KR100443488B1 - 에틸렌 합성을 조절하는 신규한 유전자 - Google Patents

Abstract

서열 목록에서 서열번호 2의 포지션 1(Met)로부터 405(Gln)까지 아미노산 서열을 엔코드하는 올리고뉴클레오타이드, 또는 아미노산 서열에서 하나 또는 여러 아미노산 삭제, 치환 또는 첨가를 지닌 두 번째 아미노산 서열을 엔코드하는 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 에틸렌 합성을 조절할 수 있는 식물 유전자를 엔코드하는 올리고뉴클레오타이드

Description

에틸렌 합성을 조절하는 신규한 유전자{Novel gene regulating ethylene synthesis}

트랜스포존(transposon)은 동물, 이스트, 박테리아 및 식물의 게놈 어디에나 있는 돌연변이 유도 유전자이다. 트랜스포존은 그 전위(transposition) 메카니즘에 따라 두 개의 카테고리로 분류된다. 클래스 Ⅱ의 트랜스포존은 복제없이 DNA 형태로 전위된다. 클래스 Ⅱ 트랜스포존의 예는 옥수수(maize(Zea mays))의 Ac/Ds, Spm/dSpm 및 Mu 성분(Fedoroff, 1989, Cell 56, 181-191 ; Fedoroff et al., 1983, Cell 35, 235-242 ; Schiefelbein et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 4783-4787)과 금어초(Antirrhinum(Antirrhinum majus))의 Tam성분(Bonas et al., 1984, EMBO J, 3, 1015-1019)을 포함한다. 클래스 Ⅱ 트랜스포존은 트랜스포존 태깅(tagging)에 의하여 유전자 분리에 널리 이용된다. 그러한 기술은 트랜스포존의 성질을 이용한다. 즉, 트랜스포존은 게놈 내에서 전위되며 어떤 유전자로 들어가, 결과로써, 유전자에 의해 조절된 페노타입(phenotype)이 변하여 그러한 유전자는 기능적으로 수정된다. 그러한 페노타입 변화가 감지될 수 있다면, 영향을 받은 유전자는 분리될 수 있다(Bancroft et al., 1993, The Plant Cell, 5, 631-638 ; Colasanti et al., 1998, Cell, 93, 593-603 ; Gray et al., 1997, Cell, 89, 25-31 ; Keddie et al., 1998, The Plant Cell, 10, 877-887 ; Whitham et al., 1994, Cell, 78, 1101-1115).

클래스 Ⅰ의 트랜스포존은 또한 레트로트랜스포존(retrotransposon)이라 불린다. 레트로트랜스포존은 중개자인 RNA를 통해 복제 전위된다. 클래스 Ⅰ 트랜스포존은 원래 초파리(Drosophila)와 이스트에서 확인되고 특성화된다. 최근의 연구는 레트로트랜스포존이 어디에나 있으며 식물 게놈에서 우세함을 밝혀냈다(Bennetzen, 1996, Trends Microbiolo., 4, 347-353 ; Voytas, 1996, Science, 274, 737-738). 대부분의 레트로트랜스포존은 통합 가능하지만 전위 불가능한 유니트로 보인다. 최근에, 그러한 타입의 약간의 레트로트랜스포존은 손상, 병원균 공격 및 세포 배양과 같은 스트레스 조건하에서 활성화되는 것으로 보고되었다(Grandbastien, 1998, Trends in Plants Science, 3, 181-187 ; Wessler, 1996, Curr. Biol., 6, 959-961 ; Wessler et al., 1995, Curr. Opin. Genet.Devel., 5, 814-821). 예를 들면, 스트레스 조건하에서의 그러한 활성은 담배의 레트로트랜스포존인 Tnt1A 및 Ttol(Pouteau et al., 1994, Plant J., 5, 535-542 ; Takeda et al., 1988, Plant Mol. Biol., 36, 365-376)과 쌀의 레트로트랜스포존인 Tos17(Hirochika et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 7783-7788)에서 발견되었다.

쌀 레트로트랜스포존 Tos17은 식물에서 널리 연구된 클래스 Ⅰ 성분이다. Tos17은 Tyl-copia 그룹 레트로-성분의 리버스 트랜스크립타제 도메인의 보존된 아미노산 서열에 기초하여 준비된 변성한 프라이머를 이용한 RT-PCR에 의해 클론되었다(Hirochika et al., 1992, Mol. Gen. Genet., 233, 209-216). Tos17은 4.3 kb의 길이를 갖고 138 bp의 두 개의 동일한 LTRs(long terminal repeats)와 개시제 메티오닌 tRNA의 3' 말단에 상보적인 PBS(primer binding site)를 갖는다(Hirochika et al., 1996, supra). Tos17의 전사(transcription)는 조직 배양에 의해 강하게 활성화되며, Tos17의 카피 수는 배양 시간에 따라 증가한다. 게놈 연구 모델로써 동백나무(japonica) 변종인 니폰베어(Nipponbare)에서 그것의 초기 카피 수는 2이다. 조직 배양으로 재생된 식물에서, 그것의 카피 수는 5 내지 30으로 증가한다(Hirochika et al., 1996, supra). 이스트와 초파리에서 발견된 클래스 Ⅱ 트랜스포존과 달리, Tos17은 염색체에서 랜덤 전위되며 안정한 방법으로 돌연변이를 유도한다. 따라서, Tos17은 쌀에서 유전자의 기능을 분석하기 위한 리버스 유전학에서 유용한 수단을 제공한다(Hirochika, 1997, Plant Mol.Biol. 35, 231-240 ; 1999, Molecular Biology of Rice, K. Shimamoto Ed., Springer-Verlag, 43-58).

(발명의 요약)

본 발명은 Tos17을 이용해 제공된 신규한 식물 유전자를 제공한다.

발명자들은 새로이 전위된 Tos17 카피와 Tos17 타겟 사이트 측면에 위치한 서열을 지닌 식물의 페노타입을 근면하게 연구하고 체계적으로 분석하였다. 결과로써, 발명자들은 Tos17 삽입에 기인한 측면 뿌리의 억제된 성장을 지닌 쌀 돌연변이를 얻었으며 에틸렌 합성을 조절할 수 있는 신규한 유전자를 찾기 위해 Tos17 타겟 사이트를 검사하여, 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 서열 목록에서 서열번호 2의 포지션 1(Met)로부터 405(Gln)까지 아미노산 서열을 엔코드하는 올리고뉴클레오타이드, 또는 아미노산 서열에서 하나 또는 여러 아미노산 삭제, 치환 또는 첨가를 지닌 두 번째 아미노산 서열을 엔코드하는 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 에틸렌 합성을 조절할 수 있는 식물 유전자를 엔코드하는 올리고뉴클레오타이드에 관한 것이다.

바람직하게는, 올리고뉴클레오타이드는 쌀로부터 얻어진다.

바람직하게는, 올리고뉴클레오타이드는 서열 목록에서 서열번호 1로 표시된다.

한가지 면에서, 본 발명은 조절 서열에 유효하게 연결된 상기-기술된 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 벡터에 관한 것이다.

바람직하게는, 벡터는 pIG121-Hm-RF이다.

