DE69921180T2

DE69921180T2 - Künstliche matrix-anheftungsregion zur erhöhung der expression von in pflanzen eingeführten genen

Info

Publication number: DE69921180T2
Application number: DE69921180T
Authority: DE
Inventors: H.M. Apolonia VAN DER GEEST; Michael W. AINLEY; M. Neil COWEN; E. Mary WELTER; T. Aaron WOOSLEY
Original assignee: Dow AgroSciences LLC
Current assignee: Corteva Agriscience LLC
Priority date: 1998-12-01
Filing date: 1999-11-30
Publication date: 2005-02-17
Anticipated expiration: 2019-12-01
Also published as: AU1833100A; EP1135512B1; DE69921180D1; JP4544748B2; ES2232190T3; JP2002531097A; ATE279524T1; WO2000032800A1; EP1135512A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Molekularbiologie der Pflanzen und insbesondere eine Technologie zur Verstärkung der Expression von Genen, welche in transformierte Pflanzenzellen eingebracht wurden.
Durch die Verwendung von rekombinanter DNA-Technologie und Gentechnologie ist es möglich geworden, gewünschte DNA-Sequenzen in Pflanzenzellen einzubringen, um die Expression von interessanten Proteinen zu ermöglichen. Pflanzen mit genetisch veränderten Eigenschaften, wie etwa beispielsweise Insektenresistenz, Krankheitsresistenz, Resistenz gegen Trockenheit, Herbizidresistenz oder metabolische Veränderungen, welche die Produktion von nützlichen Pflanzenprodukten steigern oder verändern, sind sehr vielversprechend im Hinblick auf eine Verbesserung der Landwirtschaft.
Das Erhalten von gewünschten Expressionsniveaus von DNA, welche in Pflanzenzellen eingebracht wird, bleibt eine Herausforderung. Ein Problem, welches als "Positionseffekt"-Variation bezeichnet wird, ist die Variation der Expression des gleichen Gens in unabhängigen Transformanten. Die Verwendung von natürlich vorkommenden DNA-Sequenzen, welche als Matrix-Anheftungsregionen oder Gerüst-Anheftungsregionen bezeichnet werden, um dieses Problem zu bekämpfen, wurde im U.S. Patent 5,773,689 und in WO 94/24293 vorgeschlagen.
Die vorliegende Erfindung stellt ein neues synthetisches DNA-Molekül bereit, welches Basenpaar 11 bis 309 der SEQ ID NO: 1 umfasst, welches als eine Matrix-Anheftungsregion verwendbar ist, um die Expression von Genen zu steigern, die in transformierte Pflanzen eingebracht wurden.
In einem anderen Aspekt stellt die Erfindung ein DNA-Konstrukt bereit, umfassend in der 5' nach 3'-Richtung: eine in Pflanzenzellen funktionelle Transkriptionsinitiationsregion, ein Strukturgen, welches operativ mit der Transkriptions initiationsregion verbunden ist, einen 3' nicht translatierten Bereich und eine Matrix-Anheftungsregion, umfassend Basenpaar 11 bis 309 von SEQ ID NO: 1 entweder in 5'-Position bezüglich der Transkriptionsinitiationsregion oder in 3'-Position bezüglich des Strukturgens. In einer bevorzugten Ausführungsform ist eine erste Matrix-Anheftungsregion, umfassend Basenpaar 11 bis 309 von SEQ ID NO: 1, in 5'-Position bezüglich der Transkritptionsinitiationsregion angeordnet, und eine zweite Matrix-Anheftungsregion, umfassend Basenpaar 11 bis 309 von SEQ ID NO: 1, ist in 3'-Postion bezüglich der 3' nicht translatierten Region angeordnet.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform umfasst die Matrix-Anheftungsregion der Erfindung zwei oder mehr Tandemkopien von Basenpaar 11 bis 309 der SEQ ID NO: 1.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 ist ein Schaubild, welches die Strategie zum Zusammenbauen der künstlichen MAR von SEQ ID NO: 1 zeigt.
2 ist eine schematische Darstellung des Reis-Transformationskonstrukts ArGOS2Af, welches das MAR-Dimer enthält.
3 ist ein Diagramm, worin die relative GUS-Aktivität für mehrere Reis-Transformationsereignisse verglichen wird unter Verwendung des Konstrukts GOS2, das keine MAR enthält, und dem Konstrukt ArGOS2Af, das ein künstliches MAR-Dimer enthält.
4 ist ein Schaubild, welches die Wirkung der künstlichen MAR auf den Expressionsbereich des GUS-Reportergens in transgenen Reispflanzen zeigt.
5 ist eine schematische Darstellung des Arabidopsis-Transformationskonstrukts ArAct2Af und aaaaAfAct2Af. ArAct2Af enthält Kopien des MAR-Dimers in entgegengesetzten Orientierungen, die das Reportergen flankieren. AfAct2Af enthält Kopien des MAR-Dimers in der gleichen Orientierung, die das Reportergen flankieren.
6 ist ein Diagramm, welches die relative GUS-Aktivität von mehreren Arabidopsis-Transformationsereignissen vergleicht unter Verwendung Konstrukts Act2, welches keine MAR enthält, und den Konstrukten ArAct2Af und AfAct2Af, welche ein künstliches MAR-Dimer enthalten.
7 ist ein Diagramm, welches die Wirkung der künstlichen MAR auf den Expressionsbereich des GUS-Reportergens in transgenen Arabidopsis-Pflanzen zeigt.
Beschreibung der Sequenzen

SEQ ID NO: 1 beschreibt die künstliche MAR der Erfindung.
SEQ ID NO: 2 bis 4 beschreiben ARBP-Stellen.
SEQ ID NO: 5 beschreibt eine ATF-Stelle.
SEQ ID NO: 6 beschreibt eine BEAF-32-Stelle.
SEQ IID NO: 7 bis 9 beschreiben Topoisomerase II-Stellen.
SEQ ID NO: 10 beschreibt eine „Unwinding-Sequenz".
SEQ ID NO: 11 bis 17 beschreiben SATB I-Stellen.
SEQ ID NO: 18 beschreibt beispielhafte „Bending-DNA".
SEQ ID NO: 19 beschreibt ein beispielhaftes A/T-System.
SEQ ID NO: 20 beschreibt synthetisches MAR-A.
SEQ ID NO: 21 beschreibt synthetisches MAR-B.
SEQ ID NO: 22 beschreibt synthetisches MAR-C.
SEQ ID NO: 23 beschreibt synthetisches MAR-D.
SEQ ID NO: 24 beschreibt synthetisches MAR-E.
SEQ ID NO: 25 beschreibt synthetisches MAR-F.
SEQ ID NO: 26 beschreibt das 3'-MAR-Dimer in pArGOS2Af-hpt und ArAct2Af- bin.
SEQ ID NO: 27 beschreibt den Reis-Transformationsvektor pGOS2-hpt.
SEQ ID NO: 28 beschreibt den Reis-Transformationsvektor pArGOS2Af-hpt.
SEQ ID NO: 29 beschreibt das 5'-MAR-Dimer in pArGOS2Af-hpt und ArAct2Af- bin.
SEQ ID NO: 30 beschreibt den Dikotylen-Transformationsvektor pAct2-bin.
SEQ ID NO: 31 beschreibt den Dikotylen-Tranformationsvektor pArAct2Af-bin.
SEQ ID NO: 32 beschreibt den Dikotylen-Transformationsvektor pAfAct2Af-bin.
SEQ ID NO: 33 beschreibt das 3'-MAR-Dimer in pAfAct2Af-bin.

Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Eukaryontische Kerne sind hochorganisierte Strukturen, in welchen die gesamte genetische Information in geordneter Art und Weise für die Replikation, Transkription und andere Zellereignisse zugänglich sein muss (Lewin, 1994; Dillon und Grosveld, 1994; Jackson, 1995; Wolffe, 1994). Gene sind normalerweise in Chromatinschleifen von verschiedenen Größen organisiert, welche an eine proteinartige Kernmatrix angeheftet sind an Stellen, welche als Matrix-Anheftungsregionen (MARs) bekannt sind. MARs sind oft in nicht transkribierten Regionen von Genen lokalisiert und es wird angenommen, dass sie die physikalischen Grenzen von einzelnen DNA-Schleifen bilden. In mehreren Fällen wurde gezeigt, dass MARs den Positionseffekt in transgenen Organismen verringern. Es wurde gezeigt, dass die MAR aus Hühnerlysozym die Expression steigert, die Varianz verringert und die Expression einer benachbarten Genkopienzahl in stabil transfizierten Zellen abhängig macht (Stief et al., 1989) bei transgenen Mäusen (Bonifer et al., 1990, McKnight et al., 1992) und in transgenen Tabakpflanzen (Mlynárová et al., 1994; Mlynárová et al., 1995).
