JP3521161B2 - ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼをコードするｄｎａ、それを含む組換えベクター及び形質転換植物 - Google Patents

ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼをコードするｄｎａ、それを含む組換えベクター及び形質転換植物

Info

Publication number
JP3521161B2
JP3521161B2 JP13600095A JP13600095A JP3521161B2 JP 3521161 B2 JP3521161 B2 JP 3521161B2 JP 13600095 A JP13600095 A JP 13600095A JP 13600095 A JP13600095 A JP 13600095A JP 3521161 B2 JP3521161 B2 JP 3521161B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
amino acid
acid sequence
ala
leu
gly
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
JP13600095A
Other languages
English (en)
Other versions
JPH0880197A (ja
Inventor
雅雄 新井
庄一 鈴木
宣彦 村井
パトリック・エム・フィネガン
ジェイムズ・エヌ・バーネル
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Japan Tobacco Inc
Original Assignee
Japan Tobacco Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority to JP13600095A priority Critical patent/JP3521161B2/ja
Application filed by Japan Tobacco Inc filed Critical Japan Tobacco Inc
Priority to US08/617,801 priority patent/US5880334A/en
Priority to AT95924518T priority patent/ATE286972T1/de
Priority to PCT/JP1995/001356 priority patent/WO1996001895A1/ja
Priority to KR1019960701223A priority patent/KR960705043A/ko
Priority to BR9506038A priority patent/BR9506038A/pt
Priority to AU28989/95A priority patent/AU686410B2/en
Priority to CN95190782A priority patent/CN1100874C/zh
Priority to EP95924518A priority patent/EP0723012B1/en
Priority to DE69533918T priority patent/DE69533918T2/de
Priority to CA002171470A priority patent/CA2171470A1/en
Publication of JPH0880197A publication Critical patent/JPH0880197A/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP3521161B2 publication Critical patent/JP3521161B2/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Fee Related legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8262—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield involving plant development
    • C12N15/8269—Photosynthesis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
    • C12N15/8245—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine involving modified carbohydrate or sugar alcohol metabolism, e.g. starch biosynthesis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/59—Biological synthesis; Biological purification

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ホスホエノールピルビ
ン酸カルボキシキナーゼ（以下、「ＰＣＫ」ということ
がある）遺伝子及びそれを含む組換えベクターに関す
る。
【０００２】
【従来の技術】ＰＣＫはホスホエノールピルビン酸をカ
