CZ301799A3 - Způsob využití samčí sterility u rostlin - Google Patents
Způsob využití samčí sterility u rostlin Download PDFInfo
- Publication number
- CZ301799A3 CZ301799A3 CZ19993017A CZ301799A CZ301799A3 CZ 301799 A3 CZ301799 A3 CZ 301799A3 CZ 19993017 A CZ19993017 A CZ 19993017A CZ 301799 A CZ301799 A CZ 301799A CZ 301799 A3 CZ301799 A3 CZ 301799A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- gene
- plant
- transformed
- cells
- plants
- Prior art date
Links
- 206010021929 Infertility male Diseases 0.000 title claims abstract description 36
- 208000007466 Male Infertility Diseases 0.000 title claims abstract description 36
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 32
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 claims abstract description 17
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims description 200
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 116
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 82
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 67
- 101150039403 ams gene Proteins 0.000 claims description 56
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 41
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 claims description 38
- 102000008579 Transposases Human genes 0.000 claims description 24
- 108010020764 Transposases Proteins 0.000 claims description 24
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 20
- 230000009466 transformation Effects 0.000 claims description 18
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 16
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 claims description 12
- 208000000509 infertility Diseases 0.000 claims description 9
- 230000036512 infertility Effects 0.000 claims description 9
- 208000021267 infertility disease Diseases 0.000 claims description 9
- 230000006798 recombination Effects 0.000 claims description 9
- 238000005215 recombination Methods 0.000 claims description 9
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 claims description 8
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 claims description 8
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims description 8
- 244000061176 Nicotiana tabacum Species 0.000 claims description 7
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 claims description 7
- 235000016383 Zea mays subsp huehuetenangensis Nutrition 0.000 claims description 7
- 235000009973 maize Nutrition 0.000 claims description 7
- 240000002791 Brassica napus Species 0.000 claims description 6
- 235000007688 Lycopersicon esculentum Nutrition 0.000 claims description 6
- 102000018120 Recombinases Human genes 0.000 claims description 6
- 108010091086 Recombinases Proteins 0.000 claims description 6
- 240000003768 Solanum lycopersicum Species 0.000 claims description 6
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 claims description 6
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims description 6
- 241000589155 Agrobacterium tumefaciens Species 0.000 claims description 5
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 5
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 5
- 238000013518 transcription Methods 0.000 claims description 5
- 230000035897 transcription Effects 0.000 claims description 5
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 claims description 4
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 claims description 4
- 230000010354 integration Effects 0.000 claims description 4
- 235000006008 Brassica napus var napus Nutrition 0.000 claims description 3
- 239000000284 extract Substances 0.000 claims description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 2
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 claims 4
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 claims 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 49
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 30
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 20
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 20
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 20
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 20
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 16
- 239000000047 product Substances 0.000 description 15
- 230000006862 enzymatic digestion Effects 0.000 description 13
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 13
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 12
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 12
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 12
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 10
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 9
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 9
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 description 9
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 9
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 9
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 9
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 9
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 9
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 9
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 8
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 8
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 8
- HZZVJAQRINQKSD-UHFFFAOYSA-N Clavulanic acid Natural products OC(=O)C1C(=CCO)OC2CC(=O)N21 HZZVJAQRINQKSD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 7
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 7
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 7
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 7
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 6
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 235000010419 agar Nutrition 0.000 description 6
- 229940098164 augmentin Drugs 0.000 description 6
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 6
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 6
- 238000011161 development Methods 0.000 description 6
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 6
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 6
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- 210000004291 uterus Anatomy 0.000 description 6
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 5
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 5
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 5
- 241000206672 Gelidium Species 0.000 description 5
- 240000000220 Panda oleosa Species 0.000 description 5
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 5
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 5
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 5
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 5
- 230000035558 fertility Effects 0.000 description 5
- 230000002438 mitochondrial effect Effects 0.000 description 5
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 5
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- ZBMRKNMTMPPMMK-UHFFFAOYSA-N 2-amino-4-[hydroxy(methyl)phosphoryl]butanoic acid;azane Chemical compound [NH4+].CP(O)(=O)CCC(N)C([O-])=O ZBMRKNMTMPPMMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000282465 Canis Species 0.000 description 4
- 241000701489 Cauliflower mosaic virus Species 0.000 description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 4
- NWBJYWHLCVSVIJ-UHFFFAOYSA-N N-benzyladenine Chemical compound N=1C=NC=2NC=NC=2C=1NCC1=CC=CC=C1 NWBJYWHLCVSVIJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 101150005851 NOS gene Proteins 0.000 description 4
- 235000016496 Panda oleosa Nutrition 0.000 description 4
- 241000219094 Vitaceae Species 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 4
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 4
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 4
- 235000021186 dishes Nutrition 0.000 description 4
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 4
- 230000035784 germination Effects 0.000 description 4
- 235000021021 grapes Nutrition 0.000 description 4
- 239000004009 herbicide Substances 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 239000012429 reaction media Substances 0.000 description 4
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 4
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 4
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 4
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 4
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 4
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 241000620209 Escherichia coli DH5[alpha] Species 0.000 description 3
- 108010046276 FLP recombinase Proteins 0.000 description 3
- 102100031416 Gastric triacylglycerol lipase Human genes 0.000 description 3
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 3
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 3
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 3
- OJOBTAOGJIWAGB-UHFFFAOYSA-N acetosyringone Chemical compound COC1=CC(C(C)=O)=CC(OC)=C1O OJOBTAOGJIWAGB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 230000010165 autogamy Effects 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 3
- 101150055766 cat gene Proteins 0.000 description 3
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 3
- 108010091264 gastric triacylglycerol lipase Proteins 0.000 description 3
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000005286 illumination Methods 0.000 description 3
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 3
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 3
- 238000004853 microextraction Methods 0.000 description 3
- 238000007479 molecular analysis Methods 0.000 description 3
- 230000010152 pollination Effects 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 3
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 3
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 3
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 3
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 3
- 210000003934 vacuole Anatomy 0.000 description 3
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 2
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 2
- 241000219195 Arabidopsis thaliana Species 0.000 description 2
- 108010016529 Bacillus amyloliquefaciens ribonuclease Proteins 0.000 description 2
- LMKYZBGVKHTLTN-NKWVEPMBSA-N D-nopaline Chemical compound NC(=N)NCCC[C@@H](C(O)=O)N[C@@H](C(O)=O)CCC(O)=O LMKYZBGVKHTLTN-NKWVEPMBSA-N 0.000 description 2
- 235000007340 Hordeum vulgare Nutrition 0.000 description 2
- 240000005979 Hordeum vulgare Species 0.000 description 2
- 244000017020 Ipomoea batatas Species 0.000 description 2
- 235000002678 Ipomoea batatas Nutrition 0.000 description 2
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- 102000004882 Lipase Human genes 0.000 description 2
- 108090001060 Lipase Proteins 0.000 description 2
- 239000004367 Lipase Substances 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 238000002944 PCR assay Methods 0.000 description 2
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 101710199392 TATA-box-binding protein 1 Proteins 0.000 description 2
- 235000009754 Vitis X bourquina Nutrition 0.000 description 2
- 235000012333 Vitis X labruscana Nutrition 0.000 description 2
- 240000006365 Vitis vinifera Species 0.000 description 2
- 235000014787 Vitis vinifera Nutrition 0.000 description 2
- 229920002494 Zein Polymers 0.000 description 2
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 2
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 230000003385 bacteriostatic effect Effects 0.000 description 2
- 229910002056 binary alloy Inorganic materials 0.000 description 2
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 2
- 210000003855 cell nucleus Anatomy 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 2
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 2
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 2
- 230000004720 fertilization Effects 0.000 description 2
- 210000003754 fetus Anatomy 0.000 description 2
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 2
- 230000002363 herbicidal effect Effects 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 235000019421 lipase Nutrition 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 2
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 2
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 108010058731 nopaline synthase Proteins 0.000 description 2
- 239000003375 plant hormone Substances 0.000 description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 2
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 2
- 230000022532 regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 2
- 210000003660 reticulum Anatomy 0.000 description 2
- 231100000241 scar Toxicity 0.000 description 2
- 238000005204 segregation Methods 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 2
- 230000000392 somatic effect Effects 0.000 description 2
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 230000017105 transposition Effects 0.000 description 2
- 230000017260 vegetative to reproductive phase transition of meristem Effects 0.000 description 2
- 239000005019 zein Substances 0.000 description 2
- 229940093612 zein Drugs 0.000 description 2
- 101150084750 1 gene Proteins 0.000 description 1
- IAJOBQBIJHVGMQ-UHFFFAOYSA-N 2-amino-4-[hydroxy(methyl)phosphoryl]butanoic acid Chemical compound CP(O)(=O)CCC(N)C(O)=O IAJOBQBIJHVGMQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UPMXNNIRAGDFEH-UHFFFAOYSA-N 3,5-dibromo-4-hydroxybenzonitrile Chemical compound OC1=C(Br)C=C(C#N)C=C1Br UPMXNNIRAGDFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- 108010006654 Bleomycin Proteins 0.000 description 1
- 235000011293 Brassica napus Nutrition 0.000 description 1
- 235000004977 Brassica sinapistrum Nutrition 0.000 description 1
- 239000005489 Bromoxynil Substances 0.000 description 1
- 101100290380 Caenorhabditis elegans cel-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100148606 Caenorhabditis elegans pst-1 gene Proteins 0.000 description 1
- ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N Chlorine atom Chemical compound [Cl] ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 1
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 1
- 206010010144 Completed suicide Diseases 0.000 description 1
- IMXSCCDUAFEIOE-UHFFFAOYSA-N D-Octopin Natural products OC(=O)C(C)NC(C(O)=O)CCCN=C(N)N IMXSCCDUAFEIOE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IMXSCCDUAFEIOE-RITPCOANSA-N D-octopine Chemical compound [O-]C(=O)[C@@H](C)[NH2+][C@H](C([O-])=O)CCCNC(N)=[NH2+] IMXSCCDUAFEIOE-RITPCOANSA-N 0.000 description 1
- 108700003861 Dominant Genes Proteins 0.000 description 1
- 102100039371 ER lumen protein-retaining receptor 1 Human genes 0.000 description 1
- 241000702191 Escherichia virus P1 Species 0.000 description 1
- 102000053187 Glucuronidase Human genes 0.000 description 1
- 108010060309 Glucuronidase Proteins 0.000 description 1
- 239000005561 Glufosinate Substances 0.000 description 1
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- 239000005562 Glyphosate Substances 0.000 description 1
- 108010073032 Grain Proteins Proteins 0.000 description 1
- 235000003222 Helianthus annuus Nutrition 0.000 description 1
- 244000020551 Helianthus annuus Species 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000812437 Homo sapiens ER lumen protein-retaining receptor 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000910825 Homo sapiens Protein chibby homolog 1 Proteins 0.000 description 1
- 102100024319 Intestinal-type alkaline phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 101710184243 Intestinal-type alkaline phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 108010025815 Kanamycin Kinase Proteins 0.000 description 1
- FAIXYKHYOGVFKA-UHFFFAOYSA-N Kinetin Natural products N=1C=NC=2N=CNC=2C=1N(C)C1=CC=CO1 FAIXYKHYOGVFKA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100288095 Klebsiella pneumoniae neo gene Proteins 0.000 description 1
- 235000003228 Lactuca sativa Nutrition 0.000 description 1
- 240000008415 Lactuca sativa Species 0.000 description 1
- VPRLICVDSGMIKO-UHFFFAOYSA-N Mannopine Natural products NC(=O)CCC(C(O)=O)NCC(O)C(O)C(O)C(O)CO VPRLICVDSGMIKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 240000004658 Medicago sativa Species 0.000 description 1
- 235000017587 Medicago sativa ssp. sativa Nutrition 0.000 description 1
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 101710111444 Nitric oxide synthase, brain Proteins 0.000 description 1
- 101710090055 Nitric oxide synthase, endothelial Proteins 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 101150101654 PSR1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101710096342 Pathogenesis-related protein Proteins 0.000 description 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- 240000004713 Pisum sativum Species 0.000 description 1
- 235000010582 Pisum sativum Nutrition 0.000 description 1
- KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M Potassium hydroxide Chemical compound [OH-].[K+] KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 102000029797 Prion Human genes 0.000 description 1
- 108091000054 Prion Proteins 0.000 description 1
- 102100026774 Protein chibby homolog 1 Human genes 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 101100121642 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) GEA1 gene Proteins 0.000 description 1
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 description 1
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 description 1
- 241000592344 Spermatophyta Species 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 208000003028 Stuttering Diseases 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N Thiamine Natural products CC1=C(CCO)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 1
- 244000098338 Triticum aestivum Species 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 108020002494 acetyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 102000005421 acetyltransferase Human genes 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000008186 active pharmaceutical agent Substances 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 230000003416 augmentation Effects 0.000 description 1
- 108010021384 barley lectin Proteins 0.000 description 1
- 229960001561 bleomycin Drugs 0.000 description 1
- OYVAGSVQBOHSSS-UAPAGMARSA-O bleomycin A2 Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)NCCC=1SC=C(N=1)C=1SC=C(N=1)C(=O)NCCC[S+](C)C)[C@@H](O[C@H]1[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)O[C@@H]1[C@H]([C@@H](OC(N)=O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)C=1N=CNC=1)C(=O)C1=NC([C@H](CC(N)=O)NC[C@H](N)C(N)=O)=NC(N)=C1C OYVAGSVQBOHSSS-UAPAGMARSA-O 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 235000012730 carminic acid Nutrition 0.000 description 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 1
- 230000010307 cell transformation Effects 0.000 description 1
- 210000003679 cervix uteri Anatomy 0.000 description 1
- 239000000460 chlorine Substances 0.000 description 1
- 229910052801 chlorine Inorganic materials 0.000 description 1
- 229960003324 clavulanic acid Drugs 0.000 description 1
- HZZVJAQRINQKSD-PBFISZAISA-N clavulanic acid Chemical compound OC(=O)[C@H]1C(=C/CO)/O[C@@H]2CC(=O)N21 HZZVJAQRINQKSD-PBFISZAISA-N 0.000 description 1
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 1
- 239000013065 commercial product Substances 0.000 description 1
- 239000002361 compost Substances 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 239000005546 dideoxynucleotide Substances 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000003337 fertilizer Substances 0.000 description 1
- 238000010304 firing Methods 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 239000012869 germination medium Substances 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- XDDAORKBJWWYJS-UHFFFAOYSA-N glyphosate Chemical compound OC(=O)CNCP(O)(O)=O XDDAORKBJWWYJS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940097068 glyphosate Drugs 0.000 description 1
- 101150054900 gus gene Proteins 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 239000003999 initiator Substances 0.000 description 1
- 230000002262 irrigation Effects 0.000 description 1
- 238000003973 irrigation Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- OOYGSFOGFJDDHP-KMCOLRRFSA-N kanamycin A sulfate Chemical compound OS(O)(=O)=O.O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N OOYGSFOGFJDDHP-KMCOLRRFSA-N 0.000 description 1
- 229960002064 kanamycin sulfate Drugs 0.000 description 1
- QANMHLXAZMSUEX-UHFFFAOYSA-N kinetin Chemical compound N=1C=NC=2N=CNC=2C=1NCC1=CC=CO1 QANMHLXAZMSUEX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001669 kinetin Drugs 0.000 description 1
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 1
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- VPRLICVDSGMIKO-SZWOQXJISA-N mannopine Chemical compound NC(=O)CC[C@@H](C(O)=O)NC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO VPRLICVDSGMIKO-SZWOQXJISA-N 0.000 description 1
- 230000021121 meiosis Effects 0.000 description 1
- 239000002923 metal particle Substances 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 239000007003 mineral medium Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 239000003415 peat Substances 0.000 description 1
- PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid;potassium Chemical compound [K].OP(O)(O)=O PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- 229930195732 phytohormone Natural products 0.000 description 1
- 230000008119 pollen development Effects 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- XAEFZNCEHLXOMS-UHFFFAOYSA-M potassium benzoate Chemical compound [K+].[O-]C(=O)C1=CC=CC=C1 XAEFZNCEHLXOMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000002028 premature Effects 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000006833 reintegration Effects 0.000 description 1
- 230000000979 retarding effect Effects 0.000 description 1
- 239000004576 sand Substances 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 238000010008 shearing Methods 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 159000000000 sodium salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000009331 sowing Methods 0.000 description 1
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 229910021653 sulphate ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- KYMBYSLLVAOCFI-UHFFFAOYSA-N thiamine Chemical compound CC1=C(CCO)SCN1CC1=CN=C(C)N=C1N KYMBYSLLVAOCFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003495 thiamine Drugs 0.000 description 1
- 235000019157 thiamine Nutrition 0.000 description 1
- 239000011721 thiamine Substances 0.000 description 1
- 238000000844 transformation Methods 0.000 description 1
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
- C12N15/8209—Selection, visualisation of transformants, reporter constructs, e.g. antibiotic resistance markers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
- C12N15/8213—Targeted insertion of genes into the plant genome by homologous recombination
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
- C12N15/8287—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for fertility modification, e.g. apomixis
- C12N15/8289—Male sterility
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
- Y02A40/10—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in agriculture
- Y02A40/146—Genetically Modified [GMO] plants, e.g. transgenic plants
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Plant Substances (AREA)
Description
Způsob využití samčí sterility u rostlin
Oblast techniky
Vynález se týká nového využiti samčí sterility k omezení nebezpečí pro lidstvo a životní prostředí spočívajícího v produkci transgenických rostlin.
