ES2232190T3 - Region de union a la matriz artificial para aumentar la expresion de genes introducidos en celulas vegetales. - Google Patents
Region de union a la matriz artificial para aumentar la expresion de genes introducidos en celulas vegetales.Info
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Abstract
Una molécula de ADN aislada que comprende los pb 11 a 309 de SEQ ID Nº 1. Los núcleos de las células eucarióticas son estructuras muy organizadas en las que toda la información genética ha de estar accesible de manera ordenada para la replicación, la transcripción y otros sucesos celulares. Típicamente los genes están organizados en bucles de cromatina de diversos tamaños que están unidos a la matriz nuclear proteica por sitios conocidos como regiones de unión a la matriz (MAR, por sus siglas en inglés). Las MAR suelen estar localizadas en regiones no transcritas de los genes y se cree que forman las fronteras físicas de cada bucle de ADN considerado individualmente. En varios casos, se ha indicado que las MAR reducían el efecto de la posición en los organismos transgénicos. Se ha indicado que la MAR de la lisozima de pollo aumentaba la expresión, reducía la varianza y hacía dependiente de su número de copias la expresión de un gen adyacente en células establemente transfectadas, en ratonestransgénicos y en plantas transgénicas de tabaco.
Description
Región de unión a la matriz artificial para
aumentar la expresión de genes introducidos en células
vegetales.
La presente invención se refiere a la biología
molecular de las plantas y, en particular, a la tecnología para
intensificar la expresión de genes introducidos en células de
plantas transformadas.
A través del uso de la tecnología del ADN
recombinante y de la ingeniería genética, ha sido posible introducir
secuencias deseadas de ADN en células de plantas para permitir la
expresión de proteínas de interés. Las plantas con rasgos
incorporados por técnicas de ingeniería genética, por ejemplo,
resistencia a los insectos, resistencia a las enfermedades,
resistencia a la sequía, resistencia a los herbicidas o alteraciones
metabólicas que incrementan o modifican la síntesis de productos
vegetales útiles, son muy prometedoras para mejorar la
agricul-
tura.
tura.
Obtener niveles deseados de expresión del ADN
introducido en células de plantas sigue siendo un reto. Un problema,
conocido como variación por "efecto de la posición", es la
variación en la expresión del mismo gen en transformantes
independientes. En la patente de EE.UU. 5.773.689 y en la patente WO
94/24293, se propuso el uso de secuencias de ADN de origen natural,
llamadas regiones de unión a la matriz (MAR, por sus siglas en
inglés) o regiones de unión al andamiaje para combatir este
problema.
La presente invención proporciona una nueva
molécula sintética de ADN que comprende los pares de bases (pb) 11 a
309 de SEQ ID Nº 1 que es útil como región de unión a la matriz para
incrementar la expresión de los genes introducidos en plantas
transformadas.
En otro de sus aspectos, la invención proporciona
una construcción de ADN que comprende, en la dirección 5' a 3': una
región de iniciación de la transcripción funcional en células de
plantas, un gen estructural operativamente asociado a la región de
iniciación de la transcripción, una región no traducida 3' y una
región de unión a la matriz, compuesta por los pb 11 a 309 de SEQ ID
Nº 1, situada o bien en dirección 5' respecto de la región de
iniciación de la transcripción o bien en dirección 3' respecto de
dicho gen estructural. En una realización preferida, una primera
región de unión a la matriz, compuesta por los pb 11 a 309 de SEQ ID
Nº 1, está situada en dirección 5' respecto de dicha región de
iniciación de la transcripción y una segunda región de unión a la
matriz, compuesta por los pb 11 a 309 de SEQ ID Nº 1, está situada
en dirección 3' respecto de dicha región no traducida
3'.
3'.
En una realización particularmente preferida, la
región de unión a la matriz de la invención comprende dos o más
copias en tándem de los pb 11 a 309 de SEQ ID Nº 1.
Fig. 1 es un diagrama que indica la estrategia
para ensamblar la MAR artificial de SEQ ID Nº 1.
Fig. 2 es una representación esquemática de la
construcción ArGOS2Af para transformación de arroz, que contiene la
MAR dímera.
Fig. 3 es una gráfica que compara la actividad
relativa del gen GUS para múltiples sucesos de transformación de
arroz utilizando la construcción GOS2 que no contiene MAR y la
construcción ArGOS2Af, que contiene una MAR dímera artificial.
Fig. 4 es una gráfica que indica el efecto de la
MAR artificial sobre los intervalos de expresión del gen informador
GUS en plantas transgénicas de arroz.
Fig. 5 es una representación esquemática de las
construcciones ArAct2Af y aaaaAfAct2Af para la transformación de
Arabidopsis. ArAct2Af contiene copias de la MAR dímera en
orientaciones opuestas que flanquean al gen informador. ArAct2Af
contiene copias de la MAR dímera en la misma orientación que
flanquean al gen infor-
mador.
mador.
Fig. 6 es una gráfica que compara la actividad
relativa del gen GUS para múltiples sucesos de transformación de
Arabidopsis utilizando la construcción Act2 que no contiene
MAR y las construcciones ArAct2Af y AfAct2Af, que contienen una MAR
dímera artificial.
Fig. 7 es una gráfica que indica el efecto de la
MAR artificial sobre el intervalo de expresión del gen informador
GUS en plantas transgénicas de Arabidopsis.
\newpage
SEQ ID Nº 1 describe la MAR artificial de la
invención.
SEQ ID N^{os} 2 a 4 describen sitios para
ARBP.
SEQ ID Nº 5 describe un sitio para ATF.
SEQ ID Nº 6 describe un sitio para
BEAF-32.
SEQ ID N^{os} 7 a 9 describen sitios para
topoisomerasa II.
SEQ ID Nº 10 describe una secuencia
desenrollada.
SEQ ID N^{os} 11 a 17 describen sitios para
SATB I.
SEQ ID Nº 18 describe ADN doblado ejemplar.
SEQ ID Nº 19 describe un tramo A/T ejemplar.
SEQ ID Nº 20 describe MAR-A
sintética
SEQ ID Nº 21 describe MAR-B
sintética
SEQ ID Nº 22 describe MAR-C
sintética
SEQ ID Nº 23 describe MAR-D
sintética
SEQ ID Nº 24 describe MAR-E
sintética
SEQ ID Nº 25 describe MAR-F
sintética
SEQ ID Nº 26 describe la 3' MAR dímera en
pArGOS2Af-hpt y ArAct2Af-bin
SEQ ID Nº 27 describe el vector
pGOS2-hpt para la transformación de arroz.
SEQ ID Nº 28 describe el vector
pArGOS2Af-hpt para la transformación de arroz.
SEQ ID Nº 29 describe la 5' MAR dímera en
pArGOS2Af-hpt y ArAct2Af-bin.
SEQ ID Nº 30 describe el vector
pAct2-bin para transformación de plantas
dicotiledóneas.
SEQ ID Nº 31 describe el vector
pArAct2Af-bin para transformación de plantas
dicotiledóneas.
SEQ ID Nº 32 describe el vector
pAfAct2Af-bin para transformación de plantas
dicotiledóneas.
SEQ ID Nº 33 describe la 3' MAR dímera en
pAfAct2Af-bin.