ルボキシル化してオキザロ酢酸を生成する反応を可逆的
に触媒する酵素であり、ＡＴＰ依存性のもの（EC 4.1.
1.49)とＧＴＰ依存性のもの（EC 4.1.1.32)が知られて
いる。植物のＰＣＫはＡＴＰ依存性であり、光合成にお
いて二酸化炭素からデンプンを生成する過程で重要な役
割を果たしている。
【０００３】一方、Ｃ4 植物は、熱帯原産のイネ科を主
とするものであり、Ｃ3 植物に比べて強い日射、高温や
水分欠乏条件により良く適している。すなわち、光合成
に関しては、Ｃ4 植物の最大光合成速度はＣ3 植物にお
ける速度の約２倍であり、光合成が空気中の酸素によっ
て阻害されない。また、Ｃ3 植物の光合成が飽和に達す
る光を照射してもＣ4 植物の光合成は光飽和条件に達し
ない。さらに、光合成に最適な温度はＣ3 植物よりも高
温側にある。
【０００４】上述のように、植物のＰＣＫは光合成にお
いて重要な役割を果たしており、もし、Ｃ3 植物を形質
転換してＣ4 植物のＰＣＫを発現するようにすれば、光
合成速度の増大、日光の有効利用、高温における光合成
の増大等の効果を得ることができると期待される。しか
しながら、現在までのところ、Ｃ4 植物はもちろんのこ
と、植物のＰＣＫ遺伝子の全配列は決定されていない。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の目的
は、クローン化されたＣ4 植物のＰＣＫ遺伝子及び該遺
伝子を含む組換えベクター並びに該組換えベクターによ
り形質転換された植物を提供することである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本願発明者は、鋭意研究
の結果、Ｃ4 植物であるウロクロア・パニコイデス（Ur
ochloa panicoides)のＰＣＫ遺伝子をクローニングして
その全塩基配列及びそれによってコードされる全アミノ
酸配列を決定することに成功し、さらにＰＣＫ遺伝子を
含む組換えベクターを構築して該組換えベクターで植物
を形質転換し、該ＰＣＫ遺伝子を発現する形質転換植物
を得ることに成功し、本発明を完成した。
【０００７】すなわち、本発明は、配列表の配列番号
１、２若しくは３に示されるアミノ酸配列又は該アミノ
酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が付加、欠
失、挿入若しくは置換されておりかつホスホエノールピ
ルビン酸カルボキシキナーゼ活性を有するポリペプチド
をコードする、クローン化されたＤＮＡを提供する。さ
らに本発明は、上記本発明のＤＮＡを含み、宿主細胞中
で該ＤＮＡを発現することができる組換えベクターを提
供する。さらに、本発明は、上記本発明の組換えベクタ
ーで形質転換され、ホスホエノールピルビン酸カルボキ
シキナーゼを産生する植物を提供する。
【０００８】以下、本発明を詳細に説明する。
【０００９】本発明の遺伝子は、ウロクロア・パニコイ
デスの緑葉から常法によりｃＤＮＡライブラリーを作製
し、抗ＰＣＫ抗体を用いたイムノブロッティング法によ
りＰＣＫ産生クローンを同定することによりクローニン
グされた。また、該クローン中のｃＤＮＡインサートの
塩基配列を決定することにより塩基配列が決定され、か
つ、それによってコードされるアミノ酸配列が推定され
た。この推定アミノ酸配列を有するタンパク質の分子量
は、精製ＰＣＫの分子量と一致しており、ＰＣＫの全長
をコードしているものと考えられる。上記方法の詳細
は、下記実施例に記載されている。
【００１０】上記の方法により、配列表の配列番号１及
び２に示す塩基配列が決定された。本発明は、配列番号
１及び２に示すアミノ酸配列をコードする、クローン化
されたＤＮＡを提供するものである。さらに、下記実施
例において具体的に記載されているように、ウロクロア
・パニコイデスの、活性なＰＣＫのＮ末端を決定したと
ころ、配列番号１の第５７番目のセリン、同第６１番目
のグルタミン酸、同６６番目のロイシン、同６９番目の
グリシン又は同７５番目のグリシンをＮ末端とする活性
なＰＣＫが検出された。従って、ＰＣＫ活性が発揮され
るためには、少なくとも配列番号１の第７５番目のグリ
シン以降のアミノ酸配列があればよいことがわかる。ま
た、ウロクロア・パニコイデスより精製した活性を有す
るＰＣＫからは、配列番号１の第５７番目のセリンより
も上流のアミノ酸残基をＮ末端とするものが見つからな
かったことにより、配列番号１の第１番目のメチオニン
から第５６番目のアラニンまではＰＣＫタンパク質精製
過程において切り離されたものであると推定された。こ
のことは、下記実施例において、トランジットペプチド
をコードする領域として、イネゲノムＤＮＡより調製し
たイネのルビスコ小サブユニット中の配列を用い、その
下流にＰＣＫの第５７番目のセリン以降のポリペプチド
部分をコードするＤＮＡを結合したＤＮＡを発現させる
ことにより確認された。
【００１１】さらに、下記実施例において、配列番号１
及び２で示される各アミノ酸配列をＫｐｎＩ部位で接続
し（配列番号２のアミノ酸配列の一部が上流側）、さら
にその上流にイネのルビスコ小サブユニット由来のトラ
ンジットペプチドを結合したアミノ酸配列をコードする
ＤＮＡを構築した（配列番号３）。このアミノ酸配列の
５２番目のセリン以降がＰＣＫの成熟タンパク質をコー
ドする領域である。このＤＮＡで形質転換されたイネ植
物体が、該ＤＮＡによりコードされ、かつ活性を有する
ＰＣＫを産生することが確認された。従って、本発明
は、このように、天然から分離された複数のＰＣＫ遺伝
