifft auch die vorstehenden Sequenzen (a) und (b) enthaltende Vektoren und Wirtsorganismen, wobei es sich vorzugsweise um transgene Pflanzen handelt.

Die ungerichtete Integration fremder DNA in Pflanzenzellen ist grundsätzlich möglich. Im Vergleich zu den bei Human-, Säuger- oder Insektenzellen angewandten Technologien zur gezielten Integration von DNA an bestimmte Positionen des Genoms bzw. gerichteten Exzision der integrierten DNA, konnten diese Technologien bei Pflanzen bisher nicht anwendungsfähig etabliert werden. Die Entfernung von DNA wird in Prokaryoten und in Human-, Säuger- oder Insektenzellen z. B. durch den Einsatz von sequenzspezifischen Rekombinasen erreicht. Anfangs stellte man die entsprechenden integrierten Rekombinase-Gene unter die Kontrolle induzierbarer oder gewebespezifischer Promotoren, um so den Zeitpunkt bzw. den Ort der DNA-Eliminierung steuern zu können. Jedoch erwies sich die Steuerung über einen induzierbaren oder gewebespezifischen Promotor bisher als nicht ausreichend flexibel und kontrollierbar. Zudem ist die Verfügbarkeit ideal geeigneter Promotoren ohne wesentliche Einschränkungen in der Spezifität äußerst gering.

Alternativ wurde der Ansatz der funktionellen Repression der Rekombinasefunktion durch die Fusion einer Ligandenbindungsdomäne eines nukleären Rezeptors an die Rekombinase verfolgt. Das Rec-LBD-Fusionsprotein erwies sich als enzymatisch reprimiert, wobei durch Zugabe des Liganden die Enzymfunktion wiederhergestellt werden konnte (EP-B1 0 707 599). Aber auch hier kann keine vollkommene Repression erhalten werden, beispielsweise aufgrund einer Proteinspaltung an der Fusionsstelle durch wirtsspezifische Proteasen, die die funktionelle Rekombinase freisetzen können. Dies geht aus (Logie und Stewart, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 (1995), 5940-5944) hervor.

Grundsätzlich weisen Repressionssysteme, die auf der Wirkung eines einzelnen Faktors beruhen, ein inhärentes Risiko der unvollständigen Repression auf. Bei induzierbaren Promotoren ist es kaum möglich, alle denkbaren Zustände zu untersuchen, die trotz einer guten Repression dennoch zu einer ungewollten Induktion führen können. Gewebespezifische Promotoren sind gleichartig limitiert, da auch hier eine eindeutige und vollständige Repression in Nichtzielgeweben nicht hundertprozentig sicherzustellen ist. Ähnlich verhält es sich mit der funktionellen Inhibition von Enzymaktivitäten durch Fusion mit einer Ligandenbindungsdomäne.

Eine bedingte Funktionalität von Rekombinase-vermittelter DNA-Eliminierung aus transgenen Pflanzen ist bereits gezeigt worden und sequenzspezifische Rekombinasen und deren an bestimmte Stellen des Pflanzengenoms integrierte Rekombinationsstellen sind auch für die Integration von DNA-Sequenzen an bestimmte Positionen im Pflanzengenom geeignet. Bis heute ist jedoch für die kontrollierte sequenzspezifische DNA-Integration oder DNA-Eliminierung kein System bekannt, das zur Anwendungsreife gelangt wäre. Vielmehr haben sich auch in transgenen Pflanzen die oben beschriebenen Nachteile und Einschränkungen bestätigt. Außerdem kommt bei Pflanzen im Vergleich zu anderen eukaryotischen Organismen für die Regulierung eines Rec-LBD-Systems noch erschwerend die Vielzahl von sekundären Inhaltsstoffen hinzu. So ist insbesondere eine Kreuzreaktion mit natürlich vorkommenden Steroid-verwandten Substanzen, wie Brassino-Steroiden o. ä., zu beachten. Ein erfolgreicher Einsatz des Rec-LBD-Systems in einer Pflanzenart garantiert somit nicht eine Übertragbarkeit auf eine andere Pflanzenart.

Die Anwendung von sequenzspezifischen Rekombinasen in transgenen Pflanzen erfolgte bisher für die Entwicklung von Markergen-Entfernungssystemen. Hierbei wurden vor allem durch Chemikalien induzierbare Promotoren eingesetzt. Allerdings zeigten sich verschiedene Ausführungsformen von Tetrazyklin­ reprimierten oder -induzierten Promotoren als nicht ausreichend geeignet, um eine unkontrollierte vorzeitige Aktivierung der Rekombinase zuverlässig zu unterdrücken. Die Anwesenheit des selektierbaren Markergens ist aber für die Selektion homogener, transgener Pflanzen aus der Agrobakterien-vermittelten Transformation über einen langen Zeitraum unbedingt notwendig, da es ansonsten zur Ausbildung chimärer Pflanzen kommt, die zum Teil aus transgenen Zellen, zum Teil aus nicht-transgenen durchgewachsenen Zellen bestehen. Handelt es sich um eine vegetativ vermehrte Pflanzenart, so führt dies zu einer Unkontrollierbarkeit des genutzten Pflanzenmaterials, die alleine schon aus regulatorischen Gesichtspunkten, noch mehr aber aus praktischen Aspekten heraus nicht akzeptabel ist. Bei einer sexuell vermehrten Pflanzenart kann ein Aussortieren nicht transgener Zellen über den Pollen bzw. die durch Befruchtung erzeugten Nachkommen und deren Aufspaltung entsprechend den Mendelschen Regeln erfolgen. Dies führt aber zu einer erheblichen Reduzierung der technischen Effizienz bei der Entwicklung transgener Pflanzenlinien alleine für die Markergen-Entfernung.

Bei der Produktion kritischer Proteine, die z. B. für die Pflanze physiologisch unvorteilhaft oder gar toxisch sind oder wegen medizinischer Aktivität nicht während der Wachstumsphase auf dem Feld exprimiert werden sollen, ist es ebenso wichtig, eine äußerst zuverlässige Kontrolle über die Rekombinaseaktivierung ausüben zu können. Für das "Molecular Farming" kann ein Rekombinase-induziertes "Gene Switch-System" genutzt werden, so wie es prinzipiell mit einem gewebespezifisch regulierten Promotor beschrieben worden ist. Bei einer nicht kontrollierbaren Unsicherheit des Repressionssystems würde aber kein ausreichend zuverlässiges Containment z. B. für das "Molecular Farming" therapeutischer Proteine bereitgestellt werden.

