DE60024980T2

DE60024980T2 - Chimäre expressionspromotoren von commelina yellow mottle virus und cassava vein mosaic virus

Info

Publication number: DE60024980T2
Application number: DE60024980T
Authority: DE
Inventors: Iann Rance; Veronique Gruber; Manfred Theisen
Original assignee: Meristem Therapeutics SA
Current assignee: Meristem Therapeutics SA
Priority date: 1999-03-29
Filing date: 2000-03-29
Publication date: 2006-09-21
Anticipated expiration: 2020-03-30
Also published as: US6963021B2; FR2791699A1; CA2368119A1; JP2002539837A; US20030028922A1; FR2791699B1; CN1262662C; ATE313637T1; AU3316900A; AU776656B2; EP1165815A1; DE60024980D1; EP1165815B1; WO2000058485A1; CN1353763A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft chimäre Expressionspromotoren, die insbesondere zur Verwendung auf dem Gebiet der Pflanzen-Biotechnologie vorgesehen sind.
Expressionspromotoren sind allgemein auf dem Gebiet der Biotechnologie und der Genmanipulation bekannt. Sofern insbesondere die Pflanzen-Biotechnologie betroffen ist, hängt die Expressionsrate eines für ein Polypeptid codierenden Gens, das in einer Wirtszelle produziert werden soll, häufig vom verwendeten Promoter ab. Das Problem dabei ist, daß die verschiedenen, üblicherweise verwendeten Promotoren häufig einfach wegen ihrer Gewebespezifität oder ihres Expressionsvermögens auf bestimmte Anwendungen oder Gewebe beschränkt sind. Beispielsweise ist es möglich, den Blumenkohlmosaikvirus-Promoter 35S als relativ starken Promoter z. B. im Vergleich zu dem zu nennen, der vom nos-Gen stammt, wobei diese beiden Promotoren insbesondere auf dem Gebiet der Pflanzen-Biotechnologie eingesetzt werden. Somit besteht ein Bedarf an neuen Promotoren, welche die oben beschriebenen Nachteile der Anwendung der heute bekannten Promotoren überwinden können.
Über einen Versuch, dieses Problem zu lösen, wurde in der PCT-Anmeldung mit der Veröffentlichungsnummer WO 97/48819 berichtet, die vom Cassava Vein Mosaic Virus (CsVMV) abgeleitete Promotoren beschreibt, die alle einen Abschnitt einer Nukleinsäuresequenz mit 18 aufeinanderfolgenden Nukleotiden umfassen, deren Homologie zu einer in der Anmeldung genannten Referenzsequenz mindestens 80% beträgt. Die in der vorliegenden Beschreibung und in den vorliegenden Ansprüchen verwendeten Begriffe haben, sofern nichts anderes angegeben ist, die folgenden Bedeutungen:

– „Nukleinsäure" steht für DNA oder RNA;
– eine „Nukleinsäuresequenz" steht für ein einsträngiges oder doppelsträngiges Oligomer oder Polymer aus Nukleotidbasen, das vom 5'-Ende zum 3'-Ende hin gelesen wird, und umfasst selbstreplizierende Plasmide, Gene, DNA- oder RNA-Polymere, infektiöse oder nicht-infektiöse und funktionale oder nicht-funktionale DNA oder RNA. Bei der in der vorliegenden Anmeldung verwendeten Nukleotid-Notation, und sofern nichts anderes angegeben ist, handelt es sich beim linken Ende einer einsträngigen Nukleotidsequenz einfach um das 5'-Ende;
– „abgeleitete Nukleinsäuresequenz" bedeutet, dass die Sequenz direkt oder indirekt von der Sequenz abgeleitet ist, auf die sie sich bezieht, z. B. durch Substitution, Deletion, Addition, Mutation, Fragmentation und/oder Synthese eines oder mehrerer Nukleotide;
– „Promoter" oder „Promoter-Nukleinsäuresequenz" steht für einen Bereich einer Nukleinsäure stromaufwärts des Translationsstartcodons, der direkt an der Erkennung und Bindung von RNA-Polymerase und anderen zur Transkription notwendigen Proteinen beteiligt ist;
– ein „Pflanzen-Promoter" ist ein Promoter, der in der Lage ist, eine Transkription in Pflanzenzellen zu initiieren;
– ein „konstitutiver Promoter" ist ein Promoter, der in der Lage ist, operabel mit ihm verknüpfte Nukleinsäuresequenzen in allen oder im wesentlichen allen Geweben des Wirtsorganismus während der gesamten Entwicklung des Organismus zu exprimieren;
– ein „gewebespezifischer Promoter" ist ein Promoter, der in der Lage ist, operabel mit dem Promoter verknüpfte Nukleinsäuresequenzen in gewissen spezifischen Geweben des Wirtsorganismus selektiv zu exprimieren;
– „operabel verknüpft mit" bedeutet die Verknüpfung des Promoters mit der Nukleinsäuresequenz oder dem Gen, die/das für ein zu produzierendes Polypeptid codiert, dergestalt, dass der Promoter die Transkription der verknüpften Nukleinsäuresequenz direkt steuert. Es versteht sich, dass die Promoter-Sequenz auch transkribierte Sequenzen enthält, die zwischen dem Transkriptionsstartort und dem Translations-Start-Codon liegen;
– „Expressionskassette" steht für Nukleotidsequenzen, die in der Lage sind, die Expression einer Nukleinsäuresequenz oder eines Gens, die/das für ein Polypeptid codiert, das in einem mit solchen Sequenzen kompatiblen Wirtsorganismus produziert werden soll, zu steuern. Solche Expressionskassetten umfassen mindestens einen Promoter und ein Transkriptionsterminationssignal sowie gegebenenfalls andere für die Expression notwendige oder brauchbare Faktoren;
– „Vektor" bedeutet Expressionssysteme, z. B. DNA-beschichtete Geschosse, Nukleinsäure-basierte Übergangsvehikel, Nukleinsäuremoleküle, die zur Abgabe von Nukleinsäure eingerichtet sind, und zirkuläre, selbst-replizierende autonome DNA, z. B. Plasmide, Cosmide, Phagemide usw. Wenn ein rekombinanter Mikroorganismus oder eine rekombinante Zellkultur als Wirt für einen Expressionsvektor beschrieben wird, kann dies auch zirkuläre, extrachromosomale DNA (wie z. B. Mitochondrien- oder Chloroplasten-DNA) umfassen, wenn DNA in das (die) Chromosom(en) des (der) Wirte(s) integriert wurde, wobei der Vektor entweder während der Mitose als autonome Struktur mit den Zellen stabil repliziert, in das Wirtsgenom integriert oder im Kern oder Zytoplasma des Wirtes gehalten wird;
– „Plasmid" steht für ein Molekül einer zirkulären, autonomen DNA, das zur Replikation innerhalb einer Zelle in der Lage ist, und umfasst sowohl als „Expressionsplasmide" bezeichnete wie auch als „Nicht-Expressionsplasmide" bezeichnete Plasmide. Wenn ein rekombinanter Mikroorganismus oder eine rekombinante Zellkultur in der vorliegenden Anmeldung als Wirt für ein „Expressionsplasmid" beschrieben wird, steht dies sowohl für Moleküle von zirkulärer, extrachromosomaler DNA als auch für DNA, die in das Wirtschromosom integriert wurde. Wird das Plasmid in einem Zellwirt gehalten, so wird es entweder während der Mitose als autonome Struktur mit den Zellen stabil repliziert oder in das Wirtsgenom integriert;
– „heterologe Sequenz" oder „heterologe Nukleinsäuresequenz" steht für eine Sequenz, die von einer Quelle oder einer Spezies stammt, die ihrer natürlichen Umgebung fremd ist, oder die, wenn sie aus derselben Umgebung stammt, gegenüber ihrer nativen Form modifiziert wurde. Die Modifikation der Nukleinsäuresequenz kann z. B. durch Behandlung der Nukleinsäure mit einem Restriktionsenzym erfolgen, um ein Nukleinsäurefragment zu erzeugen, das mit einem Promoter operabel verknüpfbar ist. Die Modifikation kann auch mit solchen Techniken, wie ortsspezifischer oder ortsgerichteter Mutagenese, durchgeführt werden;
– „Box" steht für eine Nukleinsäuresequenz, der eine Regulierungsfunktion zugeschrieben wird;
– „-artig" bedeutet, dass die Box und/oder die Nukleinsäuresequenz, auf die sich der Begriff bezieht, eine gewisse Sequenzübereinstimmung oder -gemeinsamkeit mit einer bekannten Referenz-Box und/oder -Nukleinsäuresequenz und vorzugsweise mindestens 50% Sequenzübereinstimmung, noch bevorzugter eine Sequenzübereinstimmung von mindestens 75% und besonders bevorzugt eine Sequenzübereinstimmung von mindestens 90% mit der Referenzsequenz aufweist. Der prozentuale Anteil der Sequenzübereinstimmung wird ausgehend von einem Vergleichsfenster von mindestens 6 benachbarten Nukleotidbasen berechnet. Die Bestimmung eines Vergleichsfensters kann mit Sequenz-Alignment-Algorithmen zur Bestimmung einer Homologie mit einer Referenzsequenz, z. B. mit dem lokalen Homologiealgorithmus, dem Homologie-Alignment-Algorithmus und dem Ähnlichkeitssuche-Algorithmus, erfolgen, wobei diese Algorithmen auch in elektronischer oder computerisierter Form unter den Bezeichnungen GAP, BESTFIT, FASTA und TFASTA existieren. Der prozentuale Anteil der Sequenzübereinstimmung wird durch einen Vergleich der Referenzsequenz mit der Box und/oder der Nukleinsäuresequenz erhalten;
– „gelegen" steht für die Position eines identifizierten Elementes, wie einer „Box", einer Restriktionsenzymstelle oder eines Codons mit einer bestimmten Funktion, auf einer Nukleinsäuresequenz. Die angegebene Position ist durch eine Zahl angezeigt, die sich auf die Startposition des Elementes in der Nukleinsäuresequenz in Richtung des Leserahmens der letzteren bezieht, d.h. die sich meist, sofern nichts anderes angegeben ist, von 5' bis 3' erstreckt;
– „transgene Pflanze" steht für eine Pflanze, die mit Genmanipulationstechniken erhalten wurde, und umfasst ganze dadurch erhaltene Pflanzen, deren Nachkommenschaft sowie deren lebenswichtige Pflanzenorgane, wie z. B. Wurzeln, Stiele und Blätter, die mit diesen Techniken erhalten wurden. Die transgenen Pflanzen gemäß der vorliegenden Erfindung können unterschiedliche Ploidie-Grade aufweisen und insbesondere polyploid, diploid und haploid sein;
– „Propagul" bedeutet eine strukturierte oder unstrukturierte Ansammlung oder Anordnung oder Assoziation von Pflanzenzellen, aus denen eine ganze Pflanze regeneriert werden kann, wie z. B. Explantate, Kalli, Stiele, Blätter, Wurzeln, Schnitte und auch Samen.

Der Anmelder der vorliegenden Erfindung wählte einen anderen Ansatz als der Anmelder der zuvor erörterten PCT-Patentanmeldung. Tatsächlich gelang es dem gegenwärtigen Anmelder durch einen glücklichen Zufall, chimäre Promotoren herzustellen, die der zuvor beschriebenen Anforderung genügen und diese erfüllen können und die insbesondere in der Lage sind, die Expressionsrate eines Gens oder einer Nukleinsäuresequenz, das/die für ein zu produzierendes Polypeptid in einer Wirtszelle und insbesondere in einer Pflanzenzelle oder einer regenerierten Pflanze codiert, gegenüber den bereits vorhandenen, am häufigsten eingesetzten Promotoren zu erhöhen. Ferner gelang es dem Anmelder auch, eine vollständige Familie von Promotoren zu produzieren, um den Promoter wählen zu können, der für die vorgesehene Aufgabe oder Anwendung und für die Umgebung, in der er eingesetzt werden soll, am besten geeignet ist, und somit die Expressionsrate eines zu exprimierenden Gens, das für ein zu produzierendes Polypeptid codiert, bis zu einem gewissen Grad kontrollierbar zu machen.
Folglich ist eines der Ziele der vorliegenden Erfindung ein chimärer Expressionspromoter mit mindestens einer Nukleinsäuresequenz, die von einem ersten Pflanzen-Promoter mit einem pflanzlichen, vaskulären Expressionspromoterbereich abgeleitet ist, der durch eine Nukleinsäuresequenz ersetzt ist, die von einem zweiten Pflanzen-Promoter abgeleitet ist und einen pflanzlichen Grüngewebe-Expressionspromoterbereich umfasst.
Vorzugsweise stammt der erste Pflanzen-Promoter vom Commelina Yellow Mottle Virus (CoYMV) und der zweite Pflanzen-Promoter vom Cassava Vein Mosaic Virus (CsVMV). Noch bevorzugter stammen die Promoter-Nukleinsäuresequenzen von den intergenischen Regionen des ersten und des zweiten Promoters.
Bei einer besonders bevorzugten Ausführungsform weist der chimäre Expressionspromoter zumindest einen Teil einer Nukleinsäuresequenz auf, die mit der Nummer SEQ.ID01 gekennzeichnet und zumindest mit einem Teil einer Nukleinsäuresequenz fusioniert ist, welche mit der Nummer SEQ.ID02 gekennzeichnet ist. Bei einer noch bevorzugteren Ausführungsform ist der erfindungsgemäße chimäre Promoter aus der Gruppe ausgewählt, die aus den mit den Nummern SEQ.ID03, SEQ.ID04, SEQ.ID05, SEQ.ID06 und SEQ.ID07 gekennzeichneten Nukleinsäuresequenzen besteht.
Gemäß einem anderen Ziel der vorliegenden Erfindung stellte der Anmelder fest, dass es möglich ist, besonders aktive chimäre Expressionspromotoren ausgehend von einem Basispromoter viralen Ursprungs herzustellen, von dem ein Teil aus einem exogenen Element besteht, das in der Lage ist, die Expression von pflanzlichem Grüngewebe (GT) zu fördern. Vorzugsweise ist auch das exogene GT-Promoterelement viralen Ursprungs. Ferner und gemäß einer bevorzugten Ausführungsform dieses Aspektes der Erfindung stammt der Promoter viralen Ursprungs vom Commelina Yellow Mottle Virus (CoYMV).
Vorzugsweise stammt das exogene Promoterelement vom Cassava Vein Mosaic Virus (CsVMV). Noch bevorzugter ersetzt das exogene GT-Element das endogene Element, das in der Lage ist, die Expression vaskulären Gewebes (VT) des Promoters viralen Ursprungs zu fördern.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der zuvor definierten, oben erwähnten Ziele der Erfindung weisen die chimären Promoter ferner mindestens eine „Endosperm-artige" Box, noch bevorzugter 4 bis 10 „Endosperm-artige" Boxen und besonders bevorzugt 6 „Endosperm-artige" Boxen auf.
Gemäß einer anderen bevorzugten Ausführungsform weisen die Promotoren ferner mindestens eine „as1-artige" Box auf, die mit dem pflanzlichen Grüngewebe (GT)-Promoterelement operabel verknüpft ist.
Gemäß wiederum einer weiteren bevorzugten Ausführungsform weisen die Promotoren der vorliegenden Erfindung mindestens eine „as1"-Box auf, die mit dem pflanzlichen Grüngewebe (GT)-Promoterelement operabel verknüpft ist.
Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform weisen die Promotoren ferner mindestens eine „as2"-Box auf, die mit dem pflanzlichen Grüngewebe (GT)-Promoterelement operabel verknüpft ist.
Vorzugsweise ist/sind die eine oder mehreren „as1-artigen", „as1"- und „as2"-Boxen stromaufwärts oder stromabwärts des pflanzlichen Grüngewebe (GT)-Promoterelementes operabel verknüpft.
Noch bevorzugter ist/sind die eine oder mehreren „as1-artigen", „as1"- und „as2"-Boxen in normaler (5' > 3') oder umgekehrter (3' > 5') Ausrichtung operabel verknüpft.
Besonders bevorzugt weist der Promoter mindestens eine „as2/as2/as2"-Box in normaler (5' > 3') oder umgekehrter (3' > 5') Ausrichtung auf.
Der zuvor beschriebene Promoter ist vorzugsweise aus der Gruppe ausgewählt, die aus den mit den Nummern SEQ.ID01, SEQ.ID02, SEQ.ID03, SEQ.ID04, SEQ.ID05, SEQ.ID06, SEQ.ID07, SEQ.ID19, SEQ.ID20, SEQ.ID21, SEQ.ID22, SEQ.ID23, SEQ.ID24 und SEQ.ID25 gekennzeichneten Nukleinsäuresequenzen besteht.
Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist eine Expressionskassette mit mindestens einer Nukleinsäuresequenz, die von einem ersten Pflanzen-Promoter mit einem pflanzlichen, vaskulären Expressionspromoterbereich abgeleitet ist, der durch eine Nukleinsäuresequenz ersetzt ist, die von einem zweiten Pflanzen-Promoter abgeleitet ist und einen pflanzlichen Grüngewebe-Expressionspromoterbereich aufweist, wobei die Promoter-Nukleinsäuresequenzen mit einer (einem) für ein herzustellendes Polypeptid codierenden Nukleinsäuresequenz oder Gen operabel verknüpft sind, die (das) wiederum mit einer Transkriptionsterminations-Nukleinsäuresequenz operabel verknüpft ist.
Vorzugsweise und gemäß dieser Ausführungsform stammen der erste pflanzliche Promoter vom Commelina Yellow Mottle Virus (CoYMV) und der zweite pflanzliche Promoter vom Cassava Vein Mosaic Virus (CsVMV). Noch bevorzugter weist die Expressionskassette zumindest einen Teil einer Nukleinsäuresequenz auf, die mit der Nummer SEQ.ID01 gekennzeichnet und mit zumindest einem Teil einer Nukleinsäuresequenz fusioniert ist, welche mit der Nummer SEQ.ID02 gekennzeichnet ist.
Noch bevorzugter ist die Nukleinsäuresequenz des chimären Promoters der Expressionskassette aus der Gruppe ausgewählt, die aus den mit den Nummern SEQ.ID03, SEQ.ID04, SEQ.ID05, SEQ.ID06, SEQ.ID07, SEQ.ID19, SEQ.ID20, SEQ.ID21, SEQ.ID22, SEQID.23, SEQ.ID24 und SEQ.ID25 gekennzeichneten Sequenzen besteht.
Gemäß einem weiteren Ziel der vorliegenden Erfindung wird eine isolierte Promoter-Nukleinsäuresequenz bereitgestellt, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus den mit den Nummern SEQ.ID03, SEQ.ID04, SEQ.ID05, SEQ.ID06, SEQ.ID07, SEQ.ID19, SEQ.ID20, SEQ.ID21, SEQ.ID22, SEQ.ID.23, SEQ.ID24 und SEQ.ID25 gekennzeichneten Sequenzen besteht.
Noch ein weiteres Ziel der Erfindung betrifft Desoxynukleotid-Bausteine zur Herstellung von Promotoren oder Promoter-Nukleinsäuresequenzen der oben definierten Art. Diese Bausteine können sein:

– „direktionale" Bausteine, d.h. Sequenzen, die in derselben Richtung wie der Leserahmen der letzten Promotersequenz, üblicherweise vom 5'-Ende zum 3'-Ende, gelesen werden können, und/oder
– „Führungs"-Bausteine, d.h. Sequenzen, deren Enden Nukleotidbasen aufweisen, welche die Enden der direktionalen Bausteine überlappen.

Auf diese Weise entspricht der direktionale Baustein vorzugsweise mindestens einer Sequenz, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus den mit den Nummern SEQ.ID08, SEQ.ID09, SEQ.ID10, SEQ.ID11, SEQ.ID13 und SEQ.ID14 gekennzeichneten Sequenzen besteht.
Zudem ist es bevorzugt, eine Desoxynukleotid-„Führung" zu verwenden, die mindestens einer Sequenz entspricht, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus den mit den Nummern SEQ.ID15, SEQ.ID16, SEQ.ID17 und SEQ.ID18 gekennzeichneten Sequenzen besteht.
Noch ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist ein Vektor mit einem Promoter oder einer Promoter-Nukleinsäuresequenz, der in der Lage ist, die Transkription einer Nukleinsäuresequenz oder eines Gens, die (das) für ein herzustellendes Polypeptid codiert, zu initiieren, wobei der Promoter oder die Promoter-Nukleinsäuresequenz einem chimären Expressionspromoter oder einer Promoter- Nukleinsäuresequenz der oben vorbeschriebenen Art entspricht.
Der Vektor ist vorzugsweise aus der Gruppe ausgewählt, die aus den binären Vektoren pMRT1152, pMRT1171, pMRT1172, pMRT1185, pMRT1186, pMRT1187, pMRT1188, pMRT1182, pMRT1245, pMRT1246, pMRT1247, pMRT1248, pMRT1249, pMRT1250, pMRT1251, pMRT1252, pMRT1253 und pMRT1254 besteht.
Schließlich besteht ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung in einem Verfahren zur Herstellung eines chimären Expressionspromoters oder einer isolierten Promoter-Nukleinsäuresequenz der zuvor beschriebenen Art, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst:

– Durchführen einer als LCR bezeichneten Ligationskettenreaktion zur Herstellung einer einsträngigen, kontinuierlichen DNA aus mindestens einem Desoxynukleotid-Baustein, der aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus den „direktionalen" Desoxynukleotid-Bausteinen S1, S2, S3, S4, S5, S6 und S7 besteht, welche jeweils mit den Nummern SEQ.ID08, SEQ.ID09, SEQ.ID10, SEQ.ID11, SEQ.ID12, SEQ.ID13 bzw. SEQ.ID14 gekennzeichnet sind, und aus mindestens einem „Führungs"-Desoxynukleotid-Baustein für die Promoter-Nukleinsäuresequenz oder für den Promoter, der ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus den Führungsdesoxynukleotiden G1, G2, G3 und G4 besteht, welche jeweils mit den Nummern SEQ.ID15, SEQ.ID16, SEQ.ID17 bzw. SEQ.ID18 gekennzeichnet sind;
– Durchführen einer PCR-Amplifikation der im vorhergehenden Schritt erhaltenen, einsträngigen DNA zur Herstellung einer doppelsträngigen DNA, die dem chimären Expressionspromoter oder der Promoter-Nukleinsäuresequenz entspricht;
– gegebenenfalls Isolieren des Promoters oder der Promoter-Nukleinsäuresequenz.

Vorteilhaft und bevorzugt werden die Desoxynukleotid-Bausteine vor der Ligation phosphoryliert. Noch bevorzugter wird die Ligation in Gegenwart mindestens einer DNA-Ligase in einem Thermozyklus unter den folgenden Bedingungen durchgeführt:

– ein Zyklus von etwa einer Minute bei etwa 94°C;
– acht identische Zyklen, die jeweils aus den folgenden Schritten bestehen:
– eine Minute bei 65°C, eine Mintue bei 57°C, eine Minute bei 52°C, eine Minute bei 48°C, eine Minute bei 43°C und zehn Minuten bei 37°C.