子の部分を接続したものであってもよい。
【００１２】なお、一般に、生理作用を有するアミノ酸
配列において、１又は複数のアミノ酸が付加、欠失、挿
入若しくは置換された場合であっても、その生理活性を
維持する場合があることは当業者において広く認められ
ているところである。本発明には、このような修飾が加
えられ、かつＰＣＫ活性を有するポリペプチドをコード
するＤＮＡ断片も含まれる。すなわち、配列表の配列番
号１、２又は３で示されるアミノ酸配列において１若し
くは複数のアミノ酸が付加、欠失、挿入若しくは置換さ
れておりかつＰＣＫ活性を有するポリペプチドをコード
するＤＮＡ断片も本発明の範囲内に含まれる。
【００１３】アミノ酸の付加、欠失、挿入又は置換は、
それをコードするＤＮＡのヌクレオチドの付加、欠失、
挿入又は置換により行うことができ、これは例えば周知
技術である部位特異的変異誘発（例えばNucleic Acid R
esearch, Vol. 10, No. 20, p6487-6500, 1982) により
実施することができる。
【００１４】部位特異的変異誘発は、例えば、所望の変
異である特定の不一致の他は変異を受けるべき一本鎖フ
ァージＤＮＡに相補的な合成オリゴヌクレオチドプライ
マーを用いて次のように行うことができる。すなわち、
プライマーとして上記合成オリゴヌクレオチドを用いて
ファージに相補的な鎖を合成させ、得られた二重鎖ＤＮ
Ａでファージ担持性宿主細菌を形質転換する。形質転換
された細菌の培養物を寒天にプレートし、ファージを含
有する単一細胞からプラークを形成せしめる。そうする
と、理論的には、５０％の新コロニーが単鎖として変異
を有するファージを含有し、残りの５０％が元の配列を
有する。得られたプラークを、上記所望の変異を有する
ＤＮＡと完全に一致するものとはハイブリッド形成する
が、もとの鎖を有する不一致のものとはハイブリッド形
成しない温度において、キナーゼ処理された合成プロー
ブとハイブリッド形成せしめる。次に該プローブとハイ
ブリド形成するプラークを拾い、培養し、ＤＮＡを回収
する。
【００１５】なお、塩基配列に、下流の遺伝子の発現を
促進する作用を喪失せしめない１又は数個のヌクレオチ
ドの置換、欠失又は挿入の方法としては、上記の部位特
異的変異誘発の他にも、遺伝子を変異原で処理する方法
及び遺伝子を選択的に開裂し、次に選択されたヌクレオ
チドを除去、付加、又は置換し、次いで連結する方法も
ある。
【００１６】本発明のＤＮＡは、下記実施例に詳述する
方法によって得ることができる。あるいは、既に本発明
により、配列番号１〜３に示すように、ウロクロア・パ
ニコイデスのＰＣＫ遺伝子の塩基配列が決定されたの
で、ウロクロア・パニコイデスのゲノムＤＮＡを鋳型と
したＰＣＲ法により容易に本発明の遺伝子を得ることが
できる。
【００１７】本発明のＤＮＡは、常法により植物用の発
現ベクターに組み込むことができ、得られた組換えベク
ターで植物を形質転換することによりウロクロア・パニ
コイデスのＰＣＫを発現することができる形質転換植物
を得ることができる。植物の形質転換方法は既に確立さ
れており、アグロバクテリウム・ツメファシエンスを用
いた方法を好ましく採用することができる。アグロバク
テリウム・ツメファシエンスを用いた植物の形質転換方
法はこの分野において周知であり、これにより双子葉植
物（たとえば特開平４−３３０２３４号公報）でも単子
葉植物（WO 94/00977)でも形質転換することができる。
本発明のＰＣＫ遺伝子を導入するのに適した植物とし
て、イネ、トウモロコシ、トマト及びタバコ等を挙げる
ことができるがこれらに限定されるものではない。な
お、形質転換方法の一例は下記実施例に詳述されてい
る。
【００１８】
【実施例】以下、本発明を実施例に基づきより具体的に
説明するが本発明は下記実施例に限定されるものではな
い。
【００１９】実施例１ ＰＣＫ１のクローニング及び同
定 （Ｉ）材料及び方法 (1) 植物材料 ＲＮＡの単離のために用いた全ての植物材料は、オース
トラリア国、クィーンズランド、ブリスベン所在のＣＳ
ＩＲＯ、熱帯植物及び牧草部に寄託された、寄託番号Ｃ
Ｑ２７９８のウロクロア・パニコイデスから調製した。
光照射下で生育された植物は、夏の５週間、太陽光の下
でずっと生育した植物である。暗所で生育された植物
は、アルミフォイルで被覆したポリスチレンの箱の中の
湿潤組織上に播種された種の状態から２８℃で生育した
ものである。
【００２０】(2) ＰＣＫの精製 ２回目のＤＥＡＥ−セファロースＣＬ−６Ｂカラム（フ
ァルマシア社製）を省略したことを除き、Burnell JN,
Purification and properties of phosphoenolpyruvate
carboxykinase from C4 plants. Aust. J. Plant Phys
iol. 13:577-587 (1986)に記載された方法によりウロク
ロア・パニコイデスの葉からＰＣＫを精製した。ＰＣＫ
活性のピークを含む、１ｍｌ当たり１００μｇないし２
００μｇのタンパク質を含む、セファクリルＳ−３００
カラム（ファルマシア社製）からの分画を１２５ｍＭ
Tris-HCl, pH 6.8, ２０％グリセロール、４％ＳＤＳ、
１０％２−メルカプトエタノール、0.0025% ブロムフェ
ノールブルーと混合し、８５℃で２分間加熱した。12,0
00 x gで５分間遠心することにより清澄化し、公知の方
法（Laemmli UK: Cleavage of structural proteins du