Výhody spočívající ve využívání transgenických rostlin jsou velmi slibné. Transgenese savčích genů do rostlinné buňky nabízí zejména výhled na produkci nových rekombinantních proteinů ve velkém množství na úkor snížené produkce a bez nebezpečí virové nebo subvirové (priony) kontaminace.
Tyto výhody však nemají vést k tomu, že se zapomene na ekologická přírodní hlediska spočívající v produkci transgenických rostlin, na které je veřejnost velmi citlivá.
Dosavadní stav techniky
Vynález se týká technologie zavádějící samčí sterilitu do služeb zelené biotechnologie, která bere v úvahu ekologická a lidská hlediska.
Možné zlepšení spočívá v omezení rozptýlení transgenu do životního prostředí. Prostorová izolace kultivačních parcel již nyní umožňuje snižovat úniky transgenu, avšak tento způsob je namáhavý a pro četnost produktů se stává problematickým
K zájmu o genetické způsoby k izolování transgenů a ke snižování rizika úniku vyzývá ve svém článku Ellstrand Norman C. (Bioscience sv. 40, str. 438 až 442 1990). Mezi četnými návrhy řešení se zabývá problémem úniku transgenu. Ellstrand uvádí, že by mohly být zavedeny sterilní samčí genotypy, nebo že by mohl být letální gen pro pyl vázán přímo na gen • · · · • · · « • · · · ·· · ·· · • · • · · · konstruovaný geneticky.
V tomto směru však nedošlo k žádnému technickému vývoji. Nebylo možno předpokládat úspěšnost takového vývoje zejména vzhledem k velkému počtu zahrnutých parametrů v genetických technikách u rostlin. Nebo nebylo možno předpokládat úspěšnost v zavedení takového vývoje, zejména z hlediska četnosti parametrů v genetických technikách u rostlin.
Vynález se týká technologie umožňující zabránit rozptýlení transgenu opylováním a tedy úniku do okolí, což je technologie, podle které se používá sterilní samčí rostliny k zabránění rozptýleni příslušného transgenu začleněného do genomu příslušné rostliny.
Zájem o řízení samčí plodnosti je znám pro produkci hybridních rostlin, u kterých se aplikuje křížení dvou různých linií.
Jedním ze způsobů zabránění samooplodňování při řízeném opylováni je ruční kastrace samčích orgánů rostliny. Připomínají se také výzkumy směřující ke genetickému řízení vývoje pylu.
Samčí sterilita může být získaná, což znamená, že je nezávislá na jakékoli genetické manipulaci rekombinací ADN. Lze odlišovat samčí sterilitu cytoplasmickou od samčí sterility nukleární (Williams, 1995). Cytoplasmická sterilita je vázána na změny v organizaci a expresi mitochondriálního genomu, nukleární samčí sterilita vyplývá z mutací v genomu buněčného jádra.
Samčí sterilita může být také umělá, tedy vyvolaná expresí genu týkajícího se samčí sterility (genu AMS), který je začleněn bud do mitochondriálního genomu (samčí cytoplasmická « · • 4 4
444 444
4
4 4 4
sterilita), nebo do jaderného genomu (samčí nukleární sterilita).
Podstata vynálezu
Podstatou vynálezu je použití sterilní samčí rostliny k zabránění rozptýlení příslušného transgenu začleněného do genomu příslušné rostliny.
Podle vynálezu je rostlina nositelkou
- bud samčí cytoplasmické sterility, s výhodou umělé samčí sterility vyvolané transgenem začleněným do mitochondriální ho genomu příslušné rostliny,
- nebo samčí nukleární sterility, s výhodou samčí sterility vyvolané transgenem začleněným do nepodstatného místa nukleového genomu příslušné rostliny.
S výhodou může příslušná rostlina získat samčí sterilitu začleněním do nevýznamného jaderného genomu sekvence nesoucí gen AMS a příslušný geneticky vázaný transgen.
Vazba mezi příslušným genem a genem AMS by měla jako efekt zabránění rozptýlení pylovou cestou, umožňující tak řadu různých produkcí ve stejném prostředí.
Ostatně se není třeba obávat přenosu genu samotného AMS na rostliny divokého typu, jelikož nebude schopen být zachycen v nitru divoké populace v té míře, že by představoval genetickou zátěž jakékoli selektivní přednosti.
Vazbou mezi příslušným genem a genem AMS se dosáhne genetické vzdálenosti dostatečně slabé, aby frekvenmce rekombinace během meiozy byly zanedbatelné.
Genetickou transformací je možno do rostliny zavést dva až tři geny, jejichž fyzická vazba je naprostá.
• · · · ·· · · · ·
Vynález se týká také transgenické rostliny, části nebo extraktu transgenické rostliny, přičemž podstatou je, že příslušný transgen je vázán geneticky na gen AMS spojený s prvky umožňujícími jeho expresi v rostlinných buňkách, zejména v promotoru a terminátoru transkripce.
Podle vynálezu se předpokládá, že přítomnost příslušného genu AMS nebude bránit expresi příslušného transgenu.
částí transgenické rostliny se míní jmenovitě listy, plody nebo buňky geneticky transformovaných rostlin.
Vynález se týká také vektoru, jmenovitě plasmidu, který obsahuje příslušný transgen spojený s elementy umožňujícími jeho expresi v rostlinných buňkách, jmenovitě s promotorem a terminátorem transkripce vázaným geneticky na gen AMS spojený s elementy umožňujícími jeho expresi v rostlinných buňkách, zejména s promotorem a terminátorem transkripce.
Podle výhodného provedení vynálezu může být umělá samčí sterilita zprostředkována genem sestávajícím ze sekvence kódující protein, o kterém je domněnka, že odbourává buněčnou ARN (RNAza) za řízení promotoru specifického prašníku (Paul W. a kol., Plant Mol.Biol 19, str. 611 až 622, 1992).
Takovou RNázou může být Barnasa Bacillus amy1olique-faciens. Promotorem může být s výhodou promotor A9 Arabidopsis thaliana příslušného prašníku.
Rostliny exprimující tento pomyslný gen se stávají neschopnými produkovat pohyblivý pyl díky specifické destrukci buněk příslušného prašníku. Takové rostliny jsou ostatně normální.
Jelikož rostliny podle vynálezu nejsou schopny produkovat
| • 0 | 0 | « 0 0 | • 0 | |
| • | • | 0 | 0 0 | 0 0 0 |
| • | 0 | • · | • 0 0 | 00 0 |
| • | 0 0 0 | 0 0 0 0 | 0 0 000 0000 | 0 0 0 |
pohyblivý pyl, není nebezpečí rozptýlení příslušných genů samčí sterility zprostředkované pylem.
Rozmnožování těchto rostlin se provádí zachycováním pylu pocházejícího z rostlin, které nenesou příslušný gen podle vynálezu.
V případě kukuřice může být kultura transgenických rostlin z hlediska produkce zaručena podle schéma typu produkce semen (4 až 6 řádky samiččích následovaných 2 řádkami opylovačů). Rostliny používané jako samiččí (rostliny nesoucí příslušný gen) se vysévají ve dvojnásobné hustotě. V takovém schématu je příslušný gen vázán na selektivní gen (například gen odpovídající odolnosti proti herbicidu), což v návaznosti umožňuje ošetření selektivním činidlem (například herbicidem) k vyloučení rostlin jiných než sterilních samčích. Sklizeň se tedy týká pouze linií samiččích.
Ke konečné produkci je možno rovněž počítat se směsným osivem. V tom případě opylovací linie nenese příslušný gen a je aplikována ve směsi (10 %) s linií použitou jako samiččí. Vysévá se ve dvojnásobné hustotě. Pole se v tom případě sklízí cel é.
Podle jiného způsobu realizace vynálezu se používá cytoplasmické samčí sterility k omezení rozptýlení transgenu začleněného do genomu rostliny.
Rostliny nesoucí cytoplasmickou samčí sterilitu jsou ovlivňovány ve svém mitochondriálním genomu, který je činí neschopnými produkovat pyl za nepřítomnosti zárodečných obnovovacích genů. Tato samčí sterilita může být bud získaná nebo vyvolaná uměle zavedením mitochondriálního genomu genu udělujícího cytoplasmickou samčí sterilitu (gen CMS), například genu Ogura.
Takových rostlin se používá v semenářských podnicích k usnadnění produkce osiva. Významná část produkce kukuřičného osiva spočívá například v Evropě na využití cytoplasmické samčí sterility označované typem C“.
Výhodným způsobem podle vynálezu se zavádí transgen zpětným křížením v potomstvu rostliny, zejména kukuřice, jež je nositelkou cytoplasmické samčí sterility. Sterilní samčí rostliny je v tomto případě použito jako příbuzné samiččí. Dvě po sobě následující překřížení následovaná vyhodnocením a selekcí v potomstvu umožňují dosažení homozygotního stavu pro transgen.
Při nepřítomnosti zárodečného obnovovacího genu (genu Rf4 pro cytoplasmu C) stává se rostlina nesoucí transgen samečně sterilní. Do prostředí se tedy nedostane ani zrnko pylu nesoucího transgen. Je-li rostlina homozygotní pro transgen jsou všechna sklizená zrna nositeli genu a tudíž exprimující fenotyp.
Pěstování rostlin z hlediska produkce se uskutečňuje pěstováním rostlin opylujících v blízkosti rostlin s transgenickou samčí sterilitou. Toho se dá dosáhnout smísením semen ;
(postačuje 10 % opylovačů) bud střídáním řádků samiččích (se samčí sterilitou) se řádky opylovačů. V tomto posledním přípa- } dě se sklízejí samotné samice. j
Způsobu výroby expresního prostředku příslušného transge- í nu, spočívá podle vynálezu v tom, že l·
a) se bud transformují rostlinné buňky pomocí shora definova- í.
ného buněčného hostitele, transformovaného vektorem obsahu- j:.
jícím příslušný transgen spojený s prvky umožňujícími jeho !.<
expresi v rostlinných buňkách geneticky vázaných na gen AMS í
Γ>
spojený s prvky umožňujícími jeho expresi v rostlinných y buňkách, způsobem integrace v genomu těchto buněk genu AMS vázaného geneticky na příslušný transgen, • · · · · · • · · · « • · · « · ♦ • · · · · »» · · · ··»···· • 9 9 * • · · * •·9 999 ·
• ♦ 9 9 nebo se transformují rostlinné buňky nesoucí cytopiasmickou nebo zárodečnou samčí sterilitu způsobem integrace příslušného transgenu do genomu těch buněk;
b) vytváří se rostliny transformované z transformovaných rostlinných dále jmenovaných buněk;
c) rekuperuje se expresní produkt příslušného transgenu do příslušných buněk nebo dále jmenovaných transformovaných rostlin, jmenovitě extrakcí, následovanou v případě nezdaru případným čištěním.
Produkce transgenických rostlin podle vynálezu spočívá v tom, že jsou přítomny geny považované případně za nežádoucí, neblahé pro lidi a/nebo životní prostředí, obzvláště pro oči veřejnost i.
