JP4544748B2 - 植物細胞内に導入された遺伝子の発現を増加するための人工マトリックス付着領域 - Google Patents
植物細胞内に導入された遺伝子の発現を増加するための人工マトリックス付着領域 Download PDFInfo
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Description
【０００１】
本発明は、植物分子生物学、そして具体的には形質転換された植物細胞中に導入された遺伝子の発現を増強するための技術に関する。
【０００２】
組換えＤＮＡ技術および遺伝子工学の使用を通じて、希望のＤＮＡ配列を植物細胞内に導入して、関係するタンパク質の発現をさせることが可能となっている。遺伝子的に操作された形質、例えば有用な植物産物の生産を増加または変性する昆虫耐性、疫病耐性、渇水耐性、除草薬耐性、または代謝変性を有する植物は、農業の改善に大きい将来性を提供する。
【０００３】
植物細胞内に導入されたＤＮＡの発現の希望するレベルを得ることには、まだ問題が残っている。「位置効果」変動と呼ばれる一つの問題は、独立した形質転換体内の同じ遺伝子の発現における変動である。この問題を解明するためのマトリックス付着領域または骨格付着領域と呼ばれる天然に存在するＤＮＡ配列の使用は、米国特許（ＵＳ）第５，７７３，６８９号およびＷＯ９４／２４２９３号中に提出されている。
【０００４】
本発明は、形質転換された植物内に導入された遺伝子の発現を増加するマトリックス付着領域として有用である配列番号１の１１〜３０９を含んでなる、新規の合成ＤＮＡ分子を提供する。
【０００５】
別の態様では、本発明は、５’から３’への方向で、植物細胞内で機能性の転写開始領域、転写開始領域と操作的に関連する構造遺伝子、３’非翻訳領域、および該転写開始領域に対して５’または該構造遺伝子に対して３’のいずれかに位置する配列番号１のｂｐ１１から３０９までを含んでなるマトリックス付着領域を含んでなるＤＮＡ構築物を提供する。好ましい態様では、配列番号１のｂｐ１１から３０９までを含んでなる第一マトリックス付着領域が該転写開始領域に対して５’に位置し、そして配列番号１のｂｐ１１から３０９までを含んでなる第二マトリックス付着領域が該３’非翻訳領域に対して３’に位置する。
【０００６】
特に好ましくは態様では、本発明のマトリックス付着領域は配列番号１のｂｐ１１から３０９までの２個またはそれ以上の縦列コピーを含んでなる。
【０００７】
配列の説明
配列番号１には、本発明の人工ＭＡＲを記載する。
【０００８】
配列番号２〜４には、ＡＲＢＰ部位を記載する。
【０００９】
配列番号５には、ＡＴＥ部位を記載する。
【００１０】
配列番号６には、ＢＥＡＦ−３２部位を記載する。
【００１１】
配列番号７〜９には、トポイソメラーゼＩＩ部位を記載する。
【００１２】
配列番号１０には、巻き戻し配列を記載する
配列番号１１〜１７には、ＳＴＡＢ Ｉ部位を記載する。
【００１３】
配列番号１８には、例示的な曲りＤＮＡを記載する。
【００１４】
配列番号１９には、例示的なＡ／Ｔトラクトを記載する。
【００１５】
配列番号２０には、合成ＭＡＲ−Ａを記載する。
【００１６】
配列番号２１には、合成ＭＡＲ−Ｂを記載する。
【００１７】
配列番号２２には、合成ＭＡＲ−Ｃを記載する。
【００１８】
配列番号２３には、合成ＭＡＲ−Ｄを記載する。
【００１９】
配列番号２４には、合成ＭＡＲ−Ｅを記載する。
【００２０】
配列番号２５には、合成ＭＡＲ−Ｆを記載する。
【００２１】
配列番号２６には、ｐＡｒＧＯＳ２Ａｆ−ｈｐｔおよびＡｒＡｃｔ２Ａｆ−ｂｉｎ内の３’ＭＡＲダイマーを記載する。
【００２２】
配列番号２７には、コメ形質転換ベクターｐＧＯＳ２−ｈｐｔを記載する。
【００２３】
配列番号２８には、コメ形質転換ベクターｐＡｒＧＯＳ２Ａｆ−ｈｐｔを記載する。
【００２４】
配列番号２９には、ｐＡｒＧＯＳ２Ａｆ−ｈｐｔおよびＡｒＡｃｔ２Ａｆ−ｂｉｎ内の５’ＭＡＲダイマーを記載する。
【００２５】
配列番号３０には、双子葉植物形質転換ベクターｐＡｃｔ２−ｂｉｎを記載する。
【００２６】
配列番号３１には、双子葉植物形質転換ベクターｐＡｒＡｃｔ２Ａｆ−ｂｉｎを記載する。
【００２７】
配列番号３２には、双子葉植物形質転換ベクターｐＡｆＡｃｔ２Ａｆ−ｂｉｎを記載する。
【００２８】
配列番号３３には、ｐＡｆＡｃｔ２Ａｆ−ｂｉｎ内の３’ＭＡＲダイマーを記載する。
【００２９】
【発明の詳細な記述】
真核生物の核は、高度に組織化された構造であり、その中ですべての遺伝子情報は、複写、転写およびその他の細胞イベントに関して秩序だった様式で接近できなければならない（レヴィン(Lewin, 1994) 、ディロンおよびグロスフェルト(Dillon and Grosveld, 1994) 、ジャクソン(Jackson, 1995) 、ヴォルフ(Wolffe, 1994)）。遺伝子は、標準的には、マトリックス付着領域（ＭＡＲ）として知られる場所でタンパク様核マトリックスに対して付着する種々の大きさのクロマチンループ内で組織化される。ＭＡＲは、しばしば遺伝子の非翻訳領域内に位置し、そして個別のＤＮＡループの物理的境界を形成すると考えられている。多くの場合に、ＭＡＲは形質転換有機体内で位置効果を低下させることが示されている。ニワトリリゾチームＭＡＲは、発現を増加し、変動を減少しそして安定して移入された細胞内（スティーフら(Stief et al., 1989)）、形質転換マウス内（ボニファーら(Bonifer et al., 1990)、マックナイトら(McKnight et al., 1992) ）および形質転換タバコ植物内（ムリナロバら(Mlynarova et al., 1994)、ムリナロバら(Mlynarova et al., 1995 ））で、コピー数依存性の隣接遺伝子を発現させることが示された。
【００３０】
しかし、すべてのＭＡＲが遺伝子発現に対してこのような作用を有するわけではない。２個の最少ドロソフィラ(Drosophila)ＭＡＲ（１個はヒストンＨ１とＨ３遺伝子との間に、他は熱ショックＨＳＰ７０遺伝子の近くに位置する）は、安定に形質転換した細胞内で１０倍以上で発現を刺激するが、しかしこれらのＭＡＲの存在は、位置効果を低下させなかった（ポルジャックら(Poljak et al., 1994) ）。アポリポタンパク質ドメインからのＭＡＲは、低コピー形質転換体内で発現を増加し、位置効果を低下したが、しかし複数コピー形質転換体内の発現は強力に抑制された（カロスおよびフールニエ(Kalos and Fournier, 1995)）。ドロソフィラｆｔｚＭＡＲを種々の染色体位置内に配置すると、これはクロマチン構造を再構成せず、そしてＭＡＲを含むクロマチン断片は核から容易に溶出し、導入されたＭＡＲは必ずしもクロマチンドメインを形成しないことを示している（エッガートおよびジャック(Eggert and Jack, 1991) ）。反対に、重鎖座エンハンサー内の免疫グロブリンに隣接するＭＡＲは、高レベルの発現および形質転換Ｂリンパ球内の拡張ＤＮａｓｅＩ感受性ドメインの形成のために要求されるが、しかし安定に移入された組織培養細胞内ではそうではない（フォレスターら(Forrester et al., 1994)）。
【００３１】
形質転換された植物内でＭＡＲを用いた結果は、同様に複雑であった（スパイカーおよびトムソン(Spiker and Thompson, 1996) ）。酵母ＭＡＲは、安定に形質転換された煙草カルス株中で発現レベルを増加したが、しかしコピー数と発現レベルとの間に相関は発見できなかった（アレンら(Allen et al., 1993)）。反対に、ダイズ熱ショック遺伝子Ｇｍｈｓｐ１７．６−ＬからのＭＡＲ要素は、発現レベル上昇の能力を示したが、しかし変動性にはほとんど影響しなかった（シェッフルら(Schoeffl et al., 1993) ）。レポーター遺伝子構築物に隣接するダイズＭＡＲは、ＭＡＲを欠失する構築物と比較すると、発現の変動を低下させたが、形質転換タバコカルス内のレポーター遺伝子構築物の５’および３’に存在すると、発現レベルも低下させた（ブレインら(Breyne et al., 1992) ）。それぞれのＭＡＲは、これらのマトリックス結合能力に加えて異なる機能的および構造的性質を有することが可能である（ブレインら(Breyne et al., 1994) ）。
【００３２】
ＭＡＲは、通常長さは３００〜２０００塩基対であり、アデノシンおよびチミン残基が多く、そしてしばしばある種の保存された配列要素および構造的特徴を含む。文献に記載された大部分のＭＡＲは、植物から得られたものではないが、しかし他の生物体からのＭＡＲは、植物骨格に良く結合しそしてその反対も多く文献に報告されている（ディーツら(Dietz et al., 1994)）、ブレインら(Breyne et al., 1992) ）。
【００３３】
表１は、文献に記載されたＭＡＲ中に存在する配列要素を記載している。これには、下記の植物ＭＡＲが含まれている。ダイズ熱ショックタンパク質遺伝子ＭＡＲ（シェッフルら(Schoeffl et al., 1993) ）、ペチュニアＭＡＲ（ディーツら(Dietz et al., 1994)）、エンドウプラストシアニン遺伝子ＭＡＲ（ストラッターら(Slatter et al., 1991)）、メイズＡｄｈ１遺伝子５’および３’ＭＡＲ（アブラモヴァおよびベネッツエン(Avramova and Bennetzen, 1993)、アブラモヴァら(Avramova et al., 1995) ）、β−ファセオリン(phaseolin) 遺伝子５’および３’ＭＡＲ（ファンデルゲーストら(van der Geest et al., 1994)）。
【００３４】
【表１】
【００３５】
【表２】
【００３６】
本発明は、新規の人工ＭＡＲ内で表１に記載の特徴の部分集合を用いる。３２７ｂｐ人工ＭＡＲの配列は、配列番号１に記載されている。人工ＭＡＲは、ＢｇｌＩＩおよびＢａｍＨＩ制限部位により隣接される配列番号列として設計され、これらは配列番号１内に含まれているが、しかしこれらはＭＡＲの機能にとって重要ではない。ＭＡＲの機能性部分は、配列番号１の１１〜３９０を含んでなる。
【００３７】
下記の特徴が、配列番号１内で見いだされた。
【００３８】
【表３】
【００３９】
本発明の構築物中に使用された３’ＵＴＲ、すなわち３’非翻訳領域は、ｍＲＮＡの効率的な処理を与え、メッセージの安定性を維持しそして転写ｍＲＮＡ配列の３’末端にアデノシン・リボヌクレオチドの付加を指令するものである。３’ＵＴＲは、プロモーター領域に本来的、構造遺伝子に本来的であっても、または他の起源から誘導されてもよい。適当な３’ＵＴＲは下記を含むがこれに限定はされない。ｐｅｒ５ ３’ＵＴＲ、およびノパリン合成酵素（ｎｏｓ）遺伝子の３’ＵＴＲ。
【００４０】
実施例１
人工ＭＡＲの合成
人工ＭＡＲを構築するために、６種の個別のオリゴヌクレオチドを合成し、そしてＰＣＲにより構築した。以後ＭＲＡ−Ａ、ＭＲＡ−Ｂ、ＭＲＡ−Ｃ、ＭＲＡ−Ｄ、ＭＲＡ−ＥおよびＭＲＡ−Ｆと呼ぶ６種のオリゴヌクレオチドの配列は、それぞれ配列番号２０〜２５として配列表示表に記載する。隣接オリゴヌクレオチド間の１５ｂｐオーバーラップは、図１に記載の戦略を用いてＰＣＲによるＭＡＲの構築を可能とした。
【００４１】
ＡｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼを用いるジーンアンプ(GeneAmp) TMＰＣＲ試薬キット（パーキンエルマー(Perkin Elmer, Norwalk, CT) ）をＤＮＡ増幅に使用した。プライマーＭＲＡ−ＣおよびＭＲＡ−Ｄを用いるＰＣＲの２０サイクル（変性：９４℃で３０秒間、アニーリング：５２℃で６０秒間および延伸：７０℃で６０秒間）に、プライマーＭＲＡ−ＢおよびＭＲＡ−Ｅを用いるＰＣＲの２０サイクルを続け、第一反応からの生成物を第二反応の鋳型として使用した。この反応の２３１ｂｐ生成物を低融点アガロースゲルから精製し、そしてプライマーＭＲＡ−ＡおよびＭＲＡ−Ｆを用いるＰＣＲの２０サイクルのための鋳型として使用した。この反応からの３２７ｂｐ生成物を、ＴＡクローニング(Cloning) TMキット（インヴィトロジェン(Invitrogen, San Diego, CA) ）を用いてｐＣＲ２．１内にサブクローンし、そして配列を配列決定により確認した。
【００４２】
ＢｇｌＩＩ／ＢａｍＨＩ断片の２個の縦列コピーから成るダイマーを、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔTMＳＫ−（ストラタジーン(Stratagene, La Jolla, CA)）のＢａｍＨＩ部位内に構築した。ダイマーの配列は、配列番号２６のｂｐ５〜６３０である。
【００４３】
実施例２
人工ＭＡＲの核骨格への結合
Ａ．対照
人工ＭＡＲとしての類似した大きさおよびヌクレオチド組成の２個のＤＮＡ断片を植物ＤＮＡから増幅して結合アッセイにおける対照として使用した。これらの断片は、メイズ遺伝子Ｇｐａ１の３’末端からの６５７ｂｐ断片（グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素サブユニットＡ、ジーンバンクアクセッション番号(GeneBank accession number) Ｘ１５４０８、塩基４５１６〜５１７３、キグレイら(Quigley et al., 1989)）、および１９ｋＤアルファ・ゼイン遺伝子の５’隣接領域から４８８ｂｐ断片（ジーンバンクアクセッション番号Ｘ０５９１１、塩基３３９〜８２７、クリッツら(Kriz et al., 1987) ）であった。表２で、人工ＭＡＲおよび対照断片内に存在する特徴点を比較する。
