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Die
Erfindung betrifft die Isolierung und Charakterisierung eines Promotors,
der die Expression von Transgenen in der erwachsenen Pflanze, zum
Zweck der Verbesserung der Entwicklung der Pflanze, erlaubt, ohne
dass das Produkt dieses Transgens in dem reifen und trockenen Samenkorn
vorhanden ist. Die Erfindung bezieht sich gleichfalls auf die transgenen
Pflanzen, welche ein Gen von Interesse fusioniert mit der Promotorsequenz
umfassen.
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Die
Techniken der Molekularbiologie erlauben gegenwärtig, das genetische Erbgut
von Pflanzen zu modifizieren, um darin die Komponenten, die die
Produktion, die Qualität
oder die Gesundheit kontrollieren, zu verändern. Die Expressionsspezifität der eingeführten Transgene
beruht im wesentlichen auf der Verwendung von Promotorsequenzen
von Pflanzen oder von Mikroorganismen. Die Suche nach spezifischen
Promotoren ist folglich von entscheidender Bedeutung für die Biotechnologie
in Verbindung mit Pflanzen. Die Samenkörner bilden eine bedeutende
Komponente der Landwirtschaft als Saatgut, aber gleichfalls bei
der Ernährung
oder in der Transformationsindustrie. In dieser Hinsicht kann das
Vorhandensein von neuen Proteinen und Produkten in dem Samenkorn
Probleme aufwerfen. Es erscheint folglich interessant, über einen
Promotor verfügen zu
können,
der in allen pflanzlichen Geweben aktiv ist, aber in den Samenkörnern funktionsunfähig ist.
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Die
Merkmale eines Samenkorns werden von den Wechselwirkungen zwischen
der Reifung, welche unter Kontrolle eines speziellen genetischen
Programms abläuft,
und den Umweltbedingungen, die für
einen guten Teil die spätere
Produktion konditionieren, abhängen.
Die Mechanismen, die diese Phänomene
regulieren, sind indessen nach wie vor in breitem Umfang unverstanden.
Es existiert folglich ein wirkliches Interesse, eine gute Qualität der Saatgutchargen
aufrechtzuerhalten. Nun wirft aber die Entwicklung von transgenen Pflanzen
neue Probleme auf, welche insbesondere mit der Expression von heterologen
Genen in den Samenkörnern
dieser Pflanzen verbunden sind. Tatsächlich kann das Vorhandensein
von Proteinen oder von Polypeptiden in den Samenkörnern unheilvolle
Folgen für
deren Vermögen,
zu keimen, oder für
deren Qualität
haben. Außerdem
könnten,
wenn die Öffentlichkeit
mehr und mehr mit der Idee vertraut wird, dass essbare Pflanzen
genetisch modifiziert sein können,
essbare Samenkörner,
die das Produkt von Transgenen enthalten, nicht leicht akzeptiert
werden.
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So
besteht das der Erfindung zugrundeliegende Ziel darin, einen Promotor
zu identifizieren, der eine starke Expression eines Transgens in
allen Geweben der Pflanzen bis auf das Samenkorn erlaubt.
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Zu
diesem Zweck wurde Promotor-Trapping oder -Einfang ("promoter trapping"), ein hochwirksames Werkzeug,
um Entwicklungsprozesse zu untersuchen (Topping und Lindsey, 1995,
für eine
zusammenfassende Übersicht)
ausgeführt.
Diese Strategie basiert auf der Ver wendung eines Vektors für die Transformation
von Pflanzen, welcher an einem seiner Enden ein Reportergen (zumeist
GUS oder GFP) ohne Promotor aufweist. Wenn die Insertion in einer
kodierenden Region erfolgt und wenn die Sequenz des Reportergens
sich im Raster befindet, wird es eine Fusion auf Translationsebene
zwischen dem endogenen Protein und dem Protein des Markergens geben.
Die Strategien des Gen-Trapping weisen gegenüber der klassischen Insertionsmutagenese
einen Hauptvorteil auf, denn der Phänotyp (Expression des Reportergens
GUS) ist dominant. Diese Dominanz des Phänotyps (GUS) erlaubt, die mutierten
Allele in heterozygotem Zustand zu beobachten. Dies ist sehr interessant
für die
Untersuchung von Mutationen, die in homozygotem Zustand letal sind.
Dieser Ansatz erlaubt gleichfalls, ein Gen anhand seiner Expression
zu charakterisieren.