Aber nicht alle MARs besitzen diese Wirkungen auf die Genexpression. Zwei minimale Drosophila-MARs (eines lokalisiert zwischen den Histon H1- und H3-Genen und das andere nahe den Hitzeschock HSP70-Genen) stimulierten die Expression mehr als 10-fach in stabil transformierten Zellen, aber das Vorliegen dieser MARs verringerte den Positionseffekt nicht (Poljak et al., 1994). MARs von der Apolipoproteindomäne steigerten die Expression und verringerten den Positionseffekt in Transformanten mit geringer Kopienzahl, aber die Expression in Transformanten mit mehreren Kopien wurde stark unterdrückt (Kalos und Fournier, 1995). Wenn ein ftz-MAR aus Drosophila an einer anderen Chromosomenlokation platziert wurde, reorganisierte es die Chromatinstruktur nicht und das Chromatinfragment, welches die MAR enthielt, konnte leicht aus dem Nucleus eluiert werden, was darauf hindeutet, dass eingebrachte MARs nicht notwendigerweise Chromatindomänen bilden (Eggen und Jack, 1991). Im Gegensatz dazu waren MARs, welche den Enhancer des Genlocus der schweren Kette des Immunglobulin m flankieren, für hohe Expressionsniveaus und die Bildung einer ausgedehnten DNase I-sensitiven Domäne in transgenen B-Lymphozyten erforderlich, aber nicht in stabil transfizierten Gewebekulturzellen (Forrester et al., 1994).
Ergebnisse bei der Verwendung von MARs in transgenen Pflanzen sind ähnlich komplex (Spiker und Thompson, 1996). Eine MAR aus Hefe steigerte die Expressionsniveaus in stabil transformierten Tabakkalluslinien, aber es konnte kein Zusammenhang zwischen der Kopienzahl und dem Expressionsniveau gefunden werden (Allen et al., 1993). Im Gegensatz dazu wurde gezeigt, dass das MAR-Element von dem Hitzeschockgen Gmhsp17.6-L der Sojabohne Expressionniveaus steigern konnte, aber eine geringe Wirkung auf die Variabilität besaß (Schöffl et al., 1993). Eine Sojabohnen-MAR, welche ein Reportergenkonstrukt flankierte, verringerte die Variabilität der Expression im Vergleich mit einem Konstrukt ohne MARs, aber verringerte auch die Expressionsniveaus, wenn sie in 5'-Position und 3'-Position eines Reportergenkonstrukts in transgenen Tabackallus vorlag (Breyne et al., 1992). Es ist möglich, dass einzelne MARs neben ihrer Matrixbindungsfähigkeit unterschiedliche funktionelle und strukturelle Eigenschaften besitzen (Breyne et al., 1994).
MARs sind normalerweise 300 bis 2000 Basenpaare lang, reich an Adenosin- und Thyminresten und enthalten oft bestimmte konservierte Sequenzelemente und Strukturmerkmale. Die meisten in der Literatur beschriebenen MARs werden nicht aus Pflanzen erhalten, sondern es ist gut dokumentiert worden, dass MARs aus anderen Organismen Pflanzengerüste binden und umgekehrt (Dietz et al., 1994; Breyne et al., 1992).
Tabelle 1 beschreibt Sequenzelemente, welche in MARs vorliegen, die in der Literatur beschrieben werden, einschließlich der folgenden Pflanzen-MARs: Hitzeschockproteingen-MAR aus der Sojabohne (Schöffl et al., 1993); Petunien-MAR (Dietz et al., 1994); das Plastocyaningen-MAR aus der Erbse (Slatter et al., 1991); die 5'- und 3'-MARs des Adh1-Gens aus Mais (Avramova und Bennetzen, 1993; Avramova et al., 1995); die 5'- und 3'-MARs des b-Phaseolingens (van der Geest et al., 1994).
K: G oder T, M: A oder C, N: A, C, G oder T, R: A oder G, S: C oder G, W: A oder T, Y: C oder T.
Die vorliegende Erfindung nutzt einen Teil der in Tabelle 1 beschriebenen Merkmale in einer neuen künstlichen MAR. Die Sequenz der künstlichen MAR mit 327 bp ist in SEQ ID NO::1 angegeben. Die künstliche MAR wurde als eine Sequenz entworfen, flankiert von Bg/ll und BamHl Restriktionsstellen, welche in der SEQ ID NO:1 enthalten sind, aber welche für die Funktion der MAR unkritisch sind. Der funktionelle Teil der MAR umfasst Basenpaar 11 bis 309 der SEQ ID NO:1.
Die folgenden Merkmale werden in der SEQ ID NO:1 gefunden:
Die 3' UTR oder 3' nicht translatierte Region, welche in erfindungsgemäßen Konstrukten verwendet wird, ist eine Region, welche ein effizientes Prozessieren des mRNA verleiht, die Stabilität der Matrize beibehält und die Zugabe der Adenosinribonukleotide an das 3'-Ende der transkribierten mRNA-Sequenz richtet. Die 3' UTR kann mit der Promotorregion nativ sein, mit dem Strukturgen nativ sein oder kann aus einer anderen Quelle stammen. Geeignete 3' UTRs umfassen, sind aber nicht beschränkt auf: die per5 3' UTR und die 3' UTR des Nopalinsyntase (nos)-Gens.
Beispiel 1
Synthese einer künstlichen MAR
Um die künstliche MAR zu konstruieren, wurden sechs einzelne Oligonukleotide synthetisiert und mittels PCR zusammengefügt. Die Sequenzen der sechs Oligonukleotide, hierin nachfolgend als MAR-A, MAR-B, MAR-C, MAR-D, MAR-E und MAR-F bezeichnet, sind im Sequenzprotokoll als SEQ ID NO:20 bis 25 entsprechend angegeben. Eine Überlagerung von 15 bp zwischen benachbarten Oligonukleotiden ermöglichte das Zusammenfügen der MAR mittels PCR unter Verwendung der in 1 gezeigten Strategie.
Für die DNA-Amplifikation wurde das GeneAmp^TM PCR-Reagenzienkit mit AmpIiTaq DNA-Polymerase (Perkin Elmer, Norwalk, CT) verwendet. Zwanzig Zyklen der PCR (Denaturierung: 30 sec bei 94°C; Annealing: 60 sec bei 52°C und Verlängerung: 60 sec bei 70°C) mit den Primern MAR-C und MAR-D wurden gefolgt von zwanzig Zyklen der PCR mit den Primern MAR-B und MAR-E unter Verwendung des Produkts aus der ersten Reaktion als Templat für die zweite Reaktion. Das Produkt mit 231 bp dieser Reaktion wurde aus einem Agarosegel mit geringem Schmelzpunkt gereinigt und als ein Templat für 20 Zyklen einer PCR mit den Primern MAR-A und MAR-F verwendet. Das Produkt mit 327 bp aus dieser Reaktion wurde unter Verwendung des TA Cloning^TM Kits (Invitrogen, San Diego, CA) in pCR2.1 subkloniert und die Sequenz wurde durch Sequenzierung überprüft.
Ein Dimer bestehend aus zwei Tandemkopien des Bg/II/BamHI Fragments wurde in die BamHI Stelle von pBluescript^TM SK- (Stratagene, La Jolla, CA) eingebracht. Die Sequenz des Dimers ist bp 5 – 630 von SEQ ID NO:26.