Ve skutečnosti je třeba k získání transgenických rostlin vytřídit z milionů buněk buňky připouštějící zavedení modifikace. K tomu se používá genů nazývaných markéry, které udělují obvykle odolnost vůči antibiotikům nebo herbicidům. Tyto geny jsou obvykle považovány za nežádoucí a k jejich vyloučení byly navrhovány různé strategie (například kotransformace, a použití rekombinací).
Tak se světový patentový spis číslo WO 92/01370 týká způsobu produkce transgenické rostliny obsahující příslušný gen oproštěný od markerových genů za použití transpozičního syst ému.
Světový patentový spis číslo WO 91/09957 se týká způsobu rekombinace specifického pro místa v buňkách rostlin, který používá systému Cre/lox k vytvoření, oddělení, začlenění nebo vzájemné záměny segmentů ADN. Popsaný způsob lze použít k eliminaci markerového genu. Uvádí se také využití způsobu k obnově plodnosti při výrobě hybridních osiv genetickým způsobem.
• · · 9 9 · 9 · · * 9 9 · · · ·
9 9 9 9 9
9« 999 ··· ···· 99
9· 9
9
Dosud však nebylo v oboru použito samčí sterility jako markéru jako takového k třídění.
Podle jednoho způsobu realizace vynálezu může gen AMS sloužit jako pozitivní markér pro vytřídění rostlin majících začleněný příslušný transgen, přičemž jedinci mají vyšlechtěný uvedený gen AMS.
Přítomnost tohoto genu AMS je možno zjistit zejména molekulárními analýzami za použití polymeračních reakci řetězce (PCR) a/nebo analýzami Southern blot obvyklými způsoby (Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. Molecular cloning, a laboratory manual, 2. vydání, Cold Spring Harbor laboratory press, 1989). Rostliny mající samčí sterilitu mohou být také velmi snadno vytříděny pozorováním přítomnosti nebo nepřítomnosti vývoje zrnek pylu. Gen AMS sloužící jako pozitivní markér může pak být považován za nežádoucí a může být vystřižen.
Podle jiného způsobu realizace vynálezu umožňuje gen AMS zlepšení procesu eliminace nežádoucího exogenního fragmentu ADN v rámci oddělování rostlin transformovaných geneticky.
Aby mohly být skutečně účinné stávající strategie oddělování, spočívající na využití markerového genu, jak jsou popsány například v citovaných patentových spisech, mají fungovat s velmi vysokoou frekvencí. Buňky nebo rostliny, které ztratily markerový gen, nejsou už vytříditelné, vzhledem k výchozím. Třídění tedy spočívá na těžkých a obtížných molekulárních způsobech .
Podle vynálezu se využívá genu udávajícího umělou samčí sterilitu (gen AMS), jako sebevražedného markéru nebo negativního markéru tím , že se vystřihne a pouze jedinci, kteří tento markér ztratily, se rozmnožují. To umožňuje využití strategie vytřídění exogenního nežádoucího fragmentu ADN mají9 • · 0 0 0 0 «· 0 0 0 000 000 0 0 00 · 000 0 00000 0 0 0 0 0 0 0 000 «00 0 0 0 0 0 0 0
000 000 0000 00 00 čího slabé výnosy a tudíž rozšíření oboru výzkumu v této ob1ast i .
Podle vynálezu je gen AMS geneticky vázán na nežádoucí fragment ADN takovým způsobem, že tento gen AMS a tento nežádoucí fragment ADN by mohly být vystřiženy současně.
Tento exogenní nežádoucí fragment ADN může být nadto markerovým genem, s výhodou genem udělujícím odolnost proti antibiotiku.
Systémy eliminace nežádoucích genů spočívají obecně na dvou složkách: na vystřihnutelném fragmentu ADN, který obsahuje nežádoucí gen a na induktoru takové excise.
Způsobem podle vynálezu se do vystřihnutelného fragmentu zavede gen udělující umělou samčí sterilitu. Rostliny, transformované první složkou, jsou tedy sterilní z hlediska samčí sterility a uchovány překřížením (back cross”). Induktor, zavedený křížením, zavede eliminaci fragmentu ADN obsahujícího gen AMS, čímž vyvolá vývoj plodů pocházejících ze samooplodnění. Tyto plody obsahují jedince zbavené genu AMS a genu nežádoucího.
V praxi stačí sklízet samotná zrna produkovaná samooplodněním rostlinami F1 obsahujícími obě složky.
Podle jiného využití vynálezu může být rostlina mající integrovaný vystřihnutelný fragment ADN obsahující gen AMS, transformována fragmentem ADN indukujícím excisi.
Systém vystřihování, použitý podle vynálezu k eliminaci nežádoucího fragmentu ADN, může být systémem transpozice, jakým je jmenovitě systém Ac/Ds kukuřice nebo systémem rekombinace, jakým je jmenovitě systém Cre/lox bakteriofágu P1, sys10 • · · · · · · · · * · · ··· · ····· • · · 4 · · · ·····♦ • · · · · · · ·· ··· ··· ···· ·· 99 tém FLP/FRT kvasnic, rekombináza Gin fágu Mu, rekombináza Pin E. coli nebo systém R/RS plasmidu pSR1 .
Vektor, jmenovitě plasmid podle vynálezu přináší vystřihovatelný fragment ADN, kterým se rozumí nežádoucí fragment ADN a AMS, přičemž tímto nežádoucím fragmentem ADN je s výhodou markerový gen, s výhodou gen udělující odolnost proti antibiotiku, přičemž gen AMS a nežádoucí fragment ADN jsou každý napojeny na prvky umožňující jejich expresi do rostlinných buněk, zejména promotoru a terminátoru transkripce. Vektorů podle vynálezu se využívá k transformaci rostlinných buněk.
Kit k provádění eliminace vystřihovatelného fragmentu spočívá podle vynálezu v tom, že obsahuje jednak shora definovaný vektor obsahující příslušný transgen spojený s prvky umožňujícími jeho expresi v rostlinných buňkách, vázaný geneticky na gen AMS spojený s prvky umožňujícími jeho expresi v rostlinných buňkách nesoucích vystřihnutelný gen AMS nebo rostlinu nebo část rostliny transformované vektorem podle vynálezu a na druhé straně vektor nesoucí zdroj transponázy nebo rekombinázy, nebo rostlinu nebo část rostliny transformované vektorem podle vynálezu.
Transformace rostlinných buněk může být uskutečněna transferem dále jmenovaných vektorů do protoplastů, obzvláště po jejich inkubaci do roztoku polyethylenglykolu (PG) v přítomnosti dvoumocných kat iontů (Ca2+), způsobem, který popsal Krans a kol. (1982).
Transformace rostlinných buněk může být uskutečněna také elektroporací, jmenovitě způsobem, který popsal Fromm M.E., Taylor L.P., Walbot V. (Nátuře sv. 319, str. 791 až 793 (1986)
Transformace rostlinných buněk může být uskutečněna také použitím genového děla, umožňujícího vystřelování vysokou rychlostí kovových částic odvozených z příslušných sekvencí ADN dodávajícím tak geny dovnitř buněčného jádra, jmenovitě způsobem, který popsal Sanford J.C. (Trends in Biotechnology 6, str. 299 až 302, 1988)
Jiným způsobem transformace rostlinných buněk je cytoplasmická nebo nukleární mikroinjektáž.
Podle obzvášt výhodného provedení vynálezu jsou rostlinné buňky transformovány vektorem podle vynálezu, přičemž se má za to, že buněčný hostitel je schopen infikovat příslušné rostlinné buňky a umožňuje integrovat do jejich genomu příslušné sekvence ADN původně obsažené v genomu shora uvedeného vektoru
S výhodou je použitým shora jmenovaným buněčným hostitelem Agrobacteri um tumefaciens, obzvláště způsobem, který popsal Bevan (1984) a An G. (Plant Physiol. 81, str. 86 až 91, 1986(, nebo také Agrobacteri um rhizogenes, jmenovitě způsobem, který popsal Jouanin (Plant. Sci. 53, str. 53 až 63, 1987).
Transformace rostlinných buněk se s výhodou provádí transferem oblasti T kruhového plasmidu extrachromosomického induktoru nádorů Ti Agrobacterium tumefaciens, za použití binárního systému (Watson a kol., ADN recombinant, vydavatel De Boeck Universitě, str. 273 až 292).
K tomu jsou konstruovány dva vektory. V jednom z nich je oblast ADN-T eliminována dělením s výjimkou pravého a levého okraje, přičemž markerový gen je vložen mezi ně, aby se umožnila selekce v buňkách rostlin. Druhým účastníkem binárního systému je vnější pomocný plasmid Ti, plasmid modifikovaný, který nemá ADN-T ale obsahuje vždy virulentní geny, viry potřebné k transformaci rostlinné buňky. Tento plasmid je obsažen v Agrobacteriu.
Gen AMS a příslušný gen mohou být připojeny najednou nebo jednotlivě na systém řízení transkripce, obzvláště na trans12 • toto to ·· ·· ·· • · · · toto· · · ·· · ··· · ····· ·· ·· · ········ • · · ·· ·· ·· ··· ······· ·· ·· kripční promotor a terminátor. Gen AMS může být jmenovitě napojen na systém řízení transkripce mající promotor umožňující specifickou expresi v prašníku, jako je promotor A3 nebo A9 (světový patentový spis číslo WO 92/11379) nebo promotory TA29, TA26 nebo TA13 (světový patentový spis číslo WO 89/10396).
Jako terminátory transkripce, kterých lze použít, přicházejí v úvahu terminátor polyA 35S mozaikového viru květáku (CaMV), který popsal Franck a kol. (Cell 21, str. 285 až 294, 1980) nebo terminátor polyA NOS, který odpovídá nekódované oblasti 3' genu nopalinové syntézy plasmidu Ti Agrobakteria tumefaciens kmene nopalinu (Depicker a kol., J. Mol. Appl. Genet 1, str. 561 až 573, (1982).
Jako promotory transkripce, kterých lze použít například ve spojení s příslušným genem přicházejí v úvahu zejména:
- promotor 35S, nebo s výhodou konstitutivní dvojitý promotor 35S (pd35S) CaMV, který popsal Kay (Science 236, str. 1299 až 1302, 1987),
- promotor PCRU křížaté ředkvičky umožňující expresi rekombinantních peptidů podle vynálezu jedinečně v osivu (nebo v zt— nech) rostliny získané z transformovaných buněk podle vynálezu a popsané v článku Depigny-This a kol. (1992),
- promotory PGEA1 a PGEA6 odpovídající oblasti 5' nekódující geny rezervního proteinu zrn, GEA1 a GEA6, Arabidopsis thaliana (Gaubier a kol., Mol. Gen. 238, str. 409 až 418, 1993) umožňující specifickou expresi v zrnech,
- chimerní promotor superpromotor PSP (Ni M a kol.,Pint J. 7, str. 661 až 676, 1995) tvořený fúzí trojnásobného opakování aktivačního transkripčního prvku promotoru genu oktopinové syntézy Agrobacteria tumefaciens, transkripčního aktivačního prvku promotoru genu mannopinové syntézy a promotoru mannopinové syntézy Agrobacteria tumefaciens,
- aktinový promotor rýže másledovaný intronovým aktinem rýže (PAR-JAR) obsaženým v plasmidu pAct1-F4 který popsal McElroy • 4 • 4 4 4
44· 444
4 (Mol. Gen. Genet. 231, str. 150 až 160, 1991)
- promotor HMGW (High Molecular Weight Glutenine) ječmene (Anderson O.D. a kol., 1989),
- promotor genu gama-zeinu kukuřice (P-gama-zein) obsažený v plasmidu pgama63, který popsal Reina a kol. (1990) a umožňující expresi v bílkovině kukuřičných zrn.
S výhodou jsou gen samčí sterility a příslušný gen spojeny alespoň v jedné sekvenci kódující peptid zodpovědný za určení rekombinantních peptidů do stanovené oblasti rostlinné buňky, jmenovitě do endoplastového retikula nebo do vakuol nebo dokonce do vnějšku buňky, do pektobuněčných přepážek nebo do extrabuněčného prostoru nazývaného též apoplasma.
Tyto sekvence kódující adresní peptid mohou být původu rostlinného, lidského nebo zvířecího.
K sekvencím rostlinného původu kódujícím adresní peptid patří například:
- zárodečná sekvence 69 nukleotidů (vyznačených v následujících příkladech) kódující prepeptid (peptidový signál) 23 aminokyselin sporaminu A u sladkých brambor, přičemž peptidový signál umožňuje vstup rekombinantních polypeptidů podle vynálezu do sekrečního systému rostlinných buněk transformovaných podle vynálezu (hlavně do endoplasmidového retikula).
- nukleotidová sekvence 42 nukleotidů (vyznačených v následujících příkladech) kódující N-terminálový propeptid vakuolárního určení 14 aminokyselin sporaminu A u sladkých brambor, umožňující nahromadění rekombinantních polypeptidů ve vakuolách transformovaných rostlinných buněk podle vynálezu,
- nukleotidová sekvence 111 nukleotidů (vyznačených v následujících příkladech) kódující prepropeptid 37 aminokyselin sporaminu A sestávající z N-terminálové části k C-terminálové • 9 9 9
9 9 9
999 999
- 14 • · · »· části 23 aminokyselin shora uvedeného peptidového signálu následovaného 14 aminokyselinami, přičemž tento propeptid umožňuje vstup rekombinantních peptidů podle vynálezu do sekrečního systému a jejich hromadění ve vakuolách rostlinných buněk transformovaných podle vynálezu, přičemž tři jemnované sekvence popsal Murakami a kol. (Plant Mol. Biol. 7, str. 343 až 355, 1986) a Matsuoka a kol. (1991),
- karboxyterminální propeptid lektinu ječmene, který popsali
Schroeder R,
Borkhsenious O.N., Matsuoka K., Nakamura K.
Rakhel N.V. (Plant Physiol narek S.Y. a Ralkhel N.V. 1206, 1991),
101, str. 451 až 458, 1993) a Bed(The plant Cell, 3, str. 1195 až
- a PRS (Pathogenesis Related Protein, Cornelissen a kol. (1986) umožňující sekreci.
