JP2002027992A - ペチュニアの転写因子ＰｅｔＳＰＬ２の遺伝子の導入によって花序の節間を短縮させる方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【課題】 植物の形質、特に植物の高さおよび節間の長
さを変化させ得る転写因子をコードする遺伝子、当該遺
伝子の導入により植物の形質が変化した植物を作出する
方法、および当該方法により作出された植物を提供す
る。 【解決手段】 以下の（ａ）または（ｂ）のＤＮＡを含
む遺伝子：（ａ）ペチュニア由来の特定の塩基配列を有
するＤＮＡ：または（ｂ）（ａ）の塩基配列を有するＤ
ＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、
かつ植物の形質を変化させ得る転写因子をコードするＤ
ＮＡ。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、植物の形質を変化
させ得る転写因子をコードする遺伝子およびその利用に
関する。本発明は、特に、ペチュニア由来の新規遺伝子
であるＰｅｔＳＰＬ２遺伝子、およびその関連遺伝子、
ならびにそれらの利用に関する。

【０００２】

【従来の技術】植物の形質、例えば、花の形態形成の制
御機構を解明するため、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄ
ｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）、キンギョソウ（Ａｎ
ｔｉｒｒｈｉｎｕｍ ｍａｊｕｓ）、およびペチュニア
（Ｐｅｔｕｎｉａ ｈｙｂｒｉｄａ）などを用いて、分
子生物学的および分子遺伝学的に研究が行われている。
特に、ペチュニアは、研究材料として好んで使用されて
いる。その理由として、ペチュニアは、園芸植物として
価値が高く多種多様な品種が存在すること、形質転換し
易いこと、花が大きくて見やすいこと、および遺伝学的
な知見の蓄積が豊富であることが挙げられる（高辻博
志、「植物の形を決める分子機構」、細胞工学、植物細
胞工学シリーズ（秀潤社）、９６〜ｌ０６頁）。

【０００３】上記の植物の花の器官が変化した突然変異
体から、その変異の原因となる遺伝子が単離されてい
る。その結果、花の分化および形態形成の制御には、転
写因子が重要な役割を果たしていることが明らかになっ
てきた。例えば、シロイヌナズナのＳＵＰＥＲＭＡＮ
は、ＤＮＡ結合ドメインとしてジンクフィンガーモチー
フを有する転写因子である。その遺伝子に変異が生じて
いるＳＵＰＥＲＭＡＮ変異体では、雄しべの数が著しく
増加し、雌しべが退化することが知られている（遺伝、
１９９７年４月号（５１巻４号）、３４〜３８頁）。

【０００４】植物の形質の制御に関与する新規な転写因
子を同定することは、その制御の機構を理解するために
重要である。遺伝子工学的手法を用いれば、花の形態形
成などを制御する転写因子の遺伝子を植物に導入するこ
とができる。遺伝子導入により、従来の交配による手法
では得られないか、または得ることが困難である新規な
形質を花を有する植物に付与できる可能性がある。この
ような新規な形質を有する植物は、園芸上の価値が高い
と考えられる。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記課題の
解決を意図するものである。本発明の目的は、植物の形
質、特に植物の高さおよび節間の長さを変化させ得る転
写因子をコードする遺伝子を提供することにある。本発
明の他の目的は、遺伝子の導入により植物の形質が変化
した植物を作出する方法を提供することにある。本発明
のさらなる目的は、植物の形質が変化した植物を提供す
ることにある。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明は、以下の（ａ）
または（ｂ）のＤＮＡを含む遺伝子に関する： （ａ）配列番号１によって示される塩基配列の第１９０
位から第８０７位までの塩基配列を有するＤＮＡ；また
は （ｂ）（ａ）の塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェ
ントな条件下でハイブリダイズし、かつ植物の形質を変
化させ得る転写因子をコードするＤＮＡ。

【０００７】本発明はまた、以下の（ｉ）または（ｉ
ｉ）の転写因子をコードする遺伝子に関する： （ｉ）配列番号２によって示されるアミノ酸配列の第１
位から第２０６位までのアミノ酸配列を含む転写因子；
または （ｉｉ）アミノ酸配列（ｉ）において、１またはそれ以
上のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸
配列を有し、かつ植物の形質を変化させ得る転写因子。

【０００８】１つの実施態様においては、上記の植物の
形質は、植物の高さおよび節間の長さからなる群より選
択される。

【０００９】本発明はさらに、上記の遺伝子のいずれか
を植物細胞に導入する工程、およびこの遺伝子が導入さ
れた植物細胞を植物体に再生する工程を含む、植物の形
質が変化した植物を作出する方法に関する。

【００１０】１つの実施態様においては、上記の植物は
双子葉植物である。好ましくは、双子葉植物はナス科植
物であり、より好ましくは、ペチュニア属植物である。

【００１１】１つの実施態様においては、上記の遺伝子
は植物発現ベクターに組み込まれている。

【００１２】本発明はさらに、上記の方法のいずれか１
つに記載の方法により作出された、植物の形質が変化し
た植物に関する。

【００１３】

【発明の実施の形態】以下、本発明を詳しく説明する。

【００１４】「転写因子」は、遺伝子の調節領域のＤＮ
Ａに結合してｍＲＮＡの合成を制御するタンパク質をい
う。ある種の転写因子は、そのＤＮＡ結合ドメインにジ
ンクフィンガーモチーフと呼ばれる保存性の高いアミノ
酸配列を有することが知られている。

【００１５】本発明の遺伝子は、植物の形質を変化させ
得る転写因子をコードする遺伝子である。この遺伝子
は、以下のＤＮＡのいずれかを含み得る： （ａ）配列番号１によって示される塩基配列の第１９０
位から第８０７位までの塩基配列を有するＤＮＡ；およ
び （ｂ）（ａ）の塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェ
ントな条件下でハイブリダイズし、かつ植物の形質を変
化させ得る転写因子をコードするＤＮＡ。