ring the assemblyof the head of bacteriophage T4,
Nature 227: 680-685 (1970) ）の方法により、１６ｃ
ｍｘ１８ｃｍｘ０．２ｃｍの１０％ＳＤＳ−ポリアクリ
ルアミドゲルにかけて電気泳動を行った。ゲルを０．５
％クマシーブルーＲ−２５０、４０％エタノール、１０
％酢酸で１時間染色し、１０％メタノール、１０％酢酸
で脱染色した。
【００２１】電気溶出用の試料を調製するために、染色
されたタンパク質バンドを切り出し、０．１５ＭＮａＣ
ｌ、１％ＳＤＳ、５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．
５で平衡化し、次いで１０ｍＭＴｒｉｓ酢酸、ｐＨ８．
６、１ｍＭＥＤＴＡ、１％ＳＤＳで平衡化した。５ｍｌ
の注射器の胴部を通過させることによりゲルのスライス
を破壊し、Little Blue Tank（商品名）電気溶出装置
（米国ＩＳＣＯ社製）のトラップの陽極ウェルに入れ
た。トラップを１０ｍＭＴｒｉｓ酢酸、ｐＨ８．６、１
ｍＭＥＤＴＡ、１％ＳＤＳで満たし、一方、陽極及び陰
極室を４０ｍＭＴｒｉｓ酢酸、ｐＨ８．６、１ｍＭＥＤ
ＴＡ、１％ＳＤＳで満たした。電気溶出は、３Ｗの一定
電力で３時間行った。トラップの陰極ウェルからのタン
パク質の回収率は９０％を超えていた。電気溶出された
ＰＣＫをＣｅｎｔｒｉｃｏｎ−３０（商品名）限外ろ過
カプセル（オーストラリア、アミコン社）中で遠心する
ことにより濃縮した。次いで、これをＰＢＳ（１５ｍＭ
リン酸ナトリウム、ｐＨ７．２、１４０ｍＭＮａＣｌ、
３ｍＭＫＣｌ）で１００倍に希釈し、再濃縮した。
【００２２】(3) 抗ＰＣＫ抗体の調製 ５００μｌのＰＢＳ中にある約５００μｇのゲル精製Ｐ
ＣＫを同体積のフロインドの完全アジュバントと混合し
た。混合物の一部（５００μｌ）をウサギ（ニュージー
ランド長耳種）のそれぞれの大腿部に筋肉内注射した。
最初の注射から３０日後及び４８日後に、フロインドの
完全アジュバントに代えて不完全アジュバントを用いる
ことを除き、上記と同様にして追加免疫を行った。２回
目の追加免疫の際、及びその後１０〜１４日間隔で耳の
静脈から採血した。血液試料を凝血させ、次いで1000 x
gで１０分間遠心することにより清澄化した。清澄化し
た血清をアジ化ナトリウム中に０．０２％の濃度にし、
４℃で保存した。
【００２３】(4) ＰＣＫの電気ブロッティング及び免疫
検出 タンパク質を１０％アクリルアミドゲルのＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥにかけ（Laemmli、上掲）、クマシーブルーＲ−２
５０で染色するか又は電気ブロッティングに用いた。イ
ムノブロッティング実験のために、ゲルを２５ｍＭＴｒ
ｉｓ、１９２ｍＭグリシン、２０％メタノール中で平衡
化し、次いで、この緩衝液を用いて、トランス−ブロッ
ト（商品名）チャンバー（オーストラリア国、バイオ−
ラド社製）内のニトロセルロース膜（ドイツ国、シュレ
イヒャー・アンド・シュエル）に、氷上で２５０ｍＡで
１時間電気ブロッティングした。ＴＢＳＴ（１２．５ｍ
ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１３７ｍＭＮａＣ
ｌ、２．７ｍＭＫＣｌ、０．１％ Tween 20)中０．５％
スキムミルクで膜を１６時間ブロッキングした。次いで
清澄化したウサギ抗ＰＣＫ抗血清を加え、１時間インキ
ュベートした。膜をＴＢＳＴで１０分間３回洗い、プロ
トブロット（商品名）検出システムを用いて製造社（オ
ーストラリア国、プロメガ社）の指示書に従って、結合
した抗体を検出した。Ｎ末端アミノ酸配列を決定するた
めに、タンク緩衝液が１０ｍＭＣＡＰＳ、ｐＨ１１、１
０％メタノールであることを除き上記と同様な電気ブロ
ッティングにより、タンパク質をポリビニリデンジフロ
リド（ＰＶＤＦ）膜（オーストラリア国、バイオ−ラド
社製）に転写した。５０％メタノール中０．１％クマシ
ーブルーＲ−２５０でブロットを染色し、５０％メタノ
ールで脱染色し、空気乾燥した。配列決定に用いるタン
パク質バンドを切り出した。
【００２４】(5) ウロクロア・パニコイデスからのＲＮ
Ａの単離 種々のウロクロア・パニコイデス組織から、コムチンス
キーとサッチの方法（Chomczynski P, Sacchi N: Singl
e-step method of RNA isolation by acid guanidinium
thiocyanate phenol chloroform extraction. Anal. B
iochem. 162: 156-159 (1987) により全ＲＮＡを抽出し
た。オリゴ−（ｄＴ）25−結合常磁性粒子（ノルウェー
国ダイナル社製）を用いた、バッチ処理により、製造社
の指示書に従って、ポリ（Ａ）+ ＲＮＡを全ＲＮＡから
単離した。
【００２５】(6) ウロクロア・パニコイデスｃＤＮＡラ
イブラリーの構築及びスクリーニング タイムセイバー（商品名）ｃＤＮＡ合成キット（オース
トラリア国、アムラド−ファルマシア社製）を用い、製
造社の指示書に従って、３μｇのウロクロア・パニコイ
デスポリ（Ａ）+ ＲＮＡからλｇｔ１１Ｄ中でディレク
ショナルｃＤＮＡライブラリーを構築した。ギガパック
II（商品名）パッケージングエキストラクツ（米国、ス
トラタジーン社製）を用いてライブラリーをパッケージ
ングし、Ｙ１０８８プレーティング細菌上で滴定し、増