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Es
wurde während
der Ausarbeitung der Erfindung festgestellt, dass eine Insertion
eines Reportergens in das ein Protein vom Typ "Fettsäurehydroxylase" ("fatty acid hydroxylase"; FAH) von Arabidopsis
kodierende Gen zu einer Expression in allen Geweben der Pflanze
bis auf das Samenkorn führt.
Dieser Promotortyp ist von sehr großer Bedeutung für biotechnologische
Anwendungen. Er erlaubt, ein Protein von Interesse ab dem umfassenden
Eindringen in allen Geweben der Pflanze mit einem hohen Expressionsniveau, außer in dem
Samenkorn, exprimieren zu lassen. Man kann folglich eine Pflanze
gegen zahlreiche Arten von biotischem oder abiotischem Stress schützen, ohne
den Gehalt von deren Samenkorn zu modifizieren. Man kann gleichfalls
eine Antisinn-Sequenz, die gegen ein Zielgen gerichtet ist, in allen
Geweben außer
in dem Samenkorn exprimieren lassen.
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Beschreibung
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So
betrifft die Erfindung eine Promotorsequenz, welche die Expression
eines Gens von Interesse in den Geweben einer Pflanze, außer dem
in Reifung befindlichen Samenkorn und dem trockenen Samenkorn erlaubt,
wobei die Sequenz eine Sequenz umfasst, welche wenigstens 80% Identität zu der
Sequenz oder einem Abschnitt der Sequenz des Promotors des Gens
der FAH von Arabidopsis aufweist.
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Diese
Sequenz umfasst vorzugsweise eine Sequenz, welche wenigstens 80%
Identität
zu der Sequenz oder einem Abschnitt der Sequenz SEQ ID No.1 aufweist.
Unter "% Identität" versteht man den
Prozentsatz von identischen Nukleotiden, der durch die Fachleute
auf diesem Gebiet leicht berechnet werden kann unter Verwendung
eines Datenverarbeitungsprogramms für Sequenzvergleiche, wie des
Programms DNASIS (Version 2.5 für
Windows; Hitachi Software Engineering Co., Ltd., South San Francisco,
CA) unter Verwendung der im Handbuch des Herstellers, welches in
die Beschreibung unter Bezugnahme aufgenommen wird, beschriebenen
Standardparameter. In diesem Kontext können die Sequenzen und die
Identitätsprozentsätze gleichfalls
erhalten werden, indem man die Datenverarbeitungsressourcen des
Internets einsetzt. Man kann das Programm Blast (WWW.ncbi.nlm.nih.gov)
und das Programm FastDB mit den folgenden Parametern "Mismatch penalty
1.00; Gap Penalty 1.00; Gap Size Penalty 0.33; Joining penalty 30.0" aufführen. Diese
Algorithmen sind in "Current
Methods in Sequencing and synthesis; Methods and Applications", Seiten 127–149, 1988, Ala
R. Liss, Inc., welches in die ten 127–149, 1988, Ala R. Liss, Inc.,
welches in die Beschreibung durch Bezugnahme aufgenommen wird, aufgeführt.
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Man
kann die Sequenzen mit 80% Identität gleichfalls als Sequenzen
definieren, die mit der Sequenz SEQ ID No.1 unter Bedingungen hoher
Stringenz hybridisieren. Diese Bedingungen sind in Sambrook et al., Molecular
Cloning, A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press, 1989) in
den Abschnitten 11.1 bis 11.61, welche in die Beschreibung unter
Bezugnahme aufgenommen werden, aufgeführt.
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Die
erfindungsgemäße Sequenz
weist vorteilhafterweise die Sequenz oder einen Abschnitt der folgenden
Sequenz SEQ ID No.1 auf:
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Die
Erfindung bezieht sich gleichfalls auf die Verwendung eines Abschnitts
der Sequenz SEQ ID No.1 zur Identifizierung von Fragmenten, welche
in der Lage sind, die Expression eines Gens von Interesse in einer Pflanze,
außer
dem Samenkorn, als Promotor zu steuern. Es ist so möglich, die
minimale Region der Sequenz des Promotors des Gens der FAH, um eine
wirksame Expression sicherzustellen, zu definieren. In diesem Sinne
kann der Promotor durch Hinzufügen
von Sequenzen, wie Enhancer-Sequenzen, durch Deletion von nicht-essentiellen
und/oder nicht gewünschten
Regionen modifiziert werden. Der Promotor kann synthetische und/oder
natürliche
Sequenzen umfassen.