【００４４】
【表４】
【００４５】
Ｂ．メイズ葉から核の調製
核骨格の単離に使用する核は、公開されたプロトコール（ホールら(Hall et al., 1991) ）を適用して若いメイズ葉から調製した。核を計数し、そしてＤＡＰＩ染色アリコート試料の顕微鏡検査により完全さを検査した。高品質核のみを二ヨードサリチル酸リチウム抽出による核骨格調製に使用した。
【００４６】
核精製のために、Ｖ４段階植物（第四または第五葉）からの若いメイズの葉をカミソリ刃を用いて採取し、洗浄および乾燥した。中央脈を除いた後、葉を液体窒素内で冷凍し、そして乳鉢と乳棒を用いて微粉に粉砕した。粉末状の葉をガラスビーカーに移し、５ｍｌ ＮＩＢ１＋ＰＩ（０．５Ｍヘキシレングリコール、２０ｍＭピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス〔２−エタンスルホン酸〕（ＰＩＰＥＳ）、ｐＨ６．５、２０ｍＭ ＫＣｌ、７ｍＭ ２−メルカプトエタノール、０．５ｍＭエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、０．４％トリトン(Triton)Ｘ−１００TM〔ローム・アンド・ハース社(Rohm & Haas Company, Philadelphia, PA) 〕、０．０５ｍＭスペルミン、０．１２５ｍＭスペルミジン、１ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）、１μｇ／ｍｌロイペプチン、１μｇ／ｍｌアプロチニン）を葉組織グラムあたりに加えた。葉抽出物を順番に１９００、５２０、１２５、８５および４０ｍｍフィルターに４℃で通して濾過し、フィルターを葉グラムあたりに１ｍｌのＮＩＢ１＋ＰＩでリンスして、デブリ内に保持されたすべての核を収集した。粗核抽出液の１５ｍｌを７ｍｌ ４０％パーコル(Percoll) TM（ファルマシア・バイオテク(Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) ）のＮＩＢ１（０．５Ｍヘキシレングリコール、２０ｍＭ ＰＩＰＥＳ、ｐＨ６．５、２０ｍＭ ＫＣｌ、７ｍＭ ２−メルカプトエタノール、０．５ｍＭ
ＥＤＴＡ、０．４％トリトンTMＸ−１００、０．０５ｍＭスペルミン、０．１２５ｍＭスペルミジン）およびＮＩＢ１内の５ｍｌ ７０％パーコルから成るパーコルのグラジエントに加えた。１５分間、５００ｘｇで４℃における遠心分離の後、４０％／７０％界面を滅菌したパスツールピペットで集め、そして２倍体積のＮＩＢ２（０．５Ｍヘキシレングリコール、２０ｍＭ ＰＩＰＥＳ、ｐＨ６．５、２０ｍＭ ＫＣｌ、７ｍＭ ２−メルカプトエタノール、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５ｍＭスペルミン、０．１２５ｍＭスペルミジン）に加え、これはペレットおよびその他のデブリを避けるように努めて行った。１０分間、４℃で６００ｘｇの遠心分離により核を濃縮した。
【００４７】
核ペレットを２０ｍｌ ＮＩＢ２中に再懸濁し、そして前と同様に遠心分離した。この段階をさらに１回反復して、パーコルの痕跡を洗浄除去した。血球計算器を用いて核を計数し、そしてＮＩＢ２＋ＰＩ／５０％グリセロール（０．５Ｍヘキシレングリコール、２０ｍＭ ＰＩＰＥＳ、ｐＨ６．５、２０ｍＭ ＫＣｌ、７ｍＭ ２−メルカプトエタノール、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５ｍＭスペルミン、０．１２５ｍＭスペルミジン、５０％グリセロール、１ｍＭ ＰＭＳＦ、１μｇ／ｍｌロイペプチン、１μｇ／ｍｌアプロチニン）中に、核２千万個／ｍｌで再懸濁した。骨格調製に使用するまで核を−８０℃で貯蔵した。
Ｃ．核骨格の調製
冷凍した核を解凍し、そして核２百万個あたりにＮＩＢ３＋ＰＩ（０．５Ｍヘキシレングリコール、２０ｍＭ ＰＩＰＥＳ、ｐＨ６．５、２０ｍＭ ＫＣｌ、７ｍＭ ２−メルカプトエタノール、０．０５ｍＭスペルミン、０．１２５ｍＭスペルミジン、１ｍＭ ＰＭＳＦ、１μｇ／ｍｌロイペプチン、１μｇ／ｍｌアプロチニン）の１０ｍｌを用いて洗浄した。核を１０分間、６００ｘｇで遠心分離して集め、１ｍＭ ＣｕＳＯ4 の存在下、２００ｍｌ ＮＩＢ３＋ＰＩ中に再懸濁し、そして１０分間、４２℃でインキュベーションして核を安定化した。
【００４８】
１０ｍｌ ＨＩＢ＋ＰＩ（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１００ｍＭ酢酸リチウム、１０ｍＭ ＬＩＳ（二ヨードサリチル酸リチウム）、０．１％ジギトニン、２ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＰＭＳＦ、１μｇ／ｍｌロイペプチン、１μｇ／ｍｌアプロチニン）中で１５分間、室温でインキュベーションしてヒストンを抽出した。得られた核ハローを遠心分離管に移し、そして４０００ｘｇ、１０分間でペレット化した。ハローを、１０ｍｌ ＨＷＢ（２０ｍＭトリス、ｐＨ８、７０ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ ＫＣｌ、７ｍＭ ２−メルカプトエタノール、０．１％ジギトニン、０．０５ｍＭスペルミン、０．１２５ｍＭスペルミジン）を用いて２回、そしてＤ／ＢＢ＋ＰＩ（ＨＷＢ＋１０ｍＭ ＭｇＣｌ2 、１ｍＭ ＰＭＳＦ、１μｇ／ｍｌロイペプチン、１μｇ／ｍｌアプロチニン）を用いて１回洗浄してＬＩＳを除いた。ハローが良くペレット化されない場合には、引き続いての遠心分離段階をスローブレーキ設定を用いて６０００ｘｇで行った。ハローの品質をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにより検査して、ヒストンの９５％以上が抽出操作により除去されたことを確認した。
【００４９】
洗浄した核ハローを４００μｌ Ｄ／ＢＢ＋ＰＩ中に再懸濁し、そして制限酵素の２００単位（ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩのそれぞれ１００ｕ）を加え、そして３７℃で２〜３時間、ハローを沈降しないように揺動台上でインキュベーションした。制限酵素は、核ＤＮＡの７０％以上を除去して、核骨格を生成した。骨格を３００ｘｇでペレット化し、そしてＨＷＢ＋ＰＩ（ＨＷＢ＋１ｍＭ
ＰＭＳＦ、１μｇ／ｍｌロイペプチン、１μｇ／ｍｌアプロチニン）を用いて洗浄した。核骨格を４００μｌ ＨＷＢ＋ＰＩ中に再懸濁し、そして１００μｌアリコート試料（核相当物５百万個を含む）に分離した。
Ｄ．核骨格への人工ＭＡＲの結合
ＨＷＢ＋ＰＩ中の骨格の１００μｌアリコート試料をプローブおよび大腸菌(E. coli) 競合ＤＮＡと一緒に、３７℃で２〜３時間、揺動台シェーカー上のシリコン加工ミクロフュージ(microfuge) 管内でインキュベーションした。インキュベーションの後、上清画分（非結合ＤＮＡ断片を含む）とペレット画分（骨格および結合ＤＮＡ断片を含む）とを、水平ミクロフュージ管内、３０００ｘｇで５分間の遠心分離で分離した。ペレットを１回、２００μｌ ＨＷＢを用いて洗浄してプロテイナーゼ阻害剤を除去し、１００μｌ溶解緩衝液（１０ｍＭトリス、ｐＨ８、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％ＳＤＳ、０．５ｍｇ／ｍｌプロテイナーゼＫ）内に再懸濁し、そして一晩、室温でインキュベーションした。
【００５０】
同じ画分のペレットおよび上清を０．９％アガロースゲル上で分離し、これを引き続いて７％ＴＣＡ中に２０分間浸漬して固定し、乾燥して室温でＸ−線フィルムおよび／またはホスホイメージャーTMＳＩ(PhosphoImagerTM SI, Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA) ）のための貯蔵リン・スクリーンに暴露した。
【００５１】
人工ＭＡＲモノマーもしくはダイマーまたは対照Ｇｐａｌもしくはゼイン配列を含むプラスミドを、５’オーバーハング末端を生成する制限酵素を用いて消化した。ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウサブユニットを、〔α−32Ｐ〕ｄＣＴＰ（アマーシャム・ライフ・サイエンス(Amersham Life Science, Arlington Heights, IL)）を用いるオーバーハングの充填のために使用した。末端標識したＤＮＡ断片を結合アッセイのプローブとして用い、すなわち、断片を精製したメイズ核骨格と一緒に、非標識大腸菌競合ＤＮＡの存在下でインキュベーションし、そして挿入物の相対結合を決定した。結合アッセイに使用した核、プローブおよび非標識大腸菌競合ＤＮＡの相対量は、強くおよび弱く結合したＭＡＲの間で最大の区別が得られるように最適化した。最適相対量は、アッセイ毎に、非標識大腸菌競合ＤＮＡの２、５または１０μｇ、核骨格の核相当物５百万個、および消化して標識したプラスミドの１ｆｍｏｌであった。
【００５２】
人工ＭＡＲダイマーは、競合ＤＮＡの高レベルの存在下でも核骨格調製物に非常に強く結合した。モノマーＭＡＲも、低い親和性ではあったけれども、核骨格調製物に結合した。いずれの対照配列も、これらは人工ＭＡＲと大きさおよび相対ＡＴ含有量が類似していたにもかかわらず、ペレット画分中には保持されなかった。これは、人工ＭＡＲ中に含まれる要素が結合を容易にすることを示唆する。
【００５３】
実施例３
コメ内の人工ＭＡＲの評価
Ａ．コメ形質転換ベクター
ｐＧＯＳ２−ｈｐｔ（配列番号２７）は、３５Ｓプロモーターにより駆動されるハイグロマイシン選択性マーカーおよびＧＯＳ２／ＧＵＳ／ｎｏｓカセット（ＧＯＳ２転写開始領域／ＧＵＳ構造遺伝子／ｎｏｓ３’非翻訳領域）を含むコメ形質転換ベクターである。この構築物中のＧＯＳ２転写開始領域は、１１００ｂｐイントロンにより中断されたプロモーターの１０１０ｂｐおよび非翻訳５’リーダーの１７０ｂｐを含んでなる（デ・パーターら(de Pater et al., 1992) ）。
【００５４】
ｐＡｒＧＯＳ２Ａｆ−ｈｐｔ（配列番号２８）は、ｐＧＯＳ２−ｈｐｔと同じコメ形質転換ベクターであるが、しかしこれはＧＯＳ２転写開始領域に対して５’に位置する配列番号２９のＭＡＲダイマーおよびｎｏｓ３’ＵＴＲに対して３’に位置する配列番号２６のＭＡＲダイマーを有する点が異なる。
【００５５】
ＡｒＧＯＳ２Ａｆ構築物の図形表示を図２に示す。
Ｂ．コメの形質転換
胚起源カルスの開始のために、ジャポニカ栽培変種、タイペイ(Taipei)３０９の成熟種子を脱穀し、そして７０％エタノール中で５〜７分間滅菌し、次いで０．０２％ツイーン(Tween) TM２０（ＩＣＩアメリカス社(ICI Americas, Inc) ）を含む２５％市販漂白液（２．６％次亜塩素酸ナトリウム）中に、減圧下で３０〜４５分間浸漬した。次いで種子を５回、滅菌した蒸留水中でリンスし、そして誘導媒体（ＮＢ）に移すまで濾紙上に置いた。ＮＢ培地は、Ｎ６マクロ要素（チュー(Chu, 1978) ）、Ｂ５ミクロ要素およびビタミン類（ガンボルグら(Gamborg et al., 1968)）、３００ｍｇ／ｌ加水分解カゼイン、５００ｍｇ／ｌ Ｌ−プロリン、５００ｍｇ／ｌ Ｌ−グルタミン、３０ｇ／ｌスクロース、２ｍｇ／ｌ ２，４−ジクロロ−フェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）、および２．５ｇ／ｌゲルライトTM（Gelrite TM、メルク社(Merck & Co., Rahway, NJ) ）を含み、ｐＨを５．８に調整してある。誘導培地で培養した成熟種子を暗所、２８℃で３週間インキュベーションした。成熟胚の胚盤領域から誘導された一次カルスを引き続いての維持(maintenance) のために新しいＮＢ培地に移し、その後２週間の二次培養期間維持した。
【００５６】
ブラスティング(Blasting)のためのＤＮＡを調製するために、プラスミドＤＮＡ（ｐＧＯＳ２−ｈｐｔまたはｐＡｒＧＯＳＡｆ−ｈｐｔ）の約１４０μｇを金粒子６０ｍｇ上に沈降させた。プラスミドＤＮＡを、１．５〜３．０ミクロン（アルドリッチケミカル社(ALdrich Chemical Co., Milwaukee, WI) ）または１．０ミクロン（バイオ−ラド・ラボラトリーズ (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) ）金粒子の６０ｍｇ上に沈降させた。沈降混合物は、洗浄済金粒子の６０ｍｇ、水／ＤＮＡ（１４０μｇ）の３００μｌ、２．５Ｍ ＣａＣｌ2 の７４μｌおよび０．１Ｍスペルミジンの３０μｌを含んでいた。成分を上記の順序で加えた後、混合物を直ちに回転攪拌し、そして２〜３分間沈降させた。上清をピペットで吸引除去し、廃棄した。ＤＮＡ被覆金粒子を１００％エタノール１ｍｌ中に再懸濁し、そしてブラスティング実験に使用するためにエタノールｍｌあたりに１７．５ｍｇＤＮＡ／７．５ｍｇ金まで希釈した。
【００５７】