幅した（Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T: Molecu
lar Cloning. A Laboratory Manual, 2nd ed. Cold Spr
ing harbor laboratory Press, Cold Spring Harbor NY
(1989) ）。増幅されなかったライブラリーは２ｘ１０
5 個の独立したクローンを含んでいた。免疫スクリーニ
ングのために、増幅されたライブラリーからのクローン
をプレートし、ＩＰＴＧで誘導をかけ、ハイボンド−Ｃ
エキストラ（商品名）（オーストラリア国、アマシャム
社製）に常法（Sambrook J. ら、上掲）により転写し
た。膜を上述のようにして１時間ブロッキングし、次い
で１０μｌのウサギ抗ＰＣＫ抗血清を含む５０ｍｌのＴ
ＢＳＴ中で１６時間インキュベートした。膜を洗い、イ
ムノブロッティング実験と同様にして結合抗体を検出し
た。
【００２６】ハイブリダイゼーションによるスクリーニ
ングのために、プラークをハイボンド−Ｎ+ （商品名）
（オーストラリア国、アマシャム社製）に転写し、変性
し、ファージＤＮＡを製造社の薦めに従って０．４ＭＮ
ａＯＨで固定した。膜を５ｘＳＳＣ（１ｘ＝０．１５Ｍ
ＮａＣｌ、１５ｍＭクエン酸三ナトリウム）、５０％ホ
ルムアミド、０．１％ＳＤＳ、５０ｍＭリン酸ナトリウ
ム（ｐＨ７．０）、０．１％フィコール（商品名）（オ
ーストラリア国、アムラド−ファルマシア社製）、０．
１％ポリビニルピロリドン、０．１％ウシ血清アルブミ
ン、２５０μｇ／ｍｌ熱変性ニシン精子ＤＮＡ中で４２
℃で１時間プレハイブリダイゼーションし、次いで熱変
性した放射標識プローブを加えた。ＤＮＡ制限断片プロ
ーブをアガロースゲルから精製し（Sambrook J. ら、上
掲）、ＧＩＧＡプライムＤＮＡラベリングキット（オー
ストラリア国、ブレサテック社製）を用いたランダムプ
ライミングにより［α−32Ｐ］ｄＣＴＰ（オーストラリ
ア国、ＮＥＮ−ＤｕＰｏｎｔ社製）で放射標識した。ハ
イブリダイゼーションは４２℃で１６時間行い、膜を２
ｘＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ中で４２℃で１５分間２回洗
い、次いで、０．１ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で６５
℃で１５分間２回洗った。
【００２７】(7) ｃＤＮＡ挿入物のサブクローニング及
び配列決定 ファージＤＮＡをプレート溶解物から調製し、常法（Sa
mbrook J. ら、上掲）により、挿入物をpBluescript II
-KS （商品名、米国ストラタジーン社製）にサブクロー
ニングした。配列決定のために、エキソヌクレアーゼII
I を用いてネステッド(nested)欠失の組を構築し（Heni
koff S: Unidirectional digestion with exonuclease
III creates targeted breakpoints for DNA sequencin
g. Gene28: 351-359 (1984)) 、ヤエナリヌクレアーゼ
で消化し、再連結した。アルカリ溶解ミニプレパレーシ
ョン（Sambrook J. ら、上掲）した適当な欠失プラスミ
ドをアルカリ中で煮沸することにより変性し（Yie Y. W
ei Z, Tien P: A simplified and reliable protocol f
or plasmid DNA sequencing: fast miniprep and denat
uration. Nucleic Acids Res 21:361 (1993))、Ｔ７シ
ーケンシングキット（商品名、オーストラリア国、アム
ラド−ファルマシア社製）を用いて、ジデオキシチェイ
ンターミネーション法（Sanger F, Nicklen S, Coulson
AR: DNA sequencing with chain terminating inhibit
ors. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463-5467 (197
7)) により配列決定を行った。制限酵素及び他の核酸修
飾酵素はオーストラリア国、アムラド−ファルマシア社
から購入した。
【００２８】(8) ノーザン分析 ８ｍＭホルムアルデヒドを含む１．２％アガロースゲル
上でポリ（Ａ）+ ＲＮＡを分離した（Sambrook J. ら、
上掲）。０．４ＭＮａＯＨをバッファーとして用い、Ｒ
ＮＡをハイボンド−Ｎ+ （商品名）に７５ｍｍＨｇの圧
力下で２時間転写した。膜を０．９ＭＮａＣｌ、６ｍＭ
ＥＤＴＡ、６０ｍＭＮａＨ2 ＰＯ4 、ｐＨ７．４、５０
％ホルムアミド、０．１％ＳＤＳ、１０％硫酸デキスト
ラン、０．０４％フィコール（商品名）、０．０４％ポ
リビニルピロリドン、０．０４％ウシ血清アルブミン、
０．５ｍｇ／ｍｌ変性ニシン精子ＤＮＡ中で４２℃で３
〜４時間プレハイブリダイゼーション行った。熱変性放
射標識制限断片を加え、ハイブリダイゼーションを４２
℃で１６時間行った。膜を上述のプラークリフトの場合
と同様にして洗った。
【００２９】結果 (1) ウサギ抗ウロクロア・パニコイデスＰＣＫ抗血清の
調製 ウロクロア・パニコイデスＰＣＫの分子レベルの特徴付
けの第１段階は精製ＰＣＫに対する抗血清を得ることで
あった。Burnell JN（上掲）に従い、硫酸アンモニウム
沈殿、イオン交換及び分子ふるいクロマトグラフィーを