Los núcleos de las células eucarióticas son
estructuras muy organizadas en las que toda la información genética
ha de estar accesible de manera ordenada para la replicación, la
transcripción y otros sucesos celulares (Lewin, 1994; Dillon y
Grosveld, 1994; Jackson, 1995; Wolffe, 1994). Típicamente los genes
están organizados en bucles de cromatina de diversos tamaños que
están unidos a la matriz nuclear proteica por sitios conocidos como
regiones de unión a la matriz (MAR, por sus siglas en inglés). Las
MAR suelen estar localizadas en regiones no transcritas de los genes
y se cree que forman las fronteras físicas de cada bucle de ADN
considerado individualmente. En varios casos, se ha indicado que las
MAR reducían el efecto de la posición en los organismos
transgénicos. Se ha indicado que la MAR de la lisozima de pollo
aumentaba la expresión, reducía la varianza y hacía dependiente de
su número de copias la expresión de un gen adyacente en células
establemente transfectadas (Stief et al., 1989), en ratones
transgénicos (Bonifer et al., 1990, McKnight et al.,
1992) y en plantas transgénicas de tabaco (Mlynárová et al.,
1994; Mlynárová et al., 1995).
Sin embargo, no todas las MAR tienen estos
efectos sobre la expresión génica. Dos MAR mínimas de
Drosophila (una localizada entre los genes de las histonas
H1 y H3 y el otro cerca de los genes de las proteínas de choque
térmico, también conocidas como proteínas de estrés, HSP70)
estimularon la expresión multiplicándola por un factor superior a 10
en células establemente transformadas, pero la presencia de estos
MAR no reducía el efecto de la posición (Poljak et al.,
1994). Las regiones MAR del dominio apolipoproteína aumentaron la
expresión y disminuyeron el efecto de la posición en transformantes
con bajo número de copias, pero la expresión en transformantes con
copias múltiples fue reprimida fuertemente. (Kalos y Fournier,
1995). Cuando se colocó una MAR de Drosophila ftz en un lugar
cromosómico diferente, no se reorganizó la estructura cromatínica y
el fragmento de cromatina que contenía la MAR se pudo eluir
fácilmente del núcleo, lo que indica que la MAR introducida no forma
necesariamente dominios en la cromatina (Eggert and Jack, 1991). En
cambio, se requerían MAR a ambos lados del intensificador del locus
de la cadena pesada de inmunoglobulina m para obtener altos niveles
de expresión y la formación de un dominio extendido sensible a
ADNasa I en linfocitos \beta transgénicos, pero no en células de
cultivo de tejidos establemente transfectadas (Forrester et
al., 1994).
Los resultados de utilizar MAR en plantas
transgénicas han sido igualmente complejos (Spiker and Thompson,
1996). Una MAR de levadura aumentó los niveles de expresión en
líneas de callo de tabaco establemente transformadas, pero no se
pudo encontrar ninguna correlación entre el número de copias y el
nivel de expresión (Allen et al., 1993). En cambio, se
demostró que el elemento MAR del gen de la proteína del choque
térmico de soja, Gbmhspl7.6-L, era capaz de
aumentar los niveles de expresión pero tenía poco efecto sobre la
variabilidad (Schöffl et al., 1993). Una construcción de un
gen informador con regiones MAR de soja a ambos lados se expresaba
con menor variabilidad que una construcción que carecía de regiones
MAR, pero también disminuían los niveles de expresión si estaban
presentes las regiones en 5' y 3' respecto de una construcción de un
gen informador en callo de tabaco transgénico (Breyne et al.,
1992). Es posible que las regiones MAR consideradas de una en una
puedan tener diferentes propiedades funcionales y estructurales
además de su capacidad de unión a la matriz (Breyne et al.,
1994).
Las MAR tienen normalmente 300 a 2000 pares de
bases de longitud, son ricas en restos de adenosina y timina y a
menudo contienen ciertos aspectos estructurales y elementos de la
secuencia conservados. La mayoría de las MAR descritas en la
bibliografía no se obtienen a partir de plantas sino que está bien
documentado que las MAR de otros organismos unen andamiajes de
plantas y viceversa (Dietz et al. 1994; Breyne et al.,
1992).
La Tabla 1 describe elementos de secuencia
presentes en MAR descritas en la bibliografía, incluidas las
siguientes MAR de plantas: MAR del gen de la proteína del choque
térmico de soja, (Schöffl et al., 1993); una MAR de petunia
(Dietz et al., 1994); la MAR del gen de la plastocianina de
guisante (Slatter et al., 1991); Las MAR en 5' y 3' respecto
del gen Adh1 de maíz (Avramova y Bennetzen, 1993; Avramova et
al., 1995); Las MAR en 5' y 3' respecto del gen de
b-faseolina (van der Geest et al., 1994).
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(Tabla pasa a página
siguiente)
La presente invención utiliza un subconjunto de
las características descritas en la Tabla 1 en una nueva MAR
artificial. La secuencia de la MAR artificial de 327 pb se da en SEQ
ID Nº 1. La MAR artificial se ideó como una secuencia flanqueada por
sitios de restricción BglII y BamHI, que están
incluidos en SEQ ID Nº 1, pero que no son críticos para la función
de la MAR. La porción funcional de la MAR comprende los pb 11 a 309
de SEQ ID Nº 1.
Se encuentran las siguientes características en
SEQ ID Nº 1:
La UTR 3', o región no traducida 3', que se
emplea en las construcciones de la invención es una que confiere un
eficiente procesamiento del ARNm, mantiene la estabilidad del
mensaje y dirige la adición de los ribonucleótidos de adenosina al
extremo 3' de la secuencia de ARNm transcrita. La UTR 3' puede ser
nativa con la región promotora, nativa con el gen estructural, o se
puede derivar de otra fuente. Entre las UTR 3' adecuadas, se
incluyen, pero sin limitarse a ellas: la UTR 3' per5, y la
UTR 3' del gen de la nopalina sintasa (nos).
Para construir la MAR artificial, se sintetizaron
seis nucleótidos individuales que luego se ensamblaron por PCR. Las
secuencias para los seis oligonucleótidos, denominadas aquí en lo
sucesivo MAR-A, MAR-B,
MAR-C, MAR-D, MAR-E,
y MAR-F, se dan en la Lista de Secuencias como SEQ
ID N^{OS}: 20 a 25, respectivamente. Un solapamiento de 15 pb
entre oligonucleótidos adyacentes permitió el ensamblaje de la MAR
por PCR, utilizando la estrategia indicada en la Figura 1.
Para la amplificación del ADN, se utilizó el kit
de reactivos de PCR GeneAmp^{TM} con ADN polimerasa AmpliTaq
(Perkin Elmer, Norwalk, CT). A veinte ciclos de PCR
(desnaturalización: 30 s a 94ºC; hibridación: 60 s a 52ºC y
extensión: 60 s a 70ºC) con cebadores MAR-C y
MAR-D le siguieron 20 ciclos de PCR con cebadores
MAR-B y MAR-E, utilizando el
producto de la primera reacción como molde para la segunda reacción.
El producto de 231 pb de esta reacción se purificó en un gel de
agarosa de bajo punto de fusión y se utilizó como molde durante 20
ciclos de PCR con los cebadores MAR-A y
MAR-F. El producto de 327 pb de esta reacción se
subclonó en pCR2.1 utilizando el kit TA Cloning^{TM} Kit
(Invitrogen, San Diego, CA) y la secuencia se verificó por
secuenciación.
En el sitio BamHI de pBluescript^{TM}
SK- (Stratagene, La Jolla, CA), se construyó un dímero constituido
por dos copias en tándem del fragmento BglII/BamHI. La
secuencia del dímero está formada por los pb 5-630
de SEQ ID Nº 26.
Dos fragmentos de ADN de similar tamaño y
composición de nucleótidos que la MAR artificial se amplificaron a
partir de ADN de planta para servir como controles en el ensayo de
unión. Estos fragmentos fueron un fragmento de 657 pb del extremo 3'
de un gen de maíz Gpal (subunidad A de la
gliceraldehído-3-fosfato
deshidrogenasa, número de acceso en GenBank X15408, bases 4516 a
5173, Quigley et al., 1989) y un fragmento de 488 pb de la
región flanqueante en dirección 5' de un gen de
alfa-zeína de 19 kD, (número de acceso en GenBank
X05911, bases 339 a 827, Kriz et al., 1987). La Tabla 2
compara las características presentes en los fragmentos de MAR
artificial y control.