Mezi sekvence kódující určující peptid lze jmenovat sekvence, které kódují peptidy KDEL, SEKDEL a HDEL na okraji C-terminálu a umožňující určení do endoplasmického retikula.
Jako rostlinné buňky, schopné transformace způsobem podle vynálezu, se příkladně uvádějí buňky řepky olejky, tabáku, kukuřice, hrachu, rajčat, pšenice, ječmene, brambor, sóji, slunečnice, hlávkového salátu, rýže a vojtěšky.
Příslušné geny k začlenění do genomu rostlinné buňky mohou být obzvláště geny kódující proteiny lidského nebo zvířecího původu, jež mohou být zajímavé z terapeutického nebo profylaktického hlediska, jako je kolagen a gastrická lipáza.
Použitými markerovými geny mohou být obzvláště geny vykazující odolnost proti antibiotikům, jako je hydromycin, kanamycin, bleomycin nebo streptomycin nebo herbicidům jako je glufosinát, glyfosát nebo bromoxynil.
• 4 · » »· ·♦ ·« ···· · · · · ···> • 9 · · 4····
9 9 9 9 11 991 111
9 9 11 9 9
111 199 1911 19 * ·
Vynález objasňují, nijak však neomezují následující příklady praktického provedení za pomoci přiložených diagramů.
Přehled obrázků na výkresech
Na obr. 1 je lokalizace nukleotidů A9a a A9b. šipkou před 3’Ac je vyznačeno místo klonování příslušného genu.
Na obr. 2 je lokalizace nukleotidů EM1 a EM5. šipkou před 3’Ac je vyznačeno místo klonování příslušného genu.
Na obr. 3 je lokalizace nukleotidů 5Ή a Ac12. šipkou před 3’Ac je vyznačeno místo klonování příslušného genu.
Příklady provedení vynálezu
Konstrukce různých plasmidů stejně jako jejich vazba a transformace bakterií Escherichia coli DH5a, jež byly prve učiněny kompetentními, se uskutečňuje díky obvyklým technikám rekombinace ADN (Sambrook a kol., Fritsch E.F., Maniatis T., Molecular cloning, a laboratory manual, 2. vydání, Cold Spring Harbor laboratory press, 1989).
Příklad 1
Konstrukce binárního plasmidů spojujícího samčí sterilitu zprostředkovanou genem kódujícím PR-g1ukanázu, příprava psí gastrické lipázy, selekce na kanamycin a selekce na Basta, použitelného k transgenesi řepky olejky.
Binární plasmid odvozený od pGA492 (An G., Plant Physiol. 81, str. 86 až 91, 1986), který obsahuje mezi pravým a levým okrajem vložky plasmidů pTiT37 Agrobacteri um tumefaciens, na své transferové ADN, následující sekvence: konstitutivní promotor genu nos kódující nopalinovou syntázu (Depicker a kol., J. Mol. Appl. Genet 1, str. 561 až 573, 1982), sekvenci kódující gen NPTII kódující fosfotransferázu neomycinu vykazující odolnost vůči kanamycinu (Berg D.E., Berg C.M. Biotech16 nology 1, str. 417 až 435, 1983), oddělený z osmi prvních kodonů, z nichž iniciační kodon methionin ATG je fúzován na sekvence 14 prvních kodonů sekvence kódující gen nos zbavený regionu prvních 14 kodonů, terminátor nos (Depicker a kol., j. Mol. Appl. Genet 1, str. 561 až 573, 1982), region obsahující četná klonovací místa (označovaná také jako polylinker) (Hindi 1 1 -Xbal -Sací -Hpal -Kpnl -Cl al -Bg 1 1 1 ) předcházející gen CAT kódující chloranfenikolovou acetyltransferázu (Close J.J., Rodriguez R.L. Gene 20, str. 305 až 316, 1982) a koncové sekvence genu 6 plasmidu pTiA6 Agrobacterium tumefaciens (Liu, Mol. Plant. Microb., Interactions 6, str. 144 až 156 (1951).
a) Konstrukce plasmidu pB10C500 nesoucího gen vykazující samčí st eri1 i tu
Použije se chimerního genu odpovídajícího promotoru
A9-PR-glukanázy-T35S obsaženého v pDW80PR (Woral1 D., Hird a Scott R., Plant Cell 4, Kpnl-EcoRV nesoucí chimerní
M.
Hodge R., Paul W.
Draper J str. 759 až 771, 1992). Fragment gen se izoluje dvojitou enzymatickou digescí pomocí Kpnl a EcoRV, vyčistí se elektroelucí po elektroforetické migraci na vysušeném 0,8% agarovém gelu vysráženém v alkoholu. Začlení se do míst Kpnl a Smál plasmidu pBluescript KS+ (obchodní produkt společnosti Stratagene). Vazba se uskuteční 100 ng defosforylovaného plasmidu a 50 ng fragmentů Kpnl-EcoRV v reakčním prostředí 10 pl v přítomnosti 1 μΐ pufru ligázy T4 DNA x 10 (Amersham) a 2,5 U enzymu ligázy T4 DNA (Amersham) během 16 hodin při teplotě 14 °C. Transformují se předběžně aktivované buňky Escherichia coli DH5a. Plasmidická ADN získaných klonů vytříděných na mediu obsahujícím 50 pg/ml ampicillinu se extrahuje způsobem alkalické lyse a analyzuje se enzymatickou digescí restrikčními enzymy. Ze získaného plasmidu se začlení fragment Kpnl-Sstl, nesoucí shora popsaný chimerní gen, na místa Kpnl a Sst1 pGA492. Chimerní fragment se izoluje obvyklými způsoby. Vazba se uskuteční 100 ng defosforyloveného vek- 17 9 · ΒΒΒΒ • Β β ΒΒΒ ΒΒΒ
Β 9 · ·
ΒΒΒΒΒΒΒ »· β* toru a 50 ng fragmentu vnášejícího fragmenty Kpnl-Sstl do 10 ml reakčního prostředí v přítomnosti 1 μΐ pufru ligázy T4 DNA x 10 (Amersham) a 2,5 J enzymu ligázy T4 DNA (Amersham) během 16 hodin při teplotě 14 °C. Transformují se předběžně aktivované buňky Escherichia coli DH5a. Plasmidická ADN získaných klonů, vytříděných na mediu obsahujícím 12 pg/ml tetracykli nu, se extrahuje způsobem alkalické lyse a analyzuje se enzymatickou digescí restrikčními enzymy. Získaný vektor se jmenuje PB10C500.
b) Konstrukce plasmidu pB!0C501 nesoucího gen vykazující odolnost vůči Basta
Fragment EcoRl-Hindl11 nesoucí chimérní gen P35S-pat-TNOS izolovaný z plasmidu plB16.1 (Broer a kol., Braunschweig Symposium on Applied Plant Molecular Biology, Braunschweig 21.23. listopadu 1988), Proceedings, Ed Galling G. str. 240, 1989) se začlení do míst EcoRl a Hindi 11 pBSllSK+ (produkt společnosti Stratagene) a modifikovaného přísadou místa Kpnl v místě Smál sekvence polylinkeru pBSllSK+. Výsledný plasmid se nazývá pB!0C501. Plasmidická ADN získaných klonů vytříděných na mediu, obsahujícím 50 pg/ml ampicillinu, se extrahuje způsobem alkalické lyse a analyzuje se enzymatickou digescí restrikčními enzymy.
c) Konstrukce plasmidu pB10C502 nesoucího gen kódující gastrickou psí lipázu
Chimérní gen odpovídající PCRU-PSLGL.-LGC-TSSS, izolovaný z pB10C93 a popsaný ve světové přihlášce vynálezu číslo WO 96/33277 je nesen fragmentem zísakným dvojitou digescí Sací a Xhol, přičemž místo Sací bylo nahraženo působením enzymu polymerázy T4 DNA (New England Biolabs) podle doporučení výrobce. Tento fragment byl začleněn mezi místo Apal zpracované působenmím enzymu polymeráza T4 DNA a místo Xhol plasmidu
·· ··» ·····*· ·» φ ·
PB10C501. Výsledný plasmid se nyzývá pB10C502. Plasmidická ADN získaných klonů, vytříděných na mediu obsahujícím 50 pg/ml ampicillinu, se extrahuje způsobem alkalické lyse a analyzuje se enzymatickou digesci restrikčními enzymy.
d) Konstrukce binárního vektoru pB10C503
Z pBlOC5O2 se izoluje fragment Kpnl nesoucí expresní kazety PCRU-PSLGL-LGC-T35S a P35S-patTNOS a váze se na místo Kpnl pB10C500. Výsledný plasmid se nazývá pB10C503. Plasmidická ADN získaných klonů vytříděných na mediu, obsahujícím 12 pg/ml ampicillinu, se extrahuje způsobem alkalické lyse a analyzuje se enzymatickou digesci restrikčními enzymy.
Plasmidická ADN plasmidu pB10C503 se začlení přímou transformací do kmene LBA4404 Agrobacterium tumefaciens způsobem, který popsal Holsters a kol., Mol. Gen. Genet. 163, str. 181 až 187, 1978).
Příklad 2
Konstrukce binárního plasmidu spojujícího samčí sterilitu vykazovanou genem kódujícím barnázu, produkce gastrické psí lipázy, vytřídění na kamamycinu a vytřídění na Basta, použitelné k transgenese řepky olejky.
a) Konstrukce plasmidu pB10C504 nesoucího gen vykazující samčí st er i 1 i t u
Použije se chimerního genu odpovídajícího promotoru A9-PR-barnázy-T35S obsaženého v pWP173 (Paul W. a kol., Plant Mol. Biol 19, str. 611 až 622, 1992). Fragment Kpnl-EcoRV nesoucí chimerní gen se začlení do míst Kpnl a Smál plasmidu pBluescript KS+ (obchodní produkt společnosti Stratagene). Ze získaného plasmidu se začlení fragment Knpl-Sstl nesoucí chimerní gen do míst Kpnl a Sstl pGA492. Výsledný vektor se nazý19 • · · « 0 · * · · · ·
0 0 ί 0 00000
0 0 0 0 0 0 • 0 00 « ·0· 0·0· 0· 00 vá pB1OC5O4. Plasmidická ADN získaných klonů vytříděných, na mediu obsahujícím 50 pg/ml ampicillinu, se extrahuje způsobem alkalické lyse a analyzuje se enzymatickou digescí s restrikčními enzymy.
b) Konstrukce plasmidu pBlOC5O1 nesoucího gen vykazující odolnost vůči Basta
Vektor se konstruuje způsobem popsaným v příkladu 1b).
c) Konstrukce plasmidu pBlOC5O1 nesoucího gen kódující psí gastrickou lipázu
Vektor pB10C502 se konstruuje způsobem popsaným v příkladu 1c).
d) Konstrukce vektoru pB10C505
Z pB10C502 se izoluje fragment Kpnl nesoucí expresní kazety PCRU-PSLGL-LGC-T35S1’ a P35S-patTNOS a váže se na místo Kpnl pB10C504. Výsledný plasmid se nazývá pB10C505. Plasmidická ADN získaných klonů, vytříděných na mediu obsahujícím 50 pg/ml ampicillinu, se extrahuje způsobem alkalické lyse a analyzuje se enzymatickou digescí s restrikčními enzymy.
Plasmidická ADN plasmidu pB10S505 se začlení přímou transformací do kmene LBA4404 Agrobacteria tumefaciens způsobem, který popsal Holsters a kol. (Mol. Gen. Genet. 163, str. 181 až 187, (1978)
Příklad 3
Získání rostlin transgenické řepky olejky
Zrna jarní řepky (Brassica napus cv WESTAR nebo linie Limagrain) se 40 minut desinfikují v 15% roztoku Domestos. Po ft · ft * · · · · ftft· ftft ftft ftftft ······· • · ftft · ftft · • ftft ftftft • · ftft ftft
5-násobném promytí sterilní vodou se zrna nechají vyklíčit po 20 zrnech v květináči o průměru 7 cm a výšce 10 cm v minerálním prostředí Murashige a Skoog (Sigma M 5519) se 30 g/1 sacharosy a se ztuhženém agarovým gelem 5 g/1. Květináče se umístí do kultivátoru o teplotě 26 ’C s periodou osvitu 16h/8h a s intenzitou osvětlení 80 μΕ.m2s”1 . Po 5 dnech klíčení se odberou sterilně dělohy odříznutím každého řapíku 1 mm pod děložním kolínkem.
Současně se realizuje v Er1enmayerově baňce o obsahu 50 ml předkultura Agrobacteri um tumefaciens kmene LBA4404, obsahující binární plasmidy během 36 hodin při teplotě 28 °C v 10 ml bakteriálního prostředí 2YT (Sambrook J., Fritsch E.F., Máni at i s T. Molecular cloning, a laboratory manual, 2. vydání, Cold Spring Harbor laboratory press (1989) doplněného užitečnými antibiotiky vytříděním z použitého kmene.
Předkultura slouží k vysetí zároveň s 1% novou bakteriální kulturou za stejných podmínek. Po 14 hodinách se kultura odstředuje 15 minut při 3000 g a bakterie se převedou do ekvivalentního objemu tekutého klíčícího prostředí. Tato suspense se rozdělí na Petriho misky o průměru 5 cm 5 ml/na misku.
Odříznutý vršek řapíku se ponoří na několik sekund do takto připraveného roztoku agrobakteriί, načež se řapík ponoří několik milimetrů do regeneračního prostředí. Toto prostředí má stejné základní složení jako klíčící prost ředí obsahujícího navíc 4 mg/1 benzylaminopuri nu (BAP), fytohormonu podporujícího nové tvoření výhoneků. Deset explantů (děloha s řapíkem) se kultivují v Petriho miskách o průměru 9 cm (Greiner odkaz 664102).
Po dvou dnech společné kultivace za stejných podmínek prostředí jako klíčení, se explanty přepíchají do pěstitelských nádob (Sigma, odkaz P1552) obsahujících předchozí pro21 • · · · 4 · « 4 9 * · · • · t 9 · · · · · · · · A » « ······ • < · · · · · ·· ··· ··· ···« ·· ·· středí doplněné selektivním činidlem: 45 mg/1 síranu kanamycinu (Sigma odkaz K 4000) a bakteriostatikem: směs hmotnostně 1/6 draselné soli kyseliny klavulanové a 5/6 sodné soli amoxillínu (injektovatelný AugmentinR) do 600 mg/1.