ヘリウムブラスティングのために、活発に生育している大きさが２〜４ｍｍの胚起源カルス培養物を、ヘリウムブラスティングの前４時間の間、０．２Ｍマンニトールおよび０．２Ｍソルビトールを含むＮＢ培地上にカルスを置いて高オスモティクム(osmoticum) 処理した（ヴェインら(Vein et al., 1993) ）。オスモティクム処理に続いて、カルス培養物をブラスティング培地（ＮＢ＋２％アガー）に移し、そしてステンレス鋼網（２３０ミクロン）で覆った。ヘリウムブラスティングは、調製した組織標的に向かってその中に懸濁したＮＤＡ被覆金粒子を加速吹きつけすることを含む。使用した装置は、引用することにより本明細書中に編入される米国特許（ＵＳ）第５，１４１，１３１号に記載の初期の原型で、両方共に同様に機能した。カルス培養物を種々のヘリウム圧力（１７５０〜２，２５０ｐｓｉ）で、標的あたりに１〜３回ブラスティングした。ブラスティングの後、高オスモティクム培地にカルスを戻し、その一晩後に、３０ｍｇ／ｌハイグロマイシンを含むＮＢ培地から成る選択培地上に配置した。２週間後に、さらに高い選択剤濃度、すなわちＮＢ＋５０ｍｇ／ｌハイグロマイシンを含む新しい選択培地に培養物を移した（リーら(Li et al., 1993) ）。
【００５８】
ＮＢ＋５０ｍｇ／ｌハイグロマイシン上に回収したコンパクトで黄白色の胚起源カルス培養物を予備再生（ＰＲ）培地＋５０ｍｇ／ｌハイグロマイシンに移して再生した。ＰＲ培地は、２ｍｇ／ｌベンジルアミノプリン（ＢＡＰ）、１ｍｇ／ｌナフタレン酢酸（ＮＡＡ）、および５ｍｇ／ｌアブシジン酸（ＡＢＡ）を含むＮＢ培地から成っていた。暗所における２週間の培養の後、これらを再生（ＲＮ）培地に移した。ＲＮ培地の組成は、３ｍｇ／ｌＢＡＰ、および０．５ｍｇ／ｌ ＮＡＡを含むＮＢ培地である。ＲＮ培地上の培養物を２週間、２８℃で高蛍光（３２５−ｆｔ−キャンドル）下でインキュベーションした。生育長２ｃｍを有する小植物を、ＧＡ７容器（マゼンタ社(Magenta Corp. Chicago, IL) ）中でｐＨ５．８に調整した、１／２Ｂ５ビタミン、１０ｇ／ｌ スクロース、０．０５ｍｇ／ｌ ＮＡＡ、５０ｍｇ／ｌ ハイグロマイシンおよび２．５ｇ／ｌゲルライトTMを有する１／２ＭＳ培地（ムラシゲおよびスクーグ(Murashige and Skoog, 1962) ）に移した。小植物が十分成長した根系を有するまで生育すると、これらを土壌〔メトロミックス(Metro-Mix) ３６０（スコッツ−シエラ・ホーティカルチュラル・プロダクツ社(Scotts-Sierra Horticultural Products Co., Marysville, OH)）１部、および表土１部〕に移し、そして高さ６０ｃｍに達するまで栽培室（２９／２４℃の昼夜サイクル、湿度５０〜６０％、照明期間１２時間）に置き、その時点で定量ＧＵＳ分析のために葉２枚を採取し、そして植物を成熟するまで生育させるために温室に移した。
Ｃ．サザン分析
サザン分析は、特定の遺伝子構築物の不変のコピーを含む一次再生（Ｒ0 ）コメ株を特定するために使用した。
【００５９】
β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）遺伝子構築物のコーディング領域に特異性のＤＮＡプローブを、キアエキス(Qiaex) ＩＩ ＤＮＡ精製キット（キアジェン社(Qiagen Inc., Chatsworth, CA) ）を用いてゲル精製した。放射能標識したプローブは、レディーツーゴー(Ready-To-Go) TMＤＮＡ標識ビーズ（ファルマシアＬＫＢ(Pharmacia LKB, Piscataway, NJ) ）を用いて、〔α32Ｐ〕ｄＣＴＰ（アマーシャム・ライフサイエンス、Arlington Heights, IL)の５０μＣを用いて調製した。
【００６０】
Ｒ0 コメ植物からの葉材料を各株からの２つの代表から採取した。Ｒ0 植物からのゲノムＤＮＡをサガイ−マルーフらの記載(Saghai-Maroof et al., 1984)に従って凍結乾燥した組織から調製した。
【００６１】
コメＤＮＡの４μｇを制限酵素を用いて消化して、製造者（ベセスダ・リサーチ・ラボラトリー(Bethesda Research Laboratory, Gaithersburg, MD)）により示唆された条件下で不変の遺伝子構築物を解放し、アガロースゲル電気泳動により分離した。ＤＮＡをサザン(1975,1989) の記載に従ってナイロン膜上にブロットした。放射能標識したプローブＤＮＡを、６０℃に加熱した最少ハイブリダイゼーション緩衝液（１０％ポリエチレングリコール、７％ドデシル硫酸ナトリウム、０．６ｘ ＳＳＣ、１０ｍＭリン酸ナトリウム、５ｍＭ ＥＤＴＡおよび１００ｍｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ）の５０ｍｌを用いてブロット上のゲノムＤＮＡにハイブリダイゼーションし、そして変性した放射能標識したプローブと混合し、次いで一晩６０℃でハイブリダイゼーションするためにブロットに添加した。ブロットを６０℃、０．２５Ｘ ＳＳＣおよび０．２％ＳＤＳ中で４５分間洗浄し、乾燥ブロットし、そして２枚の強化スクリーンを有するＸＡＲ−５フィルムに一晩暴露した。
【００６２】
サザン分析は、７０のＡｒＧＯＳ２Ａｆ Ｒ0 コメ株について行った。Ｒ0 植物からのＤＮＡを制限酵素ＸｂａＩを用いて消化し、これは、不変の遺伝子構築物が存在する場合には、ＧＵＳコーディング領域に特異性のプローブを用いて放射能標識すると５．７ｋｂハイブリダイゼーション生成物をもたらすはずである。５．７ｋｂ断片は、逆方向の人工ＭＡＲ、ＧＯＳ２プロモーター、ＧＵＳコーディング領域、ｎｏｓ３’ＵＴＲおよび正方向の人工ＭＡＲを含むはずである。期待された５．７ｋｂハイブリダイゼーション生成物が、７０のコメ株の２５株で検出された。２５株の全ては、複数ハイブリダイゼーション生成物を有し、２株は一致する複合ハイブリダイゼーションパターンを有し、これらが多分同じ形質転換イベントに由来することを示唆する。
【００６３】
非ＭＡＲ対照株、ＣＯＳ２もサザン分析により分析した。４８のＧＯＳ２ Ｒ0 株からのＤＮＡを、制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩを用いて消化し、これは、不変の遺伝子が存在する場合には、ＧＵＳコーディング領域に特異性のプローブを用いて放射能標識すると４．４ｋｂハイブリダイゼーション生成物をもたらすはずである。４．４ｋｂ断片は、ＧＯＳ２プロモーターの１．６ｋｂ、ＧＵＳコーディング領域、ｎｏｓ３’ＵＴＲおよび３５Ｔプロモーター（選択可能なマーカー遺伝子を駆動するために使用したプロモーター）を含むであろう。期待された４．４ｋｂハイブリダイゼーション生成物が、４８のＧＯＳ２株の２８株で検出された。２株は一致する複合ハイブリダイゼーションパターンを有し、これらが多分同じ形質転換イベントに由来したことを示唆する。２株は遺伝子キメラを含んでいた。
Ｄ．ＧＵＳ分析
コメの分析は、一次形質転換体の若い葉について、植物を環境制御した栽培室内で６〜８週間生育させ、そして約６０ｃｍの高さに達した後に行った。２株の独立して再生したコメ植物を形質転換イベントに関して分析した。個別の形質転換体をサザンブロットで分析して、導入遺伝子の不変のコピーの存在を検査し、そして独立した形質転換イベントを示すユニークなハイブリダイゼーションパターンをそれぞれのイベントが示すかどうかを決定した。導入遺伝子の完全なコピー、キメライベント、または二重の組込みイベントを欠く植物は、分析に含めなかった。
【００６４】
分析の結果を図４および５に報告する。図４において、エラーバーは、各形質転換イベントに対する植物の間の標準偏差を示す。試料２件を独立してそれぞれの植物について処理した。一般に、各形質転換イベントからの独立したコメ植物内のＧＵＳの発現のレベルは、同様であった（図４に示す結果の標準偏差により示される通り）。
【００６５】
図５は、記載の範囲内のＧＵＳを発現する形質転換イベントの割合を報告する。
アラビドプシス(Arabidopsis) における人工ＭＡＲの評価
Ａアラビドプシス形質転換ベクター
Ａｃｔ２／ＧＵＳ／ｎｏｓ（Ａｃｔ２転写開始領域／ＧＵＳ構造遺伝子／ｎｏｓ３’ＵＴＲ）構築物を双子葉植物系（アラビドプシス）における試験のために作製した。ベクター３個を作製した。
【００６６】
ｐＡｃｔ２−ｂｉｎ（配列番号３０）は、Ａｃｔ２／ＧＵＳ／ｎｏｓカセット、１９Ｓ／ＮＰＴＩＩ／ｏｒｆ２５ｐｏｌｙＡを選択可能マーカーとして、そして３５Ｓ／ＧＦＰ／ｎｏｓを独立レポーター遺伝子として含むバイナリーベクターである。
【００６７】
ｐＡｒＡｃｔ２Ａｆ−ｂｉｎ（配列番号３１）は、Ａｃｔ２転写開始領域に対して５’に位置する配列番号２９のＭＡＲダイマー、およびｎｏｓ３’ＵＴＲに対して３’に位置する配列番号２６のＭＡＲダイマーを有することを除いて、ｐＡｃｔ２−ｂｉｎと一致する。
【００６８】
ｐＡｆＡｃｔ２Ａｆ−ｂｉｎ（配列番号３２）は、Ａｃｔ２転写開始領域に対して５’に位置する配列番号２６のＭＡＲダイマー、およびｎｏｓ３’ＵＴＲに対して３’に位置する配列番号３３のＭＡＲダイマーを有することを除いて、ｐＡｃｔ２−ｂｉｎと一致する。
【００６９】
これらのベクターは、アラビドプシス中の人工ＭＡＲダイマーの二方向での試験を可能とした。ｐＡｒＡｃｔ２Ａｆ−ｂｉｎおよびｐＡｆＡｃｔ２Ａｆ−ｂｉｎ構築物の図式表示を図３に示す。
Ｂ．アラビドプシス形質転換
アラビドプシス形質転換は、パム・グリーン(Pam Green) により提供されたプロトコール（ファンホフおよびグリーン(van Hoof and Green, 1996)）に従って行い、これはニコル・ベヒトルド（ベヒトルドら(Bechtold et al., 1993) ）、アンドルー・ベント（ベントら(Bent et al., 1994) ）およびタカシ・アラキ（Takashi Araki 私信）を適応させたものである。
【００７０】
生態型コロンビア(Columbia)の種子を４インチの角形鉢に植え、窓用の網で覆い、明所１６時間／暗所８時間、２２℃の条件下、週に１回のサブイリゲーション(subirrigation) により施肥して栽培した。肥料は、５ｍＭ ＫＮＯ3、２．５ｍＭ ＫＰＯ4（ｐＨ５．５）、２ｍＭ ＭｇＳＯ4、２ｍＭ Ｃａ（ＮＯ3）2、０．０５ｍＭ Ｆｅ・ＥＤＴＡ、０．０７ｍＭホウ酸、０．０１４ｍＭＭｎＣｌ2、０．００５ｍＭ ＣｕＳＯ4、０．００１ｍＭ ＺｎＳＯ4、０．０００２ｍＭ ＮａＭｏＯ4、および０．０１ｍＭ ＮａＣｌから成っていた。植物を鉢あたりに４本に間引き、数本の束が現れるまで栽培した。植物が形質転換に適するようになると、土上の部分を、アグロバクテリウム(Agrobacterium)細胞を含む浸潤媒体（２．２ｇ／ｌ ＭＳ塩、１Ｘ Ｂ５ビタミン、５０ｇ／ｌスクロース、２．５ｍＭ ＭＥＳ、ｐＨ５．７、０．０４４ Ｍ ベンジルアミノプリン、２００ｍｌ／ｌシルヴェット(Silwet)Ｌ−７７TM〔オシ・スペシャルティーズ社(Osi Specialties, Inc)〕）中に浸漬し、４００ｍｍＨｇ（約１インチ）の減圧下の真空乾燥器内に５分間置いた。迅速に減圧から解放した後、鉢を水切りし、そしてプラスチックラップで覆ったトレー内に横に置いて２４時間湿度を保持した。次の日に鉢の覆いを取り、直立させた。植物を個別に支持し、そして２週間後に灌水を徐々に減らして植物を完全乾燥させた。種子を各植物から個別に採取した。
【００７１】
形質転換イベントの選択のために、植物あたりに種子１〜１０ｍｇを、１０％漂白液中に７分間、激しく攪拌しながら浸漬して表面滅菌し、次いで滅菌水中で３回リンスし、そしてアラビドプシス発芽媒体（ＭＳ塩、ＭＳビタミン、１０％スクロース、２．５ｍＭ ２−〔Ｎ−モルホリノ〕エタンスルホン酸〔ＭＥＳ〕、３０ｍｇ／ｌカナマイシン、５０ｍｇ／ｌバンコマイシンおよび０．１％バクト(Bacto) TMアガー〔ディフコ・ラボラトリーズ(Difco Laboratories, Detroit, MI)〕）を含むフラスコ内に置いた。連続光内、９０ｒｐｍで３日間振とうした後、種子が発芽し、そして発芽後７および１２日の間に、形質転換体を緑色の幼植物として単離した。非形質転換種子は、小さい淡色の幼植物を発生した。形質転換体をプレート内の固体媒体（ＭＳ塩、Ｂ５ビタミン、１０％スクロース、２．５ｍＭ ＭＥＳ、１５ｇ／ｌファイタガー(Phytagar)TM〔ジブコＢＲＬ、Gaitersberg, MD〕、３０ｍｌ／ｌカナマイシン、５０ｍｇ／ｌバンコマイシン）に移してさらに選択した。１〜２週間後に、真の形質転換体をＧＡ７容器（ＭＳ塩、Ｂ５ビタミン、０．３％スクロース、２．５ｍＭ ＭＥＳ）に１〜２週間移し、次いでＴ１種子を産生するために土壌内に植えた。
Ｃ．サザン分析
サザン分析は、特定の遺伝子構築物の不変のコピーを含む一次再生Ｔ２アラビドプシス株を特定するために使用した。
【００７２】
アラビドプシス葉組織のプールした試料を、液体窒素内で粉末化した。次いで破砕した組織を３分間、５００μｌ ２Ｘ抽出緩衝液（２％ＣＴＡＢ、１００ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、２０ｍＭ ＥＤＴＡ、１．４Ｍ ＮａＣｌおよび２％ ２−メルカプトエタノール）中、６５℃でインキュベーションした。クロロホルム／オクタノール（２４：１）の５００μｌを加え、試料を２分間振とうし、次いでマイクロ遠心分離機内で１４，０００ｘｇで回転し、そして上清を除去した。クロロホルム／オクタノール抽出を繰り返した。沈降緩衝液（１％