【００１６】好ましくは、本発明の遺伝子は（ａ）のＤ
ＮＡを含み得る。

【００１７】本発明の遺伝子はまた、以下の転写因子の
いずれかをコードし得る： （ｉ）配列番号２によって示されるアミノ酸配列の第１
位から第２０６位までのアミノ酸配列を含む転写因子；
および （ｉｉ）アミノ酸配列（ｉ）において、１またはそれ以
上のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸
配列を有し、かつ植物の形質を変化させ得る転写因子。

【００１８】好ましくは、上記の遺伝子は（ｉ）の転写
因子をコードし得る。

【００１９】本発明において特に好ましい遺伝子は、Ｐ
ｅｔＳＰＬ２遺伝子である。この遺伝子のｃＤＮＡ配列
（配列番号１）および推定アミノ酸配列（配列番号２）
を図１に示す。

【００２０】「植物の形質」の変化とは、植物の形態の
少なくとも１つについての任意の変化をいう。植物の形
態は、好ましくは植物の高さおよび節間の長さの少なく
とも一方であるが、これらに限定はされない。この変化
は、本発明の遺伝子を導入して得られた植物の形質を、
遺伝子導入前の植物（野生種または園芸品種）の形質と
比較することにより評価される。

【００２１】変化した植物の高さとしては、矮性および
半矮性などが挙げられるが、これらに限定はされない。
矮性は、好ましくは、遺伝子導入前の植物の標準的な高
さの約１／２以下、より好ましくは約１／３以下の高さ
をいう。

【００２２】変化した節間の長さとしては、節間の短縮
が挙げられるが、これに限定はされない。節間の短縮に
は、生殖枝の節間（すなわち花序）および栄養枝の節間
（すなわち葉序）のいずれの短縮も含まれる。花序の短
縮は、特に好ましい変化の例である。節間の長さの変化
は、好ましくは、遺伝子導入前の植物の標準的な節間と
比較して約１／２以下、より好ましくは約１／５以下、
さらにより好ましくは約１／１０以下の短縮である。

【００２３】変化した植物の形質は、より好ましくは矮
性と節間の短縮との組合せであり、さらに好ましくは矮
性と花序の短縮との組合せである。

【００２４】本発明の遺伝子は、例えば、公知の転写因
子の遺伝子によりコードされるアミノ酸配列の保存領域
に対応するデジェネレートプライマー対を用いて、植物
のゲノミックＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、その
後、得られた増幅ＤＮＡ断片をプローブとして用いて同
じ植物のゲノミックライブラリーをスクリーニングする
ことにより単離され得る。そのようなプライマー対の例
として、５’−ＣＡＲＧＣＮＹＴＮＧＧＮＧＧＮＣＡＹ
−３’（配列番号３）または５’−ＹＴＮＧＧＮＧＧＮ
ＣＡＹＡＴＧＡＡＹ−３’（配列番号４）と５’−ＡＲ
ＮＣＫＮＡＲＹＴＣＮＡＲＲＴＣ−３’（配列番号５）
との組合せが挙げられる。ここで、Ｎはイノシンであ
り、ＲはＧまたはＡであり、ＹはＣまたはＴであり、そ
してＫはＴまたはＧである。

【００２５】ＰＣＲは、市販のキットおよび装置の製造
者の指針に基づいて行うか、当業者に周知の手法で行い
得る。遺伝子ライブラリーの作製法、プローブとのハイ
ブリダイゼーションに使用するストリンジェントな条
件、および遺伝子のクローニング法も当業者に周知であ
る。例えば、マニアティスらのＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃ
ｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａ
ｌ、第２版、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎ
ｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８９）を参
照のこと。

【００２６】得られた遺伝子の塩基配列は、当該分野で
公知のヌクレオチド配列解析法または市販されている自
動シーケンサーにより決定し得る。

【００２７】本発明の遺伝子は、天然から単離されたも
のに限定されず、合成ポリヌクレオチドも含み得る。合
成ポリヌクレオチドは、例えば、上記のようにして配列
決定された遺伝子を、当業者に周知の手法によって改変
することにより入手し得る。

【００２８】本発明の遺伝子は、当業者に周知の方法を
用いて、適切な植物発現ベクターに連結され、公知の遺
伝子組換え技術により、植物細胞に導入され得る。導入
された遺伝子は、植物細胞中のＤＮＡに組み込まれて存
在する。なお、植物細胞中のＤＮＡとは、染色体のみな
らず、植物細胞中に含まれる各種オルガネラ（例えば、
ミトコンドリア、葉緑体など）に含まれるＤＮＡを含
む。

【００２９】「植物」は、単子葉植物および双子葉植物
のいずれも含む。好ましい植物は、双子葉植物である。
双子葉植物は、離弁花亜綱および合弁花亜綱のいずれも
含む。好ましい亜綱は、合弁花亜綱である。合弁花亜綱
は、リンドウ目、ナス目、シソ目、アワゴケ目、オオバ
コ目、キキョウ目、ゴマノハグサ目、アカネ目、マツム
シソウ目、およびキク目のいずれも含む。好ましい目
は、ナス目である。ナス目は、ナス科、ハゼリソウ科、
ハナシノブ科、ネナシカズラ科、およびヒルガオ科のい
ずれも含む。好ましい科は、ナス科である。ナス科は、
ペチュニア属、チョウセンアサガオ属、タバコ属、ナス
属、トマト属、トウガラシ属、ホオズキ属、およびクコ
属などを含む。好ましい属は、ペチュニア属、チョウセ
ンアサガオ属、およびタバコ属であり、より好ましく
は、ペチュニア属である。ペチュニア属は、Ｐ．ｈｙｂ
ｒｉｄａ種、Ｐ．ａｘｉｌｌａｒｉｓ種、Ｐ．ｉｎｆｌ
ａｔａ種、およびＰ．ｖｉｏｌａｃｅａ種などを含む。
好ましい種は、Ｐ．ｈｙｂｒｉｄａ種である。「植物」
は、特に他で示さない限り、花および／または果実を有
する植物体および植物体から得られる種子を意味する。
「植物細胞」の例としては、葉および根などの植物器官
の細胞、カルスならびに懸濁培養細胞が挙げられる。