Noch ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist eine transgene Pflanze, in deren Genom mindestens ein Promoter oder mindestens eine Promoter-Nukleinsäuresequenz der zuvor definierten Art stabil integriert ist. Die transgene Pflanze ist vorzugsweise unter zweikeimblättrigen Arten, bevorzugt unter Kartoffel, Tabak, Baumwolle, Kopfsalat, Tomate, Melone, Gurke, Erbse, Raps, Canola, Zuckerrübe oder Sonnenblume, oder unter einkeimblättrigen Arten, vorzugsweise Weizen, Gerste, Hafer, Reis oder Mais, ausgewählt.
Wiederum ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist ein Propagul einer transgenen Pflanze der zuvor definierten Art, bei dem es sich vorzugsweise um einen Samen handelt.
Gemäß der vorliegenden Erfindung ist ein weiteres Ziel eine Zelle, die einen Promoter oder eine Promoter-Nukleinsäuresequenz der zuvor definierten Art enthält, und vorzugsweise ist die Zelle eine Pflanzenzelle.
Gemäß einem weiteren Ziel der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Expression einer/eines für ein herzustellendes Polypeptid codierenden Nukleinsäuresequenz oder Gens durch die Zelle bereitgestellt, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst:

– Transformieren einer Zelle mit einem Vektor, der mindestens einen Promoter oder mindestens eine Promoter-Nukleinsäuresequenz der zuvor definierten Art aufweist;
– Kultivieren der Zelle unter Bedingungen, welche die Expression der/des für das Polypeptid codierenden Nukleinsäuresequenz oder Gens und deren/dessen Herstellung ermöglichen. Die Zelle ist vorzugsweise eine prokaryontische oder eukaryontische Zelle und ist besonders bevorzugt aus der Gruppe ausgewählt, die aus mikrobiellen Zellen, Algen- und Mikroalgenzellen, Pilz-, Insekten-, Tier-, Säugetier-, Menschen- und Pflanzenzellen besteht, und ist am bevorzugtesten eine Pflanzenzelle.

Gemäß wiederum einem weiteren Ziel der vorliegenden Erfindung wird ein Herstellungsverfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze oder eines Propaguls bereitgestellt, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst:

– Transformieren einer Pflanzenzelle mit einem Vektor, der mindestens einen Promoter oder mindestens eine Promoter-Nukleinsäuresequenz der zuvor definierten Art aufweist;
– Auswählen der Pflanzenzelle, in welche der Promoter oder die Promoter-Nukleinsäuresequenz integriert ist;
– Propagieren der ausgewählten, transformierten Pflanzenzelle durch Kultivierung oder durch Regeneration ganzer chimärer oder transgener Pflanzen.

KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
Die Erfindung wird durch die folgende detaillierte Beschreibung einer oder mehrerer bevorzugter Ausführungsformen, die lediglich als nicht einschränkende Beispiele angegeben sind, und unter Bezugnahme auf die beigefügte Zeichnung noch besser verständlich. Es zeigen:
die I, II und III schematisch die Strukturen der vergleichbaren Referenz-Konstrukte, wodurch ein Vergleich der chimären Promotoren der vorliegenden Erfindung mit den bereits bekannten und verwendeten ermöglicht wird. In I enthält die betreffende Konstruktion das Reportergen, das für β-Glucuronidase in völliger Abwesenheit einer Promoter-Sequenz an sich codiert, und ist damit als negative Kontrolle geeignet.
II schematisch ein Konstrukt, welches das β-Glucuronidase-Gen unter der Kontrolle des CaMV-Doppel-35S-Promoters enthält, das als starke Referenzkontrolle geeignet ist.
III ein Konstrukt, das als interne Referenz für die Versuche zur transienten Expression geeignet ist und das Reporter-Gen enthält, welches unter der Kontrolle des CaMV 35S-Promoters für eine Luciferase codiert;
IV schematisch die Struktur mehrerer bevorzugter Ausführungsformen von chimären Promotoren, die gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellt sind. Die chimären Promotoren MPr1116 und MPr1117 wurden mit der als Ib-PCR bezeichneten Technik erhalten. MPr1146 und MPr1147 wurden durch Klonieren der Aktivatorelemente as1 und as2 des CaMV-Promoters an der Restriktionsenzymstelle DraIII erhalten. Der Promoter MPr1154 wurde durch Deletion der beiden „as-1-artigen" Sequenzen aus dem in der 5'-Region von MPr1147 vorhandenen CoYMV-Promoter erhalten. Alle diese Promotoren wurden an den Restriktionsstellen PstI und BamHI in den Vektor pMRT1144 kloniert, um eine Transkriptionsfusion mit dem Reportergen uidA zu erhalten;
V die histochemische Färbung von Tabakblättern, die mit unterschiedlichen Promotoren gemäß der vorliegenden Erfindung transformiert wurden. Die Tabakblätter wurden durch ein biolistisches Verfahren unter Verwendung einer von BIORAD erhältlichen „PDS1000/He"-Genkanone unter folgenden Bedingungen transformiert: gebrochene Berstscheiben bei 900 psi, 2 μg DNA, die über zwei aufeinanderfolgende Beschüsse bombardiert wurde, wobei die Geschosse aus Goldperlen oder -kugeln mit einem Durchmesser von etwa 1 μm bestanden und das Pflanzenmaterial zunächst 6, dann 9 cm vom Makrocarrier positioniert war. Nach dem Beschuss wurden die Blätter in einem Kulturschrank 48 Stunden im Dunkeln inkubiert, um die Expression des Reportergens zu ermöglichen. Dann wurden die Blätter in 0,1 M Phosphatpuffer, der 2 mg/ml X-Glu enthielt, 24 bis 48 Stunden bei 37°C inkubiert und anschließend in einem 70%igen Ethanolbad gebleicht.
VI einen Graphen zum Vergleich der relativen Promoteraktivität der unterschiedlichen Konstrukte nach transienter Expression in Tabakblättern. Drei Tage nach dem Beschuss wurden die Blätter gemahlen, und dann wurde der Rohextrakt mittels Zentrifugation geklärt. Die β-Glucuronidase- und die Luciferaseaktivität wurden mittels fluorimetrischer Verfahren bei Rohextrakt-Aliquots gemessen; dann wurde das Verhältnis von GUS-Aktivität/LUC-Aktivität bestimmt. Die Histogramme entsprechen dem Mittel der Verhältnisse für ein bestimmtes Konstrukt +/– Standardfehler des Mittelwertes;
VII schematisch andere bevorzugte Ausführungsformen chimärer Promotoren gemäß der vorliegenden Erfindung, wobei:
die dunklen, scheibenförmigen Symbole für das Grüngewebeexpressionsspezifische Element stehen;
die kleinen weißen, parallelepipedförmigen Symbole für die „Endospermartigen" Boxen stehen;
die kleinen und großen, schwarz schraffierten Parallelepipede jeweils für die „as-2"- und die „as-1"-Boxen des CaMV-Promoters stehen.
VIII einen Vergleich der relativen Aktivität der unterschiedlichen erfindungsgemäßen Promotoren in Experimenten zur transienten Expression in Maisalbumin, wobei die β-Glucuronidase- und die Luciferase-Aktivität mittels Fluorimetrie mit einem Rohextrakt-Aliquot bestimmt wurden. Die Histogramme entsprechen dem Mittel für eine bestimmte Konstruktion +/– Standardfehler des Mittelwertes;
IX einen Vergleich der relativen Aktivität der chimären Promotoren MPr1116, MPr1146, MPr1167 und des Referenz-Promoters MPr1092, bewertet bei stabiler Tabakexpression. Von jedem primären Transformanten wurden Proben 2, 4, 6, 8 und 10 Wochen nach dem Transfer der Pflanzen in das Gewächshaus genommen. Die β-Glucuronidaseaktivität jeder Probe wurde bestimmt und gegenüber der Gesamtmenge an Gesamtprotein gewichtet. Für jede Transformantenreihe wurden die Aktivitäten zu einem bestimmten Zeitpunkt in absteigender Reihenfolge klassifiziert und verglichen;
X einen Vergleich der relativen Aktivität der chimären Promotoren MPr1162, MPr1164, MPr1165, MPr1167 und des Referenz-Promoters MPr1092, bewertet bei stabiler Tabakexpression. Von jedem primären Transformanten wurden Proben 2, 4, 6, 8 und 10 Wochen nach dem Transfer in das Gewächshaus genommen. Die β-Glucuronidaseaktivität jeder Probe wurde bestimmt und gegenüber der Gesamtmenge an Protein gewichtet. Für jede Transformantenreihe wurden die Aktivitäten zu einem bestimmten Zeitpunkt in absteigender Reihenfolge klassifiziert und verglichen.
In den verschiedenen Figuren haben bestimmte Begriffe die folgenden Bedeutungen:

– uidA = die Sequenz, die für β-Glucuronidase codiert;
– IV2 = das Patatin-Genintron;
– nos term = der Terminator des Nopalin-Synthasegens;
– 35S term = der RNA 35S CaMV-Terminator;
– CaMV = das Blumenkohlmosaikvirus;
– as-1 = Aktivierungssequenz 1 des CaMV 35S-Promoters;
– as-2 = Aktivierungssequenz 2 des CaMV 35S-Promoters;
– B = die Endonukleaserestriktionsstelle BamHI;
– E = die Endonukleaserestriktionsstelle EcoRI;
– H = die Endonukleaserestriktionsstelle HindIII;
– P = die Endonukleaserestriktionsstelle PstI;
– Sp = die Endonukleaserestriktionsstelle SphI.
– D = die Endonukleaserestriktionsstelle DraIII;
– N = die Endonukleaserestriktionsstelle NdeI;
– S = die Endonukleaserestriktionsstelle SpeI;
– CoYMV = das Commelina Yellow Mottle Virus;
– CsVMV = das Cassava Vein Mosaic Virus;
– TATA = die TATA-Box;
– +1 = der Transkriptionsstartort;
– „-artig" bedeutet, dass die Sequenz nicht 100%ig homolog zu der Sequenz ist, auf die sie sich bezieht, wie dies zuvor definiert wurde.

BEISPIELE
Beispiel 1
Vergleichskonstrukte (Kontrollen)
Um einen Vergleich zwischen den chimären Promotoren der vorliegenden Erfindung und den bekannten und derzeit verwendeten chimären Promotoren zu ermöglichen, wurde das uidA-Gen, das für β-Glucuronidase codiert (Jefferson et al., 1986) und die Intron IV2-Sequenz des Kartoffel-Patatingens ST-LS1 (Vancanneyt et al., 1990) (uidA-IV2) enthält, unter Kontrolle eines der Promotoren und des Terminators des Nopalin-Synthasegens (nos term) von Agrobacterium tumefaciens in das Plasmid pGEM3Z, das von Promega Corp. (Madison, USA) kommerziell erhältlich ist, eingebracht.
1.1. Konstruktion der negativen Kontrolle pMRT1144
Um die Klonierung zu erleichtern, wurde ein von pGEM3Z abgeleitetes Plasmid, das nur die Sequenzen „uidA-IV2/nos term" enthielt und dem jegliche Promotersequenz fehlte, hergestellt. Dieses Plasmid wurde als pMRT1144 bezeichnet und diente als negative Kontrolle (I).
Zur Insertion der uidA/nos term-Sequenz in pGEM3Z wurden die uidA-Sequenz unter der Kontrolle des vollständigen Promoters des Erbsen-Plastocyaningens und der Nopalinsynthase-Terminator aus 5 μg des Plasmids pGA492-PpetE. isoliert. Dieses Plasmid war durch Klonierung in das Plasmid pGA492-Pem2-uidA erhalten worden, wobei der petE-Promoter vom Erbsen-Plastocyaningen des Plasmids pKHn2 (Pwee et Gray, 1993) und nicht vom em2-Promoter (Gaubier et al., 1993) stammte, der wiederum vom Plasmid bp I221-Pem2 stammt. Das Plasmid bp I221-Pem2 wurde 1 Stunde bei 37°C mit je 20 Einheiten der Enzyme HindIII und EcoRI verdaut. Dann wurde die Expressionskassette „Pem2/uidA/nos term" mittels Elektrophorese auf 0,8% Agarosegel aufgetrennt, elektroeluiert, in Gegenwart von 1/10 Volumen 3M Natriumacetat, pH 4,8, und 2,5 Volumina absolutem Ethanol 30 Minuten bei –80°C präzipitiert, 30 Min. bei 12000 g zentrifugiert, in 70% Ethanol gewaschen, getrocknet, in Wasser resuspendiert und an den HindIII- und EcoRI-Stellen des Plasmids pGA492 (An, 1986) insertiert, das zuvor von diesen beiden Enzymen 1 h bei 37°C verdaut worden war, in Gegenwart von 1/10 Volumen 3M Natriumacetat, pH 4,8, und 2,5 Volumina absolutem Ethanol 30 Min. bei –80°C präzipitiert, 30 Min. bei 12000 g zentrifugiert, in 70% Ethanol gewaschen, getrocknet und dann in Wasser resuspendiert. Die Ligation wurde 16 h bei 14°C in Gegenwart von 1,0 μl T4 10X DNA-Ligasepuffer (Amersham) und 2,5 Einheiten T4 DNA-Ligase (Amersham) durchgeführt.
Zuvor hergestellte, lebensfähige und kompetente Escherichia coli DH5α-Bakterien wurden transformiert (Hannahan, 1983). Die Plasmid-DNA der erhaltenen Klone, selektiert auf mit Tetracyclin (12 mg/l) ergänztem Luria-Bertani-Medium (LB, 10 g/l Bactotrypton, 5 g/l Hefeextrakt, 10 g/l NaCl, 15 g/l Agar), wurde gemäß dem alkalischen Lyseverfahren (Birnboim und Doly, 1983) extrahiert und durch enzymatischen Verdau analysiert.
Ausgehend vom erhaltenen pGA492-Pem2-uidA-Plasmid, wurde der Promoter Pem2 mittels Doppelverdau mit HindIII und XbaI deletiert. Das Plasmidfragment wurde mittels Elektrophorese auf 0,8% Agarosegel aufgetrennt, elektroeluiert, in Gegenwart von 1/10 Volumen 3M Natriumacetat, pH 4,8, und 2,5 Volumina absolutem Ethanol 30 Min. bei –80°C präzipitiert, 30 Min. bei 12000 g zentrifugiert, in 70% Ethanol gewaschen, getrocknet und 30 Min. bei 37°C einem Klenow-Fragment von DNA-Polymerase I (New England Biolabs) nach den Empfehlungen des Herstellers ausgesetzt. Dann wurde es durch Extraktion eines Volumens von Phenol, dann eines Volumens Phenol : Chloroform : Isoamylalkohol (25:24:1 v/v/v) und schließlich eines Volumens Chloroform : Isoamylalkohol (24:1 v/v) deproteiniert, in Gegenwart von 1/10 Volumen 3M Natriumacetat, pH 4,8, und 2,5 Volumina absolutem Ethanol 30 Min. bei –80°C präzipitiert, dann 30 Min. bei 12000 g zentrifugiert, in 70% Ethanol gewaschen, getrocknet und in Wasser resuspendiert. Dann wurde es 1 h bei 37°C unter Verwendung von 10 Einheiten alkalischer Phosphatase aus Kalbsdarm (Boehringer Mannheim) gemäß den Empfehlungen des Herstellers dephosphoryliert, durch Extraktion mit einem Volumen Phenol, dann mit einem Volumen Phenol : Chloroform : Isoamylalkohol (25:24:1 v/v/v) und schließlich einem Volumen Chloroform : Isoamylalkohol (24:1 v/v) deproteiniert, in Gegenwart von 1/10 Volumen 3M Natriumacetat, pH 4,8, und 2,5 Volumina absolutem Ethanol 30 Min. bei –80°C präzipitiert, dann 30 Min. bei 12000 g zentrifugiert, in 70% Ethanol gewaschen, getrocknet und dann in Wasser resuspendiert. Das resultierende Plasmid wurde als pGA492ΔPem2 bezeichnet.
Parallel dazu wurde der Promoter petE (818 bp), der dem Promoter des Erbsen-Plastocyaningen entspricht, aus dem Plasmid pKHn2 durch 1-stündigen Verdau mit Ncol bei 37°C erhalten. Das 828 bp Promoter-Fragment wurde auf 0,8% Agarosegel isoliert, elektroeluiert, in Gegenwart von 1/10 Volumen 3M Natriumacetat, pH 4,8, und 2,5 Volumina absolutem Ethanol 30 Min. bei –80°C präzipitiert, 30 Min. bei 12000 g zentrifugiert, in 70% Ethanol gewaschen, getrocknet, in Wasser resuspendiert, dann 30 Min. bei 30°C der Einwirkung von 5 Einheiten Mungbohnen-Nuclease (New England Biolabs) gemäß den Empfehlungen des Herstellers unterzogen, durch Extraktion mit einem Volumen Phenol, dann einem Volumen Phenol : Chloroform : Isoamylalkohol (25:24:1 v/v/v) und schließlich einem Volumen Chloroform : Isoamylalkohol (24:1 v/v) deproteiniert, in Gegenwart von 1/10 Volumen 3M Natriumacetat, pH 4,8, und 2,5 Volumina absolutem Ethanol 30 Min. bei –80°C präzipitiert, dann 30 Min. bei 12000 g zentrifugiert, in 70% Ethanol gewaschen, getrocknet und dann in Wasser resuspendiert.
Dieses Promoter-Fragment wurde 16 h bei 14°C in Gegenwart von 1,0 μl T4 10X DNA-Ligasepuffer (Amersham) und 2,5 Einheiten T4 DNA-Ligase (Amersham) in das oben beschriebene Plasmid pGA492ΔPem2 insertiert. Zuvor hergestellte, lebensfähige und kompetente Escherichia coli DHSα-Bakterien wurden transformiert. Die Plasmid-DNA der erhaltenen Klone, selektiert auf mit Tetracyclin (12 mg/l) ergänztem LB-Medium, wurde gemäß dem alkalischen Lyseverfahren extrahiert und durch enzymatischen Verdau analysiert. Das resultierende Plasmid wurde als pGA492-petE prom bezeichnet.
Um die Expressionskassette „petE prom/uidA/nos term" zu isolieren, wurden 5 μg des Plasmids pGA492-petE prom mit PstI (dessen Stelle in der 5'-Region des Promoters des Erbsen-Plastocyaningens lag) und EcoRI (dessen Stelle in der 3'-Region der Terminatorsequenz lag) 1 h bei 37°C verdaut, einer Elektrophorese auf 0,8% Agarosegel unterzogen und auf einer QIAquick Affinitätssäule (Qiagen, Hilden, Deutschland) gemäß der Empfehlung des Lieferanten gereinigt. Ferner wurden gleichzeitig 500 ng des Plasmids pGEM3Z 1 h bei 37°C mit EcoRI und PstI (Restriktionsstellen im multiplen Klonierungsort oder Polylinker vorhanden) verdaut, einer Elektrophorese auf 0,8% Agarosegel unterzogen und dann auf einer QIAquick-Affinitätssäule gereinigt.
Die Ligation wurde mit 50 ng des Vektors pGEM3Z-PstI/EcoRI und 50 ng der Expressionskassette petE prom/uidA/nos term 1 Nacht bei 18°C in einem Reaktionsvolumen von 12 μl in Gegenwart von 1,2 μl T4 10X DNA-Ligasepuffer (New England Biolabs) und 400 Einheiten T4 DNA-Ligase (New England Biolabs) durchgeführt.
Zuvor hergestellte Escherichia coli DH5α-Bakterien wurden mit dem Ligationsreaktionsgemisch transformiert. Die Plasmid-DNA der erhaltenen Klone, selektiert auf mit Ampicillin (50 mg/l) ergänztem LB-Medium, wurde gemäß dem alkalischen Lyseverfahren extrahiert und durch enzymatischen Verdau analysiert. Das erhaltene Plasmid wurde als pGEM3Z-petE prom bezeichnet.
Um das 192 bp IV2-Intron des Kartoffel-Patatingens in die codierende uidA-Sequenz zu insertieren, wurde ein interner Abschnitt dieses Gens (Fragment SnaBI/BstBI mit 710 bp in pGEM3Z-petE prom) exzisiert und dann durch die äquivalente Sequenz ersetzt, die das IV2-Intron (Fragment SnaBI/BstBI mit 902 bp) enthielt. Um dies zu erreichen, wurde das Plasmid pGEM3Z-petE prom 1 h bei 37°C mit SnaBI (der Restriktionsort lag an Position +383 bp stromabwärts des Initiator-ATG-Codons des uidA-Gens), dann 1 h bei 65°C mit BstBI (die Stelle lag an Position +1093 bp) verdaut. Das von diesem 710 bp-Fragment deletierte Plasmid wurde durch 0,8% Gelagarose-Elektrophorese isoliert und dann auf einer QIAquick-Affinitätssäule gereinigt. Das Fragment BstBI/SnaBI mit 902 bp, das der IV2-Intronsequenz entspricht, auf welche die uidA-Sequenz folgt, die sich von Position +383 bis +1093 bp erstreckt, wurde aus dem Plasmid pSCV1.2-GI isoliert und gereinigt. Dieses Plasmid stammt vom Plasmid pSCVI.2, das wiederum vom Plasmid pSCV1 stammt, das 1990 von G. A. Edwards nach den üblichen Klonierverfahren konstruiert wurde. Das binäre Plasmid pSCV1.2 wurde durch Klonieren des Fragmentes HindIII, das die Expressionskassette „35S prom/nptII/nos term" trägt (Fromm et al., 1986), an die HindIII-Stelle von pSCVI erhalten. Die Expressionskassette „35S prom/GUS-IV2/35S term" wurde durch 1-stündigen Verdau des Plasmids p35S GUS INT mit HindIII bei 37°C, wie von Vancanneyt et al. (1990) beschrieben, erhalten. Das der Expressionskassette entsprechende DNA-Fragment wurde auf 0,8% Agarosegel isoliert, elektroeluiert, dann in Gegenwart von 1/10 Volumen 3M Natriumacetat, pH 4,8, und 2,5 Volumina absolutem Ethanol 30 Min. bei –80°C präzipitiert, anschließend 30 Min. bei 12000 g zentrifugiert, in 70% Ethanol gewaschen, getrocknet und in Wasser resuspendiert. Die 5'-überhängenden Enden dieses Fragmentes wurden durch die Einwirkung des DNA-Polymerase I Klenow-Fragmentes (New England Biolabs) 30 Min. bei 37°C gemäß den Empfehlungen des Herstellers gebluntet, und das Fragment wurde durch Extraktion mit einem Volumen Phenol, dann einem Volumen Phenol : Chloroform : Isoamylalkohol (25:24:1 v/v/v) und schließlich einem Volumen Chloroform : Isoamylalkohol (24:1 v/v) deproteiniert, in Gegenwart von 1/10 Volumen 3M Natriumacetat, pH 4,8, und 2,5 Volumina absolutem Ethanol 30 Min. bei –80°C präzipitiert, dann 30 Min. bei 12000 g zentrifugiert, in 70% Ethanol gewaschen, getrocknet und dann schließlich mit 20 ng des Plasmids pSCVI.2 ligiert und 1 h bei 25°C mit SmaI in Gegenwart von 1,0 μl T4 10X DNA-Ligasepuffer (Amersham) und 2,5 Einheiten T4 DNA-Ligase (Amersham) 16 h bei 14°C verdaut. Zuvor hergestellte kompetente und lebensfähige Escherichia coli DH5α-Bakterien wurden transformiert. Die Plasmid-DNA der erhaltenen Klone, selektiert auf mit Ampicillin (50 mg/l) ergänztem LB-Medium, wurde gemäß dem alkalischen Lyseverfahren extrahiert und durch enzymatischen Verdau analysiert.
Fünf Mikrogramm (5 μg) des Plasmids pSCV1.2-GI wurden 1 h bei 37°C mit SnaBI (der Restriktionsort lag an Position +383 bp stromabwärts des Initiator-ATG-Codons des Gens uidA) und dann 1 h bei 65°C mit BstBI (Stelle lag an Position +1285 bp) verdaut. Das 902 bp-Fragment wurde durch 1,0% Agarosegel-Elektrophorese isoliert und dann auf einer QIAquick-Affinitätssäule gereinigt. Die Ligation wurde mit 20 ng des Vektors pGEM3Z-petE prom BstBI/SnaBI und 80 ng des 902 bp-Fragmentes BstBI/SnaBI 1 Nacht bei 18°C in einem Reaktionsvolumen von 10 μl in Gegenwart von 1,0 μl T4 10X DNA-Ligasepuffer (New England Biolabs) und 400 Einheiten T4 DNA-Ligase (New England Biolabs) durchgeführt. Zuvor hergestellte kompetente und lebensfähige Escherichia coli DH5α-Bakterien wurden mit der Hälfte des Ligationsreaktionsgemisches transformiert. Die Plasmid-DNA der erhaltenen Klone, selektiert auf mit Ampicillin (50 mg/l) ergänztem LB-Medium, wurde gemäß dem alkalischen Lyseverfahren extrahiert und durch enzymatischen Verdau analysiert. Das erhaltene Plasmid wurde als pGEM3Z-petE prom/IV2 bezeichnet.
Zur Eliminierung der Promotersequenz, die dem 818 bp-Fragment (petE) entspricht, aus dem Plasmid pGEM3Z-petE prom/IV2 wurde letzteres 1 h bei 37°C mit BamHI, dann 1 h bei 37°C mit PstI verdaut, durch Elektrophorese auf 0,8% Gelagarose isoliert und dann auf einer QIAquick-Affinitätssäule gereinigt. Die 5'-überhängenden Enden dieses Plasmids wurden mit Pfu DNA-Polymerase (Stratagene, La Jolla, USA) gemäß den Empfehlungen des Lieferanten gebluntet. Die Ligation wurde mit 10 ng des so modifizierten Plasmids 1 Nacht bei 18°C in einem Reaktionsvolumen von 1,2 μl in Gegenwart von 1,2 μl T4 10X DNA-Ligasepuffer (New England Biolabs) und 400 Einheiten T4 DNA-Ligase (New England Biolabs) durchgeführt. Zuvor hergestellte kompetente und lebensfähige Escherichia coli DH5α-Bakterien wurden mit der Hälfte des Reaktionsgemisches der Ligation transformiert. Die Plasmid-DNA der erhaltenen Klone, selektiert auf mit Ampicillin (50 mg/l) ergänztem LB-Medium, wurde gemäß dem alkalischen Lyseverfahren extrahiert, durch enzymatischen Verdau analysiert und druch Sequenzierung nach dem von Sanger et al. (1977) beschriebenen Verfahren nachgewiesen. Das erhaltene Plasmid wurde als pMRT1144 bezeichnet (I).
1.2. Konstruktion der positiven Kontrolle MPr1092
Um eine Referenz-Promotersequenz zu erhalten, wurde der „doppelte 35S"-Promoter des Blumenkohlmosaikvirus (CaMV D35S prom) stromaufwärts der Sequenz uidA-IV2/nos term plaziert. Das Plasmid pMRT1092 (I) ergab sich aus den folgenden Klonierungsschritten: Zunächst wurde das 192 bp IV2-Intron des Kartoffel-Patatingens, wie im Abschnitt 1.1 beschrieben, an Position +383 bp in die codierende Sequenz uidA insertiert. Eine Menge von einem Mikrogramm (1 μg) des Plasmids pBI221 (Clontech, CA, USA) wurde 1,5 h bei 37°C mit SnaBI und dann 1,5 h bei 65°C mit BstBI verdaut. Das Plasmid, dessen 710 bp-Fragment deletiert war, wurde durch 0,8% Agarosegel-Elektrophorese isoliert und dann auf einer QIAquick-Affinitätssäule gereinigt.
Eine Menge von zwanzig Nanogramm (20 ng) des Vektors pBI221 BstBI/SnaBI und 80 ng des 902 bp Fragmentes BstBI/SnaBI, das vom zuvor beschriebenen pSCV1.2-GI stammte, wurden 1 Nacht bei 18°C in einem Reaktionsvolumen von 10 μl in Gegenwart von 1 μl T4 10X DNA-Ligasepuffer (New England Biolabs) und 400 Einheiten T4 DNA-Ligase (New England Biolabs) ligiert. Zuvor hergestellte kompetente und lebensfähige Escherichia coli DH5α-Bakterien wurden mit der Hälfte des Ligationsreaktionsgemisches transformiert. Die DNA der erhaltenen Klone, selektiert auf mit Ampicillin (50 mg/l) ergänztem LB-Medium, wurde gemäß dem alkalischen Lyseverfahren extrahiert und durch enzymatischen Verdau analysiert. Das erhaltene Plasmid wurde als pBI221/uidA-IV2 bezeichnet.
Anschließend wurde die Sequenz des einfachen 35S CaMV-Promoters, die im Plasmid pBI221/uidA-IV2 vorliegt, durch die Sequenz „CaMV D35S" ersetzt. Um dies zu erreichen, wurde das Plasmid pBI221/uidA-IV2 10,5 h bei 37°C mit 10 Einheiten HindIII verdaut, und dann wurden die klebrigen Enden durch die Einwirkung des Klenow-Fragmentes von DNA-Polymerase I (New England Biolabs) 30 Min. bei 37°C gemäß den Empfehlungen des Herstellers gebluntet. Nach Reinigung des Produktes dieser Reaktion auf einer QIAquick-Affinitätssäule wurde die DNA über Nacht bei 37°C mit 10 Einheiten BamHI verdaut. Das Plasmidfragment, das dem Vektor entsprach, dessen 828 bp CaMV 35S Promoter-Fragment deletiert war, wurde durch 0,8% Agarosegel-Elektrophorese isoliert und dann auf einer QIAquick-Affinitätssäule gereinigt.
Der CaMV D35S-Promoter wurde aus dem Plasmid pJIT163Δ erhalten. Dieses Plasmid ist von pJIT163 abgeleitet, das wiederum vom Plasmid pJIT160 (Guérineau und Mullineaux, 1993) abgeleitet ist. Das Plasmid pJIT163 besitzt ein ATG-Codon zwischen den Stellen HindIII und SalI des Polylinkers. Um dieses ATG zu deletieren und das Plasmid pJIT163Δ zu erhalten, wurde die Plasmid-DNA von pJIT163 mit HindIII und SalI verdaut, mittels 0,8% Agarosegel-Elektrophorese gereinigt, elektroeluiert, in Gegenwart von 1/10 Volumen 3M Natriumacetat, pH 4,8, und 2,5 Volumina absolutem Ethanol 30 Min. bei –80°C präzipitiert, 30 Min. bei 12000 g zentrifugiert, in 70% Ethanol gewaschen, getrocknet, 30 Min. bei 37°C der Einwirkung des Klenow-Fragmentes von DNA-Polymerase I (New England Biolabs) gemäß den Empfehlungen des Herstellers unterzogen, durch Extraktion mit einem Volumen Phenol, dann einem Volumen Phenol : Chloroform : Isoamylalkohol (25:24:1 v/v/v) und schließlich einem Volumen Chloroform : Isoamylalkohol (24:1 v/v) deproteiniert, in Gegenwart von 1/10 Volumen 3M Natriumacetat, pH 4,8, und 2,5 Volumina absolutem Ethanol 30 Min. bei –80°C präzipitiert, dann 30 Min. bei 12000 g zentrifugiert, in 70% Ethanol gewaschen, getrocknet und schließlich in Gegenwart von 1,0 μl T4 10X DNA-Ligasepuffer (Amersham) und 2,5 Einheiten T4 DNA-Ligase (Amersham) 16 h bei 14°C ligiert. Zuvor hergestellte lebensfähige und kompetente Escherichia coli DH5α-Bakterien wurden transformiert. Die Plasmid-DNA der erhaltenen Klone, selektiert auf mit Ampicillin (50 mg/l) ergänztem LB-Medium, wurde gemäß dem alkalischen Lyseverfahren extrahiert und durch enzymatischen Verdau analysiert.
Zehn Mikrogramm (10 μg) des Plasmids pJIT163Δ wurden 10,5 h bei 37°C mit 10 Einheiten KpnI (Stelle lag in der 5'-Region des Promoters) verdaut, und dann wurden die klebrigen Enden durch die Einwirkung von 6 Einheiten T4 DNA-Polymerase (New England Biolabs) 30 Min. bei 37°C gemäß den Empfehlungen des Herstellers gebluntet. Nach Reinigung des Produktes dieser Reaktion auf einer QIAquick-Affinitätssäule wurde die DNA über Nacht bei 37°C mit 10 Einheiten BamHI verdaut. Das resultierende 761 bp DNA-Fragment, das dem D35S-Promoter entsprach, wurde mittels 1,0% Agarosegel-Elektrophorese isoliert und dann auf einer QIAquick-Affinitätssäule gereinigt.
Das Reaktionsgemisch, das 10 ng Plasmidvektor, 100 ng des 761 bp-Fragmentes, 1,0 μl T4 10X DNA-Ligasepuffer (New England Biolabs) und 400 Einheiten T4 DNA-Ligase (New England Biolabs) enthielt, wurde über Nacht bei 18°C einer Ligation in 10 ml unterzogen. Zuvor hergestellte lebensfähige und kompetente Escherichia coli DH5α-Bakterien wurden mit der Hälfte des Ligationsreaktionsgemisches transformiert. Die Plasmid-DNA der erhaltenen Klone, selektiert auf mit Ampicillin (50 mg/l) ergänztem LB-Medium, wurde gemäß dem alkalischen Lyseverfahren extrahiert und durch enzymatischen Verdau analysiert. Das erhaltene Plasmid wurde als pMRT1092 bezeichnet (II).
1.3. Beschreibung des Referenz-Plasmids pCaMV35Sluc
Das als interne Referenz für die transiente Expression verwendete Plasmid war pCaMV35Sluc (Torrent et al., 1997), das die Expressionskassette für das Luciferase (luc)-Reportergen unter der Kontrolle des RNA CaMV 35S-Promoters und -terminators enthält (III).
Beispiel 2
Konstruktion chimärer Promotoren durch Kombination von Elementen der CsVMV- und CoYMV-Promotoren
Der gesamte Promoter der intergenischen Region von CoYMV entspricht einer Sequenz von 1038 bp, die sich von Position –1026 bp bis Position +12 bp (bezogen auf das 5'-Ende des CoYMV-Transkriptes, und zuvor von Medberry et al., 1992, als Sequenz EMBL X52938 identifiziert) erstreckt. Ein Fragment von 243 bp dieses ganzen Promoters (Medberry und Olszewski, 1993) wurde zur Konstruktion der chimären Promotoren gemäß der vorliegenden Erfindung zurückbehalten, das im Sequenzprotokoll mit SEQ.ID01 gekennzeichnet ist. Auf diesem 243 bp Fragment wurden mehrere potenziell regulatorische Sequenzen putativ identifiziert (vom 5'-Ende in Richtung des 3'-Endes, wobei deren Positionen in Basenpaaren (bp) relativ zum Transkriptionsinitiationsstartpunkt +1, wie in IV gezeigt, angegeben sind:

– eine „as-1-artige" Box, die eine Länge von 16 bp und eine gewisse Ähnlichkeit mit der Aktivierungssequenz 1 (as-1), die im CaMV 35S-Promoter vorhanden ist, aufweist und sich von Position –226 bp bis Position –210 bp erstreckt;
– eine 76 bp-Sequenz, die für die Expression in vaskulärem Gewebe verantwortlich ist (Medberry et al., 1992), sich von Position –161 bp bis Position –85 bp erstreckt und in IV mit VT bezeichnet ist;
– ein GTAA-Element, das für die Expression in Grüngewebe spezifisch ist und an Position –76 bp liegt;
– drei „Endosperm-artige" Boxen, die eine gewisse Ähnlichkeit mit den für die spezifische Expression im Endosperm von Getreidepflanzen verantwortlichen Boxen aufweisen und sich an den Positionen –118 bp, –77 bp und –20 bp befinden;
– eine „TATA"-Box an Position –32 bp;
– der Startpunkt der Transkription +1 (Position 1);
– eine 5'-untranslatierte Region (UTR), die sich von Position +1 bis Position +12 bp erstreckt.

Der Promoter der intergenischen Region von CsVMV entspricht einer Sequenz von 515 bp, die sich von Position +7162 bp bis Position +7677 bp erstreckt (zuvor als Sequenz EMBL U59751 identifiziert, Verdaguer et al., 1996). Auf diesem 515 bp-Fragment, das im Sequenzprotokoll als SEQ.ID02 bezeichnet ist, wurden mehrere potenziell regulatorische Sequenzen putativ identifiziert (vom 5'-Ende in Richtung des 3'-Endes, deren Positionen in Basenpaaren (bp) bezüglich des Transkriptionsinitiationsstartpunktes +1 angegeben sind, wie dies in IV gezeigt ist):

– eine 104 bp-Sequenz, von der berichtet wird, dass sie dafür verantwortlich ist, in Grüngeweben eine starke Expression zu vermitteln, die sich von Position
– 220 bp bis Position –116 bp erstreckt und in IV mit GT bezeichnet ist;
– ein „as1-artiges" Element mit einer Länge von 16 bp, das eine gewisse Ähnlichkeit mit der Aktivierungssequenz 1 (as-1) aufweist, die im CaMV 35S-Promoter vorhanden ist, und das sich von Position –219 bp bis Position –203 bp erstreckt;
– 7 „GTAA"-Elemente, die für die Expression in Grüngeweben spezifisch sind und an den Positionen –437, –216, –144, –130, –116 bp, +16 und +63 bp liegen;
– 7 „Endosperm-artige" Boxen, die eine gewisse Ähnlichkeit mit den Boxen aufweisen, die für die spezifische Expression im Endosperm von Getreidepflanzen verantwortlich sind und sich an den Positionen –196, –145, –136, –130, –122, +14 und +31 bp befinden;
– eine „TATA"-Box an Position –33 bp;
– der Initiationsstartpunkt der Transkription +1 (Position +1);
– eine 5'-untranslatierte Region (UTR), die sich von Position +1 bis Position 71 bp erstreckt.

2.1. Konstruktion von MPr1116
Die 104 bp-Sequenz von CsVMV, die sich von Position –221 bp bis Position –116 bp erstreckt (bezogen auf den Startpunkt der Transkriptionsinitiation +1), trägt 4 „Endosperm-artige" Boxen, vier „GTAA"-Elemente, die für die Expression in Grüngewebe spezifisch sind, und ein as-1-artiges Element, und ist für die Expression in vaskulärem Gewebe verantwortlich. Die 76 bp-Region von CoYMV (die sich von Position –160 bp bis Position –84 bp erstreckt und im Sequenzprotokoll mit der Nummer SEQ.ID01 gekennzeichnet ist), ist für die Expression in vaskulärem Gewebe verantwortlich.
Der Promoter MPr1116 wurde, wie dies in IV schematisch dargestellt ist, durch Fusionieren der 104 bp-Sequenz des Promoter aus der intergenischen Region des CsVMV-Genoms, die im Sequenzprotokoll mit SEQ.ID02 gekennzeichnet ist, mit der CoYMV-Sequenz, deren 76 bp-Region deletiert war, unter Anwendung des Ib-PCR-Verfahrens erzeugt.
Dieses Verfahren kombiniert eine als LCR bezeichnete Ligationskettenreaktion (Barany, 1991), die eine einsträngige, kontinuierliche DNA produziert, welche von „direktionalen" Oligodesoxynukleotid-Bausteinen ausgeht, mit einer PCR-Reaktion, die zur Produktion einer doppelsträngigen DNA führt.
Die einsträngige, kontinuierliche DNA wurde ausgehend von den folgenden „direktionalen" Desoxynukleotiden gebildet:

– S1 = 5' CATGCTGCAGACTAGTATCCGCCGTCATCAATGACATCATCACAGTACTGA GGAGATGAATAGCT 3' (SEQ.ID08)
– S2 = 5' AGCCATGACACTCTGTGCGAATATTGAAGACGTAAGCACTGACGACAACAA TGAAAAGAA 3' (SEQ.ID09)
– S3 = 5' GAAGATAAGGTCGGTGATTGTGAAAGAGACATAGAGGACACATGTAAGGT GGAAAATGTAAG 3' (SEQ.ID10)
– S4 = 5' GGCGGAAAGTAACCTTATGCATTTGTAACTTGGTTACCCGGTATGCCGGTT CCCAAGCTTTAT 3' (SEQ.ID11)
– S5 = 5' TTCCTTATTTAAGCACTTGTGTAGTAGCTTAGAAAACCAACACAACAACCTA GAGGATCCCCG 3' (SEQ.ID12)

Einhundert Pikomol der Desoxynukleotide S1, S2 und S3 wurden in der 5'-Region durch die Einwirkung von 15 Einheiten Kinase (Amersham) in Gegenwart von 5 μl 10X Kinasepuffer (Amersham) und 500 Pikomol ATP (Sigma) 30 Minuten bei 37°C phosphoryliert. Die phosphorylierten Oligodesoxynukleotide wurden durch Extraktion mit einem Volumen Phenol, dann einem Volumen Phenol : Chloroform : Isoamylalkohol (25:24:1 v/v/v) und schließlich einem Volumen Chloroform : Isoamylalkohol (24:1 v/v) gereinigt, bevor sie mit einem 1/10 Volumen 3M Natriumacetat, pH 4,8, und 2,5 Volumina absolutem Ethanol 20 Min. bei –80°C präzipitiert wurden, und dann 30 Min. bei 16060 g zentrifugiert. Die präzipitierten Oligodesoxynukleotide wurden in 70% Ethanol gewaschen, getrocknet und dann in Wasser in einer Konzentration von 10 pmol/μl resuspendiert.
Zur Verknüpfung der „direktionalen" Oligodesoxynukleotide wurden die folgenden „Führungs"-Oligodesoxynukleotide verwendet:

– G1 = 5' GACTCCTCTACTTATCGATCGGTACTGTGAGACA 3' (SEQ.ID15)
– G2 = 5' GCTGTTGTTACTTTTCTTCTTCTATTCCAGCCA 3' (SEQ.ID16)
– G3 = 5' ATTCCACCTTTTACATTCCCGCCTTTCATTG 3' (SEQ.ID17)
– G4 = 5' CAAGGGTTCGAAATAAAGGAATAAATTCGTGA 3' (SEQ.ID18)

Zur Durchführung der LCR-Reaktion wurden 10 pmol der phosphorylierten „direktionalen" Desoxynukleotide S1, S2, S3, S4 und S5 in Gegenwart von 10 pmol der „Führungs"-Desoxynukleotide G1, G2, G3 und G4, 5 μl 10X Taq DNA-Ligasepuffer (New England Biolabs) und 40 Einheiten Taq DNA-Ligase (New England Biolabs) ligiert. Die Ligationsreaktion wurde in einem GeneAmp PCR System 9700-Thermozyklus (Perkin Elmer, Norwalk, USA) durchgeführt. Dieser bestand aus einem Zyklus von 1 Min. bei 94°C und 8 identischen Zyklen, die jeweils aus der Abfolge der folgenden Schritte bestanden: 1 Min. bei 65°C, 1 Min. bei 57°C, 1 Min. bei 52°C, 1 Min. bei 48°C, 1 Min. bei 43°C und schließlich 10 Min. bei 37°C. Dann wurde das Ligationsreaktionsgemisch auf einer QIAquick-Säule gemäß den Empfehlungen des Lieferanten gereinigt.
Schließlich erfolgte eine PCR-Amplifikation der erhaltenen einsträngigen DNA in einem GeneAmp PCR System 9700-Thermozyklus in Gegenwart von je 100 pmol der Oligodesoxynukleotid-Sonden 5' CATGCTGCAGACTAGTATCC 3' und 5' CGGGGATCCTCTAGGTTGT 3', je 50 nmol der dNTP, 10 μl Vent 10X DNA-Polymerasepuffer (New England Biolabs) und 2 Einheiten DNA Vent-Polymerase (New England Biolabs). Die DNA wurde 5 Min. bei 94°C denaturiert, 25 Zyklen unterzogen, die jeweils aus einem 30-sekündigen Denaturierungsschritt bei 95°C, einem 30-sekündigen Hybridisierungsschritt bei 55°C und einem 45-sekündigen Elongationsschritt bei 72°C bestanden, und dann wurde die Elongation bei 72°C für 5 Min. fortgesetzt.
Die DNA-Fragmente aus dem Reaktionsgemisch wurden 45 Min. bei 37°C mit 20 Einheiten BamHI, dann 1 h bei 37°C mit 20 Einheiten PstI verdaut und schließlich auf einer QIAquick-Säule gereinigt. Sie wurden in das Plasmid pGEM3Z-petE prom (das im Abschnitt 1.2. beschrieben ist) insertiert, 1 h bei 37°C mit BamHI, dann 1 h bei 37°C mit PstI verdaut, einer 0,8% Agarosegel-Elektrophorese unterzogen, auf einer QIAquick-Affinitätssäule gereinigt, 1 h bei 37°C in Gegenwart von 12 μl 10X Puffer 3 (New England Biolabs) und 5000 Einheiten alkalischer Phosphatase aus Kalbsdarm (CIP, New England Biolabs) dephosphoryliert und schließlich auf einer QIAquick-Affinitätssäule gereinigt. Zur Durchführung der Ligation wurden 25 ng des wie oben behandelten Plasmids mit 100 ng der aus den PCR-Reaktionen erhaltenen DNA-Fragmente in Gegenwart von 1,2 μl T4 10X DNA-Ligasepuffer (New England Biolabs) und 400 Einheiten T4 DNA-Ligase (New England Biolabs) 1 Nacht bei 18°C kontaktiert. Zuvor hergestellte Escherichia coli DH5α-Bakterien wurden mit der Hälfte des Ligationsreaktionsgemisches transformiert. Die DNA der erhaltenen Klone, selektiert auf mit Ampicillin (50 mg/l) ergänztem LB-Medium, wurde gemäß dem alkalischen Lyseverfahren extrahiert und durch enzymatischen Verdau und Genamplifikation unter Verwendung des auf dem Promoter selektierten Desoxynukleotids 5'-CATGCTGCAGACTAGTATCC 3' und des auf der uidA-Sequenz selektierten Desoxynukleotids 5' TTGATTTCACGGGTTGGG 3' analysiert. Es wurden zwei resultierende Plasmide pMRT1116 und pMRT1117 sequenziert. Das Plasmid pMRT1116 enthält den Promoter MPr1116 (SEQ.ID03), während das Plasmid pMRT1117 den Promoter MPr1117 (SEQ.ID04) trägt, der sich von MPr1116 durch eine Duplikation der „as1-artigen" Box und ihrer unmittelbaren Umgebung, deren Länge 33 bp beträgt, in der 5'-Region des chimären Promoters sowie durch die Deletion von 3 bp an den Positionen –140, –25 und –24 und durch den Austausch eines Cytosins durch ein Thymin an Position –54 bp unterscheidet (wie in IV gezeigt).
2.2. Konstruktion des Promoters MPr1146
Der Promoter MPr1146 (IV) wurde durch Insertieren der 58 bp-Sequenz, die einer Duplikation des as-2-Elementes (Lam und Chua, 1989) und des vom RNA 35S CaMV-Promoter stammenden as-1-Elementes (Lam et al., 1989) entspricht, an den Restriktionsstellen NheI und DraIII von MPr1116 erhalten.
Um dies zu erreichen, wude das Plasmid pMRT1116 1 h bei 37°C mit 25 Einheiten NheI und dann 1 h bei 37°C mit 4 Einheiten DraIII verdaut. Das so verdaute Plasmid wurde auf 0,8% Agarosegel isoliert, auf einer QIAquick-Affinitätssäule gereinigt und 1 h bei 37°C in Gegenwart von 12 μl 10X Puffer 3 (New England Biolabs) und 5000 Einheiten alkalischer Phosphatase aus Kalbsdarm (CIP, New England Biolabs) dephosphoryliert, und schließlich erneut auf einer QIAquick-Affinitätssäule gereinigt.
Das Fragment SpeI/DraIII mit 70 bp, das die beiden as-2-Elemente und das as-1-Element enthielt, wurde aus dem Plasmid pMRT1111 erhalten.
Dieses letztere Plasmid, das eine 58 bp-Sequenz enthält, die einer Duplikation des as-2-Elementes (Lam und Chua, 1989) und eines as-1-Elementes (Lam et al., 1989) entspricht, das vom 35S RNA CaMV-Promoter stromaufwärts des minimalen Erbsen-Plastocyanin-Promoters, modifiziert durch die Addition einer „G"-Box, stammt, wurde durch Ib-PCR auf folgende Weise erhalten. Die einsträngige kontinuierliche DNA wurde unter Verwendung der folgenden „direktionalen" Desoxynukleotide erzeugt:

– S1 = 5' TTCCCTTCAAACACATACAAATTCAGTAGAGAAGAAACTCATTACTCTTGAG AAACCTAGAGGATCCCCG 3' (SEQ.ID08)
– S2 = 5' CACAAAAACCCAATCCACATCTTTATCATCCATTCTATAAAAAATCACCTTC TGTGTGTCTCTCTT TCGA 3' (SEQ.ID09)
– S5 = 5' CTGTGGCACATCTACATTATCTAAATCTAAGCCACGTCGGAGGATAACATA TTCTTCCACACATCTTAGCCA 3' (SEQ.ID12)
– S7 = 5' CATGCTGCAGACTAGTGATTGATGTGATATCAAGATTGATGTGATATCTCC ACTGACGTAAGGGATGACGCATGCCACT 3' (SEQ.ID14)

Einhundert Pikomol (100 pmol) der Desoxynukleotide S1, S2 und S5 wurden 30 Min. bei 37°C mit 15 Einheiten Kinase (Amersham) in Gegenwart von 5 μl 10X Kinasepuffer (Amersham) und 500 pmol ATP (Sigma) 5'-phosphoryliert. Die phosphorylierten Oligodesoxynukleotide wurden durch Extraktion mit einem Volumen Phenol, dann einem Volumen Phenol : Chloroform : Isoamylalkohol (25:24:1 v/v/v) und schließlich einem Volumen Chloroform : Isoamylalkohol (24:1 v/v) gereinigt, bevor sie mit 1/10 Volumen 3M Natriumacetat, pH 4,8, und 2,5 Volumina absolutem Ethanol 20 Min. bei –80°C präzipitiert und dann 30 Min. bei 16060 g zentrifugiert wurden. Die präzipitierten Oligodesoxynukleotide wurden in 70% Ethanol gewaschen, getrocknet und dann in Wasser in einer Konzentration von 10 pmol/μl resuspendiert. Zur Verknüpfung der „direktionalen" Oligodesoxynukleotide wurden die folgenden „Führungs"-Oligodesoxynukleotide verwendet:

– G1 = 5' TGTGTTTGAAGGGAATCGAAAGAGAGACACA 3' (SEQ.ID.15)
– G2 = 5' GATTGGGTTTTTGTGTGGCTAAGATGTGTG 3' (SEQ.ID16)
– G4 = 5' TGTAGATGTGCCACAGAGTGGCATGCGT 3' (SEQ.ID18)

Zur Durchführung der LCR-Reaktion wurden 10 pmol der phosphorylierten direktionalen Desoxynukleotide S1, S2, S5 und S7 in Gegenwart von 10 pmol der „Führungs"-Desoxynukleotide G1, G2 und G4, 5 μl Taq 10X DNA-Ligasepuffer (New England Biolabs) und 40 Einheiten Taq DNA-Ligase (New England Biolabs) ligiert. Die Ligationsreaktion wurde in einem GeneAmp PCR System 9700-Thermozyklus (Perkin Elmer, Norwalk, USA) durchgeführt. Dieser besteht aus einem Zyklus von 1 Min. bei 94°C und 8 identischen Zyklen, die jeweils aus der Abfolge der folgenden Schritte bestehen: 1 Min. bei 65°C, 1 Min. bei 57°C, 1 Min. bei 52°C, 1 Min. bei 48°C, 1 Min. bei 43°C und schließlich 10 Min. bei 37°C. Dann wurde das Ligationsreaktionsgemisch auf einer QIAquick-Affinitätssäule gemäß den Empfehlungen des Herstellers gereinigt.
Schließlich wurde eine PCR-Amplifikation der erhaltenen einsträngigen, kontinuierlichen DNA in einem GeneAmp PCR System 9700-Thermozyklus in Gegenwart von je 100 pmol der folgenden Oligodesoxynukleotidsonden 5' CATGCTGCAGACTAGTGGATT 3' und 5' CGGGGATCCTCTAGGTTTCT3', je 50 nmol der dNTP, 10 μl Vent 10X DNA-Polymerasepuffer (New England Biolabs) und 2 Einheiten Vent DNA-Polymerase (New England Biolabs) durchgeführt. Die DNA wurde 5 Min. bei 94°C denaturiert, 25 Zyklen, die jeweils aus einem 30-sekündigen Denaturierungsschritt bei 95°C, einem 30-sekündigen Hybridisierungsschritt bei 56°C und einem 1-minütigen Elongationsschritt bei 72°C bestanden, und dann 5 Min. einer weiteren Elongation bei 72°C unterzogen.
Die DNA-Fragmente des Reaktionsgemisches wurden 45 Min. bei 37°C mit 20 Einheiten BamHI, dann 1 h bei 37°C mit 20 Einheiten PstI verdaut, und schließlich auf einer QIAquick-Säule gereinigt. Sie wurden in das Plasmid pGEM3Z-petE prom insertiert, 1 h bei 37°C mit BamHI, dann 1 h bei 37°C mit PstI verdaut, einer 0,8% Agarosegel-Elektrophorese unterzogen, auf einer QIAquick-Affinitätssäule gereinigt, 1 h bei 37°C in Gegenwart von 12 μl 10X-Puffer 3 (New England Biolabs) und 5000 Einheiten alkalischer Phosphatase aus Kalbsdarm (CIP, New England Biolabs) dephosphoryliert, und schließlich auf einer QIAquick-Affinitätssäule gereinigt. Zur Durchführung der Ligation wurden 25 ng Plasmid, das wie oben beschrieben behandelt war, mit 100 ng der durch PCR erhaltenen DNA-Fragmente in Gegenwart von 1,2 μl T4 10X DNA-Ligasepuffer (New England Biolabs) und 400 Einheiten T4 DNA-Ligase (New England Biolabs) 1 Nacht bei 18°C kontaktiert. Zuvor hergestellte lebensfähige und kompetente Escherichia coli DH5α-Bakterien wurden mit der Hälfte des Ligationsreaktionsgemisches transformiert. Die DNA der erhaltenen Klone, selektiert auf mit Ampicillin (50 mg/l) ergänztem LB-Medium, wurde gemäß dem alkalischen Lyseverfahren extrahiert und durch enzymatischen Verdau analysiert. Die Promotersequenz MPr1111 eines dieser Klone wurde durch Sequenzierung nachgewiesen.
Das 70 bp-Fragment, das die beiden as-2-Elemente und das as-1-Element enthielt, wurde durch 1-stündigen Verdau von 25 μg des Plasmids pMRT1111 mit 40 Einheiten SpeI bei 37°C, dann mit 4 Einheiten DraIII für 1 h bei 37°C erhalten. Das Fragment wurde mittels Elektrophorese auf Nu-Sieve 3% Gelagarose (FMC, Rockland, USA) isoliert und schließlich auf einer QIAquick-Affinitätssäule gereinigt.
Die Ligation wurde mit 30 ng des dephosphorylierten Plasmidvektors pMRT1116 NheI/DraIII und 50 ng des 70 bp-Fragmentes 15 h bei 18°C in einem Reaktionsvolumen von 20 μl in Gegenwart von 2,0 μl T4 10X DNA-Ligasepuffer (New England Biolabs) und 800 Einheiten T4 DNA-Ligase (New England Biolabs) durchgeführt. Zuvor hergestellte lebensfähige und kompetente Escherichia coli DH5α-Bakterien wurden mit der Hälfte des Ligationsreaktionsgemisches transformiert. Die Plasmid-DNA der erhaltenen Klone, selektiert auf mit Ampicillin (50 mg/l) ergänztem LB-Medium, wurde gemäß dem alkalischen Lyseverfahren extrahiert und durch enzymatischen Verdau sowie durch Genamplifikation unter Verwendung des auf dem Promoter selektierten Desoxynukleotids 5' CATGCTGCAGACTAGTATCC 3' und des auf der uidA-Sequenz selektierten Desoxynukleotids 5' TTGATTTCACGGGTTGGG 3' analysiert. Die Promotersequenz MPr1146 (SEQ.ID05) eines dieser Klone wurde durch Sequenzierung nachgewiesen.
2.3. Konstruktion des Promoters MPr1147:
Der Promoter MPr1147 (IV) wurde durch Insertieren einer Sequenz mit 44 bp aus dem RNA 35S CaMV-Promoter, der die Elemente as-2 und as-1 (Lam, 1989; Lam et al., 1989) und Restriktionsstellen benachbart den Stellen NheI und DraIII von MPr1117 (SEQ.ID04) enthielt, erhalten.
Um dies zu erreichen, wurde das Plasmid pMRT1117 mit 25 Einheiten NheI 1 h bei 37°C verdaut und dann auf einer QIAquick-Affinitätssäule gereinigt. Die erzeugten Enden wurden durch die Einwirkung von Pfu DNA-Polymerase (Stratagene, La Jolla, USA) gemäß den Empfehlungen des Lieferanten gebluntet, und dann wurde das erhaltene Plasmid 1 h bei 37°C mit 4 Einheiten DraIII verdaut. Das so modifizierte Plasmid wurde auf 0,8% Agarosegel isoliert, auf einer QIAquick-Affinitätssäule gereinigt und 1 h bei 37°C in Gegenwart von 12 μl 10X Puffer 3 (New England Biolabs) und 5000 Einheiten alkalischer Phosphatase aus Kalbsdarm (CIP, New England Biolabs) dephosphoryliert, und schließlich erneut auf einer QIAquick-Affinitätssäule gereinigt.
Das 54 bp-Fragment PstI/DraIII, das die 44 bp der as-2- und as-1-Elemente von CaMV 35S enthielt, wurde aus dem Plasmid pMRT1110 erhalten. Das Plasmid pMRT1110, das eine Sequenz von 44 bp enthält, die dem as-2-Element (Lam und Chua, 1989) und dem as-1-Element (Lam et al., 1989) des 35S RNA CaMV-Promoters stromaufwärts des durch Addition einer „G"-Box modifizierten, minimalen Erbsenplastocyanin-Promoters entspricht, wurde mittels Ib-PCR auf folgende Weise erhalten. Die einsträngige, kontinuierliche DNA wurde unter Verwendung der folgenden „Führungs"-Desoxynukleotide gebildet:

– S1 = 5' TTCCCTTCAAACACATACAAATTCAGTAGAGAAGAAACTCATTACTCTTGAG AAACCTAGAGGATC CCCG 3' (SEQ.ID08)
– S2 = 5' CACAAAAACCCAATCCACATCTTTATCATCCATTCTATAAAAAATCACCTTC TGTGTGTCTCTCTT TCGA 3' (SEQ.ID09)
– S5 = 5' CTGTGGCACATCTACATTATCTAAATCTAAGCCACGTCGGAGGATAACATA TTCTTCCACACATCT TAGCCA 3' (SEQ.ID12)
– S6 = 5' CATGCTGCAGACTAGTGGATTGATGTGATATCTCCACTGACGTAAGGGATG ACGCATGCCACT 3' (SEQ.ID13)

Einhundert Pikomol (100 pmol) der Desoxynukleotide S1, S2 und S5 wurden bei 5' mit 15 Einheiten Kinase (Amersham) in Gegenwart von 5 μl 10X Kinasepuffer (Amersham) und 500 pmol ATP (Sigma) 30 Min. bei 37°C phosphoryliert. Die phosphorylierten Oligodesoxynukleotide wurden durch Extraktion mit einem Volumen Phenol, dann einem Volumen Phenol : Chloroform : Isoamylalkohol (25:24:1 v/v/v) und schließlich einem Volumen Chloroform : Isoamylalkohol (24:1 v/v) gereinigt, bevor sie mit 1/10 Volumen 3M Natriumacetat, pH 4,8, und 2,5 Volumina absolutem Ethanol 20 Min. bei –80°C präzipitiert wurden, und dann 30 Min. bei 16060 g präzipitiert. Die präzipitierten Oligodesoxynukleotide wurden in 70% Ethanol gewaschen, getrocknet und dann in Wasser in einer Konzentration von 10 pmol/μl resuspendiert. Zum Verknüpfen der „direktionalen" Oligodesoxynukleotide wurden die folgenden „Führungs"-Oligodesoxynukleotide verwendet:

– G1 = 5' TGTGTTTGAAGGGAATCGAAAGAGAGACACA 3' (SEQ.ID15)
– G2 = 5' GATTGGGTTTTTGTGTGGCTAAGATGTGTG 3' (SEQ.ID16)
– G4 = 5' TGTAGATGTGCCACAGAGTGGCATGCGT 3' (SEQ.ID18)

Zur Durchführung der LCR-Reaktion wurden 10 pmol der phosphorylierten „direktionalen" Desoxynukleotide S1, S2, S5 und S6 in Gegenwart von 10 pmol der „Führungs"-Desoxynukleotide G1, G2 und G4, 5 μl Taq 10X DNA-Ligasepuffer und 40 Einheiten Taq DNA-Ligase (New England Biolabs) ligiert. Die Ligationsreaktion wurde in einem GeneAmp PCR System 9700-Thermozyklus durchgeführt. Dieser besteht aus einem Zyklus von 1 Min. bei 94°C, und 8 identischen Zyklen, die jeweils aus der Abfolge der folgenden Schritte bestehen: 1 Min. bei 65°C, 1 Min. bei 57°C, 1 Min. bei 52°C, 1 Min. bei 48°C, 1 Min. bei 43°C und schließlich 10 Min. bei 37°C. Dann wurde das Ligationsreaktionsgemisch auf einer QIAquick-Säule gemäß den Empfehlungen des Lieferanten gereinigt.
Schließlich wurde eine PCR-Amplifikation der erhaltenen einsträngigen DNA in einem GeneAmp PCR System 9700-Thermozyklus in Gegenwart von je 100 pmol der Oligodesoxynukleotid-Sonden 5' CATGCTGCAGACTAGTGGATT 3' und 5' CGGGGATCCTCTAGGTTTCT 3', je 50 nmol jeder dNTP, 10 μl 10X Vent DNA-Polymerasepuffer (New England Biolabs) und 2 Einheiten Vent DNA-Polymerase (New England Biolabs) durchgeführt. Die DNA wurde 5 Min. bei 94°C denaturiert, 25 Zyklen, die jeweils aus einem 30-sekündigen Denaturierungsschritt 95°C, einem 30-sekündigen Hybridisierungsschritt bei 56°C und einer 1-minütigen Elongation bei 72°C bestanden, und dann 5 Min. einer weiteren Elongation bei 72°C unterzogen. Die DNA-Fragmente des Reaktionsgemisches wruden 45 Min. bei 37°C mit 20 Einheiten BamHI, dann 1 h bei 37°C mit 20 Einheiten PstI verdaut und schließlich auf einer QIAquick-Säule gereinigt. Sie wurden in das Plasmid pGEM3Z-petE prom insertiert, 1 h bei 37°C mit BamHI, dann 1 h bei 37°C mit PstI verdaut, einer 0,8% Agarosegel-Elektrophorese unterzogen, auf einer QIAquick-Affinitätssäule gereinigt, 1 h bei 37°C in Gegenwart von 12 μl 10X Puffer 3 (New England Biolabs) und 5000 Einheiten alkalischer Phosphatase aus Kalbsdarm (CIP, New England Biolabs) dephosphoryliert und schließlich auf einer QIAquick-Affinitätssäule gereinigt. Zur Durchführung der Ligation wurden 25 ng des wie oben behandelten Plasmids mit 100 ng der durch PCR erhaltenen DNA- Fragmente in Gegenwart von 1,2 μl T4 10X DNA-Ligasepuffer (New England Biolabs) und 400 Einheiten T4 DNA-Ligase (New England Biolabs) 1 Nacht bei 18°C kontaktiert. Zuvor hergestellte lebensfähige und kompetente Escherichia coli DH5α-Bakterien wurden mit der Hälfte des Ligationsreaktionsgemisches transformiert. Die DNA der erhaltenen Klone, selektiert auf mit Ampicillin (50 mg/l) ergänztem LB-Medium, wurde gemäß dem alkalischen Lyseverfahren extrahiert und durch enzymatischen Verdau analysiert. Die von diesem Plasmid pMRT1110 getragene Promotersequenz MPr1110 wurde mittels Sequenzierung nachgewiesen.
Das 54 bp-Fragment, das die vom CaMV-Promoter stammenden Sequenzen as-2 und as-1 enthielt, wurde durch 1-stündigen Verdau von 25 μg des Plasmids pMRT1110 bei 37°C mit 80 Einheiten of PstI erhalten; dann wurden die erzeugten Enden durch Einwirkung von Pfu DNA-Polymerase (Stratagene, La Jolla, USA) gemäß den Empfehlungen des Lieferanten gebluntet. Das so modifizierte Plasmid wurde 1 h bei 37°C mit 4 Einheiten DraIII verdaut, und das 54 bp-Fragment wurde mittels Elektrophorese auf 3% Nu-Sieve-Agarosegel (FMC, Rockland, USA) isoliert und schließlich auf einer QIAquick-Affinitätssäule gereinigt. Die Ligation wurde mit 30 ng des Vektors pMRT1117, der wie zuvor beschrieben hergestellt wurde, und 50 ng des 54 bp-Fragmentes 15 h bei 18°C in einem Reaktionsvolumen von 20 μl in Gegenwart von 2,0 μl T4 10X DNA-Ligasepuffer (New England Biolabs) und 800 Einheiten T4 DNA-Ligase (New England Biolabs) durchgeführt. Zuvor hergestellte lebensfähige und kompetente Escherichia coli DH5α-Bakterien wurden mit der Hälfte des Ligationsreaktionsgemisches transformiert. Die Plasmid-DNA der erhaltenen Klone, selektiert auf mit Ampicillin (50 mg/l) ergänztem LB-Medium, wurde gemäß dem alkalischen Lyseverfahren extrahiert und durch enzymatischen Verdau und Genamplifikation unter Verwendung des aus dem Promoter selektierten Desoxynukleotids 5' CATGCTGCAGACTAGTATCC 3' und des aus der uidA-Sequenz selektierten Desoxynukleotids 5' TTGATTTCACGGGTTGGG 3' analysiert. Die Promotersequenz MPr1147 (SEQ.ID06) eines dieser Klone wurde durch Sequenzierung nachgewiesen.
2.4. Konstruktion des Promoters MPr1154:
Der Promoter MPr1154 (IV) wurde durch Deletion einer 44 bp-Sequenz, die das duplizierte as-1-artige Element enthielt, aus dem CoYMV, das im Promoter MPr1147 (SEQ.ID04) vorhanden war, erhalten.
Um dies zu erreichen, wurde das Plasmid pMRT1147 mit 20 Einheiten SpeI 1 h bei 37°C verdaut, auf 0,8% Gelagarose isoliert, auf einer QIAquick-Affinitätssäule gereinigt und 15 h bei 18°C in einem Reaktionsvolumen von 10 μl in Gegenwart von 1 μl T4 10X DNA-Ligasepuffer (New England Biolabs) und 400 Einheiten T4 DNA-Ligase (New England Biolabs) religiert. Zuvor hergestellte lebensfähige und kompetente Escherichia coli DH5α-Bakterien wurden mit der Hälfte des Ligationsreaktionsgemisches transformiert. Die Plasmid-DNA der erhaltenen Klone, selektiert auf mit Ampicillin (50 mg/l) ergänztem LB-Medium, wurde gemäß dem alkalischen Lyseverfahren extrahiert, sowie durch enzymatischen Verdau und Genamplifikation unter Verwendung des aus dem Plasmid selektierten Desoxynukleotids 5' ATTTAGGTGACACTATAG 3' und des aus der uidA-Sequenz selektierten Desoxynukleotids 5' TTGATTTCACGGGTTGGG 3' analysiert. Die Promotersequenz MPr1154 (SEQ.ID07) eines dieser Klone wurde mittels Sequenzierung nachgewiesen.
2.5. Konstruktion der Promotoren MPr1162, MPr1163, MPr1164, MPr1165:
Die Promotoren MPr1162, MPr1163, MPr1164 und MPr1165 (VII) wurden durch Insertion einer oder mehrerer Kopien der 70 bp-Sequenz, die einer Duplikation der as-2-Box (Lam und Chua, 1989) und der as-1-Box (Lam et al., 1989) des 35S RNACaMV-Promoters entsprach und auf beiden Seiten Restriktionsstellen trug, in die BstEII-Stelle von MPr116 (SEQ.ID03) in 5' > 3'-Ausrichtung oder umgekehrt, d.h. in 3' > 5'-Ausrichtung, erhalten.
Dazu wurde das Plasmid pMRT1116 mit 4 Einheiten BstEII 1 h bei 37°C verdaut und dann auf einer QIAquick-Affinitätssäule gereinigt. Die erzeugten Enden wurden durch Einwirkung von Pfu DNA-Polymerase (Stratagene, La Jolla, USA) gemäß den Empfehlungen des Lieferanten gebluntet, dann 1 h bei 37°C in Gegenwart von 12 μl 10X „Puffer 3" (New England Biolabs) und 25 Einheiten alkalischer Phosphatase aus Kalbsdarm (CIP, New England Biolabs) dephosphoryliert. Schließlich wurde das so erhaltene Plasmid erneut auf einer QIAquick-Affinitätssäule gereinigt.
Das 70 bp SpeI/DraIII-Fragment, das die zwei „as-2"-Boxen und die „as-1-Box enthielt, wurde aus dem Plasmid pMRT1111 erhalten.
Das Plasmid pMRT1111, das eine 58 bp-Sequenz enthält, die einer Duplikation der as-2-Box (Lam und Chua, 1989) und der as-1-Box (Lam et al., 1989) des 35S RNA CaMV-Promoters, der stromaufwärts des durch Addition einer „G"-Box modifizierten, minimalen Erbsenplastocyanin-Promoters angeordnet ist, entspricht, wurde mittels Ib-PCR auf folgende Weise erhalten. Die einsträngige DNA wurde mit Hilfe der folgenden direktionalen Oligodesoxynukleotide hergestellt:

– S1 = 5' TTCCCTTCAAACACATACAAATTCAGTAGAGAAGAAACTCATTACTCTTGAG AAACCTAGAGGATC CCCG 3' (SEQ.ID08)
– S2 = 5' CACAAAAACCCAATCCACATCTTTATCATCCATTCTATAAAAAATCACCTTC TGTGTGTCTCTCTT TCGA 3' (SEQ.ID09)
– S5 = 5' CTGTGGCACATCTACATTATCTAAATCTAAGCCACGTCGGAGGATAACATA TTCTTCCACACATCT TAGCCA 3' (SEQ.ID12)
– S7 = 5' CATGCTGCAGACTAGTGATTGATGTGATATCAAGATTGATGTGATATCTCC ACTGACGTAAGGGAT GACGCATGCCACT 3' (SEQ.ID14)