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Die
Erfindung betrifft ein Verfahren, welches die Isolierung und die
Charakterisierung des Promotors des Gens der FAH in Pflanzen erlaubt,
welches die folgenden Schritte umfasst:
- a)
Verwendung eines Primers, welcher eine Sequenz mit wenigstens 80%
Identität
zu einer Sequenz, welche wenigstens 10 aufeinanderfolgende Nukleotide
der Sequenz SEQ ID No.5 aufweist, oder einer komplementären Sequenz
aufweist, eines Primers, der unter Bedingungen hoher Stringenz mit
einer jeglichen SEQ ID No.4 kodierenden Sequenz oder einer Sequenz,
die wenigstens 80% Identität
zu einer Sequenz, welche wenigstens 10 aufeinanderfolgende Nukleotide
der genomischen Sequenz des Gens der FAH von Arabidopsis, welche
unter der Nummer AC003096 zugänglich
ist, aufweist, oder einer komplementären Sequenz aufweist, hybridisiert,
für die
Isolierung und/oder Amplifizierung der Sequenz stromaufwärts des 5'-Endes des Gens der
FAH,
- b) Klonierung und Sequenzierung der in Schritt a) erhaltenen
Sequenz.
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Die
SEQ ID No.5 entspricht der kodierenden Sequenz des Gens der FAH
von Arabidopsis:
DEFINITION: vollständige cDNA von "Arabidopsis thaliana
fatty acid hydroxylase Fah lp"
(FAH1)
AUFNAHMENUMMER
(ACCESSION): AF021804
ORGANISMUS: Arabidopsis thaliana, Eukaryota;
Viridiplantae; Streptophyta; Embryophyta; Tracheophyta; Euphyllophytes;
Spermatophyta; Magnoliophyta; Eudicotyledone; Rosidae; Brassicales;
Brassicaceae.
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Referenz:
Mitchell, A.G., und Martin, C.E. (1997). Fah lp, a saccharomyces
cerevisiae cytochrome b5 fusion protein, and its arabidopsis thaliana
homolog that lacks the cytochrome b5 domain both function in the alpha-hydroxylation
of sphingolipid-associated very long chain fatty acids; J. Biol.
Chem. 272(45), 28281–28288;
MEDLINE 98019193.
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Es
ist gleichfalls möglich,
einen Primer, welcher eine Sequenz umfasst, welche wenigstens 80%
Identität
zu einer Sequenz aufweist, welche wenigstens 10 aufeinanderfolgende
Nukleotide der genomischen Sequenz des Gens der FAH von Arabidopsis
(Introns und Exons), welche für
den Fachmann unter der Nummer AC003096 zugänglich ist, aufweist, oder
einen Primer, der unter Bedingungen hoher Stringenz mit einer jeglichen
Sequenz, die die folgende SEQ ID No.4 (Arabidopsis thaliana, "fatty acid hydroxylase
Fah lp") kodiert, hybridisiert,
zu verwenden:
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So
kann die Promotorsequenz, welche die Expression eines Gens von Interesse
in den Geweben einer Pflanze, ausgenommen in dem in Reifung befindlichen
Samenkorn und in dem trockenen Samenkorn, erlaubt, gleichfalls dadurch
charakterisiert werden, dass sie eine Sequenz umfasst, welche wenigstens
80% Identität
zu der Sequenz oder einem Abschnitt der Sequenz des Promotors des
Gens der FAH aufweist, welche ausgehend von dem zuvor beschriebenen
Verfahren erhalten werden kann.
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Ein
anderer Aspekt der Erfindung bezieht sich auf eine Expressionskassette,
welche eine Sequenz von Interesse umfasst, welche fusioniert ist
mit einer Sequenz, welche eine Promotorsequenz, wie oben definiert,
umfasst. Die Sequenz von Interesse kann eine RNA, ein Protein oder
ein Polypeptid, welche (s) die Pflanze gegen einen biotischen oder
abiotischen Stress schützt,
kodieren. Die Kassette kann die Cosuppression der Expression eines
Gens erlauben, welche dadurch gekennzeichnet ist, dass die Sequenz
von Interesse ein Protein oder ein Polypeptid kodiert, welches in
der Lage ist, die Funktion eines endogenen Proteins oder Polypeptids
zu ersetzen. Die Sequenz von Interesse kann gleichfalls eine Antisinn-Sequenz
kodieren, welche gegen ein Zielgen gerichtet ist. Dies erlaubt bei
Kombination mit der ektopischen Überexpression
eines Gens von Interesse in den Samenkörnern, eine jegliche Expression
dieses Gens in anderen Geweben zu verhindern, da die Antisinn-Sequenz
darin nicht exprimiert wird. Dies erweist sich als überaus nützlich in
dem Falle, wo man wünscht,
ein Protein in den Samenkörnern überzuexprimieren,
ohne die Entwicklung anderer Gewebe der Pflanze zu stören. Die
erfindungsgemäße Kassette
kann außerdem
ein der Selektion dienendes Markergen, eine Leader-Sequenz, welche
den Durchtritt, die Sekretion oder das zielgerichtete Dirigieren
(Targeting) des Expressionsprodukts in verschiedene Organellen kontrolliert,
eine Transkriptions- und Translationsterminationssignalsequenz umfassen.