【００３０】「植物発現ベクター」は、本発明の遺伝子
の発現を調節するプロモーターなどの種々の調節エレメ
ントが宿主植物の細胞中で作動し得る状態で連結されて
いる核酸配列をいう。好適には、植物遺伝子プロモータ
ー、ターミネーター、薬剤耐性遺伝子、およびエンハン
サーを含み得る。発現ベクターのタイプおよび使用され
る調節エレメントの種類が、宿主細胞に応じて変わり得
ることは、当業者に周知の事項である。本発明に用いる
植物発現ベクターは、さらにＴ−ＤＮＡ領域を有し得
る。Ｔ−ＤＮＡ領域は、特にアグロバクテリウムを用い
て植物を形質転換する場合に遺伝子の導入の効率を高め
る。

【００３１】「植物遺伝子プロモーター」は、植物で発
現するプロモーターを意味する。構成的プロモーター、
および花を含む植物体の一部において選択的に発現する
プロモーターが好ましい。プロモーターの例としては、
カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓプ
ロモーター、およびノパリン合成酵素のプロモーターが
挙げられるが、これらに限定されない。

【００３２】「ターミネーター」は、遺伝子のタンパク
質をコードする領域の下流に位置し、ＤＮＡがｍＲＮＡ
に転写される際の転写の終結、およびポリＡ配列の付加
に関与する配列である。ターミネーターは、ｍＲＮＡの
安定性に寄与し、そして遺伝子の発現量に影響を及ぼす
ことが知られている。ターミネーターの例としては、Ｃ
ａＭＶ３５Ｓターミネーター、およびノパリン合成酵素
遺伝子のターミネーター（Ｔｎｏｓ）が挙げられるが、
これらに限定されない。

【００３３】「薬剤耐性遺伝子」は、形質転換植物の選
抜を容易にするものであることが望ましい。カナマイシ
ン耐性を付与するためのネオマイシンフォスフォトラン
スフェラーゼＩＩ（ＮＰＴＩＩ）遺伝子、およびハイグ
ロマイシン耐性を付与するためのハイグロマイシンフォ
スフォトランスフェラーゼ遺伝子などが好適に用いられ
得るが、これらに限定されない。

【００３４】「エンハンサー」は、目的遺伝子の発現効
率を高めるために用いられ得る。エンハンサーとして
は、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター内の上流側の配列を含
むエンハンサー領域が好適である。エンハンサーは、１
つの植物発現ベクターあたり複数個用いられ得る。

【００３５】本発明における植物発現ベクターは、当業
者に周知の遺伝子組換え技術を用いて作製され得る。植
物発現ベクターの構築には、例えば、ｐＢＩ系のベクタ
ーまたはｐＵＣ系のベクターが好適に用いられるが、こ
れらに限定されない。

【００３６】植物細胞への植物発現ベクターの導入に
は、当業者に周知の方法、例えば、アグロバクテリウム
を介する方法、および直接細胞に導入する方法が用いら
れ得る。アグロバクテリウムを介する方法としては、例
えば、Ｎａｇｅｌらの方法（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅ
ｔｔ．，６７，３２５（１９９０））が用いられ得る。
この方法は、まず、植物発現ベクターで（例えば、エレ
クトロポレーションによって）アグロバクテリウムを形
質転換し、次いで、形質転換されたアグロバクテリウム
をリーフディスク法等の周知の方法により植物細胞に導
入する方法である。植物発現ベクターを直接細胞に導入
する方法としては、エレクトロポレーション法、パーテ
ィクルガン、リン酸カルシウム法、およびポリエチレン
グリコール法などがある。これらの方法は、当該分野に
おいて周知であり、形質転換する植物に適した方法が、
当業者により適宜選択され得る。

【００３７】植物発現ベクターを導入された細胞は、例
えば、カナマイシン耐性などの薬剤耐性を基準として選
択される。選択された細胞は、常法により植物体に再生
され得る。

【００３８】再生した植物体においては、当業者に周知
の手法を用いて、導入された本発明の遺伝子の発現を確
認し得る。この確認は、例えば、ノーザンブロット解析
を用いて行い得る。具体的には、植物の葉から全ＲＮＡ
を抽出し、変性アガロースでの電気泳動の後、適切なメ
ンブランにブロットする。このブロットに、導入遺伝子
の一部分と相補的な標識したＲＮＡプローブをハイブリ
ダイズさせることにより、本発明の遺伝子のｍＲＮＡを
検出し得る。

【００３９】本発明の植物は、上記の手法によって作出
された、植物の形質が変化した形質転換植物である。変
化した植物の形質（すなわち、植物の高さおよび／また
は節間の長さ）は、公知の野生種または園芸品種には存
在しない形質であることが好ましい。また、変化した植
物の形質は、園芸上価値の高い形質であることが好まし
い。さらに、変化した植物の形質は、得られた植物の子
孫にわたって、安定に保持されることが好ましい。