Einhundert Pikomol (100 pmol) der Oligodesoxynukleotide S1, S2 und S5 wurden 30 Min. bei 37°C mit 15 Einheiten Kinase (Amersham) in Gegenwart von 5 μl 10X Kinasepuffer (Amersham) und 500 pmol ATP (Sigma) 5'-phosphoryliert. Die phosphorylierten Desoxynukleotide wurden durch Extraktion mit einem Volumen Phenol, dann einem Volumen Phenol : Chloroform : Isoamylalkohol (25:24:1 v/v/v) und schließlich einem Volumen Chloroform : Isoamylalkohol (24:1 v/v) gereinigt, bevor sie mit 1/10 Volumen 3M Natriumacetat, pH 4,8, und 2,5 Volumina absolutem Ethanol 20 Min. bei –80°C präzipitiert wurden, und dann 30 Min. bei 16060 g zentrifugiert. Die präzipitierten Oligodesoxynukleotide wurden in 70% Ethanol gewaschen, getrocknet und dann in Wasser in einer Konzentration von 10 pmol/ml resuspendiert. Zur Verknüpfung der direktionalen Oligodesoxynukleotide wurden die folgenden Führungsoligodesoxynukleotide verwendet:

Zur Durchführung der LCR-Reaktion wurden 10 pmol der phosphorylierten Oligodesoxynukleotide S1, S2, S5 und S7 in Gegenwart von 10 pmol der Führungsoligodesoxynukleotide G1, G2 und G4, 5 μl Taq 10X DNA-Ligasepuffer (New England Biolabs) und 40 Einheiten Taq DNA-Ligase (New England Biolabs) ligiert. Die Ligationsreaktion wurde in einem „GeneAmp PCR System 9700"-Thermozyklus (Perkin Elmer, Norwalk, USA) durchgeführt. Dieser bestand aus einem 1-minütigen Zyklus bei 94°C und 8 identischen Zyklen, die jeweils aus der Abfolge der folgenden Schritte bestanden: 1 Min. bei 65°C, 1 Min. bei 57°C, 1 Min. bei 52°C, 1 Min. bei 48°C, 1 Min. bei 43°C und schließlich 10 Min. bei 37°C. Dann wurde das Ligationsreaktionsgemisch auf einer QIAquick-Säule gemäß den Empfehlungen des Lieferanten gereinigt.
Schließlich wurde eine PCR-Amplifikation der erhaltenen einsträngigen DNA in einem „GeneAmp PCR System 9700"-Thermozyklus in Gegenwart von je 100 pmol der Oligodesoxynukleotid-Sonden 5' CATGCTGCAGACTAGTGGATT 3' und 5' CGGGGATCCTCTAGGTTTCT 3', 50 nmol jedes dNTP, 10 μl Vent 10X DNA-Polymerasepuffer (New England Biolabs) und 2 Einheiten Vent DNA-Polymerase (New England Biolabs) durchgeführt. Die DNA wurde 5 Min. bei 94°C denaturiert, 25 Zyklen, die jeweils aus einem 30-sekündigen Denaturieriungsschritt bei 95°C, einem 30-sekündigen Hybridisierungsschritt bei 56°C und einer 1-minütigen Elongation bei 72°C bestanden, und dann 5 Min. einer weiteren Elongation bei 72°C unterzogen.
Die DNA-Fragmente aus dem Reaktionsgemisch wurden 45 Min. bei 37°C mit 20 Einheiten BamHI, dann 1 h bei 37°C mit 20 Einheiten PstI verdaut, und schließlich auf einer QIAquick-Säule gereinigt. Sie wurden in das Plasmid pGEM3Z-petE prom insertiert, das zuvor 1 h bei 37°C mit BamHI, dann 1 h bei 37°C mit PstI verdaut worden war, einer Elektrophorese auf 0,8% Agarosegel unterzogen, auf einer QIAquick-Affinitätssäule gereinigt, 1 h bei 37°C in Gegenwart von 12 μl 10X „Puffer 3" (New England Biolabs) und 25 Einheiten alkalischer Phosphatase aus Kalbsdarm (CIP, New England Biolabs) dephosphoryliert und schließlich auf einer Qiaquick-Affinitätssäule gereinigt. Zur Durchführung einer Ligation wurden 25 ng des so behandelten Plasmids mit 100 ng der durch PCR erhaltenen DNA-Fragmente in Gegenwart von 1,2 μl of T4 10X DNA-Ligasepuffer (New England Biolabs) und 400 Einheiten T4 DNA-Ligase (New England Biolabs) 1 Nacht bei 18°C kontaktiert. Zuvor hergestellte lebensfähige und kompetente Escherichia coli DH5α-Bakterien wurden mit der Hälfte des Ligationsreaktionsgemisches transformiert. Die DNA der erhaltenen Klone, selektiert auf mit Ampicillin (50 mg/l) ergänztem LB-Medium, wurde gemäß dem alkalischen Lyseverfahren extrahiert und durch enzymatischen Verdau analysiert. Die Promotersequenz MPr1111 eines der erhaltenen Klone wurde mittels Sequenzierung nachgewiesen.
Das 70 bp-Fragment, das die beiden „as-2"-Boxen und die „as-1"-Box enthielt, wurde durch 1-stündigen Verdau von 25 mg des Plasmids pMRT1111 mit 40 Einheiten SpeI bei 37°C, dann mit 4 Einheiten DraIII für 1 h bei 37°C erhalten. Das Fragment wurde mittels Elektrophorese auf Nu-Sieve 3%-Agarosegel (FMC, Rockland, USA) isoliert und schließlich auf einer QIAquick-Affinitätssäule gereinigt. Die Enden dieses Fragmentes wurden durch Einwirkung von Pfu DNA-Polymerase (Stratagene, La Jolla, USA) gemäß den Empfehlungen des Lieferanten gebluntet und dann erneut auf einer QIAquick-Affinitätssäule gereinigt.
Die Ligation wurde mit 30 ng des wie oben beschrieben hergestellten pMRT1116-Vektors und 50 ng des 70 bp-Fragmentes 15 h bei 18°C in einem Reaktionsgemisch von 20 μl in Gegenwart von 2,0 μl 10X T4 DNA-Ligasepuffer (New England Biolabs) und 400 Einheiten T4 DNA-Ligase (New England Biolabs) durchgeführt. Zuvor hergestellte lebensfähige und kompetente Escherichia coli DH5α-Bakterien wurden mit einem Drittel des Ligationsreaktionsgemisches transformiert. Die Plasmid-DNA der erhaltenen Klone, selektiert auf mit Ampicillin (50 mg/l) ergänztem LB-Medium, wurde gemäß dem alkalischen Lyseverfahren extrahiert und durch enzymatischen Verdau sowie durch Genamplifikation mit Hilfe des universellen SP6-Oligodesoxynukleotids (5' TAAATCCACTGTGATATCTTATG 3'), das sich in der 5'-Region des Promoters befand, und des Oligodesoxynukleotids 5' TTGATTTCACGGGTTGGG 3', das auf der uidA-Sequenz selektiert wurde, analysiert. Diese Klonierungsstrategie ermöglichte die Produktion von 70 bp-Fragment-Inserts in den Vektor in der Ausrichtung 5' > 3' (die Sequenzen as-2/as-2/as-1 werden in der gleichen Ausrichtung wie in ihrem nativen Promoter kloniert), in der gegenläufigen Ausrichtung 3' > 5' (eine Ausrichtung, die gegenläufig zu der im CaMV 35S-Promoter vorhandenen ist) und in einer oder mehreren Kopien. Die folgenden synthetischen und chimären Promotoren konnten mit dieser Strategie erhalten werden: MPr1162 (SEQ.ID19), welcher der Insertion einer einzelnen 70 bp-Sequenz in normaler 5' > 3'-Ausrichtung entspricht, MPr1163 (SEQ.ID20), welcher der Insertion zweier 70 bp-Sequenzen in normaler 5' > 3'-Ausrichtung entspricht, MPr1164 (SEQ.ID21), welcher der Insertion einer einzelnen 70 bp-Sequenz in entgegengesetzter oder gegenläufiger Ausrichtung entspricht, und MPr1165 (SEQ.ID22), welcher der Insertion von vier 70 bp-Sequenzen in normaler 5' > 3'-Ausrichtung entspricht. Jeder dieser Klone wurde durch Sequenzierung nachgewiesen.
2.6. Konstruktion der Promotoren MPr1167, MPr1168 und MPr1169:
Die Promotoren MPr1167, MPr1168 und MPr1169 (VII) sind von MPr1147 (SEQ.ID06) abgeleitet. Sie wurden durch Insertieren einer oder mehrerer 70 bp-Sequenzen, welche die 58 bp-Sequenz enthielt(en), die einer Duplikation der as-2-Box (Lam und Chua, 1989) und der as-1-Box (Lam et al., 1989) des 35S RNACaMV-Promoters entspricht, in die BstEII-Stelle von MPr1147 in normaler 5' > 3'-Ausrichtung (d. h. in gleicher Ausrichtung wie die native Ausrichtung der Sequenzen im CaMV-Promoter kloniert) erhalten.
Dazu wurde das Plasmid pMRT1147 mit 4 Einheiten BstEII 1 h bei 37°C verdaut und dann auf einer Qiaquick-Affinitätssäule gereinigt. Die erzeugten Enden wurden durch Einwirkung von Pfu DNA-Polymerase (Stratagene, La Jolla, USA) gemäß den Empfehlungen des Lieferanten gebluntet und dann 1 h bei 37°C in Gegenwart von 12 μl 10X „Puffer 3" (New England Biolabs) und 25 Einheiten alkalischer Phosphatase aus Kalbsdarm (CIP, New England Biolabs) dephosphoryliert. Schließlich wurde das so erhaltene Plasmid erneut auf einer Qiaquick-Affinitätssäule gereinigt.
Das 70 bp SpeI/DraIII-Fragment, das die zwei „as-2"-Boxen und die „as-1"-Box enthielt, wurde aus dem Plasmid pMRT1111 erhalten, dessen Produktion zuvor beschrieben wurde. Die Enden dieses Fragmentes wurden wie oben beschrieben gebluntet.
Die Ligation wurde mit 30 ng des wie zuvor beschrieben hergestellten Vektors pMRT1147 und 50 ng des 70 bp-Fragmentes 15 h bei 18°C in einem Reaktionsgemisch von 20 μl in Gegenwart von 2,0 μl 10X T4 DNA-Ligasepuffer (New England Biolabs) und 400 Einheiten T4 DNA-Ligase (New England Biolabs) durchgeführt. Zuvor hergestellte lebensfähige und kompetente Escherichia coli DH5α-Bakterien wurden durch Umsetzung mit einem Drittel des Ligationsreaktionsgemisches transformiert. Die Plasmid-DNA der erhaltenen Klone, selektiert auf mit Ampicillin (50 mg/l) ergänztem LB-Medium, wurde gemäß dem alkalischen Lyseverfahren extrahiert, und durch enzymatischen Verdau sowie durch Genamplifikation unter Verwendung des in der 5'-Region des Promoters gelegenen, universellen SP6 Oligodesoxynukleotids (5' TAAATCCACTGTGATATCTTATG 3') und des aus der uidA-Sequenz selektierten Oligodesoxynukleotids 5' TTGATTTCACGGGTTGGG 3' analysiert. Die folgenden synthetischen Promotoren konnten mit dem vorhergehenden Verfahren hergestellt werden: MPr1167 (SEQ.ID23), welcher der Insertion von drei 70 bp-Sequenzen in normaler 5' > 3'-Ausrichtung entspricht, MPr1168 (SEQ. ID24), welcher der Insertion von zwei 70 bp-Sequenzen in normaler 5' > 3'-Ausrichtung entspricht, und MPr1169 (SEQ.ID25), welcher der Insertion einer einzelnen 70 bp-Sequenz in normaler 5' > 3'-Ausrichtung entspricht. Jeder dieser Klone wurde mittels Sequenzierung nachgewiesen.
2.7. Produktion des binären Vektors pMRT1218, der den Promoter MPr1218 enthält:
Der Referenz-Promoter zur Expression des GUS-Reportergens in Maissamen-Endosperm ist der Promoter des Gens, das für ein Speicherprotein in Maissamen mit 28 kDa codiert, das zur Familie der Gamma-Zeine gehört. Dieses Konstrukt ist in der am 30. September 1999 im Namen der Anmelder eingereichten französischen Patentanmeldung Nr. FR 9912373 beschrieben und hier zu Zwecken der spezifischen Beschreibung des Referenz-Promoters und -Vektors aufgenommen. Die 1,7 kb y-Zein-Promotersequenz (Pry-zein) voller Länge, die im von Reina et al. (1990) beschriebenen Plasmid p63 enthalten ist, wurde stromaufwärts der uidA-IV2/term-nos-Sequenz in einen als pMRT1126 bezeichneten Vektor eingesetzt. Der Vektor pMRT1126 ist in der oben erwähnten französischen Patentanmeldung vollständig beschrieben, und seine Beschreibung wird hier zu Zwecken der Beschreibung dieses Vektoren aufgenommen. Der Promoter Mpr1126 im Vektor pMRT1126 ist vom HMWG-Dx5 (Glutenin mit hohem Molekulargewicht)-Promoter durch Deletion der stromaufwärts des Nukleotids -142 gelegenen Sequenz abgeleitet, die zwei „Prolamin-artige" Boxen, zwei „GATA"-Boxen, eine „G"-Box und ein Aktivatorelement aufweist. Das Promoter-Fragment wurde mittels PCR amplifiziert und isoliert.
Der 1,7 kb y-Zein-Promoter wurde durch 1-stündigen Verdau von 15 μg des Plasmids p63 mit den Restriktionsenzymen HindIII und BamHI bei 37°C erhalten. Das so freigesetzte 1,7 kb Pr y-Zein-Fragment wurde auf 0,8% Agarosegel mit einem „Concert Rapid Gel Extraction System"-Kit isoliert.
Parellel dazu wurden 10 μg des Plasmids pMRT1126 1 h bei 37°C mit den Restriktionsenzymen HindIII und BamHI verdaut. Das Vektorfragment wurde dann auf 0,8% Agarosegel mit einem „Concert Rapid Gel Extraction System"-Kit isoliert und mit 40 Einheiten alkalischer Phosphatase aus Kalbsdarm (New England Biolabs) in Gegenwart von 10X „Puffer 3" 1 h bei 37°C dephosphoryliert.
Die Ligationsreaktion wurde mit 50 ng des y-Zein-Promoter-Fragmentes und 100 ng des Plasmids pMRT1126 in einem Reaktionsvolumen von 10 μl in Gegenwart von T4 10X DNA-Ligasepuffer und 400 Einheiten T4 DNA-Ligase (New England Biolabs) in einem „GeneAmp PCR System 9700"-Thermozyklus, wie oben beschrieben, durchgeführt. Zuvor hergestellte lebensfähige und kompetente Escherichia coli DH5α-Bakterien wurden mit dem gesamten Reaktionsgemisch transformiert. Die Plasmid-DNA der erhaltenen Klone, selektiert auf mit Ampicillin (50 mg/l) ergänztem LB-Medium, wurde gemäß dem alkalischen Lyseverfahren extrahiert und durch enzymatischen Verdau analysiert. Das resultierende Plasmid wurde als pMRT1218 bezeichnet.
3. Konstruktion von die Promotoren enthaltenden binären Plasmiden
Zum Klonieren der verschiedenen Expressionskassetten wurden drei Arten von binären Vektoren verwendet. Der Vektor pGA492 wurde zum Herstellen der Kassetten, die MPr1116, MPr1146, MPr1147 und MPr1092 enthielten, verwendet, um die Expressionskassetten oder binären Vektoren pMRT1152, pMRT1171, pMRT1172 bzw. pGA492MPr1092 zu erzeugen. Der Vektor pGA492 wurde wie folgt hergestellt. Eine Menge von 25 g des Plasmids pGA492 (An, 1986) wurde 1 h bei 37°C mit 80 Einheiten HindIII verdaut und dann auf einer QIAquick-Affinitätssäule gereinigt. Die 5'-überhängenden Enden dieses Plasmids wurden unter Verwendung von Pfu DNA-Polymerase (Stratagene, La Jolla, USA) gemäß den Empfehlungen des Lieferanten gebluntet. Das so modifizierte Plasmid wurde 1 h bei 37°C mit 80 Einheiten EcoRI verdaut; dann wurde der Vektor, aus dem das 291 bp-Fragment deletiert war, auf 0,7% Agarosegel isoliert und auf einer QIAquick-Affinitätssäule gereinigt. Eine Menge von 25 μg des Plasmids pGA492 (An, 1986) wurde 1 h bei 37°C mit 80 Einheiten HindIII verdaut und dann auf einer QIAquick-Affinitätssäule gereinigt.
Der Vektor pMRT1118 wurde zum Klonieren der Kassetten unter der Kontrolle der Promotoren MPr1162, MPr1164, MPr1165, MPr1167 und MPr1092 verwendet, was die Vektoren pMRT1185, pMRT1186, pMRT1187, pMRT1188 bzw. pMRT1182 ergab.
Das Plasmid pMRT1118 ist in der am 3. September 1999 ebenfalls im Namen des vorliegenden Anmelders eingereichten französischen Patentanmeldung Nr. FR9911112 vollständig beschrieben, wobei dessen spezifische Beschreibung hier durch Bezugnahme aufgenommen wird. Das binäre Plasmid pMRT1118 (5971 pb) resultiert von der Einführung eines mit dem AvrII-Enzym verdauten T-DNA-Fragmentes in die AvrII-Stelle eines anderen dephosphorylierten Plasmids, das in der zuvor erwähnten früheren Anmeldung desselben Anmelders ebenfalls vollständig beschrieben, als pMRT1106 bezeichnet und hier ebenfalls durch Bezugnahme aufgenommen ist.
Zur Durchführung der Insertion wurde die pMRT1106 Plasmid-DNA (5 μg) mit dem AvrII-Enzym verdaut, mit Hilfe des „QIAquick PCR Purification"-Kits gereinigt, dann mit 50 Einheiten alkalischer Phosphatase aus Kalbsdarm (New England Biolabs) in einem Endvolumen des Reaktionsgemisches von 120 μl in Gegenwart von 12 μl 3 × 10 Puffer (New England Biolabs) 1 Stunde bei 37°C dephosphoryliert, durch Elektrophorese auf 0,6% Agarosegel in TBE-Puffer isoliert, mit einem „QIAquick Gel Extraction"-Kit gereinigt, ein zweites Mal unter den oben erwähnten Bedingungen mit der alkalischen Phosphatase aus Kalbsdarm dephosphoryliert, und schließlich mit einem „QIAquick PCR Purification"-Kit gereinigt sowie in 50 μl H₂O übertragen.
Die PCR-Ligationsreaktion wurde mit 32,5 ng verdautem, dephosphoryliertem Plasmid pMRT1106 und 50 ng in einem Reaktionsgemisch-Volumen von 10 μl in Gegenwart von 1 μl T4 10x DNA-Ligasepuffer (New England Biolabs) und 400 Einheiten T4 DNA-Ligase (New England Biolabs) verdauter T-DNA-Fragmente durchgeführt. Die Ligation umfasste 180 Zyklen mit je 2 Schritten, einem ersten 30-sekündigen Schritt bei 10°C und einem zweiten 30-sekündigen Schritt bei 30°C in einem „GeneAmp PCR System 9700"-Thermozyklus.
Zuvor hergestellte lebensfähige und kompetente Escherichia coli DH5α-Bakterien wurden transformiert (Hanahan, 1983). Die Plasmid-DNA der erhaltenen Klone, selektiert auf mit Kanamycin (50 mg/l) ergänztem LB-Medium, wurde gemäß dem alkalischen Lyseverfahren extrahiert (Birnboim und Doly, 1979) und durch enzymatischen Verdau und Sequenzierung nachgewiesen. Das resultierende Plasmid wurde als pMRT1118 bezeichnet.
Dieser Vektor wurde dann folgendermaßen hergestellt: eine Menge von 25 μg Plasmid wurde 1 h bei 37°C mit 80 Einheiten HindIII verdaut und dann auf einer Qiaquick-Affinitätssäule gereinigt. Die 5'-überhängenden Enden dieses Plasmids wurden unter Verwendung von Pfu DNA-Polymerase (Stratagene, La Jolla, USA) gemäß den Empfehlungen des Lieferanten gebluntet. Das so modifizierte Plasmid wurde 1 h bei 37°C mit 80 Einheiten EcoRI verdaut, und dann wurde der Vektor auf 0,7% Agarosegel isoliert und auf einer Qiaquick-Affinitätssäule gereinigt. Dies wurde dann 1 h bei 37°C unter Verwendung von 10 Einheiten alkalischer Phosphatase aus Kalbsdarm (New England Biolabs) gemäß den Empfehlungen des Herstellers dephosphoryliert und dann auf einer QIAquick-Affinitätssäule gereinigt.
Der Vektor pMRT1195 wurde zum Klonieren der Kassetten unter der Kontrolle der Promotoren MPr1116, MPr1154, MPr1162, MPr1163, MPr1164, MPr1165, MPr1167, MPr1168, MPr1169 und MPr1092 verwendet, was die Vektoren pMRT1245, pMRT1246, pMRT1247, pMRT1248, pMRT1249, pMRT1250, pMRT1251, pMRT1252, pMRT1253 bzw. pMRT1254 ergab.
Der Vektor pMRT1195, der auch in der früheren französischen Patentanmeldung Nr. FR 9911112 beschrieben ist, die ebenfalls im Namen des vorliegenden Anmelders am 3. September 1999 eingereicht wurde und hier durch Bezugnahme auf diesen besonderen Aspekt aufgenommen wird, umfasst in dieser Reihenfolge: eine ori RK2-Region, gefolgt von einer ori ColEI-Region, gefolgt von einer nptIII- und einer nptII-Region und dann einer trfA-Region, auf die anschließend eine linksbündige Transfer-DNA-Region, eine nos-Terminator-Region, eine Stabregion (die für Phosphinotricin-Acetyltransferase, ein Herbizidresistenz vermittelndes Protein, codiert), eine Reis-Aktin-Intron-1 Region, eine Polyadenylierungstranskriptionsterminationssignal-Region, eine Region mit mehreren Klonierungsstellen und dann eine rechtsbündige Transfer-DNA-Region. Der Vektor pMRT1195 wurde folgendermaßen hergestellt: Eine Menge von 20 μg des Plasmids pMRT1195 wurde 1 h bei 37°C mit 15 Einheiten HpaI verdaut und dann auf einer QIAquick-Affinitätssäule gereinigt. Der so geöffnete Vektor wurde 1 h bei 37°C mit 10 Einheiten alkalischer Phosphatase aus Kalbsdarm (New England Biolabs) gemäß den Empfehlungen des Herstellers dephosphoryliert und dann auf einer QIAquick-Affinitätssäule gereinigt.
3.1. Produktion von pMRT1152
Die Expressionskassette MPr1116/uidA-IV2/nos term wurde an die modifizierte HindIII-Stelle des binären Plasmids pGA492 kloniert.
Sie wurde aus dem Plasmid pMRT1116 erhalten, das 1 h bei 37°C mit 80 Einheiten PstI verdaut und auf einer QIAquick-Affinitätssäule gereinigt worden war. Die 5'-überhängenden Enden dieses Plasmids wurden unter Verwendung von Pfu DNA-Polymerase (Stratagene, La Jolla, USA) gemäß den Empfehlungen des Lieferanten gebluntet. Das so modifizierte Plasmid wurde 1 h bei 37°C gleichzeitig mit 80 Einheiten EcoRI und 40 Einheiten XmnI verdaut, und dann wurde das der Expressionskassette entsprechende 2,5 kb DNA-Fragment auf 1% Agarosegel getrennt und auf einer QIAquick-Affinitätssäule gereinigt.
Die Ligation wurde mittels Vermischen von 100 ng des wie oben beschrieben hergestellten binären Plasmids pGA492 mit 50 ng der Expressionskassette 1 Nacht bei 18°C in einem Reaktionsvolumen von 20 μl in Gegenwart von 2 μl T4 10X DNA-Ligasepuffer (New England Biolabs) und 400 Einheiten T4 DNA-Ligase (New England Biolabs) durchgeführt. Zuvor hergestellte lebensfähige und kompetente Escherichia coli DH5α-Bakterien wurden mit der Hälfte des Ligationsreaktionsgemisches transformiert. Die Plasmid-DNA der erhaltenen Klone, selektiert auf mit Tetracyclin (12 mg/l) ergänztem LB-Medium, wurde gemäß dem alkalischen Lyseverfahren extrahiert und durch enzymatischen Verdau sowie durch Genamplifikation unter Verwendung des aus der Transfer-DNA des binären Plasmids selektierten Desoxynukleotids 5' ATATGAGACTCTAATTGGATACCGAGGGG 3' und des aus der Expressionskassette in der uidA-Sequenz selektierten Desoxynukleotids 5' TTGATTTCACGGGTTGGG 3' analysiert. Der resultierende Klon wurde als pMRT1152 bezeichnet.
3.2. Produktion des binären Plasmids pMRT1171