Es wurden Verfahren beschrieben, um den Einsatz von Rec-LBD-Systemen zu optimieren, z. B. wurde dazu ein bidirektionaler konstitutiver Promotor für die Steuerung des zu aktivierenden Gens verwendet. Zwischen diesen Promotor und das Gen wurde flankiert von Rekombinationssequenzen ein selektierbares Markergen kloniert. Hinter die freie zweite Promotorposition wurde das Rec-LBD-System kloniert. Nach Induktion von Rec-LBD durch Zugabe des Liganden erfolgte die Eliminierung der Markergensequenz, wobei das zu aktivierende Gen unter die Kontrolle des konstitutiven Promotors kommt. Für eine Anwendung in Pflanzen ist jedoch auch hier die Beschränkung auf ein einziges Kontrollsystem problematisch, wobei zusätzlich noch ein Durchlesen vom konstitutiven Promotor über das Markergen hinweg in das zu aktivierende Gen erfolgen kann. Weiterhin sind nur äußerst wenige bidirektionale Promotoren, die in Pflanzen aktiv sind, bekannt, so dass hier für die praktische Anwendung ein stark beschränkender Faktor vorliegt. Es wurde auch ein komplexeres System beschrieben, wobei die zeitliche Steuerung nach wie vor ausschließlich durch die Ligandenzugabe erfolgt. Dabei wurde das Rec-LBD-Gen unter der Kontrolle eines gewebespezifischen Promotors kloniert. In dem betreffenden Gewebe ist demzufolge immer ein Rec-LBD-Protein vorhanden, welches nachweislich Restaktivitäten aufweist. Es sind zwar viele pflanzliche gewebespezifische Promotoren bekannt, die z. T. auch eine gute Begrenzung auf das gewünschte Gewebe aufweisen, dennoch besteht aufgrund von Positionseffekten eine erhebliche Gefahr, dass in einzelnen transgenen Pflanzenlinien starke Abweichungen von dem ursprünglich charakterisierten gewebespezifischen Expressionsprofil auftreten. Insbesondere ist die Übertragbarkeit von einer auf eine andere Pflanzenart sehr stark eingeschränkt. Die gewebespezifische Regulation ist daher für die Anwendung in Pflanzen nur eingeschränkt einsetzbar.

Somit liegt der Erfindung im wesentlichen das technische Problem zugrunde, ein auf dem Rec-System basierendes Eliminierungssystem für eine gewünschte DNA-Sequenz zur Verfügung zu stellen, das die Nachteile der im Stand der Technik beschriebenen Verfahren nicht aufweist, d. h. vor allem gewährleistet, dass die Unterdrückung der Rekombinase- Aktivität, solange erwünscht, vollkommen ist und in einem gewünschten Wirtsorganismus erreicht werden kann.

Die Lösung dieses technischen Problems wurde durch die Bereitstellung der in den Patentansprüchen gekennzeichneten Ausführungsformen erreicht.

Es stellte sich bei den zu der vorliegenden Erfindung führenden Experimenten heraus, dass durch eine doppelt reprimierte Kontrolle der Eliminierung von DNA-Sequenzen zwischen Rekombinations-DNA-Sequenzen im pflanzlichen Genom (einschließlich des plastidären und mitochondrialen Genoms) die Lösung des vorstehenden technischen Problems erreicht werden kann. Hierzu wurden die Repression der Transkription des Rekombinase-Gens über einen induzierbaren Promotor und die Repression der Enzymfunktion über das Rec-LBD-System kombiniert. Durch die Auswahl eines gleichzeitig gewebespezifischen und induzierbaren Promotors, für den nunmehr geringere Qualitätsanforderungen anliegen, ist es möglich, auch eine zusätzliche Gewebespezifität zu integrieren. Die zweifache Repression wirkt direkt auf die Rekombinationsaktivität. So erfolgt beispielsweise die Repression der Transkription des für die Rekombinase kodierenden Gens durch einen induzierbaren Promotor, der z. B. erst unter anaeroben Bedingungen aktiv, wird. Ferner kodiert das Gen für ein Rekombinase-LBD-Fusionsprotein, das inaktiviert ist, solange kein Ligand vorhanden ist. Eine restliche Transkription sowie die Restaktivität des Rec-LBD-Fusionsproteins in transgenen Pflanzen werden durch den synergistischen Repressionseffekt auf ein äußerstes Minimum gedrückt.

Somit betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur gesteuerten Eliminierung einer gewünschten DNA-Sequenz in einem Wirtsorganismus, vorzugsweise einer transgenen Pflanze, das dadurch gekennzeichnet ist, dass
in Schritt (I) der Wirtsorganismus mit (a) der später zu eliminierenden, 5' und 3' von Rekombinations-DNA-Sequenzen flankierten DNA-Sequenz und (b) einer diese Rekombinations- DNA-Sequenzen erkennenden Ligandenbindungsdomäne-Rekombinase- Fusionsprotein (Rec-LBD) kodierenden, unter der Kontrolle eines induzierbaren Promotors stehenden DNA-Sequenz unter Bedingungen transformiert wird, unter denen der induzierbare Promotor reprimiert wird, wobei der spezifisch an Rec-LBD bindende Ligand abwesend ist; und
in Schritt (II) die Eliminierung der zu eliminierenden DNA-Sequenz über die Expression von Rec-LBD durch Aktivierung des induzierbaren Promotors und die Aktivierung von Rec-LBD durch Zugabe des spezifisch an Rec-LBD bindenden Liganden zum gewünschten Zeitpunkt erfolgt.

Verfahren zur Konstruktion der zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens benötigten Konstrukte sind dem Fachmann bekannt und auch in gängigen Standardwerken beschrieben (vgl. z. B. Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Aufl. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY). Die (a) zu eliminierende, 5' und 3' von Rekombinations-DNA-Sequenzen flankierte DNA-Sequenz und (b) die die Rekombinations-DNA- Sequenzen erkennende, Ligandenbindungsdomäne-Rekombinase- Fusionsprotein (Rec-LBD) kodierende, unter der Kontrolle eines induzierbaren Promotors stehende DNA-Sequenz liegen beide vorzugsweise auf einem Vektor inseriert vor, wobei es sich bei dem Vektor vorzugsweise um ein Plasmid, ein Cosmid, ein Virus, einen Bacteriophagen oder einen anderen in der Gentechnik üblichen Vektor handelt. Diese Vektoren können weitere Funktionseinheiten besitzen, die eine Stabilisierung der Vektoren im Wirtsorganismus bewirken, wie einen bakteriellen Replikationsursprung oder die 2-Mikron-DNA zur Stabilisation in Saccharomyces cerevisiae. Ferner können "left border"- und "right border"-Sequenzen agrobakterieller T-DNA enthalten sein, wodurch eine stabile Integration in das Erbgut von Pflanzen ermöglicht wird. Ferner kann eine Terminationssequenz vorhanden sein, die der korrekten Beendigung der Transkription und der Addition einer Poly-A-Sequenz an das Transkript dient. Derartige Elemente sind in der Literatur beschrieben (vgl. Gielen et al., EMBO J. 8 (1989), 23-29) und sind beliebig austauschbar.