【００４０】

【実施例】以下に実施例を挙げて、本発明を具体的に説
明する。この実施例で使用した制限酵素、プラスミドな
どは、商業的な供給源から入手可能である。

【００４１】（実施例１：ＰｅｔＳＰＬ２遺伝子の単
離）シロイヌナズナのＳＵＰＥＲＭＡＮ遺伝子にコード
されるタンパク質と、大豆の根粒に特異的に発現するＧ
ｍＮ４７９遺伝子（河内ら、私信）にコードされるタン
パク質とを比較した。両タンパク質に共通に存在するア
ミノ酸配列に基づいてＰＣＲに用いるデジェネレート・
プライマーを３種類作成した。遺伝子の５’側から３’
側に向かう二つのプライマーの塩基配列は、それぞれ
５’−ＣＡＲＧＣＮＹＴＮＧＧＮＧＧＮＣＡＹ−３’
（プライマー１、アミノ酸配列ＱＡＬＧＧＨに対応す
る；配列番号３）および５’−ＹＴＮＧＧＮＧＧＮＣＡ
ＹＡＴＧＡＡＹ−３’（プライマー２、アミノ酸配列Ｌ
ＧＧＨＭＮに対応する；配列番号４）であり、３’側か
ら５’側に向かうプライマーの塩基配列は５’−ＡＲＮ
ＣＫＮＡＲＹＴＣＮＡＲＲＴＣ−３’（プライマー３、
アミノ酸配列ＤＬＥＬＲＬに対応する；配列番号５）で
ある。ここで、Ｎはイノシンであり、ＹはＣまたはＴで
あり、ＲはＧまたはＡであり、そしてＫはＴまたはＧで
ある。

【００４２】Ｂｏｕｔｒｙ，Ｍ．ａｎｄ Ｃｈｕａ
Ｎ．Ｈ．（１９８５）ＥＭＢＯ Ｊ．４，２１５９−２
１６５に記載の方法に従って抽出したペチュニア（Ｐｅ
ｔｕｎｉａ ｈｙｂｒｉｄａ ｖａｒ．Ｍｉｔｃｈｅｌ
ｌ）のゲノミックＤＮＡを鋳型とし、プライマー１およ
びプライマー３を用いて、９４℃／１０分の後、９４℃
／３０秒、５０℃／３０秒、７２℃／６０秒を３０サイ
クルした後、７２℃／７分の条件で第一のＰＣＲを行っ
た。さらに第一のＰＣＲ産物の一部を鋳型にし、プライ
マー２およびプライマー３を用いて第２のＰＣＲを行っ
た（反応条件は第一のＰＣＲと同じ）。増幅されたＤＮ
Ａ断片をＴＡクローニングベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇ
ｅｎ製）に挿入し、常法に従って大腸菌に導入した。形
質転換された大腸菌からプラスミドを抽出し、ＤＮＡ塩
基配列を決定した。その結果、得られたＤＮＡ断片にお
いては、ＳＵＰＥＲＭＡＮおよびＧｍＮ４７９に共通に
含まれるジンクフィンガーモチーフの一部がコードされ
ていることがわかった。このＤＮＡ断片が由来した遺伝
子を、ＰｅｔＳＰＬ２遺伝子と名付けた。なお、この実
験において、ＰｅｔＳＰＬ２と類似の塩基配列を含む３
つの他のＤＮＡ（ＰｅｔＳＰＬ１、３および４遺伝子）
の存在が示された。ＰｅｔＳＰＬ３遺伝子については、
同一出願人による特願平１０−６５９２１を参照。

【００４３】ＰｅｔＳＰＬ２遺伝子のｃＤＮＡをクロー
ニングするために、上記のＤＮＡ断片およびＧＥＮＥＴ
ＲＡＰ ｃＤＮＡ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（ＢＲ
Ｌ社製）を用いて、ｐＳＰＯＲＴプラスミドベクター
（ＢＲＬ社製）中に作製されたペチュニア（Ｐｅｔｕｎ
ｉａ ｈｙｂｒｉｄａ ｖａｒ．Ｍｉｔｃｈｅｌｌ）の
花のつぼみのｃＤＮＡライブラリー（ＢＲＬ社製キット
による）をスクリーニングし、数個のクローンを得た。
このようにして、ペチュニア由来のＰｅｔＳＰＬ２遺伝
子のｃＤＮＡを単離した。

【００４４】（実施例２：ＰｅｔＳＰＬ２遺伝子の塩基
配列およびアミノ酸配列の解析）実施例１で得られたク
ローンのうち最長のクローンに含まれる約１．０ｋｂの
ＰｅｔＳＰＬ２遺伝子ｃＤＮＡ断片のＤＮＡ塩基配列を
決定した（配列番号１）。得られたＤＮＡ塩基配列に含
まれるオープンリーディングフレームから、タンパク質
アミノ酸配列を推定した（配列番号２）。

【００４５】塩基配列の解析により、ＰｅｔＳＰＬ２遺
伝子は、ＳＵＰＥＲＭＡＮ遺伝子、ＰｅｔＳＰＬ１遺伝
子、およびＰｅｔＳＰＬ４遺伝子に対して、それぞれ、
５８％、６７％、および５１％の塩基配列相同性を示し
た。ＰｅｔＳＰＬ２遺伝子とＰｅｔＳＰＬ３遺伝子と
は、２５％の塩基配列相同性を示した。なお、塩基配列
の解析は、各遺伝子のコード領域のみで行った。

【００４６】アミノ酸配列解析の結果、ＰｅｔＳＰＬ２
は、ＳＵＰＥＲＭＡＮと類似のＴＦＩＩＩＡタイプのジ
ンクフィンガーモチーフを１個含んでいた。このことか
ら、ＰｅｔＳＰＬ２は転写因子であることが推定され
た。ＰｅｔＳＰＬ２は、ＳＵＰＥＲＭＡＮおよびＰｅｔ
ＳＰＬ３に対して、全アミノ酸配列レベルで、それぞれ
３７％および２３％の相同性を示した。

【００４７】表１は、ＳＵＰＥＲＭＡＮおよび各Ｐｅｔ
ＳＰＬのジンクフインガーモチーフにおけるアミノ酸配
列を比較する。ジンクフィンガーモチーフにおける、Ｐ
ｅｔＳＰＬ２のＳＵＰＥＲＭＡＮに対するアミノ酸配列
相同性（約１００％）は、ＰｅｔＳＰＬ１のＳＵＰＥＲ
ＭＡＮに対する対応する相同性（約１００％）と同じで
あり、ＰｅｔＳＰＬ３のＳＵＰＥＲＭＡＮに対する対応
する相同性（約７６％）と比較して高いことが示された
（ここで、ジンクフィンガーモチーフを表１の４番目の
Ｃから２４番目のＨまでとして、アミノ酸配列相同性を
計算した）。表１はまた、ＳＵＰＥＲＭＡＮおよび各Ｐ
ｅｔＳＰＬのＣ末端疎水性領域の比較を示す。