Se prepararon núcleos para uso en el aislamiento
de andamiajes nucleares a partir de hojas de maíz joven por
adaptación de un protocolo publicado (Hall et al., 1991). Se
contaron los núcleos y se comprobó su integridad por examen
microscópico de alícuotas teñidas con DAPI. Sólo se utilizaron
núcleos de alta calidad para preparar andamiajes nucleares por
extracción con diyodosalicilato de litio.
Para la purificación de los núcleos, se
recogieron hojas de maíz joven en el estadio V4 (cuarta o quinta
hoja) utilizando una cuchilla de afeitar, y se lavaron y secaron.
Después de retirar el nervio central de las hojas, éstas se
congelaron en nitrógeno líquido y se machacaron con mortero y
almirez para obtener un polvo fino. Las muestras de hojas reducidas
a polvo se transfirieron a un vaso de precipitados de vidrio y, por
cada gramo de tejido de hoja, se añadieron 5 ml de NIB1+PI
(hexilenglicol 0,1 M, ácido
piperazin-N,N'-bis[2-etanosulfónico]
(PIPES) 20 mM, pH 6,5, KCl20 mM, 2-mercaptoetanol 7
mM, ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) 0,5 mM, Triton
X-100^{(R)} al 4% [Rohm & Haas Company,
Philadelphia, PA], espermina 0,05 mM, espermidina 0,125 mM, fluoruro
de fenilmetilsulfonilo (PMSF) 1 mM, 1 \mug/ml de leupeptina, 1
\mug/ml de aprotinina). El extracto de hojas se filtró
secuencialmente a través de filtros de 1900, 520, 125, 85 y 40 mm a
4ºC y los filtros se lavaron con 1 ml de NIB1+PI por gramo de hojas
para recoger todos los núcleos que quedaron atrapados en el desecho.
Se cargaron 15 ml de extracto nuclear bruto en gradientes de
Percoll^{TM} (Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) que consistían en
7 ml de Percoll al 40% en NIB1 (hexilenglicol 0,5 mM, PIPES 20 mM,
pH 6,5, KCl 20 mM, 2-mercaptoetanol 7 mM, EDTA 0,5
mM, Triton^{TM} X-100 al 0,4%, espermina 0,05 mM,
espermidina 0,125 mM) y 5 ml de Percoll al 70% en NIB1. Después de
centrifugar durante 15 min a 500xg a 4ºC, se recogió la interfase
40%/70% con una pipeta pasteur estéril y se añadió a 2 volúmenes de
NIB2 (hexilenglicol 0,5 M, PIPES 20 mM, KCl 20 mM,
2-mercaptoetanol 7 mM, EDTA 0,5 mM, espermina 0,05
mM, espermidina 0,125 mM), procurando evitar el sedimento y otros
desechos. Los núcleos se concentraron por centrifugación a 600xg
durante 10 min a 4ºC.
El sedimento nuclear se resuspendió en 20 ml de
NIB2 y se centrifugó como antes. Esta etapa se repitió una vez más
para separar mediante lavado las trazas de Percoll. Los núcleos se
contaron utilizando un hemacitómetro y se resuspendieron en
NIB2+PI/glicerol al 50% (hexilenglicol 0,5 M, PIPES 20 mM, pH 6,5,
KCl 20 mM, 2-mercaptoetanol 7 mM, EDTA 0,5 mM,
espermina 0,05 mM, espermidina 0,125 mM, glicerol al 50%, PMSF 1 mM,
1 \mug/ml de leupeptina, 1 \mug/ml de aprotinina) a 20 millones
de núcleos/ml. Los núcleos se almacenaron a -80ºC hasta que se
utilizaron para la preparación de andamiajes.
Los núcleos congelados se descongelaron y lavaron
con 10 ml de NIB3+PI (hexilenglicol 0,5 M, PIPES 20 mM, pH 6,5, KCl
20 mM, 2-mercaptoetanol 7 mM, espermina 0,05 mM,
espermidina 0,125 mM, PMSF 1 mM, 1 \mug/ml de leupeptina, 1
\mug/ml de aprotinina) por 20 millones de núcleos. Los núcleos se
recogieron por centrifugación a 600xg durante 10 minutos, se
resuspendieron en 200 ml de NIB3+PI en presencia de CuSO_{4} 1 mM
y se incubaron durante 10 min a 42ºC para estabilizar los
núcleos.
Se extrajeron histonas por incubación en 10 ml de
HIB+PI (HEPES 20 mM, pH 7,4, acetato de litio 100 mM, LIS
(diyodosalicilato de litio) 10 mM, digitonina al 0,1%, EDTA 2 mM,
PMSF 1 mM, 1 \mug/ml de leupeptina, 1 \mug/ml de aprotinina)
durante 15 minutos a temperatura ambiente. Los halos nucleares
resultantes se transfirieron a un tubo de centrífuga y se
centrifugaron a 4000xg durante 10 minutos. Los halos se lavaron dos
veces con 10 ml de HWB (Tris 20 mM, pH 8, NaCl 70 mM, KCl 20 mM,
2-mercaptoetanol 7 mM, digitonina al 0,1%, espermina
0,05 mM, espermidina 0,125 mM) y una vez con D/BB+PI (HWB +
MgCl_{2} 10 mM, PMSF 1 mM, 1 \mug/ml de leupeptina, 1 \mug/ml
de aprotinina) para separar el LIS. Si los halos no sedimentan bien,
se realizan varias etapas más de centrifugación a 6000xg utilizando
un ajuste de frenado lento. La calidad de los halos se verificó por
SDS-PAGE en gel para garantizar que se separaron más
del 95% de las histonas en el procedimiento de extracción.
Los halos nucleares lavados se resuspendieron en
400 \mul de D/BB+PI y se añadieron 200 unidades de enzimas de
restricción (100 u de cada una de EcoRI y HindIII), y
se incubaron a 37ºC durante 2-3 horas sobre una
plataforma basculante para evitar que los halos sedimentaran. Las
enzimas de restricción separaron más del 70% del ADN nuclear,
produciendo andamiajes nucleares. Los andamiajes se centrifugaron a
300xg y se lavaron con HWB+PI (HWB + PMSF 1 mM, 1 \mug/ml de
leupeptina, 1 \mug/ml de aprotinina). Los andamiajes nucleares se
resuspendieron en 400 \mul de HWB+PI y se separaron en alícuotas
de 100 \mul (que contenían 5 millones de equivalentes
nucleares).
Se incubaron alícuotas de 100 \mul de
andamiajes en HWB+PI con ADN sonda y ADN competidor de E.
coli a 37ºC durante 2-3 horas en tubos de
microcentrífuga siliconizados sobre una plataforma basculante para
mantenerlos agitados. Después de la incubación, la fracción
sobrenadante (que contenía fragmentos de ADN no unidos) y la
fracción sedimentada (que contenía andamiajes y fragmentos de ADN
unidos) se separaron por centrifugación en una microcentrífuga
horizontal a 3000xg durante 5 min. El sedimento se lavó una vez con
200 \mul de HWB para separar los inhibidores de proteasas, se
resuspendió en 100 \mul de tampón de lisis (Tris 10 mM, pH 8, EDTA
10 mM, SDS al 0,5%, 0,5 mg/ml de Proteasa K) y se incubaron durante
una noche a temperatura ambiente.