Die beiden vorstehend beschriebenen DNA-Sequenzen (a) und (b) können auch auf unterschiedlichen Vektoren inseriert sein und der Wirtsorganismus, vorzugsweise die transgene Pflanze, kann gleichzeitig mit beiden Vektoren oder zuerst mit dem einen und zu einem späteren Zeitpunkt mit dem anderen Vektor transformiert werden. Beispielsweise kann auch die DNA-Sequenz (a) oder (b) bereits in das Genom des Wirtsorganismus integriert sein und erst dann die Transformation mit einem die entsprechend andere DNA-Sequenz enthaltenen Vektor erfolgen. Besonders wird erwähnt, dass das Rekombinase-Gen auf einem Virus, z. B. TMV, liegen kann und erst nach Infektion des Wirtsorganismus aktiviert wird. Die DNA-Sequenz (b) kann auch Bestandteil der DNA-Sequenz (a) sein, d. h. zwischen die Rekombinations-DNA-Sequenzen inseriert sein, so dass nach Aktivierung das für die Rekombinase kodierende Gen selbst exzisiert wird.

Nach Expression (über die Promotor-Aktivierung) und Aktivierung (durch Zugabe des an Rec-LBD bindenden Liganden) der Rekombinase erfolgt an den beiden Rekombinations-DNA- Sequenzen eine ortsspezifische Rekombination und damit eine Exzision der zu eliminierenden DNA-Sequenz, wodurch beispielsweise ein zu exprimierendes Gen direkt stromabwärts zu seinem Promotor lokalisiert wird, was die Transkription und Translation und somit die Fremd-Protein-Biosynthese initiiert. Für das erfindungsgemäße Verfahren ist prinzipiell jedes Rekombinase-System geeignet, wobei gemäß Standardverfahren der Fachmann das für die Rekombinase kodierende Gen derart modifiziert, dass dieses für die Rekombinase als Fusionsprotein mit einem Liganden-bindenden Protein oder einem Teil davon so kodiert, dass die Rekombinase erst nach Bindung des Liganden enzymatisch aktiv ist, d. h. durch die Fusion mit der LBD in Abwesenheit des Liganden die Rekombinase inaktiv ist. Der hier verwendete Begriff "Ligandenbindungsdomäne" oder "LBD" umfaßt jegliches Protein oder Proteinfragment, welches in der Lage ist, nach Fusion an die Rekombinase die Rekombinaseaktivität in Abwesenheit des Liganden zu inhibieren und nach Zugabe des Liganden zu restaurieren. Für das erfindungsgemäße Verfahren ist das in der WO 95/00555 beschriebene Rekombinase-LBD-System bevorzugt, bei dem der die Rekombinase über die LBD aktivierende Ligand Östradiol ist. Die von der vorliegenden Erfindung umfaßten Rekombinase- Systeme umfassen nicht nur die bereits vorstehend bzw. in der Literatur beschriebenen Systeme bzw. durch Fusion mit einer LBD-Domäne modifizierten Systeme, sondern auch Systeme, die sich von den ursprünglichen Systemen durch weitere Modifikationen unterscheiden, solange diese die erfindungsgemäße Verwendung nicht wesentlich beeinträchtigen.

Zur Vorbereitung der Einführung eines Fremdgens in den Wirtsorganismus, z. B. in höhere Pflanzen, stehen eine große Anzahl von Klonierungsvektoren zur Verfügung, die ein Replikationssignal für E.coli und ein Markergen zur Selektion transformierter Bakterienzellen enthalten. Beispiele für derartige Vektoren sind pBR322, pUC-Serien, M13mp-Serien, pACYC184, etc. Das Fremdgen kann an einer passenden Restriktionsschnittstelle in den Vektor eingeführt werden. Das erhaltene Plasmid wird für die Transformation von E.coli- Zellen verwendet. Transformierte E.coli-Zellen werden in einem geeigneten Medium gezüchtet, anschließend geerntet und lysiert, wodurch das Plasmid erhalten wird. Als Analysemethode zur Charakterisierung der gewonnenen Plasmid-DNA werden im allgemeinen Restriktionsanalysen, Gelelektrophoresen und weitere biochemisch-molekularbiologische Methoden eingesetzt. Nach jeder Manipulation kann die Plasmid-DNA gespalten und gewonnene DNA-Fragmente können mit anderen DNA-Sequenzen verknüpft werden. Jede Plasmid-DNA-Sequenz kann in den gleichen oder anderen Plasmiden kloniert werden.

Für die Einführung von DNA in Wirtsorganismen, z. B. in eine pflanzliche Wirtszelle, stehen eine Vielzahl von Techniken zur Verfügung. Diese Techniken umfassen die Transformation pflanzlicher Zellen mit T-DNA unter Verwendung von Agrobacterium tumefaciens oder Agrobacterium rhizogenes als Transformationsmittel, die Fusion von Protoplasten, die Injektion, die Elektroporation von DNA, die Einbringung von DNA mittels der biolistischen Methode sowie weitere Möglichkeiten.

Bei der Injektion und Elektroporation von DNA in Pflanzenzellen werden an sich keine speziellen Anforderungen an die verwendeten Plasmide gestellt. Es können einfache Plasmide, z. B. pUC-Derivate, verwendet werden. Sollen aber aus derartig transformierten Zellen ganze Pflanzen regeneriert werden, sollte ein selektierbarer Marker vorhanden sein. Je nach Einführungsmethode gewünschter Gene in die Pflanzenzelle können weitere DNA-Sequenzen erforderlich sein. Werden z. B. für die Transformation der Pflanzenzelle das Ti- oder Ri- Plasmid verwendet, so muß mindestens die rechte Begrenzung, häufig jedoch die rechte und linke Begrenzung der Ti- und Ri- Plasmid T-DNA als Flankenbereich mit den einzuführenden Genen verbunden werden.

Werden für die Transformation Agrobakterien verwendet, ist es günstig, die einzuführende DNA in spezielle Plasmide zu klonieren, insbesondere in einen intermediären oder in einen binären Vektor. Die intermediären Vektoren können aufgrund von Sequenzen, die homolog zu Sequenzen in der T-DNA sind, durch homologe Rekombination in das Ti- oder Ri-Plasmid der Agrobakterien integriert werden. Dieses enthält außerdem die für den Transfer der T-DNA notwendige vir-Region. Intermediäre Vektoren können nicht in Agrobakterien replizieren. Mittels eines Helferplasmids kann der intermediäre Vektor auf Agrobacterium tumefaciens übertragen werden. Binäre Vektoren können sowohl in E.coli als auch in Agrobakterien replizieren. Sie enthalten ein Selektionsmarker-Gen und einen Linker oder Polylinker, welche von der rechten und linken T-DNA Grenzregion eingerahmt werden. Sie können direkt in die Agrobakterien transformiert werden. Das als Wirtszelle dienende Agrobakterium soll ein Plasmid, das eine vir-Region trägt, enthalten. Die vir-Region ist für den Transfer der T- DNA in die Pflanzenzelle notwendig. Zusätzliche T-DNA kann vorhanden sein. Das derartig transformierte Agrobakterium wird zur Transformation von Pflanzenzellen verwendet.