【００４８】

【表１】 上記の結果から、ＰｅｔＳＰＬ２は、ＰｅｔＳＰＬ３と
は別のクラスに属し、よりＳＵＰＥＲＭＡＮに類縁性の
高い新規な転写因子であることが推定される。

【００４９】（実施例３：ＰｅｔＳＰＬ２をコードする
ポリヌクレオチドを含む植物発現ベクターの構築）プラ
スミドｐＢＩ２２１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈから購入）中の
ＣａＭＶ ３５Ｓプロモーターを含むＤＮＡ断片（Ｈｉ
ｎｄＩＩＩ−ＸｂａＩ断片）およびＮＯＳターミネータ
ーを含むＤＮＡ断片（ＳａｃＩ−ＥｃｏＲＩ断片）を順
次プラスミドｐＵＣＡＰ（ｖａｎ Ｅｎｇｅｌｅｎ，
Ｆ．Ａ．ら、ＴｒａｎｓｇｅｎｉｃＲｅｓ．４：２８８
−２９０（１９９５））のマルチクローニングサイトに
挿入し、ｐＵＣＡＰ３５Ｓを作製した。一方、ＰｅｔＳ
ＰＬ２を含むｐＳＰＯＲＴ／ＰｅｔＳＰＬ２プラスミド
をＫｐｎＩサイトおよびＳａｃＩサイト（ベクター中の
サイト）で切断し、ｐＵＣＡＰ３５ＳのＫｐｎＩおよび
ＳａｃＩサイトの間に挿入した。さらにこの組換えプラ
スミドをＡｓｃＩおよびＰａｃＩで切断し、ＰｅｔＳＰ
Ｌ２をコードするＤＮＡ断片を、バイナリーベクターｐ
ＢＩＮＰＬＵＳ（ｖａｎ Ｅｎｇｅｌｅｎ，Ｆ．Ａ．
ら、（１９９５），前出）のＡｓｃＩおよびＰａｃＩサ
イトに導入した。

【００５０】構築されたＰｅｔＳＰＬ２遺伝子高発現ベ
クター（ｐＢＩＮ−３５Ｓ−ＰｅｔＳＰＬ２）は、図２
に示されるように、ＣａＭＶ ３５Ｓプロモーター領域
（Ｐ３５Ｓ：０．９ｋｂ）、本発明のＰｅｔＳＰＬ２を
コードするポリヌクレオチド（ＰｅｔＳＰＬ２；１．０
ｋｂ）、およびノパリン合成酵素のターミネーター領域
（Ｔｎｏｓ：０．３ｋｂ）を含んで構成されている。図
２のＰｎｏｓは、ノパリン合成酵素のプロモーター領
域、ＮＰＴＩＩはネオマイシンホスホトランスフェラー
ゼＩＩ遺伝子を示す。ＬＢおよびＲＢは、それぞれＴ−
ＤＮＡ ｌｅｆｔｂｏｒｄｅｒおよびＴ−ＤＮＡ ｒｉ
ｇｈｔ ｂｏｒｄｅｒを示す。

【００５１】（実施例４：ＰｅｔＳＰＬ２遺伝子のペチ
ュニア細胞への導入） （１）（アグロバクテリウム・チュメファシエンスの形
質転換） アグロバクテリウム・チュメファシエンスＬＢＡ４４０
４株（Ｃｌｏｎｔｅｃｈから購入）を２５０μｇ／ｍｌ
のストレプトマイシンと５０μｇ／ｍｌのリファンピシ
ンを含むＬ培地中、２８℃で培養した。Ｎａｇｅｌら
（１９９０）（前出）の方法に従って、この菌株の細胞
懸濁液を調製した。実施例３で構築したＰｅｔＳＰＬ２
遺伝子高発現ベクターを、エレクトロポレーションによ
り、上記菌株に導入した。

【００５２】（２）（ＰｅｔＳＰＬ２をコードするポリ
ヌクレオチドのペチュニア細胞への導入） 上記（１）で得られたアグロバクテリウム・チュメファ
シエンスＬＢＡ４４０４株を、ＹＥＢ培地（Ｄ．Ｍ．Ｇ
ｌｏｖｅｒ編、ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ，ＩＰＬ ＰＲ
ＥＳＳ，第２巻、７８頁）で振とう培養（２８℃，２０
０ｒｐｍ）した後、滅菌水で２０倍に希釈した。この希
釈液中で、ペチュニア（Ｐｅｔｕｎｉａｈｙｂｒｉｄａ
ｖａｒ．Ｍｉｔｃｈｅｌｌ）の葉片と共存培養した。
２〜３日後、カルベニシリンを含む培地で上記細菌を除
去し、その後、この葉片を２週間ごとに選択培地で継代
培養した。上記ＰｅｔＳＰＬ２遺伝子と共に導入された
ｐＢＩＮＰＬＵＳ由未のＮＰＴＩＩ遺伝子発現によるカ
ナマイシン抵抗性を指標として、形質転換されたペチュ
ニア細胞を選抜した。常法により、形質転換細胞からカ
ルスを誘導した後、植物体に再分化した。