ＣＴＡＢ、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、および１％ ２−メルカプトエタノール）の１ｍｌを上清に加え、次いで室温で６０分間インキュベーションした。ＤＮＡをマイクロ遠心分離機で５分間、３５００ｘｇの遠心分離によりペレット化した。ペレットを水切りし、そして２００μｌの１．０Ｍ ＮＨ4 ＯＡｃ中に再懸濁した。１００μｌの７．５Ｍ ＮＨ4 ＯＡｃおよびイソプロパノール１ｍｌを加え、試料を氷上で５分間インキュベーションし、次いで１４，０００ｘｇで５分間遠心分離した。ペレットを水切りし、そして２００μｌ ＴＥ中に再懸濁した。１００μｌの７．５Ｍ ＮＨ4 ＯＡｃおよびイソプロパノール１ｍｌを加え、氷上で５分間インキュベーションし、次いで１４，０００ｘｇで５分間遠心分離した。ペレットを水切りし、そして７０％エタノールを用いてリンスし、そしてスピード・ヴァック（Speed Vac 、サヴァント・インスツルメント社(Savant Instrument Inc., Farmingdale, NY) ）内で乾燥した。乾燥したペレットを２０μｌ ＴＥ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）中に再懸濁した。
【００７３】
サザン分析は、２９ ＡｒＡｃｔ２Ａｆ Ｔ２株および２４ ＡｆＡｃｔ２Ａｆ Ｔ２株について行った。ＡｒＡｃｔ２Ａｆ植物からのＤＮＡの１μｇを制限酵素ＸｂａＩを用いて、製造者（ベセスダ・リサーチ・ラボラトリーズ、Gaithersberg, MD）により示唆された条件下で消化し、そしてアガロースゲル電気泳動により分離し、これは、遺伝子構築物が不変の場合には、ＧＵＳコーティング領域に対して特異性のプローブで放射能標識すると、４．６ｋｂハイブリダイゼーション生成物をもたらすはずである。ＡｒＧＯＳ２Ａｆコメ植物と同様に、４．６ｋｂ断片は、逆方向の人工ＭＡＲ、Ａｃｔ２プロモーター、ＧＵＳコーディング領域、ｎｏｓ３’ＵＴＲおよび正方向の人工ＭＡＲから成るはずである。ＤＮＡをサザンの記載(1975,1989) に従ってナイロン膜上にブロットした。放射能標識したプローブＤＮＡを、６０℃に加熱した最少ハイブリダイゼーション緩衝液（１０％ポリエチレングリコール、７％ドデシル硫酸ナトリウム、０．６ｘ ＳＳＣ、１０ｍＭリン酸ナトリウム、５ｍＭ ＥＤＴＡおよび１００ｍｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ）の５０ｍｌを用いてブロット上のゲノムＤＮＡにハイブリダイゼーションし、そして変性した放射能標識プローブと混合し、次いで６０℃で一晩ハイブリダイゼーションするためのブロットに添加した。このブロットを６０℃、０．２５Ｘ ＳＳＣおよび０．２％ＳＤＳ中で４５分間洗浄し、乾燥ブロットし、そして２枚の強化スクリーンを有するＸＡＲ−５フィルムに一晩暴露した。
【００７４】
期待された４．６ｋｂハイブリダイゼーション生成物が、２９ ＡｒＡｃｔ２Ａｆ株の２６株で検出された。第二のサザンブロットは、ＡｒＡｃｔ２Ａｆ構築物のコピー数を決定するために作製した。ＡｒＡｃｔ２Ａｆ ＤＮＡを、構築物をＴ ＤＮＡの右および左境界付近で切断する制限酵素ＳｓｔＩおよびＸｈｏＩを用いて消化した。人工ＭＡＲおよび左境界からＸｈｏＩ部位に向かって８００ｂｐ下流のＤＮＡに対して特異性のプローブを用いてブロットを放射能標識した。ＡｒＡｃｔ２Ａｆ構築物の単一コピーは、３種のハイブリダイゼーション生成物を有するであろう。すなわち左および右境界ＤＮＡから成る未知の大きさの２断片、および境界から内部のＤＮＡである８．９ｋｂ断片である。２９株中の２２株は、３種またはこれ以下のハイブリダイゼーション生成物を有し、ＡｒＡｃｔ２Ａｆ構築物の単一コピーが存在することを示した。
【００７５】
ＡｆＡｃｔ２Ａｆ植物からのＤＮＡを制限酵素ＸｂａＩを用いて消化し、これは、遺伝子構築物が不変のままであれば、ＧＵＳコーティング領域に対して特異性のプローブで放射能標識すると、５．７ｋｂハイブリダイゼーション生成物をもたらすはずである。５．７ｋｂ断片は、正方向の人工ＭＡＲ、Ａｃｔ２プロモーター、ＧＵＳコーディング領域、ｎｏｓ３’ＵＴＲおよび正方向の人工ＭＡＲから成るはずである。これは緑色の蛍光タンパク質コーディング領域およびｎｏｓ３’ＵＴＲも含む。期待された５．７ｋｂハイブリダイゼーション生成物が、２４ ＡｆＡｃｔ２Ａｆ株の２４株すべてで検出された。
【００７６】
第二のサザンブロットは、ＡｆＡｃｔ２Ａｆ構築物のコピー数を決定するために作製した。ＡｆＡｃｔ２Ａｆ ＤＮＡを、構築物をＴ ＤＮＡの右および左境界付近で切断する制限酵素ＳｓｔＩおよびＸｈｏＩを用いて消化した。人工ＭＡＲおよび左境界からＸｈｏＩ部位に向かって８００ｂｐ下流のＤＮＡに対して特異性のプローブを用いてブロットを放射能標識した。ＡｆＡｃｔ２Ａｆ構築物の単一コピーは、３種のハイブリダイゼーション生成物を有するであろう。すなわち左および右境界ＤＮＡから成る未知の大きさの２断片、および境界から内部のＤＮＡである８．９ｋｂ断片である。２４株中の１５株は、３種またはこれ以下のハイブリダイゼーション生成物を有し、ＡｆＡｃｔ２Ａｆ構築物の単一コピーが存在することを示した。
【００７７】
非ＭＡＲ対照株のＡｃｔｂｉｎもサザン分析で分析した。３４ Ａｃｔｂｉｎ Ｔ２株からのＤＮＡを、制限酵素ＰｓｔＩを用いて消化し、これは、構築物が不変のままであれば、ＧＵＳコーティング領域に対して特異性のプローブで放射能標識すると、３．４ｋｂハイブリダイゼーション生成物をもたらすはずである。３．４ｋｂ断片は、Ａｃｔ２プロモーター、ＧＵＳコーディング領域、およびｎｏｓ３’ＵＴＲから成るはずである。期待された３．４ｋｂハイブリダイゼーション生成物が、３４ Ａｃｔｂｉｎ株の３０株で検出された。第二のサザン分析をＡｃｔｂｉｎ構築物のコピー数を決定するために行った。Ａｃｔｂｉｎ株からのＤＮＡを、構築物をＴ ＤＮＡの右および左境界付近で切断する制限酵素ＳｓｔＩおよびＸｈｏＩを用いて消化した。３’ＵＴＲおよび左境界からＸｈｏＩ部位に向かって８００ｂｐ下流のＤＮＡに対して特異性のプローブを用いてブロットを放射能標識した。Ａｃｔｂｉｎ構築物の単一コピーは、３種のハイブリダイゼーション生成物を有するであろう。すなわち左および右境界ＤＮＡから成る未知の大きさの２断片、および境界から内部のＤＮＡである８．２ｋｂ断片である。３４株中の９株は、３種またはこれ以下のハイブリダイゼーション生成物を有し、Ａｃｔｂｉｎ構築物の単一コピーが存在することを示した。
Ｄ．ＧＵＳ分析
アラビドプシスの栽培のために、Ｔ２種子を生体外で、９０ｍｇ／ｌカナマイシンを含むＭＳ媒体上で発芽させ、そして３週齢のカナマイシン耐性幼植物を採取した。形質転換イベントあたりに幼植物３０個のバッチをＧＵＳ分析に使用し、そして別の幼植物をＤＮＡ抽出に使用した。
【００７８】
ＧＵＳ活性の分析のために、葉試料を液体窒素中で粉末化し、そして組織約４００ｍｌの試料をミクロフュージ管内に入れた。各葉試料からの２個の独立試料を処理した。組織は、−７０℃で貯蔵するかまたは直ちに抽出した。粉末化した組織を、１％ポリビニルポリピロリドン（緩衝液中で少なくとも１時間水和した）および２０％グリセロールを加えて変性したＧＵＳ溶解緩衝液（ジェファーソンら(Jefferson et al., 1987)）と混合してＧＵＳを抽出した。氷上で少なくとも１０分間インキュベーションした後、試料を１６，０００ｘｇで１０分間遠心分離した。上清を回収しそして上記のようにして第二回目の遠心分離を行った。上清を回収しそしてドライアイス上で冷凍しそして−７０℃で貯蔵した。実験は、上記の緩衝液内で貯蔵した場合に、ＧＵＳ活性が少なくとも４回の冷凍−解凍サイクルで安定であることを示した（Ｗ．Ｍ．エインレー(Ainley)未公開）。ＧＵＳ活性は、ＧＵＳ−ライト(Light) TMキット（トロピックス社(Tropix, Inc., Bedford, MA)）を用いて測定した。未希釈抽出物または蛍光計で測定した蛍光が範囲内にあるように希釈した抽出物の５ｍｌ試料を、ＧＵＳ−ライトTM反応緩衝液の１９５ｍｌに加えた。蛍光は、５秒の経過の後５秒間積算した。タンパク質は、標準としてヒト血清アルブミンを用いるブラッドフォードにより開発されたアッセイ(Bradford, 1976)を用いて測定した。ＧＵＳ活性は、ＳＩＧＭＡから入手したＧＵＳ標準を用いて、実験間で正規化した。標準および植物試料内の植物タンパク質の量は、同じであった。必要な場合には、非形質転換植物の抽出物を用いてタンパク質を調整した。
【００７９】
図６および７は、ＧＵＳ分析の結果を報告している。図６は、基礎、非−ＭＡＲ構築物（Ａｃｔｂｉｎ）または指示した方向（ＡｒＡｃｔ２ＡｆまたはＡｆ−Ａｃｔ−Ａｆ）にある人工ＭＡＲにより隣接されている基礎構築物を発現する独立した形質転換イベントに対して観察された発現を報告している。標準偏差は、種々の植物から採取した植物間の変動を示す。矢印は、ＭＡＲの相対方向を示す。
【００８０】
図７中では、指示された範囲内でＧＵＳを発現する形質転換イベントの割合を示す。
Ｅ．レポーター遺伝子構築物を発現する形質転換植物の特性試験。
【００８１】
Ｔ２アラビドプシス植物を分析した。挿入コピー数を決定するために、カナマイシン耐性の分離に関して植物を評価した。カイ二乗解析で検定して、いくつかのイベントは、１個または２個の挿入物カテゴリー内に入らなかった。残りの植物の中で、７２％は単一挿入であった。挿入の大部分は導入遺伝子の複数コピーを有していた。アラビドプシス形質転換イベントは、制御された環境下で生育させたけれども、重複したプレートの間で植物の相対成長にいくらかの偶然的な相違があった。これらの場合に、イベントは使用しないかまたは再度栽培した。重複プレートから決定した発現の変動係数は、１〜４６％の間に広がり、その８９％は２０％以下であった（図６）。
【００８２】
一般に、構築物に関して試験したすべてのアラビドプシス形質転換イベントを一緒に栽培および分析した。植物の生育は制御された環境下であったけれども、構築物を発現する形質転換イベントの間に観察された相違が、異なる実験の間に起きた環境の相違によるものである可能性も残る。この可能性を除くために、アラビドプシス形質転換イベントの３組からの最高発現イベント３例を一緒に生育させて再分析した。この分析は、形質転換イベントの組の間の初期の相違を確認した。
導入遺伝子発現に対する人工ＭＡＲの効果の要約
コメとアラビドプシスの両者において、ＭＡＲ含有構築物を発現する形質転換イベントの平均発現レベルは、ＭＡＲ要素を欠くものよりも高いレベルで発現した（表３）。アラビドプシスにおいては、試験したＭＡＲの方向は、発現のレベルに影響した。ＧＵＳ遺伝子構築物の両方の側で同じ方向にＭＡＲがある構築物を含む植物は、ＭＡＲが反対方向に向いている構築物を含む植物よりも高いレベルでＧＵＳを発現した。
【００８３】
形質転換イベントのそれぞれの組内で、より高い発現株内の方が、より低い株内よりも比例的により高い発現レベルのように見える。これを文書化するために、発現例の上位１／４の発現を比較した（表３）。このデータに基づくと、ＡｆＡｃｔ２Ａｆ構築物を発現する形質転換イベントの上位１／４は、Ａｃｔｂｉｎ構築物を発現するイベントの上位１／４よりも５．６倍高いレベルでＧＵＳタンパク質を産生する。コメおよびアラビドプシスの両者において逆方向にある人工ＭＡＲは、それぞれの構築物を欠くＭＡＲよりも約２倍、発現を増強する。
【００８４】
【表５】
【００８５】
これまで公開された研究（ホームズ−デーヴィスおよびコマイにより概説(Holms-Davis and Comai, 1998) ）は、１例のＭＡＲを除いて、今日まで試験されたすべてのＭＡＲがレポーター遺伝子の発現を増強することを示している。本研究は、優先的にＭＡＲ内に見いだされる要素を用いて構築したＭＡＲが、単子葉および双子葉植物の双方を代表する植物種内で発現を増強できるという最初の報告である。
【００８６】
【表６】
【００８７】
【表７】
【００８８】
【表８】
【００８９】
【表９】
【００９０】
【表１０】
【００９１】
【表１１】
【００９２】
【表１２】
【００９３】
【表１３】
【図面の簡単な説明】
【図１】 配列番号１の人工ＭＡＲを構築するための戦略を示す図である。
【図２】 ＭＡＲダイマーを含むコメ形質転換構築物ＡｒＧＯＳ２Ａｆの図式表示である。
【図３】 ＭＡＲを含まない構築物ＧＯＳ２および人工ＭＡＲダイマーを含む構築物ＡｒＧＯＳ２Ａｆを用いた複数のコメ形質転換イベントに対する相対ＧＵＳ活性を比較したグラフである。
【図４】形質転換コメ植物におけるＧＵＳレポーター遺伝子の発現の範囲に対する人工ＭＡＲの効果を示すグラフである。
【図５】 アラビドプシス形質転換構築物ＡｒＡｃｔ２ＡｆおよびａａａａＡｆＡｃｔＡｆの図式表示である。ＡｒＡｃｔ２Ａｆは、レポーター遺伝子に隣接して反対方向にあるＭＡＲダイマーのコピーを含む。ＡｆＡｃｔ２Ａｆは、レポーター遺伝子に隣接して同じ方向にあるＭＡＲダイマーのコピーを含む。
【図６】 ＭＡＲを含まない構築物Ａｃｔ２および人工ＭＡＲダイマーを含む構築物ＡｒＡｃｔ２ＡｆおよびＡｆＡｃｔ２Ａｆを用いた複数アラビドプシス形質転換イベントに対する相対ＧＵＳ活性を比較したグラフである。
【図７】 形質転換アラビドプシス植物におけるＧＵＳレポーター遺伝子の発現の範囲に対する人工ＭＡＲの効果を示すグラフである。
【配列表】
本発明は、植物分子生物学、そして具体的には形質転換された植物細胞中に導入された遺伝子の発現を増強するための技術に関する。
【０００２】
組換えＤＮＡ技術および遺伝子工学の使用を通じて、希望のＤＮＡ配列を植物細胞内に導入して、関係するタンパク質の発現をさせることが可能となっている。遺伝子的に操作された形質、例えば有用な植物産物の生産を増加または変性する昆虫耐性、疫病耐性、渇水耐性、除草薬耐性、または代謝変性を有する植物は、農業の改善に大きい将来性を提供する。
【０００３】