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Unter "Gen von Interesse" oder "Transgen" versteht man im
Rahmen der Erfindung ein Gen, welches insbesondere unter den Genen,
welche ein Protein oder Polypeptid, welches die Pflanze gegen einen
biotischen oder abiotischen Stress schützt, kodieren, ausgewählt wird,
wobei die störenden
Gene ein Produkt kodieren, welches in der Lage ist, die Funktion
oder die Expression einer endogenen mRNA, eines endogenen Proteins
oder eines endogenen Polypeptids zu ersetzen und/oder zu hemmen.
Man kann beispielsweise die Gene, welche Ribozyme gegen endogene
mRNAs kodieren, Gene, deren Transkriptionsprodukt zumindest teilweise
komplementär
zu einer endogenen Ziel-mRNA ist (
EP
240 208 , welche in die Beschreibung durch Bezugnahme aufgenommen
wird), aufführen.
Man kann gleichfalls Gene aufführen,
deren Transkriptionsprodukt identisch oder ähnlich ist zu den Transkripten
von endogenen Genen, die in der Lage sind, durch Cosuppression die
Expression der genannten endogenen Gene zu hemmen (Napoli, C., et
al., 1990, The Plant Cell, 2, 279–289, welche in der Beschreibung
durch Bezugnahme zitiert wird). Selbstverständlich kann das Gen gemäß der Erfindung
ein Enzym kodieren, welches am Stoffwechsel derart beteiligt ist,
dass es die Biosynthese von Metaboliten stattfinden lässt oder
begünstigt,
insbesondere Metabolite, welche für die Ernährung von Mensch oder Tier
nützlich
sind oder die Entwicklung beeinflussen können. Die erfindungsgemäße Promotorsequenz
kann die Expression eines Fremdgens induzieren und bei verschiedenen
Pflanzenarten eingesetzt werden. Der Begriff "Fremdgen" oder "Transgen" wird gleichfalls so verstanden, dass
er eine jegliche Region von kodierender oder nichtkodierender DNA
(Protein, Polypeptid, Antisinn-Sequenz, katalytische RNA, Viroid u.s.w.)
definiert. Ein Protein von Interesse für die Entwicklung und die Produktion
der Pflanze kann auf konstitutive Weise in allen Organen der Pflanze
unter Verwendung dieses Promotors produziert werden, ohne dass die
Zusammensetzung des Samenkorns beeinflusst wird. Die Proteine von
Interesse sind, nicht erschöpfend definiert,
jene, die einen besseren Schutz der Pflanze erlauben gegenüber:
- – Arten
von biotischem Stress: Schutz gegen Pathogene, Bakterien, Pilze,
Insekten, Nematoden, Parasiten oder Schädlinge, Schutz gegen Viren
und intrazelluläre
Pathogene, insbesondere jene, die nicht durch die Samenkörner übertragen
werden;
- – Arten
von abiotischem Stress: Schutz gegen Wärme und Kälte, Frost, Arten von Hydro-Stress,
wie Trockenheit oder im Gegenteil Anoxie, Verschmutzung (Ozon, SO
2), Lichthemmung und Arten von Licht-Stress, Liegen, Phytosanierung
(Phytoremediation) oder Arten von Nahrungs-Stress, welche durch einen
Mangel oder einen Überschuss
eines Nährelements
verursacht werden (insbesondere Salz-Stress).
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Ein
jegliches Gen von Interesse kann folglich unter die Kontrolle der
isolierten Promotorsequenz gestellt werden. Für die Expression in Pflanzen
kann dieses Gen gleichfalls nicht transkribierte 3'-Sequenzen, welche
in Pflanzen aktive Polyadenyliervngssignale aufweisen, umfassen.
Diese Sequenzen können
beispielsweise jene sein, die den transkribierten, aber nicht translatierten
3'-Abschnitt des
Gens der 35S-RNA des Blumenkohlmosaikvirus (CaMV-35S) oder die nicht-translatierte
3'-Region des Gens,
welches die Nopalinsynthese des Ti-Plasmids von Agrobacterium tumefaciens
kodiert (NOS), kodieren.