Für den Transfer der DNA in die Pflanzenzelle können Pflanzen- Explantate zweckmäßigerweise mit Agrobacterium tumefaciens oder Agrobacterium rhizogenes kokultiviert werden. Aus dem infizierten Pflanzenmaterial, z. B. Blattstücke, Stengelsegmente, Wurzeln, Protoplasten oder Suspensions­ kultivierte Pflanzenzellen, können dann in einem geeigneten Medium, welches Antibiotika oder Biozide zur Selektion transformierter Zellen enthalten kann, wieder ganze Pflanzen regeneriert werden. Die so erhaltenen Pflanzen können dann auf Anwesenheit der eingeführten DNA untersucht werden. Andere Möglichkeiten der Einführung fremder DNA unter Verwendung des biolistischen Verfahrens oder durch Protoplasten-Fusion sind bekannt.

Alternative Systeme zur Transformation von monokotylen Pflanzen sind die Transformation mittels des biolistischen Ansatzes, die elektrisch oder chemisch induzierte DNA-Aufnahme in Protoplasten, die Elektroporation von partiell permeabilisierten Zellen, die Makroinjektion von DNA in Blütenstände, die Mikroinjektion von DNA in Mikrosporen und Pro-Embryonen, die DNA-Aufnahme durch keimende Pollen und die DNA-Aufnahme in Embryonen durch Quellung (zur Übersicht: Potrykus, Physiol. Plant (1990), 269-273). Während die Transformation dikotyler Pflanzen über Ti-Plasmid- Vektorsysteme mit Hilfe von Agrobacterium tumefaciens etabliert ist, weisen neuere Arbeiten darauf hin, dass auch monokotyle Pflanzen der Transformation mittels Agrobacterium basierender Vektoren zugänglich sind.

Bei den in dem erfindungsgemäßen Verfahren nützlichen transgenen Pflanzen kann es sich prinzipiell um Pflanzen jeder beliebigen Pflanzenspezies handeln, d. h. sowohl monokotyle als auch dikotyle Pflanzen. Bevorzugt handelt es sich um Nutzpflanzen, insbesondere um Pflanzen, wie Weizen, Gerste, Reis, Mais, Zuckerrübe, Zuckerrohr, Kartoffel, Brassicaceen, Leguminosen oder Tabak. Auch können es Algen, Moose und Pilze sein. Die für die Eliminierung der entsprechenden DNA-Sequenz gewünschten Pflanzenteile betreffen prinzipiell jedes beliebige Pflanzenteil, jedenfalls Vermehrungsmaterial und Ernteprodukte dieser Pflanzen, z. B. Früchte, Samen, Knollen, Wurzelstöcke, Sämlinge, Stecklinge, etc.

In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens liegt die zu eliminierende DNA-Sequenz zwischen einem Promotor und einem Gen und verhindert die Transkription und/oder Translation dieses Gens. Erst nach Expression und Aktivierung der Rekombinase erfolgt eine ortsspezifische Rekombination zwischen den beiden Rekombinations-DNA-Sequenzen und damit eine Exzision der zu eliminierenden DNA-Sequenz, wodurch das gewünschte Gen direkt stromabwärts zum Promotor lokalisiert wird, was die Transkription und Translation und somit die Fremd-Protein-Biosynthese initiiert. Diese Vorgehensweise erlaubt beispielsweise den Einsatz bei der Nach-Ernte-Produktion eines unter der Kontrolle eines sehr starken Promotors stehenden Gens, das für das gewünschte zu produzierende Protein kodiert.

Das erfindungsgemäße Verfahren, das wie vorstehend beschrieben, durch ein sehr dichtes Repressionssystem hinsichtlich der Rekombinase gekennzeichnet ist, kann somit auch zur rekombinanten Produktion von hoch phytotoxischen Proteinen oder Peptiden verwendet werden, oder zur Produktion von Proteinen oder Peptiden, die eine kritische medizinische Wirkung ausüben. Zu einem für die Zelle toxischen Protein oder Peptid zählt beispielsweise ein membranstörendes Protein oder Peptid, wie Mellittin, Magainin, Cecropin, Attacin, Lysozym, etc., ein Peptidantibiotikum, wie Vancomycin, Valinomycin, etc., oder eine RNAse, inbesondere eine RNAse ohne DNAse- Aktivität. Ferner zählt zu einem das Wachstum der Pflanze physiologisch hindernden Protein oder Peptid eine Cytosindeaminase, Diphterietoxin A, Herpes simplex Virus Thymidinkinase Typ I, ein rol-Protein aus Agrobacterium rhizogenes, ein Antikörper gegen Abszisinsäure, etc.

Ferner kann das erfindungsgemäße Verfahren auch dazu verwendet werden, ursprünglich zur Selektion von Transformanten verwendete Markergene, die zu einem späteren Zeitpunkt in der transgenen Pflanze nicht mehr erwünscht sind, zu eliminieren. Somit ist in einer Weiteren bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens die zu eliminierende DNA-Sequenz ein selektierbares Markergen. In einer noch mehr bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens kodiert das selektierbare Markergen für ein ein Antibiotikum inaktivierendes Protein, z. B. Neomycinphosphotransferase II, oder es handelt sich um ein für das "Green Fluorescent Protein" kodierendes Gen.

Desweiteren kann das erfindungsgemäße Verfahren auch dazu verwendet werden, daß nach Eliminierung der gewünschten DNA- Sequenz, z. B. des selektierbaren Markergens, eine zweite gewünschte DNA-Sequenz gezielt in das Genom des Wirtsorganismus integriert wird, d. h. anstelle der eliminierten DNA-Sequenz zwischen die 5' und 3' Rekombinations-DNA-Sequenzen eingeführt wird. Hierzu kann der Wirtsorganismus mit einem die zweite gewünschte DNA-Sequenz enthaltenden Vektor transformiert werden, so daß letztere DNA- Sequenz spezifisch in das Genom des Wirtsorganismus einrekombinieren kann. Hinsichtlich der hierfür geeigneten Vektoren, DNA-Sequenzen und Bedingungen wird auf vorstehende Ausführungen verwiesen.

Für das erfindungsgemäße Verfahren geeignete induzierbare Promotoren und die hierfür in Frage kommenden Induktoren (bzw. Inhibitoren) (gasförmige, flüssige oder feste, flüchtige Verbindungen) sind dem Fachmann bekannt. Geeignete gasförmige Induktoren sowie Bedingungen zum möglichst effizienten Austausch der Gasphase sind dem Fachmann ebenfalls bekannt. Es wird auf das Anaerocult-System (Merck, Darmstadt, Deutschland) verwiesen, das ein anaerobes Milieu, in dem Sauerstoff gebunden und CO₂ freigesetzt werden, erzeugt. In diesem System wird der GapC4 Promoter aus Mais anaerob durch die CO₂- Atmosphäre induziert (Bülow, L. et al., Molecular Plant- Microbe Interactions (1999), 182-188). Ebenso wird der gleiche Effekt durch Einleitung von technischem Stickstoff erreicht. Ein weiteres Beispiel ist die Induktion von "Pathogenesis related protein"-Promotoren, wie L-Phenylalanin-, Ammonium Lyase-, Chalcon Synthase- oder "Hydroxyproline rich glycoprotein"-Promotoren durch Ethylen (Ecker, J. R. und Davis, R. W., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 (1987), 5202-5206).