用いて、圃場で生育したウロクロア・パニコイデスの葉
からＰＣＫを精製した。セファクリルＳ−３００（ファ
ルマシア社製）カラムクロマトグラフィーからのタンパ
ク質のピーク画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。
クマシーブルーで染色すると、約６９、６３、６２、６
１及び６０ｋＤａの５種類のタンパク質種が得られた。
これらのうち、６２ｋＤａのタンパク質種が最も多く存
在したので、これをＰＣＫであると推定し、ゲル精製し
た。精製された最終産物はＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で単一で
あるように思われたので、これをウサギ抗血清の調製の
ための抗原として用いた。
【００３０】抗原精製のために用いた同じカラム画分の
イムノブロットを検出するために得られた抗血清を用い
た。得られたパターンは、検出タンパク質及び５つの種
の相対染色強度の両方において、クマシーブルーで染色
したプロフィールと同じプロフィールを示した。しかし
ながら、ウロクロア・パニコイデスの粗組織抽出物をこ
の抗血清で検出すると、染色強度において微妙な違いが
観察された。粗抽出物においては、６３、６２及び６１
ｋＤａの種は同じ強度に染色されたが６０ｋＤａの種の
強度が非常に弱く、一方、精製ＰＣＫにおいては、６３
ｋＤａの種が他の種よりも弱く染色された。
【００３１】(2) ＰＣＫｃＤＮＡのクローニング及び配
列解析 圃場で生育したウロクロア・パニコイデスの緑葉から単
離したポリ（Ａ）+ ＲＮＡを用いて、λｇｔ１１誘導体
ベクター中でｃＤＮＡ発現ライブラリーを構築した。こ
のライブラリーの２ｘ１０5 プラークを上記抗ＰＣＫ抗
血清でスクリーニングすると、免疫応答するクローンが
４０個得られた。これらのうち１２個のクローンを再ク
ローニングして均一化した。ｃＤＮＡ挿入物をサブクロ
ーニングし、その末端の配列を決定した。１２個の全て
の挿入物は、サッカロミセス・セレビシアエのＰＣＫ配
列（Stucka R et al., Nucleotide sequence of the ph
osphoenolpyruvate carboxykinase gene from Saccarom
yces cerevisiae. NucleicAcids Res 16: 10926 (198
8))と相同性を有していた。最も長い挿入物、すなわ
ち、λＰＣＫ１００１０１の挿入物は１．４ｋｂの長さ
を有しており、約６２ｋＤａのタンパク質をコードする
には不十分である。ＰＣＫの全長をコードするオープン
リーディングフレームをカバーするｃＤＮＡを得るため
に、ｃＤＮＡの５’末端から３’末端に向って段階的に
延びる、放射標識した制限酵素断片を用いてライブラリ
ーを再スクリーニングした。両方向において完全に配列
決定された、得られた重複するクローンを図１に示す。
λＰＣＫ１１０４０２の挿入物は、λＰＣＫ１００１０
１及びλＰＣＫ１９０２０３の挿入物とそれぞれ６７５
ｂｐ及び１３２ｂｐずつ重複していた。これらのクロー
ンの重複領域は同一の配列を有していた。
【００３２】その結果、配列表１に示す、２２２０ｂｐ
のｃＤＮＡ配列が決定された。この配列は１８７２ｂｐ
のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む。こ
のＯＲＦは６２４アミノ酸残基のタンパク質をコードす
る。このＯＲＦをコードする遺伝子を以下、ＰＣＫ１と
言う。ＰＣＫ１のＯＲＦはポリ（Ａ）テールまで延びる
２８８ｂｐの３’非翻訳領域と５７ｂｐの５’非翻訳領
域に挟まれている。
【００３３】(3) ＰＣＫ１タンパク質の性質 推定された６２４アミノ酸残基から成るＰＣＫ１タンパ
ク質の分子量は６８４７４Ｄａである。カイトとドゥー
リトルのアルゴリズム（Kyte J, Doolittle RF: A simp
le method for displaying the hydropathic character
of a protein,J. Mol. Biol. 157: 105-132 (1982))
によれば、ＰＣＫ１は全体として親水性であり、ポポと
デヴィトリーの基準（Popot J-L, de Vitry C: On the
microassembly of integral mebrane proteins. Annu.
Rev. Biophys. Biophys. Chem.19: 369-403 (1990)に
よれば、膜を通過する領域を有さない。このことは、Ｐ
ＣＫが細胞質に局在しているという事実と符合する。
【００３４】(4) ＰＣＫのアミノ末端配列の分析 ウロクロア・パニコイデスＰＣＫのＮ−末端アミノ酸配
列を直接決定した。セファクリルＳ−３００（ファルマ
シア社製）カラムからの、ピークＰＣＫ活性を含む画分
をＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけた。この際、６０〜６３ｋＤ
ａのタンパク質が単一の幅広のバンドを形成するように
した。この材料をＰＶＤＦ膜にブロットし、全バンドを
自動エドマン分解の１２サイクルにかけた。１サイクル
毎に、検出可能な量の４又は５アミノ酸が遊離された。
これらのデータから、ウロクロア・パニコイデスＰＣＫ
のｃＤＮＡから推定されるアミノ酸配列に対応する、５
種類の重複する配列が決定された。これらの配列を下記
表１に示す。
【００３５】
【表１】
【００３６】表１に示すように、５種類の配列の全て
は、互いに１９アミノ酸残基の範囲内から始まってお