植物細胞内に導入されたＤＮＡの発現の希望するレベルを得ることには、まだ問題が残っている。「位置効果」変動と呼ばれる一つの問題は、独立した形質転換体内の同じ遺伝子の発現における変動である。この問題を解明するためのマトリックス付着領域または骨格付着領域と呼ばれる天然に存在するＤＮＡ配列の使用は、米国特許（ＵＳ）第５，７７３，６８９号およびＷＯ９４／２４２９３号中に提出されている。
【０００４】
本発明は、形質転換された植物内に導入された遺伝子の発現を増加するマトリックス付着領域として有用である配列番号１の１１〜３０９を含んでなる、新規の合成ＤＮＡ分子を提供する。
【０００５】
別の態様では、本発明は、５’から３’への方向で、植物細胞内で機能性の転写開始領域、転写開始領域と操作的に関連する構造遺伝子、３’非翻訳領域、および該転写開始領域に対して５’または該構造遺伝子に対して３’のいずれかに位置する配列番号１のｂｐ１１から３０９までを含んでなるマトリックス付着領域を含んでなるＤＮＡ構築物を提供する。好ましい態様では、配列番号１のｂｐ１１から３０９までを含んでなる第一マトリックス付着領域が該転写開始領域に対して５’に位置し、そして配列番号１のｂｐ１１から３０９までを含んでなる第二マトリックス付着領域が該３’非翻訳領域に対して３’に位置する。
【０００６】
特に好ましくは態様では、本発明のマトリックス付着領域は配列番号１のｂｐ１１から３０９までの２個またはそれ以上の縦列コピーを含んでなる。
【０００７】
配列の説明
配列番号１には、本発明の人工ＭＡＲを記載する。
【０００８】
配列番号２〜４には、ＡＲＢＰ部位を記載する。
【０００９】
配列番号５には、ＡＴＥ部位を記載する。
【００１０】
配列番号６には、ＢＥＡＦ−３２部位を記載する。
【００１１】
配列番号７〜９には、トポイソメラーゼＩＩ部位を記載する。
【００１２】
配列番号１０には、巻き戻し配列を記載する
配列番号１１〜１７には、ＳＴＡＢ Ｉ部位を記載する。
【００１３】
配列番号１８には、例示的な曲りＤＮＡを記載する。
【００１４】
配列番号１９には、例示的なＡ／Ｔトラクトを記載する。
【００１５】
配列番号２０には、合成ＭＡＲ−Ａを記載する。
【００１６】
配列番号２１には、合成ＭＡＲ−Ｂを記載する。
【００１７】
配列番号２２には、合成ＭＡＲ−Ｃを記載する。
【００１８】
配列番号２３には、合成ＭＡＲ−Ｄを記載する。
【００１９】
配列番号２４には、合成ＭＡＲ−Ｅを記載する。
【００２０】
配列番号２５には、合成ＭＡＲ−Ｆを記載する。
【００２１】
配列番号２６には、ｐＡｒＧＯＳ２Ａｆ−ｈｐｔおよびＡｒＡｃｔ２Ａｆ−ｂｉｎ内の３’ＭＡＲダイマーを記載する。
【００２２】
配列番号２７には、コメ形質転換ベクターｐＧＯＳ２−ｈｐｔを記載する。
【００２３】
配列番号２８には、コメ形質転換ベクターｐＡｒＧＯＳ２Ａｆ−ｈｐｔを記載する。
【００２４】
配列番号２９には、ｐＡｒＧＯＳ２Ａｆ−ｈｐｔおよびＡｒＡｃｔ２Ａｆ−ｂｉｎ内の５’ＭＡＲダイマーを記載する。
【００２５】
配列番号３０には、双子葉植物形質転換ベクターｐＡｃｔ２−ｂｉｎを記載する。
【００２６】
配列番号３１には、双子葉植物形質転換ベクターｐＡｒＡｃｔ２Ａｆ−ｂｉｎを記載する。
【００２７】
配列番号３２には、双子葉植物形質転換ベクターｐＡｆＡｃｔ２Ａｆ−ｂｉｎを記載する。
【００２８】
配列番号３３には、ｐＡｆＡｃｔ２Ａｆ−ｂｉｎ内の３’ＭＡＲダイマーを記載する。
【００２９】
【発明の詳細な記述】
真核生物の核は、高度に組織化された構造であり、その中ですべての遺伝子情報は、複写、転写およびその他の細胞イベントに関して秩序だった様式で接近できなければならない（レヴィン(Lewin, 1994) 、ディロンおよびグロスフェルト(Dillon and Grosveld, 1994) 、ジャクソン(Jackson, 1995) 、ヴォルフ(Wolffe, 1994)）。遺伝子は、標準的には、マトリックス付着領域（ＭＡＲ）として知られる場所でタンパク様核マトリックスに対して付着する種々の大きさのクロマチンループ内で組織化される。ＭＡＲは、しばしば遺伝子の非翻訳領域内に位置し、そして個別のＤＮＡループの物理的境界を形成すると考えられている。多くの場合に、ＭＡＲは形質転換有機体内で位置効果を低下させることが示されている。ニワトリリゾチームＭＡＲは、発現を増加し、変動を減少しそして安定して移入された細胞内（スティーフら(Stief et al., 1989)）、形質転換マウス内（ボニファーら(Bonifer et al., 1990)、マックナイトら(McKnight et al., 1992) ）および形質転換タバコ植物内（ムリナロバら(Mlynarova et al., 1994)、ムリナロバら(Mlynarova et al., 1995 ））で、コピー数依存性の隣接遺伝子を発現させることが示された。
【００３０】
しかし、すべてのＭＡＲが遺伝子発現に対してこのような作用を有するわけではない。２個の最少ドロソフィラ(Drosophila)ＭＡＲ（１個はヒストンＨ１とＨ３遺伝子との間に、他は熱ショックＨＳＰ７０遺伝子の近くに位置する）は、安定に形質転換した細胞内で１０倍以上で発現を刺激するが、しかしこれらのＭＡＲの存在は、位置効果を低下させなかった（ポルジャックら(Poljak et al., 1994) ）。アポリポタンパク質ドメインからのＭＡＲは、低コピー形質転換体内で発現を増加し、位置効果を低下したが、しかし複数コピー形質転換体内の発現は強力に抑制された（カロスおよびフールニエ(Kalos and Fournier, 1995)）。ドロソフィラｆｔｚＭＡＲを種々の染色体位置内に配置すると、これはクロマチン構造を再構成せず、そしてＭＡＲを含むクロマチン断片は核から容易に溶出し、導入されたＭＡＲは必ずしもクロマチンドメインを形成しないことを示している（エッガートおよびジャック(Eggert and Jack, 1991) ）。反対に、重鎖座エンハンサー内の免疫グロブリンに隣接するＭＡＲは、高レベルの発現および形質転換Ｂリンパ球内の拡張ＤＮａｓｅＩ感受性ドメインの形成のために要求されるが、しかし安定に移入された組織培養細胞内ではそうではない（フォレスターら(Forrester et al., 1994)）。
【００３１】
形質転換された植物内でＭＡＲを用いた結果は、同様に複雑であった（スパイカーおよびトムソン(Spiker and Thompson, 1996) ）。酵母ＭＡＲは、安定に形質転換された煙草カルス株中で発現レベルを増加したが、しかしコピー数と発現レベルとの間に相関は発見できなかった（アレンら(Allen et al., 1993)）。反対に、ダイズ熱ショック遺伝子Ｇｍｈｓｐ１７．６−ＬからのＭＡＲ要素は、発現レベル上昇の能力を示したが、しかし変動性にはほとんど影響しなかった（シェッフルら(Schoeffl et al., 1993) ）。レポーター遺伝子構築物に隣接するダイズＭＡＲは、ＭＡＲを欠失する構築物と比較すると、発現の変動を低下させたが、形質転換タバコカルス内のレポーター遺伝子構築物の５’および３’に存在すると、発現レベルも低下させた（ブレインら(Breyne et al., 1992) ）。それぞれのＭＡＲは、これらのマトリックス結合能力に加えて異なる機能的および構造的性質を有することが可能である（ブレインら(Breyne et al., 1994) ）。
【００３２】
ＭＡＲは、通常長さは３００〜２０００塩基対であり、アデノシンおよびチミン残基が多く、そしてしばしばある種の保存された配列要素および構造的特徴を含む。文献に記載された大部分のＭＡＲは、植物から得られたものではないが、しかし他の生物体からのＭＡＲは、植物骨格に良く結合しそしてその反対も多く文献に報告されている（ディーツら(Dietz et al., 1994)）、ブレインら(Breyne et al., 1992) ）。
【００３３】
表１は、文献に記載されたＭＡＲ中に存在する配列要素を記載している。これには、下記の植物ＭＡＲが含まれている。ダイズ熱ショックタンパク質遺伝子ＭＡＲ（シェッフルら(Schoeffl et al., 1993) ）、ペチュニアＭＡＲ（ディーツら(Dietz et al., 1994)）、エンドウプラストシアニン遺伝子ＭＡＲ（ストラッターら(Slatter et al., 1991)）、メイズＡｄｈ１遺伝子５’および３’ＭＡＲ（アブラモヴァおよびベネッツエン(Avramova and Bennetzen, 1993)、アブラモヴァら(Avramova et al., 1995) ）、β−ファセオリン(phaseolin) 遺伝子５’および３’ＭＡＲ（ファンデルゲーストら(van der Geest et al., 1994)）。
【００３４】
【表１】
【表２】
本発明は、新規の人工ＭＡＲ内で表１に記載の特徴の部分集合を用いる。３２７ｂｐ人工ＭＡＲの配列は、配列番号１に記載されている。人工ＭＡＲは、ＢｇｌＩＩおよびＢａｍＨＩ制限部位により隣接される配列番号列として設計され、これらは配列番号１内に含まれているが、しかしこれらはＭＡＲの機能にとって重要ではない。ＭＡＲの機能性部分は、配列番号１の１１〜３９０を含んでなる。
【００３７】
下記の特徴が、配列番号１内で見いだされた。
【００３８】
【表３】
本発明の構築物中に使用された３’ＵＴＲ、すなわち３’非翻訳領域は、ｍＲＮＡの効率的な処理を与え、メッセージの安定性を維持しそして転写ｍＲＮＡ配列の３’末端にアデノシン・リボヌクレオチドの付加を指令するものである。３’ＵＴＲは、プロモーター領域に本来的、構造遺伝子に本来的であっても、または他の起源から誘導されてもよい。適当な３’ＵＴＲは下記を含むがこれに限定はされない。ｐｅｒ５ ３’ＵＴＲ、およびノパリン合成酵素（ｎｏｓ）遺伝子の３’ＵＴＲ。
【００４０】
実施例１
人工ＭＡＲの合成
人工ＭＡＲを構築するために、６種の個別のオリゴヌクレオチドを合成し、そしてＰＣＲにより構築した。以後ＭＲＡ−Ａ、ＭＲＡ−Ｂ、ＭＲＡ−Ｃ、ＭＲＡ−Ｄ、ＭＲＡ−ＥおよびＭＲＡ−Ｆと呼ぶ６種のオリゴヌクレオチドの配列は、それぞれ配列番号２０〜２５として配列表示表に記載する。隣接オリゴヌクレオチド間の１５ｂｐオーバーラップは、図１に記載の戦略を用いてＰＣＲによるＭＡＲの構築を可能とした。
【００４１】
ＡｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼを用いるジーンアンプ(GeneAmp) TMＰＣＲ試薬キット（パーキンエルマー(Perkin Elmer, Norwalk, CT) ）をＤＮＡ増幅に使用した。プライマーＭＲＡ−ＣおよびＭＲＡ−Ｄを用いるＰＣＲの２０サイクル（変性：９４℃で３０秒間、アニーリング：５２℃で６０秒間および延伸：７０℃で６０秒間）に、プライマーＭＲＡ−ＢおよびＭＲＡ−Ｅを用いるＰＣＲの２０サイクルを続け、第一反応からの生成物を第二反応の鋳型として使用した。この反応の２３１ｂｐ生成物を低融点アガロースゲルから精製し、そしてプライマーＭＲＡ−ＡおよびＭＲＡ−Ｆを用いるＰＣＲの２０サイクルのための鋳型として使用した。この反応からの３２７ｂｐ生成物を、ＴＡクローニング(Cloning) TMキット（インヴィトロジェン(Invitrogen, San Diego, CA) ）を用いてｐＣＲ２．１内にサブクローンし、そして配列を配列決定により確認した。
【００４２】
ＢｇｌＩＩ／ＢａｍＨＩ断片の２個の縦列コピーから成るダイマーを、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔTMＳＫ−（ストラタジーン(Stratagene, La Jolla, CA)）のＢａｍＨＩ部位内に構築した。ダイマーの配列は、配列番号２６のｂｐ５〜６３０である。
【００４３】
実施例２
人工ＭＡＲの核骨格への結合
Ａ．対照
人工ＭＡＲとしての類似した大きさおよびヌクレオチド組成の２個のＤＮＡ断片を植物ＤＮＡから増幅して結合アッセイにおける対照として使用した。これらの断片は、メイズ遺伝子Ｇｐａ１の３’末端からの６５７ｂｐ断片（グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素サブユニットＡ、ジーンバンクアクセッション番号(GeneBank accession number) Ｘ１５４０８、塩基４５１６〜５１７３、キグレイら(Quigley et al., 1989)）、および１９ｋＤアルファ・ゼイン遺伝子の５’隣接領域から４８８ｂｐ断片（ジーンバンクアクセッション番号Ｘ０５９１１、塩基３３９〜８２７、クリッツら(Kriz et al., 1987) ）であった。表２で、人工ＭＡＲおよび対照断片内に存在する特徴点を比較する。
【００４４】
【表４】
Ｂ．メイズ葉から核の調製
核骨格の単離に使用する核は、公開されたプロトコール（ホールら(Hall et al., 1991) ）を適用して若いメイズ葉から調製した。核を計数し、そしてＤＡＰＩ染色アリコート試料の顕微鏡検査により完全さを検査した。高品質核のみを二ヨードサリチル酸リチウム抽出による核骨格調製に使用した。
【００４６】