Zu den induzierbaren, für das erfindungsgemäße Verfahren geeigneten Promotoren zählen auch Promotoren, die durch Vernebelung eines Induktors induzierbar sind. Für eine Vernebelung geeignete lösliche Induktoren sowie Bedingungen zur möglichst effizienten Vernebelung sind dem Fachmann ebenfalls bekannt. Es wird auf ein chimäres Transkriptions- Induktionssystem verwiesen, das durch den löslichen Induktor Dexamethason induziert wird (Plant J. 11 (1997) 605-612; Kunkel et al., Nature Biotechnol. 17(1999), 916-918). Der Incw1-Promoter von Mais wird durch die Zugabe von Sucrose oder D-Glucose aktiviert (Chen, W. H. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96 (1999), 10512-10517). Viele "Pathogenesis related protein"-Promotoren werden durch Salicylsäure aktiviert (Gaffney et al., Science 261 (1993), 754-756. Ein flüchtiger Induktor ist Methylsalicylat, das in der aufnehmenden Pflanze zu Salicylat umgewandelt wird, was induzierend wirkt (Shulaev, V. et al., Nature 385 (1997), 718-721). Die Vernebelung von Lösungen, z. B. von Promotor-induzierenden (Bio-)Chemikalien, bietet den Vorteil der technisch einfachen und gleichmäßigen Verteilung der induzierenden Substanz um das zu induzierende Gewebe herum und in das Gewebe hinein. Vorzugsweise wird durch aktive Umwälzung der Gasphase eine schnelle Einstellung der gleichmäßigen Verteilung gefördert. Zudem wird dadurch, ein einfacher und effizienter Ausgleich von entstehenden Konzentrationsunterschieden erreicht, so dass kontrollierte Prozeßbedingungen gewährleistet werden können. Für die Vernebelung kann z. B. auch die Agrochemikalie RH5992 (Tebufenozide, Rohm & Haas, Croyden, UK) verwendet werden, wobei RH5992 über ein chimäres Transkriptionsaktivatorprotein als Induktor für den zu induzierenden Promotor fungiert (Gatz und Lenk, Trends in Plant Science 3 (1998), 352-358). Der Promotor wird spezifisch durch RH5992 angeschaltet und ist ohne Vorhandensein dieser Verbindung inaktiv. Der Induktor- Nebel wird dabei z. B. durch eine kontinuierliche Luftverteilung gleichmäßig an das zu induzierende Gewebe herangespült. Durch Diffusion von der Gewebeoberfläche in die Zellen hinein wird die wirksame Induktion des Promotors erreicht.

Für ein Überströmen geeignete flüchtige Induktoren und durch diese induzierbare Promotoren sind dem Fachmann ebenfalls bekannt. Insbesondere ist Methylsalicylat zu nennen, das in der aufnehmenden Pflanze zu Salicylat umgewandelt wird, welches, wie vorstehend beschrieben, induzierend wirkt (Shulaev, V. et al., supra). Ein weiteres Beispiel für einen flüchtigen Induktor ist Ethanol, welches den alcA Promotor aus Aspergillus nidulans in transgenem Tabak induziert (Caddick, M. X. et al., Nature Biotechnology 16 (1998), 177-180). Für ein aktives Überströmen wird so vorgegangen, dass der flüssige oder feste (flüchtige) Induktor mit einem geeigneten gasförmigen Trägermedium zur Überführung in die flüchtige, gasförmige Phase überströmt wird und vorzugsweise wird eine aktive Umwälzung der Gasphase durchgeführt, um die gleichmäßige Verteilung des Induktors zu erreichen.

Geeignete physikalisch, z. B. durch thermische Veränderungen wie Hitze- oder Kälteschock, induzierbare Promotoren sind dem Fachmann ebenfalls bekannt. Zu hitzeinduzierbaren Promotoren zählen z. B. HSP81-1 Promotor aus Arabidopsis thaliana (Yabe et al. Plant Cell Physiol. 35 (1994), 1207-1219) Ha hsp 18.6 G2 Promotor aus Sonnenblume (Coca et al. Plant Mol. Biol, 31 (1996) 863-876), HSP18.2 Promotor aus Arabidapsis thaliana in transgenem Tabak (Yoshida et al. Appl. Microbiol. Biotechnol. 44 (1995), 466-472), während zu kälteinduzierbaren Promotoren z. B. der C17 Promotor aus Kartoffel (Kirsch et al. Plant. Mol Biol. 33 (1997), 897-909) zählt.

Somit handelt es sich bei dem für das erfindungsgemäße Verfahren geeigneten induzierbaren Promotor vorzugsweise um einen durch anaerobe Bedingungen, durch eine Chemikalie oder einen physikalisch induzierbaren Promotor, wie den GapC4- Promotor oder den Adh1-Promotor, und die Induktion erfolgt über eine Veränderung der Gasphase derart, dass es sich um einen Sauerstoffentzug handelt; siehe dazu auch die vorstehenden Ausführungen. Besonders bevorzugt in dem erfindungsgemäßen Verfahren ist der anaerob induzierbare GapC4 Promotor (DE 195 47 272), z. B. in Verbindung mit abgeerntetem transgenem Pflanzengewebe, z. B. transgenen Kartoffelknollen. Die meisten pflanzlichen Promotoren werden unter anaeroben Bedingungen abgeschaltet, während der GapC4 Promotor unter aeroben Bedingungen abgeschaltet ist und durch einfachen Sauerstoffentzug angeschaltet wird (Bülow et al., supra). Dies wird z. B. durch die Einleitung von Stickstoff oder Kohlendioxid in den Reaktions- oder Lagerraum erreicht. Innerhalb weniger Stunden wird somit auch in einer intakten Kartoffelknolle ein vollständig anaerobes Milieu erreicht, wodurch die Promotorinduktion und Fremdproteinexpression erfolgt.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die für das Ligandenbindungsdomäne-Rekombinase-Fusionsprotein (Rec-LBD) kodierende, unter der Kontrolle eines induzierbaren Promotors stehende DNA-Sequenz (b) nicht stabil in das Wirtsgenom integriert, sondern wird erst zum gewünschten Zeitpunkt durch ein sich systemisch verbreitendes Virus eingeschleust, z. B. im Fall von Pflanzen, über TMV oder TMV-basierende Vektoren. Diese Vorgehensweise eignet sich besonders gut für die Nach- Ernte-Produktion eines gewünschten Proteins.