다른 면에서, 본 발명은 상기-기술된 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 식물과 상기-기술된 벡터로 형질 전환된 식물에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 상기-기술된 올리고뉴클레오타이드를 식물로 도입하는 단계를 포함하는 에틸렌 합성을 조절하기 위한 방법에 관한 것이다.

본 발명은 신규한 유전자에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 본 발명은 식물에서 에틸렌 합성을 조절하는 기능을 지닌 단백질을 엔코드하는 신규한 유전자에 관한 것이다.

도 1은 본 발명에 따른 올리고뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 서열을 나타내는 도표이다. 도면에서, 삼각형 마크는 인트론의 위치를 나타낸다. 괄호 안의 숫자는 인트론에서 뉴클레오타이드의 수를 나타낸다. 도면 중간에서 세 번째인트론 위의 아랫쪽 화살표는 Tos17 삽입의 위치를 나타낸다. 도면 아랫부분에 보이는 4개의 아랫쪽 화살표는 폴리아데닐레이션 사이트를 나타낸다. 밑줄친 부분은 소수성 잔기가 풍부한 영역을 나타낸다. 원으로 나타낸 아미노산 잔기는 RING 핑거 영역에서 보존된 Zn²⁺-결합 잔기를 나타낸다.

도 2는 컴플리멘테이션(complementation) 테스트에서 상보적인 벡터의 구조를 나타내는 도표이다.

도 3은 Tos17 삽입 돌연변이와 본 발명의 올리고뉴클레오타이드 도입으로 얻어진 형질 전환체에서 측면 뿌리의 성장을 나타내는 사진이다. 왼쪽으로부터, 콘트롤(야생형 쌀 뿌리), Tos17 삽입 돌연변이에서 측면 뿌리의 성장 및 본 발명의 올리고뉴클레오타이드 도입으로 얻어진 형질 전환체에서 측면 뿌리의 성장을 나타낸다. 야생형(왼쪽)에 비교하여, Tos17 삽입 돌연변이(중간)에서, 측면 뿌리의 성장은 중요하게 억제된다. 본 발명의 올리고뉴클레오타이드 도입으로 얻어진 형질 전환체(오른쪽)에서, 측면 뿌리의 성장은 야생형의 레벨로 회복되었다.

도 4는 측면 뿌리의 성장에서 에틸렌 전구체 ACC와 에틸렌 억제자 AgNO₃의 효과를 나타내는 도표이다. 왼쪽으로부터, 야생형 쌀의 측면 뿌리의 성장(처리되지 않은), 야생형 쌀(10^-4M ACC로 처리된), Tos17 삽입 돌연변이(처리되지 않은)및 Tos17 삽입 돌연변이(10^-7M AgNO₃으로 처리된)를 나타낸다. 야생형이 ACC로 처리되면, 측면 뿌리의 성장은 억제된다. Tos17 삽입 돌연변이가 AgNO₃으로 처리되면, 측면 뿌리의 성장은 정상 레벨로 회복되었다.

도 5는 야생형과 돌연변이에서 생산된 에틸렌 양 사이의 비교를 나타내는 도표이다.

(발명의 상세한 설명)

본 발명은 Tos17을 이용해 제공된 신규한 식물 유전자, 신규한 유전자를 포함하는 벡터, 신규한 유전자로 형질 전환된 식물과 신규한 유전자로 식물을 형질 전환하는 단계를 포함하는 식물을 향상시키기 위한 방법을 제공한다.

본 발명은 에틸렌 합성을 조절할 수 있는 식물 유전자를 엔코드하는 올리고뉴클레오타이드를 제공한다. 여기에 사용된 "에틸렌 합성을 조절할 수 있는" 용어는 식물의 에틸렌 생합성에 포함된 유전자 발현의 억제 또는 활성화를 나타낸다. "식물" 용어는 외떡잎식물(monocotyledon)과 쌍떡잎식물(dicotyledon)을 나타낸다.

에틸렌 합성을 조절할 수 있는 식물 유전자를 엔코드하는 본 발명에 따른 올리고뉴클레오타이드의 대표적인 예는 서열 목록에서 서열번호 2의 포지션 1(Met)로부터 405(Gln)까지 아미노산 서열을 엔코드하는 올리고뉴클레오타이드, 또는 아미노산 서열에서 하나 또는 여러 아미노산 삭제, 치환 또는 첨가를 지닌 아미노산 서열을 엔코드하는 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드를 포함한다.

에틸렌 합성을 조절할 수 있는 식물 유전자를 엔코드하는 본 발명의 올리고뉴클레오타이드는 올리고뉴클레오타이드가 식물에서 에틸렌 합성을 조절할 수 있는 한 서열 목록에서 서열번호 2의 포지션 303(Asp)로부터 376(Gly)까지 아미노산 서열과 적어도 80% 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 적어도 90% 서열 동일성, 더더욱 바람직하게는 적어도 95% 서열 동일성, 그리고 가장 바람직하게는 적어도 99% 서열 동일성을 지닌 올리고뉴클레오타이드를 포함한다. "서열 동일성" 용어는 관심있는 두 개의 올리고뉴클레오타이드가 동일한 서열을 지님을 나타낸다. 관심있는 두 개의 올리고뉴클레오타이드 서열 사이의 서열 동일성의 퍼센트(%)는 다음과 같이 계산된다 : 두 개의 올리고뉴클레오타이드 서열은 최적으로 정렬된다 ; 서열 사이의 동일한 핵산 염기(예를 들면, A, T, C, G, U 또는 I)를 지닌 서열 포지션은 카운트되고 매칭 포지션의 총 수는 매칭 포지션 수(matching position number)라 부른다 ; 그리고 매칭 포지션 수는 두 개의 올리고뉴클레오타이드 염기의 총 수로 나누어지고 결과는 100으로 곱해진다. 서열 동일성은 예를 들면 다음의 서열 분석 도구를 이용하여 계산될 수 있다 : Unix-based GCG Wisconsin Package(ProgramManual for the Wisconsin Package, Version 8, September 1994, Genetics Computer Group, 575 Science Drive Madison, Wisconsin, USA53711 ; Rice, P., (1996) Program Manual for EGCG Package, Peter Rice, The Sanger Centre, Hinxton Hall, Cambridge, CB10 1RQ, England) 및 ExPASy World Wide Web Server for Molecular Biology(Geneva University Hospital and University of Geneva, Geneva, Switzerland).

여기에 사용된 "조절 서열" 용어는 기능적 프로모터와 어느 다른 관련 전사 성분(예를 들면, 인핸서, CCAAT box, TATA box 와 SPI 사이트)과 같은 DNA 서열을 나타낸다.

여기에 사용된 "유효하게 연결된" 용어는 올리고뉴클레오타이드가 프로모터와 인핸서와 같은 유전자 발현을 조절하는 조절 성분에 연결되었음을 나타내며, 그러한 방법에서 올리고뉴클레오타이드에 의해 엔코드된 유전자는 호스트 세포에서 발현될 수 있다.