Beispiel 2
Bindung der künstlichen MAR an Kerngerüste
A. Kontrollen
Zwei DNA-Fragmente mit ähnlicher Größe und Nukleotidzusammensetzung wie die künstliche MAR wurden aus Pflanzen-DNA ampflifiziert, um in dem Bindungsassay als Kontrollen zu dienen. Diese Fragmente waren ein 657 bp Fragment vom 3'-Ende eines Maisgens Gpa1 (Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase Untereinheit A, GenBank Signatur X15408, Basen 4516 bis 5173, Quigley et al., 1989), und ein 488 bp Fragment von der 5'-flankierenden Region eines alpha Zeingens mit 19 kDa (GenBank Signatur X105911, Basen 339 bis 827, Kriz et al., 1987). In Tabelle 2 werden die Merkmale verglichen, welche in der künstlichen MAR und den Kontrollfragmenten vorliegen.
Tabelle 2
B. Herstellung von Kernen aus Maisblättern
Kerne für die Verwendung bei der Isolierung von Kerngerüsten wurden aus jungen Maisblättern durch Anpassung eines veröffentlichten Protokolls präpariert (Hall et al., 1991). Die Kerne wurden gezählt und durch mikroskopische Untersuchung von mit DAPI gefärbten Aliquots hinsichtlich ihrer Integrität geprüft. Es wurden nur Kerne mit hoher Qualität zur Präparation von Kerngerüsten mittels Lithiumdijodsalicylatextraktion verwendet.
Für die Kernreinigung wurden junge Maisblätter von Pflanzen des V4-Stadiums (das vierte oder fünfte Blatt) mit einer Rasierklinge geerntet, gewaschen und getrocknet. Nach der Entfernung der Mittelrippe wurden die Blätter in flüssigem Stickstoff eingefroren und mit Mörtel und Pistill zu einem feinen Pulver gemahlen. Die pulverförmigen Blätterproben wurden in einen Glasbecher übertragen und 5 ml NIB1 + PI (0,5 M Hexylenglykol, 20 mM Piperazin-N,N'-bis[2-ethansulfonsäure] (PIPES), pH 6,5, 20 mM KCI, 7 mM 2-Mercaptoethanol, 0,5 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), 0,4% Triton X-100^TM [Rohm & Haas Company, Philadelphia, PA], 0,05 mM Spermin, 0,125 mM Spermidin, 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF), 1 μg/ml Leupeptin, 1 μg/ml Aprotinin) wurden pro Gramm Blattgewebe zugegeben. Der Blattextrakt wurde nacheinander durch Filter mit 1900, 520, 125, 85 und 40 mm bei 4°C filtriert und die Filter wurden mit 1 ml NIB1+PI pro Gramm Blätter gespült, um alle Kerne zu sammeln, welche in den Trümmern zurückgehalten wurden. 15 ml roher Kernextrakt wurden auf Percoll^TM-Gradienten (Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) geladen, welche aus 7 ml 40% Percoll in NIB1 (0,5 M Hexylenglykol, 20 mM PIPES, pH, 6,5, 20 mM KCI, 7 mM 2-Mercaptoethanol, 0,5 mM EDTA, 0,4% Triton^TM X-100, 0,05 mM Spermin, 0,125 mM Spermidin) und 5 ml 70% Percoll in NIB1 bestanden. Nach einer Zentrifugation für 15 Minuten bei 500xg bei 4°C wurde die 40%/70%-Grenzfläche mit einer sterilen Pasteurpipette gesammelt und zu 2 Volumina NIB2 (0,5 M Hexlenglykol, 20 mM PIPES, püH 6,5, 20 mM KCI, 7 mM 2-Mercaptoethanol, 0,5 mM EDTA, 0,05 mM Spermin, 0,125 mM Spermidin) zugegeben, wobei darauf ge achtet wurde, dass das Pellet und andere Trümmer gemieden wurden. Die Kerne wurden durch Zentrifugation bei 600xg für 10 Minuten bei 4°C aufkonzentriert.
Das Kernpellet wurde in 20 ml NIB2 resuspendiert und wie zuvor zentrifugiert. Dieser Schritt wurde noch einmal wiederholt, um Spuren von Percoll wegzuwaschen. Die Kerne wurden unter Verwendung eines Hämocytometers gezählt und in NIB2 +PI/50% Glycerol (0,5 M Hexylenglykol, 20 mM PIPES, pH 6,5, 20 mM KCI, 7 mM 2-Mercaptoethanol, 0,5 mM EDTA, 0,05 mM Spermin, 0,125 mM Spermidin, 50% Glycerol, 1 mM PMSF, 1 μg/ml Leupeptin, 1 μg/ml Aprotinin) mit 20 Millionen Kerne/ml resuspendiert. Die Kerne wurden bis zur Verwendung für die Gerüstpräparation bei –80°C eingefroren.
C. Herstellung von Kerngerüsten
Die gefrorenen Kerne wurden aufgetaut und mit 10 ml NIB3+PI (0,5 M Hexylenglykol, 20 mM PIPES, pH 6,5, 20 mM KCI, 7 mM 2-Mercaptoethanol, 0,05 mM Spermin, 0,125 mM Spermidin, 1 mM PMSF, 1 μg/ml Leupeptin, 1 μg/ml Aprotinin) pro 20 Millionen Kerne gewaschen. Die Kerne wurden durch Zentrifugation bei 600xg für 10 Minuten gesammelt, in 200 ml NIB3+PI in Gegenwart von 1 mM CuSO₄ resuspendiert und für 10 Minuten bei 42°C inkubiert, um die Kerne zu stabilisieren.
Die Histone wurden durch Inkubation in 10 ml HIB+PI (20 mM HEPES, pH 7,4, 100 mM Lithiumacetat, 10 mM LIS (Lithiumdijodsalicylat), 0,1 % Digitonin, 2 mM EDTA, 1 mM PMSF, 1 μg/ml Leupeptin, 1 μg/ml Aprotinin) für 15 Minuten bei Raumtemperatur extrahiert. Die resultierenden Kernhalos wurden in ein Zentrifugenröhrchen transferiert und bei 4000xg für 10 Minuten zentrifugiert. Die Halos wurden zweimal mit 10 ml HWB (20 mM Tris, pH 8, 70 mM NaCl, 20 mM KCI, 7 mM 2-Mercaptoethanol, 0,1 % Digitonin, 0, 05 mM Spermin, 0,125 mM Spermidin) und einmal mit D/BB+PI (HWB + 10 mM MgCl₂, 1 mM PMSF, 1 μg/ml Leupeptin, 1 μg/ml Aprotinin) gewaschen, um das LIS zu entfernen. Falls die Halos nicht gut pelletierten, wurden nachfolgende Zentrifugationsschritte durchgeführt bei 6000xg unter Verwendung einer Anlage mit einer langsamen Bremse. Die Qualität der Halos wurde durch SDS-PAGE Gel bestätigt, um sicherzustellen, dass mehr als 95% der Histone in dem Extraktionsverfahren entfernt wurden.
Die gewaschenen Kernhalos wurden in 400 μl D/BB+PI resuspendiert und es wurden 200 Units Restriktionsenzyme zugegeben (jeweils 100 U EcoRI und HindIII) und bei 37°C für 2 – 3 Stunden auf einer Schüttelplattform inkubiert, damit die Halos sich nicht absetzten. Die Restriktionsenzyme entfernten mehr als 70% der Kern-DNA, wobei Kerngerüste erzeugt wurden. Die Gerüste wurden bei 300xg pelletiert und mit HWB+PI (HWB + 1 mM PMSF, 1 μg/ml Leupeptin, 1 μg/ml Aprotinin) gewaschen. Die Kerngerüste wurden in 400 μl HWB+PI resuspendiert und in Aliquots von 100 μl aufgeteilt (enthaltend 5 Millionen Kernäquivalente).
D. Bindung einer künstlichen MAR an Kerngerüste
100 μl Aliquots der Gerüste in HWB+PI wurden mit Sonde und Kompetitor-DNA aus E. coli bei 37°C für 2 – 3 Stunden in siliconisierten Mikrozentrifugenröhren auf einem Schüttler mit Schüttelplattform inkubiert. Nach der Inkubation wurde die Fraktion des Überstands (welche ungebundene DNA-Fragmente enthielt) und die Fraktion des Pellets (welche Gerüste und gebundene DNA-Fragmente enthielt) über Zentrifugation in einer horizontalen Mikrofuge bei 3000xg für 5 Minuten getrennt. Das Pellet wurde einmal mit 200 μl HWB gewaschen, um Proteinaseinhibitoren zu entfernen, in 100 μl Lysepuffer (10 mM Tris, pH 8, 10 mM EDTA, 0,5% SDS, 0,5 mg/ml Proteinase K) resuspendiert und über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert.