Das Rec-LBD-Gen kann auch induziert im Kern des Wirts, z. B. der transgenen Pflanzenzelle, exprimiert werden. Dabei wird das Rec-LBD-Protein mit einem N-terminalen Transitpeptid (verantwortlich für Plastiden- bzw. Mitochondrientransport) fusioniert. Das nach Induktion translatierte Protein wird demzufolge in die Plastiden bzw. die Mitochondrien transportiert. Die Rekombinationssequenzen werden zusammen mit der später zu eliminierenden DNA-Sequenz durch direkte Plastiden- oder Mitochondrien-Transformation in das Plastiden bzw. Mitochondrien-Genom eingeführt (z. B. Svab et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 (1990), 8526-8530; Carrer et al., Mol. Gen. Genet. 241 (1993), 49-56; Sidorov et al., Plant J. 19 (1999), 209-216). Nach Promotor-Induktion und Zugabe des Liganden erfolgt somit in den transformierten Plastiden bzw. Mitochondrien eine Rekombination und die zwischen den Rekombinationssequenzen befindliche DNA-Sequenz wird eliminiert. Dieses Verfahren eignet sich z. B. für die Herstellung von Proteinen mit medizinischer Wirkung, z. B. auf Herz, Kreislauf, Organfunktionen, mit Angiogenese- Induktionswirkung oder mit Hormonwirkung. Auch können Fremdsubstanzen, wie Polyhydroxyalkanoate, Polyhydroxybutyrate oder Somatotropin hergestellt werden (Poirier, Current Opinion in Biotechnology 10, (1999), 181-185; Nawrath et al., Proc. Natl. Aca. Sci. USA 91, (2994), 12760-12764; Staub et al., Nature Biotechnology 18, (2000), 333-338). Insbesondere eignet sich vorstehendes Verfahren für die Nach-Ernte-Produktion in transformierten Plastiden oder Mitochondrien. Dabei werden z. B. zwischen dem in Plastiden bzw. Mitochondrien aktiven Promotor und das zu exprimierende Gen eine von den zwei Rekombinations-DNA-Sequenzen flankierte Transkriptions- oder Translations-Stop-DNA-Sequenz integriert und das gesamte Konstrukt in die Plastiden bzw. Mitochondrien transformiert.

Somit ist in einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens das Ligandenbindungsdomäne- Rekombinase-Fusionsprotein (Rec-LBD) N-terminal mit einem Transitpeptid für plastidären oder mitochondrialen Eintransport fusioniert und die dafür kodierende DNA-Sequenz in das Kerngenom integriert, und das Gen, dessen Expression über Rec-LBD gesteuert werden soll, in das Plastiden- oder Mitochondriengenom integriert, wobei zwischen dem Promotor für dieses Gen und dem Gen selbst eine von zwei Rekombinations- DNA-Sequenzen flankierte Transkriptionsstopsequenz eingebaut ist. Beispiele für diese Transitpeptide kodierenden DNAs sind die DNA für das Transitpeptid der kleinen Untereinheit der Ribulose-Biphosphat-Carboxylase (für plastidäre Lokalisation) (Anderson and Smith, Biochemical Journal 240 (1986), 709-715), die DNA für die F1b Untereinheit der ATP-Synthase von Nicotiana plumbaginifolia fusioniert mit Mais T-urf 13 Protein (Chaumont et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 (1995), 1167-­ 1171) und die DNA für die mitochondriale Tryptophanyl-tRNA- Synthetase aus Hefe fusioniert mit GUS (Schmitz and Londsdale, Plant Cell 1 (1989), 783-791).

Die vorliegende Erfindung betrifft auch einen Vektor, der (a) eine zu eliminierende, 5' und 3' von Rekombinations-DNA- Sequenzen flankierte DNA-Sequenz und (b) eine diese Rekombinations-DNA-Sequenzen erkennende Ligandenbindungsdomäne-Rekombinase-Fusionsprotein (Rec-LBD) kodierende, unter der Kontrolle eines induzierbaren Promotors stehende DNA-Sequenz gemäß der vorstehenden Beschreibung enthält. Bezüglich geeigneter Vektoren verweisen wir auf die vorstehenden Ausführungen.

Schließlich betrifft die vorliegende Erfindung auch einen Wirtsorganismus, der gemäß Schritt (I) des erfindungsgemäßen Verfahrens transformiert wurde, oder den erfindungsgemäßen Vektor enthält. Vorzugsweise handelt es sich bei dem Wirtsorganismus um einen Wirtsorganismus, der außerdem auch gemäß Schritt (II) des erfindungsgemäßen Verfahrens behandelt wurde. Vorzugsweise handelt es sich bei dem Wirtsorganismus um eine transgene Pflanze, wobei der Ausdruck "transgene Pflanze" auch einzelne Pflanzenteile oder Pflanzenorgane umfaßt. Dazu zählen z. B. auch Samen, Früchte, Knollen, Wurzelstöcke, Sämlinge und Stecklinge.

Besonders bevorzugt sind die folgenden transgenen Pflanzen: Weizen, Gerste, Mais, Reis, Zuckerrübe, Zuckerrohr, Kartoffel, Brassicaceen, Leguminosen, Tabak, Moose, Algen und Pilze.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1 Induzierbar rekombinationsgesteuerte Nach-Ernte-Produktion eines scFv-Antikörpers unter der Kontrolle eines starken Promotors

Die in Artsaenko et al. (Molecular Breeding 4 (1998), 313-319) beschriebene cDNA, die für einen im endoplasmatischen Retikulum lokalisierten scFv(ox)-Antikörper mit KDEL-ER-Targetting-Sequenz codiert, wurde mittels einer Linker-Ligation, am 5'-Ende mit CAT GCC ATG GCA TG [5' phosphoryliertes Oligonukleotid], am 3'-Ende mit GCT CTA GAG C [5' phosphoryliertes Oligonukleotid]) derart modifiziert, dass sie am 5'-Ende eine NcoI-Restriktionsschnittstelle und am 3'- Ende eine Xbal-Restriktionsschnittstelle aufwies. Nach Verdau des Plasmids pRT100 (Töpfer et al., Nucleic Acids Research 15 (1987), 5890) mit NcoI und Xbal wurde das scFv-codierende DNA- Fragment in diesen Expressionsvektor inseriert. Es wurde das Plasmid pRT100/scFv(ox)E erhalten.

In die Ncol-Restriktionsschnittstelle von pRT100/scFv(ox) wurde eine synthetische Nukleinsäure inseriert, die zwei FRT-Rekombinationsseguenzen (Buchholz et al., Nucleic Acids Research 21 (1996), 3118-3119) enthielt. Es wurde das Plasmid pRT100/FRT-scFv(ox) erhalten.