り、最もＮ−末端側から始まるものは、１番目のメチオ
ニンから５６アミノ酸残基の後から始まっている（すな
わち、５７番目のアミノ酸であるセリンから始まる）。
同定されたＮ−末端のうち、配列Ｉ及びIII が最も豊富
である。次に、上記と同様な、ＰＣＫの電気泳動を行
い、個々のバンドの配列を決定した。しかしながら、６
２ｋＤａ及び６１ｋＤａの種についてのみ結果が得られ
た。６２ｋＤａのバンドはIII 及びIVのＮ−末端配列の
みを有し、これは推定分子量６１．８ｋＤＡ及び６１．
４ｋＤａにそれぞれ対応する。６１ｋＤａのバンドは配
列Ｖのみを有し、これは推定分子量６０．８ｋＤａに対
応する。以上、Ｎ−末端アミノ酸分析は、６９ｋＤａの
ウロクロア・パニコイデスＰＣＫ翻訳産物が、Ｎ−末端
側のリーダー配列である５６〜７５アミノ酸残基を除去
されることにより、６０．８ｋＤａないし６２．７ｋＤ
ａの成熟タンパク質になることが示唆される。従って、
本発明は、これら５種類のタンパク質をコードするＤＮ
Ａをも提供するものである。
【００３７】(5) ＰＣＫ１発現に対する光の効果 ウロクロア・パニコイデスの種子を発芽させ、苗を暗所
で７日間生育し、次いで連続９６時間光に当てた。黄化
苗条は一般的に５〜６ｃｍの長さを有し、１５〜２０ｍ
ｇの重量を有していた。延びた子葉鞘は白色であり、傷
つけられていない先端部を通して見える黄色い未熟な葉
を有していた。光に６時間さらすと、子葉鞘の先端が破
裂し、葉身がみるみる緑になり膨張した。葉は、９６時
間の光処理の間ずっと緑化し、膨張した。対照的に、子
葉鞘の他の部分はほとんど変化せず、苗条の長さ及び重
量は、光に当てている間にわずかしか増えなかった。
【００３８】９６時間の光処理の間の種々の時間に苗条
を採取した。これらの苗条から全ＲＮＡを調製し、アガ
ロースゲル上で分離し、ブロッティングし、λＰＣＫ１
００１０１の放射標識された挿入物で検出した。光照射
下で生育した植物の根及び緑葉組織からの全ＲＮＡも含
めた。緑葉からの全ＲＮＡ中、上記部分ＰＣＫ１ｃＤＮ
Ａプローブによって検出される主な種は２．７ｋｂの長
さを有していた。上記プローブは、２．７ｋｂよりも小
さなＲＮＡの不均一スメアにもまたハイブリダイズし
た。ＰＣＫ１ｃＤＮＡの両端部及び中央部の放射標識制
限酵素断片をプローブとして用いて緑葉のポリ（Ａ）+
ＲＮＡを検出すると、２．７ｋｂのＲＮＡのみが検出さ
れた。従って、この種がＰＣＫ１ｍＲＮＡであると考え
られ、全ＲＮＡの不均一なスメアは、ポリ（Ａ）テール
を欠いたＰＣＫ１転写物によるものと思われる。非ポリ
アデニル化ＲＮＡは、ＰＣＫ１ｍＲＮＡの分解又はＰＣ
Ｋ１転写の早期終結により生じ得る。
【００３９】根又は黄化苗条からの全ＲＮＡ中には、上
記１．４ｋｂのｃＤＮＡプローブによりＰＣＫ１ｍＲＮ
Ａは検出されなかった。しかしながら、６時間緑化させ
ると、ＰＣＫｍＲＮＡは苗条中に検出された。このＲＮ
Ａの量は、続く８４時間中一貫して増え続けたが、緑葉
中の量には常に及ばなかった。わずか６時間の露光で
２．７ｋｂの転写物は存在したが、不均一なスメアは露
光後４８時間まで検出されなかった。
【００４０】実施例２ ＰＣＫ２のクローニング及び同
定 実施例１と同じ操作を繰り返した。その結果、PCK1 cDN
A の単離の際に得られた陽性クローンの解析によりPCK1
cDNA と高い相同性を示すが、異なる塩基配列を持つク
ローンが得られた。重複するクローンを図２に示す。λ
PCK170204 の挿入物は、λPCK190202 およびλPCK11010
1 の挿入物とそれぞれ227bp 、107bp ずつ重複してい
た。これらの重複領域は同一の配列を有していた。その
結果、配列表の配列番号２に示す、2245bpのcDNA配列が
決定された。この配列は1878bpのオープンリーディング
フレーム(ORF) を含む。このORF は626 アミノ酸残基の
タンパク質をコードする。このORF をコードする遺伝子
を以下、PCK2と言う。PCK2のORF はポリ(A) テールまで
延びる304bp の3'非翻訳領域と44bpの5'非翻訳領域に挟
まれている。PCK2がコードするアミノ酸配列は、PCK1の
アミノ酸配列と96% 一致し、一致しない26残基のうち22
残基は同義のアミノ酸である。ＰＣＫ１とＰＣＫ２のア
ミノ酸配列の比較を図３に示す。
【００４１】実施例３ ＰＣＫ遺伝子のイネへの導入と
発現 １．PCK cDNAを植物体で発現させるための遺伝子構築材料および方法 植物材料およびゲノムDNA の単離 温室内で育成したイネ(Oriza sativa cv. Nipponbare)
およびトウモロコシ（Zea mays L. subsp. mays line B
73) の緑葉からKomariらの方法（Komari T,Saito Y, Na
kakido F, Kumashiro T : Efficient selection of som
atic hybridsin Nicotiana tabacum L. using a combin
ation of drug-resistance markersintroduced by tran
sformation. Theor, Appl. Genet. 77:547-552 (1989)
）に従ってゲノムDNA を抽出した。
【００４２】DNA の操作 DNA の操作は常法（Sambrook J, Fritsch FF, Maniatis
T :Molecular cloning.A laboratory manual, 2nd ed.
