CZ296781B6 - Zpusob vyuzití samcí sterility u rostlin - Google Patents
Zpusob vyuzití samcí sterility u rostlin Download PDFInfo
- Publication number
- CZ296781B6 CZ296781B6 CZ0301799A CZ301799A CZ296781B6 CZ 296781 B6 CZ296781 B6 CZ 296781B6 CZ 0301799 A CZ0301799 A CZ 0301799A CZ 301799 A CZ301799 A CZ 301799A CZ 296781 B6 CZ296781 B6 CZ 296781B6
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- gene
- plant
- plants
- dna
- plasmid
- Prior art date
Links
- 206010021929 Infertility male Diseases 0.000 title claims abstract description 41
- 208000007466 Male Infertility Diseases 0.000 title claims abstract description 41
- 238000000034 method Methods 0.000 title abstract description 32
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims abstract description 186
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 132
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 claims abstract description 46
- 101150039403 ams gene Proteins 0.000 claims abstract description 40
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 claims abstract description 13
- 235000016383 Zea mays subsp huehuetenangensis Nutrition 0.000 claims abstract description 13
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 claims abstract description 13
- 235000009973 maize Nutrition 0.000 claims abstract description 13
- 235000007688 Lycopersicon esculentum Nutrition 0.000 claims abstract description 9
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 claims description 27
- 240000002791 Brassica napus Species 0.000 claims description 11
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 claims description 11
- 208000000509 infertility Diseases 0.000 claims description 11
- 230000036512 infertility Effects 0.000 claims description 11
- 208000021267 infertility disease Diseases 0.000 claims description 11
- 102100031416 Gastric triacylglycerol lipase Human genes 0.000 claims description 7
- 108010091264 gastric triacylglycerol lipase Proteins 0.000 claims description 7
- 235000006008 Brassica napus var napus Nutrition 0.000 claims description 6
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 6
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 claims description 5
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 claims description 3
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 claims description 3
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 claims description 3
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 claims description 3
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 claims description 3
- 241000227653 Lycopersicon Species 0.000 claims 2
- 240000003768 Solanum lycopersicum Species 0.000 abstract description 9
- 230000002265 prevention Effects 0.000 abstract 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 82
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 62
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 46
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 36
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 35
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 28
- 102000008579 Transposases Human genes 0.000 description 25
- 108010020764 Transposases Proteins 0.000 description 25
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 21
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 21
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 21
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 21
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 19
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 17
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 16
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 14
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 14
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 13
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 12
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 12
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 11
- 230000006862 enzymatic digestion Effects 0.000 description 11
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 9
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 9
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 9
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 9
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 9
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 9
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 9
- 241000589155 Agrobacterium tumefaciens Species 0.000 description 8
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 8
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 8
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 8
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 8
- 239000000047 product Substances 0.000 description 8
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 7
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 7
- 235000010419 agar Nutrition 0.000 description 7
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 7
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 7
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 7
- 210000004291 uterus Anatomy 0.000 description 7
- 241000206672 Gelidium Species 0.000 description 6
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- OJOBTAOGJIWAGB-UHFFFAOYSA-N acetosyringone Chemical compound COC1=CC(C(C)=O)=CC(OC)=C1O OJOBTAOGJIWAGB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 6
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 6
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 6
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 5
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 5
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 5
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 244000061176 Nicotiana tabacum Species 0.000 description 5
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 description 5
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 5
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 5
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 5
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 description 5
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 5
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 5
- 238000011161 development Methods 0.000 description 5
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 5
- 230000035558 fertility Effects 0.000 description 5
- 230000035784 germination Effects 0.000 description 5
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 5
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 5
- 230000002438 mitochondrial effect Effects 0.000 description 5
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 5
- 231100000241 scar Toxicity 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 5
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- ZBMRKNMTMPPMMK-UHFFFAOYSA-N 2-amino-4-[hydroxy(methyl)phosphoryl]butanoic acid;azane Chemical compound [NH4+].CP(O)(=O)CCC(N)C([O-])=O ZBMRKNMTMPPMMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 description 4
- 241000282465 Canis Species 0.000 description 4
- HZZVJAQRINQKSD-UHFFFAOYSA-N Clavulanic acid Natural products OC(=O)C1C(=CCO)OC2CC(=O)N21 HZZVJAQRINQKSD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 4
- NWBJYWHLCVSVIJ-UHFFFAOYSA-N N-benzyladenine Chemical compound N=1C=NC=2NC=NC=2C=1NCC1=CC=CC=C1 NWBJYWHLCVSVIJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000018120 Recombinases Human genes 0.000 description 4
- 108010091086 Recombinases Proteins 0.000 description 4
- 241000219094 Vitaceae Species 0.000 description 4
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 4
- 229940098164 augmentin Drugs 0.000 description 4
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 4
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 4
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 4
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 4
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 4
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 4
- 235000021021 grapes Nutrition 0.000 description 4
- 239000004009 herbicide Substances 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 4
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 4
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 4
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 4
- 238000005204 segregation Methods 0.000 description 4
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 4
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 4
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 4
- 210000003934 vacuole Anatomy 0.000 description 4
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 4
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 4
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 4
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 4
- 235000004977 Brassica sinapistrum Nutrition 0.000 description 3
- 101100083507 Caenorhabditis elegans acl-2 gene Proteins 0.000 description 3
- 241000620209 Escherichia coli DH5[alpha] Species 0.000 description 3
- 108091029865 Exogenous DNA Proteins 0.000 description 3
- 108010046276 FLP recombinase Proteins 0.000 description 3
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 3
- 101150005851 NOS gene Proteins 0.000 description 3
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 3
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 3
- 235000009754 Vitis X bourquina Nutrition 0.000 description 3
- 235000012333 Vitis X labruscana Nutrition 0.000 description 3
- 240000006365 Vitis vinifera Species 0.000 description 3
- 235000014787 Vitis vinifera Nutrition 0.000 description 3
- 235000021186 dishes Nutrition 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 3
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 3
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 238000004853 microextraction Methods 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 3
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 3
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 3
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 3
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 3
- 241000219195 Arabidopsis thaliana Species 0.000 description 2
- LMKYZBGVKHTLTN-NKWVEPMBSA-N D-nopaline Chemical compound NC(=N)NCCC[C@@H](C(O)=O)N[C@@H](C(O)=O)CCC(O)=O LMKYZBGVKHTLTN-NKWVEPMBSA-N 0.000 description 2
- 244000017020 Ipomoea batatas Species 0.000 description 2
- 235000002678 Ipomoea batatas Nutrition 0.000 description 2
- 108010025815 Kanamycin Kinase Proteins 0.000 description 2
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 240000001140 Mimosa pudica Species 0.000 description 2
- 235000016462 Mimosa pudica Nutrition 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 2
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 2
- 238000002944 PCR assay Methods 0.000 description 2
- 101710096342 Pathogenesis-related protein Proteins 0.000 description 2
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 2
- 108091036333 Rapid DNA Proteins 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 2
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 101710199392 TATA-box-binding protein 1 Proteins 0.000 description 2
- 229920002494 Zein Polymers 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 229910002056 binary alloy Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 101150055766 cat gene Proteins 0.000 description 2
- 210000003855 cell nucleus Anatomy 0.000 description 2
- 239000013065 commercial product Substances 0.000 description 2
- 239000002361 compost Substances 0.000 description 2
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 2
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 2
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 2
- 239000012869 germination medium Substances 0.000 description 2
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 2
- 230000002363 herbicidal effect Effects 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 2
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- OOYGSFOGFJDDHP-KMCOLRRFSA-N kanamycin A sulfate Chemical compound OS(O)(=O)=O.O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N OOYGSFOGFJDDHP-KMCOLRRFSA-N 0.000 description 2
- 229960002064 kanamycin sulfate Drugs 0.000 description 2
- 108010083942 mannopine synthase Proteins 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 2
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 2
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000007479 molecular analysis Methods 0.000 description 2
- 108010058731 nopaline synthase Proteins 0.000 description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 2
- 239000003375 plant hormone Substances 0.000 description 2
- 230000010152 pollination Effects 0.000 description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 2
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 2
- 230000022532 regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 2
- 230000006833 reintegration Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 2
- 230000010153 self-pollination Effects 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 230000000392 somatic effect Effects 0.000 description 2
- 238000009331 sowing Methods 0.000 description 2
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 108091006106 transcriptional activators Proteins 0.000 description 2
- 230000017105 transposition Effects 0.000 description 2
- 230000017260 vegetative to reproductive phase transition of meristem Effects 0.000 description 2
- 239000005019 zein Substances 0.000 description 2
- 229940093612 zein Drugs 0.000 description 2
- IAJOBQBIJHVGMQ-UHFFFAOYSA-N 2-amino-4-[hydroxy(methyl)phosphoryl]butanoic acid Chemical compound CP(O)(=O)CCC(N)C(O)=O IAJOBQBIJHVGMQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UPMXNNIRAGDFEH-UHFFFAOYSA-N 3,5-dibromo-4-hydroxybenzonitrile Chemical compound OC1=C(Br)C=C(C#N)C=C1Br UPMXNNIRAGDFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150039504 6 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000589156 Agrobacterium rhizogenes Species 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 241000193744 Bacillus amyloliquefaciens Species 0.000 description 1
- 108010016529 Bacillus amyloliquefaciens ribonuclease Proteins 0.000 description 1
- 108010006654 Bleomycin Proteins 0.000 description 1
- 235000011293 Brassica napus Nutrition 0.000 description 1
- 239000005489 Bromoxynil Substances 0.000 description 1
- 241000701489 Cauliflower mosaic virus Species 0.000 description 1
- 108010035563 Chloramphenicol O-acetyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 206010010144 Completed suicide Diseases 0.000 description 1
- 101710190853 Cruciferin Proteins 0.000 description 1
- 108010066133 D-octopine dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 238000012270 DNA recombination Methods 0.000 description 1
- 108700003861 Dominant Genes Proteins 0.000 description 1
- 102100039371 ER lumen protein-retaining receptor 1 Human genes 0.000 description 1
- 241000702189 Escherichia virus Mu Species 0.000 description 1
- 241000702191 Escherichia virus P1 Species 0.000 description 1
- 108010060309 Glucuronidase Proteins 0.000 description 1
- 239000005561 Glufosinate Substances 0.000 description 1
- 239000005562 Glyphosate Substances 0.000 description 1
- 108010073032 Grain Proteins Proteins 0.000 description 1
- 240000008892 Helianthus tuberosus Species 0.000 description 1
- 235000003230 Helianthus tuberosus Nutrition 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000812437 Homo sapiens ER lumen protein-retaining receptor 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000910825 Homo sapiens Protein chibby homolog 1 Proteins 0.000 description 1
- 240000005979 Hordeum vulgare Species 0.000 description 1
- 235000007340 Hordeum vulgare Nutrition 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- FAIXYKHYOGVFKA-UHFFFAOYSA-N Kinetin Natural products N=1C=NC=2N=CNC=2C=1N(C)C1=CC=CO1 FAIXYKHYOGVFKA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GIYXAJPCNFJEHY-UHFFFAOYSA-N N-methyl-3-phenyl-3-[4-(trifluoromethyl)phenoxy]-1-propanamine hydrochloride (1:1) Chemical compound Cl.C=1C=CC=CC=1C(CCNC)OC1=CC=C(C(F)(F)F)C=C1 GIYXAJPCNFJEHY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 101710111444 Nitric oxide synthase, brain Proteins 0.000 description 1
- 101710090055 Nitric oxide synthase, endothelial Proteins 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 108091092724 Noncoding DNA Proteins 0.000 description 1
- 101150101654 PSR1 gene Proteins 0.000 description 1
- KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M Potassium hydroxide Chemical compound [OH-].[K+] KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 102000029797 Prion Human genes 0.000 description 1
- 108091000054 Prion Proteins 0.000 description 1
- 206010036790 Productive cough Diseases 0.000 description 1
- 102100026774 Protein chibby homolog 1 Human genes 0.000 description 1
- 101150020201 RB gene Proteins 0.000 description 1
- 244000088415 Raphanus sativus Species 0.000 description 1
- 235000006140 Raphanus sativus var sativus Nutrition 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 101100121642 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) GEA1 gene Proteins 0.000 description 1
- 108010016634 Seed Storage Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000592344 Spermatophyta Species 0.000 description 1
- 101710108868 Sporamin A Proteins 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N Thiamine Natural products CC1=C(CCO)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000008186 active pharmaceutical agent Substances 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 230000003190 augmentative effect Effects 0.000 description 1
- 230000010165 autogamy Effects 0.000 description 1
- 230000003385 bacteriostatic effect Effects 0.000 description 1
- 108010021384 barley lectin Proteins 0.000 description 1
- 229960001561 bleomycin Drugs 0.000 description 1
- OYVAGSVQBOHSSS-UAPAGMARSA-O bleomycin A2 Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)NCCC=1SC=C(N=1)C=1SC=C(N=1)C(=O)NCCC[S+](C)C)[C@@H](O[C@H]1[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)O[C@@H]1[C@H]([C@@H](OC(N)=O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)C=1N=CNC=1)C(=O)C1=NC([C@H](CC(N)=O)NC[C@H](N)C(N)=O)=NC(N)=C1C OYVAGSVQBOHSSS-UAPAGMARSA-O 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 235000012730 carminic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 108091092328 cellular RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000012881 co-culture medium Substances 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000009402 cross-breeding Methods 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 239000005546 dideoxynucleotide Substances 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 210000001723 extracellular space Anatomy 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 230000004720 fertilization Effects 0.000 description 1
- 239000003337 fertilizer Substances 0.000 description 1
- 210000003754 fetus Anatomy 0.000 description 1
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 108010050792 glutenin Proteins 0.000 description 1
- XDDAORKBJWWYJS-UHFFFAOYSA-N glyphosate Chemical compound OC(=O)CNCP(O)(O)=O XDDAORKBJWWYJS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940097068 glyphosate Drugs 0.000 description 1
- 101150054900 gus gene Proteins 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 238000005286 illumination Methods 0.000 description 1
- 230000008676 import Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 238000003973 irrigation Methods 0.000 description 1
- 230000002262 irrigation Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- QANMHLXAZMSUEX-UHFFFAOYSA-N kinetin Chemical compound N=1C=NC=2N=CNC=2C=1NCC1=CC=CO1 QANMHLXAZMSUEX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001669 kinetin Drugs 0.000 description 1
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 1
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000021121 meiosis Effects 0.000 description 1
- 239000002923 metal particle Substances 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 239000007003 mineral medium Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 229940046166 oligodeoxynucleotide Drugs 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 239000003415 peat Substances 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid;potassium Chemical compound [K].OP(O)(O)=O PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930195732 phytohormone Natural products 0.000 description 1
- ABVRVIZBZKUTMK-JSYANWSFSA-M potassium clavulanate Chemical compound [K+].[O-]C(=O)[C@H]1C(=C/CO)/O[C@@H]2CC(=O)N21 ABVRVIZBZKUTMK-JSYANWSFSA-M 0.000 description 1
- DWHGNUUWCJZQHO-ZVDZYBSKSA-M potassium;(2s,5r,6r)-6-[[(2r)-2-amino-2-(4-hydroxyphenyl)acetyl]amino]-3,3-dimethyl-7-oxo-4-thia-1-azabicyclo[3.2.0]heptane-2-carboxylic acid;(2r,3z,5r)-3-(2-hydroxyethylidene)-7-oxo-4-oxa-1-azabicyclo[3.2.0]heptane-2-carboxylate Chemical compound [K+].[O-]C(=O)[C@H]1C(=C/CO)/O[C@@H]2CC(=O)N21.C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=C(O)C=C1 DWHGNUUWCJZQHO-ZVDZYBSKSA-M 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 239000004576 sand Substances 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 1
- 210000003802 sputum Anatomy 0.000 description 1
- 208000024794 sputum Diseases 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- KYMBYSLLVAOCFI-UHFFFAOYSA-N thiamine Chemical compound CC1=C(CCO)SCN1CC1=CN=C(C)N=C1N KYMBYSLLVAOCFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003495 thiamine Drugs 0.000 description 1
- 235000019157 thiamine Nutrition 0.000 description 1
- 239000011721 thiamine Substances 0.000 description 1
- UZKQTCBAMSWPJD-UQCOIBPSSA-N trans-Zeatin Natural products OCC(/C)=C\CNC1=NC=NC2=C1N=CN2 UZKQTCBAMSWPJD-UQCOIBPSSA-N 0.000 description 1
- UZKQTCBAMSWPJD-FARCUNLSSA-N trans-zeatin Chemical compound OCC(/C)=C/CNC1=NC=NC2=C1N=CN2 UZKQTCBAMSWPJD-FARCUNLSSA-N 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
- 229940023877 zeatin Drugs 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
- C12N15/8209—Selection, visualisation of transformants, reporter constructs, e.g. antibiotic resistance markers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
- C12N15/8213—Targeted insertion of genes into the plant genome by homologous recombination
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
- C12N15/8287—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for fertility modification, e.g. apomixis
- C12N15/8289—Male sterility
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
- Y02A40/10—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in agriculture
- Y02A40/146—Genetically Modified [GMO] plants, e.g. transgenic plants
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Plant Substances (AREA)
Abstract
Pouzití umele vytvorené rostliny se samcí sterilitou vybrané ze souboru obsahujícího kukurici, repku olejku, nebo rajce, obsahující gen umelé samcí sterility (gen AMS) v genomu, do kterého je vclenenpozadovaný transgen, jehoz expresi nebrání prítomnost genu AMS, k zabránení sírení uvedeného transgenu.