Die Expressionskassette MPr1146/uidA-IV2/nos term wurde an die modifizierte HindIII-Stelle des binären Plasmids pGA492 kloniert, indem in gleicher Weise vorgegangen wurde wie beim Plasmid pMRT1152, wobei jedoch die Expressionskassette aus dem Plasmid pMRT1146 isoliert wurde. Der resultierende Klon wurde als pMRT1171 bezeichnet.
3.3. Produktion des binären Plasmids pMRT1172
Die Expressionskassette MPr1147/uidA-IV2/nos term wurde an die modifizierte HindIII-Stelle des binären Plasmids pGA492 kloniert, indem in gleicher Weise vorgegangen wurde wie beim Plasmid pMRT1152, wobei jedoch die Expressionskassette aus dem Plasmid pMRT1147 isoliert wurde. Der resultierende Klon wurde als pMRT1172 bezeichnet.
3.4. Produktion des binären Plasmids pGA492MPr1092
Die Promoter-Fragmente MPr1092 und die uidA-IV2/nos term-Sequenz wurden in das wie oben beschrieben hergestellte binäre Plasmid pGA492 insertiert. Die beiden Fragmente wurden in folgender Weise hergestellt:
– CaMV D35S prom wurde dadurch isoliert, dass 10 μg des Plasmids pJIT163Δ 1 h bei 37°C mit 40 Einheiten KpnI for verdaut wurden. Die Enden dieses linearisierten Plasmids wurden unter Verwendung von 6 Einheiten T4 DNA-Polymerase (New England Biolabs) 30 Min. bei 37°C gemäß den Empfehlungen des Herstellers gebluntet. Das so modifizierte Plasmid wurde auf einer QIAquick-Affinitätssäule gereinigt und dann mit 80 Einheiten HindIII erneut 1 h bei 37°C verdaut. Das dem Promoter entsprechende 743 bp-Fragment wurde auf 0,8% Agarosegel getrennt und dann auf einer QIAquick-Affinitätssäule gereinigt.
– Die Kassette „uidA-IV2/nos term" wurde erhalten, indem 4 μg des Plasmids pMRT1092 1 h mit 40 Einheiten HindIII und EcoRI verdaut wurden. Das 2,2 kb-Fragment, das der Sequenz uidA-IV2/nos term entspricht, wurde auf 0,8% Agarosegel getrennt und dann auf einer QIAquick-Affinitätssäule gereinigt.
Die Ligation zwischen den drei Fragmenten wurde durch Vermischen von 100 ng des binären Plasmids, 50 ng des Promoter-Fragments und 50 ng des der „uidA-IV2/nos term"-Sequenz entsprechenden Fragmentes in einem Reaktionsvolumen von 20 μl in Gegenwart von 2 μl T4 10X DNA-Ligasepuffer (New England Biolabs) und 400 Einheiten T4 DNA-Ligase (New England Biolabs) durchgeführt. Die Inkubation erfolgte in einem Thermozyklus, indem das Ligationsgemisch 198 Zyklen unterzogen wurde, die jeweils aus einer 30-sekündigen Inkubation bei 30°C und einer 30-sekündigen Inkubation bei 10°C bestanden. Zuvor hergestellte lebensfähige und kompetente Escherichia coli DH5α-Bakterien wurden mit der Hälfte des Ligationsreaktionsgemisches transformiert. Die Plasmid-DNA der erhaltenen Klone, selektiert auf mit Tetracyclin (12 mg/l) ergänztem LB-Medium, wurde gemäß dem alkalischen Lyseverfahren extrahiert sowie durch enzymatischen Verdau und Genamplifikation unter Verwendung des aus der Transfer-DNA des binären Plasmids selektierten Desoxynukleotids 5' ATATGAGACTCTAATTGGATACCGAGGGG 3' und des aus der Expressionskassette in der uidA-Sequenz selektierten Desoxynukleotids 5' TTGATTTCACGGGTTGGG 3' analysiert. Einer der zurückbehaltenen Klone wurde als pGA492MPr1092 bezeichnet.
Die Plasmide pMRT1152, pMRT1171, pMRT1172 und pMRT1182 wurden nach dem von Holsters et al. (1978) beschriebenen Verfahren in einen Stamm von Agrobacterium tumefaciens LBA4404 übertragen. Die Plasmid-DNA der erhaltenen Klone, selektiert auf mit Rifampicin (50 mg/l) und mit Tetracyclin (5 mg/l) ergänztem LB-Medium, wurde gemäß dem alkalischen Lyseverfahren extrahiert und durch Zugabe von Lysozym (25 mg/ml) zum Zellresuspensionspuffer modifiziert. Die erhaltene Plasmid-DNA wurde durch enzymatischen Verdau und durch Genamplifikation unter Verwendung des aus dem Plasmid selektierten Desoxynukleotids 5' ATATGAGACTCTAATTGGATACCGAGGGG 3' und des aus der Expressionskassette selektierten Desoxynukleotids 5' TTGATTTCACGGGTTGGG 3' analysiert. Die erhaltenen Agrobakterien-Klone wurde zur Durchführung einer Pflanzengenumwandlung verwendet.
3.5. Produktion der binären Vektoren pMRT1185, pMRT1186, pMRT1187 und pMRT1188:
Die Expressionskassetten MPr1162/uidA-IV2/nos term, MPr1164/uidA-IV2/ nos term, MPr1165/uidA-IV2/nos term und MPr1167/uidA-IV2/nos term wurden aus den Plasmiden spMRT1162, pMRT1164, pMRT1165 bzw. pMRT1167 hergestellt und in das zuvor beschriebene binäre Plasmid pMRT1118 kloniert.
Eine Menge von 10 μg jedes der Plasmide pMRT1162, pMRT1164, pMRT1165 und pMRT1167 wurde 1 h bei 37°C mit PstI verdaut und dann auf einer Affinitätssäule gereinigt. Die 5'-überhängenden Enden dieser verschiedenen geöffneten Vektoren wurden unter Verwendung von Pfu DNA-Polymerase (Stratagene, La Jolla, USA) gemäß den Empfehlungen des Lieferanten gebluntet. Die so behandelten Vektoren wurden erneut 1 h bei 37°C gleichzeitig mit 20 Einheiten EcoRI und 10 Einheiten XmnI verdaut. Bei jedem dieser Verdaue wurde das der Expressionskassette entsprechende DNA-Fragment auf 1% Agarosegel isoliert und auf einer QIAquick-Affinitätssäule gereinigt.
Die Ligation wurde in einem Thermozyklus (GeneAmp PCR Systems 9700) durch Vermischen von 100 ng des wie oben beschrieben hergestellten binären Plasmids pMRT1118 mit 50 ng der Expressionskassette in einem Reaktionsvolumen von 12 μl in Gegenwart von 1,2 μl T4 10X DNA-Ligasepuffer (Epicentre Technologies), 1,2 μl 25 mM ATP-Lösung und 3 Einheiten 10X DNA-Ligase (Epicentre Technologies) durchgeführt. Die Ligationsreaktion bestand aus einer Reihe von 200 identischen Zyklen, die jeweils aus einem 30-sekündigen Schritt bei 10°C und einem 30-sekündigen Schritt bei 30°C bestanden. Zuvor hergestellte, lebensfähige und kompetente Escherichia coli DH5α-Bakterien wurden mit der Hälfte des Ligationsreaktionsgemisches transformiert. Die Plasmid-DNA aus den erhaltenen Klonen, selektiert auf mit Kanamycin (50 mg/l) ergänztem LB-Medium, wurde gemäß dem alkalischen Lyseverfahren extrahiert und durch enyzmatischen Verdau mit den Enzymen BamHI und EcoRI analysiert. Die resultierenden Klone wurden als pMRT1185, pMRT1186, pMRT1187 und pMRT1188 bezeichnet und enthalten jeweils die Promotoren MPr1162, MPr1164, MPr1165 und MPr1167.
3.6. Produktion des binären Vektors pMRT1182 als positive Kontrolle
Der binäre Vektor pMRT1182 wurde durch Insertion des PrD35S CaMV Promoter-Fragmentes und der uidA-IV2/term-nos-Sequenz in das wie oben beschrieben hergestellte binäre Plasmid pMRT1118 erhalten.
Der PrD35S CaMV-Promoter wurde durch sukzessiven 1-stündigen Verdau von 10 μg des Plasmids pJIT163Δ mit KpnI und HindIII bei 37°C isoliert. Das 743 bp-Fragment, das pD35S CaMV entspricht, wurde auf 0,8% Agarosegel isoliert und dann auf einer QIAquick-Affinitätssäule gereinigt.
Die „uidA-IV2/nos term"-Sequenz wurde durch 1-stündigen Verdau von 4 μg des Plasmids pMRT1092 mit 40 Einheiten HindIII und EcoRI erhalten. Das der „uidA-IV2/nos term"-Sequenz entsprechende 2,2 kb-Fragment wurde auf 0,8% Agarosegel isoliert und dann auf einer QIAquick-Affinitätssäule gereinigt.
Die Ligation wurde in Gegenwart von 100 ng des binären Plasmids, 50 ng des PD35S CaMV-Fragmentes und 50 ng des der uidA-IV2/term-nos-Sequenz entsprechenden Fragmentes in einem Reaktionsvolumen of 20 μl in Gegenwart von T4 (1X) DNA-Ligasepuffer und 400 Einheiten T4 DNA-Ligase (New England Biolabs) durchgeführt. Die Inkubation erfolgte, wie zuvor beschrieben, durch PCR-Zyklen in einem „GeneAmp PCR System 9700"-Thermozyklus. Zuvor hergestellte, lebensfähige und kompetente Escherichia coli DH5α-Bakterien wurden mit der Hälfte des Ligationsreaktionsgemisches transformiert. Die Plasmid-DNA der erhaltenen Klone, selektiert auf mit Kanamycin (50 mg/l) ergänztem LB-Medium, wurde gemäß dem alkalischen Lyseverfahren extrahiert und durch enzymatischen Verdau analysiert. Das resultierende Plasmid wurde als pMRT1182 bezeichnet.
3.7. Produktion der binären Vektoren pMRT1245, pMRT1246, pMRT1247, pMRT1248, pMRT1249, pMRT1250, pMRT1251, pMRT1252 und pMRT1253:
Die Expressionskassetten MPr1116/uidA-IV2/nos term, MPr1154/uidA-IV2/nos term, MPr1162/uidA-IV2/nos term, MPr1163/uidA-IV2/nos term, MPr1164/uidA-IV2/nos term, MPr1165/uidA-IV2/nos term, MPr1167/uidA-IV2/nos term, MPr1168/uidA-IV2/nos term und MPr1169/uidA-IV2/nos term wurden aus den Plasmiden pMRT1116, pMRT1154, pMRT1162, pMRT1163, pMRT1164, pMRT1165, pMRT1167, pMRT1168 bzw. pMRT1169 hergestellt und in die HpaI-Stelle des binären Vektors pMRT1195 kloniert.
Eine Menge von je 10 μg der Plasmide pMRT1116, pMRT1154, pMRT1162, pMRT1163, pMRT1164, pMRT1165, pMRT1167, pMRT1168, pMRT1169 wurde 1 h bei 37°C gleichzeitig mit 20 Einheiten PstI, 20 Einheiten EcoRI und 10 Einheiten XmnI verdaut. Bei jedem dieser Verdaue wurde das der Expressionskassette entsprechende DNA-Fragment auf 1% Agarosegel isoliert und auf einer QIAquick-Affinitätssäule gereinigt. Die 5'-überhängenden Enden dieser unterschiedlichen Fragmente wurden unter Verwendung von Pfu DNA-Polymerase (Stratagene, La Jolla, USA) gemäß den Empfehlungen des Lieferanten gebluntet.
Die Ligation wurde in einem Thermozyklus (GeneAmp PCR Systems 9700) durch Vermischen von 100 ng des wie oben beschrieben hergestellten binären Vektors pMRT1195 mit 50 ng der Expressionskassette in einem Reaktionsvolumen von 12 μl in Gegenwart von 1,2 μl T4 10X DNA-Ligasepuffer (Epicentre Technologies), 1,2 μl 25 mM ATP-Lösung und 3 Einheiten 10X DNA-Ligase (Epicentre Technologies) durchgeführt. Die Ligationsreaktion bestand in einer Reihe von 200 identischen Zyklen, die jeweils aus einem 30-sekündigen Schritt bei 10°C und einem 30-sekündigen Schritt bei 30°C bestanden. Zuvor hergestellte, lebensfähige und kompetente Escherichia coli DH5α-Bakterien wurden mit der Hälfte des Ligationsreaktionsgemisches transformiert. Die Plasmid-DNA der erhaltenen Klone, selektiert auf mit Kanamycin (50 mg/l) ergänztem LB-Medium, wurde gemäß dem alkalischen Lyseverfahren extrahiert und durch enzymatischen Verdau mit den Enzymen BamHI und EcoRI analysiert. Die resultierenden Klone wurden als pMRT1245, pMRT1246, pMRT1247, pMRT1248, pMRT1249, pMRT1250, pMRT1251, pMRT1252 und pMRT1253 bezeichnet und enthalten jeweils die Promotoren MPr1116, MPr1154, MPr1162, MPr1163, MPr1164, MPr1165, MPr1167, MPr1168 und MPr1169.
3.8. Produktion des binären Vektors pMRT1254 als positive Kontrolle
Der binäre Vektor pMRT1254 wird bei der Bewertung der Expression in Pflanzen als positive Kontrolle verwendet.
Die Expressionskassette MPr1092/uidA-IV2/nos term wurde in die HpaI-Stelle des wie oben beschrieben hergestellten binären Vektors pMRT1195 kloniert. Sie wurde durch 1-stündigen Verdau von 10 μg des Plasmids pMRT1182 mit 40 Einheiten KpnI bei 37°C, Reinigung des Verdauproduktes auf einer Affinitätssäule und anschließenden Verdau mit 40 Einheiten EcoRI erhalten. Das der Expressionskassette entsprechende 2,8 kb DNA-Fragment wurde auf 1% Agarosegel isoliert und auf einer QIAquick-Affinitätssäule gereinigt. Die 5'-überhängenden Enden dieses Fragmentes wurden mit Pfu DNA-Polymerase (Stratagene, La Jolla, USA) gemäß den Empfehlungen des Lieferanten gebluntet.
Die Ligation wurde in einem Thermozyklus (GeneAmp PCR Systems 9700) durch Vermischen von 100 ng des wie zuvor beschrieben hergestellten binären Vektors pMRT1195 mit 50 ng der Expressionskassette in einem Reaktionsvolumen von 12 μl in Gegenwart von 1,2 μl T4 10X DNA-Ligasepuffer (Epicentre Technologies), 1,2 μl 25 mM ATP-Lösung und 3 Einheiten 10X DNA-Ligase (Epicentre Technologies) durchgeführt. Die Ligationsreaktion bestand aus einer Reihe von 200 identischen Zyklen, die jeweils aus einem 30-sekündigen Schritt bei 10°C und einem 30-sekündigen Schritt bei 30°C bestanden. Zuvor hergestellte, lebensfähige und kompetente Escherichia coli DH5α-Bakterien wurden mit der Hälfte des Ligationsreaktionsgemisches transformiert. Die Plasmid-DNA der erhaltenen Klone, selektiert auf mit Kanamycin (50 mg/l) ergänztem LB-Medium, wurde gemäß dem alkalischen Lyseverfahren extrahiert und durch enzymatischen Verdau mit den Enzymen BamHI und EcoRI analysiert. Der resultierende Klon wurde als pMRT1254 bezeichnet.
3.9. Produktion des binären Vektors pMRT1255 als negative Kontrolle
Der binäre Vektor pMRT1255 wird bei der Bewertung der Expression in Pflanzen als negative Kontrolle verwendet.
Die Expressionskassette, der ein Promoter fehlte und die der „uidA-IV2/nos term"-Sequenz entsprach, wurde in die HpaI-Stelle des binären Vektors pMRT1195 kloniert, um dieses Plasmid als negative Kontrolle zu verwenden.
Diese Sequenz wurde durch 1-stündigen Verdau von 10 μg des Plasmids pMRT1163 mit 40 Einheiten BamHI bei 37°C, Reinigen des Verdauproduktes auf einer Affinitätssäule und anschließenden 1-stündigen Verdau mit 40 Einheiten EcoRI bei 37°C erhalten. Das der promoterlosen Expressionskassette entsprechende 2,2 kb DNA-Fragment wurde auf 1% Agarosegel isoliert und auf einer QIAquick-Affinitätssäule gereinigt. Die 5'-überhängenden Enden dieses Fragmentes wurden mit Pfu DNA-Polymerase (Stratagene, La Jolla, USA) gemäß den Empfehlungen des Lieferanten gebluntet.
Die Ligation wurde in einem Thermozyklus (GeneAmp PCR Systems 9700) durch Vermischen von 100 ng des wie oben beschrieben hergestellten binären Vektors pMRT1195 mit 50 ng der Expressionskassette in einem Reaktionsvolumen von 12 μl in Gegenwart von 1,2 μl T4 10X DNA-Ligasepuffer (Epicentre Technologies), 1,2 μl 25 mM ATP-Lösung und 3 Einheiten 10X DNA-Ligase (Epicentre Technologies) durchgeführt. Die Ligationsreaktion bestand aus einer Reihe von 200 identischen Zyklen, die jeweils aus einem 30-sekündigen Schritt bei 10°C und einem 30-sekündigen Schritt bei 30°C bestanden. Zuvor hergestellte, lebensfähige und kompetente Escherichia coli DH5α-Bakterien wurden mit der Hälfte des Ligationsreaktionsgemisches transformiert. Die Plasmid-DNA der erhaltenen Klone, selektiert auf mit Kanamycin (50 mg/l) ergänztem LB-Medium, wurde gemäß dem alkalischen Lyseverfahren extrahiert und durch enzymatischen Verdau mit den Enzymen BamHI und EcoRI analysiert. Der resultierende Klon wurde als pMRT1255 bezeichnet.
4. Messung und Vergleich der Expressionslevel der unterschiedlichen Promotoren gemäß der Erfindung durch transiente Expressionsversuche
4.1. Kultivierung und Produktion von Pflanzenmaterial
4.1.1 Kultivierung von Tabak in vitro, Blattpräparation
Die transienten Expressionsversuche wurden mit Tabakblättern (Nicotiana tabacum L.) des 6 Wochen alten Kultivars PBD6 durchgeführt.
Reife Tabak-Kultivar PBD6-Samen wurden 10 Min. in einer gesättigten Calciumhypochlorit-Lösung (70 g/l) sterilisiert und dann dreimal 5 Min. mit sterilem, deionisiertem Wasser gespült. Die sterilen Samen wurden auf MS20-Medium gegeben (Murashige und Skoog, 1962) und 6 Wochen in einem Kulturschrank inkubiert (konstante Temperatur von 24°C, Photoperiode 16 h Licht/8 h Dunkelheit, Lichtstärke 200 μmol Photonen.m^–2.sec^–1).
Um während der Transformation eine Teilung der Blattmesophyllzellen zu vermeiden, wurden die 2 Hauptblätter der 6 Wochen alten Tabakpflanzen PBD6 24 h vor der Transformation mit einer Genkanone von der Pflanze exzisiert und mit der holzigen Seite nach oben auf schwaches Plasmolyse BY3-Medium gelegt (4,4 g/l MS Salze, 100 mg/l Myoinositol, 1 mg/l Thiamin, 200 mg/l KH₂PO₄, 30 g/l Saccharose, 45,5 g/l Sorbitol, 1 mg/l 2,4 D, pH 5,8).
4.1.2. Produktion und Präparation von Maissamen
Transiente Expressionsversuche wurden mit dem Endosperm von L2-Maissamen durchgeführt (Kultivar SN 87 165), die von Maispflanzen entnommen wurden, welche in einem Phytotron bei 24°C, 60% relativer Feuchte und einer Photoperiode von 16 h Licht/8 h Dunkelheit kultiviert worden waren.
Zwölf Tage nach Bestäubung (12 DAP) wurden die Maissamen entnommen und 5 Min. in einem 20%igen Bad von Domestos^® unter Rühren sterilisiert. Nach dem Entfernen von Domestos^® durch sukzessives Spülen mit deionisiertem, sterilisiertem Wasser, wurden die Schale und die Aleuron-Zellschicht unter sterilen Bedingungen vorsichtig entfernt. Es wurden Tangentialschnitte des nun freigelegten Endosperms angefertigt und auf mit minimalem Murashige- und Skoog-Medium (MS 5524, Sigma) getränktes Filterpapier gelegt.
4.1.3. Produktion von Maisblättern
Transiente Expressionsversuche wurden mit Blättern von L2-Mais (Kultivar SN 87 165) durchgeführt, die nach zweiwöchiger Kultivierung in einem Phytotron bei 24°C, 60% relativer Feuchte und einer Photoperiode von 16 h Licht/8 h Dunkelheit von der Pflanze entfernt wurden.
Zwölf Tage nach der Keimung wurden die jüngsten Blätter entnommen und 5 Min. in einem 20%igen Bad von Domestos^® unter Rühren sterilisiert. Das Domestos^® wurde durch anschließendes Spülen mit deionisiertem, sterilisiertem Wasser abgezogen, und dann wurden die Blätter mit der holzigen Seite nach oben 24 h auf schwaches Plasmolysemedium N6P6 0,4 M gelegt (3,98 g/l MS Salze, 100 mg/l Vitamine N6, 700 mg/l L-Prolin, 100 mg/l Caseinhydrosylat, 20 g/l Saccharose, 36,4 g/l Sorbitol, 36,4 g/l Mannitol, 1 mg/l 2,4 D, pH 5,8, 3 g/l Phytagel), um eine Teilung der Blattzellen während der Transformation zu vermeiden.
4.2. Goldteilchen-Beschichtung mit der chimären Konstruktions-DNA
Die biolistische Transformation erforderte eine vorherige DNA-Abscheidung auf kugelförmigen Goldperlen mit einem Durchmesser von 0,6 μm, die 10 Min. in absolutem Ethanol (99,98% mit weniger als 0,02% Wasser) sterilisiert, viermal in sterilem, deionisiertem Wasser gewaschen und schließlich maximal 4 Wochen bei –20°C in einer Lösung von 50% Glycerin gelagert worden waren.
Die Konzentration aller Kontroll- und Test-Plasmide, die für die Transformationsversuche verwendet wurden, wurde auf 1 μg/μl eingestellt. In jedem der Transformationsversuche wurde eine interne Referenzkontrolle (pCaMV35Sluc) cotransformiert, um die Abweichungen der GUS-Aktivität zwischen den unterschiedlichen Versuchen zu normalisieren (Leckie et al., 1994).
Das Aufbringen von DNA auf die wie oben hergestellten Goldperlen wurde in einem Sterilschrank unter laminarem Fluß durchgeführt. Ein aliquoter Anteil von 1,8 mg der sterilen Perlensuspension in 30 μl 50%igem Glycerin wurde in einem Vortex-Mischer 1 Min., dann 10 Sek. mit 20 μl einer DNA-Suspension, die 4 μg eines der zu testenden Plasmide und 2 μg des Referenzplasmids pCaMV35Sluc enthielt, heftig vermischt. Dann wurden 20 μl 2,5 M CaCl₂ zugegeben und 10 Sek. heftig vermischt. Anschließend wurden dem Gemisch 20 μl 0,1 M Spermidin zugegeben und das gesamte Gemisch weitere 30 Sekunden in einem Vortex-Mischer gerührt. Die DNA-Beschichtung der Perlen wurde durch 15-minütige Inkubation des Gemisches in Eis fortgesetzt; dann wurden die beschichteten Perlen 5 Sek. bei niedriger Geschwindigkeit zentrifugiert und zweimal in absolutem Ethanol gewaschen.
Nach dem Waschen wurden die beschichteten Perlen in 32 μl absolutem Ethanol resuspendiert, dreimal einer Ultraschallbehandlung mit einer Dauer von je 2 Sekunden unterzogen, in einem Vortex-Mischer 15 Sek. heftig vermischt, dann sofort in 4 identischen aliquoten Anteilen auf sterilen „Makrocarrier"-Platten des Biolistic PDS-1000/He-Systems verteilt, die gemäß den Empfehlungen des Lieferanten (BioRad, Hercule, USA) präpariert waren. Die gesamte Anordnung aus „Makrocarrier-Träger/die Perlenabscheidung tragendem Makrocarrier" wurde 5 Min. trocknen gelassen.
4.3 Beschuss von Tabak-Blattgeweben und transiente Expression
Der Beschuss von Tabakblättern wurde mit einem Biolistic PDS-1000/He-Genkanonensystem unter Befolgung der allgemeinen Empfehlungen des Lieferanten (BioRad, Hercule, USA) bezüglich der Handhabung und Montage der verschiedenen Bauteile der Vorrichtung durchgeführt. Jedes Blatt wurde zweimal hintereinander unter folgenden Beschussbedingungen beschossen:

– der für die Beschleunigung der beschichteten Goldperlen gewählte Heliumdruck betrug 6200 kPa (900 psi);
– die Pflanzenprobe wurde 9 cm von der Perlenbeschleunigungszone entfernt angeordnet;
– der Beschuss wurde im Vakuum bei 27 mm Quecksilber durchgeführt.