Postupně se dvakrát v třítýdenní lhůtě explanty přepíchají sterilně do novém prostředí za stejných podmínek.
Zelené výhonky, patrné na konci druhého nebo třetího přepíchání, se od explantů oddělí a kultivují se jednotlivě v průhledných květináčích o průměru 5 cm a výšce 10 cm obsahujících stejné prostředí jako shora uvedeno, avšak zbavené BAP. Po třech týdnech pěstění se lodyha transformovaného výhonku oddělí a výhonek se přepíchá do květináče s čerstvým prostředím. Ke konci třetího až čtvrtého týdne jsou kořeny dostatečně vyvinuté k umožnění aklimatizace rostliny do fytotronu. Výhonky, které nejsou zelené nebo zakořeněné, se vyloučí. Rostliny se tedy přesadí do misek se stranou vysokou 7 cm naplněných zeminou (norma NF 1144551:40 % hnědé raše! iny 30 % prosátého kompostu a 30 % písku) nasycenou vodou. Po dvou týdnech aklimatizace ve fytotronu (teplota 21 °C, fotoperioda 16h/8h při 84% relativní vlhkosti) se sazenice přesadí do květináčů o průměru 12 cm naplněných stejnou zeminou obohacenou retardačním hnojivém (Osmocote v poměru 4 g/zem) pak se přenesou do skleníku (třídy S2) s teplotou regulovanou na 18 C s dvojím kropením vodou 2 minuty denně.
Po objevení květů se květy sáčkují (Crispac, odkaz SM 570y 300 mm *700 mm) k zabránění oplodnění křížením. Jakmile lusky dozrají, sklidí se, vysuší a vymlátí. Získaná zrna slouží k dodávání biochemické aktivity příslušného genu.
Vytřídění transgenického poklesu se provádí klíčením v prostředí obsahujícím síran kanamycinu v koncentraci 100 až 150 mg/1 (podle genotypu). Prováděcí podmínky jsou stejné jak » » · » ·*» · · · shora popsáno, přičemž klíčení probíhá ve skleněných válcích s jedním zrnem ve válci. Samotné sazenice vyrážející sekundární kořínky se aklimatizují ve fytotronu před vsazením do země.
Příklad 4
Získání transgenických tabákových rostlin
Rostliny tabáku použité k transformačním pokusům (Nicotiana tabacum var. Xanthi NC a PBD6) se kultivují in vitro v základním prostředí Murashige a Skoog (1962) s přísadou vitaminů (Gamborg a kol., 1968, Sigma M0404), sacharózy 20 g/l a agaru (Merck) 8 g/l. Hodnota pH prostředí se nastaví na 5,8 roztokem hydroxidu draselného před vložením do autoklávum při 120 °C na 20 minut. Sazenice tabáku se přepíchají rozmnožováním odnožemi kolínek každých 30 dní v množícím prostředí MS20.
Všechny kultury se pěstují in vitro v kliatizovaném prostředí za těchto podmínek:
- intenzita osvětlení 30 pE.nr2.s-1, fotoperioda 16 hodin,
- termoperioda 26 °C ve dne, 24 °C v noci.
Způsob transformace je odvozen od postupu, který popsal Horsch a kol. (Science 227, str. 1229, 1985).
Předkultura Agrobacterium tumefaciens kmene LBA4404, obsahující binární plasmidy, se připraví během 48 hodin za míchání při teplotě 28 °C v prostředí LB (Sambrook a kol., 1989) s přísadou vhodných antibiotik (kanamycinu). Předkultura se zředí v poměru 1/50 ve stejném kultivačním prostředí za stejných podmínek. Po noci se kultura odstředí (10 minut 3000 g), bakterie se přenesou do ekvivalentního objemu tekutého prostředí MS30 (30 g/l sacharosy) a tato suspense se zředí v poměru 1/10.
• 9 · · 9 9 99 9« • · 9 · 9·· 9 9 99 9
999 · 99999
9 » 9 9 9 9 999999
9 9 ·9 9 9
999 ··· 9999 99 «·
Explanty přibližně 1 cm2 se odříznou z listů shora popsaných sazenic. Uvedou se na 1 hodinu do styku se suspensí bakterií, pak se rychle osuší na filtračním papíru a vnesou se do kokultivačního prostředí (pevného MS30).
Po dvou dnech se explanty přenesou do Petriho misek s regeneračním prostředím MS30, obsahujícím selekční činidlo kanamycin (2000 mg/1) nebo bakteriostatické činidlo AugmentinR (400 mg/1) a hormony potřebné k indukci výhonků (BAP, 1 mg/1 a ANA 0,1 mg/1). Sazenice se přesadí do stejného prostředí po dvou týdnech kultivace. Po dalších dvou týdnech se výhonky přenesou do Petriho misek s vývojovým prostředím sestávajícím z prostředí MS20 s přísadou kanamycinu a Augmentinu. Po 15 dnech se polovina výhonků přepíchá. Zakořenění trvá přibližně 20 dní, v kteréžto době mohou být rostlinky klonovány odnožemi mezi kolínky a vneseny do skleníku.
Příklad 5
Konstrukce zdroje transposázy
Připraví se binární plasmid nesoucí zdroj transposázy fixovaný na promotor 35S, načež je doložena silná a předčasná exprese této transposázy (Finnegan E.J., Lawrence G.J., Dennis E.S., Ellis J.G. Plant Molecular Biology 22, str. 625 až 633, 1993) .
Klonuje se fragment BamHl-EcoRl pBl35S Ac (zkonstruovaný Finneganem) v místech BamHl a SnaBl pB121 (Jefferson a kol., Plant Molecular Biology, Rep. 5, str. 387 až 405, 1987). Výsledný plasmid, nazvaný pBlOS144, obsahuje mezi pravým a levým okrajem, resistentní gen vůči kanamycinu NPT11 pod promotorem a terminátorem nos. Element Ac, oddělený z jeho části 5' pod promotorem 35S, tvoří tak fixovaný zdroj transposázy a 1400 párů bází část i 5' genu kóduj i čího β-glukuronidázu E.coli (gen φ· * · ·· Φ· «· * · · · · · » · φ φ · φ
9 9 · φ φ φ φ Φ • ♦ · * · · Φ ΦΦΦΦΦΦ
9 9 9 9 9 9
999 999 9999 99 99
GUS označený GUS na obr. 3) následovaný terminátorem nos.
Příklad 6
Konstrukce elementu DS:KanaR-AMS
Postupné kroky vedoucí k přípravě tohoto vektoru jsou:
a) Konstrukce plasmidu pBIOS2O3 nesoucího gen zprosředkující odolnost vůči kanamycinu
Začlení se fragment BamHl 1 Kb (obsahující gen NPT11) pCamVNEO (Fromm M.E., Taylor L.P., Walbot V., Nátuře sv. 319, str. 791 až 793 (1986) do místa BamHl pBIOSI (Perez P., Tiraby G., Kallerhoff J., Perret J. Plant Molecular Biology 13, str. 365 až 373, 1989). Výsledný vektor pBlOS 1K se digeruje s Ecorl. Fragment EcoRl BIOS 1K se uvolní polymerázou Klenow a klonuje se do plasmidu AF3'Ac (Cocherel S., Perez P., Degroote F., Genestier S., Picard G. Plant Molecular Biology 30, str. 539 až 551, 1996) do místa EcoRl, čímž vytváří pB10S203.
b) Konstrukce plasmidu pBIOS2O8 nesoucího gen AMS
Fragment EcoRl vektoru pBGS fleo, obsahující 399 párů vnějších bází 5' prvku Ac (Cocherel - Cocherel S., Perez P., Degroote F., Genestier S., Picard G. Plant Molecular Biology 30, str. 539 až 551, 1996) se klonuje do pBSsk (Stratagene) v místě EcoRl, čímž vytváří pBIOS2O4.
Fragment EcoRl - Hindi 11 (obsahující zakončení 3' Ac a kazetu NPT11) pBIOS2O3 se klonuje do pBSsk do míst EcoRl-Hind111 za vytvoření pBIOS2O5.
Fragment Smál pBIOS2O4 (obsahující zakončení 5' Ac) se klonuje do pBIOS2O5 v místě Smál, čímž vytváří pBIOS2O6.
• · 4 • · * 4 4 4 4
444 444 4444 44 44
Fragment Sphl DW 80 bin PR-glukanázy obsahující gen PR-glukanázy (PR-Glu) pod promotorem A9 a terminátorem CaMV (Woral1 D. , Hird M. , Hodge R., Paul W., Draper J. a Scott R. , Plant Cell 4, str. 759 až 771, 1992) se klonuje v mísatě EcoRl pBIOS206. Ve výsledném plasmidu pBI0S208 je gen A9-PR-g1ukanázy začleněn v opačném smyslu genu NPT11.
c) Začlenění elementu Ds:KanaR-AMS do binárního vektoru
Vektor pGA 492DL se získá následujícími modifikacemi pGA 492 (G.An):
- vyčlenění fragmentu Sacll-Clal odpovídajícího expresní kazetě chimerního genu NPT11. Nový vektor se nazývá pGa 492D,
- náhrada fragmentu Bglll-Scal (ztrátou části genu CAT) pGA 492D polylinkerem Sacl-Kpnl pBSllsk. Tento nový vektor se nazývá pGA 492DL.
Fragment Hindlll-Spel pBIOS2O8 se klonuje v místech Hindlll-Spel pGA 492 GL k vytvoření binárního plasmidu pBIOS232. Struktura ADN-T je schematicky znázorněna na obr. 1 a 2.
Přiklad 7
Transformace a selekce rajčat
a) Transformace rajčete (varianty UC82B) binárním konstruovaným vektorem
Binární vektor pBIO232 se přenese do kmene Agrobacterium LBA 4404 triparentál ní konjugací způsobem, který popsal Ditta G, Stanfield S., Corbin D. (Helinski D.R. Pnas 77, str. 7347 až 7351, 1980).
Transformace rajčete se provede modifikovaným způsobem, který popsal Fillatti J.J., Kiser J., Rose R. a Commai L.
··* ··· ·· (Bio/Technology 5, str. 726 až 730, 1987).
Semena kultivaru UC82B se sterilizují 15 minut v 10% Domestos, a třikrát se promyjí sterilní vodou. Zašijí se do květináče obsahujícího kultivační prostředí MSSV/2 na 7 až 8 dní.
Dělohy se vyjmou a rozřežou se příčně na tři části. Pouze středová Část se uchová a kultivuje se při teplotě 26 °C na světle v prostředí KCMS doplněném Acetosyringonem s vnějším čelem proti prostředí.
Bakterie kmene Agrobacteri um LBA 4404 se kultivují jednu noc v prostředí LB doplněném příslušných selekčním činidlem (tetracyklinem). Ráno se kultura odstředí a získaná sedlina se vrátí do kapalného prostředí KCMS.
Sazenice se namočí na 30 minut do roztoku Agrobacteria zředěného v poměru 1/20 v prostředí KCMS doplněném Acetosyringonem. Rychle se vysuší na filtračním papíru.
Sazenice se:
- vrátí zpět do prostředí KCMS na dva dny ve tmě při teplotě 26 °C,
- promyjí se tekutým prostředím 2Z doplněným Augmentinem (400 mg/1) a vysuší se na filtračním papíru,
- přenesou se do pevného prostředí 2Z obsahujícího 400 mg/1 Augmentinu a 100 mg/1 Kanamycinu, kultivují se na světle při teplotě 26 °C a
- přepíchají se po 15 dnech do čerstvého prostředí 2Z.
Tři týdny po kokultuře se objeví první výhonky. Jakmile dosáhnou přibližně 1 cm, oddělí se od sazenice a přepíchají se do prostředí Dev, kde se udržují 1 až 2 týdny, jsou-li dobře transformovány.
Když jsou dobře zakořeněny, přesadí se do substrátu Jiffy-7 ·*· ··· (produkt společnosti AS Jiffy Products) ve fytotronu, kde se rychle aklimatizují.
Když je kořenový systém dobře vyvinutý v Jiffy, přesadí se rostliny do květináčů o průměru 12 cm a pak do konteineru o průměru 30 cm a pěstují se ve skleníku při automatickém zavlažování živným roztokem (roztok zředěný 5 kg/50 1 dodávaný jako 1,6%).
b) Molekulární analysa primárních transformantů obsahujících ADN-T pBI0S144 nebo pBIOS232
Když jsou transformované rostliny dobře vyvinuté ve skleníku, odejmou se listy (přibližně 5 g) k extrakci ADN, která se analyzuje Southern Blot běžně používanými způsoby (Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. Molecular cloning, a laboratory manual, 2. vydání, Cold Spring Harbor laboratory press, 1989).
ADN každé rostliny se digeruje s enzymem Hindi 11 . Po migraci a přenesení na nitrocelulózovou membránu se podrobí hybridizaci různými sondami umožňujícími ověřit:
- počet kopií vložených ADN-T,
- zda byla ADN-T vložena celá,
- přítomnost nebo nepřítomnost vnějších okrajů.
Během těchto molekulárních analýz se vytřídí jednotlivě rostliny nesoucí ADN-T celou bez vnějších okrajů.
Podle stejného protokolu se postupuje k transformování rajčete plasmidem pBIOS144 a k vytřídění transformovaných rošt 1 i n.
Příklad 8
Vyhodnocení zdroje fixované transposázy
Jakmile je jednou zdroj fixované transposázy začleněn do rostlin, ověřuje se, zda by byl schopen aktivovat element Ds. Vytříděné rostliny, mající plasmid pBIOS144, skříží s rostlinou obsahující testovací element Ds, jehož vystřižení navrátí aktivitu genu Gus (β-g1ukoronidázy). Tato Ds se konstruuje ve dvou stupních:
- fragment Bglll-Spel pBIOS2O6 odpovídající Ds::KanaR se začlení do míst BamHl-Xbal ρΒ1221 (Clontech) k získání pBIOS226,
- začlení se celý plasmid pBIOS226 do místa HindlII v pGA 492 DL. Výsledný binární pBIOS228 nese mezi pravým a levým okrajem Ds::KanaR mezi promotorem 35S a částí kódující gen Gus.