조절 서열의 타입과 종류가 호스트 세포에 따라 변함은 이 분야의 당업자에게 잘 알려져 있다. 이 분야의 당업자에게 잘 알려진 조절 서열의 예는 CaMV35S 프로모터와 노팔린 신타제(nopaline synthase) 프로모터를 포함한다. 유전자는 알려진 방법을 이용하여 식물로 도입될 수 있다. 그러한 알려진 방법의 예는 아그로박테리움(Agrobacterium)으로 중개되는 방법 또는 세포로 유전자를 직접 도입하는 방법을 포함한다. 아그로박테리움으로 중개되는 방법의 예는 Nagel et al.의 방법이다(Microbiol. Lett., 67, 325(1990)). 이 방법에서, 예를 들면, 발현 벡터는 일렉트로포레이션(electroporation)을 이용하여 아그로박테리움으로 처음 도입되며, 변형된 아그로박테리움은 Plant Molecular Biology Manual에 기술된 방법에 따라 식물 세포로 도입된다(S.B. Gelvin et al., Academic Press Publishers). 세포로 유전자를 직접 도입하기 위해 알려진 방법의 예는 일렉트로포레이션 방법과 유전자 건(gun) 방법을 포함한다.

유전자-도입된 세포는 하이그로마이신(hygromycin) 저항성과 같은 약품 저항성에 대해 선택된 후, 일반적으로 사용되는 방법을 이용하여 식물 몸체로 재생된다.

일반적으로, 여기에 사용된 이름과 실험실 프로토콜은 이 분야에서 잘 알려져 있다. 재조합 기술, 폴리뉴클레오타이드 합성과 미생물 배양 및 형질 전환(예를 들면, 일렉트로포레이션)은 표준 기술 내에서 사용된다. 이러한 기술과 프로토콜은 이 분야의 다양한 일반 간행물과 이 명세서에서 기술된다(일반적으로, Sambrook et al., Molecular Cloning 참고 : A Laboratory Manual, 2nd Ed. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.). 이러한 간행물들은 참고문헌에 의해 여기에 포함된다.

본 발명의 올리고뉴클레오타이드는 여기 기술된 방법에 의해 대표적으로 얻어진다. 대안으로, 본 발명의 올리고뉴클레오타이드는 여기 개시된 서열에 기초하여 화학적 합성으로 얻어질 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 올리고뉴클레오타이드는 제조사가 제공한 명세서에 따라 올리고뉴클레오타이드 합성기(Applied Bio Systems 제조)를 이용하여 합성될 수 있다.

PCR 증폭 방법은 이 분야에서 잘 알려져 있다(PCR Technology : Principles and Applications for DNA Amplification, edited by HA Erlich, Freeman Press, New York, NY (1992) ; PCR Protocols : A Guide to Methods and Applications, edited by Innis, Gelfland, Snisky, and White, Academic Press, San Diego, CA (1990) ; Mattila et al. (1991) Nucleic Acids Res. 19 : 4967 ; Eckert, K.A. and Kunkel, T.A. (1991) PCR Methods and Applications 1 : 17 ; PCR, McPherson, Quirkes, and Taylor, IRL Press, Oxford). 이러한 간행물들은 참고문헌에 의해 여기에 포함된다.

본 발명은 다음의 실시예로 기술될 것이다. 본 발명은 하기 기술된 실시예로 예증되며 실시예에 한정되지 않는다.

(실시예 1) 배양에 의한 Tos17의 활성화와 결과 돌연변이의 특성화

동백나무(japonica) 변종인 니폰베어(Nipponbare)의 완전히 성숙한 종자는 상기 기술된 대로 캘러스 초기 배양과 세포 현탁 배양을 전도하기 위한 시작 물질로 사용되었다(Hirochika et al., 1996, supra). Tos17은 Otsuki 방법에 따라 활성화되었다(1990)(Rice protoplast culture, Agriculture, Forestry and Fisheries Technical information Society). 간단히, 완전히 성숙한 쌀 종자는 캘러스로의 유도를 위해 2,4-디클로로페녹시아세트산(2,4-D)(Otsuki (1990), supra)(25℃, 1개월)을 포함하는 MS 배지에서 배양되었다. 결과 캘러스는 2,4-D(Otsuki (1990), supra)를 포함하는 N6 액체 배지에서 5개월 동안 배양된 후 재생 배지로 옮겨졌다(Otsuki (1990), supra). 결과로써, 재생된 쌀(첫 번째 발생(R1) 식물)이 얻어졌다. 약 30개의 R1 종자가 결과 R1 쌀 각각에 대해 수확되었으며, 두 번째 발생(R2) 식물을 얻기 위해 토양 또는 MES 완충된 아가 배지(5 mM MES, pH 5.7 ; 0.5% 아가로즈)를 포함하는 화분에 뿌려져서 형태학적 분석이 행해졌다. 발아 1주일 후, R2 그룹에서 각 식물의 페노타입은 주의 깊게 검사되었다. 결과로써, 스트레인 LRD1의 R2 그룹의 약 1/3이 측면 뿌리의 성장에 결함을 지닌 것을 발견했다. 이는 측면 뿌리의 성장에서 LRD1 스트레인의 결함은 싱글 유전자 로커스(locus)의 열성 돌연변이에 의한 것임을 제안한다.

(실시예 2) Tos17에 의해 파열되는 유전자의 분석

측면 뿌리의 성장에서 실시예 1에서 얻어진 LRD1 스트레인의 결함은 싱글 유전자 로커스의 열성 돌연변이에 의한 것임을 증명하기 위해, Tos17이 전위에 의해 삽입된 LRD1 스트레인의 타겟 사이트(Ts) 측면에 위치한 사이트가 처음으로 증폭된다.

1. Tos17이 새로이 전위된 사이트 측면에 위치한 서열의 증폭

DNA는 CTAB 방법을 이용하여 실시예 1에서 얻어진 R2 쌀(LRD1 스트레인)로부터 준비되었다(Murray and Thompson, 1980, Nucleic Acids Res., 8, 4321-4325). Tos17 타겟 사이트 서열은 상기 기술된 대로 총 DNA를 이용한 인버스 PCR에 의해 증폭되었다(Hirochika et al., 1996, supra ; Sugimoto et al., 1994, Plant J., 5, 863-871).

간단히, 새로운 Tos17 타겟 사이트를 갖는 재생된 식물로부터 약 1 ㎍의 총 DNA가 초기에 XhoⅠ/SalⅠ로 소화되었다. 소화된 DNA는 페놀/클로로포름 추출, 에탄올 침전, 12℃에서 오버나이트로 400 ㎕의 총 부피에서 T4 DNA 리가제를 이용한 리게이션(ligation)으로 정제되었다. 염과 ATP는 울트라 프리 G3-LGC 원심분리 유니트(Millipore)를 이용하여 리게이션 혼합물로부터 제거되었다. 결찰된DNA의 절반은 PCR에서 주형으로 사용되었다. 증폭 반응은 다음 두 세트의 프라이머를 이용한 2-단계 PCR로 수행되었다. 첫 번째 단계 : Tos17 LTR1, TTGGATCTTGTATCTTGTATATAC 와 Tos17 LTR3, CCAATGGACTGGACATCCGATGGG. 두 번째 단계 : Tos17 LTR-2, GCTAATACTATTGTTAGGTTGCAA 와 Tos17 LTR-4, CTGGACATGGGCCAACTATACAGT. Tos17이 삽입되지 않은 정상 식물의 타겟 사이트는 조직 배양되지 않고, 프라이머 TGAGTTCCCCTTGAGTCAGC 와 GTAGGACACTGGACAGTTGC 를 이용하여 증폭되었다. 그런 후, 각각의 인버스 PCR 산물은 pBluescript 벡터(Stratagene)로 클론되고 서열기(ABI, Model 377)를 이용하여 서열화 되었다.