Se separaron fracciones idénticas del sedimento y
del sobrenadante en un gel de agrosa al 0,9%, que seguidamente se
fijó remojándolo en TCA al 7% durante 20 min, se secó y se expuso a
una película de rayos X a temperatura ambiente y/o pantallas
defósforo de almacenamiento para el Phospholmager® SI (Molecular
Dynamics, Sunnyvale, CA).
Los plásmidos que contenían la MAR artificial
monómera o dímera o las secuencias de Gpal o zeína control se
digirieron con enzimas de restricción que general extremos salientes
5'. Se utilizó la subunidad Klenow de ADN polimerasa I para
completar el saliente con [a-^{32}P]dCTP
(Amersham Life Science, Arlington Heights, IL). Los fragmentos de
ADN marcados en los extremos se utilizaron como sondas en el ensayo
de unión, es decir, los fragmentos se incubaron con andamiajes
nucleares de maíz purificados en presencia de ADN competidor de
E. coli no marcado y se determinó la unión relativa de los
insertos. En el ensayo de los núcleos, se optimizaron las cantidades
relativas de núcleos, sonda y ADN competidor de E. coli sin
marcar para obtener la discriminación máxima entre las MAR que se
unen fuertemente y las que se unen débilmente. Las cantidades
relativas óptimas fueron 2, 5 ó 10 \mug de ADN competidor de E.
coli sin marcar, 5 millones de equivalentes nucleares de
andamiajes nucleares y 1 fmol de plásmido digerido y marcado por
ensayo.
La MAR artificial dímera se unía muy fuertemente
a la preparación de andamiajes nucleares, incluso en presencia de
altos niveles de ADN competidor. La MAR monómera también se unía a
preparaciones de andamiajes nucleares, aunque con menor afinidad.
Ninguna secuencia control quedaba retenida en la fracción
sedimentada y ni siquiera eran similares a las MAR artificiales en
tamaño o contenido relativo de AT. Esto sugiere que los elementos
incluidos en la MAR artificial facilitan la unión.
pGOS2-hpt (SEQ.ID Nº 27) es un
vector de transformación de arroz que contiene un marcador
seleccionable de higromicina conducido por el promotor 35S y una
caja GOS2/GUS/nos (región de iniciación de la transcripción de
GOS2/gen estructural de GUS/región no traducida 3' de nos). La
región de iniciación de la transcripción de GOS2 en esta
construcción está constituida por 1010 pb de promotor y 170 pb de
líder 5' sin traducir interrumpido por un intrón de 1100 pb
(de Pater et al., 1992).
pArGOS2Af-hpt (SEQ ID Nº 28) es
un vector de transformación de arroz idéntico a
pGOS2-hpt salvo que tiene la MAR dímera de SEQ ID Nº
29 situada en dirección 5' respecto de la región de iniciación de la
transcripción de GOS2 y la MAR dímera de SEQ ID Nº 26 situada en
dirección 3' respecto de la UTR 3' de nos.
En la Fig. 2 se muestra una representación
esquemática de la construcción ArGOS2Af.
Para la iniciación de callo embriogénico, se
pelaron semillas maduras de Japonica cultivar, Taipei 309, y
su superficie se esterilizó en etanol al 70% durante
5-7 min seguidos de 30-45 min de
remojo en un blanqueante comercial al 25% (hipoclorito de sodio al
2,6%) con Tween® 20 al 0,02% (ICI Americas, Inc.) a vacío. Después,
las semillas se lavaron 5 veces en agua destilada estéril y se
pusieron sobre papel de filtro antes de transferirlas a los medios
de inducción (NB). El medio NB consistía en macroelementos N6 (Chu,
1978), microelementos B5 y vitaminas (Gamborg et al., 1968),
300 mg/l de hidrolizado de caseína, 500 mg/l de
L-prolina, 500 mg/l de L-glutamina,
30 g/l de sacarosa, 2 mg/l de ácido
2,4-dicloro-fenoxiacético (2,
4-D), y 2,5 g/l de Gelritel® (Merck & Co.,
Rawhay, NJ) con el pH ajustado a 5,8. Las semillas maduras
cultivadas en medios de inducción se incubaron en la oscuridad a
28ºC durante tres semanas. El callo primario inducido a partir de la
región escutelar del embrión maduro se transfirió a medio NB de
nueva aportación para su ulterior mantenimiento y después se mantuvo
durante un periodo de subcultivo de dos semanas.
Para preparar ADN para su explosión controlada
dentro del núcleo de la célula, se precipitaron aproximadamente 140
\mug de ADN plasmídico (pGOS2-hpt o
pArGOSAf-hpt) sobre 60 mg de partículas de oro. El
ADN plasmídico se precipitó sobre partículas de oro de
1,5-3,0 micrómetros (Aldrich Chemical Co.,
Milwaukee, WI) o de 1,0 micrómetro (Bio-Rad
Laboratories, Hercules, CA). La mezcla de precipitación incluía 60
mg de partículas de oro pre-lavadas, 300 \mul de
agua/ADN (140 pg), 74 \mul de CaCl_{2}2,5 M y 30 \mul de
espermidina 0,1 M. Después de añadir los componentes en el orden
anterior, la mezcla se agitó en torbellino inmediatamente y se dejó
sedimentar durante 2-3 min. El sobrenadante se
pipeteó y descartó. Las partículas de oro revestidas de ADN se
resuspendieron en 1 ml de etanol al 100% y se diluyeron a 17,5 mg de
ADN/7,5 mg de oro por ml de etanol para uso en experimentos de
explosión controlada dentro del núcleo de la célula.
Para la explosión controlada dentro del núcleo de
la célula utilizando helio, los cultivos de callo embriogénico en
crecimiento activo, de 2-4 mm de tamaño, se
sometieron a un tratamiento osmótico elevado poniendo el callo sobre
medio NB con manitol 0,2 M y sorbitol 0,2 M (Vain et al.,
1993) durante 4 h antes de la explosión controlada dentro del núcleo
de la célula utilizando helio. Después del tratamiento osmótico, los
cultivos de callo se transfirieron a medio de explosión (NB + agar
al 2%) y se cubrieron con una rejilla de acero inoxidable (230
micrómetros). La explosión controlada dentro del núcleo de la célula
con helio implicó la aceleración de las partículas de oro revestidas
de ADN suspendidas hacia y dentro de las dianas de tejido
preparadas. El dispositivo utilizado era un prototipo anterior al
descrito en la patente de EE.UU. nº 5.141.131, que se incorpora aquí
como referencia, aunque ambos funcionan de manera similar. Los
cultivos de callo se hicieron explosionar a diferentes presiones de
helio (122,50-157,50 kg/cm^{2}) una a tres veces
por diana. Tras la explosión controlada dentro del núcleo de la
célula, el callo se transfirió de nuevo al medio altamente osmótico
durante la noche antes de ponerlo sobre el medio de selección, que
consistía en medio NB con 30 mg/l de higromicina. Al cabo de 2
semanas, los cultivos se transfirieron a medio de selección de nueva
aportación con concentraciones más altas de agente de selección, es
decir, NB+50 mg/l de higromicina (Li. et al., 1993).