核精製のために、Ｖ４段階植物（第四または第五葉）からの若いメイズの葉をカミソリ刃を用いて採取し、洗浄および乾燥した。中央脈を除いた後、葉を液体窒素内で冷凍し、そして乳鉢と乳棒を用いて微粉に粉砕した。粉末状の葉をガラスビーカーに移し、５ｍｌ ＮＩＢ１＋ＰＩ（０．５Ｍヘキシレングリコール、２０ｍＭピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス〔２−エタンスルホン酸〕（ＰＩＰＥＳ）、ｐＨ６．５、２０ｍＭ ＫＣｌ、７ｍＭ ２−メルカプトエタノール、０．５ｍＭエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、０．４％トリトン(Triton)Ｘ−１００TM〔ローム・アンド・ハース社(Rohm & Haas Company, Philadelphia, PA) 〕、０．０５ｍＭスペルミン、０．１２５ｍＭスペルミジン、１ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）、１μｇ／ｍｌロイペプチン、１μｇ／ｍｌアプロチニン）を葉組織グラムあたりに加えた。葉抽出物を順番に１９００、５２０、１２５、８５および４０ｍｍフィルターに４℃で通して濾過し、フィルターを葉グラムあたりに１ｍｌのＮＩＢ１＋ＰＩでリンスして、デブリ内に保持されたすべての核を収集した。粗核抽出液の１５ｍｌを７ｍｌ ４０％パーコル(Percoll) TM（ファルマシア・バイオテク(Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) ）のＮＩＢ１（０．５Ｍヘキシレングリコール、２０ｍＭ ＰＩＰＥＳ、ｐＨ６．５、２０ｍＭ ＫＣｌ、７ｍＭ ２−メルカプトエタノール、０．５ｍＭ
ＥＤＴＡ、０．４％トリトンTMＸ−１００、０．０５ｍＭスペルミン、０．１２５ｍＭスペルミジン）およびＮＩＢ１内の５ｍｌ ７０％パーコルから成るパーコルのグラジエントに加えた。１５分間、５００ｘｇで４℃における遠心分離の後、４０％／７０％界面を滅菌したパスツールピペットで集め、そして２倍体積のＮＩＢ２（０．５Ｍヘキシレングリコール、２０ｍＭ ＰＩＰＥＳ、ｐＨ６．５、２０ｍＭ ＫＣｌ、７ｍＭ ２−メルカプトエタノール、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５ｍＭスペルミン、０．１２５ｍＭスペルミジン）に加え、これはペレットおよびその他のデブリを避けるように努めて行った。１０分間、４℃で６００ｘｇの遠心分離により核を濃縮した。
【００４７】
核ペレットを２０ｍｌ ＮＩＢ２中に再懸濁し、そして前と同様に遠心分離した。この段階をさらに１回反復して、パーコルの痕跡を洗浄除去した。血球計算器を用いて核を計数し、そしてＮＩＢ２＋ＰＩ／５０％グリセロール（０．５Ｍヘキシレングリコール、２０ｍＭ ＰＩＰＥＳ、ｐＨ６．５、２０ｍＭ ＫＣｌ、７ｍＭ ２−メルカプトエタノール、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５ｍＭスペルミン、０．１２５ｍＭスペルミジン、５０％グリセロール、１ｍＭ ＰＭＳＦ、１μｇ／ｍｌロイペプチン、１μｇ／ｍｌアプロチニン）中に、核２千万個／ｍｌで再懸濁した。骨格調製に使用するまで核を−８０℃で貯蔵した。
Ｃ．核骨格の調製
冷凍した核を解凍し、そして核２百万個あたりにＮＩＢ３＋ＰＩ（０．５Ｍヘキシレングリコール、２０ｍＭ ＰＩＰＥＳ、ｐＨ６．５、２０ｍＭ ＫＣｌ、７ｍＭ ２−メルカプトエタノール、０．０５ｍＭスペルミン、０．１２５ｍＭスペルミジン、１ｍＭ ＰＭＳＦ、１μｇ／ｍｌロイペプチン、１μｇ／ｍｌアプロチニン）の１０ｍｌを用いて洗浄した。核を１０分間、６００ｘｇで遠心分離して集め、１ｍＭ ＣｕＳＯ4 の存在下、２００ｍｌ ＮＩＢ３＋ＰＩ中に再懸濁し、そして１０分間、４２℃でインキュベーションして核を安定化した。
【００４８】
１０ｍｌ ＨＩＢ＋ＰＩ（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１００ｍＭ酢酸リチウム、１０ｍＭ ＬＩＳ（二ヨードサリチル酸リチウム）、０．１％ジギトニン、２ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＰＭＳＦ、１μｇ／ｍｌロイペプチン、１μｇ／ｍｌアプロチニン）中で１５分間、室温でインキュベーションしてヒストンを抽出した。得られた核ハローを遠心分離管に移し、そして４０００ｘｇ、１０分間でペレット化した。ハローを、１０ｍｌ ＨＷＢ（２０ｍＭトリス、ｐＨ８、７０ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ ＫＣｌ、７ｍＭ ２−メルカプトエタノール、０．１％ジギトニン、０．０５ｍＭスペルミン、０．１２５ｍＭスペルミジン）を用いて２回、そしてＤ／ＢＢ＋ＰＩ（ＨＷＢ＋１０ｍＭ ＭｇＣｌ2 、１ｍＭ ＰＭＳＦ、１μｇ／ｍｌロイペプチン、１μｇ／ｍｌアプロチニン）を用いて１回洗浄してＬＩＳを除いた。ハローが良くペレット化されない場合には、引き続いての遠心分離段階をスローブレーキ設定を用いて６０００ｘｇで行った。ハローの品質をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにより検査して、ヒストンの９５％以上が抽出操作により除去されたことを確認した。
【００４９】
洗浄した核ハローを４００μｌ Ｄ／ＢＢ＋ＰＩ中に再懸濁し、そして制限酵素の２００単位（ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩのそれぞれ１００ｕ）を加え、そして３７℃で２〜３時間、ハローを沈降しないように揺動台上でインキュベーションした。制限酵素は、核ＤＮＡの７０％以上を除去して、核骨格を生成した。骨格を３００ｘｇでペレット化し、そしてＨＷＢ＋ＰＩ（ＨＷＢ＋１ｍＭ
ＰＭＳＦ、１μｇ／ｍｌロイペプチン、１μｇ／ｍｌアプロチニン）を用いて洗浄した。核骨格を４００μｌ ＨＷＢ＋ＰＩ中に再懸濁し、そして１００μｌアリコート試料（核相当物５百万個を含む）に分離した。
Ｄ．核骨格への人工ＭＡＲの結合
ＨＷＢ＋ＰＩ中の骨格の１００μｌアリコート試料をプローブおよび大腸菌(E. coli) 競合ＤＮＡと一緒に、３７℃で２〜３時間、揺動台シェーカー上のシリコン加工ミクロフュージ(microfuge) 管内でインキュベーションした。インキュベーションの後、上清画分（非結合ＤＮＡ断片を含む）とペレット画分（骨格および結合ＤＮＡ断片を含む）とを、水平ミクロフュージ管内、３０００ｘｇで５分間の遠心分離で分離した。ペレットを１回、２００μｌ ＨＷＢを用いて洗浄してプロテイナーゼ阻害剤を除去し、１００μｌ溶解緩衝液（１０ｍＭトリス、ｐＨ８、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％ＳＤＳ、０．５ｍｇ／ｍｌプロテイナーゼＫ）内に再懸濁し、そして一晩、室温でインキュベーションした。
【００５０】
同じ画分のペレットおよび上清を０．９％アガロースゲル上で分離し、これを引き続いて７％ＴＣＡ中に２０分間浸漬して固定し、乾燥して室温でＸ−線フィルムおよび／またはホスホイメージャーTMＳＩ(PhosphoImagerTM SI, Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA) ）のための貯蔵リン・スクリーンに暴露した。
【００５１】
人工ＭＡＲモノマーもしくはダイマーまたは対照Ｇｐａｌもしくはゼイン配列を含むプラスミドを、５’オーバーハング末端を生成する制限酵素を用いて消化した。ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウサブユニットを、〔α−32Ｐ〕ｄＣＴＰ（アマーシャム・ライフ・サイエンス(Amersham Life Science, Arlington Heights, IL)）を用いるオーバーハングの充填のために使用した。末端標識したＤＮＡ断片を結合アッセイのプローブとして用い、すなわち、断片を精製したメイズ核骨格と一緒に、非標識大腸菌競合ＤＮＡの存在下でインキュベーションし、そして挿入物の相対結合を決定した。結合アッセイに使用した核、プローブおよび非標識大腸菌競合ＤＮＡの相対量は、強くおよび弱く結合したＭＡＲの間で最大の区別が得られるように最適化した。最適相対量は、アッセイ毎に、非標識大腸菌競合ＤＮＡの２、５または１０μｇ、核骨格の核相当物５百万個、および消化して標識したプラスミドの１ｆｍｏｌであった。
【００５２】
人工ＭＡＲダイマーは、競合ＤＮＡの高レベルの存在下でも核骨格調製物に非常に強く結合した。モノマーＭＡＲも、低い親和性ではあったけれども、核骨格調製物に結合した。いずれの対照配列も、これらは人工ＭＡＲと大きさおよび相対ＡＴ含有量が類似していたにもかかわらず、ペレット画分中には保持されなかった。これは、人工ＭＡＲ中に含まれる要素が結合を容易にすることを示唆する。
【００５３】
実施例３
コメ内の人工ＭＡＲの評価
Ａ．コメ形質転換ベクター
ｐＧＯＳ２−ｈｐｔ（配列番号２７）は、３５Ｓプロモーターにより駆動されるハイグロマイシン選択性マーカーおよびＧＯＳ２／ＧＵＳ／ｎｏｓカセット（ＧＯＳ２転写開始領域／ＧＵＳ構造遺伝子／ｎｏｓ３’非翻訳領域）を含むコメ形質転換ベクターである。この構築物中のＧＯＳ２転写開始領域は、１１００ｂｐイントロンにより中断されたプロモーターの１０１０ｂｐおよび非翻訳５’リーダーの１７０ｂｐを含んでなる（デ・パーターら(de Pater et al., 1992) ）。
【００５４】
ｐＡｒＧＯＳ２Ａｆ−ｈｐｔ（配列番号２８）は、ｐＧＯＳ２−ｈｐｔと同じコメ形質転換ベクターであるが、しかしこれはＧＯＳ２転写開始領域に対して５’に位置する配列番号２９のＭＡＲダイマーおよびｎｏｓ３’ＵＴＲに対して３’に位置する配列番号２６のＭＡＲダイマーを有する点が異なる。
【００５５】
ＡｒＧＯＳ２Ａｆ構築物の図形表示を図２に示す。
Ｂ．コメの形質転換
胚起源カルスの開始のために、ジャポニカ栽培変種、タイペイ(Taipei)３０９の成熟種子を脱穀し、そして７０％エタノール中で５〜７分間滅菌し、次いで０．０２％ツイーン(Tween) TM２０（ＩＣＩアメリカス社(ICI Americas, Inc) ）を含む２５％市販漂白液（２．６％次亜塩素酸ナトリウム）中に、減圧下で３０〜４５分間浸漬した。次いで種子を５回、滅菌した蒸留水中でリンスし、そして誘導媒体（ＮＢ）に移すまで濾紙上に置いた。ＮＢ培地は、Ｎ６マクロ要素（チュー(Chu, 1978) ）、Ｂ５ミクロ要素およびビタミン類（ガンボルグら(Gamborg et al., 1968)）、３００ｍｇ／ｌ加水分解カゼイン、５００ｍｇ／ｌ Ｌ−プロリン、５００ｍｇ／ｌ Ｌ−グルタミン、３０ｇ／ｌスクロース、２ｍｇ／ｌ ２，４−ジクロロ−フェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）、および２．５ｇ／ｌゲルライトTM（Gelrite TM、メルク社(Merck & Co., Rahway, NJ) ）を含み、ｐＨを５．８に調整してある。誘導培地で培養した成熟種子を暗所、２８℃で３週間インキュベーションした。成熟胚の胚盤領域から誘導された一次カルスを引き続いての維持(maintenance) のために新しいＮＢ培地に移し、その後２週間の二次培養期間維持した。
【００５６】
ブラスティング(Blasting)のためのＤＮＡを調製するために、プラスミドＤＮＡ（ｐＧＯＳ２−ｈｐｔまたはｐＡｒＧＯＳＡｆ−ｈｐｔ）の約１４０μｇを金粒子６０ｍｇ上に沈降させた。プラスミドＤＮＡを、１．５〜３．０ミクロン（アルドリッチケミカル社(ALdrich Chemical Co., Milwaukee, WI) ）または１．０ミクロン（バイオ−ラド・ラボラトリーズ (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) ）金粒子の６０ｍｇ上に沈降させた。沈降混合物は、洗浄済金粒子の６０ｍｇ、水／ＤＮＡ（１４０μｇ）の３００μｌ、２．５Ｍ ＣａＣｌ2 の７４μｌおよび０．１Ｍスペルミジンの３０μｌを含んでいた。成分を上記の順序で加えた後、混合物を直ちに回転攪拌し、そして２〜３分間沈降させた。上清をピペットで吸引除去し、廃棄した。ＤＮＡ被覆金粒子を１００％エタノール１ｍｌ中に再懸濁し、そしてブラスティング実験に使用するためにエタノールｍｌあたりに１７．５ｍｇＤＮＡ／７．５ｍｇ金まで希釈した。
【００５７】
ヘリウムブラスティングのために、活発に生育している大きさが２〜４ｍｍの胚起源カルス培養物を、ヘリウムブラスティングの前４時間の間、０．２Ｍマンニトールおよび０．２Ｍソルビトールを含むＮＢ培地上にカルスを置いて高オスモティクム(osmoticum) 処理した（ヴェインら(Vein et al., 1993) ）。オスモティクム処理に続いて、カルス培養物をブラスティング培地（ＮＢ＋２％アガー）に移し、そしてステンレス鋼網（２３０ミクロン）で覆った。ヘリウムブラスティングは、調製した組織標的に向かってその中に懸濁したＮＤＡ被覆金粒子を加速吹きつけすることを含む。使用した装置は、引用することにより本明細書中に編入される米国特許（ＵＳ）第５，１４１，１３１号に記載の初期の原型で、両方共に同様に機能した。カルス培養物を種々のヘリウム圧力（１７５０〜２，２５０ｐｓｉ）で、標的あたりに１〜３回ブラスティングした。ブラスティングの後、高オスモティクム培地にカルスを戻し、その一晩後に、３０ｍｇ／ｌハイグロマイシンを含むＮＢ培地から成る選択培地上に配置した。２週間後に、さらに高い選択剤濃度、すなわちＮＢ＋５０ｍｇ／ｌハイグロマイシンを含む新しい選択培地に培養物を移した（リーら(Li et al., 1993) ）。
【００５８】