Celá exprese tohoto Ds::KanaR se provede expresí přenosového genu Gus. Test Gus (Jefferson R.A., Plant Molecular Biology Re, 5, str. 387 až 405, 1987) a realizuje se na potomstvu F1 tohoto typu křížení k vyhodnocení účinnosti různých linií obsahujících transposázu. Na dělohách a na úsecích pod listy křížených rostlin mezi linií transposázy a linií testovací Ds se pozorují modré skvrny. Počet skvrn a úseků na rostlině udává účinnost zdroje transposázy v této rostlině.
Příklad 9
Vytvoření linií fixované transposázy
Vytříděné a pozitivně vyhodnocené transformaty jedné kopie a bez vnějších okrajů z předchozího příkladu se podrobí dvěma po sobě následujícím cyklům samooplodnění. Dávky semen T2 byly sklizeny odděleně.
Pro každou T2 se vyhodnotí skupina se zřetelem na odolnost proti kanamycinu ke zjištění dávek homozygotních semen. Z každé dávky se vyseje 30 semen do země ve skleníku. Osmáct dnů po vysetí se po dobu tří dnů rozprašuje roztok 400 mg/1 kanamycinu (Weider R., Koornef Μ., Zabel P., Theo. Appl. Gen. 78, str. 169 až 172, 1989). Po pěti dnech je možno identifikovat rošt29 » · 9 · · • · · ·
999 999
9999
99 • 9 9 t • 9 · 9
999 999 • · • · · * líny citlivé na kanamycin. Po vytřídění rostlin odolných a citlivých a odpovídajících Mendelově segregaci dominantního genu se identifikují dávky homozygotních rostlin pro transgen. Jsou to rostliny, kterým se dává přednost a které jsou vhodné ke křížení rostlin obsahujících element Ds::KanaR-AMS.
Příklad 10
Křížení linií Ds::KanaR-AMS s transposázovými liniemi homozygot ů
Vytříděné primární transformanty (unikopie bez okrajů) se vyhodnotí po odkvětu ve skleníku na plodnost mikroskopickým pozorováním příčného řezu prašníkové trubice jednoho nebo dvou květů z rostliny v kyselém karmínu. Na základě tohoto vyhodnocení se ponechají jen rostliny se samčí sterilitou, které nemáj i pyl.
Sterilní rostliny nesoucí Ds::KanaR-AMS se oplodní pylem linií exprimujících transposázu Ac. Plody se sklidí a semena se vyjmou.
Příklad 11
A) Identifikace vystřižení u rostlin F1
Semena pocházející z křížení mezi rostlinami nesoucími zdroj transposázy a rostlinami nesoucími Ds::KanaR-AMS se vysejí do země ve skleníku. V děložním stavu se odebere jedna děloha sazenice k rychlé extrakci ADN (Lassner M.W., Peterson P., Yoder J.I. Plant Molecular Biology Re.7, str. 116 až 128, 1989) k testu PCR s oligonukleotidy A9a a A9b (obr. 1). Použité podmínky PCR jsou následující:
ADN: 40 ng (nebo 10 μΐ mikroextrakce) oligo A9a (10 ρΜ/μ1):3 μΐ
oligo A9b (10 ρΜ/μ!):3 μΐ tamponeneček χ10:10μ!
Mix dNTP (5 mM):4 μΐ
Taq Promega:0,4 μΐ
MgCl2 25 mM:8 μΐ
H20 do 100 μΐ
Reakce se provádí v jednotce Perkin 9600. Po dvou minutách denaturace při teploitě 95 °C se provede 40 cyklů následujících operací:
denaturace při teplotě 94 ”C hybridizace při teplotě 55 °C
1'30 protažení při teplotě 72 °C.
Cílem tohoto testu je rozlišit rychle rostliny nesoucí gen AMS (pás 800 párů bází PCR) od rostlin, které ho nenesou (bez pásu PCR). Rostliny, nesoucí gen AMS, se přesadí a během kvetení se pozoruje výskyt plodů, které vykazují alespoň jeden úsek somatické excise. Pozorování plodů rostlin F1 vykazují bud excisi bez nového začlenění Ds, nebo excisi následovanou novým začleněním se ztrátou aktivity.
K ověření se vyjmou semena z těchto rostlin a zasejí se. Molekulární analýza na PCR těchto rostlin se provede k ověření, zda nenesou ještě Ds::KanaR-AMS, avšak mají jizvu (“cicatrice) ADN-T a/nebo příslušný gen. K tomu se odebere z každé rostliny děloha k rychlé extrakci ADN.
Podíl této ADN se odebere k provedení dvou reakcí PCR:
- jedné s oligonuk1eotidy EM1 a EM5 (obr. 2).
Podmínky použité PCR jsou tyto:
ADN:40 ng (nebo 10 μΐ mikroextrakce) oligo EM1 (10 ρΜ/μ!):3 μΐ oligo EM5 (10 ρΜ/μ1):3 μΐ tamponeneček χ10:10μ!
·· · · ·· ·· ···· ·· · · ···· • · · · · ···· • · · · · · · ······ • · · · · · · ·· ··· ··· ···· ·· ··
Mix dNTP (5 mM):4 μΐ
Taq Promega:0,4 μΐ
MgCl2 25 mM:18 μΐ
BSA: 8 μΐ glycerol: 2,5 μΐ
HzO do 100 μΐ
Reakce se provádějí v jednotce Perkin 9600. Po dvou minutách denaturace při teploitě 95 °C se provede 40 cyklů následuj ících operací:
denaturace při teplotě 94 °C hybridizace při teplotě 62 °C protažení při teplotě 72 °C.
Tento test umožňuje zjistit, zda je sazenice nositelkou jizvy ADN-T a/nebo příslušného genu. V případě, kdy je vystřižen element Ds, získá se přibližně 300 párů bází pro samotnou jizvu, ke které je třeba opět připojit tvar příslušného genu; -jiného s oligonukleotidy 5Ή a Ac12 (obr.3).
Podmínky použité POR jsou tyto:
ADN:40 ng (nebo 10 μΐ mikroextrakce) oligo 5Ή (10 ρΜ/μ1):3 μΐ oligo Ac12 (10 ρΜ/μ!):3 μΐ tamponeneček χ10:10μ1
Mix dNTP (5 mM):4 μΐ
Taq Promega:0,4 μΐ
MgClz 25 mM:18 μΐ
BSA X100: 8 μΐ glycerol: 2,5 μΐ
H20 do 100 μΐ
Reakce se provádějí v jednotce Perkin 9600. Po dvou minutách denaturace při teploitě 95 °C se provede 40 cyklů následujících operací:
30” denaturace při teplotě 94 °C ··· 0 · 0 0 · 0 • · · · · 00000000 0 0 0 · · · ·
000 0·0 0000 00 00 hybridizace při teplotě 62 °C
1'30 prodloužení při teplotě 72 ’C.
Tento test umožňuje ověřit nepřítomnost genu kódujícího transposázu. Není-li zesílený fragment, transposáza chybí. Je-li obsažen, zjistí se pás 1,6 Kb.
Rostliny pocházející z výstřižku nenesoucího již příslušný gen bez odolnosti proti kanamycinu ani ADN-T gen kódující transposázu budou pozitivní při první úloze oligonukleotidů (EM1-EM5) a negativní při druhé úloze (5'H-Ac12).
Analysa Southern těchto rostlin umožňuje potvrdit přítomnost příslušného genu a nepřítomnost genu odolnosti vůči kanamyci nu.
B) Identifikace transformantů zbavených selektivního markéru
1) Mateři ál
Sonda NPT11:
Zesílení fragmentu 1KB genu NPT11 vektoru pBios232 oligonukleotidy Kana 7 a Kana 8 sekvencí:
Kana 7: gctcgacgttgtcactgaad Kana 8: cccggaaaacgattccgaag
Použitý gen NPT11 se izoluje pomocí transposonu Tn5 Escherichia coli (Berg D.E., Berg C.M. Biotechnology 1, str. 417 až 435 (1983) 1983).
Sondy Cat intraLB + intraRB:
Směs dvou sond:
Cat int LB: fragment Sall ADN-T pGA 492 DL obsahující levý okraj a část genu Cat
Int RB: fragment Sall ADN-T pGA 492 obsahující pravý okraj
Soubor obou sond odpovídá souboru ADN-T pGA 492 DL, který
44 44 ··
4 * 4 4 4 4
4 4 4 4 4
4 4 44 4 444
4 4 4
444 44·4 44 44 β
4·· • 4 • 4 • 4 • ·
4* je základním vektorem, který sloužil ke konstrukci pBios 232 sloužícího k vytvoření rostlin Ds::Kana”-AMS.
2) Identifikace kultury rostlin se dvěma aktivními složkami:
Získají se a zasejí semena pocházející z křížení mezi rostlinou nesoucí Ds::KanaR-AMS a rostlinou nesoucí zdroj fixované transposázy. Provedl se test PCR na ADN kotyledonu 173 rostlin s oliginukleotidy EM1 a EM5, jak shora popsáno. Tímto testem se podařilo identifikovat 18 rostlin, u kterých byl pás 350 páru bází zesílen prostřednictvím EM1-EM5, čímž se ukázaly děje somatické excise, dokládající přítomnost a funkčnost dvou elementů systému.
Systém byl zaveden s ADN-T nesoucí Ds::KanaR-AMS nikoli však příslušný gen. Tím je pás excise vyvolané provedeným zesílením pomocí EM1 a EM5 přibližně 350 páru bází. V případě kdy je začleněn příslušný gen, by se tento pás prodloužil podle tvaru tohoto genu. Podle jiného způsobu provedení je možno rovněž využít specifických oligonukleotidů příslušného genu.
Těchto 18 rostlin se kultivuje 4 měsíce na poli. Květy se pravidelně prohlížejí k ověření plodnosti prašníku stejně jako vznik plodů. U tří z osmnácti rostlin se vyskytovaly plody pouze na některých hroznech. Tyto rostliny byly tedy chimerní pro samčí fenotypy steříIní/plodné. Plody na rostlinách se sklízely hrozen za hroznem v poměru hroznu vůči celé rostlině.
Semena plodů na třech hroznech tří rostlin, které se jevily jako částečně plodné se zasela. Listy získaných rostlin (4 sazenice/hrozen) byly odebrány k extrakci ADN pro analýzu Southern. ADN se digeruje s emzymem Hindi 11 (jediné místo v ADN-T) před elektroforézou a přenosem na membánu. 36 vzorků odpovídajících potomkům F2 se zpracovalo současně jako ADN rodičů hybridu (rostliny nesoucí Ds::KanaR-AMS a rostliny nesou34 • · · · · · β · cí zdroj fixované transposázy) k získání referenčních profilů. Hybridizace Southern blot sondami NPT11 a Cat-int LB umožnila které už nenesly ADN-T obsahující KanaR-AMS, ale které obsahovaly jizidentifikovat rostliny, zdroj trensposázy ani Ds vu ADN-T díky porovnání s profilem rodičů.
Celkem se zkoumalo 36 rostlin bez předběžného vytřídění na kanamycin pocházejících ze tří hroznů tří rostlin u kterých byly plody sledovány.
3) Bilance analyzy:
Dvacet zjizvených'' rostlin nesoucích ADN-T, tedy vykazujících jeden hybridující pás se sondou Cat int LB-BR, s menším růstem než měly rodičovské rostliny nesoucí Ds. Tentýž pás není hybridován sondou NPT11.
Třicet jedna rostlin nesoucích vykazujících pásmo hybridující sondou ko vykázaného toutéž sondou u rodičů t ransposázy.
zdroj transposázy, tedy NPT11 stejného růstu janesoucích zdroj fixované
Pět rostlin nesoucích prázdnou ADN-T ale nenesoucích zdroj transposázy.
U 36 analyzovaných rostlin se 5 prokázalo jako čisté transformanty, jež nesou pouze ADN-T nosiče příslušného genu a mající vystřižený markerový gen selekce.
Je teda možno vytřídit rostliny čistě transformované druhé generace po primárním transformantu.
Výhody této techniky jsou četné. Umožňuje předběžným způsobem identifikovat transformanty zbavené selektivního markéru.
Křížení primárního transformantu se zdrojem transposázy je usnadněno a slabší, jelikož vykazuje samčí sterilitu.
*
Tato technika umožňuje výběr menšího počtu rostlin k identifikování čistých transformantů; bez předběžného vytřídění, po analýze 36 potomků tří rostlin, bylo identifikováno pět rostlin obsahujících ADN-T zbavených Ds::KanaR-AMS.
Je tedy možno zlepšit identifikaci transformantů zbavených markérů:
jestliže se předběžně zpracují na kanamycin potomci plodů na rostlině nesoucí Ds::KanaR-AMS a zdroj transposázy, je třeba mít čtvrtinu rostlin Kanas místo 15/16 (normálně získaných jestliže neměly excisi Ds). Mezi nimi jsou 3/4 nositeli ADN-T čisté druhá čtvrtina odpovídající klasickým segregantům, které nenesou žádný transgen. Poznatek segregace 3/4 odolných rostlin pro 1/4 citlivých umožňuje ostatně rychle potvrdit, že eliminační systém byl účinný.
Je tedy možno identifikovat čisté potomstvo analýzou velmi malého počtu rostlin mezi sazenicemi F2 citlivých na kanamycin .
4) Závěr:
Tato studie ukazuje, že začlenění genu zprostředkujícího umělou samčí sterilitu v systému eliminace markerového genu Ac/Ds, umožňuje rychle identifikovat potomstvo nesoucí příslušný gen bez selektivního markéru, čímž se zcela zjednodušuje proces a zabraňuje se oplodnění pylem nedostatečně charakterizovaných transgenických dějů.