Der anaerob induzierbare GapC4 Promotor aus DE 195 47 272 wurde mittels einer PCR-Peaktion so modifiziert, dass er am 5'-Ende eine HindIII-Restriktionsschnittstelle und am 3'-Ende eine Ncol-Restriktionschnittstelle erhielt, Für die PCR-Reaktion wurde folgendes Primerpaar verwendet:

Aus dem Plasmid pRT100 wurde der CaMV 35S-Promotor mittels Restriktionsverdau mit HindIII und NcoI entfernt. Statt dessen wurde das oben beschriebene Nukleinsäurefragment mit dem GapC4 Promotor einligiert. Es wurde das Plasmid pRT100Gap erhalten. Die für das FLP-Rekombinase-LBD-Fusionsprotein kodierende cDNA (WO 95/00555) wurde als PCR-adaptiertes NcoI-XbaI-Fragment in die Ncol-Schnittstelle von pRT100Gap in der Sense-Orientierung einkloniert. Für die PCR-Reaktion wurde folgendes Primerpaar verwendet:

Es wurde das Plasmid pRT100Gap/FLP erhalten. Nach Spaltung mit HindIII wurde die Expressionskassette für das Rec-LBD-Protein isoliert. Dieses HindIII-Fragment wurde nach Auffüllen "blunt end" in Anti-Orientierung bezüglich des CaMV 35S-Promotors und des scFv (ox)-Gens zwischen die beiden FRT-Rekombinationssequenzen des Plasmids pRT100/FRT-scFv(ox) inseriert. Es wurde das Plasmid pRT100/FLP-Gap/scFv(ox) erhalten. Aus diesem wurde das gesamte Konstrukt durch Restriktionsverdau mit HindIII isoliert und in den binären Vektor pSR 8-30 inseriert (Düring et al., Plant Journal 3 (1993), 587-598; Porsch et al., Plant Molecular Biology 37 (1998), 581-585). Es wurde der Expressionsvektor pSR 8-30/FLP-Gap/scFv(ox) erhalten, dessen Struktur schematisch in Fig. 1A dargestellt ist.

Der Expressionsvektor pSP 8-30/FLP-Gap/scFv(ox) wurde zur Transformation von E.coli S17-1 verwendet. Transformanten wurden mit Agrobacterium GV 3101 gemischt und über Nacht bei 28°C inkubiert. (Koncz und Schell, Molecular and General Genetics 204 (1986), 383-396; Koncz. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94 (1987), 131-135). Es wurde auf Carbenicillin selektioniert, wobei das hierfür notwendige bla-Gen in den vorstehenden Expressionsvektoren vorlag. Selektionsklone von Agrobacterium tumefaciens wurden auf abgeschnittenen und mehrfach an der Mittelrippe eingeritzten Blättern der Kartoffelpflanze cv. Désirée aufgebracht und die Blätter wurden 2 Tage bei 20°C im Dunkeln inkubiert. Danach wurden die Agrobakterien abgewaschen und den Kartoffelblättern Pflanzenwuchsstoffe zugesetzt, so dass bevorzugt Sprosse regenerierten. Ferner wurden durch die Zugabe von Kanamycin in das Pflanzenmedium nicht-transformierte Zellen in den Kartoffelblättern abgetötet. Heranwachsende Sprosse wurden abgeschnitten und auf dem Medium ohne Pflanzenwachstumsstoffe, aber mit Kanamycin (100 mg/I,), bewurzelt. Die weitere Kultivierung der Kartoffelpflanzen erfolgte in üblicher Weise. Zur Induktion der Rekombinase wurde abgeschnittenes Blattmaterial oder intaktes oder geschnittenes Knollenmaterial mittels des Anerocult-Systems (Fa. Merck, Darmstadt, Deutschland) wie bei Bülow et al. (Molecular Plant-Microbe Interactions 12 (1999), 182-188) beschrieben induziert. Nach 40 Stunden wurde das Pflanzenmaterial mit einer Lösung von 10^-6 M Östradiol besprüht und für weitere 2 Tage kultiviert. Danach wurde das Pflanzenmaterial gemörsert. Der Nachweis des exprimierten scFv-Antikörpers wurde über den enthaltenen c-myc "Tag" mittels des monoklonalen Antikörpers 9E10-IgG (Cambridge Research Chemicals, Northwich, Cheshire, UK) oder Protein L (Clontech, Palo Alto, CA., USA) im Western Blot bzw. ELISA erbracht. Hierzu wurde das Gesamtprotein des Kartoffelmaterials isoliert und in die entsprechenden Nachweisverfahren eingesetzt. Als expressionspositiv ermittelte transgene Kartoffelpflanzen wurden im Gewächshaus im Topf oder im Erdbeet oder im Freiland unter üblichen gartenbaulichen bzw. landwirtschaftlichen Bedingungen angebaut. Die Knollen wurden nach üblicher Handhabung geerntet und gelagert.

Für die Nach-Ernte-Produktion des scFv-Antikörpers wurden die Knollen in einen Reaktionsbehälter aus Stahl oder Kunststoff verbracht, der unten ein Gaszufuhrventil und oben ein Gasabführventil aufweist. Die Raumluft im Behälter wurde schnell durch Zufuhr von technischem Stickstoff oder Kohlendioxid verdrängt, Unter langsamem Luftstrom (1 m³ Gaszufuhr pro Stunde pro m² Grundfläche) wurde eine konstante Zusammensetzung der Gasphase im Reaktionsbehälter eingestellt. Nach 40 Stunden wurde das Pflanzenmaterial mit einer Lösung von 10^-6 M Östradiol besprüht und für weitere 2 Tage kultiviert. Die Knollen wurden danach aus dem Reaktionsbehälter entnommen, homogenisiert, der Festanteil wurde abzentrifugiert und der wäßrige Überstand der chromatographischen Aufreinigung des scFv-Antikörpers zugeführt. Im Gegensatz zu dem induzierten konnte in nicht-induziertem Blatt- oder Knollengewebe kein scFv(ox) nachgewiesen werden.

Beispiel 2 Induzierbare Markergen-Entfernung durch Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens

Durch partiellen Verdau des Plasmids pRT100Gap wurde die stromaufwärts des GapC4-Promotors gelegene HindlII-Restriktionsschnittstelle geöffnet. In diese Schnittstelle wurde eine synthetische Nukleinsäure inseriert, die eine FRT-Rekombinationssequenz (Buchholz et al., supra) enthielt und am 5'-Ende die HindIII-Schnittstelle rekonstituierte. Mit einem weiteren partiellen HindIII-Verdau wurde die stromabwärts des Terminators gelegene HindIII-Schnittstelle geöffnet und eine weitere synthetische Nukleinsäure inseriert, die eine FRT-Rekombinationssequenz enthielt und am 3'-Ende die HindlII-Schnittstelle rekonstituierte. Es wurde das Plasmid pRT100GapFRT erhalten.