Los cultivos de callo embriogénico, de color
blanco amarillento, y compactos, recuperados en NB+50 mg/l de
higromicina, se regeneraron transfiriéndolos a medio de
pre-regeneración (PR)+50 mg/l higromicina. El medio
PR consistía en medio NB con 2 mg/l de
bencil-aminopurina (BAP), 1 mg/l de ácido
naftalenacético (NAA), y 5 mg/l de ácido abscísico (ABA). Después de
2 semanas de cultivo en la oscuridad, se transfirieron a medio de
regeneración (RN). La composición del medio RN es medio NB con 3
mg/l de BAP, y 0,5 mg/l de NAA. Los cultivos en medio RN se
incubaron durante 2 semanas a 28ºC bajo luz fluorescente intensa
3498,2675 lux (325-ft-candles). Las
plántulas con brotes de 2 cm se transfirieron a 1/2 de medio MS
(Murashige y Skoog, 1962) con 1/2 de vitaminas B5, 10 g/l de
sacarosa, 0,05 mg/l de NAA, 50 mg/l de higromicina y 2,5 g/l de
Gelrite^{TM} ajustado a pH 5,8 en recipientes GA7 (Magenta Corp.,
Chicago, IL). Cuando se establecieron plántulas con sistemas de
raíces bien desarrollados, se transplantaron en tierra [1 parte de
Metro-Mix 360 (Scotts-Sierra
Horticultural Products Co., Marysville, OH) y 1 parte de tierra para
la capa superior] y se dejaron crecer en un fitotrón (ciclo
día/noche 29/24ºC, 50-60% humedad, fotoperiodo 12 h)
hasta que alcanzaron una altura de 60 cm, punto en el que se
recogieron 2 hojas para análisis cuantitativo de GUS, y las plantas
se transfirieron al invernadero hasta alcanzar la madurez.
Se utilizó el análisis Southern para identificar
líneas de arroz (R_{0}) regeneradas primarias que contenían copias
intactas de la construcción génica específica.
Una sonda de ADN específica para la región
codificante de la construcción génica de la
\beta-glucuronidasa (GUS)se purificó en gel
con el kit de purificación de ADN Qiaex II (Quiagen Inc.,
Chatsworth, CA). La sonda radiomarcada se preparó usando perlas de
marcación de ADN (Pharmacia LKB, Piscataway, NJ) con 50 microcurios
de [\alpha^{32}P]dCTP (Amersham Life Science, Arlington
Heights, IL).
De dos representantes de cada línea se cogió
material foliar de plantas de arroz Ro. Se preparó ADN genómico de
las plantas Ro a partir de tejido liofilizado como han descrito
Saghai-Maroof et al. (1984).
Se digirieron 4 \mug de ADN de arroz con
enzimas de restricción para liberar la construcción génica intacta
utilizando las condiciones sugeridas por el fabricante (Bethesda
Research Laboratory, Gaithersburg, MD) y se separaron por
electroforesis en gel de agarosa. Se transfirió el ADN a membranas
de nilón como ha descrito Southern (1975, 1989). El ADN de la sonda
radiomarcarda se hibridó al ADN genómico sobre las transferencias
utilizando 50 ml de tampón mínimo de hibridación (polietilenglicol
al 10%, dodecilsulfato de sodio al 7%, 0,6xSSC, fosfato de sodio 10
mM, EDTA 5 mM y 100 mg/ml de ADN de esperma de salmón
desnaturalizado), se calentó a 60ºC y se mezcló con la sonda
radiomarcada desnaturalizada antes de añadirlo a las transferencias
para su hibridación durante la noche a 60ºC.Las transferencias se
lavaron a 60ºC en 0,25X de SSC y SDS al 0,2% durante 45 minutos, se
secaron sobre papel absorbente y se expusieron a película
XAR-5 con dos pantallas intensificadoras durante la
noche.
El análisis Southern se efectuó sobre setenta
líneas de arroz ArGOSAf R_{o}. El ADN de las plantas R_{o} se
digirió con la enzima de restricción XbaI y, si está presente
la construcción génica intacta, ello dará como resultado un producto
de hibridación de 5,7 kb cuando se radiomarca con una sonda
específica para la región codificante de GUS. El fragmento de 5,7 kb
consta de la MAR artificial en orientación inversa, el promotor de
GOS2, la región codificante de GUS, la UTR 3' de nos y la MAR
artificial en orientación directa. El producto de hibridación de 5,7
kb esperado se detectó en veinticinco de las setenta líneas de
arroz. Las veinticinco líneas, es decir todas, tenían múltiples
productos de hibridación y dos de las líneas tenían modelos
idénticos de hibridación compleja, lo que indica que probablemente
provenían del mismo suceso de transformación.
Las líneas de control no-Mar,
GOS2, también se analizaron por análisis Southern. El ADN de
cuarenta y ocho líneas de RD GOS2 se digirió con las enzimas de
restricción EcoRI y XbaI y, si está presente la
construcción génica intacta, ello dará como resultado un producto de
hibridación de 4,4 kb cuando se radiomarca con una sonda específica
para la región codificante de GUS. El fragmento de 4,4 kb incluiría
1,6 kb del promotor de GOS2, la región codificante de GUS, la UTR 3'
de nos y el promotor 35T (el promotor usado para conducir el gen del
marcador seleccionable). El producto de hibridación de 4,4 kb
esperado se detectó en veintiocho de las cuarenta y ocho líneas de
GOS2. Dos de las líneas tenían modelos de hibridación idénticos y
deben ser el resultado del mismo suceso de transformación. Dos de
las líneas contenían quimeras genéticas.
El análisis del arroz se realizó sobre plantas
jóvenes de transformantes primarios, después de haber sido
cultivadas las plantas 6-8 semanas en un fitotrón
(cámara climática) y haber alcanzado una altura de aproximadamente
60 cm. Por cada suceso de transformación, se analizaron dos plantas
de arroz regeneradas independientemente. Los transformantes
individuales se analizaron por transferencias Southern para
verificar la presencia de una copia intacta del transgén y
determinar si cada suceso mostraba modelos de hibridación únicos que
indicaran sucesos de transformación independientes. Las plantas que
carecían de una copia completa del transgén, de sucesos quiméricos o
de sucesos de integración duplicados no se incluyeron en el
análisis.
Los resultados de los análisis se dan en las
Figs. 3 y 4.
En la Fig 3, las barras de error representan la
desviación típica entre las plantas para cada suceso de
transformación. Se procesaron independientemente dos muestras para
cada planta. En general, el nivel de expresión de GUS en plantas de
arroz independientes procedentes de cada suceso de transformación
fue similar (como se demuestra por la desviación típica de los
resultados indicados en la Fig. 3).
La Fig 4 muestra el porcentaje de sucesos de
transformación que expresan GUS en los intervalos indicados.
Se hicieron construcciones Act2/GUS/nos (región
de iniciación de la transcripción de Act2/gen estructural de GUS/UTR
3' nos) para ensayo en un sistema dicotiledóneo
(Arabidopsis). Se hicieron tres vectores:
pAct2-bin (SEQ ID Nº 30) es un
vector binario que contiene una caja Act2/GUS/nos,
19S/NPTII/orf25polyA como marcador seleccionable y 35S/GFP/nos como
gen informador independiente.
pArActAf-bin (SEQ ID Nº 31) es
idéntico a pAct2-bin salvo que tiene la MAR dímera
de SEQ ID Nº 29 situada en dirección 5' respecto de la región de
iniciación de la transcripción de Act2 y la MAR dímera de SEQ ID Nº
26 situada en dirección 3' respecto de la UTR 3' de nos.
pAfAct2Af-bin (SEQ ID Nº 32) es
idéntico a pAct2-bin salvo que tiene la MAR dímera
de SEQ ID Nº 26 situada en dirección 5' respecto de la región de
iniciación de la transcripción de la MAR dímera de SEQ ID Nº 33
situada en dirección 3' respecto de la UTR 3' de nos.
Estos vectores permitieron ensayar dos
orientaciones de la MAR dímera artificial en Arabidopsis. En
la Figura 5 se muestra un esquema de las construcciones
pArAct2Af-bin y pAfAct2Af-bin.
La transformación de Arabidopsis se
realizó de acuerdo con un protocolo proporcionado por Pam Green (van
Hoof y Green 1996), que es una adaptación de los protocolos de
Nicole Bechtold (Bechtold et al., 1993), Andrew Bent (Bent
et al., 1994) y Takashi Araki (comunicación personal).