LRD1 스트레인에서 Tos17의 측면에 위치한 서열의 서열화의 결과로써, Tos17 삽입에 대한 9개의 타겟 사이트(Ts)(Ts1 내지 Ts9)가 새로이 발견되었다.

2. 돌연변이 페노타입의 결합 분석과 Ts9 유전자 로커스의 파열

측면 뿌리의 성장이 억제된 LRD1 스트레인의 R2 그룹은 프로브로써 Ts9 플랭킹 서열을 이용한 서던 블랏팅(Southern blotting)으로 동시 분리 분석을 받게 되었다. 또한, 헤테로 타입 Ts9 플랭킹 영역(Tos17-삽입된 유전자와 정상 유전자를 포함하는)을 지닌 R2 식물의 자기-수분(self-pollination)으로 얻어졌던 R3 식물 그룹은 폴리머라제 체인 반응 키트(LA-PCR, TaKaRa Biomedicals)를 이용한 결합 분석을 받게 되었다. 다음 두 개의 프라이머 플랭킹 Ts9(Tos17이 새로이 전위된 타겟 사이트)가 디자인되었다 : 포워드 프라이머 : GCAGCTATTACTGTCCTGTC 와 리버스 프라이머 : CAAGTTAGGAGCGTCATGGA. 증폭 반응의 한 사이클은 다음과 같다. 초기 변성 : 96℃, 1분. 변성 : 98℃, 20초(30 사이클). 어닐링 : 57℃, 3분. 연장 : 72℃, 5분. LA-PCR에 의해, 770 bp의 증폭된 산물이 야생형 식물에 대해 얻어졌다 ; 5.1 kbp의 증폭된 산물이 측면 뿌리의 성장에 결함을 지닌 돌연변이 식물에 대해 얻어졌다 ; 증폭된 산물 양쪽은 헤테로 타입 식물에 대해 얻어졌다. 이는 R2와 R3 그룹에서 약 100개의 식물에 대해 확인되었으며, 측면 뿌리의 억제된 성장을 지닌 페노타입에 밀접하게 연결되었다. 따라서, 측면 뿌리의 성장에서 LRD1 스트레인의 결함은 싱글 유전자 로커스 Ts9의 열성 돌연변이에 의한 것임이 확인되었다.

3. cDNA 라이브러리와 게놈 라이브러리의 구조 및 Ts9의 특성화

야생형 쌀은 4주 동안 측면 뿌리의 성장이 억제되지 않은 토양에서 성장하였다. 야생형 쌀의 뿌리는 RNA를 준비하기 위해 다음과 같이 사용되었다. 처음에, 총 RNA는 ISOGEN 용액(Nippon gene)을 이용하여 뿌리로부터 추출되었다. 폴리(A) mRNA는 mRNA 정제 키트(Stratagene)에 포함된 올리고 (dt) 셀룰로즈 컬럼을 이용하여 총 RNA로부터 얻어졌다. 결과 폴리(A) mRNA는 λZAP-Ⅱ 벡터(Stratagene)에서 cDNA 라이브러리를 구조하기 위해 일반적으로 사용되는 방법을 이용하여 cDNA를 합성하는 데 사용되었다. 뿌리로부터의 cDNA 라이브러리는 5×10⁵플라크의 감염력을 지녔다. 양성 cDNA 인서트를 지닌 pBluescript 플라스미드는 Escherichia coli XL1-Blue MRF2 스트레인에서 인 비보(in vivo) 절개되었다.

게놈 라이브러리는 발명자들에 의해 이전에 준비되었다. 준비 방법은 하기에 간단하게 기술된다. 게놈 DNA는 Sau3AI로 부분적으로 소화되었으며, 결과 게놈 단편은 EMBL3 벡터로 삽입되었다(Frischauf et al., 1983, J. Mol. Biol., 170, 827-842).

이러한 라이브러리는 Molecular Cloning, A Laboratory Manual(Sambrook et al., 1989)에 기술된 방법에 따라 프로브로써 Ts9의 인버스 PCR 산물을 이용하여 스크린 되었다.

cDNA 라이브러리와 게놈 라이브러리로부터 얻어진 강한 신호를 지닌 클론은 Ts9 플랭킹 서열(Ts9F GGAACAGACAAAGAGCGAAC, Ts9R TTGCTGTCATGGCTGCTCCT)에 특이한 한쌍의 프라이머를 이용한 PCR과 아가로즈 전기영동에 의해 더욱 스크린 되었다.

강한 하이브리다이제이션 신호를 나타내는 4개의 cDNA 클론은 cDNA 라이브러리로부터 얻어졌다.

4개의 클론 중, 약 2 kb의 크기를 가진 가장 긴 cDNA가 377 서열기(Perkin Elmer)를 이용하여 반대 방향에서 서열화 되었다. 또한, cDNA는 오픈 리딩 프레임(ORF)과 BLAST(Altshul et al., 1997, Nucleic Acids Res., 25, 3389-3402)를 이용하여 상동성 분석에 행해졌고, Mac Vector 6.0 프로그램(Teijin system technology)을 이용하여 소수성 분석에 행해졌다.

서열 분석에 따라, 가장 긴 cDNA 클론은 2093 bp의 길이(서열번호 1)를 가지며, 그 3' 말단에서 4개의 다른 폴리아데닐레이션 사이트(포지션 1954, 1978, 2011 및 2093)를 가지는 것으로 발견되었다. Mac Vector 6.0 패키지를 이용한 mRNA의 분석에 따라, 405개의 아미노산(서열번호 2)으로 이루어진 단백질을 엔코드한 가장 긴 1215-bp 오픈 리딩 프레임이 확인되었다. 이 단백질은 초파리의 G1과 같은 다른 단백질에 존재하는 RING 핑거 부분을 포함하였다. 이 단백질은 OsRing1으로 나타내어진다. 2093 bp 서열을 도 1에 나타내었다. 대표적인 RING 핑거 부분은 7개의 시스테인 잔기와 1개의 히스티딘 잔기로 이루어진 도 1에 나타낸 서열의 뉴클레오타이드 1304 내지 1426 사이에 존재한다. 이러한 잔기들은 2개의 Zn+ 이온의 이온 결합에 집합적으로 포함되는 것으로 믿어진다. 시스테인 잔기와 히스티딘 잔기 사이의 거리는 다른 단백질에 존재하는 RING 핑거 부분에서 고도로 보존된다(Freemont et al., 1991, Cell, 64, 483-484). 네 번째 시스테인이 히스티딘 잔기로 대체되는 것을 제외하고, OsRing1의 시스테인-풍부 영역은 대표적인 RING 핑거 부분의 패턴에 실질적으로 매치한다. 이 특징은 배아 발달에 포함된 초파리멜라노가스터(melanogaster)의 G1 유전자(Bouchard and Cote, 1993, Gene, 125, 205-209)와 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana)의 ATL2 유전자(Martinez-Garia, 1996, Mol. Gen. Genet, 252, 587-598)에서 발견되었다.