Gleiche Fraktionen des Pellets und des Überstands wurden auf einem 0,9%igen Agarosegel aufgetrennt, welches anschließend durch Einweichen für 20 Minuten in 7% TCA fixiert, getrocknet und bei Raumtemperatur gegenüber einem Röntgenfilm und/oder gegenüber Speicher-Phosphorscheiben für den Phosphorimager^TM SI (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA) exponiert wurde.
Die Plasmide, welche das künstliche MAR-Monomer oder -Dimer enthielten oder die Gpa1- oder Zein-Kontrollsequenzen wurden mit Restriktionsenzymen verdaut, welche 5'-Überhangenden erzeugen. Die Klenow-Untereinheit der DNA-Polymerase 1 wurde verwendet, um den Überhang mit [a-³²P] dCTP (Amersham Life Science, Arlington Heights, IL) aufzufüllen. Die endmarkierten DNA-Fragmente wurden als Sonden im Bindungsassay verwendet, d.h. die Fragmente wurden mit gereinigten Maiskerngerüsten in Gegenwart von nicht markierter Kompetitor-DNA aus E. coli inkubiert und die relative Bindung der Inserts wurde bestimmt. Die relativen Mengen von Kernen, Sonde und nicht markierter Kompetitor-DNA aus E. coli, welche im Bindungsassay verwendet wurden, wurden optimiert, um eine maximale Unterscheidung zwischen stark und schwach bindenden MARs zu erhalten. Die optimalen relativen Mengen betrugen 2, 5 oder 20 μg nicht markierter Kompetitor-DNA aus E. coli, 5 Millionen Kernäquivalente von Kerngerüsten und 1 fmol des verdauten und markierten Plasmids pro Assay.
Das künstliche MAR-Dimer band sehr stark an die Kerngerüstpräparation, sogar in Gegenwart von hohen Mengen der Kompetitor-DNA. Die Monomer-MAR band ebenso an Kerngerüstpräparationen, obgleich mit einer geringeren Affintität. Keine der Kontrollsequenzen wurde in der Pelletfraktion zurückgehalten, sogar wenn sie hinsichtlich Größe und relativem AC-Gehalt ähnlich war wie die künstlichen MARs. Dies deutet darauf hin, dass die in der künstlichen MAR enthaltenen Elemente die Bindung erleichtern.
Beispiel 3
Bewertung der künstlichen MAR in Reis
A. Reis-Transformationsvektoren
PGOS2-hpt (SEQ-ID NO: 27) ist ein Reis-Transformationsvektor, welcher einen Hygromycin-Selektionsmarker, der von dem 35S Promotor kontrolliert wird und eine GOS2/GUS/nos Kassette (GOS2-Transkriptionsinitiationsregion/GUSStrukturgen/nos 3' nicht translatierte Region) enthält. Die GOS2-Transkriptionsinitiationsregion in diesem Konstrukt umfasst 1010 bp des Promotors und 170 bp des nicht translatierten 5'-Leaders, unterbrochen durch ein Intron von 1100 bp (de Pater et al., 1992).
PArGOS2Af-hpt (SEQ ID NO:28) ist ein Reis-Transformationsvektor, welcher identisch ist mit pGOS2-hpt, außer dass in ihm das MAR-Dimer der SEQ ID NO:29 in 5'-Position bezüglich der GOS2-Transkriptionsinitiationsregion und das MAR-Dimer von SEQ ID NO:26 in 3'-Position bezüglich des nos 3' UTR enthalten ist.
Eine schematische Darstellung des ArGOS2Af Konstrukts wird in 2 abgebildet.
B. Transformation von Reis
Zur Initiierung von embryogenem Kallus wurden reife Samen eines Japonica-Kultivars Taipei 309 geschält und in 70% Ethanol für 5 – 7 Minuten oberflächensterilisiert, gefolgt von einem 30 – 45-minütigem Einweichen in 25% kommerzieller Bleiche (2,6% Natriumhypchlorit) mit 0,2% Tween^TM 20 (ICI Americas, Inc.) unter Vakuum. Die Samen wurden dann 5 mal in sterilem destilliertem Wasser gespült und auf Filterpapier platziert, ehe sie auf Induktionsmedium (NB) übertragen wurden. Das NB-Medium bestand aus N6-Makroelementen (Chu, 1978), B5-Mikroelementen und Vitaminen (Gamborg et al., 1968), 300 mg/ml Caseinhydrolysat, 500 mg/l L-Prolin, 500 mg/l L-Glutamin, 30 g/l Saccharose, 2 mg/l 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure (2,4-D) und 2,5 g/l Gelrite^TM (Merck & Co., Rawhay, NJ), wobei der pH auf 5,8 eingestellt wurde. Die auf Induktionsmedium kultivierten reifen Samen wurden im Dunkeln bei 28°C für 3 Wochen inkubiert. Primärkallus, induziert von der Scutellumregion des reifen Embryos, wurde für eine weitere Erhaltung auf frisches NB-Medium transferiert und danach während eines zweiwöchigen Subkulturzeitraums darauf gehalten.
Um die DNA für den Beschuss herzustellen, wurden etwa 140 μg der Plasmid-DNA (pGOS2-hpt oder pArGOSAf-hpt) auf 60 mg Goldpartikel präzipitiert. Die Plasmid-DNA wurde auf Goldpartikel mit 1,5 – 3,0 Mikrometer (Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI) oder 1,0 Mikrometer (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) präzipitiert. Das Präzipitationsgemisch enthielt 60 mg vorgewaschene Goldpartikel, 300 μl Wasser/DNA (140 μg), 74 μl 2,5 M CaCl₂ und 30 μl 0,1 M Spermidin. Nach der Zugabe der Bestandteile in der obigen Reihenfolge wurde das Gemisch vorsichtig geschüttelt und für 2 – 3 Minuten stehengelassen. Der Überstand wurde abpipettiert und verworfen. Die mit DNA beschichteten Goldpartikel wurden in 1 ml 100% Ethanol resuspendiert und auf 17,5 mg DNA/7,5 mg Gold/ml Ethanol zur Verwendung in den Beschussexperimenten verwendet.
Für den Heliumbeschuss wurden aktiv wachsende embryogene Kalluskulturen mit einer Größe von 2 – 4 mm vor dem Heliumbeschuss einer Hochosmosebehandlung unterzogen durch Platzieren des Kallus auf NB-Medium mit 0,2 M Mannit und 0,2 M Sorbit (Vain et al., 1993). Nach der Osmosebehandlung wurden die Kalluskulturen auf ein Medium für den Beschuss (NB+2% Agar) übertragen und mit einer Edelstahlscheibe (230 Mikrometer) bedeckt. Der Heliumbeschuss umfasste das Beschleunigen der suspendierten, mit DNA beschichteten Goldpartikel in Richtung auf die präparierten Gewebeziele und in die präparierten Gewebeziele hinein. Die verwendete Vorrichtung war ein früherer Prototyp der Vorrichtung, welche in dem US Patent Nr. 5,141,131 beschrieben ist, das hierin als Referenz enthalten ist, obgleich beide auf ähnliche Art und Weise funktionieren. Die Kalluskulturen wurden bei unterschiedlichen Heliumdrücken behandelt (1750 – 2250 psi), ein- bis dreimal pro Ziel. Nach dem Beschuss wurde der Kallus über Nacht zurück auf das Hochosmosemedium übertragen, eher er auf einem Selektionsmedium platziert wurde, das aus NB-Medium mit 30 mg/l Hygromycin bestand. Nach zwei Wochen wurden die Kulturen auf frisches Selektionsmedium mit höheren Konzentrationen des Selektionsmittels transferiert, d.h. NB + 50 mg/l Hygromycin (Li et al., 1993).