Description
Způsob využití samčí sterility u rostlin
Oblast techniky
Vynález se týká nového využití samčí sterility k omezení nebezpečí, které souvisí s produkcí transgenních rostlin, pro lidstvo a životní prostředí.
Výhody spočívající ve využívání transgenních rostlin jsou velmi slibné. Přenos savčích genů do rostlinné buňky nabízí zejména příslib produkce nových rekombinantních proteinů ve velkém množství při současném snížení výrobních nákladů a navíc bez nebezpečí virové nebo subvirové (prionové) kontaminace.
Tyto výhody však nemohou vést k tomu, že se zapomene na ekologická přírodní hlediska související s produkcí transgenních rostlin, na která je veřejnost velmi citlivá.
Dosavadní stav techniky
Vynález se týká technologie zavádějící samčí sterilitu do služeb „zelené biotechnologie“, která bere v úvahu ekologická a lidská hlediska.
Možné zlepšení spočívá v omezení rizika diseminace (síření) transgenu v životním prostředí. Prostorová izolace kultivačních parcel již nyní umožňuje snižovat „úniky“ transgenu, avšak tento způsob má omezenou účinnost a při velkém počtu produktů se stává problematickým.
K zájmu o genetické způsoby izolování transgenů a snižování rizika „úniku“ vyzývá ve svém článku Ellstrand Norman C. (Bíoscience sv. 40, str. 438 až 442 1990). Mezi četnými návrhy řešení problému „úniku“ transgenu Ellstrand uvádí, že by mohly být zavedeny genotypy se samčí sterilitou, nebo ze by mohl být gen letální pro pyl vázán přímo na gen konstruovaný metodami genetického inženýrství. V tomto směru však zatím nedošlo k žádnému technickému vývoji.
Vynález se týká nové technologie, která umožňuje zabránit diseminaci transgenu prostřednictvím pylu a tedy „úniku“ do okolí, což je technologie, kdy se používá rostliny se samčí sterilitou k tomu, aby se zabránilo diseminaci příslušného transgenu, který je začleněn do genomu příslušné rostliny. Je známo, že kontrola samčí fertility je důležitá při produkci hybridních rostlin, kdy se užívá křížení dvou různých linií. Jedním ze způsobů, jak zabránit samosprášení (samooplození) při řízeném opylování, je ruční „kastrace“ samčích orgánů rostliny. Byly prováděny také výzkumy směřující ke genetickému řízení vývoje pylu. Samčí sterilita může být „získaná“, což znamená, zeje nezávislá na jakékoli genetické manipulaci rekombinacíDNA.
Je třeba odlišovat samčí sterilitu cytoplazmatickou od samčí sterility jaderné (Williams, 1995). Cytoplazmatická sterilita je vázána na změny v organizaci a expresi mitochondriálního genomu, zatímco jaderná samčí sterilita je důsledkem mutací v genomu buněčného jádra.
Samčí sterilita může být také „umělá“, tedy vyvolaná expresi genu pro samčí sterilitu (genu AMS), který je začleněn buďto do mitochondriálního genomu (samčí cytoplazmatická sterilita), nebo do jaderného genomu (samčí jaderná sterilita).
Podstata vynálezu
Podstatou vynálezu je použití uměle vytvořené rostliny se samčí sterilitou vybrané ze souboru obsahujícího kukuřici, řepku olejku, nebo rajče, obsahující gen umělé samčí sterility (gen AMS)
-1 CZ 296781 B6 v genomu, do kterého je včleněn požadovaný transgen, jehož expresi nebrání přítomnost genu AMS, k zabránění šíření uvedeného transgenu. Podle vynálezu je tedy rostlina nositelkou:
buďto samčí cytoplazmatické sterility, s výhodou umělé samčí sterility vyvolané transgenem, který je integrován do mitochondriálního genomu rostliny, nebo samčí jaderné sterility, s výhodou samčí sterility vyvolané transgenem, kteiý je integrován do nepodstatného (neesenciálního) místa jaderného genomu rostliny.
Výhodně může rostlina podle vynálezu získat samčí sterilitu tím, že se do nevýznamného místa jaderného genomu integruje sekvence nesoucí gen AMS a požadovaný transgen, přičemž tyto geny jsou ve vztahu genové vazby (zkráceně: genově vázány).
Vazba mezi požadovaným transgenem a genem AMS zabrání díseminaci transgenu prostřednictvím pylu, což dovolí pěstovat řadu různých produktů ve stejném prostředí. Ostatně není třeba se obávat přenosu samotného genu AMS na rostliny divokého typu, jelikož nebude schopen udržet se v divoké populaci v takové míře, která by představovala vyšší „genetickou zátěž“ než jakákoliv jiná selektivní výhoda. Vazbou mezi požadovaným transgenem a genem AMS se rozumí to, že je mezi nimi genová vzdálenost dostatečně malá na to, aby frekvence rekombinace během meiozy byla zanedbatelná. Genetickou transformací je možné vnést do rostliny dva až tři geny, jejichž fyzická vazba je absolutní.
Vynález se týká také transgenní rostliny nebo části transgenní rostliny vybrané ze souboru obsahujícího kukuřici, řepku olejku, nebo rajče, která obsahuje požadovaný transgen genově vázaný s genem umělé samčí sterility (gen AMS), který je spojen s prvky umožňujícími jeho expresi v rostlinných buňkách, přičemž expresi uvedeného transgenu nebrání přítomnost genu AMS. Uvedeným prvkem umožňujícím expresi genu AMS v rostlinných buňkách je zejména promotor a terminátor transkripce.
Podle vynálezu se předpokládá, že přítomnost příslušného genu AMS nebude bránit expresi požadovaného transgenu.
Částí transgenní rostliny se míní zejména listy, plody nebo buňky geneticky transformovaných rostlin.
Podle jednoho výhodného provedení vynálezu může být umělá samčí sterilita zprostředkována genem obsahujícím sekvenci kódující protein, který odbourává buněčnou RNA (RNáza), kterýžto gen je přitom řízen promotorem specifickým pro prašníky (Paul W. a kol., Plant Mol. Biol 19, str. 611 až 622, 1992). Takovou RNázou může být například bamáza z Bacillus amyloliquefaciens. Promotorem může být s výhodou promotor A9 z Arabidopsis thaliana specifický pro tapetum prašníku.
Rostliny exprimující tento chimérický gen nejsou schopné produkovat životaschopný pyl díky specifické destrukci buněk z pletiva tapeta prašníku. Takové rostliny jsou vsak jinak zcela normální. Jelikož rostliny podle vynálezu nejsou schopny tvořit životaschopný pyl, nehrozí nebezpečí šíření transgenu ani genu samčí sterility zprostředkované pylem.
Rozmnožování těchto rostlin se provádí přenosem pylu pocházejícího z rostlin, které nenesou požadovaný gen podle vynálezu.
V případě kukuřice může být kultura transgenních rostlin z hlediska produkce zajištěna typem produkčního schématu (4 až 6 řádků samičích rostlin následováno 2 řádky opylovačů). Rostliny používané jako samičí (rostliny nesoucí požadovaný transgen) se vysévají ve dvojnásobné hustotě. V takovém schématu je požadovaný gen ve vazbě se selektivním genem (jako je například gen odpovídající za odolnost proti herbicidu), což následně umožňuje ošetřeni selektivním
-2CZ 296781 B6 činidlem (například herbicidem) k eliminaci všech ostatních rostlin kromě rostlin se samčí sterilitou. Sklizeň se tedy týká v tomto případě pouze samičích linií. K závěrečné produkci je možno též doporučit směsný osev. V tomto případě opylovací linie nenese požadovaný gen a je aplikována ve směsi (10 %) s linií použitou jako samičí. Vysévá se ve dvojnásobné hustotě. Pole se v tom případě sklízí celé.
Podle jiného způsobu provedení vynálezu se užívá cytoplazmatické samčí sterility k omezení diseminace transgenu integrovaného do genomu rostliny.
Rostliny nesoucí cytoplazmatickou samčí sterilitu jsou ovlivněny ve svém mitochondriálním genomu, takže nejsou schopné produkovat pyl za nepřítomnosti jaderných genů, které mohou tuto vlastnost obnovit. Tato samčí sterilita může být bud’ „získaná“ nebo vyvolaná uměle tak, že se do mitochondriálního genomu vnese gen udělující cytoplazmatickou samčí sterilitu (gen CMS), například gen Ogura.
Takových rostlin se používá v semenářských podnicích k produkci osiva. Významná část produkce kukuřičného osiva spočívá například v Evropě na využití cytoplazmatické samčí sterility označované typem „C“.
Ve výhodném způsobu podle vynálezu se transgen vnáší zpětným křížením do linie, zejména u kukuřice, která je nositelkou cytoplazmatické samčí sterility. Rostliny se samčí sterilitou je v tomto případě použito jako samičí parentální (rodičovské) rostliny. Dvě po sobě následující zpětná křížení následovaná hodnocením a selekcí potomstva umožňuji dosažení homozygotního stavu pro transgen.
Za nepřítomnosti genu obnovy fertility (gen Rf4 pro cytoplasmu C) se stává rostlina nesoucí transgen rostlinou se samčí sterilitou. Do prostředí se tedy nedostane ani zrnko pylu nesoucího transgen. Je-li rostlina homozygotní pro transgen jsou všechna sklizená zrna nositeli genu a tudíž exprimují fenotyp.
Pěstování těchto rostlin z hlediska produkce se uskutečňuje pěstováním rostlin opylujících v blízkosti transgenních rostlin se samčí sterilitou. Toho se dá dosáhnout smísením semen (postačuje 10% opylovačů) nebo střídáním řádků rostlin samičích (tj. se samčí sterilitou) se řádky opylovačů. V tomto případě se sklízejí pouze samičí rostliny.