Příklad 12
Konstrukce binárního plasmidu pBI0C4-FLP nesoucího rekombinázu FLP
Sekvence kódující rekombinázu FLP Sacharomyces cerevisiae je obsažena v pOG44 dodávaném společností Stratagene. Plasmid • 0
0
0
0 0 0 pOG44 se digeruje enzymem Hindi 11 a Kpnl a izoluje se fragment Hinf111-Kpnl. Uskutečni se vazba se 100 ng defosforylováného vektoru pBIOS512 a s 50 ng fragmentu Hindlll-Kpnl nesoucího sekvenci kódující rekombinázu v reakčním prostředí 10 μΐ v přítomnosti 1 pl pufru T4 DNA ligázy x10 (Amersham) a 2,5J enzymu T4 DNA ligázy (Amersham) během 16 hodin při teplotě 14 °C. Transformují se předběžně aktivované bakterie Escherichia coli DH5ct. Výsledný plasmid se nazývá pBI0S512-FLP. Získané klony plasmidické ADN, vytříděné v prostředí obsahujícím 50 pg/ml ampicillinu se extrahují způsobem alkalické lyse a analyzují se enzymatickou digescí restrikčními enzymy. Fragment nesoucí sekvenci kódující rekombinázu FLP se izoluje enzymatickou digescí Kpnl následovanou působením enzymu polymerázy T4 DNA (New England Biolabs) podle doporučení výrobce, pak digescí Hindlll. Fragment se čistí elektroforézou na 0,8% agarovém gelu, elekroeluuje se, vysráží se alkoholem a vysuší se. Enzymem Klenow (New England Biolabs) se fragment začlení do místa BamHI podle doporučení výrobce a do místa Hindlll plasmidu pBIOS512. Nukleotidová sekvence FLP se ověří sekvencováním pomocí sekvenzačního kitu T7™ (produkt společnosti Pharmacia) způsobem dideoxynukleotidů (Sanger a kol. 1977). Plasmid pBIOS512 derivuje pUC a nese expresní kazetu dvojitý promotor 35S (PD35S)-terminátor NOS (TNOS) (fragment EcoRl). Dvojitý promotor 35S pochází od pJIT 163 (světový patentový spis číslo WO 96/33277 ) .
Při postupu z pBIOS512-FLP se izoluje fragment EcoRl nesoucí expresní kazetu PD35S-FLP-TNOS enzymatickou digescí pomocí EcoRl, vyčistí se na 0,8% agarovém gelu, elekroeluuje se, vysráží se alkoholem a vysuší se. Začlení se do defosforylového místa EcoRl pBI0C4 (světový patentový spis číslo WO 96/ 33277) enzymem alkalické fosfatázy telecích střev (Boehringer Mannheim) podle doporučení výrobce. Vazba se provede 100 ng defosforylováného vektoru a 50 ng fragmentu nesoucího kazetu PD35S-FLP-TN0S v reaktičním prostředí 10 pl v přítomnosti 1 • φ
• · · · • · · · ··· ··· • · φ · φ · pl pufru ligázy Τ4 DNA χ 10 (Amersham) a 2,5 J enzymu ligázy T4 DNA (Amersham) 16 hodin při teplotě 14 °C. Transformují se předběžně aktivované bakterie Escherichia coli DH5a. Výsledný plasmid se nazývá pBI0C4-FLP. Získané klony plasmidické ADN, vytříděné v prostředí obsahujícím 12 pg/ml tetracykli nu, se extrahují způsobem alkalické lyse a analyzují se enzymatickou digesci restrikčními enzymy. Plasmidická ADN binárního plasmidu pBI0C4-FLP se začlení přímou transformací do kmene LBA4404 Agrobacteria tumefaciens způsobem, který popsal Holsters a kol. (Mol. Gen. Genet. 163, str. 181 až 187, 1978). Platnost získaného klonu se ověří enzymatickou digesci zavedené plasmidické ADN.
Příklad 13
Konstrukce binárního plasmidu a pBIOC511, nesoucího samčí sterilitu a selekci na kanamycinu mezi místy specifické rekombinace FRT, použitelného při transgenesi tabáku
Binární plasmid pGA492 (An, 1986) se zbaví následujících sekvencí: konstitutivního promotoru genu nos kódujícího nopalinovou syntázu (Depicker a kol. J. Mol. Appl. Genet 1, str. 561 až 573, 1982), sekvence kódující gen nptll kódující fosfotransferázu 11 neomycinu (Berg D.E., Berg C.M. Biotechnology 1, str. 417 až 435 (1983) zbavenou oblasti osmi prvních kodonů jejichž výchozí methioninový kodon ATG je napojen na sekvenci 14 prvních kodonů sekvence kódující gen nos (Depicker a kol. J. Mol. Appl. Genet 1, str. 561 až 573, 1982) sekvence kódující gen nos zbavený oblasti 14 prvních kodonů, terminátoru nos (Depicker a kol. J. Mol. Appl. Genet 1, str. 561 až 573, 1982). Toto oddělení se uskuteční totální digesci Clal, následovanou částečnou digesci Sacll. Fragment se čistí, podrobí se působení enzymu polymerázy T4 DNA (New England Biolabs) podle doporučení výrobce. Vazba plasmidu a transformace předběžně aktivovaných bakterií Escherichia coli DH5a se pro- 38 ,, Fritsch E.F., Maniatis manual, 2. vydání, Cold
Výsledný plasmid se nazývádějí obvyklými způsoby (Sambrook J T. Molecular cloning, a laboratory Spring Harbor laboratory press,1989) vá pBIOC5O6.
Místo specifické integrace FRT se zesílí pomocí PCR z plasmidu pOG45 od společnosti Stratagene. Oba oligodesoxynukleotidy použité jako iniciátory pro PCR jsou:
5'CCCCTGCAGTTTTCAAAAGCGCTCTGAAGTTC3' a
5'CCAAAGCTTGAATTCGCCAGGGGGATCTTGAAGTTC3'
Fragmenty odpovídající místu FRT pocházející z PCR byly digerovány pomocí Pst 1, podrobené působení enzymu polymerázy T4 DNA (New England Biolabs) podle doporučení výrobce, pak digerovány EcoRl. čistí se 2% agarovýn gelem, elektoeluují se, vysráží se alkoholem, vyuší se a vrátí se do vody. Pak se vážou mezi místem Sací předběžně podrobeným působení enzymu polymerázy T4 DNAa místa EcoRl plasmidu pUC18 (produkt společnosti Pharmacia). Výsledný plasmid se nazývá pBIOC5O7.
Druhé místo FRT se začlení do plasmidu pBIOC5O7. Druhé místo FRT vyplývá z rozšíření PCR pomocí dvou oligodesoxynuk1eot i dů:
5'CCCCTGCAGTTTTCAAAAGCGCTCTGAAGTTC3' a
5'AAAGGTACCGCCAGGGGGATCTTGAAGTTC3'.
Zesílené fragmenty se digerují pomocí Pstl a Kpnl, podrobených působení enzymu polymeráza T4 DNA a vážou se na místo Sphl předběžně zpracované působením enzymu polymerázy T4 DNA plasmidu pBIOC5O7. Výsledný plasmid se nazývá pBIOC5O8 a obsahuje obě místa FRT orientovaná ve stejném smyslu.
Z plasmidu pBIOC5O8 se izoluje fragment Hindl11-EcoRl nesoucí dvě místa FRT. Tento fragment se začlení do míst Hindi 11 a EcoRl plasmidu pBIOC5O6. Výsledný plasmid se nazývá PBIOC5O9.
* ·
K potvrzeni samčí sterility se soucího chimerní gen odpovídající obsaženému v pWP173 (Paul VJ. a kol. 611 až 622, 1992). Tento fragment enzymu polymeráza T4 DNA a váže se činkem enzymu polymeráza T4 DNA plasmid se nazývá pBIOC51O.
použije fragmentu Sphl nepromotoru A9-barnázy-T35S, , Plant Mol. Biol 19, str.
Sphl se zpracuje působením na místo Pstl zpracované úplasmidu pBIOC5O9. Výsledný
Nakonec k umožnění selekce na kanamycin (Fromm M.E., Taylor L.P., Walbot V. Nátuře sv. 319, str. 791 až 793, 1986) se fragment EcoRl zpracovaný účinkem enzymu polymeráza T4 DNA, odpovídající expresní kazetě PNOS-npt11-TNOS, izolované z plasmidu pBIOSI, do kterého byl klonován do místa BamH1 fragment BamH1 kódující gen nptll, váže na místo Kpnl zpracované působením enzymu polymerázy T4 DNA plasmidu pBIOC510. Výsledný plasmid se nazývá pBIOC511.
Seznam kultivačních prostředí
| LB | ||
| 10 | g/i | bactot ryptonu |
| 5 | g/i | kvasnicového extraktu |
| 10 | g/i | chloridu sodného |
hodnota pH 7,5 nastavená hydroxidem sodným
MSSV/2
2,2 g makro a mikroelementů (produkt společnosti Murashige a Skoog), (M 6899 Sigma) ml/1 vitaminů (produkt společnosti Nitsch) g/1 sacharosy g/1 agar-agaru hodnota pH 5,9 před autoklávováním
2Z
3,4 g makro a mikroelementů (produkt společnosti Murashige a Skoog), (M 6899 Sigma) • * · ml/1 vitaminů (produkt společnosti Nitsch) g/l sacharosy mg/1 Zéeatinu
400 mg/1 Augment i nu
100 mg/1 kanamcinu g/l agar-agaru hodnota pH 5,9 před autoklávováním
KCMS
4,4 g makro a mikroelementů (produkt společnosti Murashige a Skoog), (M 6899 Sigma)
0,9 mg/1 thiaminu
200 mg/1 dihydrogenofosfátu draseloného g/l sacharosy g/1 agat—agaru
200 μΜ acetosyri ingonu
0,2 mg/1 2-4D
0,1 mg/1 Kinetinu hodnota pH 5,9 před autoklávováním
DEV 2,2 g ml/1 15 g/l 50 mg/1 makro a mikroelementů (produkt společnosti Murashige a
Skoog) (M 6899 Sigma) vitaminů (produkt společnosti Nitsch) sacharosy kanamyci nu
400 mg/1 Augment i nu g/l agar-agaru hodnota pH 5,9 před autoklávováním
MS20
4,4 g/l M0404 (Sigma) g/l sacharosy g/l agar-agaru (pevné prostředí) hodnota pH 5,7 • · ··
- 4 1 + případně rostlinné hormony BAP 1 mg/1 a ANA 0,2 mg/1
MS30
4,4 g/1 M0404 (Sigma) g/1 sacharosy g/1 agar-agaru (pevné prostředí) hodnota pH 5,7 + případně rostlinné hormony BAP 1 mg/1 a ANA 0,2 mg/1
Průmyslová využitelnost
Využití samčí sterility rostlin pro zvýšení úrodnosti rošt 1 i n.
PETíl KALENSKÝ ATTORNEY AT LAW t
Seznam použité literatury
- An G., Plant Physiol. 81, str. 86 až 91 (1986)
- Bednarek S.Y. a Ralkhel N.V., The plant Cell, 3, str. 1195 až 1206 (1991 )
- Broer a kol., Braunschweig Symposium on Applied Plant Molecular biology, Braunschweig 21.-23. listopadu (1988), Proceedings, Ed Galling G. str. 240 (1989)
- Berg D.E., Berg C.M., Biotechnology 1, str. 417 až 435 (1983)
- Close J.J., Rodriguez R.L., Gene 20, str. 305 až 316 (1982)
- Cocherel S., Perez P., Degroote F., Genestier S., Picard G., Plant Molecular Biology 30, str. 539 až 551 (1996)
- De la Penna, Nátuře 325, str. 274 až 278 (1987)
- Depicker a kol., J. Mol. Appl. Genet 1, str. 561 až 573 (1982)
- Ditta G, Stanfield S., Corbin D, Helinski D.R., Pnas 77, str. 7347 až 7351 (1980)
- Ellstrand Norman C., Bioscience sv. 40, str. 438 až 442 (1990)
- Fillatti J.J., Kiser J., Rose R. a Commai L. Bio/Technology 5, str. 726 až 730 (1987)
- Finnegan E.J., Lawrence G.J., Dennis E.S., Ellis'J.G., Plant Molecular Biology 22, str. 625 až 633 (1993)
- Franck a kol. Cell 21, str. 285 až 294 (1980)
- Fromm M.E., Taylor L.P., Walbot V. Nátuře sv. 319, str. 791 až 793 (1986)
- Gaubier a kol., Mol.Gen. 238, str. 409 až 418 (1993)
- Holsters a kol., Mol.Gen.Genet. 163, str. 181 až 187 (1978)
- Horsch a kol., Science 227, str. 1229 (1985)
- Jefferson R.A., Plant Molecular Biology Re, 5, str. 387 až 405 (1987)
- Jouanin, Plant.Sci. 53, str. 53 až 63 (1987)
- Kay, Science 236, str. 1299 až 1302 (1987)
- Lassner M.W., Peterson P., Yoder J.I., Plant Molecular Biology Re.7, str. 116 až 128 (1989)
- Liu, Mol. Plant. Microb., Interactions 6, str. 144 až 156 (1951 )
• · • · • · • · ft · • ft ·· ·· ·· • · · · • · · · • ftftft · · · • · • · · ft
Paul W. a kol., Plant Mol Perez P., Ti raby G.,
Matsuoka K, Nakamura K., Proč. Nati. Acad.Sci. USA 88, str. 834 až 838 ( 1991 )
McElroy, Mol.Gen.Genet. 231, str. 150 až 160 (1991)
Murakami a kol., Plant Mol. Biol. 7, str. 343 až 355 (1986) Ni a kol.,Pint J. 7, str. 661 až 676 (1995)
Biol 19, str. 611 až 622 (1992) Kallerhoff J., Perret J., Plant
Molecular Biology 13, str. 365 až 373 (1989)
Rogers S., Bendich A.J., Plant Molecular Biology, Manual A65, str. 69 až 76 (1988)
Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T., Molecular cloning, a laboratory manual, 2. vydání, Cold Spring Harbor laboratory press (1989)
Sanford J.C., Trends in Biotechnology 6, str. 299 až 302 (1988)
- Schroeder M.R., Borkhsenious O.N., Matsuoka K., Nakamura K. a Rakhel N.V., Plant Physiol. 101, str. 451 až 458 (1993)
| - Watson | a | kol . , | ADN recombi nant, | vydavatel De | Boeck |
| Universitě, | str. 273 až 292 | ||||
| - Weider | R. , | Koornef | Μ., Zabel P., Theo. | Appl. Gen. 78, | st r. |
| 169 až | 1 72 | (1989) | |||
| - Wo r a11 | D. , | Hi rd M. | , Hodge R., Paul W., | Draper J. a Scott R., | |
| Plant | Cel 1 | 4, str. | 759 až 771 (1992) | ||
| - Yoder | J.I. , | Goldsbrough A.P., Bio/Technology sv. 12, | str. 263 | ||
| až 267 | (1994) |
i
Claims (12)
1. Použití sterilní samčí rostliny k zabránění rozptálení příslušného transgenu začleněného do genomu řečené rostliny.
2. Použití podle nároku 1 rošt 1 iny,která je nositelkou samčí cytoplasmické sterility.
3. Použití podle nároku 1 rostliny, která je nositelkou samčí nukleové sterility.
4. Použití vystříhnutelného genu AMS jako prostředku umožňujícího výběr rostlin geneticky transformovaných majících integrovanný příslušný transgen a vyloučený vystřohnutelný fragment ADN, přičemž uvedeným vystřihnutelným fragmentem ADN může být
- gen AMS samotný nebo
- obsažený gen AMS vázaný geneticky na nežádoucí fragment ADN, přičemž gen ADN a nežádoucí fragment ADN mohou být vystřihnuty současně, přičemž nežádoucím fragmentem ADN je s výhodou markerový gen, s výhodou gen zprostředkující odolnost vůči antibiotiku.