OsRing1 단백질의 또다른 특징은 비극성 잔기가 우세하고(전체의 41.23%) 센터 주위에(아미노산 85 내지 108, 아미노산 119 내지 134, 아미노산 196 내지 225 및 아미노산 237 내지 272) 24, 16, 30과 36 잔기의 4개의 소수성 도메인이 있다는 것이다. 12개의 약한-친수성 잔기만이 세 번째와 네 번째 소수성 도메인 사이에 존재한다. 세 번째와 네 번째 소수성 도메인을 포함하는 도메인은 가장 큰 소수성 도메인으로 간주된다. 이러한 특징 면에서, 발명자들은 OsRing1 유전자가 멤브레인-결합 단백질을 엔코드하는 것으로 믿는다.

게놈 라이브러리로부터 얻어진 약간의 양성 게놈 클론의 구조는 제한 효소 소화와 EMBL3 벡터(LA-PCR, TaKaRa Biomedicals)의 말단 서열에 특이한 다음 쌍의 프라이머를 이용한 폴리머라제 체인 반응을 이용하여 분석되었다. EMBL3(포워드 방향) : ATGGTGTCCGACTTATGCCC 와 EMBL3(리버스 방향) : CTCGTCCGAGAATAACGAGT. 서열화는 상기-기술된 전체-길이 cDNA 말단 서열에 특이한 2개의 프라이머를 이용하여 수행되었다(포워드 : GAGAGCTACCTCGAATCGAA 와 리버스 방향 : GCTCAACTCAGGTGATCATC). 특히, 14 kb 삽입 단편을 포함하는 게놈 클론은 5.3-kb 단편을 발생하기 위해 HindⅢ와 SalⅠ으로 소화되었으며 다음에는 전체-길이 cDNA서열에 특이한 상기-기술된 프라이머를 이용하여 LA-PCR이 행해졌다. 단편은 전체-길이 오픈 리딩 프레임을 포함하는 것으로 확인되었다. OsRing1 유전자는 5개의 인트론을 가지며 Tos17은 세 번째 인트론에 삽입되었다는 것이 발견되었다.

(실시예 3) OsRing1 유전자의 발현 분석

측면 뿌리의 성장에 결함을 지닌 돌연변이에서 관찰되는 Tos17 삽입에 의한 OsRing1 유전자의 발현 억제가 분석되었다. 이 말단에, 그 발현 특징을 연구하기 위해 RNA는 돌연변이(호모)와 야생형 쌀 식물로부터 추출되고 노던(northern) 분석이 이어졌다.

이러한 라인의 종자는 물에서 7일 동안 발아된 후, 토양에서 2, 4 그리고 6주 동안 배양되었다. 총 RNA는 식물 각각의 뿌리와 잎, 성숙한 식물 각각의 줄기와 꽃 기관, 그리고 ISOGEN RNA 추출 용액(Nippongene)을 이용해 캘러스로부터 추출되었다. mRNA는 oligo dt-30 컬럼(Nippongene)을 이용하여 정제되었다. mRNA는 5%(v/v) 포름알데히드 용액을 포함하는 1.5% 아가로즈 겔을 이용하여 분리되었다. 또한, DNA는 CATB 방법(Rogers and Bendich, 1994)을 이용해 식물의 잎으로부터 추출되고, XbaⅠ으로 소화되었다. 약 2 ㎍의 폴리(A) RNA와 약 1 ㎍의 DNA는 전기영동 되었다. 프리하이브리다이제이션과 하이브리다이제이션은 Sambrook et al., 1989(supra)에 기술된 방법에 따라 프로브로써 Ts9 인버스 PCR 산물을 이용하여 68℃에서 0.5 M의 NaH₂PO₄-Na₂HPO₄(pH 7.2), 7% SDS, 200 ㎍의 칼프 티무스(calf thymus) DNA를 포함하는 용액에서 3시간과 12시간 동안 각각 행해졌다. 하이브리다이제이션 후, 필터는 55℃에서 0.5% SDS를 포함하는 2x SSC 용액에서 총 1시간 동안 두 번 세척되었다.

노던 분석의 결과로써(나타내지 않은), 측면 뿌리를 지닌 2주로부터 성숙한 야생형 쌀의 뿌리에서 OsRing1 유전자의 강한 발현이 검출되었다. OsRing1 유전자는 또한 꽃 기관에서 비교적 높은 레벨로 발현되었다. 그러나, OsRing1 유전자는 캘러스 배양에서 낮은 레벨로, 묘목으로부터 성숙한 식물 모든 스테이지의 식물에서 극히 낮은 레벨로 발현되었다.

측면 뿌리의 형성은 토양에서 성장한 4주된 식물의 모든 뿌리를 자르거나 측면 뿌리가 없는 화분에서 성장한 식물을 이용하여 모의실험 할 수 있다. 뿌리가 제거된 식물에서, 측면 뿌리 없는 초기 뿌리가 트랜스플랜테이션(transplantation) 후 1주일 슈트의 베이스에서 나타났으며, 2 내지 3주 후 여러 측면 뿌리가 초기 뿌리로부터 생산되었다. 노던 분석이 행해졌다. OsRing1 유전자는 초기 뿌리에서 매우 약하게 발현되지만 여러 측면 뿌리를 지닌 뿌리에서 매우 강하게 발현되는 것이 발견되었다. 이러한 결과는 OsRing1 유전자가 측면 뿌리의 형성 또는 성장에 밀접하게 연결되어 있음을 나타낸다.

측면 뿌리의 억제된 성장을 지닌 돌연변이에서, OsRing1은 Tos17 삽입에 기인하여 발현되지 않는다. 그러한 현상의 메카니즘은 PCR을 이용한 Tos17 삽입 사이트의 서열 업스트림을 합성함으로써 연구되었다. 노던 블랏팅 분석은 프로브로써 서열을 이용하여 수행되었다. 결과로써, 측면 뿌리의 억제된 성장을 지닌 돌연변이에서, OsRing1 서열로부터 기대되는 2.1 kb RNA는 검출되지 않고, 0.9 kb RNA가 검출되었다(나타내지 않은). 0.9 kb의 사이즈는 OsRing1 돌연변이의 cDNA 5' 말단으로부터 Tos17 삽입 사이트까지의 서열에 대응한다. 이는 OsRing1 발현이 Tos17 삽입에 기인하여 방해되었으며 RING 핑거 서열을 갖지 않은 부분적 OsRing1 mRNA가 돌연변이에 축적되었음을 나타낸다. Tos17에 기인하는 유전자 발현의 제거의 동일한 예는 Tos17 삽입에 기인하는 스트라이프(stripe) 돌연변이에서 보고되어졌다(M Yamasaki에 의해 개인적으로 전해진).