Vynález se dále týká způsobu výroby produktu exprese požadovaného transgenu, který spočívá v tom, že zahrnuje
a) - buď transformaci rostlinných buněk kukuřice, řepky olejky, nebo rajčete pomocí buněčného hostitele transformovaného vektorem obsahujícím současně požadovaný transgen, spojený s prvky umožňujícími jeho expresi v rostlinných buňkách, a gen umělé samčí sterility (gen AMS), genově vázaný s uvedeným požadovaným transgenem, přičemž uvedeny gen AMS je spojený s prvky umožňujícími jeho expresi v rostlinných buňkách a přítomnost uvedeného genu AMS nebrání expresi uvedeného požadovaného transgenu, tak, že se do genomu těchto buněk včlení gen AMS genově vázaný s požadovaným transgenem,
- nebo transformaci rostlinných buněk kukuřice, řepky olejky, nebo rajčete, které jsou nositelkami samčí cytoplazmatické nebo jaderné sterility tak, že se včlení požadovaný transgen do genomu rostlinných buněk,
b) regeneraci transformovaných rostlin, které mají samčí sterilní fenotyp a exprimují uvedený požadovaný transgen, z výše uvedených transformovaných rostlinných buněk,
-3 CZ 296781 B6
c) získání produktu exprese požadovaného transgenu z transformovaných buněk nebo rostlin výše uvedených, zejména extrakcí, následovanou v případě potřeby purifikací.
Další aspekt produkce transgenních rostlin podle vynálezu spočívá v tom, že jsou přítomny geny, které by mohly být případně považovány za nežádoucí, ne-li přímo škodlivé, pro lidi a/nebo pro životní prostředí, zejména z pohledu veřejnosti.
Ve skutečnosti je třeba k získání transgenních rostlin selektovat z milionů buněk jen ty buňky, které obsahují vnášenou modifikaci. K tomu se používá genů nazývaných markéry, které udělují buňce obvykle odolnost vůči antibiotikům nebo herbicidům. Tyto geny jsou někdy považovány za nežádoucí a k jejich odstranění byly proto navrženy různé strategie (například kotransformace nebo použití rekombinázy a další).
Mezinárodní patentová přihláška WO 92/01370 se týká způsobu produkce transgenní rostliny obsahující požadovaný gen zbavený markerových genů za použití transpozičního systému.
Další mezinárodní patentová přihláška WO 91/09957 se týká způsobu místně specifické rekombinace v buňkách rostlin, který používá systému Cre/lox k přípravě delecí, inzercí nebo vzájemných výměn DNA. Popsaný způsob lze také použít k eliminaci markerového genu. Uvádí se také využití způsobu k obnově fertility při výrobě hybridních osiv užitím metod genetického inženýrství.
Avšak dosud nebylo ve stavu techniky použito samčí sterility jako markéru pro takový screening (výběr, třídění).
Podle jednoho způsobu může gen AMS sloužit jako pozitivní markér při screeningu rostlin s cílem vyhledat rostliny obsahující požadovaný transgen, přičemž jsou selektovány jednotlivé rostliny obsahující gen AMS.
Přítomnost tohoto genu AMS je možno zjistit zejména molekulárními analýzami, např. použitím polymerázové řetězové reakce (PCR) a/nebo metody Southern blot (Southemův přenos), a sice odborníkovi známými postupy (Sambrook J., Fritsch E. F., Maniatis T. Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. vydání, Cold Spring Harbor Laboratoiy Press, 1989). Rostliny nesoucí gen samčí sterility mohou být také velmi snadno selektovány pozorováním přítomnosti nebo nepřítomnosti vývoje pylových zrn. Gen AMS sloužící jako pozitivní markér může pak být považován za nežádoucí a může být vystřižen.
Podle jiného příkladu umožňuje gen AMS zlepšit proces eliminace nežádoucího exogenního fragmentu DNA v rámci selekce geneticky transformovaných rostlin.
Aby mohly být skutečně účinné stávající screeningové strategie, založené na použití markerového genu, jak jsou popsány například ve výše citovaných patentových přihláškách, musejí fungovat s velmi vysokou frekvenci. Buňky nebo rostliny, které ztratily markerový gen, nejsou už, na rozdíl od výchozích, dále selektovatelné. Screening je tedy založen na molekulárních postupech, které jsou obtížné a náročné.
Využívá se genu pro umělou samčí sterilitu (gen AMS) jako „sebevražedného markéru“ nebo „negativního markéru“ vystřižení (excise) genu, neboť jen jedinci, kteří tento markér ztratili, se rozmnožují. To umožňuje využít strategie eliminace nežádoucího exogenního fragmentu DNA mající slabé výtěžky, a tudíž významně rozšířit výzkumnou oblast.
Gen AMS je v genové vazbě s nežádoucím fragmentem DNA takovým způsobem, že gen AMS a tento nežádoucí fragment DNA jsou pak vystřiženy současně.
-4CZ 296781 B6
Nežádoucí fragment exogenní DNA může být zejména markerový gen, s výhodou gen udělující odolnost proti antibiotiku.
Obecně systémy eliminace nežádoucích genů sestávají ze dvou komponent: vystřihnutelný fragment DNA obsahující nežádoucí gen a induktor tohoto vystřižení (excise).
Podle jiného způsobu se do vystřihnutelného fragmentu zavede gen udělující umělou samčí sterilitu. Rostliny transformované první složkou jsou tedy sterilní z hlediska samčí sterility a udržují ze zpětným křížením („back Crossing“). Induktor, který je vnesen křížením, povede k eliminaci fragmentu DNA obsahujícího gen AMS, čímž se vyvolá vývoj plodů pocházejících ze samoopylení. Tyto plody obsahují jedince zbavené jak genu AMS tak i nežádoucího genu.
V praxi je postačující sklízet jen semena produkovaná samoopylením rostlinami F1 obsahujícími obě složky.
Podle jiného způsobu může být rostlina mající integrovaný vystřihnutelný fragment DNA obsahující gen AMS, transformována fragmentem DNA, který indukuje vystřižení (excisi).
Systém excise, použitý podle vynálezu k eliminaci nežádoucího fragmentu DNA, může být systémem transpozice, jakým je zejména systém Ac/Ds kukuřice nebo systémem rekombinace, jakým je zejména systém Cre/lox bakteriofágu Pl, systém FLP/FRT kvasinek, rekombináza Gin fágu Mu, rekombináza Pin E. coli nebo systém R/RS plazmidu pSRl.
Vektor, zejména plazmid, nese vystřihnutelný fragment DNA, který obsahuje nežádoucí fragment DNA a gen AMS, přičemž tímto nežádoucím fragmentem DNA je výhodně markerový gen, výhodněji gen udělující odolnost proti antibiotiku, přičemž gen AMS a nežádoucí fragment DNA jsou každý spojen s elementy umožňujícími jejich expresi v rostlinných buňkách, zejména promotorem a terminátorem transkripce. Těchto vektorů se využívá k transformaci rostlinných buněk.
Transformace rostlinných buněk může být uskutečněna přenosem dále jmenovaných vektorů do protoplastů, obzvláště po jejich inkubaci v roztoku polyethylenglykolu (PG) v přítomnosti dvoumocných kationtů (Ca2+), způsobem, který popsal Krans a kol. (1982).
Transformace rostlinných buněk může být uskutečněna také elektroporací, zejména způsobem, který popsal FrommM. E„ TaylorL. P., Walbot V. (Nátuře sv. 319, str. 791 až 793 (1986)
Transformace rostlinných buněk může být uskutečněna také biobalistickou metodou (použitím „gene gun“), která umožňuje vstřelovat vysokou rychlostí kovové částice pokryté požadovanou sekvencí DNA a vnášet tak geny přímo do buněčného jádra, zejména způsobem, který popsal Sanford J. C. (Trends in Biotechnology 6, str. 299 až 302, 1988)
Jiným způsobem transformace rostlinných buněk je mikroinjekce do cytoplazmy nebo do jádra.
Podle obzvláště výhodného provedení jsou rostlinné buňky transformovány výše uvedeným vektorem, přičemž se má za to, že buněčný hostitel je schopen infikovat příslušné rostlinné buňky a umožňuje integrovat do jejich genomu příslušné sekvence DNA původně obsažené v genomu shora uvedeného vektoru.
S výhodou je použitým shora jmenovaným buněčným hostitelem Agrobacterium tumefaciens, obzvláště způsobem, kteiý popsal Bevan (1984) a An G. (Plant Physiol. 81, str. 86 až 91, 1986), nebo také Agrobacterium rhizogenes, zejména způsobem, který popsal Jouanin (Plant. Sci. 53, str. 53 až 63, 1987).
-5CZ 296781 B6
Transformace rostlinných buněk se s výhodou provádí transferem T oblasti kruhového extrachromozomového nádory indukujícího Ti plazmidu Agrobacterium tumefaciens, a to užitím binárního systému (Watson a kol., Recombinant DNA, vydavatel De Boeck University, str. 273 až 292). K tomu jsou konstruovány dva vektory. V jednom z nich je oblast T-DNA eliminována delecí s výjimkou pravého a levého hraničního úseku, tzv. hranice („border“), přičemž markerový gen je vložen mezi ně, aby se umožnila selekce v buňkách rostlin. Druhým členem binárního systému je vnější pomocný Ti plazmid, tj. modifikovaný plazmid, který nemá T-DNA, ale obsahuje geny virulence vir, které jsou nutné k transformaci rostlinné buňky. Tento plazmid se udržuje v Agrobacteriu.
Gen AMS a požadovaný gen mohou být spojeny společně nebo jednotlivě se systémem řízení transkripce, obzvláště s promotorem a terminátorem transkripce. Gen AMS může být zejména spojen se systémem řízení transkripce, který obsahuje promotor umožňující specifickou expresi vprašníku, jako je např. promotor A3 nebo A9 (viz mezinárodní patentová přihláška WO 92/11379) nebo promotory TA29, TA26 nebo TA13 (viz mezinárodní patentová přihláška WO 89/10396).
Jako terminátory transkripce, kterých lze použít, přicházejí v úvahu terminátor polyA 358 viru mozaiky květáku (CaMV), který popsal Franck a kol. (Cell 21, str. 285 až 294, 1980) nebo terminátor polyA NOS, který odpovídá 3'-nekódující oblasti genu nopalinsyntázy Ti plazmidu nopalinového kmene Agrobacteria tumefaciens (Depicker a kol., J. Mol. Appl. Genet 1, str. 561 až 573, (1982).
Jako promotory transkripce, kterých lze použit například ve spojení s požadovaným genem přicházejí v úvahu zejména: promotor 35S, nebo s výhodou konstitutivní dvojitý promotor CaMV 35S (35Sdp), který popsal Kay (Science 236, str. 1299 až 1302, 1987), promotor PCRU kruciferinového genu ředkvičky umožňující expresi rekombinantních peptidů podle vynálezu výlučně v semenu (zrnu) rostliny získané z transformovaných buněk podle vynálezu, popsaného v článku Depigny-This a kol. (1992), promotory PGEA1 a PGEA6 odpovídající 5'-nekódující oblasti genů GEA1 a GEA6 zásobního proteinu semene z Arabidopsis thaliana (Gaubiera kol., Mol. Gen. 238, str. 409 až 418, 1993) umožňující specifickou expresi v zrnech, chimérický superpromotor PSP (Ni M a kol., Plant J. 7, str. 661 až 676, 1995) vytvořený fúzí trojnásobného opakování elementu aktivátoru transkripce promotoru genu oktopinsyntázy z Agrobacterium tumefaciens, aktivátoru transkripce promotoru genu mannopinsyntázy a promotoru mannopinsyntázy Agrobacterium tumefaciens, promotor aktinového genu z rýže následovaný intronem zaktinu rýže (PAR-JAR) obsaženy v plazmidu pActi-F4, který popsal McElroy (Mol. Gen. Genet. 231, str. 150 až 160, 1991), promotor HMGW (High Molecular Weight Glutenine, glutenin s vysokou molekulovou hmotností) ječmene (Anderson O. D. a kol., 1989), promotor genu gama-zeinu kukuřice (P-gama-zein) obsažený v plazmidu pgama63, který popsal Reina a kol. (1990) a umožňující expresi v bílkovině kukuřičných zrn.
S výhodou jsou gen samčí sterility a požadovaný gen spojeny s alespoň jednou sekvencí kódující peptid zodpovědný za směrování (import) rekombinantních peptidů do předem stanoveného kompartmentu rostlinné buňky, zejména do endoplazmatického retikula nebo do vakuol nebo dokonce do vnějšku buňky, do pektocelulózních buněčných stěn nebo do extracelulárního prostoru nazývaného též apoplazma.
Tyto sekvence kódující směrovací peptid (importní peptid, zpravidla sestávající ze signálního a tranzitního peptidů) mohou být původu rostlinného, lidského nebo zvířecího.