【００５３】（実施例５：ＰｅｔＳＰＬ２形質転換植物
におけるＰｅｔＳＰＬ２遺伝子の発現）実施例４で得ら
れたＰｅｔＳＰＬ２形質転換ペチュニア１３個体の葉か
ら、全ＲＮＡを抽出した。抽出物１０μｇずつを変性ア
ガロース電気泳動によって展開し、常法に従ってＧｅｎ
ｅｓｃｒｅｅｎ ｐｌｕｓフィルター（Ｄｕｐｏｎｔ
製）にブロッティングした。ＤＩＧ ＲＮＡラベリング
キット（Ｂｏｅｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ製）を
用いて標識したＰｅｔＳＰＬ２アンチセンスＲＮＡを用
い、キットの指示に従ってハイブリダイゼーションおよ
びフィルターの洗浄を行った。洗浄後、フィルターをＸ
ＡＲフィルム（Ｋｏｄａｋ製）に常温で１時間露光し
た。図３は、１３個体からのＰｅｔＳＰＬ２遺伝子ｍＲ
ＮＡを検出した変性アガロースゲル電気泳動像のフルオ
ログラムを示す。独立の形質転換ペチュニア１３個体の
うち、４個体が高発現プロモーターによる制御によって
ＰｅｔＳＰＬ２ｍＲＮＡを高レベルに発現していること
が示された。

【００５４】（実施例６：ＰｅｔＳＰＬ２遺伝子を高レ
ベルに発現する形質転換ペチュニアの表現型）ＰｅｔＳ
ＰＬ２遺伝子を高レベルに発現する４個体の独立の形質
転換ペチュニアのうち、比較的発現レベルが低い１個体
を除く３個体において、以下のような共通した表現型が
観察された。植物体に見られる最も顕著な変化は、花序
の節間の短縮（節間伸長の抑制）およびそれに伴う矮化
である（図４、左はＰｅｔＳＰＬ２形質転換ペチュニ
ア、右は野生型ペチュニアを示す）。この変化は、栄養
成長期よりも生殖成長期（花序）においてより顕著に表
れた。花序の節間の長さは、野生型の十分の一以下にな
ることが示された（図５、左は野生型ペチュニアの節
間、右はＰｅｔＳＰＬ２形質転換ペチュニアの節間を示
す）。その他、葉が丸みを帯び、花が少し小さいなどの
変化が見られた（図４）。

【００５５】花序の節間伸長の制御に関与する遺伝子と
してはシロイヌナズナのＥＲＥＣＴＡ遺伝子が報告され
ている（Ｔｏｒｉｉら、１９９６、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌ
ｌ，８：７３５）。しかし、ＥＲＥＣＴＡ遺伝子と本発
明のＰｅｔＳＰＬ２遺伝子との間には、塩基配列レベル
でもアミノ酸配列レベルでも有意な相同性は認められな
い。植物ホルモンの合成やその制御に関与する遺伝子の
中にも節間を短縮させる遺伝子（ｒｏｌＡなど）が知ら
れている。しかし、これらの植物ホルモン関連遺伝子
は、節間伸長の制御以外に多面的効果を示すことが知ら
れている（Ｄｅｈｉｏら、１９９３、Ｐｌａｎｔ Ｍｏ
ｌ．Ｂｉｏ．２３：１１９９）。

【００５６】上記の結果から、ＰｅｔＳＰＬ２形質転換
ペチュニアは節間の短縮により矮性となる結果、野生型
と比較して花姿が大幅に変化することが示された。従っ
て、ＰｅｔＳＰＬ２遺伝子の導入は、特に節間が伸長す
る傾向のある花卉または園芸品種について有用であるこ
とが理解される。花姿の大幅な変化は、植物に新たな鑑
賞価値をもたらし得る。また、草丈の抑制は、植物に耐
倒伏性を与える点で、大きな園芸上の価値を有し得る。
さらに、ＰｅｔＳＰＬ２遺伝子を導入した果樹は、樹形
がコンパクトになることが期待される。これは、果実の
収穫作業を効率化し得る点で有意義である。

【００５７】

【発明の効果】本発明によれば、植物の形態を変化させ
得る転写因子をコードする遺伝子が提供される。この遺
伝子を利用することにより、植物の形質が変化した植物
を作出し得る。作出された植物には、野生種および園芸
品種には存在しないか極めてまれである形質が付与され
るため、園芸上有用である。