(실시예 4) OsRing1 유전자 도입을 이용한 컴플리멘테이션 테스트

1. 상보적인 벡터의 구조와 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)를 이용한 OsRing1 돌연변이의 형질 전환

전체-길이 OsRing1 유전자의 오픈 리딩 프레임을 포함하는 5.3 kb SalⅠ/HindⅢ 단편은 CaMV35S 프로모터의 다운스트림을 연결함으로써 pIG121-Hm으로 결합되었다(Akama et al., 1992, Plant Cell Rep., 12, 7-11)(도 2). 결과 벡터는 pIG121-Hm-RF로 나타내어진다. 아그로박테리움 투메파시엔스 EHA101 스트레인은 일렉트로포레이션에 의해 재조합 벡터로 형질 전환되고, 50 mg/l의 카나마이신과 하이그로마이신을 이용하여 스크린 되었다. 결과 아그로박테리움 스트레인은 다음 사용까지 냉동 보관되었다.

OsRing1 돌연변이의 종자는 1% 소디움 하이포클로라이트로 살균되고, 살균된 증류수로 5번 세척되었다. 종자는 3% 수크로즈, 0.3 g/l 카제인 하이드롤리세이트, 2.8 g/l 프롤린과 2.0 mg/l 2,4-D를 포함하는 N6 배지에 놓여지고, 5.0 g/l 겔란 검으로 고체화되었다(Chu et al., 1975, Sci. Sinica, 18, 659-668). 배지의 pH는 오토클레이브되기 전에 pH 5.8로 조정되었다. 종자는 어두운 곳 28℃에서 2주 동안 성장하여 약 2 mm의 크기를 지닌 작은 캘러스를 얻었다. 작은 캘러스는 배지를 유도하는 캘러스로 옮겨져 밝은 곳에서 4일 동안 배양되었다. 결과 캘러스는 아그로박테리움 감염되었다.

상기-기술된 동결 건조된 아그로박테리움은 50 mg/l의 카나마이신과 50 mg/l의 하이그로마이신을 포함하는 AB 배지에서 어두운 곳 22℃에서 3일 동안 배양되고, pH 7.2로 조정되고 15 g/l 아가로 고체화되었다(Chilton et al., 1974, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 71, 3672-3676). 아그로박테리움 박테리아는 수집되어 20 ㎍의 아세토시링곤(acetosyringone)(Hiei et al., 1994)을 포함하는 액체 AAM 배지(Hiei et al., 1994, Plant J., 6, 271-282)에 현탁되었다. 캘러스가 아그로박테리움으로 감염되도록 결과 현탁액은 상기-기술된 유도된 캘러스와 함께 어두운 곳 22℃에서 7일 동안 코-배양되었다. 결과 캘러스는 500 mg/l의 카르베니실린(carbenicillin)을 포함하는 배지를 유도하는 액체 캘러스로 5번 세척되고, 살균된 Whatman No. 1 필터 종이에서 건조되었다. 캘러스는 하이그로마이신-저항성 캘러스를 선택하기 위해 50 mg/l 하이그로마이신을 포함하는 배지를 유도하는 캘러스에서 3주 동안 배양되고, 30 g/l 수크로즈, 30 g/l 솔비톨, 2 g/l 카제인 하이드롤리세이트, 2 g/l 키네틴, 500 mg/l 카르베니실린, 50 mg/l 하이그로마이신과 5 g/l 겔 검을 포함하는 MS 기초 배지(pH 5.8)(Murashige and Skoog, 1962, Physiol. Plant., 15, 473-497)를 포함하는 재생 배지로 옮겨졌다.

형질 전환체는 옥신(auxin) 또는 NAA 없이 하이그로마이신을 포함하는 재생 배지에서 쉽게 재생되어, 토양으로 옮겨졌다. 도 3에 나타낸 바와 같이, 형질 전환체는 측면 뿌리의 정상 성장을 나타내었다. 이 결과는 OsRing1 유전자의 돌연변이가 측면 뿌리의 성장 억제의 원인이라는 결론을 이끌어 낸다.

(실시예 5) OsRing1 유전자의 기능 분석

측면 뿌리의 성장이 에틸렌에 의해 억제됨은 보고되어졌다(Jackson M.B., 1991, "Ethylene in root growth and development" in The Plant Hormone Ethylene, edited by A.K. Matto and J.C. Suttle, 159-181, CRC Press, BocaRaton, FL. ISBN 0-8493-4566-9). 돌연변이에서 측면 뿌리의 억제된 성장이 에틸렌과 관련된 것인지 연구되었다.

돌연변이 종자와 대응하는 야생형 자손은 1.0% 소디움 하이포클로라이트로 살균되고 세척된 후, 25℃에서 24시간 동안 물에 담가졌다. 종자는 10^-9내지 10^-5M 옥신(Sigma 제조), 10^-6내지 10^-3M ACC(1-아미노사이클로프로판-1-카르복시산 ; 에틸렌 합성 전구체, Sigma 제조), 또는 10^-10내지 10^-7M AgNO₃; 에틸렌 합성 억제자 존재와 부재시 형태학적 분석을 위해 어두운 곳 25℃에서 7일 동안 5 mM MES(2-[N-Morpholino]ethanesulfonic acid, C₆H₁₃NO₄S, Sigma 제조) 완충된 아가 배지(pH 5.8)에 수평으로 놓여졌다(Smalle J. et al., 1997, "Ethylene can stimulate Arabidopsis hypocotyl elongation in the light", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94 : 2756-2761). 이러한 종자의 뿌리는 클로랄 하이드레이트 용액으로 투명해진 포르말린-아세트산-알코올(FAA) 고정 용액으로 고정되고(Yadegari, R. et al., 1994, "Cell differentiation and morphogenesis are uncoupled in Arabidopsis raspberry embryos", Plant Cell 6 : 1713-1729), 차동 간섭 현미경(differential interference microscope)을 이용하여 관찰되었다.

결과로써, ACC(0.5% 아가(INA AGAR, Funakoshi))를 포함하는 발아 배지에 위치한 야생형 쌀에서, 측면 뿌리의 성장은 중요하게 억제되었다(도 4). 대조적으로, 7 내지 10 M AgNO₃를 포함하는 발아 배지에서 성장한 돌연변이에서, 측면 뿌리의 성장은 야생형의 레벨까지 향상되었다. 이 현상은 돌연변이에서 에틸렌 생산의 양이 뿌리에서 증가함을 제안한다.

(실시예 6) 에틸렌 생산량의 측정

야생형과 돌연변이의 각 기관에서 에틸렌 생산량은 가스 크로마토그래피를 이용하여 측정되었다.

어두운 곳 25℃에서 7일 동안 성장했던 싹(sprout)은 자엽초(coleoptile)(상기-그라운드 부분)와 뿌리로 나누어져, 50 mL 튜브로 로드되어 밀봉되고, 어두운 곳 25℃에서 배양되었다. 20시간 후, 주사기를 이용하여 샘플을 포함하는 각 튜브로부터 1 mL의 기체가 수집되었으며, 에틸렌의 양은 다음 조건하에서 가스 크로마토그래피(GC-8AIF, Shimazu Corporation 제조)로 측정되었다.

(가스 크로마토그래피에 대한 측정 조건)

컬럼 : 활성 알루미나, 컬럼 온도 : 60℃, 샘플 난방로의 온도 : 90℃, 검출기 : 불꽃 이온화 검출기(FID)(수소 흐름 속도 : 60 KPa, 공기 흐름 속도 : 50KPa), 캐리어 가스 : 질소, 캐리어 가스 흐름 속도 : 60 KPa. 이 경우에, 에틸렌의 리텐션 타임은 0.5분이었다.