-6CZ 296781 B6
K. sekvencím rostlinného původu kódujícím směrovací peptid patří například:
nukleotidová sekvence obsahující 69 nukleotidů (vyznačených v následujících příkladech) kódující prepeptid (signální peptid) sestávající z 23 aminokyselin sporaminu A u sladkých brambor (topinambur), přičemž tento signální peptid umožňuje vstup rekombinantních polypeptidů podle vynálezu do sekrečního systému rostlinných buněk transformovaných podle vynálezu (hlavně do endoplazmatického retikula), nukleotidová sekvence 42 nukleotidů (vyznačených v následujících příkladech) kódující N-koncový propeptid sporaminu A pro směrování do vakuoly sestávající ze 14 aminokyselin u sladkých brambor, umožňující akumulaci rekombinantních polypeptidů ve vakuolách transío formovaných rostlinných buněk podle vynálezu, nukleotidová sekvence 111 nukleotidů (vyznačených v následujících příkladech) kódující aminokyselin prepropeptidu sporaminu A, sestávající ve směru od N-koncové části k C-koncové části z 23 aminokyselin shora uvedeného signálního peptidu následovaného 14 aminokyselinami shora uvedeného propeptidu, přičemž tento prepropeptid umožňuje vstup rekombinantních peptidů podle vynálezu do sekrečního systému a jejich akumulaci ve vakuolách rostlinných buněk transformovaných podle vynálezu, přičemž tři uvedené sekvence popsal Murakami a kol. (Plant Mol. Biol. 7, str. 343 až 355, 1986) a Matsuoka a kol. (1991), karboxyterminální propeptid lektinu ječmene, který popsali Schroeder R., Borkhsenious O. N., Matsuoka K., Nakamura K. a Rakhel N. V. (Plant Physiol. 101, str. 451 až 458, 1993) a Bednarek S. Y. a Ralkhel N. V; (The plant Cell, 3, str. 1195 až 1206, 1991), a PRS (protein související s patogenezí. Pathogenesis Related Protein. Comelissen a kol.
(1986)) umožňující sekreci.
Mezi sekvence kódující směrovací peptid lze zařadit také sekvence, které kódují peptidy KDEL,
SEKDEL a HDEL na C-konci a směrují peptid do endoplazmatického retikula.
Vhodné geny k vnesení do genomu rostlinné buňky mohou být obzvláště geny kódující proteiny lidského nebo zvířecího původu, které mohou být zajímavé z terapeutického nebo profylaktického hlediska, jako je např. kolagen, gastrická lipáza a další.
Použitými markerovými geny mohou být obzvláště geny poskytující odolnost proti antibiotikům, jako je např., hydromycin, kanamycin, bleomycin nebo streptomycin, nebo herbicidům, jako je glufosinát, glyfosát nebo bromoxynil.
Vynález je dále objasněn pomocí příkladů a obrázků, které však nijak rozsah vynálezu neomezují.
Přehled obrázků na výkrese 40
Na obr. 1 je lokalizace nukleotidů A9a a A9b. Šipkou před ,,3'Ac“ je vyznačeno místo klonování příslušného genu.
Na obr. 2 je lokalizace nukleotidů EMI a EM5. Šipkou před ,,3'Ac je vyznačeno místo klono45 vání přeslušného genu.
Na obr. 3 je lokalizace nukleotidů 5Ή a Acl2. Šipkou před ,,3'Ac je vyznačeno místo klonování příslušného genu.
-7CZ 296781 B6
Příklady provedení vynálezu
Konstrukce různých plazmidů a jejich ligace a transformace bakterií Escherichia coli DH50, které byly předem ošetřeny tak, aby se staly kompetentními pro transformaci, byly prováděny obvyklými postupy rekombinantní DNA (Sambrook a kol., Fritsch E.F., Maniatis T., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. vydání, Cold Spring Harbor laboratory press, 1989).
Příklad 1
Konstrukce binárního plazmidů, který kombinuje samčí sterilitu zprostředkovanou genem kódujícím PR-glukanázu, produkci psí gastrické lipázy, rezistenci při selekci na kanamycinu a na Basta, a který je použitelný pro transgenní řepku.
Binární plazmid odvozený od pGA492 (An G., Planí Physiol. 81, str. 86 až 91, 1986) obsahuje na své transferové DNA mezi pravou a levou hranicí plazmidů pTiT37 Agrobacterium tumefaciens následující sekvence: konstitutivní promotor genu nos kódující nopalinsyntázu (Depicker a kol., J. Mol. Appl. Genet 1, str. 561 až 573, 1982), sekvenci kódující gen NPTII kódující neomycinfosfotransferázu vykazující odolnost vůči kanamycinu (Berg D.E., Berg C.M. Biotechnology 1, str. 417 až 435, 1983), kde bylo deletováno (odstraněno) osm prvních kodonů, včetně iniciačního kodonu methionin ATG, fúzovaný se sekvencí 14 prvních kodonů sekvence kódující gen nos, gen nos zbavený úseku prvních 14 kodonů, terminátor nos (Depicker a kol., J. Mol. Appl. Genet 1, str. 561 až 573, 1982), úsek obsahující mnohočetná klonovací místa (polylinker) (HindlII-Xbal-SacI-Hpal-Kpnl-Clal-BglII), předcházející gen CAT kódující chloramfenikolacetyltransferázu (Close J. J., Rod riguez R.L. Gene 20, str.305 až 316, 1982), a koncová sekvence genu 6 plazmidů pTiA6 Agrobacterium tumefaciens (Liu, Mol. Plant. Microb., Interactions 6, str. 144 až 156 (1951).
a) Konstrukce plazmidů pBIOC500 nesoucího gen samčí sterility
Použije se chimérický gen odpovídající sekvenci A9-PRglukanáza-promotor T35S obsažený vpDW80PR (Worall D., Hird M., Hodge R., Paul W., Draper J. a Scott R., Plant Cell 4, str. 759 až 771, 1992). Fragment KpnI-EcoRV nesoucí chimérický gen se izoluje dvojitou enzymatickou digescí pomocí KpnI a EcoRV, vyčistí se elektroelucí po elektroforetické migraci na 0,8 % agarózovém gelu, precipituje se etanolem a vysuší. Fragment byl pak vložen do míst KpnI a Smál plazmidů pBluescript KS+ (obchodní produkt společnosti Stratagene). Ligace se provedla se 100 ng defosforylovaného plazmidů a 50 ng fragmentů KpnI-EcoRV v 10 μΐ reakční směsi v přítomnosti 1 μΐ ΙΟχ T4 DNA ligázového puíru (Amersham) a 2,5 U enzymu T4 DNA ligázy (Amersham) po dobu 16 hodin při teplotě 14 °C. Transformují se buňky Escherichia coli DH5a, které byly před tím ošetřeny tak, aby byly transformačně kompetentní. Plazmidová DNA získaných klonů selektovaných na médiu obsahujícím 50 pg/ml ampicilinu se extrahuje způsobem alkalické lyže a analyzuje se enzymatickou digescí restrikčními enzymy. Takto získaný fragment KpnI-Sstl, nesoucí shora popsaný chimérický gen, se vloží mezi místa KpnI a Sstl v pGA492. Chimérický fragment se izoluje obvyklými způsoby. Ligace se uskuteční se 100 ng defosforylovaného vektoru a 50 ng fragmentu KpnI-Sstl v 10 μΐ reakční směsi obsahující 1 μΐ 10 x pufr T4 DNA ligázy (Amersham) a 2,5 U enzymu T4 DNA ligázy (Amersham) během 16 hodin při teplotě 14 °C. Transformují se buňky Escherichia coli DH5a, které byly předtím ošetřeny tak, aby byly transformačně kompetentní. Plazmidová DNA získaných klonů, selektovaných na médiu obsahujícím 12 pg/ml tetracyklinu, se extrahuje způsobem alkalické lyže a analyzuje se enzymatickou digescí restrikčními enzymy. Takto získaný vektor byl označen pBIOC500.
-8CZ 296781 B6
b) Konstrukce plazmidu pBIOC501 nesoucího gen rezistence vůči Basta
Fragment EcoRI-HindlII nesoucí chimérický gen P35S-patTNOS izolovaný z plazmidu pIBló.l (Broer a kol., Braunschweig Symposium on Applied Plant Molecular Biology, 'Braunschweig 21,- 23. listopadu 1988), Proceedings, Ed Galling G. str. 240, 1989) byl vložen mezi místa EcoRI a HindlII vektoru pBSIISK+ (produkt společnosti Stratagene) modifikovaného přidáním místa KpnI do místa Smál sekvence polylinkeru v pBSIISK+. Výsledný plazmid se nazývá pBIOC501. Plazmidová DNA získaných klonů selektovaných na médiu obsahujícím 50 pg/ml ampicilinu, se extrahuje způsobem alkalické lyže a analyzuje se enzymatickou digescí restrikčními enzymy.
c) Konstrukce plazmidu pBIOC502 nesoucího gen kódující psí gastrickou lipázu
Chimérický gen odpovídající PCRU-PSLG-LLGC-T35S, izolovaný z pBIOC93 a popsaný v mezinárodní přihlášce vynálezu WO 96/33277, je nesen fragmentem získaným dvojitou digescí Sací a Xhol, přičemž místo Sací bylo rekonstituováno působením enzymu T4 DNA polymerázy (New England Biolabs) podle doporučení výrobce. Tento fragment byl začleněn mezi místo Apal ošetřené působením enzymu T4 DNA polymerázy a místo Xhol plazmidu pBIOC501. Výsledný plazmid byl označen pBIOC502. Plazmidová DNA získaných klonů selektovaných na médiu obsahujícím 50 μg/ml ampicilinu se extrahuje způsobem alkalické lyže a analyzuje se enzymatickou digescí restrikčními enzymy.
d) Konstrukce binárního vektoru pBIOC503
Z pBIOC502 se izoluje fragment KpnI nesoucí expresní kazety PCRU-PSLGL-LGCT35S a P35S-pat-TNOS a liguje se do místa KpnI v pBIOC500. Výsledný plazmid se nazývá pBIOC503. Plazmidová DNA získaných klonů selektovaných na médiu obsahujícím 12 pg/ml ampicilinu se extrahuje způsobem alkalické lyže a analyzuje se enzymatickou digescí restrikčními enzymy.
Plazmidová DNA plazmidu pBIOC503 byla vnesena přímou transformací do buněk kmene LBA4404 Agrobacterium tumefaciens způsobem, kteiý popsali Holsters a kol., Mol. Gen. Genet. 163, str. 181 až 187,1978).
Příklad 2
Konstrukce binárního plazmidu, který kombinuje samčí sterilitu zprostředkovanou genem kódujícím barnázu, produkci psí gastrické lipázy, rezistenci při selekci na kanamycinu a na Basta, a který je použitelný pro transgenní řepku.
a) Konstrukce plazmidu pBIOC504 nesoucího gen samčí sterility
Použije se chimérický gen odpovídající sekvenci A9-PRbamáza - promotor T35S obsažený vpWP173 (Paul W. a kol., Plant Mol. Biol 19, str. 611 až 622, 1992). Fragment KpnI-EcORV nesoucí chimérický gen se vloží mezi místa KpnI a Smál plazmidu pBluescript KS+ (obchodní produkt společnosti Stratagene). Ze získaného plazmidu se připraví fragment Knpl-Satl nesoucí chimérický gen a vloží mezi místa KpnI a Sáti v pGA492. Výsledný vektor byl označen pBIOC504. Plazmidová DNA získaných klonů selektovaných na médiu obsahujícím 50 pg/ml ampicilinu se extrahuje způsobem alkalické lyže a analyzuje se enzymatickou digescí s restrikčními enzymy.
-9CZ 296781 B6
b) Konstrukce plazmidu pBIOC501 nesoucího gen rezistence na Basta
Vektor se konstruuje způsobem popsaným v příkladu lb).
c) Konstrukce plazmidu pBIOC502 nesoucího gen kódující psí gastrickou lipázu
Vektor pBIOC502 se konstruuje způsobem popsaným v příkladu lc).
d) Konstrukce vektoru pBIOC505
Z pBIOC502 se izoluje fragment KpnI nesoucí expresní kazety PCRU-PSLGL-LGC-T35S a P35S-pat-TNO5 a liguje se do místa KpnI v pBIOC504. Výsledný plazmid se nazývá pBIOC505. Plazmidová DNA získaných klonů selektovaných na médiu obsahujícím 50 pg/ml ampicilinu se extrahuje způsobem alkalické lyže a analyzuje se enzymatickou digescí s restrikčními enzymy.
Plazmidová DNA plazmidu pBIOC505 se vnese přímou transformací do buněk kmene LBA4404 Agrobacteria tumefaciens způsobem, který popsali Holsters a kol. (Mol. Gen. Genet. 163, str. 181 až 187,(1978).
Příklad 3
Příprava transgenních rostlin řepky olejky
Semena jarní řepky (Brassica napus cv. WESTAR nebo linie Limagrain) se 40 minut dezinfikují v 15 % roztoku Domestos. Po 5-násobném promytí sterilní vodou se semena nechají vyklíčit po 20 semenech v květináči o průměru 7 cm a výšce 10 cm na minerálním médiu Murashige a Skoog (Sigma M 5519) obsahujícím 30 g/1 sacharózy a zpevněném agarózovým gelem v koncentraci 5 g/1. Květináče se umístí do kultivační komory s teplotou 26 °C s periodou osvitu 16h/Bh as intenzitou osvětlení 80 pE.m^S'1. Po 5 dnech klíčení se sterilně odeberou dělohy lístky odříznutím každého řapíku 1 mm nad rozvětvením. Současně se připraví v Erlenmayerově baňce o obsahu 50 ml předkultura Agrobacterium tumefaciens kmene LBA4404 obsahujícího binární plazmidy kultivací po 36 hodin při teplotě 28 °C v 10 ml bakteriálního živného média 2YT (Sambrook J., Fritsch E.F., Máaniatis T. Molecular Cloning, a Laboratory Manual, 2. vydání,, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) doplněného vhodnými antibiotiky pro selekci použitého kmene.
Předkultura v množství 1 % slouží k naočkování nové bakteriální kultury za stejných podmínek. Po 14 hodinách se kultura odstřeďuje 15 minut při 3000 g a bakterie se převedou do ekvivalentního objemu tekutého média pro klíčení. Alikvotní části této suspenze se rozdělí na Petriho misky o průměru 5 cm po 5 ml na misku.