Kompakte, weiß-gelbe embryogene Kalluskulturen, erhalten auf NB + 50 mg/l Hygromycin, wurden regeneriert durch einen Transfer auf Präregenerations (PR)-Medium + 50 mg/l Hygromycin. Das PR-Medium bestand aus NB-Medium mit 2 mg/l Benzylaminopurin (BAP, 1 mg/l Naphthalenessigsäure (NAA) und 5 mg/l Abscisinsäure (ABA). Nach zwei Wochen Kultur im Dunkeln wurden sie auf Regenerations (RN)-Medium übertragen. Die Zusammensetzung des RN-Mediums ist NB-Medium mit 3 mg/l BAP und 0,5 mg/l NAA. Die Kulturen auf dem RN-Medium wurden für 2 Wochen bei 28°C unter einem Hochfluoreszenzlicht (325-ft-Kerzen) inkubiert. Die Pflänzchen mit 2 cm langen Sprossen wurden in GA7-Gefäße auf½ MS-Medium (Murashige und Skoog, 1962) mit½ B5-Vitaminen, 10 g/l Saccharose, 0,05 mg/l NAA, 50 mg/l Hygromycin und 2,5 g/l Gelrite^TM übertragen, das auf pH 5,8 eingestellt war (Magenta Corp., Chicago, IL). Als die Pflänzchen mit gut entwickelten Sprosssystemen ausgestattet waren, wurden sie in Erde (1 Teil Metro-Mix 360 (Scotts-Sierra Horticultural Products Co., Marysville, OH) und 1 Teil Erde) übertragen und in einer Wachstumskammer (29/24°C Tag/Nacht-Zyklus, m 50 – 60% Luftfeuchtigkeit, 12 Stunden Photoperiode) aufgezogen, bis sie eine Höhe von 60 cm erreichten, an diesem Punkt wurden zwei Blätter für eine quantitative GUS-Analyse geerntet und die Pflanzen wurden ins Gewächshaus gebracht, um bis zur Reife heranzuwachsen.
C. Southern-Analysen
Southern-Analysen wurden verwendet, um primäre regenerierte (R₀) Reislinien zu identifizieren, die intakte Kopien des speziellen Genkonstrukts enthielten.
Eine DNA-Probe, welche spezifisch ist für die codierende Region des β-Glucuronidase (GUS)-Genkonstrukts wurde mit dem Qiaex II DNA-Reinigungskit (Qiagen Inc., Chatsworth, CA) gelgereinigt. Eine radiomarkierte Sonde wurde hergestellt unter Verwendung von Ready-To-Go^TM DNA-Markierungsbeads (Pharmacia LKB, Piscataway, NJ) mit 50 Mikrocurie [α³²P] dCTP (Amersham Life Science, Arlington Heigths, IL).
Blattmaterial von R₀-Reispflanzen wurde von zwei repräsentativen Pflanzen von jeder Linie geerntet. Die genomische DNA der R₀-Pflanzen wurde hergestellt aus lyophilisiertem Gewebe, wie von Saghai-Maroof et al. (1984) beschrieben.
Vier Mikrogramm Reis-DNA wurden mit einem Restriktionsenzym verdaut, um das intakte Genkonstrukt freizusetzen, unter Verwendung von Bedingungen, welche vom Hersteller vorgeschlagen werden (Bethesda Research Laboratory, Gaithersburg, MD) und durch Agarogegelelektrophorese aufgetrennt. Die DNA wurde auf Nylonmembranen geblottet, wie von Southern (1975, 1989) beschrieben. Radiomarkierte Sonden-DNA wurde mit der genomischen DNA auf den Blots unter Verwendung von 50 ml Minimalhybridisierungspuffer (10% Polyethylenglykol, 7% Natriumdodecylsulfat, 0,6 x SSC, 10 mM Natriumphosphat, 5 mM EDAT und 100 mg/ml denaturierte Lachssperma-DNA) hybridisiert, auf 60°C erhitzt und mit der denaturierten radiomarkierten Sonde gemischt, ehe sie zu den Blots zugegeben wurde für eine Hybridisierung bei 60°C über Nacht. Die Blots wurden bei 60°C in 0,25 x SSC und 0,2% SDS für 45 Minuten gewaschen, trocken geblottet und gegenüber einem XAR-5 Film mit zwei intensivierenden Scheiben über Nacht exponiert.
Die Southern-Analysen wurde bei siebzig ArGOS2Af-R₀-Reislinien durchgeführt. Die DNA der R₀-Pflanzen wurde mit dem Restriktionsenzym Xbal verdaut, welches bei Vorliegen eines intakten Genkonstrukts ein Hybridisierungsprodukt von 5,7 kb ergeben sollte, wenn es mit einer Sonde radiomarkiert wird, welche für die GUS-codierende Region spezifisch ist. Das 5,7 kb Fragment sollte aus der künstlichen MAR in umgekehrter Orientierung, dem GOS2-Promotor, der GUScodierenden Region, dem nos 3' UTR und der künstlichen MAR in Vorwärtsorientierung bestehen. Das erwartete Hbyridisierungsprodukt mit 5,7 kb wurde in fünfundzwanzig der siebzig Reislinien nachgewiesen. Alle der fünfundzwanzig Linien besaßen mehrere Hybridisierungsprodukte und zwei der Linien besaßen identische komplexe Hybridisierungsmuster, was darauf hindeutet, dass sie wahrscheinlich vom gleichen Transformationsereignis stammen.
Die Kontrolllinien ohne MAR, GOS2, wurden ebenso durch Southern-Analyse analysiert. Die DNA von achtundvierzig GOS2-R₀-Linien wurde mit den Restriktionsenzymen EcoRI und Xbal verdaut, weiche bei Vorliegen des intakten Gens ein Hybridisierungsprodukt von 4,4 kb ergeben sollten, wenn eine Radiomarkierung mit einer Sonde erfolgt, die für die GUS-codierende Region spezifisch ist. Das 4,4 kb-Fragment würde 1,6 kb des GOS2-Promotors, die GUS-codierende Region, den nos 3' UTR und den 35T-Promotor (der verwendete Promotor, um das selektierbare Markergen zu steuern) umfassen. Das erwartete 4,4 kb-Hybridisierungsprodukt wurde in achtundzwanzig der achtundvierzig GOS2-Linien nachgewiesen. Zwei der Linien besaßen identische Hybridisierungsmuster und müssen aus dem gleichen Transformationsereignis entstanden sein. Zwei der Linien enthielten genetische Chimären.
D. GUS-Analyse
Die Analyse der Reispflanzen wurde an jungen Blättern von primären Transformanten durchgeführt, nachdem die Pflanzen 6 bis 8 Woche in einer Wachstumskammer mit kontrollierter Umgebung aufgezogen wurden und eine Höhe von etwa 60 cm erreicht hatten. Zwei unabhängig regenerierte Reispflanzen wurden pro Transformationsereignis analysiert. Einzelne Transformanten wurden durch Southern-Blots analysiert, um das Vorliegen einer intakten Kopie des Transgens zu bestätigen und zu bestimmen, ob jedes Ereignis einzigartige Hybridisierungsmuster aufwies, was auf unabhängige Transformationsereignisse hindeutet. Pflanzen ohne komplette Kopie des Transgens, chimäre Ereignisse oder doppelte Integrationsereignisse wurden in die Analyse nicht aufgenommen.
Die Ergebnisse der Analyse sind in den 3 und 4 gezeigt. In 3 zeigen die Fehlerbalken die Standardabweichung zwischen den Pflanzen für jedes Transformationsereignis an. Zwei Proben wurden unabhängig pro Pflanze aufgearbeitet. Im Allgemeinen war das Expressionsniveau der GUS in unabhängigen Reispflanzen von jedem Transformationsereignis ähnlich (wie durch die Standardabweichung der in 3 gezeigten Ergebnisse demonstriert wird).
4 zeigt den Prozentanteil der Transformationsereignisse, welche GUS in den angegebenen Bereichen exprimieren.
Bewertung der künstlichen MAR in Arabidopsis
A. Arabidopsis-Transformationsvektoren
Die Kontrukte Act2/GUS/nos (Act2-Transkriptionsinitiationsregion/GUS-Strukuturgen/ nos 3' UTR) wurden hergestellt zur Untersuchung in einem Dikotylensystem (Arabidopsis). Es wurden drei Vektoren hergestellt: pAct2-bin (SEQ ID NO:30) ist in binärer Vektor, welcher eine Act2/GUS/nos-Kassette enthält, als selektierbaren Macker 19S/NPTII/orf25polyA und als unabhängiges Reportergen 35S/GFP/nos.