Se echaron semillas de ecotipo Columbia en
tiestos cuadrados de unos 10 cm (4 pulgadas), se cubrieron con una
malla y se cultivaron en condiciones de 16 horas de luz/8 horas de
oscuridad a 22ºC, fertilizando por subirrigación una vez a la
semana. El fertilizante consistía en KNO_{3} 5 mM, KPO_{4} 2,5
mM (pH 5,5), MgSO_{4} 2 mM, Ca(NO_{3})_{2} 2 mM,
Fe\cdotEDTA 0,05 mM, ácido bórico 0,07 mM, MnCl_{2} 0,014 mM,
CuSO_{4} 0,005 mM, ZnSO_{4} 0,001 mM, NaMoO_{4} 0,0002 mM, y
NaCl 0,01 mM. Las plantas se clarearon dejando 4 por tiesto y se
cultivaron hasta que nacieron varios brotes. Cuando las plantas
estaban listas para transformar, las partes encima de tierra se
sumergieron en medio de infiltración (2,2 g/l de sales MS, 1X
vitaminas B5, 50 g/l de sacarosa, MES 2,5 mM, pH 5,7,
bencilaminopurina 0,044 M, 200 ml/l de Silwet
L-77^{TM} [Osi Specialties, Inc.] que contenía
células de Agrobacterium, y se pusieron dentro de un
desecador a vacío de 400 mm de Hg (aproximadamente 17 pulgadas)
durante 5 minutos. Después de liberar rápidamente el vacío, los
tiestos se drenaron y se tumbaron sobre sus lados en una bandeja
cubierta con una envoltura de plástico para mantener la humedad
durante 24 horas. Al día siguiente, se descubrieron los tiestos y se
pusieron en pie. Se amontonaron las plantas de una en una y después
de 2 semanas se redujo el riego gradualmente para dejar que las
plantas se secaran. Se recogieron semillas de cada planta
individualmente.
Para la selección de sucesos de transformación,
se esterilizaron superficialmente 1-10 mg de
semillas por planta por remojo en blanqueante al 10% durante 7
minutos mientras se mezclaba vigorosamente, seguido de tres lavados
en agua estéril, y se pusieron en un matraz que contenía medio de
germinación de Arabidopsis (sales MS, vitaminas MS, sacarosa
al 10%, ácido 2-[N-morfolinoetanosulfónico [MES] 2,5
mM, 30 mg/l de kanamicina, 50 mg/l vancomicina y
Bacto^{TM}-Agar al 0,1% [Difco Laboratories,
Detroit, MI]). Después de agitar en luz continua a 90 rpm durante 3
días, las semillas germinaron y se aislaron transformantes como
plántulas verdes entre 7 y 12 días después de la germinación. Las
semillas no transformadas produjeron pequeñas plántulas blanqueadas.
Los transformantes se transfirieron a medio sólido (sales MS,
vitaminas B5, sacarosa al 10%, MES 2,5 mM, 15 g/l de Phytagar^{TM}
[Gibco BRL, Gaithersburg, MD], 30 ml/l de kanamicina, 50 mg/l de
vancomicina) en placas para selección adicional. Después de una a
dos semanas, se transfirieron transformantes verdaderos a
recipientes GA7 (sales MS, vitaminas B5, sacarosa al 0,3%, MES 2,5
mM) durante una a dos semanas antes de plantarlos en tierra para
producir semillas T1.
Se utilizó el análisis Southern para identificar
líneas de Arabidopsis T2 regeneradas primarias que contenían
copias intactas de la construcción génica específica.
Las muestras reunidas de tejido foliar de
Arabidopsis se redujeron a polvo en nitrógeno liquido. Luego
el tejido molido se incubó durante tres minutos en 500 \mul de
tampón de extracción 2X (CTAB al 2%, TrisHCl 100 mM, pH 8,0, EDTA 20
mM, NaCl 1,4 M y 2-mercaptoetanol al 2%) a 65ºC. Se
añadieron 500 \mul de cloroformo/octanol (24:1), las muestras se
sacudieron durante dos minutos y después se centrifugaron a 14.000 g
en una microcentrífuga y se separó el líquido sobrenadante. Se
repitió la extracción con cloroformo/octanol. Al líquido
sobrenadante, se añadió un ml de tampón de precipitación (CTAB al
1%, Tris-HCl 50 mM, pH 8,0, EDTA 10 mM, y
2-mercaptoetanol al 1%) y después se incubó a
temperatura ambiente durante 60 minutos. El ADN se sedimentó por
centrifugación a 3.500g durante 5 minutos en una microcentrífuga. El
sedimento se escurrió y se resuspendió en 200 \mul de NH_{4}OAc
1,0 M. Se añadieron 100 \mul de NH_{4}OAc 7,5 M y 1 ml de
isopropanol, las muestras se incubaron en hielo durante 5 minutos y
después se centrifugaron a 14.000 g durante 5 minutos. El sedimento
se escurrió y resuspendió en 200 \mul de TE. Se añadieron 100
\mul de NH_{4}OAc 7,5 M y 1 ml de isopropanol y se incubó en
hielo durante 5 minutos y después se centrifugó a 14.000 g durante 5
minutos. El sedimento se escurrió y se lavó con etanol al 70% y se
secó en un Speed Vac (Savant Instruments Inc., Farmingdale, NY). El
sedimento secado se resuspendió en 20 \mul de TE (TRIS 10 mM, EDTA
1 mM, pH 8,0).
Se llevó a cabo un análisis Southern sobre 29
líneas de ArAct2Af T2 y 24 líneas de AfAct2Af T2. Se digirió un
microgramo de ADN de las plantas ArAct2Af con la enzima de
restricción XbaI utilizando condiciones sugeridas por el
fabricante (Bethesda Research Laboratory, Gaithersburg, MD) y los
fragmentos generados se separaron por electroforesis en gel de
agarosa, dando como resultado un producto de hibridación de 4,6 kb,
si la construcción génica está intacta, cuando se radiomarcó con una
sonda específica para la región codificante de GUS. De manera
similar a las plantas de arroz ArGOS2Af, el fragmento de 4,6 kb
constará de la MAR artificial en orientación inversa, el promotor de
Act2, la región codificante de GUS, la UTR 3' de nos y la MAR
artificial en orientación directa. Se transfirió el ADN sobre
membranas de nilón como ha descrito Southern (1975, 1989). El ADN de
la sonda radiomarcada se hibridó al ADN genómico en las
transferencias utilizando 50 ml de tampón de hibridación mínimo
(polietilenglicol al 10%, dodecilsulfato de sodio al 7%, 0,6 x SSC,
fosfato de sodio 10 mM, EDTA 5 mM y 100 mg/ml de ADN de esperma de
salmón desnaturalizado), se calentó a 60ºC y se mezcló con la sonda
radiomarcada desnaturalizada antes de añadirlo a las transferencias
para su hibridación durante la noche a 60ºC. Las transferencias se
lavaron a 60ºC en 0,25X SSC y SDS al 0,2% durante 45 minutos, se
secaron sobre papel absorbente y se expusieron a película de
XAR-5 con dos pantallas intensificadoras durante la
noche.
El producto de hibridación de 4,6 kb esperado se
detectó en veintiséis de las veintinueve líneas de ArAct2Af. Se
generó una segunda transferencia Southern para determinar el número
de copias de la construcción de ArAct2Af. El ADN de ArAct2Af se
digirió con las enzimas de restricción SstI y XhoI que
cortan la construcción cerca de los márgenes izquierdo y derecho del
ADN-T. Las transferencias se radiomarcaron con
sondas específicas para la MAR artificial y para el ADN del margen
izquierdo del sitio XhoI 800 pb en dirección 3'. Una sola
copia de la construcción de ArAct2Af tendrá tres productos de
hibridación: dos fragmentos de tamaño desconocido, consistente en el
ADN de los márgenes izquierdo y derecho, y el fragmento de 8,9 kb
que es el ADN situado entre ambos márgenes. Veintidós de la
veintinueve líneas tenían tres o menos productos de hibridación, lo
que indica que estaba presente una sola copia de la construcción de
ArAct2Af.