Konec řapíku s řeznou plochou se ponoří na několik sekund do takto připraveného roztoku agrobakterií, načež se řapík ponoří několik milimetrů do regeneračního média. Toto médium má stejné základní složení jako médium pro klíčení a obsahuje navíc 4 mg/1 benzylaminopurinu (BAP), fytohormonu podporujícího tvorbu pupenů. Deset explantátů (děloha s řapíkem) se kultivuje na jedné Petriho misce o průměru 9 cm (Greiner, katalog, č. 664102).
Po dvou dnech společné kultivace (ko-kultivace) za stejných podmínek prostředí jako při klíčení, se explantáty přepíchají do pěstitelských nádob Phytatray (Sigma, katalog, ě. P1552) obsahujících dříve uvedené médium doplněné selektivním činidlem: 45 mg/1 sulfátu kanamycinu (Sigma,
-10CZ 296781 B6 katalog, č. K 4000) a bakteriostatikem: směs 1/6 (hmot.) draselné soli kyseliny klavulanové a 5/6 (hmot.) sodné soli amoxilinu (Augmenting pro injekce) v koncentraci do 600 mg/1.
Postupně se dvakrát v třítýdenní lhůtě explantáty přepichují sterilně do nového média za stejných podmínek.
Zelené pupeny (výhonky), patrné na konci druhého nebo třetího přepíchání, se z explantátů oddělí a kultivují se jednotlivě v průhledných nádobách o průměru 5 cm a výšce 10 cm obsahujících stejné médium jako shora uvedeno, avšak bez BAP. Po třech týdnech pěstění se stonek transformovaného pupenu odřízne a pupen se přepíchne do květináče s čerstvým médiem. Ke konci třetího až čtvrtého týdne jsou kořeny již dostatečně vyvinuté, aby umožnily aklimatizaci rostlinek ve fytotronu. Pupeny, které nejsou zelené nebo zakořeněné, se vyloučí. Rostlinky se tedy přesadí do misek se stranou vysokou 7 cm naplněných zeminou (norma NF U44551:40 % hnědé rašeliny 30 % prosetého kompostu a 30 % písku) nasycenou vodou. Po dvou týdnech aklimatizace ve fytotronu (teplota 21 °C, fotoperioda 16h/8h při 84 % relativní vlhkosti) se sazenice přesadí do květináčů o průměru 12 cm naplněných stejnou zeminou obohacenou hnojivém s retardovaným uvolňováním (Osmocote v poměru 4 g/1 kompostu) pak se přenesou do skleníku (třídy S2) s teplotou regulovanou na 18 °C s dvojím kropením vodou 2 minuty denně.
Jakmile se objeví květy, obalí se (Crispac, katalog, č. SM 570y, 300 mm x 700 mm), aby se zabránilo zkříženému oplodnění. Jakmile lusky dozrají, sklidí se, usuší a vydrolí se semena. Získaná semena slouží k testování biochemické aktivity požadovaného genu.
Selekce transgenního potomstva se provádí klíčením v médiu obsahujícím sulfát kanamycinu v koncentraci 100 až 150 mg/1 (podle genotypu). Podmínky jsou stejné jako byly výše uvedené při klíčení, avšak s tím rozdílem, že klíčení probíhá ve skleněných zkumavkách, přičemž je ve zkumavce vždy jedno semeno. Pouze rostlinky, u kterých se vyvinou sekundární kořínky během prvních třech týdnů, se aklimatizují ve fytotronu před tím, než jsou přeneseny do skleníku.
Příklad 4
Příprava transgenních rostlin tabáku
Rostliny tabáku použité k transformačním pokusům (Nicotiana tabacum var. Xanthi NC a PBD6) se kultivují in vitro v základním médiu Murashige a Skoog (1962) s přísadou vitaminů (Gamborg a kol., 1968, Sigma M0404), sacharózy 20 g/1 a agaru (Merck) 8 g/1. Hodnota pH prostředí se nastaví na 5,8 roztokem hydroxidu draselného před vložením do autoklávu při 120 °C na 20 minut. Rostlinky tabáku se přepichují každých 30 dní, přičemž se provede řez v internódiu, do množícího média MS20.
Všechny kultury se pěstují in vitro v klimatizovaném prostředí za těchto podmínek:
intenzita osvětlení 30 pE.m^.S1, fotoperioda 16 hodin, termoperioda 26 °C ve dne, 24 °C v noci.
Způsob transformace je odvozen z postupu, který popsal Horsch a kol. (Science 227, str. 1229, 1985).
Předkultura Agrobacterium tumefaciens kmene LBA4404, obsahující binární plazmidy, se připraví během 48 hodin za míchání při teplotě 28 °C v médiu LB (Sambrook a kol., 1989) s přísadou vhodných antibiotik (kanamycinu). Předkultura se zředí v poměru 1/50 ve stejném kultivačním médiu za stejných podmínek. Po noci se kultura odstředí (10 minut 3000 g), bakterie se pře-11 CZ 296781 B6 nesou do ekvivalentního objemu tekutého média MS30 (30 g/1 sacharózy) a tato suspenze se zředí v poměru 1/10.
Explantáty velikosti přibližně 1 cm2 se odříznou z listů shora popsaných rostlinek. Uvedou se na 1 hodinu do styku se suspenzí bakterií, pak se rychle osuší na filtračním papíru a přenesou se na kokultivační médium prostředí (pevné MS30).
Po dvou dnech se explantáty přenesou do Petriho misek s regeneračním médiem MS30 obsahujícím selekční činidlo kanamycin (2000 mg/1) nebo bakteriostatické činidlo AugmentinR (400 mg/1) a hormony potřebné k indukci pupenů (BAP, 1 mg/1 a NAA 0,1 mg/1). Rostlinky se přesadí do stejného média po dvou týdnech kultivace. Po dalších dvou týdnech se rostlinky přenesou do Petriho misek s vývojovým médiem, což je médium MS20 s přísadou kanamycinu a Augmentinu. Po 15 dnech se polovina výhonků přepíchá. Zakořenění trvá přibližně 20 dní, v kteréžto době mohou být rostlinky klonovány řezem v internódiu nebo mohou být přeneseny do skleníku.
Příklad 5
Konstrukce zdroje transposázy
Připraví se binární plazmid nesoucí zdroj transposázy spojený s promotorem 355, jelikož byla prokázána silná a časná exprese této transposázy (Finnegan E. J., Lawrence G. J., Dennis E. S., Ellis J. G. Plant Molecular Biology 22, str. 625 až 633, 1993).
Fragment BamHl-EcoRI pB135S Ac (zkonstruovaný Finnegan se klonuje do míst BamHI a SnaBI vpBI121 (Jefferson a kol., Plant Molecular Biology. Rep. 5, str. 387 až 405, 1987). Výsledný plazmid, nazvaný pBIOS144, obsahuje mezi pravou a levou hranicí gen rezistence vůči kanamycinu NPTII řízený promotorem terminátorem nos, element Ac, jehož 5'-část byla deletová řízený promotorem 358, tvořící zdroj fixované transposázy, a 1 párů bází 5-části genu kódujícího β-glukuronidázu E. coli (GUS označený delGUS na obr. 3) následovaný terminátorem nos.
Příklad 6
Konstrukce elementu DS: KanaR-AMS
Postupné kroky vedoucí k přípravě tohoto vektoru jsou:
a) Konstrukce plazmidu pBIOC203 nesoucího gen rezistence v kanamycinu
Fragment BamHI 1 Kb (obsahující gen NPTII) z pCamVNEO (Fr Μ. E., Taylor L.P., Walbot V., Nátuře sv. 319, str. 791 až (1986) se vloží do místa BamHI pBIOSI (Perez P., Tiraby Kallerhoff J., Perret J. Plant Molecular Biology 13, str. 365 373, 1989). Výsledný vektor pBIOS 1K se štěpí EcoRI. Fragm EcoRI z pBIOS 1K se zatupí Klenow polymerázou a klonuje se plazmidu AF3'Ac (Cocherel S., Perez P., Degroote F., Genesí S., Picard G. Plant Molecular Biology 30, str. 539 až 551, 19 do místa EcoRI, čímž se vytvoří pBIOS203.
b) Konstrukce plazmidu pBIOS208 nesoucího gen AMS
Fragment EcoRI vektoru pEGS phleo, obsahující 399 párů bází z 5' elementu Ac (Cocherel Cocherel S., Perez P., Degroote F., Genestier S., Picard G. Plant Molecular Biology 30,
- 12CZ 296781 B6 str. 539 až 551, 1996) se klonuje do pBSsk (Stratagene) do místa EcoRI, čímž se vytvoří pBIOS204.
Fragment EcoRI - HindlII (obsahující 3' -konec Ac a kazetu NPTII) pBIOS203 se klonuje do pBSsk do míst EcoRI-HindllI, čímž se vytvoří pBIOS205.
Fragment Smál pBIOS204 (obsahující 5' -konec Ac) se klonuje do pBIOS205 v místě Smál, čímž vytvoří pBIOS206.
Fragment Sphl z DW 80 bin PR-glukanázy obsahující gen PR-glukanázy (PR-Glu) pod promotorem A9 a terminátorem CaMV (Worall D., Hird M., Hodge R., Paul W., Draper J. a Scott R., Plant Cell 4, str. 759 až 771, 1992) se klonuje do místa EcoRI pBIOS206. Ve výsledném plazmidu, tj. pBIOS208, je gen A9-PR glukanázy začleněn v opačné orientaci než gen NPTII.
c) Začlenění elementu Ds: KanaR-AMS do binárního vektoru
Vektor pGA 492DL se získá následujícími modifikacemi pGA 492 (G. An):
delece fragmentu SacII/Clal odpovídajícího expresní kazetě chimérického genu NPTII.
Nový vektor se nazývá pGa 492D, náhrada fragmentu BglII/Scal (ztráta části genu CAT) pGA 492D polylinkerem SacI/KpnI z pBSIIsk. Tento nový vektor se nazývá pGA 492DL.
Fragment HindlII/Spel pBIOS208 se pak klonoval do míst HindlII/Spel v pGA 492 GL, aby se vytvořil binární plazmid pBIOS232. Struktura této T-DNA je schematicky znázorněna na obr. 1 a 2.
Příklad 7
Transformace a selekce rajčat
a) Transformace rajčete (varianty UCB2B) konstruovaným binárním vektorem
Binární vektor pBIOS232 se přenese do kmene Agrobacterium LBA 4404 triparentální konjugací způsobem, který popsali Ditta G, Stanfield S., Corbin D. (Helinski D.R. Pnas 77, str. 7347 až 7351, 1980).
Transformace rajčete se provede modifikovaným způsobem, který popsali Fillatti J. J., Kiser J., Rose R, a Commai L. (Bio/Technology 5, str. 726 až 730,1987).
Semena kultivaru UC82B se sterilizují 15 minut v 10 % Domestos, a třikrát se promyjí sterilní vodou. Vysejí se do květináče obsahujícího kultivační médium MSSV/2 na 7 až 8 dní.
Dělohy se vyjmou a rozřežou se příčně na tři části. Pouze středová část se uchová a kultivuje se při teplotě 26 °C na světle v médiu KCMS doplněném acetosyringonem se spodní plochou proti médiu.
Bakterie kmene Agrobacterium LBA 4404 se kultivují jednu noc v médiu LB doplněném požadovaným selekčním činidlem (tetracyklinem). Ráno se kultura odstředí a získaná peleta se vrátí do tekutého média KCMS. Explantáty se namočí na 30 minut do roztoku Agrobacteria zředěného v poměru 1/20 v médiu KCMS doplněném acetosyringonem. Rychle se vysuší na filtračním papíru.
- 13 CZ 296781 B6
Explantáty se potom:
vrátí zpět na médium KCMS na dva dny ve tmě při teplotě 26 °C, promyjí se tekutým médium 2Z doplněným augmentinem (400 mg/1) a vysuší se na filtračním papíru, přenesou se na pevné médium 2Z obsahující 400 mg/1 augmentinu a 100 mg/1 kanamycinu, kultivují se na světle při teplotě 26 °C a přenesou se po 15 dnech na čerstvé médium 2Z.
Tři týdny po kokultivaci se objeví první pupeny. Jakmile dosáhnou přibližně velikosti 1 cm, oddělí se od explantátu a přenesou se na médium Dev, kde se zakoření za 1 až 2 týdny, jsou-li dobře transformovány.
Když jsou dobře zakořeněny, přesadí se do substrátu Jiffy-7 (produkt společnosti AS Jifťy Products) ve fytotronu, kde se rychle aklimatizují.
Když je kořenový systém dobře vyvinutý v Jiffy, přesadí se rostliny do květináčů o průměru 12 cm a pak do kontejneru o průměru 30 cm a pěstují se ve skleníku při automatickém zavlažování živným roztokem (roztok zředěný 5kg/501 dodávaný jako 1,6 %).
b) Molekulární analýza primárních transformant obsahujících T-DNA pBIOS144 nebo pBIOS232
Když jsou transformované rostliny dobře vyvinuté ve skleníku, odeberou se listy (přibližně 5 g) k extrakci DNA, která se analyzuje metodou Southern Blot běžně používaným způsobem (Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. vydání. Cold Spring Harbor Laboratoiy Press, 1989).
DNA každé rostliny se naštěpí enzymem HindlII. Po migraci a přenesení na nitrocelulózovou membránu se podrobí hybridizaci s různými sondami umožňujícími ověřit:
počet kopií vložených T-DNA, zda byla T-DNA vložena celá, přítomnost nebo nepřítomnost úseků vně hranic.
Pomocí těchto molekulárních analýz se selektují jednotlivé rostliny nesoucí jednu kopii neporušené T-DNA bez úseků vnějších k hranicím.