PArAct2Af-bin (SEQ ID NO:31) ist identisch mit pAct2-bin, außer dass er das MAR-Dimer von SEQ ID NO:29 in 5'-Position der Act2-Transkriptionsinitiationsregion enthält und das MAR-Dimer von SEQ ID NO:26 in 3'-Position des nos 3' UTR.
pAfAct2Af-bin (SEQ ID NO:32) ist identisch mit pAct2-bin, außer dass er das MAR-Dimer von SEQ ID NO:26 in 5'-Position der Act2-Transkriptionsinitiationsregion und das MAR-Dimer von SEQ ID NO:33 in 3'-Position des nos 3' UTR enthält.
Diese Vektoren ermöglichten eine Untersuchung von zwei Orientierungen des künstlichen MAR-Dimers in Arabidopsis. Ein Schema der Konstrukte ArAct2Af-bin und pAfAct2Af-bin ist in 5 gezeigt.
B. Arabidopsis-Transformation
Die Arabidopsis-Transformation wurde nach einem Protokoll von Pam Green (van Hoof und Green 1996) durchgeführt, welches eine Anpassung von Protokollen von Nicole Bechtold (Bechtold et al., 1993), Andrew Bent (Bent et al., 1994) und Takashi Araki (persönliche Mitteilung) darstellt.
Samen des Ecotpys Columbia wurden in Töpfe mit 4 Quadratinch gepflanzt, mit Fenstergitter bedeckt und unter Bedingungen von 16 Stunden Licht/8 Stunden Dunkelheit bei 22°C aufgezogen, wobei die Düngung einmal pro Woche durch Wässern erfolgte. Der Dünger bestand aus 5 mM KNO₃, 2,5 mM KPO₄ (pH 5,5), 2mM MgSO₄, 2 mM Ca(NO₃)₂, 0,05 mM Fe·EDTA, 0,07 mM Borsäure, 0,014 mM MnCl₂, 0,005 mM CuSO₄, 0,001 mM ZnSO₄, 0,002 mM NaMoO₄ und 0,01 mM NaCl. Die Pflanzen wurden auf vier Pflanzen pro Topf ausgedünnt und aufgezogen, bis mehrere Triebe bzw. Knospen erschienen. Als die Pflanzen bereit waren zur Transformation, wurden die obigen Erdteile in Infiltrationsmedium (2,2 g/l MS-Salze, 1 × B5 Vitamine, 50 g/l Saccharose, 2,5 mM MES, pH 5,7, 0,044 M Benzylaminopurin, 200 ml/l Silwet L-77^TM [Osi Specialties, Inc.]), welches Agrobacterium-Zellen enthielt, untergetaucht, und im Inneren eines Vakuumexsikkators unter einem Vakuum von 400 mm Hg (etwa 17 Inch) für 5 Minuten platziert. Nach schnellem Entspannen des Vakuums wurden die Töpfe getrocknet und auf ihren Seiten in einem Gestell platziert, das mit einer Plastikverpackung bedeckt war, um die Feuchtigkeit für 24 Stunden beizubehalten. Am nächsten Tag wurden die Töpfe freigelegt und aufrecht gestellt. Die Pflanzen wurden einzeln hochgebunden und nach zwei Wochen wurde die Bewässerung nach und nach verringert, um ein Austrocknen der Pflanzen zu ermöglichen. Die Samen wurden von jeder Pflanze einzeln geerntet.
Für eine Selektion der Transformationsereignisse wurden 1 – 10 mg Samen pro Pflanze durch Eintauchen in 10% Bleiche unter heftigem Mischen für 7 Minuten oberflächensterilisiert, gefolgt von drei Spülungen in sterilem Wasser, und in einem Kolben platziert, welcher Arabidopsis-Keimungsmedium (MS-Salze, MS-Vitamine, 10% Saccharose, 2,5 mM 2-[N-Morpholinojethansulfonsäure [MES], 30 mg/l Kanamycin, 20 mg/l Vancomycin und 0,1% Bacto^TM-Agar [Difco Laboratories, Detroit, MI]) enthielt. Nach Schütteln in kontinuierlichem Licht bei 90 rpm für 3 Tage keimten die Samen und Transformanten wurden als grüne Keimlinge 7 und 12 Tage nach der Keimung isoliert. Nach transformierte Samen erzeugten kleine ausgebleichte Keimlinge. Die Transformanten wurden auf festes Medium (MS-Salze, B5-Vitamine, 10% Saccharose, 2,5 mM MES, 15 g/l Phytagar^TM [Gibco BRL, Gaithersburg, MD], 30 ml/l Kanamycin, 50 mg/l Vancomycin) in Platten für eine weitere Selektion übertragen. Nach einer oder zwei Wochen wurden echte Transformanten in GA7-Gefäße (MS-Salze, B5-Vitamine, 0,3% Saccharose, 2,5 mM MES) für eine oder zwei Wochen übertragen, vor dem Pflanzen in Erde für die Herstellung von T1-Samen.
C. Southern-Analysen
Die Southern-Analysen wurden verwendet, um primäre regenerierte T2-Arabidopsis-Linien zu identifizieren, welche intakte Kopien des speziellen Genkonstrukts enthielten.
Die vereinigten Proben des Arabidopsis-Blattgewebes wurden in flüssigem Stickstoff pulverisiert. Das gemahlene Gewebe wurde dann für drei Minuten in 500 μl 2 × Extraktionspuffer (2% CTAB, 100 mM Tris-HCl, pH 8,0, 20 mM EDTA, 1,4 M NaCl und 2% 2-Mercaptoethanol) bei 65°C inkubiert. Fünfhundert μl Chloroform/Octanol (24 : 1) wurden zugegeben, die Proben wurden für zwei Minuten geschüttelt und dann bei 14000 g in einer Mikrozentrifuge zentrifugiert, und der Überstand wurde entfernt. Die Chloroform/Octanol-Extraktion wurde wiederholt. 1 ml Präzipitationspuffer (1 % CTAB, 50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 10 mM EDTA und 1 % 2-Mercaptoethanol) wurde zu dem Überstand zugegeben und dann bei Raumtemperatur für 60 Minuten inkubiert. Die DNA wurde durch Zentrifugation bei 3500g für 5 Minuten in einer Mikrozentrifuge pelletiert. Das Pellet wurde getrocknet und in 20 1,0 μl M NH₄OAc resuspendiert. 100 μl 7,5 M NH₄OAc und 1 ml Isopropanol wurden zugegeben, die Proben wurden auf Eis für 5 Minuten inkubiert und dann bei 14000g für 5 Minuten zentrifugiert. Das Pellet wurde getrocknet und in 200 μl TE resuspendiert. 100 μl 7,5 M NH₄OAc und 1 ml Isopropanol wurden zugegeben und auf Eis für 5 Minuten inkubiert, dann bei 14000g für 5 Minuten zentrifugiert. Das Pellet wurde getrocknet und mit 70% Ethanol gespült und in einem Speed Vac (Savant Instruments Inc., Farmingdale, NY) getrocknet. Das getrocknete Pellet wurde in 20 μl TE (10 mM TRIS, 1 mM EDTA, pH 8,0) resuspendiert.
Die Southern-Analysen wurden mit 29 ArAct2Af T2-Linien und 24 AfAct2Af T2-Linien durchgeführt. 1 μg DNA der ArAct2Af-Pflanzen wurde mit dem Restriktionsenzym Xbal unter Bedingungen verdaut, die vom Hersteller (Bethesda Research Laboratory, Gaithersburg, MD) vorgeschlagen werden, und durch Agarosegelelektrophorese aufgetrennt, was bei Radiomarkierung mit einer Sonde, die spezifisch ist für die GUS-codierende Region, ein 4,6 kb Hybridisierungsprodukt ergeben sollte, wenn das Genkonstrukt intakt ist. Ähnlich wie bei den ArGOS2Af-Reispflanzen sollte das 4,6 kb-Fragment aus der künstlichen MAR in umgekehrter Orientierung, dem Act2-Promotor, der GUS-codierenden Region, dem nos 3' UTR und der künstlichen MAR in der Vorwärtsorientierung bestehen. Die DNA wurde auf Nylonmembranen geblottet, wie von Southern beschrieben (1975, 1989). Radiomarkierte Sonden-DNA wurde mit der genomischen DNA auf den Blots unter Verwendung von 50 ml Minimalhybridisierungspuffer (10%Polyethylenglykol, 7% Natriumdodecylsulfat, 0,6 × SSC, 50 mM Natriumphosphat, 5 mM EDTA und 100 mg/ml denaturierte Lachssperma-DNA) hybridisiert, wurde auf 60°C erhitzt und mit der denaturierten radiomarkierten Sonde gemischt, ehe sie zu den Blots zugegeben wurde für eine Hybridisierung bei 60°C über Nacht. Die Blots wurden bei 60°C in 0,25 × SSC und 0,2% SDS für 45 Minuten gewaschen, trocken geblottet und gegenüber einem XAR-5 Film mit zwei intensivierenden Scheiben über Nacht exponiert.