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Gemäß der Erfindung
kann das Gen von Interesse gleichfalls ein Gen, welches die Entwicklung
kontrolliert, sein, wie beispielsweise ein Gen, welches am Stoffwechsel
der Hormone, bei der Signalweiterleitung oder an der Kontrolle des
Zellzyklus beteiligt ist.
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Ein
anderer Aspekt der Erfindung bezieht sich auf einen Vektor, insbesondere
einen Plasmidvektor, welcher eine Expressionskassette, wie oben
definiert, umfasst. Die Erfindung hat gleichfalls eine Pflanzenzelle,
welche mit der Kassette oder einem Vektor, welcher die Kassette
umfasst, transformiert ist, und einen Kit zur Transformation von
Pflanzen, welcher die Kassette oder den Vektor umfasst, zum Gegenstand.
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Die
Herstellung der Plasmide, die Konstruktion der chimären Gene
und der Expressionskassetten, die Restriktionen der DNA durch Endonukleasen,
die Transformation und die Bestätigung
der Transformationen werden gemäß den Standardprotokollen
(Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, Manual, Cold Spring Harbor
Laboratory, welches in die Beschreibung durch Bezugnahme aufgenommen
wird) ausgeführt.
Die Konstruktion der Vektoren, die für die Transformationsexperimente
eingesetzt werden können,
bildet einen Teil der molekularbiologischen Techniken, welche bekannt
sind und routinemäßig in diesem
Anwendungsgebiet praktiziert werden.
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Ein
ergänzender
Aspekt der Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung
von transgenen Pflanzen, in welchen ein Gen von Interesse in allen
Geweben, außerdem
dem in Reifung befindlichen Samenkorn und in dem trockenen Samenkorn,
exprimiert wird, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass es die
folgenden Schritte umfasst:
- a) Transfer einer
Kassette oder eines Vektors gemäß der Erfindung
in Zellen von Pflanzen,
- b) Kultivierung der in Schritt a) erhaltenen transformierten
Zellen derart, dass die transgenen Pflanzen erhalten werden.
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Der
Transfer der DNA in das Innere der Pflanzenzellen, insbesondere
von Zellen des Endosperms oder von totipotenten Zellen, welche sich
von unreifen Embryonen ableiten, kann durch Standardtechniken erfolgen
(Plant Cell Report, 10, 595, 1992), insbesondere durch Transfer
via Agrobakterien (Plant J., 1994, 6, 271), durch Elektroporation
(Nature, 1987, 327, 70), Laserporation (Barley Genetics, 1991 VI,
231), durch Polyethylenglycol oder durch die biolistische Methode,
welche als "particle
gun" bezeichnet
wird (Nature, 1987, 327, 70). Allgemein tragen bezüglich Vektoren
für Transformationen über ein
Agrobakterium (Infiltration in planta, Bechtold et al., 1993) die
Transformationsvektoren Selektionsmarker, T-DNA-Ränder, Klonierungsstellen,
Replikationsfunktionen wie auch andere Elemente, sofern sie für den guten
Transfer der Transgene erforderlich sind (Bouchez et al., 1993).
Die oben erwähnten
Veröffentlichungen
werden in die Beschreibung durch Bezugnahmen aufgenommen.
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Die
Erfindung hat gleichfalls eine transgene Pflanze zum Gegenstand,
die durch Ausführen
des oben erwähnten
Verfahrens erhalten werden kann.
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Unter "Pflanze, welche erhalten
werden kann" versteht
man eine jegliche Pflanze, welche ein Transgen in ihren Geweben,
außer
den reifen und trockenen Samenkörnern,
exprimiert, wobei die Pflanze einen erfindungsgemäßen Promotor
aufweist. Die Pflanzen, die durch ein jegliches äquivalentes Verfahren, welches zu
dem gleichen Ergebnis führt,
erhalten werden, sind gleichfalls Gegenstand der Erfindung. Die
Liste der Pflanzen, bei denen diese Promotorsequenz eingesetzt werden
kann, umfasst insbesondere die Pflanzen, die für jegliche Industriezweige
nützlich
sind. Man kann beispielsweise Colza, die Kreuzblütler, Mais, Soja, Weizen, Sonnenblume,
Erbse, die Zierpflanzen und die Bäume aufführen.