Podle stejného protokolu se postupuje při transformování rajčete plazmidem pBIOS144 a při následující selekci transformovaných rostlin.
Příklad 8
Vyhodnocení zdroje fixované transposázy
Jakmile je jednou zdroj fixované transposázy začleněn do rostlin, ověřuje se, zda by byl schopen aktivovat element Ds.
Selektované rostliny, obsahující plazmid pBIOS144, byly kříženy rostlinou obsahující testovací element Ds, jehož vystřižen obnoví aktivitu genu Gus (beta-glukoronidázy). Tento Ds byl konstruován ve dvou stupních:
-14CZ 296781 B6 fragment BglII-Spel z pBIOS206 odpovídající Ds: :KanaR se vloží do míst BamHI-Xbalu v pBI221 (Clontech), čímž se získá pBIOS226, celý plazmid pBIOS226 se pak vloží do místa HindlII v pG 492 DL. Výsledný binární pBIOS228 nese mezi pravou a levou hranicí Ds: :KanaR mezi promotorem 35S a kódujícím úsekem gen Gus.
Každé vystřižení genu Ds: :KanaR se projeví expres reportérového genu Gus. Test Gus (Jefferson R.A., Plant Molecula Biology Rep, 5, str. 387 až 405, 1987) se provede na potomstvu F tohoto typu křížení k vyhodnocení účinnosti různých linií obsahujících transposázu. Modré skvrny byly detekovány na dělohách a na úsecích listů rostlin získaných křížením rostli transpósázové linie a testovací Ds linie. Počet modrých skvrn a plošek na rostlině ukazuje účinnost zdroje transposázy v této rostlině.
Příklad 9
Příprava linií fixované transposázy
Vybrané transformanty vyhodnocené jako pozitivní obsahujíc jednu kopii bez úseků vně hranic z předchozího příkladu byl podrobeny dvěma po sobě následujícím cyklům samooplodnění. Pak byly sklizeny odděleně dvě skupiny semen T2.
Každá skupina T2 se vyhodnotí samostatně se zřetelem na segregaci odolnosti proti kanamycinu ke zjištění skupiny homozygotních semen. Z každé skupiny se vyseje 30 semen do půdy ve skleníku. Osmnáct dnů po vysetí se po dobu tří dnů rozprašuje roztok 400 mg/1 kanamycinu (Weider R., Koomef M., Zabel P., Theo. Appl. Gen. 78, str. 169 až 172, 1989). Po pěti dnech je možno identifikovat rostliny citlivé na kanamycin. Skupiny rostlin které jsou homozygotní na transgen jsou identifikovány podle segregace rezistentních a citlivých rostlin odpovídající Mendelově segregaci dominantního genu. Jsou to skupiny rostlin, které se uchovají a použijí se ke křížení rostlin obsahujících element Ds: :KanaR-AMS.
Příklad 10
Křížení linií Ds: :KanaR-AMS s homozygotními transposázovými liniemi
Vybrané primární transformanty (obsahující jednu kopii bez úseků vně hranic) byly hodnoceny ihned po odkvětu ve skleníku na fertilitu mikroskopickým pozorováním příčných řezů prašníkových pouzder jednoho nebo dvou květů z každé rostliny po obarvení kyselým karmínem. Na základě tohoto vyhodnocení byly ponechány jen rostliny se samčí sterilitou, které nemají vůbec pyl.
Sterilní rostliny nesoucí Ds: :KanaR-AMS se oplodní pylem z linií exprimujících transposázu Ac. Plody jsou pak sklizeny semena odebrána.
Příklad 11
A) Identifikace excise u rostlin F1
Semena pocházející z křížení mezi rostlinami nesoucími zdroj transposázy a rostlinami nesoucími Ds: :KanaR-AMS se vysejí do půdy ve skleníku. Ve stadiu rozvinutí děloh se odebere jedna děloha z klíční rostlinky pro rychlou extrakci DNA (Lassner M. W., Peterson P., Yoder J.I. Plant
- 15CZ 296781 B6
Molecular Biology Rep.7, str. 116 až 128, 1989), se kterou se pak provede test PCR s oligonukleotidy A9a a A9b (obr. 1). Podmínky pro PCR jsou následující:
DNA: 40 ng (nebo 10 μΐ z mikroextrakce) oligo A9a (10 pmol/μΐ): 3 μΐ oligo A9b (10 pmol/μΐ): 3 μΐ lOxpufr: 10 μΐ dNTP směs (5 mM) : 4 μΐ Taq (Promega): 0,4 μΐ 25 mM MgCl2:8 μΐ H2O do 100 μΐ
Reakce se provádí v přístroji Perkin 9600. Po dvou minutách denaturace při teplotě 95 °C se provede 40 cyklů podle následujícího schématu:
vteřin denaturace při teplotě 94 °C 30 vteřin hybridizace při teplotě 55 °C minuta a 30 vteřin prodlužování (extenze) řetězce při teplotě 72 °C.
Cílem tohoto testu je rychle identifikovat rostliny nesoucí gen AMS (po PCR pás o velikosti 800 párů bází) a odlišit je od rostlin, které ho nenesou (bez pásu produktu PCR). Rostliny, nesoucí gen AMS, se přesadí a během kvetení se pozoruje výskyt plodů, které vykazují alespoň jeden úsek somatické excise. Vyšetření plodů rostlin F1 ukáže bud’ excisi bez reinzerce (nového začlenění) Ds nebo excisi následovanou novým začleněním se ztrátou aktivity.
Pro ověření se vyjmou semena z těchto rostlin a zasejí se. Molekulární analýza PCR těchto rostlin se provede k ověření, zda nenesou ještě Ds: :KanaR-AMS, avšak nesou stopu („ jizvu“) TDNA a/nebo požadovaný gen. K tomu se odebere z každé rostlinky děloha k rychlé extrakci DNA. Díl (alikvot) této DNA se odebere k provedení dvou reakcí PCR:
Jedna reakce s oligonukleotidy EMI a EM5 (obr. 2). Podmínky pro tuto PCR jsou:
DNA: 40 ng (nebo 10 μΐ z mikroextrakce) oligo EMI (10 pmol/μΐ): 3 μΐ oligo EM5 (10 pmol/μΐ) : 3 μΐ lOxpufr: 10 μΐ dNTP směs (5 mM) : 4 μΐ
Taq (Promega): 0,4 ul mM MgCl2:18 μΐ
BSA x 100: 8 μΐ glycerol: 2,5 μΐ
H2O do 100 μΐ
Reakce se provádí v přístroji Perkin 9600. Po dvou minutách denaturace při teplotě 95 °C se provede 40 cyklů podle následujícího schématu:
vteřin denaturace při teplotě 94 °C vteřin hybridizace při teplotě 62 °C vteřin prodlužování (extenze) řetězce při teplotě 72 °C.
Tento test umožňuje zjistit, zdaje rostlinka nositelkou „jizvy“ T-DNA a/nebo příslušného požadovaného genu. V případě, že element Ds byl vystřižen, získá se fragment přibližně velikosti 300 párů bází pro samotnou Jizvu“, ke které je třeba přičíst velikost požadovaného genu;
-16CZ 296781 B6
Druhá reakce byla provedena s oligonukleotidy 5Ή a Acl2 (obr. 3). Podmínky použité pro PCR jsou tyto:
DNA: 40 ng (nebo 10 μΐ z mikroextrakce) oligo 5 Ή (10 pmol/μΐ): 3 μΐ oligo Acl2 (10 pmol/μΐ) : 3 μΐ lOxpufr: 10 μΐ dNTP směs (5 mM) : 4 μΐ
Taq (Promega): 0,4 ul mM MgCl2:18 μΐ
BSAx 100:8 μΐ glycerol: 2,5 μΐ
H2Odo 100 μΐ
Reakce se provádí v přístroji Perkin 9600. Po dvou minutách denaturace při teplotě 95 °C se provede 40 cyklů podle následujícího schématu:
vteřin denaturace při teplotě 94 °C 30 vteřin hybridizace při teplotě 62 °C minuta a 30 vteřin prodlužování (extenze) řetězce při teplotě 72 °C.
Tento test umožňuje ověřit nepřítomnost genu kódujícího transposázu. Není-li přítomen amplifíkovaný fragment, transposáza chybí. Je-li transposáza přítomna, lze detekovat fragment velikosti 1,6 kb.
Rostliny vzniklé v důsledku události vystřižení nesoucí již jen požadovaný gen bez genu odolnosti proti kanamycinu nebo bez T-DNA gen kódujícího transposázu budou pozitivní při prvním PCR testu s oligonukleotidy EMI-EM5 a negativní při druhém testu s oligonukleotidy 5'H-Acl2.
Southernova analýza těchto rostlin umožňuje potvrdit přítomnost požadovaného genu a nepřítomnost genu odolnosti vůči kanamycinu.
B) Identifikace transformantů zbavených selektivního markéru
1) Materiál
Sonda NPTH:
Amplifikace fragmentu o velikosti 1 kb genu ΝΡΤΠ z vektoru pBIOS232 pomocí oligonukleotidů Kana7 a Kana8 sekvencí:
Kana7: gctcgacgttgtcactgaad
Kana8 : cccggaaaacgattccgaag
Použitý gen NPTII byl izolován z transposozu Tn5 Escherichia coli (Berg D.E., Berg C. M. Biotechnology 1, str. 417 až 435 (1983) 1983).
Sondy Cat intraLB + intraRB:
- 17CZ 296781 B6
Směs dvou sond:
Cat int LB: fragment Sáli T-DNA z pGA 492 DL obsahující levou hranici a část genu Cat Int RB: fragment Sáli T-DNA z pGA 492 obsahující pravou hranici
Obě sondy společně odpovídají celé T-DNA pGA 492 DL, což je základní vektor, který byl použit ke konstrukci pBIOS232 sloužícího k vytvoření rostlin Ds: KanaR-AMS.
2) Identifikace a kultivace rostlin se dvěma aktivními složkami:
Získají se a zasejí semena pocházející z křížení mezi rostlinou nesoucí Ds: :Kana-AMS a rostlinou nesoucí zdroj fixované transposázy. Provedl se PCR test na DNA z děloh 173 rostlin s oligonukleotidy EMI a EM5, jak bylo výše popsáno. Tímto testem se podařilo identifikovat 18 rostlin, u kterých byl s oligonukleotidy EMI-EM5 amplifikován pás velikosti 350 pár; bází, čímž se projevilo uskutečnění somatické excise, dokládající přítomnost a funkčnost dvou elementů systému.
Systém byl vyvinut užitím T-DNA nesoucí Ds: : KanaR-AMS nikoli však požadovaný gen. Proto byl pás excise amplifikovaný pomocí EMI a EM5 přibližně 350 párů bází. V případě, kdy byl začleněn požadovaný gen, by se tento pás prodloužil podle velikosti tohoto genu. Při jiném způsobu provedení je možno rovněž využít specifických oligonukleotidů příslušného genu.
Těchto 18 rostlin se kultivovalo 4 měsíce na poli. Květy se pravidelně prohlížejí k ověření fertility prašníku stejně jako vznik plodů. U tří z osmnácti rostlin se vyskytovaly plody pouze v některých hroznech. Tyto rostliny byly tedy chiméricko pro samčí fenotypy sterilní/plodné. Plody na rostlinách se sklízely hrozen za hroznem, přičemž se zaznamenávala poloha hroznu na rostlině.
Semena z plodů ze třech hroznů tří rostlin, které se jevily jako částečně plodné, byla vyseta. Listy získaných rostlin (4 sazenice/hrozen) byly odebrány k extrakci DNA pro Southern analýzu. DNA se naštěpila enzymem HindlII (jediné místo v T-DNA) před elektroforézou a přenosem na membránu. 36 vzorků odpovídajících potomstvu F2 se zpracovalo současně jako DNA rodičů hybridů (rostliny nesoucí Ds: :KanaR-AMS a rostliny nesoucí zdroj fixované transposázy) k získání referenčních profilů. Hybridizace Southern blot sondami NPTII a Cat-int LB umožnila identifikovat rostliny, které již nenesly T-DNA obsahující zdroj trensposázy ani Ds: KanaRAMS, ale které obsahovaly,, jizvu T-DNA díky porovnání s profilem rodičů.
Celkem se zkoumalo 36 rostlin bez předběžné selekce na kanamycin pocházejících ze tří hroznů tří rostlin, u kterých se objevily plody.
3) Bilance analýzy:
Dvacet rostlin nesoucích,, jizvu“ T-DNA, tedy vykazujících jeden pás hybridizující se sondou Cat int LB-BR, jehož velikost je však menší než měly rodičovské rostliny nesoucí Ds. Tentýž pás nehybridizuje se sondou NPTII.
Třicet jedna rostlin nesoucích zdroj transposázy, tedy vykazujících pás hybridizující se sondou NPTII stejné velikosti, jaké se detekuje toutéž sondou u rodičů nesoucích zdroj fixované transposázy.
Pět rostlin nesoucích prázdnou T-DNA ale nenesoucích zdroj transposázy.
Ze 36 analyzovaných rostlin se 5 prokázalo jako čisté transformanty, jež obsahují pouze T-DNA nesoucí požadovaný gen, přičemž markerový gen byl vystřižen.
- 18CZ 296781 B6
Bylo tedy možné selektovat správně transformované druhé generace z primárních transformant.
Výhody této techniky jsou četné. Umožňuje již v jakémkoliv časném stadiu identifikovat transformanty zbavené selektivního markéru. Křížení primární transformanty se zdrojem transposázy je snazší a spolehlivější, jelikož rostlina obsahující zdroj transposázy vykazuje samčí sterilitu. Tato technika dále dovoluje selektovat menší počet rostlin pro identifikování požadovaných transformant: bez jakékoliv předběžné selekce po analýze 36 potomků tří rostlin bylo identifikováno pět rostlin obsahujících T-DNA zbavených Ds: :KanaR-AMS.