El ADN de las plantas AfAct2Af se digirió con la
enzima de restricción XbaI que, en caso de que esté presente
la construcción intacta, ello dará como resultado un producto de
hibridación de 5,7 kb cuando se radiomarca con una sonda específica
para la región codificante de GUS. El fragmento de 5,7 kb constará
de la MAR artificial en orientación directa, el promotor de Act2, la
región codificante de GUS, la UTR 3' de nos y la MAR artificial en
orientación directa. También se incluye la región codificante de la
proteína verde fluorescente y la UTR 3' de nos. El producto de
hibridación de 5,7 kb esperado se detectó en todas y cada una de las
veinticuatro líneas de AfAct2Af.
Se generó una segunda transferencia Southern para
determinar el número de copias de la construcción de AfAct2Af. El
ADN de ArAct2Af se digirió con las enzimas de restricción
SstI y XhoI que cortan la construcción cerca de los
márgenes izquierdo y derecho del ADN-T. Las
transferencias se radiomarcaron con sondas específicas para la MAR
artificial y para el ADN del margen izquierdo del sitio XhoI
800 pb en dirección 3'. Una sola copia de la construcción de
AfAct2Af tendrá tres productos de hibridación: dos fragmentos de
tamaño desconocido, consistentes en el ADN de los márgenes izquierdo
y derecho, y el fragmento de 8,9 kb que es el ADN situado entre
ambos márgenes. Quince de las veinticuatro líneas tenían tres o
menos productos de hibridación, lo que indica que estaba presente
una sola copia de la construcción de ArAct2Af.
Las líneas de control no-Mar,
Actbin, también se analizaron por análisis Southern. El ADN de
treinta y cuatro líneas Actbin 72 se digirió con la enzima de
restricción PstI que, en caso de que la construcción
permanezca intacta, dará como resultado un producto de hibridación
de 3,4 kb cuando se radiomarca con una sonda específica para la
región codificante de GUS. El fragmento de 3,4 kb constará del
promotor de Act2, la región codificante de GUS y la UTR 3' de nos.
En treinta de las treinta y cuatro líneas de Actbin se detectó el
producto de hibridación de 3,4 kb esperado. Se generó una segunda
transferencia Southern para determinar el número de copias de la
construcción de Actbin. El ADN de las líneas Actbin se digirió con
las enzimas de restricción SstI y XhoI que cortan la
construcción cerca de los márgenes izquierdo y derecho del
ADN-T. Las transferencias se radiomarcaron con
sondas específicas para la UTR 3' de nos y para el ADN del margen
izquierdo del sitio XhoI 800 pb en dirección 3'. Una sola
copia de la construcción de Actbin tendrá tres productos de
hibridación: dos fragmentos de tamaño desconocido, consistentes en
el ADN de los márgenes izquierdo y derecho, y el fragmento de 8,2 kb
que es el ADN situado entre ambos márgenes. Nueve de las treinta y
cuatro líneas tenían tres productos de hibridación o menos, lo que
indica que estaba presente una sola copia de la construcción
Actbin.
Para cultivar Arabidopsis, la semilla de
T2 se hizo germinar in vitro en medio MS que contenía 90 mg/l
de kanamicina y se recogieron plantas de 3 semanas de edad
resistentes a kanamicina. Se utilizaron dos lotes de 30 plántulas
por suceso de transformación para el análisis de GUS y se utilizaron
algunas plántulas más para extraer el ADN.
Para el análisis de la actividad de GUS, se
redujeron a polvo muestras de hojas en nitrógeno líquido y se
pusieron muestras de aproximadamente 400 ml de tejido en tubos de
microcentrífuga. Se procesaron dos muestras independientes
procedentes de cada muestra de hojas. El tejido se almacenaba a
-70ºC o bien se extraía inmediatamente. Se extrajo GUS mezclando el
tejido en polvo con tampón de lisis para GUS (Jefferson et
al., 1987) modificado por adición de polivinilpolipirrolidona al
1% (hidratada en el tampón durante al menos una hora) y glicerol al
20%. Después de incubar en hielo durante al menos 10 min, las
muestras se centrifugaron a 16.000 g durante 10 min. Los líquidos
sobrenadantes se recuperaron y se centrifugaron una segunda vez como
se ha descrito antes. Los líquidos sobrenadantes se recuperaron y
congelaron sobre hielo seco y se almacenaron a -70ºC. Los
experimentos indicaron que la actividad de GUS era estable durante
al menos 4 ciclos de congelación descongelación cuando se
almacenaron en el tampón descrito anteriormente (W.M. Ainley, sin
publicar). La actividad de GUS se midió utilizando un kit
GUS-Light^{TM} (Tropix, Inc., Bedford, MA). A 195
ml del tampón de reacción GUS-Light^{TM} se
añadieron muestras de cinco ml de extracto sin diluir o de extracto
diluido de modo que la luminiscencia estuviera dentro del intervalo
medido por el luminómetro. La luminiscencia se integró durante 5 s
después de una demora de 5 s. La proteína se midió con el ensayo
desarrollado por Bradford (1976) utilizando seralbúmina humana como
patrón. La actividad de GUS se normalizó entre experimentos
utilizando un patrón de GUS obtenido de SIGMA. La cantidad de
proteína de planta en los patrones y en las muestras de plantas era
la misma; en los casos necesarios, la proteína se ajustó utilizando
extractos de plantas sin transformar.
Las Figs. 6 y 7 dan a conocer los resultados del
análisis de GUS. La Fig. 6 da a conocer la expresión observada para
sucesos independientes de transformación que expresan o bien la
construcción no-MAR de base (Actbin) o bien la
construcción de base flanqueada por la MAR artificial en la
orientación indicada (ArAct2Af o
Af-Act-Af). Las desviaciones típicas
indican la varianza entre las plantas recogidas de diferentes
placas. Las flechas indican las orientaciones relativas de las
MAR.
E.
En la Fig. 7, se muestra el porcentaje de sucesos
de transformación que expresan GUS en los intervalos indicados.
Se analizaron plantas de Arabidopsis T2.
Las plantas fueron evaluadas en cuanto a segregación de resistencia
a la kanamicina para determinar el número de copias del inserto.
Unos cuantos sucesos no caían en ninguna categoría de inserto, como
se determinó por análisis Chi cuadrado. De las plantas restantes, el
72% tenía un solo inserto. La mayoría de los insertos tenían
múltiples copias del transgén. Aunque los sucesos de transformación
de Arabidopsis eran cultivados en entornos controlados, había
algunas diferencias ocasionales en el crecimiento relativo de las
plantas entre las placas duplicadas. En esos casos, los sucesos o no
se utilizaron o se cultivaron de nuevo. El coeficiente de varianza
de la expresión determinada a partir de placas duplicadas fluctuaba
entre 1 y 46%, con el 89% por debajo de 20% (Figura 6).
En general, todos los sucesos de transformación
de Arabidopsis ensayados para una construcción se cultivaron
y analizaron juntos. Aunque el crecimiento de las plantas ocurrió en
entornos controlados, existía la posibilidad de que las diferencias
observadas entre los sucesos de transformación que expresaban las
construcciones fueran debidas a diferencias ambientales entre los
diferentes experimentos. Para eliminar esta posibilidad, tres de los
sucesos de máxima expresión obtenidos a partir de los tres conjuntos
de sucesos de transformación de Arabidopsis se cultivaron
juntos y se reanalizaron. Este análisis confirmó las diferencias
previas entre los conjuntos de sucesos de transforma-
ción.
ción.