ＮＢ＋５０ｍｇ／ｌハイグロマイシン上に回収したコンパクトで黄白色の胚起源カルス培養物を予備再生（ＰＲ）培地＋５０ｍｇ／ｌハイグロマイシンに移して再生した。ＰＲ培地は、２ｍｇ／ｌベンジルアミノプリン（ＢＡＰ）、１ｍｇ／ｌナフタレン酢酸（ＮＡＡ）、および５ｍｇ／ｌアブシジン酸（ＡＢＡ）を含むＮＢ培地から成っていた。暗所における２週間の培養の後、これらを再生（ＲＮ）培地に移した。ＲＮ培地の組成は、３ｍｇ／ｌＢＡＰ、および０．５ｍｇ／ｌ ＮＡＡを含むＮＢ培地である。ＲＮ培地上の培養物を２週間、２８℃で高蛍光（３２５−ｆｔ−キャンドル）下でインキュベーションした。生育長２ｃｍを有する小植物を、ＧＡ７容器（マゼンタ社(Magenta Corp. Chicago, IL) ）中でｐＨ５．８に調整した、１／２Ｂ５ビタミン、１０ｇ／ｌ スクロース、０．０５ｍｇ／ｌ ＮＡＡ、５０ｍｇ／ｌ ハイグロマイシンおよび２．５ｇ／ｌゲルライトTMを有する１／２ＭＳ培地（ムラシゲおよびスクーグ(Murashige and Skoog, 1962) ）に移した。小植物が十分成長した根系を有するまで生育すると、これらを土壌〔メトロミックス(Metro-Mix) ３６０（スコッツ−シエラ・ホーティカルチュラル・プロダクツ社(Scotts-Sierra Horticultural Products Co., Marysville, OH)）１部、および表土１部〕に移し、そして高さ６０ｃｍに達するまで栽培室（２９／２４℃の昼夜サイクル、湿度５０〜６０％、照明期間１２時間）に置き、その時点で定量ＧＵＳ分析のために葉２枚を採取し、そして植物を成熟するまで生育させるために温室に移した。
Ｃ．サザン分析
サザン分析は、特定の遺伝子構築物の不変のコピーを含む一次再生（Ｒ0 ）コメ株を特定するために使用した。
【００５９】
β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）遺伝子構築物のコーディング領域に特異性のＤＮＡプローブを、キアエキス(Qiaex) ＩＩ ＤＮＡ精製キット（キアジェン社(Qiagen Inc., Chatsworth, CA) ）を用いてゲル精製した。放射能標識したプローブは、レディーツーゴー(Ready-To-Go) TMＤＮＡ標識ビーズ（ファルマシアＬＫＢ(Pharmacia LKB, Piscataway, NJ) ）を用いて、〔α32Ｐ〕ｄＣＴＰ（アマーシャム・ライフサイエンス、Arlington Heights, IL)の５０μＣを用いて調製した。
【００６０】
Ｒ0 コメ植物からの葉材料を各株からの２つの代表から採取した。Ｒ0 植物からのゲノムＤＮＡをサガイ−マルーフらの記載(Saghai-Maroof et al., 1984)に従って凍結乾燥した組織から調製した。
【００６１】
コメＤＮＡの４μｇを制限酵素を用いて消化して、製造者（ベセスダ・リサーチ・ラボラトリー(Bethesda Research Laboratory, Gaithersburg, MD)）により示唆された条件下で不変の遺伝子構築物を解放し、アガロースゲル電気泳動により分離した。ＤＮＡをサザン(1975,1989) の記載に従ってナイロン膜上にブロットした。放射能標識したプローブＤＮＡを、６０℃に加熱した最少ハイブリダイゼーション緩衝液（１０％ポリエチレングリコール、７％ドデシル硫酸ナトリウム、０．６ｘ ＳＳＣ、１０ｍＭリン酸ナトリウム、５ｍＭ ＥＤＴＡおよび１００ｍｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ）の５０ｍｌを用いてブロット上のゲノムＤＮＡにハイブリダイゼーションし、そして変性した放射能標識したプローブと混合し、次いで一晩６０℃でハイブリダイゼーションするためにブロットに添加した。ブロットを６０℃、０．２５Ｘ ＳＳＣおよび０．２％ＳＤＳ中で４５分間洗浄し、乾燥ブロットし、そして２枚の強化スクリーンを有するＸＡＲ−５フィルムに一晩暴露した。
【００６２】
サザン分析は、７０のＡｒＧＯＳ２Ａｆ Ｒ0 コメ株について行った。Ｒ0 植物からのＤＮＡを制限酵素ＸｂａＩを用いて消化し、これは、不変の遺伝子構築物が存在する場合には、ＧＵＳコーディング領域に特異性のプローブを用いて放射能標識すると５．７ｋｂハイブリダイゼーション生成物をもたらすはずである。５．７ｋｂ断片は、逆方向の人工ＭＡＲ、ＧＯＳ２プロモーター、ＧＵＳコーディング領域、ｎｏｓ３’ＵＴＲおよび正方向の人工ＭＡＲを含むはずである。期待された５．７ｋｂハイブリダイゼーション生成物が、７０のコメ株の２５株で検出された。２５株の全ては、複数ハイブリダイゼーション生成物を有し、２株は一致する複合ハイブリダイゼーションパターンを有し、これらが多分同じ形質転換イベントに由来することを示唆する。
【００６３】
非ＭＡＲ対照株、ＣＯＳ２もサザン分析により分析した。４８のＧＯＳ２ Ｒ0 株からのＤＮＡを、制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩを用いて消化し、これは、不変の遺伝子が存在する場合には、ＧＵＳコーディング領域に特異性のプローブを用いて放射能標識すると４．４ｋｂハイブリダイゼーション生成物をもたらすはずである。４．４ｋｂ断片は、ＧＯＳ２プロモーターの１．６ｋｂ、ＧＵＳコーディング領域、ｎｏｓ３’ＵＴＲおよび３５Ｔプロモーター（選択可能なマーカー遺伝子を駆動するために使用したプロモーター）を含むであろう。期待された４．４ｋｂハイブリダイゼーション生成物が、４８のＧＯＳ２株の２８株で検出された。２株は一致する複合ハイブリダイゼーションパターンを有し、これらが多分同じ形質転換イベントに由来したことを示唆する。２株は遺伝子キメラを含んでいた。
Ｄ．ＧＵＳ分析
コメの分析は、一次形質転換体の若い葉について、植物を環境制御した栽培室内で６〜８週間生育させ、そして約６０ｃｍの高さに達した後に行った。２株の独立して再生したコメ植物を形質転換イベントに関して分析した。個別の形質転換体をサザンブロットで分析して、導入遺伝子の不変のコピーの存在を検査し、そして独立した形質転換イベントを示すユニークなハイブリダイゼーションパターンをそれぞれのイベントが示すかどうかを決定した。導入遺伝子の完全なコピー、キメライベント、または二重の組込みイベントを欠く植物は、分析に含めなかった。
【００６４】
分析の結果を図４および５に報告する。図４において、エラーバーは、各形質転換イベントに対する植物の間の標準偏差を示す。試料２件を独立してそれぞれの植物について処理した。一般に、各形質転換イベントからの独立したコメ植物内のＧＵＳの発現のレベルは、同様であった（図４に示す結果の標準偏差により示される通り）。
【００６５】
図５は、記載の範囲内のＧＵＳを発現する形質転換イベントの割合を報告する。
アラビドプシス(Arabidopsis) における人工ＭＡＲの評価
Ａアラビドプシス形質転換ベクター
Ａｃｔ２／ＧＵＳ／ｎｏｓ（Ａｃｔ２転写開始領域／ＧＵＳ構造遺伝子／ｎｏｓ３’ＵＴＲ）構築物を双子葉植物系（アラビドプシス）における試験のために作製した。ベクター３個を作製した。
【００６６】
ｐＡｃｔ２−ｂｉｎ（配列番号３０）は、Ａｃｔ２／ＧＵＳ／ｎｏｓカセット、１９Ｓ／ＮＰＴＩＩ／ｏｒｆ２５ｐｏｌｙＡを選択可能マーカーとして、そして３５Ｓ／ＧＦＰ／ｎｏｓを独立レポーター遺伝子として含むバイナリーベクターである。
【００６７】
ｐＡｒＡｃｔ２Ａｆ−ｂｉｎ（配列番号３１）は、Ａｃｔ２転写開始領域に対して５’に位置する配列番号２９のＭＡＲダイマー、およびｎｏｓ３’ＵＴＲに対して３’に位置する配列番号２６のＭＡＲダイマーを有することを除いて、ｐＡｃｔ２−ｂｉｎと一致する。
【００６８】
ｐＡｆＡｃｔ２Ａｆ−ｂｉｎ（配列番号３２）は、Ａｃｔ２転写開始領域に対して５’に位置する配列番号２６のＭＡＲダイマー、およびｎｏｓ３’ＵＴＲに対して３’に位置する配列番号３３のＭＡＲダイマーを有することを除いて、ｐＡｃｔ２−ｂｉｎと一致する。
【００６９】
これらのベクターは、アラビドプシス中の人工ＭＡＲダイマーの二方向での試験を可能とした。ｐＡｒＡｃｔ２Ａｆ−ｂｉｎおよびｐＡｆＡｃｔ２Ａｆ−ｂｉｎ構築物の図式表示を図３に示す。
Ｂ．アラビドプシス形質転換
アラビドプシス形質転換は、パム・グリーン(Pam Green) により提供されたプロトコール（ファンホフおよびグリーン(van Hoof and Green, 1996)）に従って行い、これはニコル・ベヒトルド（ベヒトルドら(Bechtold et al., 1993) ）、アンドルー・ベント（ベントら(Bent et al., 1994) ）およびタカシ・アラキ（Takashi Araki 私信）を適応させたものである。
【００７０】
生態型コロンビア(Columbia)の種子を４インチの角形鉢に植え、窓用の網で覆い、明所１６時間／暗所８時間、２２℃の条件下、週に１回のサブイリゲーション(subirrigation) により施肥して栽培した。肥料は、５ｍＭ ＫＮＯ3、２．５ｍＭ ＫＰＯ4（ｐＨ５．５）、２ｍＭ ＭｇＳＯ4、２ｍＭ Ｃａ（ＮＯ3）2、０．０５ｍＭ Ｆｅ・ＥＤＴＡ、０．０７ｍＭホウ酸、０．０１４ｍＭＭｎＣｌ2、０．００５ｍＭ ＣｕＳＯ4、０．００１ｍＭ ＺｎＳＯ4、０．０００２ｍＭ ＮａＭｏＯ4、および０．０１ｍＭ ＮａＣｌから成っていた。植物を鉢あたりに４本に間引き、数本の束が現れるまで栽培した。植物が形質転換に適するようになると、土上の部分を、アグロバクテリウム(Agrobacterium)細胞を含む浸潤媒体（２．２ｇ／ｌ ＭＳ塩、１Ｘ Ｂ５ビタミン、５０ｇ／ｌスクロース、２．５ｍＭ ＭＥＳ、ｐＨ５．７、０．０４４ Ｍ ベンジルアミノプリン、２００ｍｌ／ｌシルヴェット(Silwet)Ｌ−７７TM〔オシ・スペシャルティーズ社(Osi Specialties, Inc)〕）中に浸漬し、４００ｍｍＨｇ（約１インチ）の減圧下の真空乾燥器内に５分間置いた。迅速に減圧から解放した後、鉢を水切りし、そしてプラスチックラップで覆ったトレー内に横に置いて２４時間湿度を保持した。次の日に鉢の覆いを取り、直立させた。植物を個別に支持し、そして２週間後に灌水を徐々に減らして植物を完全乾燥させた。種子を各植物から個別に採取した。
【００７１】
形質転換イベントの選択のために、植物あたりに種子１〜１０ｍｇを、１０％漂白液中に７分間、激しく攪拌しながら浸漬して表面滅菌し、次いで滅菌水中で３回リンスし、そしてアラビドプシス発芽媒体（ＭＳ塩、ＭＳビタミン、１０％スクロース、２．５ｍＭ ２−〔Ｎ−モルホリノ〕エタンスルホン酸〔ＭＥＳ〕、３０ｍｇ／ｌカナマイシン、５０ｍｇ／ｌバンコマイシンおよび０．１％バクト(Bacto) TMアガー〔ディフコ・ラボラトリーズ(Difco Laboratories, Detroit, MI)〕）を含むフラスコ内に置いた。連続光内、９０ｒｐｍで３日間振とうした後、種子が発芽し、そして発芽後７および１２日の間に、形質転換体を緑色の幼植物として単離した。非形質転換種子は、小さい淡色の幼植物を発生した。形質転換体をプレート内の固体媒体（ＭＳ塩、Ｂ５ビタミン、１０％スクロース、２．５ｍＭ ＭＥＳ、１５ｇ／ｌファイタガー(Phytagar)TM〔ジブコＢＲＬ、Gaitersberg, MD〕、３０ｍｌ／ｌカナマイシン、５０ｍｇ／ｌバンコマイシン）に移してさらに選択した。１〜２週間後に、真の形質転換体をＧＡ７容器（ＭＳ塩、Ｂ５ビタミン、０．３％スクロース、２．５ｍＭ ＭＥＳ）に１〜２週間移し、次いでＴ１種子を産生するために土壌内に植えた。
Ｃ．サザン分析
サザン分析は、特定の遺伝子構築物の不変のコピーを含む一次再生Ｔ２アラビドプシス株を特定するために使用した。
【００７２】
アラビドプシス葉組織のプールした試料を、液体窒素内で粉末化した。次いで破砕した組織を３分間、５００μｌ ２Ｘ抽出緩衝液（２％ＣＴＡＢ、１００ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、２０ｍＭ ＥＤＴＡ、１．４Ｍ ＮａＣｌおよび２％ ２−メルカプトエタノール）中、６５℃でインキュベーションした。クロロホルム／オクタノール（２４：１）の５００μｌを加え、試料を２分間振とうし、次いでマイクロ遠心分離機内で１４，０００ｘｇで回転し、そして上清を除去した。クロロホルム／オクタノール抽出を繰り返した。沈降緩衝液（１％
ＣＴＡＢ、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、および１％ ２−メルカプトエタノール）の１ｍｌを上清に加え、次いで室温で６０分間インキュベーションした。ＤＮＡをマイクロ遠心分離機で５分間、３５００ｘｇの遠心分離によりペレット化した。ペレットを水切りし、そして２００μｌの１．０Ｍ ＮＨ4 ＯＡｃ中に再懸濁した。１００μｌの７．５Ｍ ＮＨ4 ＯＡｃおよびイソプロパノール１ｍｌを加え、試料を氷上で５分間インキュベーションし、次いで１４，０００ｘｇで５分間遠心分離した。ペレットを水切りし、そして２００μｌ ＴＥ中に再懸濁した。１００μｌの７．５Ｍ ＮＨ4 ＯＡｃおよびイソプロパノール１ｍｌを加え、氷上で５分間インキュベーションし、次いで１４，０００ｘｇで５分間遠心分離した。ペレットを水切りし、そして７０％エタノールを用いてリンスし、そしてスピード・ヴァック（Speed Vac 、サヴァント・インスツルメント社(Savant Instrument Inc., Farmingdale, NY) ）内で乾燥した。乾燥したペレットを２０μｌ ＴＥ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）中に再懸濁した。
【００７３】