Dále je tedy možno zlepšit identifikaci transformantů zbavených markérů:
Jestliže se potomstvo z plodů na rostlině nesoucí Ds: :KanaR-AMS a zdroj transposázy ošetří před kanamycinem, čtvrtina (1/4) by měla být KanaS místo 15/16 (normálně získaných jestliže neměly excisi Ds). Mezi nimi jsou 3/4 nositeli „požadované T-DNA, a další čtvrtina odpovídá klasickým segregantám, které nenesou žádný transgen. Pozorování segregace 3/4 odolných rostlin a 1/4 citlivých umožňuje ostatně rychle potvrdit, že eliminační systém byt účinný. Je tedy možno identifikovat požadované potomstvo analýzou velmi malého počtu rostlin vybraných z rostlin F2 citlivých na kanamycin.
4) Závěr:
Tato studie ukazuje, že začlenění genu zprostředkujícího umělou samčí sterilitu v systému eliminace markerového genu Ac/Ds umožňuje rychle identifikovat potomstvo nesoucí požadovaný gen bez selektivního markéru, čímž se zcela zjednodušuje proces a zabraňuje se pylem zprostředkovanému rozšíření nedostatečně charakterizovaných transgenních dějů.
Příklad 12
Konstrukce binárního plazmidu pBIOC4-FLP nesoucího rekombinázu FLP
Sekvence kódující rekombinázu FLP Sacharomzces cerevisiae je obsažena v poG44 dodávaném společností Stratagene. Plazmid poG44 se naštěpí enzymem HindlII a KpnI a izoluje se fragment HindlKpnl. Provede se ligace se 100 ng defosforylovaného vektoru pBIOS512 a s 50 ng fragmentu HindlII-Kpnl nesoucího sekvenci kódující rekombinázu v reakční směsi 10 μΐ v přítomnosti 1 μΐ lOxpufřu T4 DNA ligázy (Amersham) a 2,5 U enzymu T4 DNA ligázy (Amersham) během 16 hodin při teplotě 14 °C. Transformují se bakterie Escherichia coli DH5a, které byly předem ošetřeny tak, aby byly transformačně kompetentní. Výsledný plazmid se nazývá pBIOS512-FLP. Plazmidová DNA výsledných klonů, které byly selektovány v médiu obsahujícím 50 pg/ml ampicilinu, byla extrahována způsobem alkalické lyže a analyzována štěpením restrikčními enzymy. Fragment nesoucí sekvenci kódující rekombinázu FLP byl izolován enzymatickým štěpením KpnI a poté působením enzymu T4 DNA polymerázy (New England Biolabs) podle doporučení výrobce, pak ještě štěpením užitím HindlII. Fragment se čistí elektroforézou na 0,8 % agarózovém gelu, elekroeluuje se, vysráží se alkoholem a vysuší se. Fragment se vloží do místa BamHI, které bylo ošetřeno enzymem Klenow (New England Biolabs) podle doporučení výrobce, a do místa HindlII plazmidu pBIOS512. Nukleotidová sekvence FLP se ověří sekvencováním pomocí kitu pro sekvencování T7TM (Pharmacia) dideoxynukleotidovou metodou (Sanger a kol. 1977). Plazmid pBIOS512 je derivátem pUC a nese expresní kazetu dvojitý promotor 35S (PD35S) - terminátor NOS (TNOS) (fragment EcoRI). Dvojitý promotor 35S pochází z pJIT 163 (WO 96/33277).
-19CZ 296781 B6
Fragment EcoRI nesoucí expresní kazetu PD35S-FLP-TNOS byl izolován z pBIOS512-FLP enzymatickou digescí pomocí EcoRI, vyčistí se na 0,8 % agarózovém gelu, elekroeluuje se, vysráží se alkoholem a vysuší se. Pak byl vložen do defosfoiylovaného místa EcoRI plazmidu pBIOC4 (WO 96/ 33277) defosforylovaného telecí alkalickou fosfatázou (Boehringer Mannheim) podle doporučení výrobce. Ligace se provede se 100 ng defosforylovaného vektoru a 50 ng fragmentu nesoucího kazetu PD35S-FLP-TNOS v 10 μΐ reakční směsi v přítomnosti 1 μΐ lOxpufru T4 DNA ligázy x 10 (Amersham) a 2,5 U T4 DNA ligázy (Amersham) po dobu 16 hodin při teplotě 14 °C. Ligaění směsí se transformují bakterie Escherichia coli DH5a, předem ošetřené tak, aby byly transformačně kompetentní. Výsledný plazmid se nazývá pBIOC4-FLP. Plazmidová DNA výsledných klonů, které byly selektovány v médiu obsahujícím 12 pg/ml tetracyklinu, byla extrahována způsobem alkalické lyže a analyzována digescí restrikčními enzymy. Plazmidová DNA binárního plazmidu pBIOC4-FLP byla vnesena přímou transformací do kmene LBA4404 Agrobacteriium tumefaciens způsobem, který popsali Holsters a kol. (Mol. Gen. Genet. 163, str. 181 až 187, 1978). Platnost získaného klonu se ověří enzymatickou digescí vnesené plazmidové DNA.
Příklad 13
Konstrukce binárního plazmidu, pBIOC511, nesoucího gen samčí sterility gen pro selekci na kanamycinu mezi místy FRT specifické rekombinace, kterýžto plazmid je vhodný pro transgenozi tabáku
Binární plazmid pGA492 (An, 1986) byl delecí zbaven následujících sekvencí: konstitutivního promotoru genu nos kódujícího nopalinsyntézu (Depicker a kol. J. Mol. Appl. Genet 1, str. 561 až 573, 1982), sekvence kódující gen NPTII kódující neomycinfosfotransferázu II (Berg D.E., Berg C. M. Biotechnology 1, str. 417 až 435 (1983) zbavenou oblasti osmi prvních kodonů jejichž iniciační methioninový kodon ATG je napojen na sekvenci 14 prvních kodonů sekvence kódující gen nos (Depicker a kol. J. Mol. Appl. Genet 1, str. 561 až 573, 1982), sekvence kódující gen nos zbavený oblasti 14 prvních kodonů, terminátoru nos (Depicker a kol. J. Mol. Appl. Genet 1, str. 561 až 573, 1982). Tato delece byla provedena úplnou digescí Clal následovanou parciální digescí SacII. Fragment se čistí a podrobí se působení enzymu T4 DNA polymerázy (New England Biolabs) podle doporučení výrobce Ligace plazmidu a transformace do bakterií. Escherichia coli DH5a, které byly předem ošetřeny tak, aby byly kompetentní pro transformaci, se provádějí obvyklými postupy ( Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. Molecular Cloning, a Laboratory Manual, 2. vydání. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Výsledný plazmid byl nazván pBIOC506.
Místo FRT specifické integrace bylo amplifikováno pomocí PCR z plazmidu poG45 (Stratagene). Oligodesoxynukleotidy použité jako primery PCR jsou:
5'CCCCTGCAGTTTTCAAAAGCGCTCTGAAGTTC3'a
5'CCAAAGCTTGAATTCGCCAGGGGGATCTTGAAGTTC3'.
Fragmenty odpovídající místu FRT získané z PCR byly štěpeny pomocí Pstl, podrobeny působení enzymu T4 DNA polymerázy (New England Biolabs) podle doporučení výrobce, pak štěpeny EcoRI. Čistí se na 2 % agarózovém gelu, elektoeluují se, vysráží se alkoholem, vysuší a opět rozpustí ve vodě. Pak se ligují mezi místo Sací předem ošetřené T4 DNA polymerázou a místo EcoRI plazmidu pUCIB (Pharmacia). Výsledný plazmid byl nazván pBIOC507.
Druhé místo FRT se začlení do plazmidu pBIOC507. Toto druhé místo FRT bylo získáno provedením PCR pomocí následujících dvou oligodeoxynukleotidů:
-20CZ 296781 B6 'CCCCTGCAGTTTTCAAAAGCGCTCTGAAGTTC3' a
5'AAAGGTACCGCCAGGGGGATCTTGAAGTTC3'.
Amplifikované fragmenty se digerují pomocí Pstl a KpnI, podrobených působení enzymu T4 DNA polymerázy, a ligují se do místa Sphl předem opracovaného působením enzymu T4 DNA polymerázy v plazmidu pBIOC507. Výsledný plazmid se nazývá pBIOC508 a obsahuje obě místa FRT orientovaná ve stejném smyslu.
Z plazmidu pBIOC508 se izoluje fragment HindlII-EcoRI nesoucí dvě místa FRT. Tento fragment se začlení do míst HindlII a EcoRI plazmidu pBIOC506. Výsledný plazmid se nazývá pBIOC509.
K potvrzení samčí sterility se použije fragmentu Sphl nesoucího chimérický gen odpovídající A9bamáza-T35S promotor, obsažený v pWPI73 (Paul W. a kol., Plant Mol. Biol 19, str. 611 až 622, 1992). Tento fragment Sphl se opracoval působením enzymu T4 DNA polymeráza a vložil do místa Pstl plazmidu pBIOC509, ošetřeného předem T4 DNA polymerázou. Výsledný plazmid se nazývá pBIOC510.
Nakonec, aby byla možná selekce na kanamycinu (Fromm Μ. E., Taylor L.P., Walbot V. Nátuře sv. 319, str. 791 až 793, 1986), se fragment EcoRI ošetřený T4 DNA polymerázou odpovídající expresní kazetě PNOS-NPTII-TNOS, izolované z plazmidu pIOSl, do kterého byl do místa BamHI klonován fragment BamHI kódující gen NPTII, liguje do místa KpnI ošetřeného T4 DNA polymerázou do plazmidu pBIOC510. Výsledný plazmid se nazývá pBIOC511.
Průmyslová využitelnost
Samčí sterility rostlin lze využít ve šlechtitelství a pro zvýšení výnosů plodin.
Přehled kultivačních médií
LB g/1 bactotryptonu g/1 kvasnicového extraktu g/1 chloridu sodného pH 7,5 upraveno hydroxidem sodným
MSSV/2
2,2 g makro- a mikroelementů (podle Murashige a Skoog) (Sigma, katalog, č. M 6899) 2 ml/1 vitaminů (podle Nitsche) g/1 sacharózy g/1 agar-agaru pH 5,9 před autoklávováním
2Z
3,4 g makro- a mikroelementů (podle Murashige a Skoog) (Sigma, katalog, č. M 6899) 2 ml/1 vitaminů (podle Nitsche) g/1 sacharózy mg/1 zeatinu
-21 CZ 296781 B6
400 mg/1 augmentinu 100 mg/1 kanamcinu 8 g/1 agar-agaru pH 5,9 před autoklávováním
KCMS
4,4 g makro- a mikroelementů (podle Murashige a
Skoog) (Sigma, katalog, č. M 6899)
0,9 mg/1 thiaminu
200 mg/1 dihydrogenofosforečnanu draselného g/1 sacharózy g/1 agar-agaru
200 μιηοΐ/ΐ acetosyringonu
0,2 mg/12,4-D
0,1 mg/1 kinetinu pH 5,9 před autoklávováním
DEV
2,2 g makro- a mikroelementů (podle Murashige a Skoog) (Sigma, katalog, č. M 6899) ml/1 vitaminů (podle Nitsche) g/1 sacharózy mg/1 kanamycinu
400 mg/1 augmentinu g/1 agar-agaru pH 5,9 před autoklávováním
MS20
4,4 g/1 MO404 (Sigma) g/1 sacharózy g/1 agar-agaru (pevné médium) pH 5,7 + případně rostlinné hormony BAP 1 mg/1 a NAA 0,2 mg/1
MS30
4,4 g/1 MO404 (Sigma) g/1 sacharózy g/1 agar-agaru (pevné médium) pH 5,7 + případně rostlinné hormony BAP 1 mg/1 a NAA 0,2 mg/1
Seznam použité literatury
An G., Plant Physiol. 81, str. 86 až 91 (1986)
Bednarek S. Y. a Ralkhel N. V., The plant Cell, 3, str. 1195 až 1206 (1991)
Broer a kol., Braunschweig Symposium on Applied Plant Molecular biology. Braunschweig 21.-23. listopadu (1988), Proceedings. Ed Galling G. str. 240 (1989)
Berg D. E., Berg C. M., Biotechnology 1, str. 417 až 435 (1983)
Close J. J., Rodriguez R. L., Gene 20, str. 305 až 316 (1982)
-22 CZ 296781 B6
Cocherel S., Perez P., Degroote F., Genestier S., Picard G., Plant Molecular Biology 30, str. 539 až 551 (1996)
De la Penna, Nátuře 325, str. 274 až 278 (1987)
Depicker a kol., J. Mol. Appl. Genet 1, str. 561 až 573 (1982)
Ditta G, Stanfíeld S., Corbin D, Helinski D. R., Pnas 77, str. 7347 až 7351 (1980)
Ellstrand Norman C., Bioscience sv. 40, str. 438 až 442 (1990)
Fillatti J. J., Kiser J., Rose R. a Commai L. Bio/Technology 5, str. 726 až 730 (1987) Finnegan E. J., Lawrence G. J., Dennis E. S., Ellis J. G., Plant Molecular Biology 22, str. 625 až 633 (1993)
- Franěk a kol. Cell 21, str. 285 až 294 (1980)
Fromm Μ. E., Taylor L. P., Walbot V. Nátuře sv. 319, str. 791 až 793 (1986)
Gaubier a kol., Mol. Gen. 238, str. 409 až 418 (1993)
Holsters a kol., Mol. Gen. Genet. 163, str. 181 až 187 (1978)
Horsch a kol., Science 227, str. 1229 (1985)
Jefferson R. A., Plant Molecular Biology Re, 5, str. 387 až 405 (1987)
Jouanin. Plant. Sci. 53, str. 53 až 63 (1987)
- Kay. Science 236, str. 1299 až 1302 (1987)
Lassner M. W., Peterson P., Yoder J. I., Plant Molecular Biology Re.7, str. 116 až 128 (1989)
Liu. Mol. Plant. Microb., Interactions 6, str. 144 až 156 (1951)
Matsuoka K, Nakamura K., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 88, str. 834 až 838 (1991)
McElroy. Mol. Gen. Genet. 231, str. 150 až 160 (1991)
Murakami a kol., Plant Mol. Biol. 7, str. 343 až 355 (1986)
Ni a kol., Pint J. 7, str. 661 až 676 (1995)
- Paul W. a kol., Plant Mol. Biol 19, str. 611 až 622 (1992)
Perez P., Tiraby G., Kallerhoff J., Perret J., Plant Molecular Biology 13, str. 365 až 373 (1989)
Rogers S., Bendich A. J., Plant Molecular Biology. Manual A65, str. 69 až 76 (1988) Sambrook J., Fritsch E. F., Maniatis T., Molecular cloning, a laboratory manual, 2. vydání. Cold Spring Harbor laboratory press (1989)
Sanford J. C., Trends in Biotechnology 6, str. 299 až 302 (1988)
Schroeder M. R., Borkhsenious O.N., Matsuoka K., Nakamura K. a Rakhel N. V., Plant Physiol. 101, str. 451 až 458 (1993)
Watson a kol., ADN recombinant, vydavatel De Boeck Universitě, str. 273 až 292 Weider R., Koornef M., Zabel P., Theo. Appl. Gen. 78, str. 169 až 172 (1989)
Worall D., Hird M., Hodge R., Paul W., Draper J. a Scott R., Plant Cell 4, str. 759 až 771 (1992)
Yoder J. I., Goldsbrough A. P., Bio/Technology sv. 12, str. 263 až 267 (1994)
Claims (10)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Použití uměle vytvořené rostliny se samčí sterilitou vybrané ze souboru obsahujícího kukuřici, řepku olejku, nebo rajče, obsahující gen umělé samčí sterility (gen AMS) v genomu, do kterého je včleněn požadovaný transgen, jehož expresi nebrání přítomnost genu AMS, k zabránění síření uvedeného transgenu.