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So
betrifft die Erfindung eine Pflanze, wie oben definiert, die in
ihren Geweben, außer
in den Samenkörnern,
ein Gen, dessen Produkt (RNA oder Protein) die Pflanze gegen einen
biotischen oder abiotischen Stress schützt, eine Antisinn-Sequenz,
welche gegen ein Zielgen gerichtet ist, ein Protein oder ein Polypeptid, welches
in der Lage ist, die Funktion eines endogenen Proteins oder Polypeptids
zu ersetzen, oder eine Sequenz, welche ein Protein kodiert, welches
an der Biosynthese von Metaboliten beteiligt ist, oder ein Gen,
welches die Entwicklung kontrolliert, wie beispielsweise ein Gen,
welches an dem Stoffwechsel der Hormone, an der Signalweiterleitung
oder an der Kontrolle des Zellzyklus beteiligt ist, exprimiert.
Die erfindungsgemäße Pflanze
kann gleichfalls ein Protein von Interesse unter der Kontrolle eines
anderen Promotors als des Promotors des Gens der FAH und eine Antisinn-Sequenz,
welche in der Lage ist, die Expression des Proteins von Interesse
zu hemmen, unter der Kontrolle des Promotors des Gens der FAH exprimieren
derart, dass das Gen von Interesse lediglich in den Samenkörnern exprimiert
wird.
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Die
ausgehend von einer erfindungsgemäßen transgenen Pflanze erhaltenen
Samenkörner,
die folglich das Expressionsprodukt des Transgens nicht enthalten,
werden durch die Erfindung mit umfasst wie auch deren Verwendung
in einem jeglichen Industriezweig.
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Für die folgende
Beschreibung wird auf die Legenden der Figuren, die nachfolgend
aufgeführt
werden, Bezug genommen:
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Legenden:
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Figur 1: Intron/Exon-Struktur
der mRNA des Gens der FAH
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Die
Rechtecke mit den Schraffuren repräsentieren die Introns. Der
Maßstab
ist in der Figur angegeben. T29F13 ist ein Bac und TA1234 eine cDNA.
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Figur 2: Struktur dar Region
des FAH-Gens
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PFAH
upper und A1 repräsentieren
die zum Sequenzieren des Promotors verwendeten Primer. Die Rechtecke
mit den Schraffuren repräsentieren
den transkribierten, nicht translatierten 5'-Abschnitt. Der Maßstab ist in der Figur angegeben.
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Figur 3: Karte des Plasmids
pBI101
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Karte
des Plasmids pBI101, welches den eingesetzten pFAH-Promotor enthält.
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Beispiel 1: Klonierung
des Promotor
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Materialien
und Methoden
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Isolierung der Promotorregion
der FAH
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Die
für die
Extraktion von genomischer DNA von Arabidopsis eingesetzte Methode
wurde inspiriert von jener, die von Doyle und Doyle (1990) beschrieben
wurde. Das Prinzip beruht auf den Detergens-Eigenschaften vom Cetyltrimethylammoniumbromid
(CTAB; Sigma Chemical Co., USA), welche die spezifische Denaturierung
der Protein- und Polysaccharid-artigen Makromoleküle erlauben.
Ungefähr
2 g Pflanzenmaterial (in vitro kultivierte Keimlinge im Alter von
1 bis 2 Wochen) werden in flüssigem
Stickstoff fein zermahlen und in ein 50 ml-Röhrchen vom Typ FALCON (Costar,
USA), welches 7,5 ml auf 65°C
vorgewärmten
Extraktionspuffer enthält,
transferiert. Die Extraktion erfolgt bei 65°C 30 min unter regelmäßiger Bewegung.
Die durch β-Mercaptoethanol
und das CTAB des Puffers denaturierten Proteine werden dann mit
einem Volumen Chloroform extrahiert, dann nach Zentrifugation (4430
g, 10 min) entfernt. Die Nukleinsäuren des Überstands werden durch ein
Volumen Isopropanol in Gegenwart von 3 M Natriumacetat (1/10, Vol./Vol.)
ausgefällt,
abzentrifugiert (7900 g, 10 min), dann mit 70%-igem Ethanol gespült. Der
Bodensatz wird in einem Eppendorf-Reaktionsgefäß in 100 μl Wasser wieder aufgenommen
und die Ribonukleinsäuren
werden durch Zugabe von 3 μl
RNase A mit einer Konzentration von 10 mg/ml (Sigma Chemical Co.,
USA) entfernt. Die DNA wird von Proteinen befreit, dann erneut mit
absolutem Ethanol ausgefällt.
Nach einer Zentrifugation in einem Eppendorf-Reaktionsgefäß wird der
Bodensatz gewaschen, getrocknet in 50 bis 100 μl Wasser wieder aufgenommen
und vor den Analysen bei –20°C aufbewahrt.