5. Použití podle nároku 1 až 4 rostliny volené ze souboru zahrnujícího kukuřici, řepku olejku, tabák nebo rajče.
6. Transgenická rostlina, její část nebo extrakt, vyznačující se t i m, že příslušný transgen je geneticky vázán na gen AMS napojený na prvky umožňující jeho expresi v rostlinných buňkách, jmenovitě promotor a terminátor t ranskri pce.
7. Vektor, zvláště plasmid, vyznačující se t i m, že obsahuje příslušný transgen napojený na prvky umožňující jeho expresi v rostlinných buňkách, jmenovitě promotor a terminátor transkripce, vázaný geneticky na gen AMS napojený
- ·· ·· na prvky umožňující jeho expresi v rostlinných buňkách, jmenovitě promotor a terminátor transkripce.
8. Buněčný hostitel, zvláště bakterie jako je Agrobacterium tumefaciens, transformovaný vektorem podle nároku 7.
9. Způsob začlenění genu AMS do rostliny, vyznačující se t í m, že zahrnuje transformaci rostlinných buněk, jmenovitě pomocí buněčného hostitele podle nároku 8, přičemž sám je transformován vektorem podle nároku 7 způsobem začlenění do genomu těch buněk genu AMS vázaného geneticky na příslušný transgen.
10. Způsob eliminace vystříhnute1 něho fragmentu ADN, v yznačující se tím,že
a) se transformují rostlinné buněk podle nároku 8, pomocí buněčného hostitele, transformovaňky vektorem podle nároku 7, obsahujícím vystříhnuté!ný gen AMS způsobem integrace do genomu těchto buněk genu AMS vystříhnutelného rekombinací nebo t ransposi cí,
b) regenerují se rostliny transformované z transformovaných rostlinných shora buněk,
c) transformují se rostlinné buňky začleněním elementu indukujícího transformaci nebo rekombinací do genomu buněk,
d) regenerují se transformované buňky z transformovaných rostlinných buněk podle stupně c),
e) kříží se rostliny se samčí sterilitou, získané podle stupně b), s liniemi expresujíčími transposázu nebo rekombinázu, získané podle stupně d), přičemž k vystřihování dochází u rostlin F1, bud a') transformací rostlinných buněk pomocí buněčného hostitele podle nároku 8, transformovaného vektorem podle nároku 7, obsahujícím vystříhnutelný gen AMS způsobem integrace do genomu těchto buněk genu AMS vystříhnutelného rekombinací nebo transposi cí, b') regenerují se rostliny transformované z transformovaných • · • ···· ··· rostlinných dále jmenovaných buněk, c') transformují se rostlinné buňky pocházející z transformovaných rostlin začleněním elementu indukujícího transformaci nebo rekombinaci do genomu těch buněk,
ď) regenerují se transformované buňky pocházející z transfoi— movaných rostlinných buněk ze stupně c'),
11. Způsob přípravy expresního produktu transgenu vyznačující se t í m, že se
a) transformují rostlinné bubuňky zvláště pomocí buněčného hostitele podle nároku 8 transformovaného vektorem podle nároku 7 způsobem začlenění do genomu buněk genu AMS vázaného geneticky na příslušný transgen.
- nebo se transformují rostlinné buňky nesoucí cytoplasmickou nebo nukleovou samčí sterilitu začleněním příslušného transgenu do genomu buněk,
b) regenerují se transformované buňky z transformovaných rostlinných buněk,
c) rekuperuje se expresní produkt transgenu do buněk nebo shora jmenovaných transformovaných rostlin, zvláště extrakcí, následovanou případným Čištěním.
12. Kit k provádění způsobu podle nároku 10, vyznačující se tím, že obsahuje vektor podle nároku 7, obsahující vystřižitelný gen AMS, nebo část transformované rostliny vektorem, část vektoru nesoucího zdroj transposázy nebo rekombinázy, nebo rostlinu nebo její část transformovanou vektorem .
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR9702369A FR2759857B1 (fr) | 1997-02-27 | 1997-02-27 | Nouvelles utilisations de la sterilite male chez les plantes |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ301799A3 true CZ301799A3 (cs) | 2000-03-15 |
| CZ296781B6 CZ296781B6 (cs) | 2006-06-14 |
Family
ID=9504258
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ0301799A CZ296781B6 (cs) | 1997-02-27 | 1998-02-26 | Zpusob vyuzití samcí sterility u rostlin |
Country Status (12)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US7112719B2 (cs) |
| EP (1) | EP0972061B1 (cs) |
| AT (1) | ATE338824T1 (cs) |
| AU (1) | AU6734998A (cs) |
| CA (1) | CA2282726C (cs) |
| CZ (1) | CZ296781B6 (cs) |
| DE (1) | DE69835812T2 (cs) |
| ES (1) | ES2273411T3 (cs) |
| FR (1) | FR2759857B1 (cs) |
| HU (1) | HU224706B1 (cs) |
| PL (1) | PL336300A1 (cs) |
| WO (1) | WO1998038323A2 (cs) |
Families Citing this family (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6632980B1 (en) | 1997-10-24 | 2003-10-14 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Binary viral expression system in plants |
| JP2004512007A (ja) * | 2000-02-28 | 2004-04-22 | エール ユニヴァーシティ | トランス遺伝子の伝達を削減または排除する方法および組成物 |
| EP1174512A1 (en) * | 2000-07-17 | 2002-01-23 | Peter Stamp | Seed composition and method for reducing or preventing the release of genetically manipulated pollen |
| GB0108048D0 (en) * | 2001-03-30 | 2001-05-23 | Isis Innovation | Specification of meiocyte and tapetal cell layers in plants |
| FR2825579B1 (fr) * | 2001-06-11 | 2004-07-23 | Rhobio | Methode d'obtention de plante monocotyledone contenant un gene d'interet sans sequence auxiliaire etrangere |
| WO2003003816A2 (en) | 2001-07-06 | 2003-01-16 | Monsanto Technology Llc | Methods for enhancing segregation of transgenes in plants and compositions thereof |
| US7667096B2 (en) | 2003-06-03 | 2010-02-23 | University Of Georgia Research Foundation, Inc. | Conditional sterility in plants |
| WO2005070088A2 (en) * | 2004-01-15 | 2005-08-04 | University Of Georgia Research Foundation, Inc. | Chimeric sequences for tissue-specific gene expression in plants |
| CN111676229B (zh) * | 2020-06-30 | 2021-07-13 | 四川农业大学 | 一种玉米雄性核不育基因ms40及其分子标记和应用 |
Family Cites Families (15)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5180873A (en) * | 1985-04-16 | 1993-01-19 | Dna Plant Technology Corporation | Transformation of plants to introduce closely linked markers |
| US6737560B1 (en) * | 1988-02-03 | 2004-05-18 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Molecular methods of hybrid seed production |
| GB8810120D0 (en) * | 1988-04-28 | 1988-06-02 | Plant Genetic Systems Nv | Transgenic nuclear male sterile plants |
| US5689041A (en) * | 1989-08-10 | 1997-11-18 | Plant Gentic Systems N.V. | Plants modified with barstar for fertility restoration |
| WO1991009957A1 (en) * | 1989-12-22 | 1991-07-11 | E.I. Du Pont De Nemours And Company | Site-specific recombination of dna in plant cells |
| US5451513A (en) * | 1990-05-01 | 1995-09-19 | The State University of New Jersey Rutgers | Method for stably transforming plastids of multicellular plants |
| DK0558676T3 (da) * | 1990-11-23 | 2000-09-25 | Aventis Cropscience Nv | Fremgangsmåde til transformering af enkimbladede planter |
| GB9028060D0 (en) * | 1990-12-24 | 1991-02-13 | Nickerson Int Seed | Recombinant dna |
| WO1993001283A1 (en) * | 1991-07-08 | 1993-01-21 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture | Selection-gene-free transgenic plants |
| GB9115909D0 (en) * | 1991-07-23 | 1991-09-04 | Nickerson Int Seed | Recombinant dna |
| EG23907A (en) * | 1994-08-01 | 2007-12-30 | Delta & Pine Land Co | Control of plant gene expression |
| JP3256952B2 (ja) * | 1994-11-09 | 2002-02-18 | 日本製紙株式会社 | 植物への遺伝子導入用ベクター、並びにこれを用いた遺伝子導入植物の作成方法及び植物への遣伝子多重導入方法 |
| DE69635181T2 (de) * | 1995-02-21 | 2006-06-14 | Bayer Bioscience Nv | Verfahren zur herstellung von männlich sterilen pflanzen |
| FR2733249B1 (fr) * | 1995-04-20 | 1997-06-06 | Biocem | Lipase gastrique de chien recombinante et polypeptides derives produits par les plantes, leurs procedes d'obtention et leurs utilisations |
| WO1998006861A2 (en) * | 1996-08-15 | 1998-02-19 | Agrivax Incorporated | Delivery of tolerogenic antigens via edible plants or plant-derived products |
-
1997
- 1997-02-27 FR FR9702369A patent/FR2759857B1/fr not_active Expired - Fee Related
-
1998
- 1998-02-26 ES ES98912557T patent/ES2273411T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1998-02-26 US US09/380,086 patent/US7112719B2/en not_active Expired - Fee Related
- 1998-02-26 WO PCT/FR1998/000381 patent/WO1998038323A2/fr active IP Right Grant
- 1998-02-26 CA CA002282726A patent/CA2282726C/fr not_active Expired - Fee Related
- 1998-02-26 EP EP98912557A patent/EP0972061B1/fr not_active Expired - Lifetime
- 1998-02-26 CZ CZ0301799A patent/CZ296781B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1998-02-26 AT AT98912557T patent/ATE338824T1/de not_active IP Right Cessation
- 1998-02-26 AU AU67349/98A patent/AU6734998A/en not_active Abandoned
- 1998-02-26 DE DE69835812T patent/DE69835812T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1998-02-26 PL PL98336300A patent/PL336300A1/xx unknown
- 1998-02-26 HU HU0001856A patent/HU224706B1/hu not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ES2273411T3 (es) | 2007-05-01 |
| DE69835812D1 (de) | 2006-10-19 |
| US7112719B2 (en) | 2006-09-26 |
| EP0972061A2 (fr) | 2000-01-19 |
| PL336300A1 (en) | 2000-06-19 |
| HUP0001856A2 (hu) | 2000-09-28 |
| CA2282726C (fr) | 2008-08-19 |
| US20020157129A1 (en) | 2002-10-24 |
| EP0972061B1 (fr) | 2006-09-06 |
| FR2759857A1 (fr) | 1998-08-28 |
| ATE338824T1 (de) | 2006-09-15 |
| HU224706B1 (en) | 2006-01-30 |
| CA2282726A1 (fr) | 1998-09-03 |
| WO1998038323A3 (fr) | 1998-12-17 |
| AU6734998A (en) | 1998-09-18 |
| CZ296781B6 (cs) | 2006-06-14 |
| FR2759857B1 (fr) | 1999-04-30 |
| DE69835812T2 (de) | 2007-09-13 |
| WO1998038323A2 (fr) | 1998-09-03 |
| HUP0001856A3 (en) | 2002-04-29 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| AU639059B2 (en) | Site-specific recombination of dna in plant cells | |
| US5658772A (en) | Site-specific recombination of DNA in plant cells | |
| EP0775212B1 (en) | Control of plant gene expression | |
| US5723765A (en) | Control of plant gene expression | |
| AU718262B2 (en) | Methods and constructs for producing male sterile plants | |
| ES2253813T3 (es) | Induccion de esterilidad masculina en plantas por la expresion de niveles elevados de estreptavidina. | |
| JP2003514521A (ja) | 植物における条件導入遺伝子の発現および形質除去のための方法 | |
| JP2018503392A (ja) | 遺伝子一過性発現により完全な植物において部位特異的改変を行うための方法 | |
| AU2010343047B2 (en) | Male and female sterility lines used to make hybrids in genetically modified plants | |
| JP2000116258A (ja) | 二元性潜在性細胞毒性法によるハイブリッド種子の産生方法 | |
| WO1994000583A1 (en) | Transformation of plants by direct injection of dna | |
| JP2001512988A (ja) | 条件的雌性不稔性を用いるハイブリッド種子作成の方法 | |
| AU733080B2 (en) | Pollen-based transformation system using solid media | |
| CZ301799A3 (cs) | Způsob využití samčí sterility u rostlin | |
| AU739946B2 (en) | Nuclear male sterile plants, method of producing same and methods to restore fertility | |
| US20050120416A1 (en) | Novel method for the production of hybrid maize seeds | |
| JP4814686B2 (ja) | 雌雄配偶子形成不全植物の作成方法 | |
| US20020129399A1 (en) | Biotin-binding compounds for induction of sterility in plants | |
| AU3042099A (en) | Seeds and plants whereof the germinating capacity is destroyed by total or partial lack of at least one energy reserve indispensable to germination |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PD00 | Pending as of 2000-06-30 in czech republic | ||
| MM4A | Patent lapsed due to non-payment of fee |
Effective date: 20120226 |