결과를 도 5에 나타내었다. 도 5에 나타낸 바와 같이, 생산된 에틸렌의 양은 야생형에 비교하여 돌연변이에서 중요하게 증가되었다. 이 결과는 OsRing1 유전자가 뿌리에서 에틸렌 합성 억제의 원인임을 보여준다.

상기-기술된 실시예들은 본 발명의 다양한 면, 본 발명의 특정 올리고뉴클레오타이드의 제조 및 활용을 예증한 것이며 본 발명의 범위를 한정하려 한 것은 아니다.

식물 번식에 유용한, 에틸렌 합성을 조절할 수 있는 신규한 올리고뉴클레오타이드가 제공된다. 식물은 에틸렌 합성을 조절하기 위해 식물로 올리고뉴클레오타이드를 도입함으로써 제공된다. 식물은 다음의 특성들을 지닌다 : 측면 뿌리 성장의 가속화, 침수 저항성 및 과일과 꽃의 품질을 유지하기 위해 향상된 능력.

본 발명은 출원전 발명자들의 불가피한 사정에 의해 공지되었는바 이에 대한 신규성 상실의 예외 규정의 적용을 요구합니다. 본 발명은 제21회 일본 분자생물학회 연회 프로그램 및 강연 요지집에 일부 개시되어 있고, 동 학회는 1998년 12월 16일부터 1998년 12월 19일까지 파시피코 요코하마에서 개최되었으며 이러한 프로그램과 강연 요지의 간행은 1998년 11월 25일자로 발간되었습니다. 동 간행은 제21회 일본 분자생물학회 편집위원회와 동경대학 의과학연구소에서 간행하였으며 그 연락처는 재단법인 학회센터 간사이 오피스이고, 그 주소는 일본국 도요나가시 신센리 히가시마치 1-4-2의 센리라이프사이언스센터빌딩 14층이며 전화번호는 (06)873-2301이며 팩시밀리번호는 (06)873-2300입니다.