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Amplifizierung der genomischen
DNA
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Die
Promotorsequenz wurde amplifiziert, indem die Technik der PCR, die
eine bekannte Technik ist (Sambrook et al., 1989), eingesetzt wurde.
Primer, welche dem 5'-Abschnitt
(upper) und dem 3'-Abschnitt
(lower) der Promotorsequenz entsprachen, wurden von der genomischen
Sequenz des BAC T29F13 (AC003096 (siehe 1) abgeleitet.
Genomische DNA einer Wildtyp-Linie (Ler) wurde als Matrize für die Amplifizierung des
Promotorabschnitts eingesetzt. Die Amplifizierungsreaktionen wurden
ausgeführt
auf einem Thermocycler-Gerät
(MJ Research PTC100-96) in 0,2 ml-Röhrchen (Prolabo), welche die
folgende Mischung enthielten:
1 μl (10 ng) DNA, 2 μl 10×Puffer
(BRL), 2 μl
25 mM MgCl2, 0,8 μl
5 mM dNTP, 1 μl
Primer 1 (10 pmol/μl),
1 μl Primer
2 (10 pmol/μl),
0,5 μl (1
U) Taq-DNA-Polymerase (5 U/μl),
H2O auf 20 μl.
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Bakterientransformation
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Die
Genotypen von für
die Ausführung
der Experimente eingesetzten Bakterien sind:
E. coli-Stamm
DH12S (ϕ80 dlacZ ΔM15
mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC)
araΔ139 Δ(ara,leu)7697 ΔlacX74 galU galK
rpsL deoR nupG recA1/F'proAB+
lacIq ZΔM15).
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Agrobacterium tumefaciens
pmp90C58CE
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Die
Transformation der Bakterien (E. coli-Stamm DH12S) durch ein rekombiniertes
Plasmid wird durch Elektroporation (Potter, 1993) ausgeführt. In
einem Elektroporationsgefäß (1 ml,
Breite 0,1 cm) werden 2 μl
Ligationsreaktionsmischung mit 50 μl aufgetauten und auf Eis gehaltenen
Bakterien gemischt. Das Gefäß wird dann
in ein Elektroporationsgefäß (Gene
Pulser II System: BIO-RAD, FRANKREICH) gesetzt und es wird eine Spannung
von 1,25 kV während
einer Zeitspanne, welche von dem Widerstand (200 Ω) und der
Kapazität
(25 μF)
des Stromkreises abhängig
ist, angelegt. Es wird ein ml SOC-Medium zugesetzt, um die Verwehrung
der Bakterien zu begünstigen,
und das Ganze wird in einem 10 ml-Röhrchen 2 h bei 37°C unter rotierender
Bewegung (220 Upm) inkubiert. Die transformierten Bakterien werden
dann auf Schalen, enthaltend festes LB-Medium, welches mit dem adäquaten Antibiotikum
ergänzt
ist, ausgestrichen und bei 37°C
eine Nacht lang inkubiert. Die Selektion der durch das rekombinierte
Plasmid pMeca transformierten Bakterien erfolgt durch 0,04 mg/ml
Ampicillin in Gegenwart von 0,2 mg/ml X-Gal und von 0,05 mg/ml IPTG.
Für die
anderen rekombinierten Plasmide erfolgt die Selektion der Bakterien
auf einem LB-Medium mit dem adäquaten
Antibiotikum in einer Endkonzentration von 0,04 mg/ml.
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β-Glucuronidase-Aktivität
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Für die Samenkörner erfolgt
eine Aussaat auf zwei Lagen Whatman 1M-Papier von 4,7 cm (Maindstone,
England), welche mit 2 ml sterilem Wasser durchtränkt werden.
Nach 48 h Durchtränkung
in einem mit Wasser gesättigten
Gefäß werden
die Samenkörner
angekratzt und in ein Eppendorf-Reaktionsgefäß gelegt, wozu 100 μl Infiltrationspuffer
(100 mM Phosphatpuffer, pH 7,2, 10 mM EDTA, Triton X-100, 0,1% (Vol./Vol.)), ergänzt mit
X-Gluc (5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-glucuronsäure), hinzugesetzt
wurden. Das X-Gluc wird in DMF (Dimethylformamid) zu einer Stammkonzentration:
100 μ (10
mg/100 μl)
gelöst.
Der Infiltrationspuffer wird unmittelbar vorher in einem Verhältnis von
1/100 mit der X-Gluc-Stammlösung
ergänzt.