サザン分析は、２９ ＡｒＡｃｔ２Ａｆ Ｔ２株および２４ ＡｆＡｃｔ２Ａｆ Ｔ２株について行った。ＡｒＡｃｔ２Ａｆ植物からのＤＮＡの１μｇを制限酵素ＸｂａＩを用いて、製造者（ベセスダ・リサーチ・ラボラトリーズ、Gaithersberg, MD）により示唆された条件下で消化し、そしてアガロースゲル電気泳動により分離し、これは、遺伝子構築物が不変の場合には、ＧＵＳコーティング領域に対して特異性のプローブで放射能標識すると、４．６ｋｂハイブリダイゼーション生成物をもたらすはずである。ＡｒＧＯＳ２Ａｆコメ植物と同様に、４．６ｋｂ断片は、逆方向の人工ＭＡＲ、Ａｃｔ２プロモーター、ＧＵＳコーディング領域、ｎｏｓ３’ＵＴＲおよび正方向の人工ＭＡＲから成るはずである。ＤＮＡをサザンの記載(1975,1989) に従ってナイロン膜上にブロットした。放射能標識したプローブＤＮＡを、６０℃に加熱した最少ハイブリダイゼーション緩衝液（１０％ポリエチレングリコール、７％ドデシル硫酸ナトリウム、０．６ｘ ＳＳＣ、１０ｍＭリン酸ナトリウム、５ｍＭ ＥＤＴＡおよび１００ｍｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ）の５０ｍｌを用いてブロット上のゲノムＤＮＡにハイブリダイゼーションし、そして変性した放射能標識プローブと混合し、次いで６０℃で一晩ハイブリダイゼーションするためのブロットに添加した。このブロットを６０℃、０．２５Ｘ ＳＳＣおよび０．２％ＳＤＳ中で４５分間洗浄し、乾燥ブロットし、そして２枚の強化スクリーンを有するＸＡＲ−５フィルムに一晩暴露した。
【００７４】
期待された４．６ｋｂハイブリダイゼーション生成物が、２９ ＡｒＡｃｔ２Ａｆ株の２６株で検出された。第二のサザンブロットは、ＡｒＡｃｔ２Ａｆ構築物のコピー数を決定するために作製した。ＡｒＡｃｔ２Ａｆ ＤＮＡを、構築物をＴ ＤＮＡの右および左境界付近で切断する制限酵素ＳｓｔＩおよびＸｈｏＩを用いて消化した。人工ＭＡＲおよび左境界からＸｈｏＩ部位に向かって８００ｂｐ下流のＤＮＡに対して特異性のプローブを用いてブロットを放射能標識した。ＡｒＡｃｔ２Ａｆ構築物の単一コピーは、３種のハイブリダイゼーション生成物を有するであろう。すなわち左および右境界ＤＮＡから成る未知の大きさの２断片、および境界から内部のＤＮＡである８．９ｋｂ断片である。２９株中の２２株は、３種またはこれ以下のハイブリダイゼーション生成物を有し、ＡｒＡｃｔ２Ａｆ構築物の単一コピーが存在することを示した。
【００７５】
ＡｆＡｃｔ２Ａｆ植物からのＤＮＡを制限酵素ＸｂａＩを用いて消化し、これは、遺伝子構築物が不変のままであれば、ＧＵＳコーティング領域に対して特異性のプローブで放射能標識すると、５．７ｋｂハイブリダイゼーション生成物をもたらすはずである。５．７ｋｂ断片は、正方向の人工ＭＡＲ、Ａｃｔ２プロモーター、ＧＵＳコーディング領域、ｎｏｓ３’ＵＴＲおよび正方向の人工ＭＡＲから成るはずである。これは緑色の蛍光タンパク質コーディング領域およびｎｏｓ３’ＵＴＲも含む。期待された５．７ｋｂハイブリダイゼーション生成物が、２４ ＡｆＡｃｔ２Ａｆ株の２４株すべてで検出された。
【００７６】
第二のサザンブロットは、ＡｆＡｃｔ２Ａｆ構築物のコピー数を決定するために作製した。ＡｆＡｃｔ２Ａｆ ＤＮＡを、構築物をＴ ＤＮＡの右および左境界付近で切断する制限酵素ＳｓｔＩおよびＸｈｏＩを用いて消化した。人工ＭＡＲおよび左境界からＸｈｏＩ部位に向かって８００ｂｐ下流のＤＮＡに対して特異性のプローブを用いてブロットを放射能標識した。ＡｆＡｃｔ２Ａｆ構築物の単一コピーは、３種のハイブリダイゼーション生成物を有するであろう。すなわち左および右境界ＤＮＡから成る未知の大きさの２断片、および境界から内部のＤＮＡである８．９ｋｂ断片である。２４株中の１５株は、３種またはこれ以下のハイブリダイゼーション生成物を有し、ＡｆＡｃｔ２Ａｆ構築物の単一コピーが存在することを示した。
【００７７】
非ＭＡＲ対照株のＡｃｔｂｉｎもサザン分析で分析した。３４ Ａｃｔｂｉｎ Ｔ２株からのＤＮＡを、制限酵素ＰｓｔＩを用いて消化し、これは、構築物が不変のままであれば、ＧＵＳコーティング領域に対して特異性のプローブで放射能標識すると、３．４ｋｂハイブリダイゼーション生成物をもたらすはずである。３．４ｋｂ断片は、Ａｃｔ２プロモーター、ＧＵＳコーディング領域、およびｎｏｓ３’ＵＴＲから成るはずである。期待された３．４ｋｂハイブリダイゼーション生成物が、３４ Ａｃｔｂｉｎ株の３０株で検出された。第二のサザン分析をＡｃｔｂｉｎ構築物のコピー数を決定するために行った。Ａｃｔｂｉｎ株からのＤＮＡを、構築物をＴ ＤＮＡの右および左境界付近で切断する制限酵素ＳｓｔＩおよびＸｈｏＩを用いて消化した。３’ＵＴＲおよび左境界からＸｈｏＩ部位に向かって８００ｂｐ下流のＤＮＡに対して特異性のプローブを用いてブロットを放射能標識した。Ａｃｔｂｉｎ構築物の単一コピーは、３種のハイブリダイゼーション生成物を有するであろう。すなわち左および右境界ＤＮＡから成る未知の大きさの２断片、および境界から内部のＤＮＡである８．２ｋｂ断片である。３４株中の９株は、３種またはこれ以下のハイブリダイゼーション生成物を有し、Ａｃｔｂｉｎ構築物の単一コピーが存在することを示した。
Ｄ．ＧＵＳ分析
アラビドプシスの栽培のために、Ｔ２種子を生体外で、９０ｍｇ／ｌカナマイシンを含むＭＳ媒体上で発芽させ、そして３週齢のカナマイシン耐性幼植物を採取した。形質転換イベントあたりに幼植物３０個のバッチをＧＵＳ分析に使用し、そして別の幼植物をＤＮＡ抽出に使用した。
【００７８】
ＧＵＳ活性の分析のために、葉試料を液体窒素中で粉末化し、そして組織約４００ｍｌの試料をミクロフュージ管内に入れた。各葉試料からの２個の独立試料を処理した。組織は、−７０℃で貯蔵するかまたは直ちに抽出した。粉末化した組織を、１％ポリビニルポリピロリドン（緩衝液中で少なくとも１時間水和した）および２０％グリセロールを加えて変性したＧＵＳ溶解緩衝液（ジェファーソンら(Jefferson et al., 1987)）と混合してＧＵＳを抽出した。氷上で少なくとも１０分間インキュベーションした後、試料を１６，０００ｘｇで１０分間遠心分離した。上清を回収しそして上記のようにして第二回目の遠心分離を行った。上清を回収しそしてドライアイス上で冷凍しそして−７０℃で貯蔵した。実験は、上記の緩衝液内で貯蔵した場合に、ＧＵＳ活性が少なくとも４回の冷凍−解凍サイクルで安定であることを示した（Ｗ．Ｍ．エインレー(Ainley)未公開）。ＧＵＳ活性は、ＧＵＳ−ライト(Light) TMキット（トロピックス社(Tropix, Inc., Bedford, MA)）を用いて測定した。未希釈抽出物または蛍光計で測定した蛍光が範囲内にあるように希釈した抽出物の５ｍｌ試料を、ＧＵＳ−ライトTM反応緩衝液の１９５ｍｌに加えた。蛍光は、５秒の経過の後５秒間積算した。タンパク質は、標準としてヒト血清アルブミンを用いるブラッドフォードにより開発されたアッセイ(Bradford, 1976)を用いて測定した。ＧＵＳ活性は、ＳＩＧＭＡから入手したＧＵＳ標準を用いて、実験間で正規化した。標準および植物試料内の植物タンパク質の量は、同じであった。必要な場合には、非形質転換植物の抽出物を用いてタンパク質を調整した。
【００７９】
図６および７は、ＧＵＳ分析の結果を報告している。図６は、基礎、非−ＭＡＲ構築物（Ａｃｔｂｉｎ）または指示した方向（ＡｒＡｃｔ２ＡｆまたはＡｆ−Ａｃｔ−Ａｆ）にある人工ＭＡＲにより隣接されている基礎構築物を発現する独立した形質転換イベントに対して観察された発現を報告している。標準偏差は、種々の植物から採取した植物間の変動を示す。矢印は、ＭＡＲの相対方向を示す。
【００８０】
図７中では、指示された範囲内でＧＵＳを発現する形質転換イベントの割合を示す。
Ｅ．レポーター遺伝子構築物を発現する形質転換植物の特性試験。
【００８１】
Ｔ２アラビドプシス植物を分析した。挿入コピー数を決定するために、カナマイシン耐性の分離に関して植物を評価した。カイ二乗解析で検定して、いくつかのイベントは、１個または２個の挿入物カテゴリー内に入らなかった。残りの植物の中で、７２％は単一挿入であった。挿入の大部分は導入遺伝子の複数コピーを有していた。アラビドプシス形質転換イベントは、制御された環境下で生育させたけれども、重複したプレートの間で植物の相対成長にいくらかの偶然的な相違があった。これらの場合に、イベントは使用しないかまたは再度栽培した。重複プレートから決定した発現の変動係数は、１〜４６％の間に広がり、その８９％は２０％以下であった（図６）。
【００８２】
一般に、構築物に関して試験したすべてのアラビドプシス形質転換イベントを一緒に栽培および分析した。植物の生育は制御された環境下であったけれども、構築物を発現する形質転換イベントの間に観察された相違が、異なる実験の間に起きた環境の相違によるものである可能性も残る。この可能性を除くために、アラビドプシス形質転換イベントの３組からの最高発現イベント３例を一緒に生育させて再分析した。この分析は、形質転換イベントの組の間の初期の相違を確認した。
導入遺伝子発現に対する人工ＭＡＲの効果の要約
コメとアラビドプシスの両者において、ＭＡＲ含有構築物を発現する形質転換イベントの平均発現レベルは、ＭＡＲ要素を欠くものよりも高いレベルで発現した（表３）。アラビドプシスにおいては、試験したＭＡＲの方向は、発現のレベルに影響した。ＧＵＳ遺伝子構築物の両方の側で同じ方向にＭＡＲがある構築物を含む植物は、ＭＡＲが反対方向に向いている構築物を含む植物よりも高いレベルでＧＵＳを発現した。
【００８３】
形質転換イベントのそれぞれの組内で、より高い発現株内の方が、より低い株内よりも比例的により高い発現レベルのように見える。これを文書化するために、発現例の上位１／４の発現を比較した（表３）。このデータに基づくと、ＡｆＡｃｔ２Ａｆ構築物を発現する形質転換イベントの上位１／４は、Ａｃｔｂｉｎ構築物を発現するイベントの上位１／４よりも５．６倍高いレベルでＧＵＳタンパク質を産生する。コメおよびアラビドプシスの両者において逆方向にある人工ＭＡＲは、それぞれの構築物を欠くＭＡＲよりも約２倍、発現を増強する。
【００８４】
【表５】
これまで公開された研究（ホームズ−デーヴィスおよびコマイにより概説(Holms-Davis and Comai, 1998) ）は、１例のＭＡＲを除いて、今日まで試験されたすべてのＭＡＲがレポーター遺伝子の発現を増強することを示している。本研究は、優先的にＭＡＲ内に見いだされる要素を用いて構築したＭＡＲが、単子葉および双子葉植物の双方を代表する植物種内で発現を増強できるという最初の報告である。
【００８６】
【表６】
【表７】
【表８】
【表９】
【表１０】
【表１１】
【表１２】
【表１３】
【図面の簡単な説明】
【図１】 配列番号１の人工ＭＡＲを構築するための戦略を示す図である。
【図２】 ＭＡＲダイマーを含むコメ形質転換構築物ＡｒＧＯＳ２Ａｆの図式表示である。
【図３】 ＭＡＲを含まない構築物ＧＯＳ２および人工ＭＡＲダイマーを含む構築物ＡｒＧＯＳ２Ａｆを用いた複数のコメ形質転換イベントに対する相対ＧＵＳ活性を比較したグラフである。
【図４】形質転換コメ植物におけるＧＵＳレポーター遺伝子の発現の範囲に対する人工ＭＡＲの効果を示すグラフである。
【図５】 アラビドプシス形質転換構築物ＡｒＡｃｔ２ＡｆおよびａａａａＡｆＡｃｔＡｆの図式表示である。ＡｒＡｃｔ２Ａｆは、レポーター遺伝子に隣接して反対方向にあるＭＡＲダイマーのコピーを含む。ＡｆＡｃｔ２Ａｆは、レポーター遺伝子に隣接して同じ方向にあるＭＡＲダイマーのコピーを含む。
【図６】 ＭＡＲを含まない構築物Ａｃｔ２および人工ＭＡＲダイマーを含む構築物ＡｒＡｃｔ２ＡｆおよびＡｆＡｃｔ２Ａｆを用いた複数アラビドプシス形質転換イベントに対する相対ＧＵＳ活性を比較したグラフである。
【図７】 形質転換アラビドプシス植物におけるＧＵＳレポーター遺伝子の発現の範囲に対する人工ＭＡＲの効果を示すグラフである。
【配列表】
Claims (7)
- 配列番号１のｂｐ１１から３０９までを含んでなる単離されたＤＮＡ分子。
- ５’から３’への方向で、植物細胞内で機能性の転写開始領域、転写開始領域と協同して機能する構造遺伝子、３’非翻訳領域、および該転写開始領域に対して５’または該構造遺伝子に対して３’のいずれかに位置する配列番号１のｂｐ１１から３０９までを含んでなるマトリックス付着領域を含んでなるＤＮＡ構築物であって、該配列番号１のｂｐ１１から３０９までを含んでなる第一マトリックス付着領域が該転写開始領域に対して５’に位置し、そして配列番号１のｂｐ１１から３０９までを含んでなる第二マトリックス付着領域が該構造遺伝子に対して３’に位置する、上記のＤＮＡ構築物。
- マトリックス付着領域のそれぞれが、配列番号１のｂｐ１１から３０９までの２個またはそれ以上の縦列コピーを含んでなる、請求項２記載のＤＮＡ構築物。
- 細胞中に導入された構造遺伝子の増加した発現を有する組換え植物細胞を製造する方法において、再生可能な植物細胞を、５’から３’への方向で、植物細胞内で機能性の転写開始領域、転写開始領域と協同して機能する構造遺伝子、３’非翻訳領域、および該転写開始領域に対して５’または該構造遺伝子に対して３’のいずれかに位置する配列番号１のｂｐ１１から３０９までを含むトリックス付着領域を含んでなるＤＮＡ構築物を用いて形質転換することを特徴とする、上記の方法。
- ＤＮＡ構築物が、該転写開始領域に対して５’に位置する配列番号１のｂｐ１１から３０９までを含んでなる第一マトリックス付着領域、および該構造遺伝子に対して３’に位置する配列番号１のｂｐ１１から３０９までを含んでなる第二マトリックス付着領域を含む、請求項４記載の方法。
- 該第一および第二マトリックス付着領域がそれぞれ配列番号１のｂｐ１１から３０９までの２個またはそれ以上の縦列コピーを含んでなる、請求項５記載の方法。
- 配列番号１のｂｐ１１から３０９までのＤＮＡを含む形質転換された植物細胞。
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