Tanto en arroz como en Arabidopsis, el
nivel medio de expresión de sucesos de transformación que expresan
las construcciones que contienen MAR fue mayor que el de las que
carecen de los elementos MAR (Tabla 3). En Arabidopsis, la
orientación de las MAR ensayadas influyó sobre el nivel de
expresión. Las plantas que contenían construcciones en la que las
MAR estaban en la misma orientación en cualquier lado de la
construcción génica de GUS expresaron GUS a niveles más altos que
las plantas que contenían construcciones en las que las MAR estaban
orientadas en orientaciones opuestas.
Parecía haber un nivel de expresión
proporcionalmente mayor en los expresores más altos que en los
expresores más bajos en cada conjunto de sucesos de transformación.
Para documentar esto, se comparó la expresión del cuartil superior
de los expresores (Tabla 3). Basándose en estos datos, el cuartil
superior de los sucesos de transformación que expresan la
construcción AfAct2Af producen la proteína GUS a niveles 5,6 veces
más altos que en el cuartil superior de sucesos que expresan la
construcción Actbin. Las MAR artificiales en orientaciones opuestas
tanto en arroz como en Arabidopsis intensifican la expresión
aproximadamente dos veces más que las respectivas construcciones que
carecen de las MAR.
| \begin{minipage}[t]{155mm} Las medias para el cuarto cuartil de los niveles de expresión de los sucesos de transformación fueron estadísticamente diferentes (p es menor o igual que 0,05) en base a los análisis del ensayo de la t. (Gopal K. Kanji 1995). \end{minipage} |
Estudios publicados anteriormente (revisados por
Holmes-Davis y Comai, 1998) han demostrado que,
salvo una MAR, todas las demás ensayadas hasta la fecha intensifican
la expresión de los genes informadores. Este estudio representa el
primer informe de que una MAR construida utilizando elementos
encontrados preferentemente en regiones MAR puede intensificar la
expresión en especies de plantas que representan tanto a las
monocotiledóneas como a las dicotiledóneas.
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\hskip1cmWoosley, Aaron T
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MATRIZ PARA AUMENTAR LA EXPRESIÓN DE GENES INTRODUCIDOS EN CÉLULAS
DE PLANTAS
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 50545
\vskip0.400000\baselineskip
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<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 327
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: MAR artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial para el sitio ARBP
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatttcasttg taaaa
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<211> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: sitio ARBP
\vskip0.400000\baselineskip
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: sitio ARBP
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: sitio de ATF
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<213> Secuencia Artificial
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<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: sitio para BEAF-32
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<213> Secuencia Artificial
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<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: sitio para topoisomerasa II
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: sitio para topoisomerasa II
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: sitio para topoisomerasa II
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: secuencia desenrollada
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<211> 11
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: sitio para SATB1
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<211> 9
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: sitio para SATB1
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\hskip-.1em\dddseqskipataatcttc
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<210> 13
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<211> 10
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: sitio para SATB1
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\hskip-.1em\dddseqskipttattattta
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: sitio para SATB1
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<212> ADN
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<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: sitio para SATB1
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<210> 16
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\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: sitio para SATB1
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipttttaatgag ataataa
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: sitio para SATB1
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptataatcttc
\hfill10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: sitio del ADN desenrollado
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaaannnnnnn aaa
\hfill13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: tramo de oligo A/T ejemplar
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaaaaaaa
\hfill7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 54
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: oligonucleótido MAR-A
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipttccagatct cgatatcttt aatttctaat atatttagaa ggggtttaga ttta
\hfill54
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 63
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: oligonucleótido MAR-B
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgaaggggttt agatttatat atgacgtcca tgaaaaaaaa ttttaaaacg ataggccagc
\hfill60
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptcc
\hfill63
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 63
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: oligonucleótido MAR-C
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgataggcca gctccaaaga atatatttcc ctggagctgg taaatattaa ttagtcctct
\hfill60
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccc
\hfill63
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 75
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: oligonucleótido MAR-D
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcttggcatgg agctatataa tcttaaaaag gaatcaaaaa tatcgaaaaa tatattagaa
\hfill60
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgggagaggac taatt
\hfill75
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 74
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: oligonucleótido MAR-E
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccaagtcaag tgtgcttttt aaaaattttg ctgacttcat aaaatatatt aggaagtcag
\hfill60
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcttggcatgg agct
\hfill74
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 74
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: oligonucleótido MAR-F
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcacggatcc tgcaagagtt ttacaagtga aattaagttt aaacatttat aaatatatac
\hfill60
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcaagtcaagt gtgc
\hfill74
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 668
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: 3' MAR en
\vskip1.000000\baselineskip
ArActAf
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9361
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: pGOS2-hpt
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10629
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: pArGOS2Af-hpt
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 676
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: 5' MAR en
\vskip1.000000\baselineskip
Ar-Act-Af
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15676
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: pAct2-bin
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17111
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: pArActAf-bin
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17116
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: pAfActAf-bin
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 646
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: 3' MAR en
pAf-Act2-Af
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 33
Claims (10)
1. Una molécula de ADN aislada que comprende los
pb 11 a 309 de SEQ ID Nº 1.
2. Una construcción de ADN, que comprende, en
dirección 5' a 3': una región de iniciación de la transcripción
funcional en células de plantas, un gen estructural operativamente
asociado a la región de iniciación de la transcripción, una región
no traducida 3', y una región de unión a la matriz que comprende los
pb 11 a 309 de SEQ ID Nº: 1 situada o bien en dirección 5' respecto
de la región de iniciación de la transcripción o bien en dirección
3' respecto de dicho gen estructural.
3. Una construcción de ADN según la
reivindicación 2, en donde dicha región de unión a la matriz
comprende dos o más copias en tándem de los pb 11 a 309 de SEQ ID Nº
1.
4. Una construcción de ADN según la
reivindicación 2, en donde una primera región de unión a la matriz
que comprende los pb 11 a 309 de SEQ ID Nº 1 está situada en 5'
respecto de dicha región de iniciación de la transcripción y una
segunda región de unión a la matriz que comprende los pb 11 a 309 de
SEQ ID Nº 1 está situada en 3' respecto de dicho gen
estructural.
5. Una construcción de ADN según la
reivindicación 4, en donde dichas regiones de unión a la matriz
comprenden dos o más copias en tándem de los pb 11 a 309 de SEQ ID
Nº 1.
6. Un método para producir células de plantas
recombinantes en las que se ha introducido un incremento de la
expresión de genes estructurales, que comprende:
transformar una célula de planta capaz de
regenerarse con una construcción de la reivindicación 2.
7. Un método según la reivindicación 6, en donde
la región de unión a la matriz en dicha construcción de ADN
comprende dos o más copias en tándem de los pb 11 a 309 de SEQ ID Nº
1.
8. Un método según la reivindicación 6, en donde
la construcción de ADN incluye una primera región de unión a la
matriz que comprende los pb 11 a 309 de SEQ ID Nº: 1 situados en 5'
respecto de dicha región de iniciación de la transcripción y una
segunda región de unión a la matriz que comprende los pb 11 a 309 de
SEQ ID Nº: 1 situada en 3' respecto de dicho gen estructural.
9. Un método según la reivindicación 8, en donde
cada una de dichas regiones primera y segunda de unión a la matriz
comprende dos o más copias en tándem de los pb 11 a 309 de SEQ ID Nº
1.
10. Una célula de planta transformada que
contiene el ADN de los pb 11 a 309 de SEQ ID Nº 1.
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