【００５８】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> National Institute of Agrobiological Resoueces, Ministry of Agricu lture, Forestry and Fisheries <120> Method for Shorting Internode of Inflorescence by Introducing Gene for Petunia transcription factor PetSPL2 <130> J101412280 <140> JP <141> 1998-08-07 <160> 7 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 997 <212> DNA <213> Petunia hybrida var.Mitchell <220> <221> CDS <222> (190)..(807) <400> 1 cccagtgcca ttttttctct ctagtcaagc tctctatatc atcatcacta ttcccttggc 60 tgcagtaaca ctcctattta accctcacaa aaaaattacc agagggcagc aaaaaatgct 120 tgaacataat tattatactt actattaagc tagatttcct cttgatcttg ctaggtttga 180 ctggagaaa atg gca ggc atg gat aga aac agt ttc aac agt aag tac ttc 231 Met Ala Gly Met Asp Arg Asn Ser Phe Asn Ser Lys Tyr Phe 1 5 10 aaa aac aaa agc atc atg gca aga cag atg gag tac ttg aat aac aac 279 Lys Asn Lys Ser Ile Met Ala Arg Gln Met Glu Tyr Leu Asn Asn Asn 15 20 25 30 aat ggc gac aat aac aac aac aat aat gtt aca agc tca tta cga gat 327 Asn Gly Asp Asn Asn Asn Asn Asn Asn Val Thr Ser Ser Leu Arg Asp 35 40 45 aat tat gga aat gaa gat cat tta ctt ggt gga cta ttc tct tgg cct 375 Asn Tyr Gly Asn Glu Asp His Leu Leu Gly Gly Leu Phe Ser Trp Pro 50 55 60 cca aga tct tat aca tgt agc ttt tgt aaa agg gaa ttt aga tct gct 423 Pro Arg Ser Tyr Thr Cys Ser Phe Cys Lys Arg Glu Phe Arg Ser Ala 65 70 75 caa gct ctt ggt gga cac atg aat gtt cat aga aga gat aga gcc att 471 Gln Ala Leu Gly Gly His Met Asn Val His Arg Arg Asp Arg Ala Ile 80 85 90 ttg aga caa tca cca cct aga gat att aat agg tat tct ctt cta aac 519 Leu Arg Gln Ser Pro Pro Arg Asp Ile Asn Arg Tyr Ser Leu Leu Asn 95 100 105 110 ctt aat ctt gaa cca aac cct aac ttt tac cct agt cat aac cct agt 567 Leu Asn Leu Glu Pro Asn Pro Asn Phe Tyr Pro Ser His Asn Pro Ser 115 120 125 ttt tca aga aaa ttc cca cct ttt gaa atg agg aaa tta gga aaa gga 615 Phe Ser Arg Lys Phe Pro Pro Phe Glu Met Arg Lys Leu Gly Lys Gly 130 135 140 gtt gtt cca aac aat cac ttg aaa agt gcc aga ggg cgt ttt gga gtt 663 Val Val Pro Asn Asn His Leu Lys Ser Ala Arg Gly Arg Phe Gly Val 145 150 155 gag aaa att gac tct ttc atg caa gaa aaa gaa tgt act act aca gtg 711 Glu Lys Ile Asp Ser Phe Met Gln Glu Lys Glu Cys Thr Thr Thr Val 160 165 170 atc aag aag tcc gag ttt cta aga ttg gac ttg gga att ggg ttg atc 759 Ile Lys Lys Ser Glu Phe Leu Arg Leu Asp Leu Gly Ile Gly Leu Ile 175 180 185 190 agt gaa tca aag gaa gat tta gat ctt gaa ctt cga ctg gga tcc act 807 Ser Glu Ser Lys Glu Asp Leu Asp Leu Glu Leu Arg Leu Gly Ser Thr 195 200 205 taactatatc taatttttac ggcattaagg tttgtaaatt gagtcgacag cttagtcaaa 867 actacttatg cactttaata tggcttcttg tgctatattt atttatttta catggctgta 927 tctaggtttg cattttaaga tttagtacct tgtcagatta aaagaaaacg aaagttaaat 987 taaaaaaaaa 997 <210> 2 <211> 206 <212> PRT <213> Petunia hybrida var.Mitchell <400> 2 Met Ala Gly Met Asp Arg Asn Ser Phe Asn Ser Lys Tyr Phe Lys Asn 1 5 10 15 Lys Ser Ile Met Ala Arg Gln Met Glu Tyr Leu Asn Asn Asn Asn Gly 20 25 30 Asp Asn Asn Asn Asn Asn Asn Val Thr Ser Ser Leu Arg Asp Asn Tyr 35 40 45 Gly Asn Glu Asp His Leu Leu Gly Gly Leu Phe Ser Trp Pro Pro Arg 50 55 60 Ser Tyr Thr Cys Ser Phe Cys Lys Arg Glu Phe Arg Ser Ala Gln Ala 65 70 75 80 Leu Gly Gly His Met Asn Val His Arg Arg Asp Arg Ala Ile Leu Arg 85 90 95 Gln Ser Pro Pro Arg Asp Ile Asn Arg Tyr Ser Leu Leu Asn Leu Asn 100 105 110 Leu Glu Pro Asn Pro Asn Phe Tyr Pro Ser His Asn Pro Ser Phe Ser 115 120 125 Arg Lys Phe Pro Pro Phe Glu Met Arg Lys Leu Gly Lys Gly Val Val 130 135 140 Pro Asn Asn His Leu Lys Ser Ala Arg Gly Arg Phe Gly Val Glu Lys 145 150 155 160 Ile Asp Ser Phe Met Gln Glu Lys Glu Cys Thr Thr Thr Val Ile Lys 165 170 175 Lys Ser Glu Phe Leu Arg Leu Asp Leu Gly Ile Gly Leu Ile Ser Glu 180 185 190 Ser Lys Glu Asp Leu Asp Leu Glu Leu Arg Leu Gly Ser Thr 195 200 205 <210> 3 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <220> <221> modified base <222> (6) <223> i <220> <221> modified base <222> (9) <223> i <220> <221> modified base <222> (12) <223> i <220> <221> modified base <222> (15) <223> i <400> 3 cargcnytng gnggncay 18 <210> 4 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <220> <221> modified base <222> (3) <223> i <220> <221> modified base <222> (6) <223> i <220> <221> modified base <222> (9) <223> i <400> 4 ytnggnggnc ayatgaay 18 <210> 5 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <220> <221> modified base <222> (3) <223> i <220> <221> modified base <222> (6) <223> i <220> <221> modified base <222> (12) <223> i <400> 5 arncknaryt cnarrtc 17 <210> 6 <211> 887 <212> DNA <213> Petunia hybrida var.Mitchell <220> <221> CDS <222> (90)..(728) <400> 6 tctacaaggc aataacaagt tatagtatca tctttctttt attaccttta tagaactatc 60 atttttccac cgttgactct ctctctcta atg gaa act agt aaa aat cag ccg 113 Met Glu Thr Ser Lys Asn Gln Pro 1 5 tct gtc tca gaa aat gtt gat cag cag aaa gta gat aac tct tct tca 161 Ser Val Ser Glu Asn Val Asp Gln Gln Lys Val Asp Asn Ser Ser Ser 10 15 20 gat gaa caa caa att tca att atc caa agc agc cat act act aaa tcc 209 Asp Glu Gln Gln Ile Ser Ile Ile Gln Ser Ser His Thr Thr Lys Ser 25 30 35 40 tat gag tgc aac ttt tgt aaa aga ggt ttt tct aac gca caa gca ctt 257 Tyr Glu Cys Asn Phe Cys Lys Arg Gly Phe Ser Asn Ala Gln Ala Leu 45 50 55 ggt ggc cac atg aat atc cat cgt aag gac aag gcc aaa ctc aaa aaa 305 Gly Gly His Met Asn Ile His Arg Lys Asp Lys Ala Lys Leu Lys Lys 60 65 70 caa aag cag cat caa cga caa caa aaa cct acc tcg gtt tcc aaa gaa 353 Gln Lys Gln His Gln Arg Gln Gln Lys Pro Thr Ser Val Ser Lys Glu 75 80 85 acc aac atg gct cac aat atc ttg cta gcg gat gat tct aac atc cct 401 Thr Asn Met Ala His Asn Ile Leu Leu Ala Asp Asp Ser Asn Ile Pro 90 95 100 acc aca atc ccc ttt ttt cct tct ctt aca tca cca aac aca tcc aac 449 Thr Thr Ile Pro Phe Phe Pro Ser Leu Thr Ser Pro Asn Thr Ser Asn 105 110 115 120 cct tta ggg ttc gtg tct tct tgc act act gca gac acc gtc ggg caa 497 Pro Leu Gly Phe Val Ser Ser Cys Thr Thr Ala Asp Thr Val Gly Gln 125 130 135 aga cag att caa gat cta aac tta gtc atg ggt tca act ctt aac gtt 545 Arg Gln Ile Gln Asp Leu Asn Leu Val Met Gly Ser Thr Leu Asn Val 140 145 150 ctc aga atg aat agt gtt gaa gcg ggt tct gtt gat tca cgt gaa aat 593 Leu Arg Met Asn Ser Val Glu Ala Gly Ser Val Asp Ser Arg Glu Asn 155 160 165 aga ttg ccg gct aga aat caa gaa act aca cca ttt tac gcg gaa ttg 641 Arg Leu Pro Ala Arg Asn Gln Glu Thr Thr Pro Phe Tyr Ala Glu Leu 170 175 180 gac ctt gag ctg cga tta ggt cat gag cct gca cct tcc acg gat ata 689 Asp Leu Glu Leu Arg Leu Gly His Glu Pro Ala Pro Ser Thr Asp Ile 185 190 195 200 tca tca gct aat tcg ggt tta ggc aca aga aag ttc tta tgatttattg 738 Ser Ser Ala Asn Ser Gly Leu Gly Thr Arg Lys Phe Leu 205 210 gtactattgc tgctaaatgc tttttctttt tactactgtt tagggttttt ttgtgactat 798 gatactactt ttgctacatc tgaattgtct tgaactcttt tattcagagt tcttggattt 858 tgctttgctt gttttaatct ggctctaga 887 <210> 7 <211> 213 <212> PRT <213> Petunia hybrida var.Mitchell <400> 7 Met Glu Thr Ser Lys Asn Gln Pro Ser Val Ser Glu Asn Val Asp Gln 1 5 10 15 Gln Lys Val Asp Asn Ser Ser Ser Asp Glu Gln Gln Ile Ser Ile Ile 20 25 30 Gln Ser Ser His Thr Thr Lys Ser Tyr Glu Cys Asn Phe Cys Lys Arg 35 40 45 Gly Phe Ser Asn Ala Gln Ala Leu Gly Gly His Met Asn Ile His Arg 50 55 60 Lys Asp Lys Ala Lys Leu Lys Lys Gln Lys Gln His Gln Arg Gln Gln 65 70 75 80 Lys Pro Thr Ser Val Ser Lys Glu Thr Asn Met Ala His Asn Ile Leu 85 90 95 Leu Ala Asp Asp Ser Asn Ile Pro Thr Thr Ile Pro Phe Phe Pro Ser 100 105 110 Leu Thr Ser Pro Asn Thr Ser Asn Pro Leu Gly Phe Val Ser Ser Cys 115 120 125 Thr Thr Ala Asp Thr Val Gly Gln Arg Gln Ile Gln Asp Leu Asn Leu 130 135 140 Val Met Gly Ser Thr Leu Asn Val Leu Arg Met Asn Ser Val Glu Ala 145 150 155 160 Gly Ser Val Asp Ser Arg Glu Asn Arg Leu Pro Ala Arg Asn Gln Glu 165 170 175 Thr Thr Pro Phe Tyr Ala Glu Leu Asp Leu Glu Leu Arg Leu Gly His 180 185 190 Glu Pro Ala Pro Ser Thr Asp Ile Ser Ser Ala Asn Ser Gly Leu Gly 195 200 205 Thr Arg Lys Phe Leu 210