Die für das FLP-Rekombinase-LBD-Fusionsprotein kodierende cDNA (WO 95/00555) wurde als PCR-adaptiertes Ncol-Xbal-Fragment In die NcoI-Schnittstelle von pRT100GapFRT in der Sense- Orientierung einkloniert. Für die PCR-Reaktion wurde folgendes Primerpaar verwendet:

Es wurde das Plasmid pRT100GapFRT/FLP erhalten. Aus dem Plasmid pLH9000 (Hausmann und Töpfer, Vorträge Pflanzenzüchtung 45 (1999), 155-172) wurde die Expressionskassette für das selektierbare nptII-Markergen, enthaltend den CaMV 35S-Promotor und Terminator (Odell et al., Nature 313 (1995), 810-812) sowie dazwischen das Neomycinphosphotransferase II-Gen (nptII) (Beck et al., Gene 19 (1982), 327-336) als XbaI/Sfil-Fragment durch Restriktionsverdau mit Xbal und Sfil isoliert. Diese Expressionskassette wurde in Sense-Orientierung in die geöffnete Xbal-Schnittstelle des Plasmids pRT100GapFRT/FLP inseriert, indem nach erfolgtem ersten "sticky end"-Ligationsschritt überhängende Enden aufgefüllt wurden und dann eine "blunt end"-Ligation als zweiter Schritt erfolgte. Es wurde das Plasmid pRT100GapFRT/FLP-NPT erhalten. Aus diesem wurde das gesamte Konstrukt durch Restriktionsverdau mit HindIll isoliert und in den binären Vektor pSR 8-30 inseriert. Es wurde der Expressionsvektor pSR 8-30/Gap-FLP-NPT erhalten, dessen Struktur schematisch in Fig. 1B dargestellt ist.

Die Kartoffeltransformation erfolgte wie unter Beispiel 1 beschrieben. Die anaerobe Induktion der Transkription des Rekombinase-Gens erfolgte in abgeschnittenem Blattmaterial auf MS-Medium ebenfalls analog wie in Beispiel 1 beschrieben. Die Aktivierung der FLP-LBD-Rekombinase erfolgte gleichzeitig durch Zugabe von 10^-6 M Östradiol in das Medium. Die Induktion erfolgte über einen Zeitraum von einer Woche. Nach Abschluß der Induktion wurde das Blattmaterial kleingeschnitten und auf Sproßinduktionsmedium ausgelegt. Regenerierte Sprosse wurden ohne Selektion bewurzelt. Es wurden 100 Sprosse regeneriert, die mittels Southern-Hybridisierung mit der nptII Gen-Sonde auf Eliminierung des nptII-Gens analysiert wurden.

Es zeigte sich, dass in einer großen Anzahl der regenerierten Sprosse das nptII-Gen nicht mehr enthalten war.

Claims (19)

1. Verfahren zur gesteuerten Eliminierung einer gewünschten DNA-Sequenz in einem Wirtsorganismus, dadurch gekennzeichnet, dass
in Schritt (I) der Wirtsorganismus mit

• a) der später zu eliminierenden, 5' und 3' von Rekombinations-DNA-Sequenzen flankierten DNA-Sequenz und
• b) einer diese Rekombinations-DNA-Sequenzen erkennenden Ligandenbindungsdomäne-Rekombinase-Fusionsprotein (Rec-LBD) kodierenden, unter der Kontrolle eines induzierbaren Promotors stehenden DNA-Sequenz unter Bedingungen transformiert wird, unter denen der induzierbare Promotor reprimiert wird, wobei der spezifisch an Rec-LBD bindende Ligand abwesend ist; und

in Schritt (II) die Eliminierung der zu eliminierenden DNA-Sequenz über die Expression von Rec-LBD durch Aktivierung des induzierbaren Promotors und die Aktivierung von Rec-LBD durch Zugabe des spezifisch an Rec-LBD bindenden Liganden zu dem gewünschten Zeitpunkt erfolgt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die zu eliminierende DNA-Sequenz zwischen einem Promotor und einem Gen liegt und die Transkription und/oder Translation des Gens verhindert.

3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei das Gen für ein für die Zelle toxisches Protein oder Peptid kodiert.

4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei das für die Zelle toxische Protein oder Peptid eine RNAse ist.

5. Verfahren nach Anspruch 3, wobei das für die Zelle toxische Protein oder Peptid ein membranstörendes Protein oder Peptid ist.

6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei das membranstörende Protein oder Peptid Mellittin, Magainin, Cecropin, Attacin oder Lysozym ist.

7. Verfahren nach Anspruch 2, wobei das Gen für ein das Wachstum des Wirtsorganismus physiologisch hinderndes Protein oder Peptid kodiert.

8. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die zu eliminierende DNA-Sequenz ein selektierbares Markergen ist.

9. Verfahren nach Anspruch 8, wobei das selektierbare Markergen für ein ein Antibiotikum inaktivierendes Protein kodiert.

10. Verfahren nach Anspruch 8, wobei das selektierbare Markergen für ein "Green Fluorescent Protein" kodiert.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei der induzierbare Promotor ein anaerob, durch eine Chemikalie oder physikalisch induzierbarer Promotor ist.

12. Verfahren nach Anspruch 11, wobei der anaerob induzierbare Promotor der GapC4 Promotor ist.

13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei die die Rekombinations-DNA-Sequenzen erkennende Ligandenbindungsdomäne-Rekombinase-Fusionsprotein (Rec- LBD) kodierende, unter der Kontrolle eines induzierbaren Promotors stehende DNA-Sequenz (b) nicht stabil in das Wirtsgenom integriert ist, sondern erst zum gewünschten Zeitpunkt durch ein sich systemisch verbreitendes Virus eingeschleust wird.

14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, wobei das Ligandenbindungsdomäne-Rekombinase-Fusionsprotein (Rec- LBD) N-terminal mit einem Transitpeptid für plastidären oder mitochondrialen Transport fusioniert ist, die dafür kodierende DNA-Sequenz in das Kerngenom integriert ist und das Gen, dessen Expression über Rec-LBD gesteuert werden soll, in das Plastiden- oder Mitochondriengenom integriert ist, wobei zwischen dem Promotor für dieses Gen und dem Gen selbst eine von zwei Rekombinations-DNA- Sequenzen flankierte Transkriptionsstopsequenz eingebaut ist.

15. Vektor, enthaltend

• a) eine zu eliminierende, 5' und 3' von Rekombinations- DNA-Sequenzen flankierte DNA-Sequenz und
• b) eine diese Rekombinations-DNA-Sequenzen erkennende Ligandenbindungsdomäne-Rekombinase-Fusionsprotein (Rec-LBD) kodierende, unter der Kontrolle eines induzierbaren Promotors stehende DNA-Sequenz gemäß der Definition nach einem der Ansprüche 1 bis 14.

16. Wirtsorganismus, der gemäß Schritt (I) des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 14 transformiert wurde oder den Vektor nach Anspruch 15 enthält.

17. Wirtsorganismus nach Anspruch 16, der außerdem gemäß Schritt (II) des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 15 behandelt wurde.

18. Wirtsorganismus nach Anspruch 16 oder 17, der eine transgene Pflanze ist.

19. Transgene Pflanze nach Anspruch 18, wobei die transgene Pflanze Weizen, Gerste, Mais, Reis, Zuckerrübe, Zuckerrohr, Kartoffel, eine Brassicacee, eine Leguminose, Tabak, ein Moos, eine Alge oder ein Pilz ist.