Bei den anderen Geweben werden die Proben direkt in den Infiltrationspuffer
gegeben und die Färbung
wird dann gemäß dem gleichen
Protokoll ausgeführt.
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Die
Infiltration erfolgt unter Vakuum (in einer Vakuumglocke):
- – das
Vakuum wird zweimal aufgehoben.
- – das
Vakuum wird 1 h gehalten, dann werden die Proben über Nacht
bei 37°C
aufgestellt.
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Ergebnisse
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Die
einleitenden Analysen haben gezeigt, dass ein Enzym, das an dem
Stoffwechsel der Lipide beteiligt ist (die "Fatty Acid Hydroxylase": FAH) eine Expression
aufweisen könnte,
die dem Promotortyp mit den gesuchten Eigenschaften entspricht.
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Die
Sequenz des fraglichen Gens wurde dank der Sequenzen, die aus der
systematischen Sequenzierung des Genoms von Arabidopsis thaliana
stammen, erhalten und erweist sich als auf dem BAC T29F13 lokalisiert.
Es wurde in den Datenbanken eine exprimierte Sequenz (EST TAI234)
identifiziert und diese scheint einer Volllängen-Sequenz der mRNA der FAH
zu entsprechen. Dies hat die Identifizierung der transkribierten, nicht
translatierten 5'-Sequenz
und der vorhergesehenen Lage der Promotorsequenz erlaubt. Die Intron/Exon-Struktur
wurde auf der Ebene des transkribierten, nicht-translatierten Abschnitts,
aus dem "Alignment" des BAC mit der
EST TAI234 abgeleitet (1).
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Der
Promotor wurde durch PCR ausgehend von dem Primer pFAH/upper und
dem Primer A1, welcher in dem transkribierten, nicht-translatierten
5'-Abschnitt plaziert
ist (2), amplifiziert. Eine Untersuchung der Sequenz
hat gezeigt, dass die amplifizierte Sequenz eine mutmaßliche TATA-Box
bei –100
bp von der mutmaßlichen
Transkriptionstartstelle (gemäß der Volllängen-cDNA)
und eine CCAAT-Box bei –190
bp von eben diesem Transkriptionsstart aufweist. Das amplifizierte
PCR-Fragment (932 bp) wurde in einen Vektor pGEM-T (PROMEGA) kloniert,
sequenziert, dann in einen binären
Vektor (pBI101, Clontech), welcher ein GUS-Reportergen ohne Promotor
enthält,
(3) inseriert. Dieses Konstrukt wurde dann durch "Transformation in
planta" über Agrobakterien
in Wildtyp-Pflanzen (Ökotyp
Ws) eingeschleust. Es wurden dreizehn primäre Transformanten erhalten,
die auf ihre GUS-Aktivität
während
ihrer Entwicklung getestet wurden.
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Beispiel 2: Expression
das Reportergens unter dar Kontrolle des Pramotors des Gens der
FAH.
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Die
Expression ist ab 20 h nach dem Beginn der Durchtränkung in
dem Embryon stark. Während
der Entwicklung ist die Expression in allen Geweben mit einer gewissen
Präferenz
für die
Leitgewebe stark. Diese Ergebnisse zeigen, dass die isolierte Promotorsequenz
dem eingesetzten Reportergen (GUS) tatsächlich ein sehr spezifisches
Expressionsprofil verleiht. Der Promotor ist während der gesamten Entwicklung
der Pflanze in allen getesteten Geweben (Blätter, Blüten, Stiele, Wurzeln u.s.w...),
außer
dem Samenkorn im Verlauf der Reifung, aktiv (siehe nachstehende
Tabelle 2).
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Tabelle
1: Expressionsprofil des Reportergens GUS
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Die
Expression des Markers bestätigt
die Funktionalität
des Promotors und seine Spezifität.
Dieser Promotortyp ist folglich von sehr großer Bedeutung für biotechnologische
Anwendungen, wie die Expression eines Anti-Insekten-Toxins (Typ
Bt) in Pflanzen und die Expression eines jeglichen Transgens, welches
erlaubt, quantitativ oder qualitativ die Entwicklung und das Wachstum
der Pflanze zu verbessern, ohne dass das durch das Transgen kodierte
Protein in dem Samenkorn vorhanden ist.
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REFERENZEN
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Agrobacterium mediated gene transfer by Infiltration of adult Arabidopsis
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on Basta resistance for in planta transformation of Arabidopsis
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- Doyle J.J. und Doylle J. L. (1990). Isolation of plant DNA from
fresh tissue Focus; 12: 13–15
- Sambrook J. Fritsch E. F. und Maniatis T. (1939); Cold Spring
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