<110> National Institute of Agrobiological Sciences Bio-oriented Technology Research Advancement Institution <120> Novel gene regulating ethylene synthesis <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 2105 <212> DNA <213> Oryza Sativa var. Nipponbare <220> <221> CDS <222> (313)..(1527) <400> 1 gcgtaagaaa aataaaagga gaaaaaggaa tagagaaatt ggggaagaga gctacctcga 60 atcgaagctg cgatctccac ctggtgaaat aggagaattg atgaattgct gagatttggt 120 gattagaggg acctttgctg ctgaggcatt gaggtacact aaaagcaagg gtgtgaaaaa 180 ggcaacttca attgaaaaca tctacatatc taggaatgtc ctgaaactaa tgtgtggagt 240 aaacttctag tttattgctg tccgtcctgt tgggccacag tgcgaaggtc aggcagtagt 300 catccattac tg atg ggg gac tct gga aat gcc agt cat cgt gat 345 Met Gly Asp Ser Gly Asn Ala Ser His Arg Asp 1 5 10 cac acg atc gac ata ctg aga aat gat gca act ttc cca tca aca tct 393 His Thr Ile Asp Ile Leu Arg Asn Asp Ala Thr Phe Pro Ser Thr Ser 15 20 25 cat cag gat aat cat aat aac ttg gat gag ttg cac caa act aga ggg 441 His Gln Asp Asn His Asn Asn Leu Asp Glu Leu His Gln Thr Arg Gly 30 35 40 cct cta aat gat gtt cct cat gtc cca gaa agt tct gct agt gca act 489 Pro Leu Asn Asp Val Pro His Val Pro Glu Ser Ser Ala Ser Ala Thr 45 50 55 cct gca tct atc tcc cga aac gct tct ttt gca aga aga gat caa gaa 537 Pro Ala Ser Ile Ser Arg Asn Ala Ser Phe Ala Arg Arg Asp Gln Glu 60 65 70 75 cac cgt caa cca aat cct ttg aat tct ggc ttc tgg atc tca att gag 585 His Arg Gln Pro Asn Pro Leu Asn Ser Gly Phe Trp Ile Ser Ile Glu 80 85 90 ctt att gta agt tta agc cag att ata gca gct att act gtc ctg tca 633 Leu Ile Val Ser Leu Ser Gln Ile Ile Ala Ala Ile Thr Val Leu Ser 95 100 105 gta tca agg aac gag cat cct cat gct cct ttg gct cag tgg ctt att 681 Val Ser Arg Asn Glu His Pro His Ala Pro Leu Ala Gln Trp Leu Ile 110 115 120 ggt tat acg ata ggt tgt gtt gct act ctt cct cac ctt tat tgg cga 729 Gly Tyr Thr Ile Gly Cys Val Ala Thr Leu Pro His Leu Tyr Trp Arg 125 130 135 ttt ctc cac cgc aat cgg cag aac aca gag caa gaa tca aca aat cag 777 Phe Leu His Arg Asn Arg Gln Asn Thr Glu Gln Glu Ser Thr Asn Gln 140 145 150 155 gtt tca tct gaa agg gac gta tat gag cct aat tct tat gta gta gtt 825 Val Ser Ser Glu Arg Asp Val Tyr Glu Pro Asn Ser Tyr Val Val Val 160 165 170 tcg tct gct cat gga tca gaa gtt gtg gac agt ggt aat aat ggt gga 873 Ser Ser Ala His Gly Ser Glu Val Val Asp Ser Gly Asn Asn Gly Gly 175 180 185 gta gca agg att gca agt cca agg gtc tac gca ttg gtt gcg tgc ttc 921 Val Ala Arg Ile Ala Ser Pro Arg Val Tyr Ala Leu Val Ala Cys Phe 190 195 200 aaa ttg gct ctg gat tgt ttc ttt gct gtg tgg ttt gtt gtt ggg aat 969 Lys Leu Ala Leu Asp Cys Phe Phe Ala Val Trp Phe Val Val Gly Asn 205 210 215 gtg tgg ata ttc ggg ggc cgt act tct ctc cat gac gct cct aac ttg 1017 Val Trp Ile Phe Gly Gly Arg Thr Ser Leu His Asp Ala Pro Asn Leu 220 225 230 235 tac agg ctg tgc ata gta ttc ctt gca ttc ggc ttc atc ggc tat gcc 1065 Tyr Arg Leu Cys Ile Val Phe Leu Ala Phe Gly Phe Ile Gly Tyr Ala 240 245 250 ctg cct ttc atc cta tgt aca atg ata tgc tgc tgc cta ccc tgc att 1113 Leu Pro Phe Ile Leu Cys Thr Met Ile Cys Cys Cys Leu Pro Cys Ile 255 260 265 atc tcc atg atg ggc atc cac gag gat ttg gat ttt aac aga ggc gct 1161 Ile Ser Met Met Gly Ile His Glu Asp Leu Asp Phe Asn Arg Gly Ala 270 275 280 act gca gaa gca atc gat gcc ttg gtg gca tac aag ttc caa tcg aaa 1209 Thr Ala Glu Ala Ile Asp Ala Leu Val Ala Tyr Lys Phe Gln Ser Lys 285 290 295 aag ttt caa gat gga gaa gcg gga gaa gat aat ggt gga gta ttg gca 1257 Lys Phe Gln Asp Gly Glu Ala Gly Glu Asp Asn Gly Gly Val Leu Ala 300 305 310 315 gct gga aca gac aaa gag cga act att tct gca gaa gac gct gta tgc 1305 Ala Gly Thr Asp Lys Glu Arg Thr Ile Ser Ala Glu Asp Ala Val Cys 320 325 330 tgc atc tgc ttg tca aag ttc tca aac aac gaa gat cta cgg gag ctt 1353 Cys Ile Cys Leu Ser Lys Phe Ser Asn Asn Glu Asp Leu Arg Glu Leu 335 340 345 ccc tgc aat cat gtt ttc cac ttg gaa tgc gtc gat aaa tgg ctc aag 1401 Pro Cys Asn His Val Phe His Leu Glu Cys Val Asp Lys Trp Leu Lys 350 355 360 ata aac gca ctg tgc cct ctt tgc aag gct gac tta ggc ggc tcg acg 1449 Ile Asn Ala Leu Cys Pro Leu Cys Lys Ala Asp Leu Gly Gly Ser Thr 365 370 375 aat gct ccg gac tcg agc tcc agg agc agc cat gac agc aac aac agc 1497 Asn Ala Pro Asp Ser Ser Ser Arg Ser Ser His Asp Ser Asn Asn Ser 380 385 390 395 aga gtc agg aac gac gtc gag tca caa cag tag ctgctctcat gccctttccc 1550 Arg Val Arg Asn Asp Val Glu Ser Gln Gln 400 405 atgagcatgg ggatggaaca cattcttgac aatctacaaa ttggcatgca acttctcaag 1610 tccctttttt tttcagacag acttgaatag agcatttgcc tacactgctc tctggtgtta 1670 acccagaaac tcctatgagg ctgaggctat ggctatgagt tgctgcctgc agtttgttct 1730 gaactgaagt tgcctgtaag gctgtaacag attatagatg gtgttggaat agttatcatg 1790 atgatcacct gagttgagca tattaggttg ttgaggttaa ccttcaaccg gggaggttca 1850 atgtaattat ctccttgttt aggaaaaaat cccctcccct ttgtatttgc tcccttgtat 1910 agaaaacaac catttccatt gtatatcaga tcaattttgc ctgcattttg taaattcagt 1970 tagtaggcag agatttccca gcaatcatca agcggttgag caagtacaga ttagcagttg 2030 agtttatttt actgtaatgc aacaattata gatgatatta ccatgaaata atcatttgag 2090 cccaaaaaaa aaaaa 2105 <210> 2 <211> 405 <212> PRT <213> Oryza Sativa var. Nipponbare <400> 2 Met Gly Asp Ser Gly Asn Ala Ser His Arg Asp His Thr Ile Asp Ile 1 5 10 15 Leu Arg Asn Asp Ala Thr Phe Pro Ser Thr Ser His Gln Asp Asn His 20 25 30 Asn Asn Leu Asp Glu Leu His Gln Thr Arg Gly Pro Leu Asn Asp Val 35 40 45 Pro His Val Pro Glu Ser Ser Ala Ser Ala Thr Pro Ala Ser Ile Ser 50 55 60 Arg Asn Ala Ser Phe Ala Arg Arg Asp Gln Glu His Arg Gln Pro Asn 65 70 75 80 Pro Leu Asn Ser Gly Phe Trp Ile Ser Ile Glu Leu Ile Val Ser Leu 85 90 95 Ser Gln Ile Ile Ala Ala Ile Thr Val Leu Ser Val Ser Arg Asn Glu 100 105 110 His Pro His Ala Pro Leu Ala Gln Trp Leu Ile Gly Tyr Thr Ile Gly 115 120 125 Cys Val Ala Thr Leu Pro His Leu Tyr Trp Arg Phe Leu His Arg Asn 130 135 140 Arg Gln Asn Thr Glu Gln Glu Ser Thr Asn Gln Val Ser Ser Glu Arg 145 150 155 160 Asp Val Tyr Glu Pro Asn Ser Tyr Val Val Val Ser Ser Ala His Gly 165 170 175 Ser Glu Val Val Asp Ser Gly Asn Asn Gly Gly Val Ala Arg Ile Ala 180 185 190 Ser Pro Arg Val Tyr Ala Leu Val Ala Cys Phe Lys Leu Ala Leu Asp 195 200 205 Cys Phe Phe Ala Val Trp Phe Val Val Gly Asn Val Trp Ile Phe Gly 210 215 220 Gly Arg Thr Ser Leu His Asp Ala Pro Asn Leu Tyr Arg Leu Cys Ile 225 230 235 240 Val Phe Leu Ala Phe Gly Phe Ile Gly Tyr Ala Leu Pro Phe Ile Leu 245 250 255 Cys Thr Met Ile Cys Cys Cys Leu Pro Cys Ile Ile Ser Met Met Gly 260 265 270 Ile His Glu Asp Leu Asp Phe Asn Arg Gly Ala Thr Ala Glu Ala Ile 275 280 285 Asp Ala Leu Val Ala Tyr Lys Phe Gln Ser Lys Lys Phe Gln Asp Gly 290 295 300 Glu Ala Gly Glu Asp Asn Gly Gly Val Leu Ala Ala Gly Thr Asp Lys 305 310 315 320 Glu Arg Thr Ile Ser Ala Glu Asp Ala Val Cys Cys Ile Cys Leu Ser 325 330 335 Lys Phe Ser Asn Asn Glu Asp Leu Arg Glu Leu Pro Cys Asn His Val 340 345 350 Phe His Leu Glu Cys Val Asp Lys Trp Leu Lys Ile Asn Ala Leu Cys 355 360 365 Pro Leu Cys Lys Ala Asp Leu Gly Gly Ser Thr Asn Ala Pro Asp Ser 370 375 380 Ser Ser Arg Ser Ser His Asp Ser Asn Asn Ser Arg Val Arg Asn Asp 385 390 395 400 Val Glu Ser Gln Gln 405

Claims (7)

1. 에틸렌 합성을 조절할 수 있는 식물 유전자를 지니는 올리고뉴클레오타이드에 있어서, 서열번호 2의 포지션 1(Met)로부터 405(Gln)까지의 아미노산 서열을 코딩하는 올리고뉴클레오타이드
2. 제 1항에 있어서, 올리고뉴클레오타이드는 쌀로부터 얻어짐을 특징으로 하는 올리고뉴클레오타이드
3. 제 1항에 있어서, 올리고뉴클레오타이드는 서열 목록에서 서열번호 1로 표시됨을 특징으로 하는 올리고뉴클레오타이드
4. 제 1항에 따른 서열번호 1의 올리고뉴클레오타이드와 프로모터, 인핸서 등의 유전자 발현을 조절하는 조절 서열이 유효하게 연결되어 있는 벡터
5. 삭제
6. 제 4항에 따른 벡터로 형질 전환된 식물세포
7. 제 1항에 따른 올리고뉴클레오타이드를 식물로 도입하는 단계를 포함하는 에틸렌 합성을 조절하기 위한 방법