- 2. Použití podle nároku 1, kdy rostlina je nositelkou samčí cytoplazmatické sterility.
- 3. Použití podle nároku 1, kdy rostlina je nositelkou samčí jaderné sterility.
- 4. Použití podle některého z nároků 1 až 3, kdy požadovaný transgen kóduje požadovaný protein zajímavý z terapeutického nebo profylaktického hlediska.
- 5. Použití podle nároku 4, kdy požadovaný transgen je zvolen mezi proteinem kódujícím kolagen nebo gastrickou lipázu.
- 6. Transgenní rostlina nebo část transgenní rostliny vybraná ze souboru obsahujícího kukuřici, řepku olejku, nebo rajče, která obsahuje požadovaný transgen genově vázaný s genem umělé samčí sterility (gen AMS), který je spojen s prvky umožňujícími jeho expresi v rostlinných buňkách, přičemž expresi uvedeného transgenu nebrání přítomnost genu AMS.
- 7. Transgenní rostlina nebo část transgenní rostliny podle nároku 6, kdy prvky umožňující expresi v rostlinných buňkách jsou promotorem a terminátorem transkripce.
- 8. Transgenní rostlina nebo část transgenní rostliny podle některého z nároku 6 nebo 7, ve které je gen umělé samčí sterility (gen AMS) spojen s promotorem umožňujícím specifickou expresi v prašníku.
- 9. Transgenní rostlina nebo část transgenní rostliny podle některého z nároků 6 až 8, kdy požadovaný transgen kóduje požadovaný protein zajímavý z terapeutického nebo profylaktického hlediska.
- 10. Transgenní rostlina nebo část transgenní rostliny podle nároku 9, kdy požadovaný transgen je zvolen mezi proteinem kódujícím kolagen nebo gastrickou lipázu.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR9702369A FR2759857B1 (fr) | 1997-02-27 | 1997-02-27 | Nouvelles utilisations de la sterilite male chez les plantes |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ301799A3 CZ301799A3 (cs) | 2000-03-15 |
| CZ296781B6 true CZ296781B6 (cs) | 2006-06-14 |
Family
ID=9504258
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ0301799A CZ296781B6 (cs) | 1997-02-27 | 1998-02-26 | Zpusob vyuzití samcí sterility u rostlin |
Country Status (12)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US7112719B2 (cs) |
| EP (1) | EP0972061B1 (cs) |
| AT (1) | ATE338824T1 (cs) |
| AU (1) | AU6734998A (cs) |
| CA (1) | CA2282726C (cs) |
| CZ (1) | CZ296781B6 (cs) |
| DE (1) | DE69835812T2 (cs) |
| ES (1) | ES2273411T3 (cs) |
| FR (1) | FR2759857B1 (cs) |
| HU (1) | HU224706B1 (cs) |
| PL (1) | PL336300A1 (cs) |
| WO (1) | WO1998038323A2 (cs) |
Families Citing this family (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6632980B1 (en) | 1997-10-24 | 2003-10-14 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Binary viral expression system in plants |
| KR20030031467A (ko) * | 2000-02-28 | 2003-04-21 | 예일 유니버시티 | 트랜스진의 유전을 감소 또는 제거하는 방법 및 조성물 |
| EP1174512A1 (en) * | 2000-07-17 | 2002-01-23 | Peter Stamp | Seed composition and method for reducing or preventing the release of genetically manipulated pollen |
| GB0108048D0 (en) * | 2001-03-30 | 2001-05-23 | Isis Innovation | Specification of meiocyte and tapetal cell layers in plants |
| FR2825579B1 (fr) * | 2001-06-11 | 2004-07-23 | Rhobio | Methode d'obtention de plante monocotyledone contenant un gene d'interet sans sequence auxiliaire etrangere |
| ATE530654T1 (de) * | 2001-07-06 | 2011-11-15 | Monsanto Technology Llc | Verfahren zur förderung der aufspaltung von transgenen bei pflanzen und zusammensetzungen dafür |
| US7667096B2 (en) | 2003-06-03 | 2010-02-23 | University Of Georgia Research Foundation, Inc. | Conditional sterility in plants |
| US7491811B2 (en) * | 2004-01-15 | 2009-02-17 | University Of Georgia Research Foundation, Inc. | Repressor-mediated tissue-specific gene expression in plants |
| CN111676229B (zh) * | 2020-06-30 | 2021-07-13 | 四川农业大学 | 一种玉米雄性核不育基因ms40及其分子标记和应用 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1991009957A1 (en) * | 1989-12-22 | 1991-07-11 | E.I. Du Pont De Nemours And Company | Site-specific recombination of dna in plant cells |
| WO1996004393A2 (en) * | 1994-08-01 | 1996-02-15 | Delta And Pine Land Company | Control of plant gene expression |
Family Cites Families (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5180873A (en) * | 1985-04-16 | 1993-01-19 | Dna Plant Technology Corporation | Transformation of plants to introduce closely linked markers |
| US5741684A (en) * | 1988-02-03 | 1998-04-21 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Molecular methods of hybrid seed production |
| GB8810120D0 (en) * | 1988-04-28 | 1988-06-02 | Plant Genetic Systems Nv | Transgenic nuclear male sterile plants |
| US5689041A (en) * | 1989-08-10 | 1997-11-18 | Plant Gentic Systems N.V. | Plants modified with barstar for fertility restoration |
| US5451513A (en) * | 1990-05-01 | 1995-09-19 | The State University of New Jersey Rutgers | Method for stably transforming plastids of multicellular plants |
| US5641664A (en) * | 1990-11-23 | 1997-06-24 | Plant Genetic Systems, N.V. | Process for transforming monocotyledonous plants |
| GB9028060D0 (en) * | 1990-12-24 | 1991-02-13 | Nickerson Int Seed | Recombinant dna |
| WO1993001283A1 (en) * | 1991-07-08 | 1993-01-21 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture | Selection-gene-free transgenic plants |
| GB9115909D0 (en) * | 1991-07-23 | 1991-09-04 | Nickerson Int Seed | Recombinant dna |
| JP3256952B2 (ja) * | 1994-11-09 | 2002-02-18 | 日本製紙株式会社 | 植物への遺伝子導入用ベクター、並びにこれを用いた遺伝子導入植物の作成方法及び植物への遣伝子多重導入方法 |
| ATE304600T1 (de) * | 1995-02-21 | 2005-09-15 | Bayer Bioscience Nv | Verfahren zur herstellung von männlich sterilen pflanzen |
| FR2733249B1 (fr) * | 1995-04-20 | 1997-06-06 | Biocem | Lipase gastrique de chien recombinante et polypeptides derives produits par les plantes, leurs procedes d'obtention et leurs utilisations |
| EP0939826A2 (en) * | 1996-08-15 | 1999-09-08 | Agrivax Incorporated | Delivery of tolerogenic antigens via edible plants or plant-derived products |
-
1997
- 1997-02-27 FR FR9702369A patent/FR2759857B1/fr not_active Expired - Fee Related
-
1998
- 1998-02-26 DE DE69835812T patent/DE69835812T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1998-02-26 WO PCT/FR1998/000381 patent/WO1998038323A2/fr active IP Right Grant
- 1998-02-26 US US09/380,086 patent/US7112719B2/en not_active Expired - Fee Related
- 1998-02-26 AU AU67349/98A patent/AU6734998A/en not_active Abandoned
- 1998-02-26 PL PL98336300A patent/PL336300A1/xx unknown
- 1998-02-26 HU HU0001856A patent/HU224706B1/hu not_active IP Right Cessation
- 1998-02-26 AT AT98912557T patent/ATE338824T1/de not_active IP Right Cessation
- 1998-02-26 CA CA002282726A patent/CA2282726C/fr not_active Expired - Fee Related
- 1998-02-26 ES ES98912557T patent/ES2273411T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1998-02-26 CZ CZ0301799A patent/CZ296781B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1998-02-26 EP EP98912557A patent/EP0972061B1/fr not_active Expired - Lifetime
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1991009957A1 (en) * | 1989-12-22 | 1991-07-11 | E.I. Du Pont De Nemours And Company | Site-specific recombination of dna in plant cells |
| WO1996004393A2 (en) * | 1994-08-01 | 1996-02-15 | Delta And Pine Land Company | Control of plant gene expression |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Ellstrand, N.C. and Hoffman, C.A: Hybridization as an avenue of escape for engineered genes. BioScience 40, 438 - 442,1990 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| FR2759857A1 (fr) | 1998-08-28 |
| EP0972061A2 (fr) | 2000-01-19 |
| HUP0001856A2 (hu) | 2000-09-28 |
| FR2759857B1 (fr) | 1999-04-30 |
| DE69835812T2 (de) | 2007-09-13 |
| CA2282726A1 (fr) | 1998-09-03 |
| HUP0001856A3 (en) | 2002-04-29 |
| WO1998038323A2 (fr) | 1998-09-03 |
| US20020157129A1 (en) | 2002-10-24 |
| PL336300A1 (en) | 2000-06-19 |
| WO1998038323A3 (fr) | 1998-12-17 |
| EP0972061B1 (fr) | 2006-09-06 |
| ATE338824T1 (de) | 2006-09-15 |
| US7112719B2 (en) | 2006-09-26 |
| CA2282726C (fr) | 2008-08-19 |
| DE69835812D1 (de) | 2006-10-19 |
| ES2273411T3 (es) | 2007-05-01 |
| AU6734998A (en) | 1998-09-18 |
| CZ301799A3 (cs) | 2000-03-15 |
| HU224706B1 (en) | 2006-01-30 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| AU639059B2 (en) | Site-specific recombination of dna in plant cells | |
| US5658772A (en) | Site-specific recombination of DNA in plant cells | |
| AU718262B2 (en) | Methods and constructs for producing male sterile plants | |
| EP0329308B1 (en) | Antisense gene systems of pollination control for hybrid seed production | |
| WO1990008828A2 (en) | Molecular methods of hybrid seed production | |
| JP2003514521A (ja) | 植物における条件導入遺伝子の発現および形質除去のための方法 | |
| JP2000116258A (ja) | 二元性潜在性細胞毒性法によるハイブリッド種子の産生方法 | |
| EP0436467A2 (en) | Expression of S-locus specific glycoprotein gene in transgenic plants | |
| CA2296501C (en) | Pollen-based transformation system using solid media | |
| AU739946B2 (en) | Nuclear male sterile plants, method of producing same and methods to restore fertility | |
| CZ296781B6 (cs) | Zpusob vyuzití samcí sterility u rostlin | |
| US5728926A (en) | Antisense gene systems of pollination control for hybrid seed production | |
| US20050120416A1 (en) | Novel method for the production of hybrid maize seeds | |
| US20020129399A1 (en) | Biotin-binding compounds for induction of sterility in plants | |
| AU655574C (en) | Molecular methods of hybrid seed production | |
| EP1279734A1 (en) | Molecular methods of hybrid seed production | |
| MXPA98008802A (en) | Genetic constructions and methods to produce fruits with very little seed or with reduced size seeds |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PD00 | Pending as of 2000-06-30 in czech republic | ||
| MM4A | Patent lapsed due to non-payment of fee |
Effective date: 20120226 |