Das erwartete 4,6 kb-Hybridisierungsprodukt wurde in sechsundzwanzig der neunundzwanzig ArAct2Af-Linien nachgewiesen. Es wurde ein zweiter Soutern Blot erzeugt, um die Kopienzahl des ArAct2Af-Konstrukts zu bestimmen. Die ArAct2Af-DNA wurde mit den Restriktionsenzymen SstI und XhoI verdaut, die das Konstrukt nahe den rechten und linken Grenzen der T-DNA schneiden. Die Blots wurden mit Sonden radiomarkiert, welche für die künstliche MAR und die DNA von der linken Grenze zur Xhol-Stelle 800 by stromabwärts spezifisch waren. Eine einzelne Kopie des ArAct2Af-Konstrukts besitzt drei Hybridisierungsprodukte: zwei Fragmente von unbekannter Größe, bestehend aus der linken und rechten Grenz-DNA und das 8,9 kb-Fragment, welches die DNA im Inneren der Grenzen darstellt.
Zweiundzwanzig der neunundzwanzig Linien besaßen drei oder weniger Hybridisierungsprodukte, was darauf hindeutet, dass eine einzelne Kopie des ArAct2Af-Konstrukts vorlag.
Die DNA der AfAct2Af-Pflanzen wurde mit dem Restriktionsenzym XbaI verdaut, welches dann, wenn das Konstrukt intakt bleibt, ein 5,7 kb Hybridisierungsprodukt ergeben sollte bei Radiomarkierung mit einer Sonde, die spezifisch ist für die GUS-codierende Region. Das 5,7 kb-Fragment sollte aus der künstlichen MAR in der Vorwärtsorientierung, dem Act2-Promotor, der GUS-codierenden Region, dem nos 3' UTR und der künstlichen MAR in Vorwärtsorientierung bestehen. Es umfasst auch die codierende Region für das grün fluoreszierende Protein ("green fluorescent protein") und den nos 3' UTR. Das erwartete 5,7 kb-Hybridisierungsprodukt wurde in allen der vierundzwanzig ArAct2Af-Linien nachgewiesen.
Ein zweiter Southern-Blot wurde erzeugt, um die Kopienzahl des AfAct2Af-Konstrukts zu bestimmen. Die AfAct2Af-DNA wurde mit den Restriktionsenzymen SstI und XhoI verdaut, welche das Konstrukt nahe den rechten und linken Grenzen der T-DNA schneiden. Die Blots wurden mit Sonden radiomarkiert, welche für die künstliche MAR und die DNA von der linken Grenze bis zur Xhol-Stelle 800 by stromabwärts spezifisch waren. Eine einzelne Kopie des AfAct2Af-Konstrukts besitzt drei Hybridisierungsprodukte: zwei Fragmente von unbekannter Größe, bestehend aus der rechten und linken Grenz-DNA, und das 8,9 kb-Fragment, welches die DNA im Innern der Grenzen darstellt. Fünfzehn der vierundzwanzig Linien besaßen drei oder weniger Hybridisierungsprodukte, was darauf hindeutet, dass eine einzelne Kopie des AfAct2Af-Konstrukts vorlag.
Die Kontrolllinien ohne MAR, Actbin, wurden auch durch Southern-Analyse analysiert. Die DNA von vierunddreißig Actbin T2-Linien wurde mit dem Restriktionsenzym PstI verdaut, welches dann, wenn das Konstrukt intakt bleibt, ein 3,4 kb Hybridisierungsprodukt ergeben sollten bei Radiomarkierung mit einer Sonde, die spezifisch ist für die GUS-codierende Region. Das 3,4 kb-Fragment sollte aus dem Act2-Promotor, der GUS-codierenden Region und dem nos 3' UTR bestehen. Das erwartete 3,4 kb-Hybridisierungsprodukt wurde in dreißig der vierunddreißig Actbin-Linien nachgewiesen. Ein zweiter Southern-Blot wurde erzeugt, um die Kopienzahl des Actbin-Konstrukts zu bestimmen. Die DNA der Actbin-Linien wurde mit den Restriktionsenzymen SstI und XhoI verdaut, welche das Konstrukt nahe den rechten und linken Grenzen der T-DNA schneiden. Die Blots wurden mit Sonden radiomarkiert, welche spezifisch waren für den nos 3' UTR und die DNA von der linken Grenze bis zur Xhol-Stelle 800 bp stromabwärts. Eine einzelne Kopie des Actbin-Konstrukts besitzt drei Hybridisierungsprodukte: zwei Fragmente von unbekannter Größe, bestehend aus der linken und rechten Grenz-DNA und das 8,2 kb-Fragment, welches die DNA innerhalb der Grenzen darstellt. Neun der vierunddreißig Linien besaßen drei oder weniger Hybridisierungsprodukte, was darauf hindeutet, dass eine einzelne Kopie des Actbin-Konstrukts vorlag.
D. GUS-Analyse
Zum Heranwachsen von Arabidopsis wurden T2-Samen in vitro auf MS-Medium mit 90 mg/l Kanamycin gekeimt und drei Wochen alte Kanamycin-resistente Keimlinge wurden geerntet. Zwei Chargen mit 30 Keimlingen pro Transformationsereignis wurden für eine GUS-Analyse verwendet und weitere Keimlinge wurden zur DNA-Extraktion verwendet.
Für die Analyse der GUS-Aktivität wurden Blattproben in flüssigem Stickstoff pulverisiert und Proben von ungefähr 400 ml Gewebe wurden in Mikrozentrifugenröhren platziert. Zwei unabhängige Proben von jeder Blattprobe wurden verarbeitet. Das Gewebe wurde entweder bei –70°C gelagert oder unmittelbar extrahiert. GUS wurde extrahiert durch Mischen des pulverisierten Gewebes mit GUS-Lysepuffer (Jefferson et al., 1987), modifiziert durch die Zugabe von 1 % Polyvinylpolypyrrolidon (hydratisiert für mindestens eine Stunde in dem Puffer) und 20% Glycerol. Nach einer Inkubation auf Eis für mindestens 10 Minuten wurden die Proben bei 16000g für 10 Minuten zentrifugiert. Die Überstände wurden gewonnen und ein zweites Mal wie oben beschrieben zentrifugiert. Die Überstände wurden gewonnen und auf Trockeneis eingefroren und bei –70°C gelagert. Die Experimente zeigten, dass die GUS-Aktivität für mindestens 4 Zyklen von Einfreiren und Auftauen bei Lagerung in dem oben beschriebenen Puffer (W.M. Ainley, nicht veröffentlicht) stabil war. Die GUS-Aktivität wurde gemessen unter Verwendung eines GUS-Light^TM-Kits (Tropix, Inc., Bedford, MA). Proben von 5 ml unverdünntem Extrakt oder von so verdünntem Extrakt, dass die Lumineszenz innerhalb des vom Luminometer gemessenen Bereichs lagen, wurden zu 195 ml des GUS-Light^TM-Reaktionspuffers zugegeben. Die Lumineszenz wurde für 5 Sekunden nach einer 5 Sekunden-Verzögerung integriert. Das Protein wurde gemessen mit dem von Bradford (1976) entwickelten Assay unter Verwendung von humanem Serumalbumin als Standard. Die GUS-Aktivität wurde zwischen den Experimenten normalisiert unter Verwendung eines GUS-Standards, erhalten von Sigma. Die Menge an Pflanzenprotein in den Standards und Pflanzenproben war die gleiche, das Protein wurde, wenn nötig, unter Verwendung von Extrakten von nicht-transformierten Pflanzen angepasst.