【図面の簡単な説明】

【図１】ＰｅｔＳＰＬ２遺伝子の塩基配列および推定ア
ミノ酸配列を示す。

【図２】ＰｅｔＳＰＬ２遺伝子高発現ベクター（ｐＢＩ
Ｎ−３５Ｓ−ＰｅｔＳＰＬ２）の概略を示す。

【図３】ＰｅｔＳＰＬ２形質転換ペチュニアにおいてＰ
ｅｔＳＰＬ２遺伝子のｍＲＮＡを検出した変性アガロー
スゲル電気泳動像のフルオログラムを示す。

【図４】（左）ＰｅｔＳＰＬ２形質転換ペチュニアの植
物体と（右）野生型ペチュニアの植物体とを撮影した生
物の形態を示す写真を示す。

【図５】（左）野生型ペチュニアの節間と（右）Ｐｅｔ
ＳＰＬ２形質転換ペチュニアの節間を撮影した生物の形
態を示す写真を示す。

フロントページの続き Ｆターム(参考） 2B030 AA02 AB03 AD11 CA06 CA17 CA19 CB02 CD03 CD07 CD09 CD13 CD14 CD17 4B024 AA08 AA20 BA80 CA04 CA09 CA20 DA01 EA04 FA02 FA20 GA11 GA14 GA17 GA27 HA20 4B065 AA11X AA88X AA88Y AC14 AC20 BA03 BA25 BD50 CA53

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 以下の（ａ）または（ｂ）のDNAを含む
   遺伝子： （ａ）配列番号１によって示される塩基配列の第１９０
   位から第８０７位までの塩基配列を有するDNA；または （ｂ）（ａ）の塩基配列を有するDNAとストリンジェン
   トな条件下でハイブリダイズし、かつ植物の形質を変化
   させ得る転写因子をコードするDNA。