Nach dem Beschuss verblieben die Blätter in BY3-Medium und wurden bei 24°C 48 h in Dunkelheit in einem Kulturschrank inkubiert. Diese Inkubation ermöglichte den Ablauf einer transienten Expression der in die Zellen eingeführten Transgene.
4.3.1 Bewertung der Aktivität der unterschiedlichen Promotoren durch histochemische Färbung
Die Sichtbarmachung der Expression von β-Glucuronidase wurde mittels histochemischer Färbung durchgeführt, wie von Jefferson et al. (1987) beschrieben. Nach 48 h im Kulturschrank wurde jedes Blatt entlang der Längsachse der Mittelrippe auseinandergeschnitten. Die eine Hälfte des Blattes wurde in Färbepuffer für β-Glucuronidase (500 mg/l 5-Brom-, 4-Chlor-, 3-Indolylglucuronid (X-Gluc), 0,05% Triton x100 in 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7,0) 48 h bei 37°C inkubiert, während die andere Hälfte in flüssigem Stickstoff eingefroren und dann bei –80°C gelagert wurde.
Nach der Färbung wurden die Blätter gebleicht, indem sie 3 bzw. 12 h in zwei 95%ige Ethanolbäder getaucht, dann in destilliertem Wasser gespült und zwischen zwei Cellophanfolien flach getrocknet wurden. Die Ergebnisse dieser histochemischen Färbungen sind in V dargestellt. Die Promoteraktivität der verschiedenen Konstruktionen wurde anhand der Anzahl blauer Flecken bewertet, die auf jeder Blatthälfte nach zwei Beschüssen sichtbar wurden, wobei die Gesamtmenge der das GUS-Reportergen tragenden DNA 2 μg betrug.
Zwei Kategorien von Promotoren wurden identifiziert. Die mit den Promotoren MPr1116 und MPr1146 beschossenen Blätter zeigten im Durchschnitt eine Anzahl blauer Flecken von deutlich mehr als 150 (VIII) im Vergleich zur Anzahl blauer Flecken, die durch Beschuss der Blätter unter den gleichen Bedingungen und mit der gleichen Menge an Referenz-Kontrollplasmid pMRT1092 erhalten wurde. Die mit den Promotoren MPr1117 und MPr1147 beschossenen Blätter zeigen eine durchschnittliche Anzahl blauer Flecken, die im Bereich von 50 bis 150 liegt (vgl. VIII).
Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass die chimären Promotoren MPr1116 und MPr1146 die Expression von β-Glucuronidase in einem Maße ermöglichen oder fördern, das größer oder gleich dem ist, das unter Verwendung des starken, konstitutiven Referenzpromoters D35S prom erhalten wird.
4.3.2. Quantifizierung der Expression von β-Glucuronidase mit den verschiedenen Promotoren durch luminometrische Bestimmung der enzymatischen Aktivität
Die eingefrorenen Blatthälften wurden in einem Mörser gemahlen, und dann ließ man das Pulver in Extraktionspuffer (25 mM Trisphosphat, pH 7,8, 2 mM Dithiothreitol, 2 mM 1,2-Diaminocyclohexan-N,N,N',N'-Tetraessigsäure, 10% Glycerin, 1% Triton X100) in einem Verhältnis von 1 ml Puffer zu 200 mg Gewebe auftauen. Das Gemisch wurde homogenisiert, dann 15 Min. in Eis inkubiert, bevor es durch 5-minütige Zentrifugation bei 16060 g geklärt wurde.
Die GUS-Aktivität wurde auf 20 μl geklärtem Blattrohextrakt unter Verwendung eines „GUS-Light chemiluminescent reporter gene assay"-Detektionskits (Tropix Inc., Bedford, USA) gemäß den Empfehlungen des Lieferanten bestimmt. Die Bestimmung der Lichtemission wurde unter Verwendung eines Lumat LB-9507-Luminometers (EGG-Berthold, Bad Wildbad, Deutschland) durchgeführt.
Die Luciferaseaktivität wurde auf 20 μl Blattrohextrakt unter Verwendung eines „Luciferase assay system"-Detektionskits (Promega Corp., Madison, USA) gemäß den Empfehlungen des Lieferanten bestimmt. Die Bestimmung der Lichtemission erfolgte unter Verwendung eines Lumat LB 9507-Luminometers.
Die Ergebnisse sind in VI dargestellt. Für jeden Versuch (ein beschossenes Blatt = ein Rohextrakt) wurde das Verhältnis zwischen der mit dem Luminometer bestimmten β-Glucuronidase- und Luciferaseaktivität berechnet. Das Mittel der verschiedenen Versuche für eine bestimmte Konstruktion und der Standardfehler des Mittelwertes wurden bestimmt. Die erhaltenen Ergebnisse zeigen:
Die Promotoren MPr1116 und MPr1146 (IV) scheinen die Expression gegenüber der des Doppel-35S CaMV-Referenzpromoters (MPr1092, II) merklich zu erhöhen. Der Promoter MPr1146 unterscheidet sich vom Promoter MPr1116 durch die Insertion einer Duplikation der „as-2"-Box vor der „as-1"-Box des 35S CaMV-Promoters, der zwischen der „as1-artigen" Box des CoYMV-Promoters und dem Grüngewebe-spezifischen Element des CsVMV-Promoters liegt. Diese Insertion von Elementen des 35S CaMV-Promoters in MPr1146 scheint den durchschnittlichen Expressionsgrad gegenüber dem Promoter MPr1116 geringfügig zu erhöhen (4,5%). Diese Elemente scheinen in einer solchen Kombination an einer positiven Synergie beteiligt zu sein.
Die Promotoren MPr1116 und MPr1117 (IV) unterscheiden sich nur hinsichtlich der Addition einer „as1-artigen" Box des CoYMV-Promoters in MPr1117. Die durch den Promoter MPr1117 vermittelte durchschnittliche Expression ist deutlich geringer als die mit MPr1116 erhaltene Expression (22%). Dieses Ergebnis legt nahe, dass das „as1-artige" Element von CoYMV, das in der 5'-Region des chimären Promoters liegt, eine Rolle als Repressor der Promoteraktivität spielt.
Der Promoter MPr1147 (IV) unterscheidet sich vom Promoter MPr1117 durch die Insertion der „as-1"- und „as-2"-Boxen zwischen dem „as1-artigen" Element des CoYMV-Promoters und dem Grüngewebe-spezifischen Element des CsVMV-Promoters. Die Addition dieser Boxen und die Interaktion mit den anderen Elementen scheinen zu einer deutlichen Verringerung der durchschnittlichen Expressionsrate gegenüber MPr1117 zu führen (43%). Die Assoziation dieser Elemente scheint eine negative Synergie zu begünstigen. Dies kann bei Konstrukten genutzt werden, bei denen das in der transformierten Zelle erforderliche Expressionslevel relativ niedrig ist, z. B. wenn eine Resistenz gegen Antibiotika oder Herbizide zu Selektions- oder Markierungszwecken bereitgestellt wird. Dennoch unterscheidet sich die geringste Expression, die vom Promoter MPr1147 vermittelt wird, nur um 51% von der mit dem Promoter MPr1092 erhaltenen Expression. Dieser negative Effekt könnte im Falle der chimären Promotoren durch eine Konkurrenz mit transaktivierenden Elementen oder auch durch eine sterische Hinderungswirkung dieser Faktoren gegenüber dem Promoter erklärt werden, wodurch dessen Aktivität vermindert wird.
Abschließend ist festzustellen, dass die chimären Promotoren MPr1116 und MPr1146 eine durchschnittliche Expression des GUS-Reportergens in Tabakblättern zu verursachen scheinen, die merklich besser als die mit MPr1092 erhaltene ist. Von diesem letzteren Promoter wird in der Literatur allgemein berichtet, dass er der stärkste chimäre Promoter (in einer Größenordnung von 10-mal größer als der starke konstitutive Promoter CaMV p35S (Kay et al., 1987) sei und routinemäßig zur Transgenese verwendet werde. MPr1116 und MPr1146 können damit unter die stärksten chimären Promotoren eingereiht werden, die bisher bekannt sind.
Die schwächer exprimierenden Promotoren können, wie oben erwähnt, als Promotoren interessant sein, die zur Vermittlung von antibiotischer Resistenz für Selektionszwecke, z. B. in gleicher Weise wie Promotoren des „nos"-Typs, verwendet werden.
IX zeigt komplementäre Ergebnisse. Bei jedem Versuch wurde das Verhältnis zwischen der mit dem Luminometer bestimmten β-Glucuronidaseaktivität und Luciferaseaktivität berechnet. Das gewichtete Mittel der verschiedenen Versuche für eine bestimmte Konstruktion und der Standardfehler des Mittelwertes wurden bestimmt. Die erhaltenen Ergebnisse zeigen:

– Die Promotoren MPr1163 und MPr1165 (vgl. VII) sind, ganz ähnlich wie die Promotoren MPr1116 und MPr1146 (vgl. VII), für eine durchschnittliche Expression des Reportergens verantwortlich, die geringfügig, d.h. 8%, 5%, 6,5% bzw. 11,5%, größer ist als die mit dem Referenz-Promoter MPr1092 erhaltene Expression. Die Promotoren MPr1163 und MPr1165 unterscheiden sich vom Promoter MPr1116 jeweils durch die Insertion von 2 bzw. 4 Serien der as-2/as-2/as-1-Boxen unmittelbar stromabwärts der Grüngewebe-spezifischen Region des CsVMV-Promoters. Diese Insertion mehrerer Boxen des CaMV 35S-Promoters in MPr1116 ermöglicht keine Erhöhung des durchschnittlichen Expressionsgrades gegenüber dem des Promoters MPr1116.
– Der Vergleich der durchschnittlichen Aktivität der Promotoren MPr1146 und MPr1162 zeigt, dass eine Klonierung der Serie der Aktivierungselemente „as-2/as-2/as-1" des CaMV-Promoters in MPr1116 in die 5'-Region der Grüngewebe-spezifischen Region des CsVMV-Promoters, wie dies bei MPr1146 der Fall ist, günstiger ist, als eine Klonierung eben dieser Elemente in die 3'-Region dieser Sequenz, wie dies bei MPr1162 der Fall ist. Diese Daten zeigen, dass die Position der Aktivierungselemente zueinander in einem signifikanten Zusammenhang mit der Fähigkeit des Promoters zur wirksamen Transkription steht. Somit liegt eine Synergie zwischen den Aktivierungselementen vor.
– Der Vergleich der durchschnittlichen Aktivität der Promotoren MPr1162, MPr1163 und MPr1165 zeigt, dass eine Multiplikation der as-2/as-2/as-1-Boxen unmittelbar stromabwärts der Grüngewebe-spezifischen Region des CsVMV-Promoters keinen signifikanten proportionalen Anstieg der Aktivität dieser Promotoren bei der transienten Expression ergibt. Diese Daten zeigen allgemein, dass keine positive Synergie zwischen der Gesamtheit dieser in solchen Kombinationen zusammengestellten Aktivierungselement-Boxen vorlag. Ohne sich auf eine Theorie festlegen zu wollen, könnte dies durch eine Konkurrenz mit Transaktivierungselementen oder auch durch Probleme der sterischen Behinderung dieser Transaktivierungselemente auf dem Promoter zu erklären sein.
– Der berichtete negative Effekt der „as1-artigen" Box von CoYMV, der oben beim Vergleich der Aktivität zwischen den Promotoren MPr1116, der nur eine solche Box aufweist, und MPr1117, der zwei solche Boxen aufweist, erwähnt worden war, hat sich bestätigt. Die Deletion dieser „as1-artigen" Boxen im Promoter MPr1154 ermöglicht gegenüber dem Promoter MPr1147 eine signifikante Erhöhung der Aktivität des Promoters um 65%.
– Die Promotoren MPr1162 und MPr1164 (VII) unterscheiden sich nur in der Ausrichtung der Reihe der as-2/as-2/as-1-Boxen von CaMV stromabwärts der CsVMV-Sequenz. Zwischen diesen beiden Promotoren war kein signifikanter Unterschied festzustellen. Die Ausrichtung dieser Boxen scheint daher zumindest in der derzeitigen Konfiguration keine Auswirkungen auf die Aktivität des chimären Promoters zu haben.

Zusammenfassend ist festzustellen, dass die chimären Promotoren MPr1163 und MPr1165 eine durchschnittliche Expression des GUS-Reportergens in Tabakblättern hervorzurufen scheinen, die zumindest so groß wie die mit dem Promoter MPr1092 erhaltene ist. Die chimären Promotoren MPr1163 und MPr1165 können damit, ganz ähnlich wie die Promotoren MPr1116 und MPr1146, unter die stärksten chimären Promotoren eingereiht werden, die bisher beschrieben wurden, und können daher routinemäßig in Transgeneseprogrammen für zweikeimblättrige Pflanzen als Ersatz für den CaMV D35S (Doppel-35S oder verstärkten) Promoter verwendet werden.
4.4. Beschuss von Mais und transiente Expression
Der Beschuss verschiedener Maisgewebe sowie u.a. junger Blätter und von Albumin wurde mit einem Biolistic PDS-1000/He-Genkanonensystem unter Anwendung der allgemeinen Empfehlungen des Lieferanten (BioRad, Hercule, USA) bezüglich der Handhabung und Montage der verschiedenen Bauteile der Vorrichtung durchgeführt. Jedes Endosperm wurde zweimal in Folge mit Wolframteilchen eines Durchmessers von 0,6 μm unter folgenden Beschussbedingungen beschossen:

– der Heliumdruck zum Beschleunigen der Teilchen betrug 6200 kPa (900 psi);
– die Pflanzenprobe wurde 6 cm von der Teilchenbeschleunigungszone angeordnet;
– der Beschuss wurde im Vakuum bei 27 mm Quecksilber durchgeführt.

Nach dem Beschuss wurde das Endosperm in seiner Lage belassen und in einem Kulturschrank 24 h bei 26°C in Dunkelheit inkubiert, um eine transiente Expression der in die Zellen eingebrachten Transgene zu ermöglichen.
4.5. Bewertung der Aktivität unterschiedlicher Promotoren in Mais-Endosperm durch histochemische Färbung
Die Sichtbarmachung der Expression von β-Glucuronidase wurde mittels histochemischer Färbung, wie von Jeffersson et al. (1987) beschrieben, durchgeführt. Nach 24 h in einem Kulturschrank wurde jede Endosperm-Portion 48 h bei 37°C in Gegenwart des Substrates 5-Brom-, 4-Chlor-, 3-Indolylglucuronid, von X-Gluc bei 500 mg/l in 0,1 M Phosphatpuffer bei pH 7,0, dem Triton x100 0,05% zugegeben worden war, inkubiert.
Nach dem Färben wurden die Endosperm-Portionen in Wasser gespült und dann in einem 96%igen Ethanolbad aufbewahrt.
Die Promoterativität der verschiedenen Konstruktionen wurde anhand der Anzahl blauer Flecken bewertet, die sich nach zwei Beschüssen auf jeder Endosperm-Portion zeigten, wobei insgesamt 2 μg DNA, die das GUS-Reportergen trug, vorlagen.
Eine Analyse der Ergebnisse der histochemischen Färbungen zeigte, dass zwei Kategorien von Promotoren identifiziert werden konnten. Das mit den Promotoren MPr1092, MPr1116, MPr1146 und MPr1147 beschossene Endosperm zeigte im Durchschnitt relativ wenige blaue Flecken mit geringem Durchmesser, deren Anzahl im Bereich von 0 bis 15 lag. Das mit den Promotoren MPr1154, MPr1162, MPr1163, MPr1164, MPr1167 und MPr1169 und mit dem Referenz-Kontrollpromoter MPr1218 beschossene Endosperm zeigte eine Anzahl blauer Flecken im einschließlichen Bereich von 10 bis 30, deren Durchmesser größer als der mit den obigen, zuvor beschriebenen Promotoren erhaltene war.
4.6. Bewertung der β-Glucuronidaseexpression in Mais-Endosperm mittels luminometrischer Enzymassay-Bestimmung
Gefrorene Portionen Endosperm wurden in einem Röhrchen in Extraktionspuffer (25 mM Trisphosphat, pH 7,8, 2 mM Dithiothreitol, 2 mM 1,2-Diaminocyclohexan-N,N,N',N'-tetraessigsäure, 10% Glycerin, 1% Triton X100) unter Verwendung von 1 ml Puffer pro 200 mg Gewebe gemahlen. Das Gemisch wurde homogenisiert und dann 15 Min. in Eis inkubiert, bevor es durch 5-minütige Zentrifugation bei 16060 g geklärt wurde. Die GUS-Aktivität wurde mit 20 μl des geklärten Rohextraktes unter Verwendung eines „GUS-Light chemiluminescent reporter gene assay"-Detektionskits (Tropix Inc., Bedford, USA) gemäß den Empfehlungen des Lieferanten gemessen. Die Messung der Lichtemission wurde mit einem Lumat LB 9507-Luminometer (EGG-Berthold, Bad Wildbad, Deutschland) durchgeführt.
Die Luciferaseaktivität wurde mit 20 μl Rohextrakt mit einem „Luciferase assay system"-Detektionskit (Promega Corp., Madison, USA) gemäß den Empfehlungen des Lieferanten gemessen. Die Messung der Lichtemission wurde mit einem Lumat LB 9507-Luminometer durchgeführt.
Die Ergebnisse sind in VIII dargestellt. Für jeden Rohextrakt wurde die Beziehung zwischen der mit dem Luminometer bestimmten β-Glucuronidaseaktivität und Luciferaseaktivität berechnet. Dann wurden das Mittel der verschiedenen Versuche für eine bestimmte Konstruktion und der Standardfehler des Mittelwertes bestimmt. Die erhaltenen Ergebnisse zeigen, dass der ursprüngliche virale Promoter MPr1116 eine Aktivität vermittelt, die 3,8-mal stärker als die mit dem Referenz-Promoter MPr1218 erhaltene ist. Dies zeigt, dass der chimäre Promoter, der „Endosperm-artige" Boxen enthält, die zur Expression des GUS-Reportergens in Maissamen notwendigen Signale besitzt. Die chimären Promotoren MPr1162, MPr1163, MPr1164 und Mpr1165, die vom Promoter Mpr1116 abgeleitet sind, weisen eine Aktivität auf, die zwischen 4,7- und 6-mal stärker als die mit MPr1218 erhaltene und zwischen 1,2- und 1,6-mal stärker als die mit MPr1116 erhaltene ist. Angesichts der Tatsache, dass alle von MPr1116 abgeleiteten chimären Promotoren die gleiche Grundsequenz besitzen, die abgesehen von den Aktivierungselementen des CaMV-Promoters die gleichen Regulierungselemente oder Boxen aufweist, scheinen die festgestellten Unterschiede der Aktivität durch die von CaMV entnommenen Aktivierungselemente bedingt zu sein.
Die Promotoren, die eine Duplikation der „as1-artigen" Box von CoYMV enthalten, was bei den Promotoren MPr1167, MPr1168 und MPr1169 der Fall ist, zeigen alle im Durchschnitt eine Aktivität, die deutlich geringer als bei den Promotoren ist, die nur eine einzige „as1-artige" Box enthalten, wie dies bei den Promotoren MPr1162, MPr1163, MPr1164 und MPr1165 der Fall ist. Diese Ergebnisse scheinen den Repressoreffekt dieses Elementes von CoYMV, der bereits bei der transienten Expression in Tabak zu beobachten war, zu bestätigen. Der Vergleich der durchschnittlichen Aktivitäten, die von den Promotoren MPr1116 und MPr1154 vermittelt werden, zeigt jedoch, dass die Abwesenheit der „as1-artigen" Box und ihre Ersetzung durch eine aktivierende Sequenz „as-2/as-1" von CaMV in MPr1154 nicht zu einem Anstieg der Aktivität gegenüber MPr1116 führt. Daher scheint wohl eher die Position der Boxen unmittelbar in der 5'-Region der 104 bp-Sequenz von CsVMV ungünstig für die Aktivität zu sein, und nicht die Boxen selbst.
Ohne sich auf eine Theorie festlegen zu wollen, ist es wahrscheinlich, dass die Bindung von Transaktivatoren in dieser Position eine Strukturveränderung der gesamten „Promotersequenz/Protein"-Anordnung hervorruft, und dass dies für die Bindung anderer Aktivierungselemente und/oder des Transkriptionssystems ungünstig ist.
Die Analyse der Ergebnisse zeigt, dass die Anzahl der Wiederholungen der Kombination von „as-2/as-2/as-1"-Boxen wahrscheinlich die Aktivität der chimären Promoter bedingt. Beispielsweise war eine Erhöhung der durchschnittlichen Aktivität zwischen MPr1162, der eine einzige Serie von Elementen besitzt, MPr1163, der zwei solche Serien besitzt, und MPr1165, der 4 solche Serien besitzt, zu beobachten, auch wenn die Unterschiede nicht sehr signifikant erscheinen. In gleicher Weise erhöht sich die Aktivität zwischen MPr1169, MPr1169 und MPr1167, die jeweils 1, 2 bzw. 3 Serien von Boxen aufweisen.
Schließlich scheint die Ausrichtung dieser Aktivierungsboxen oder -elemente keine Folgen für die Aktivität zu haben, da kein signifikanter Unterschied zwischen den Promotoren MPr1162 und MPr1164 zu beobachten war.
Abschließend lässt sich feststellen, dass die gemäß der vorliegenden Erfindung erzeugten chimären Promotoren in einkeimblättrigen Pflanzen funktionsfähig und operabel sind und insbesondere in Mais-Albumin starke Aktivität zeigen. Die Promotoren MPr1163 und MPr1165 sind die Promotoren, welche 12 Tage nach der Bestäubung die stärkste Aktivität des GUS-Gens bei der transienten Expression in Mais-Endosperm zeigen. Diese Aktivität findet auf hohem Niveau statt, da sie etwa 6-mal höher als die ist, die mit dem starken Promoter erhältlich ist, der für die aktive Expression von Gamma-Zein, dem Hauptspeicherprotein in Mais-Albumin, verantwortlich ist. Diese Promotoren können daher routinemäßig in Transgeneseprogrammen für einkeimblättrige Pflanzen als wirksame Alternative zu anderen heterologen Promotoren verwendet werden.
5. Expression der verschiedenen Promotoren in Tabak nach stabiler Transformation
5.1. Stabile Transformation von Tabak
Eine Tabak-Transformation (Nicotiana tabacum L., Kultivar PBD6) wurde durch Infektion von Blattscheiben von 6 Wochen alten Tabakpflanzen mit rekombinanten Agrobakterien gemäß dem von Horsch et al. (1985) beschriebenen Verfahren durchgeführt.
Während der Transformation wurden die Petrischalen unter folgenden Bedingungen in einem Kulturschrank inkubiert: eine Temperatur von 24°C, eine Photoperiode von 16 h in der Nacht/8 h am Tag, eine Lichtstärke von 200 μmol Photonen.m^–2.sec^–1, und abgesehen vom anfänglichen Cokultivierungsschritt wurden alle Kallogenese-, Regenerations- und Verwurzelungsschritte auf unterschiedlichen selektiven Medien durchgeführt, die mit Augmentin^® (400 mg/l) und Kanamycin (200 oder 100 mg/ml) ergänzt waren.
Die verschiedenen eingesetzten Schritte und Medien waren die folgenden:

– ein Cokultivierungsschritt mit einer Dauer von drei Tagen, bei dem die Agrobakterien die Pflanzenzellen infizieren, auf einem festen MS30-Cokulturmedium (Medium mit MS-Base (Murashige und Skoog, 1962), ergänzt mit 4,4 g/l Vitaminen (Gamborg et al., 1968) (Sigma, M0404), 30 g/l Saccharose, 8 g/l Agar (Merck), pH 5,7), ergänzt mit 1 mg/l Benzylaminopurin und 0,1 mg/l Indol-3-essigsäure;
– zwei Knospungsschritte mit einer Dauer von je zwei Wochen in einem Kulturschrank auf festem MS20-Regenerationsmedium (Salze und Vitamine, MS 4,4 g/l (Sigma, M0404), 20 g/l Saccharose, 8 g/l Agar (Merck), pH 5,7), ergänzt mit 1 mg/l Benzylaminopurin, 0,1 mg/l Indol-3-essigsäure, 400 mg/l Augmentin^® und 200 mg/l Kanamycin;
– ein Entwicklungs- und Verwurzelungsschritt mit einer Dauer von 3 Wochen in einem Kulturschrank auf festem MS20-Entwicklungsmedium, ergänzt mit 400 mg/l Augmentin^® und 100 mg/l Kanamycin;
– ein Schritt zum Umtopfen in Glastöpfe in einem Kulturschrank auf festem MS20-Entwicklungsmedium, ergänzt mit 400 mg/l Augmentin^® und 100 mg/l Kanamycin.

5.2. Messung und Vergleich der β-Glucuronidaseaktivität in regenerierten Tabakpflanzen
Die β-Glucuronidaseaktivität wurde bei Proben von transgenen Pflanzen der ersten Generation gemessen, die 2 Wochen nach ihrer Akklimatisierung in einem Gewächshaus genommen wurden. Von jeder Pflanze wurden drei Blattproben genommen, eine von einem „gealterten" Blatt (das sich auf der unteren Blattebene befand), eine von einem reifen Blatt (das sich auf einer mittleren Blattebene befand), und eine von einem jungen Blatt (das sich am Pflanzenscheitel befand).
Jede Probe wurde in flüssigem Stickstoff in einem Mörser gemahlen, und dann wurde das Pulver in Extraktionspuffer (25 mM Trisphosphat, pH 7,8, 2 mM Dithiothreitol, 2 mM 1,2-Diaminocyclohexan-N,N,N',N'-Tetraessigsäure, 10% Glycerin, 1% Triton X100) in einem Verhältnis von 1 ml Puffer zu 200 mg Gewebe resuspendiert. Das Gemisch wurde homogenisiert und dann 15 Min. in Eis inkubiert, bevor es durch 5-minütige Zentrifugation bei 16060 g geklärt wurde.
Die GUS-Aktivität wurde bei 20 μl geklärtem Blattrohextrakt unter Verwendung eines „GUS-Light chemiluminescent reporter gene assay"-Detektionskits (Tropix Inc., Bedford, USA) gemäß den Empfehlungen des Lieferanten gemessen. Die Messung der Lichtemission wurde mit einem Lumat LB 9507-Luminometer (EGG-Berthold, Bad Wildbad, Deutschland) durchgeführt.
Die Gesamtmenge des im Rohextrakt vorhandenen Proteins wurde nach dem Bradford-Verfahren (1976) mit einem „BioRad protein assay" (BioRad, München, Deutschland) gemessen.
Zitierte Literatur

An G. (1986). Development of plant promoter expression vector and their use for analysis of differential activity of nopaline synthase promoter in transformed tobacco cells. Plant Physiol. 81, 86-91.
Barany F. (1991). The ligase chain reaction in a PCR world. PCR Methods Appl. 1, 5-16.
Birnboim H. C. und Doly J. (1979). A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA. Nuc. Ac. Res. 7, 1513.
Bradford M. (1976). A rapid and sensitive method for the detection of microgram quantities of proteins utilizing the principle of protein-dye binding. Anal.Biochem. 72, 248-254.
Fromm M. E., Taylor L. P. und Walbot V. (1986). Stable transformation of maize after gene transfer by electroporation. Nature, 319, 791-793.
Gamborg O. L., Miller R. A. und Ojima K. (1968). Nutrient requirements of suspension cultures of soybean root cells. Exp. Cell Res. 50, 151-158.
Gaubier P., Raynal M., Hull G., Huestis G. M., Grellet F., Arenas C., Pages M. und Delseny M. (1993). Two different Em-like genes are expressed in Arabidopsis thaliana seeds during germination. Mol. Gen. Genet. 238, 409-418.
Guérineau und Mullineaux (1993). In Plant molecular biology labfax, Croy R. R. D. (Hrsg.), BioS Scientific Publishers, Blackwell Scientific Publications.
Jefferson R. A., Burgess S. M. und Hirsh D (1986). b-Glucuronidase as a genefusion marker. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 83, 8447-8451.
Jefferson R. A., Kavanagh T. A. und Bevan M. W. (1987). GUS fusions : β-glucuronidase as a sensitive und versatile gene fusion marker in higher plants. EMBO J. 6, 3901-3907.
Hanahan D. (1983). Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids. J. Mol. Biol. 166, 557.
Holsters M., Dewaele D., Depicker A., Messenf E., Van Montagu M. und Schell J. (1978). Transfection und transformation of Agrobacterium tumefaciens. Mol. Gen. Genet. 136, 181-187.
Horsch R. B., Fry J. E., Hoffmann N. L., Eiholtz D., Rogers S. G. und Fraley R. T. (1985). A simple and general method for transferring genes into plants. Science 227, 129-1231.
Kay R., Chan A., Daly M. und McPherson J. (1987). Duplication of CaMV 35S promoter sequences creates a strong enhancer for plant genes. Science 236, 1299-1302.
Lam E., Benfey P. N., Gilmartin P. M., Fang R. X. und Chua N. H. (1989). Sitespecific mutations alter in vitro factor binding and change promoter expression pattern in transgenic plants. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 7890-7894.
Lam E. und Chua N. H. (1989). ASF-2 : a factor that binds to the Blumenkohlmosaikvirus 35S Promoter und a conserved GATA box in Cab promoters. Plant Cell, 1, 1147-1156.
Last D. I. und Gray J. C. (1989). Plastocyanin is encoded by a single-copy gene in the pea haploid genome. Plant Mol. Biol. 12, 655-666.
Leckie L., Devoto A. und Lorenzo G. (1994). Normalization of GUS by LUC activity from the same cell extract reduces transformation variability. Biotechniques 17, 52-56.
Murashige T. und Skoog F. (1962). A revised medium for rapid growth und bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant. 15, 473-497.
Medberry S. L., Lockhart B. E. L. und Olszewski N. E. (1992). The Commelina Yellow Mottle Virus promoter is a strong promoter in vascular and reproductive tissues. Plant Cell, 4, 185-192.
Pwee K. H. und Gray J. C. (1993). The pea plastocyanin promoter directs cell-specific but not full light-regulated expression in transgenic tobacco plants. Plant J. 3, 437-449.
Sanger F., Nicklen S. und Coulson A. R. (1977). DNA sequencing with chainterminating inhibitors. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463-5467.
Torrent M., Alvarez I., Geli M. I., Dalcol I. und Ludevid D. (1997). Lysine-rich modified g-zein accumulate in protein bodies of transiently transformed maize endosperms. Plant Mol. Biol. 34, 139-149.
Vancanneyt G., Schmidt R., O'Connor-Sanchez A., Willmitzer L. und Rocha-Sosa M. (1990). Construction of an intron-containing marker gene: Splicing of the intron in transgenic plants and its use in monitoring early events in Agrobacterium-mediated plant transformation. Mol. Gen. Genet. 220, 245-250. Verdaguer B., von Kochko A., Beachy R. N. und Fauquet C. (1996).
Isolation and expression in transgenic tobacco and rice plants of the Cassava Vein Mosaic Virus (CsVMV) promoter. Plant Mol. Biol. 31, 1129-1139.

SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Chimärer Expressionspromoter mit mindestens einer Nukleinsäuresequenz, die aus einem ersten, vom Commelina Yellow Mottle Virus (CoYMV) stammenden Pflanzen-Promoter besteht, mit einem pflanzlichen, vaskulären Expressionspromoterbereich, der durch eine Nukleinsäuresequenz ersetzt ist, die aus einem zweiten, vom Cassava Vein Mosaic Virus (CsVMV) stammenden Pflanzen-Promoter besteht, und mit einem pflanzlichen Grüngewebe-Expressionspromoterbereich.
Chimärer Expressionspromoter nach Anspruch 1, der zumindest einen Teil einer Nukleinsäuresequenz aufweist, die im Sequenzprotokoll mit der Nummer SEQ.ID01 gekennzeichnet und zumindest mit einem Teil einer Nukleinsäuresequenz fusioniert ist, die im Sequenzprotokoll mit der Nummer SEQ.ID02 gekennzeichnet ist.
Chimärer Promoter nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Nukleinsäuresequenz des chimären Promoters aus einer Sequenz besteht, die aus der Gruppe der Sequenzen ausgewählt ist, welche im Sequenzprotokoll mit den Nummern SEQ.ID03, SEQ.ID04, SEQ.ID05, SEQ.ID06, SEQ.ID07, SEQ.ID19, SEQ.ID20, SEQ.ID21, SEQ.ID22, SEQ.ID23, SEQ.ID24 und SEQ.ID25 gekennzeichnet sind.
Chimärer Promoter nach einem der vorhergehenden Ansprüche, der ferner mindestens eine „Endosperm-artige" Box aufweist.
Chimärer Promoter nach einem der vorhergehenden Ansprüche, der ferner mindestens eine „as1-artige" Box aufweist, die mit der Nukleinsäuresequenz des pflanzlichen Grüngewebe-Expressionspromoters operabel verknüpft ist.
Chimärer Promoter nach einem der vorhergehenden Ansprüche, der ferner mindestens eine „as2"-Box aufweist, die mit der Nukleinsäuresequenz des pflanzlichen Grüngewebe-Expressionspromoters operabel verknüpft ist.
Chimärer Promoter nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die eine oder die mehreren „as1-artigen", „as1"- und „as2"-Boxen stromaufwärts oder stromabwärts der Nukleinsäuresequenz des pflanzlichen Grüngewebe-Expressionspromoters operabel verknüpft ist/sind.
Chimärer Promoter nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die eine oder die mehreren „as1-artigen", „as1"- und „as2"-Boxen in normaler (5' > 3') oder umgekehrter (3' > 5') Ausrichtung operabel verknüpft ist/sind.
Chimärer Promoter nach einem der vorhergehenden Ansprüche, der mindestens eine „as2/as2/as2"-Box in normaler (5' > 3') oder umgekehrter (3' > 5') Ausrichtung aufweist.
Chimärer Promoter nach einem der Ansprüche 4 bis 9, der mindestens eine Sequenz aufweist, die aus der Gruppe der Sequenzen ausgewählt ist, welche im Sequenzprotokoll mit den Nummern SEQ.ID03, SEQ.ID04, SEQ.ID05, SEQ.ID06, SEQ.ID07, SEQ.ID19, SEQ.ID20, SEQ.ID21, SEQ.ID22, SEQ.ID23, SEQ.ID24 und SEQ.ID25 gekennzeichnet sind.
Expressionskassette mit mindestens einer Nukleinsäuresequenz, die aus einem ersten, vom Commelina Yellow Mottle Virus (CoYMV) stammenden Pflanzen-Promoter besteht, mit einem pflanzlichen, vaskulären Expressionspromoterbereich, der durch eine Nukleinsäuresequenz ersetzt ist, die aus einem zweiten, vom Cassava Vein Mosaic Virus (CsVMV) stammenden Pflanzen-Promoter besteht, und mit einem pflanzlichen Grüngewebe-Expressionspromoterbereich, wobei die Sequenzen mit einer (einem) für ein herzustellendes Polypeptid codierenden Nukleinsäuresequenz oder Gen operabel verknüpft sind, die (das) wiederum mit einer Transkriptionsterminations-Nukleinsäuresequenz operabel verknüpft ist.
Expressionskassette nach Anspruch 11, die zumindest einen Teil einer Nukleinsäuresequenz aufweist, die im Sequenzprotokoll mit der Nummer SEQ.ID01 gekennzeichnet und mit zumindest einem Teil einer Nukleinsäuresequenz fusioniert ist, die im Sequenzprotokoll mit der Nummer SEQ.ID02 gekennzeichnet ist.
Expressionskassette nach Anspruch 12, wobei die Promoter-Nukleinsäuresequenz aus einer Sequenz besteht, die aus der Gruppe der Sequenzen ausgewählt ist, welche im Sequenzprotokoll mit den Nummern SEQ.ID03, SEQ.ID04, SEQ.ID05, SEQ.ID06, SEQ.ID07, SEQ.ID19, SEQ.ID20, SEQ.ID21, SEQ.ID22, SEQ.ID23, SEQ.ID24 und SEQ.ID25 gekennzeichnet sind.
Isolierte Promoter-Nukleinsäuresequenz, die eine Fusion mindestens eines Promoter-Teils jeder der im Sequenzprotokoll mit den Nummern SEQ.ID01 und SEQ.ID02 gekennzeichneten Sequenzen umfasst.
Isolierte Promoter-Nukleinsäuresequenz nach Anspruch 14, die einer der Sequenzen entspricht, welche im Sequenzprotokoll mit den Nummern SEQ.ID03, SEQ.ID04, SEQ.ID05, SEQ.ID06, SEQ.ID07, SEQ.ID19, SEQ.ID20, SEQ.ID21, SEQ.ID22, SEQ.ID23, SEQ.ID24 und SEQ.ID25 gekennzeichnet sind.
Direktionaler Desoxynukleotid-Baustein zur Konstruktion eines chimären Expressionspromoters oder einer isolierten Promoter-Nukleinsäuresequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 10 oder 14 oder 15, wobei der Baustein der Sequenz entspricht, die im Sequenzprotokoll mit der Nummer SEQ.ID08 gekennzeichnet ist.
Direktionaler Desoxynukleotid-Baustein zur Konstruktion eines chimären Expressionspromoters oder einer isolierten Promoter-Nukleinsäuresequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 10 oder 14 oder 15, wobei der Baustein der Sequenz entspricht, die im Sequenzprotokoll mit der Nummer SEQ.ID09 gekennzeichnet ist.
Direktionaler Desoxynukleotid-Baustein zur Konstruktion eines chimären Expressionspromoters oder einer isolierten Promoter-Nukleinsäuresequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 10 oder 14 oder 15, wobei der Baustein der Sequenz entspricht, die im Sequenzprotokoll mit der Nummer SEQ.ID10 gekennzeichnet ist.
Direktionaler Desoxynukleotid-Baustein zur Konstruktion eines chimären Expressionspromoters oder einer isolierten Promoter-Nukleinsäuresequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 10 oder 14 oder 15, wobei der Baustein der Sequenz entspricht, die im Sequenzprotokoll mit der Nummer SEQ.ID11 gekennzeichnet ist.
Direktionaler Desoxynukleotid-Baustein zur Konstruktion eines chimären Expressionspromoters oder einer isolierten Promoter-Nukleinsäuresequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 10 oder 14 oder 15, wobei der Baustein der Sequenz entspricht, die im Sequenzprotokoll mit der Nummer SEQ.ID12 gekennzeichnet ist.
Direktionaler Desoxynukleotid-Baustein zur Konstruktion eines chimären Expressionspromoters oder einer isolierten Promoter-Nukleinsäuresequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 10 oder 14 oder 15, wobei der Baustein der Sequenz entspricht, die im Sequenzprotokoll mit der Nummer SEQ.ID13 gekennzeichnet ist.
Direktionaler Desoxynukleotid-Baustein zur Konstruktion eines chimären Expressionspromoters oder einer isolierten Promoter-Nukleinsäuresequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 10 oder 14 oder 15, wobei der Baustein der Sequenz entspricht, die im Sequenzprotokoll mit der Nummer SEQ.ID14 gekennzeichnet ist.
Desoxynukleotid-Führungsbaustein zur Konstruktion eines chimären Expressionspromoters oder einer isolierten Promoter-Nukleinsäuresequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 10 oder 14 oder 15, wobei der Baustein der Sequenz entspricht, die im Sequenzprotokoll mit der Nummer SEQ.ID15 gekennzeichnet ist.
Desoxynukleotid-Führungsbaustein zur Konstruktion eines chimären Expressionspromoters oder einer isolierten Promoter-Nukleinsäuresequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 10 oder 14 oder 15, wobei der Baustein der Sequenz entspricht, die im Sequenzprotokoll mit der Nummer SEQ.ID16 gekennzeichnet ist.
Desoxynukleotid-Führungsbaustein zur Konstruktion eines chimären Expressionspromoters oder einer isolierten Promoter-Nukleinsäuresequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 10 oder 14 oder 15, wobei der Baustein der Sequenz entspricht, die im Sequenzprotokoll mit der Nummer SEQ.ID17 gekennzeichnet ist.
Desoxynukleotid-Führungsbaustein zur Konstruktion eines chimären Expressionspromoters oder einer isolierten Promoter-Nukleinsäuresequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 10 oder 14 oder 15, wobei der Baustein der Sequenz entspricht, die im Sequenzprotokoll mit der Nummer SEQ.ID18 gekennzeichnet ist.
Vektor mit einem Promoter oder einer Promoter-Nukleinsäuresequenz, der in der Lage ist, die Transkription einer Nukleinsäuresequenz oder eines Gens, die (das) für ein herzustellendes Polypeptid codiert, zu initiieren, wobei der Promoter oder die isolierte Promoter-Nukleinsäuresequenz einem chimären Expressionspromoter oder einer Promoter-Nukleinsäuresequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 10 oder 14 oder 15 entspricht.
Transgene Pflanze, in deren Genom mindestens ein Promoter oder mindestens eine Promoter-Nukleinsäuresequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 10 bzw. 14 oder 15 stabil integriert ist.
Transgene Pflanze nach Anspruch 28, die unter zweikeimblättrigen Arten, vorzugsweise Kartoffel, Tabak, Baumwolle, Kopfsalat, Tomate, Melone, Gurke, Erbse, Raps, Zuckerrübe oder Sonnenblume, oder unter einkeimblättrigen Arten, vorzugsweise Weizen, Gerste, Hafer, Reis oder Mais, ausgewählt ist
Propagul einer transgenen Pflanze nach einem der Ansprüche 28 oder 29.
Propagul einer transgenen Pflanze nach Anspruch 30, bei dem es sich um einen Samen handelt.
Zelle, die einen Promoter oder eine Promoter-Nukleinsäuresequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 10 bzw. 14 oder 15 enthält und vorzugsweise eine Pflanzen-, Menschen-, Tier-, Insekten-, Bakterien-, Hefe-, Pilz-, Algen- oder Mikroalgenzelle ist.
Zelle nach Anspruch 32, bei der es sich um eine Pflanzenzelle handelt.
Verfahren zum Exprimieren einer/eines interessierenden Nukleinsäuresequenz oder Gens, die/das für ein herzustellendes Polypeptid codiert, durch eine Zelle, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: – Transformieren der Zelle mit einem Vektor, der mindestens einen Promoter oder mindestens eine Promoter-Nukleinsäuresequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 10 oder 14 bis 15 aufweist; – Kultivieren der Zelle unter Bedingungen, welche die Expression der/des interessierenden Nukleinsäuresequenz oder Gens, die/das für das herzustellende Polypeptid codiert, ermöglichen.
Verfahren nach Anspruch 34, wobei die Zelle eine prokaryontische oder eukaryontische Zelle ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 34 oder 35, wobei die Zelle eine Zelle ist, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Bakterien-, Pilz-, Hefe-, Insekten-, Menschen-, Tier-, Algen-, Mikroalgen- und Pflanzenzellen besteht.
Verfahren nach einem der Ansprüche 34 bis 36, wobei die Zelle eine Pflanzenzelle ist.
Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze nach einem der Ansprüche 28 oder 29 oder eines Propaguls nach Anspruch 30, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: – Transformieren einer Pflanzenzelle mit einem Vektor, der mindestens einen Promoter oder mindestens eine Promoter-Nukleinsäuresequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 10 oder 14 oder 15 aufweist; – Auswählen der Pflanzenzelle, in welche der Promoter oder die Promoter-Nukleinsäuresequenz integriert ist; – Propagieren der transformierten, ausgewählten Pflanzenzelle durch Kultivierung oder durch Regeneration ganzer chimärer oder transgener Pflanzen.