Die 6 und 7 zeigen die Ergebnisse der GUS-Analyse. 6 zeigt die Expression, die bei unabhängigen Transformationsereignissen beobachtet wurde, wobei entweder die Basis, das Konstrukt ohne MAR (Actbin) oder das Basiskonstrukt, flankiert von der künstlichen MAR in der angezeigten Orientierung (ArAct2Af oder Af-Act-Af) angegeben wird. Die Standardabweichungen zeigen die Varianz zwischen Pflanzen an, die von unterschiedlichen Platten geerntet wurden. Pfeile zeigen die relativen Orientierungen der MARs.
E.
In 7 wird der Prozenzanteil der Transformationsereignisse gezeigt, welche GUS in den angegebenen Bereichen exprimieren.
E.
E. Charakterisierung der transgenen Pflanzen, welche die Reportergenkonstrukte exprimieren
Es wurden die zwei Arabidopsis-Pflanzen analysiert. Die Pflanzen wurden im Hinblick auf die Segregation von Kanamycinresistenz bewertet, um die Kopienzahl des Inserts zu bestimmen. Einige wenige Ereignisse fielen nicht in eine der Kategorien mit einem oder zwei Inserts, wie durch Chi-Quadrat-Analysen bestimmt wurde. Von den verbleibenden Pflanzen besaßen 72% ein einzelnes Insert. Die meisten der Inserts besaßen mehrfache Kopien des Transgens. Obwohl die Arabidopsis-Transformationsereignisse unter kontrollierten Umgebungen aufge zogen wurden, gab es gelegentlich einige Unterschiede im relativen Wachstum der Pflanzen zwischen den Duplikatplatten. In diesen Fällen wurden die Ereignisse entweder nicht verwendet oder wurden erneut herangezogen. Der Varianzkoeffizient der Expression, bestimmt von Duplikatplatten, lag im Bereich von zwischen 1 und 46%, wobei 89 Prozent unterhalb von 20 Prozent lagen (6).
Im Allgemeinen wurden alle für ein Konstrukt getesteten Arabidopsis-Transformationsereignisse zusammen herangezogen und analysiert Obwohl das Wachstum der Pflanzen unter kontrollierten Bedingungen durchgeführt wurde, blieb die Möglichkeit bestehen, dass die Unterschiede, welche zwischen den Transformationsereignissen, welche die Konstrukte exprimieren, beobachtet wurden, aufgrund von Umweltunterschieden aufträten, die zwischen den Experimenten auftraten. Um diese Möglichkeit auszuschließen, wurden drei der höchsten Expressionsereignisse von den drei Sätzen der Arabidopsis-Transformationsereignisse zusammen herangezogen und erneut analysiert. Diese Analysen bestätiaten die früheren Unterschiede zwischen den Sätzen der Transfnrmationsereignisse.
Zusammenfassung der Effekte der künstlichen MAR auf die Transgenexpression
Sowohl bei Reis als auch Arabidopsis exprimierten die durchschnittlichen Expressionsniveaus der Transformationsereignisse, welche die MAR-haltigen Konstrukte exprimierten, mit einem höheren Niveau als diejenigen, ohne die MAR-Elemente (Tabelle 3). In Arabidopsis beeinflusste die Orientierung der untersuchten MARs das Expressionsniveau. Pflanzen mit Konstrukten, bei welchen die MARs auf beiden Seiten des GUS-Genkonstrukts in der gleichen Orientierung volagen, exprimierten GUS mit höheren Spiegeln als Pflanzen mit Konstrukten, in welchen die MARs in entgegengesetzten Richtungen orientiert waren.
Sie schienen in jedem Satz von Transformationsereignissen in den höheren Expressoren ein proportional höheres Expressionsniveau als in den niedrigeren Expressoren aufzuweisen. Um dies zu dokumentieren, wurde die Expression des oberen Quartils der Expressoren verglichen (Tabelle 3). Bezogen auf diese Daten produzierte das obere Quartil der Transformationsereignisse, die das AfAct2Af- Konstrukt exprimierten, GUS-Protein mit Spiegeln, welche 5,6 mal höher waren als beim oberen Quartil der Ereignisse, welche das Actbin-Konstrukt exprimierten. Sowohl in Reis als auch in Arabidopsis verstärken die künstlichen MARs in entgegengesetzten Orientierungen die Expression ungefähr zweifach gegenüber den entsprechenden Konstrukten ohne MARs.
Tabelle 3 Vergleich der Expression von Transformationsereignissen, die entweder die Basiskonstrukte exprimieren, oder die Basiskonstrukte, flankiert durch die künstlichen MARs
Durchschnitte für das obere Quartil der Expressionsniveaus der Transformationsereignisse waren statistisch unterschiedlich (p ist kleiner oder gleich 0,05), basierend auf T-Testanalysen (Gopal K. Kanji, 1995) Zuvor veröffentlichte Untersuchungen (rezensiert von Holmes-Davis und Comai, 1998) haben gezeigt, dass mit Ausnahme von einer MAR alle bislang untersuchten MARs die Expression von Reportergenen verstärken. Diese Untersuchung stellt den ersten Bericht darüber dar, dass ein MAR, welches unter Verwendung von Elementen konstruiert wurde, die bevorzugt in MARs gefunden werden, die Expression in Pflanzenspezies sowohl von Monocotyledonen als auch von Dikotyledonen verstärken kann.
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SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Isoliertes DNA-Molekül, umfassend bp 11 bis 309 von SEQ ID NO:1.
DNA-Konstrukt, umfassend in der Richtung 5' nach 3': eine in Pflanzenzellen funktionelle Transkriptionsinitiationsregion, ein Strukturgen, welches operativ mit der Transkriptionsinitiationsregion verbunden ist, eine 3' nicht translatierte Region und eine Matrix-Anheftungsregion, umfassend by 11 bis 309 von SEQ ID NO: 1 entweder in 5'-Position bezüglich der Transkriptionsinitiationsregion oder in 3'-Position bezüglich des Strukturgens.
DNA-Konstrukt nach Anspruch 2, worin die Matrix-Anheftungsregion zwei oder mehrere Tandemkopien von by 11 bis 309 von SEQ ID NO: 1 umfasst.
DNA-Konstrukt nach Anspruch 2, worin eine erste Matrix-Anheftungsregion, welche by 11 bis 309 von SEQ ID NO:1 umfasst, in 5'-Position bezüglich der Transkriptionsinitiationsregion angeordnet ist, und eine zweite Matrix-Anheftungsregion, welche by 11 bis 309 von SEQ ID NO:1 umfasst, in 3'-Position bezüglich des Strukturgens angeordnet ist.
DNA-Konstrukt nach Anspruch 4, worin jede der Matrix-Anheftungsregionen zwei oder mehrere Tandemkopien von by 11 bis 309 von SEQ ID NO: 1 umfasst.
Verfahren zur Herstellung rekombinanter Pflanzenzellen mit einer erhöhten Expression der darin eingebrachten Strukturgene, welches umfasst: Transformieren einer zur Regeneration befähigten Pflanzenzelle mit einem DNA-Konstrukt nach Anspruch 2.
Verfahren nach Anspruch 6, worin die Matrix-Anheftungsregion in dem DNA-Konstrukt zwei oder mehrere Tandemkopien von by 11 bis 309 von SEQ ID NO: 1 umfasst.
Verfahren nach Anspruch 6, worin das DNA-Konstrukt eine erste Matrix-Anheftungsregion, welche by 11 bis 309 von SEQ ID NO:1 umfasst, in 5'-Position bezüglich der Transkriptionsinitiationsregion umfasst, und eine zweite Matrix-Anheftungsregion, welche by 11 bis 309 von SEQ ID NO:1 umfasst, in 3'-Position bezüglich des Strukturgens umfasst.
Verfahren nach Anspruch 8, worin die erste und zweite Matrix-Anheftungsregion jeweils zwei oder mehrere Tandemkopien von by 11 bis 309 von SEQ ID NO: 1 umfassen.
Transformierte Pflanzenzelle, welche die DNA von by 11 bis 309 von SEQ ID NO:1 umfasst.