Cold spring harbor laboratory press, Cold Spring
Harbor NY (1989) ）に従った。オリゴDNA の合成はDN
A シンセサイザ392 （アメリカ国、アプライドバイオシ
ステムズ社製）により行った。PCR は常法（Mcpherson
MJ, Quirke P, Taylor GR : PCR. A practical approac
h. Oxford express press, Oxford NY (1991) ）に従っ
た。PCR 産物のサブクローニングにはTA Cloningキット
（商品名、アメリカ国、インビトロゲン社製）を用い
た。配列決定はDNA cycle sequencing kit（商品名、ア
メリカ国、アプライドバイオシステムズ社製）を用いて
シーケンサー373A（アメリカ国、アプライドバイオシス
テムズ社製）により行った。
【００４３】他のＤＮＡ領域の調製 プロモーターはトウモロコシのホスホエノールピルビン
酸カルボキシラーゼのプロモーター領域の配列（Hudspe
th RL, Grula JW : Structure and expressionof the m
aize gene encoding the phosphoenolpyruvate carboxy
lase isozymeinvolved in C4 photosynthesis. Plant
Mol. Biol. 12:579-589 (1989)）をもとに合成したプラ
イマーを用い、PCR 法によってトウモロコシゲノムDNA
より単離した。用いたプライマーの塩基配列は、次のと
おりであった。 正方向プライマー：5'-AGACGACTCTTAGCCACAGCC-3' 逆方向プライマー：5'-TCGATGGAGTGGTGCTTCTC-3'
【００４４】ターミネーターとしてプラスミドDNA pGL2
（Biland B, Iida S, Peterhans A,Potrykus I, Panszk
owski J : The 3'-terminal region of the hygromycin
-B-resistance gene is important for its activity i
n Escherichia coli andNicotiana tabacum. Gene 10
0:247-250 (1991)）上のカリフラワーモザイクウイルス
35S ターミネーター（SphI-EcoRI断片）を用いた。
【００４５】トランジットペプチドをコードする領域
は、イネのルビスコ小サブユニットの配列（Matsuoka
M, Kano-Murakami Y, Tanaka Y, Ozeki Y, Yamamoto N
:Classification and nucleotide sequence of cDNA e
ncoding the small sub-unit of riburose-1,5-bisphos
phate carboxylase from rice. Plant CellPhysiol.
29:1015-1022 (1988) ）をもとに合成したプライマーを
用い、PCR 法によってイネゲノムDNA より単離した。用
いたプライマーの塩基配列は、次のとおりであった。 正方向プライマー：5'-GGAATTCCATGGTGCATCTCAAGAAGTAC
-3' 逆方向プライマー：5'-GCTCTAGACTGCATGCACCTGATCC-3'
【００４６】葉緑体へ輸送されるPCK をコードする遺伝
子は、λPCK170204 およびλPCK100101 をそれぞれの挿
入物中に存在するKpnI部位で接続し、PCK2がコードする
アミノ酸配列の57番目のセリンの上流でトランジットペ
プチドをコードする上記遺伝子と接続した。
【００４７】プラスミドDNA pUC18 （Yanish-Perron C,
Vieira J, Messing J : ImprovedM13 phage cloning v
ectors and host strains: nucleotide sequences of t
heM13mp18 and pUC19 vectors. Gene 33:103-119 (198
5)）のマルチクローニング部位に、プロモーター、トラ
ンジットペプチドとPCK をコードする遺伝子、ターミネ
ーターの順にそれぞれを挿入した。構築したプラスミド
はpPCKと名付けた。
【００４８】構築したプラスミドの遺伝子地図を図４に
示す。また、構築したcDNAの領域の配列を配列表の配列
番号３に示す。配列番号３に示される塩基配列のうち、
ｎｔ１〜ｎｔ１５３がイネルビスコ小サブユニット由来
のトランジットペプチドをコードする領域、ｎｔ１５４
〜ｎｔ９６６がＰＣＫ２のＮ末端側をコードする領域、
ｎｔ９６７〜ｎｔ１８６３がＰＣＫ１のＣ末端側をコー
ドする領域である。
【００４９】2.イネの形質転換材料および方法 日本稲品種「月の光」の未熟種子の表面を70％エタノー
ルで30秒間、続いて１％次亜塩素酸ナトリウム液で40分
間殺菌し、滅菌水で３回洗浄した。この種子を２Ｎ６固
形培地に置床し、30℃の暗所で培養した。未熟種子胚盤
より脱分化したカルスをＮ６液体培地に植え継ぎ、25℃
の暗所で125 回転/ 分の旋回培養をした。培養細胞は１
週間毎に新しい液体培地に継代した。
【００５０】継代培養３日目の細胞を1.0 ％セルラーゼ
オノヅカＲＳ（ヤクルト本社）、1.0 ％マセロザイムＲ
10（ヤクルト本社）、0.1 ％ペクトリアーゼＹ-23 （盛
進製薬）、0.5 ％ドリセラーゼ（協和発酵）、0.4 Ｍマ
ンニトールを含む酵素液に懸濁し、30℃の暗所に静置し
た。３時間後に細胞懸濁液を20μｍのナイロンメッシュ
で濾過し、得られた濾液を50×ｇで５分間遠心分離し
た。得られたプロトプラストの沈澱を0.4 Ｍのマンニト
ールに懸濁し、同液で２回プロトプラストを洗浄した。
【００５１】得られたプロトプラストを２×106 細胞/
ｍｌとなるようにＥＰＡＡ緩衝液（Tada Y, Sakamoto
M, Fujimura T : Efficient gene introduction into r
ice byelectroporation and analysis of transgenic p
lants: use of electropora-tion buffer lacking chlo
ride ions. Theor.Appl.Genet. 80:475-180 (1990)）に
懸濁し、氷中に５分間静置した。プロトプラスト液に10
μｇのpGL2プラスミドと30μｇのpPCKプラスミドを加
え、エレクトロポレーション装置（アメリカ国、バイオ
ラド社）を用いて250 μＦ、600 Ｖ/ ｃｍの電気パルス
を与えた。パルス処理をしたプロトプラストを氷中に15
分間静置した後、室温に30分間放置した。
【００５２】プロトプラストを遠心分離して集め、３×
105 細胞/ ｍｌとなるように1.25％シープラーク（商品
名）アガーロス（アメリカ国、ＦＭＣ社）を含むＲ２−
１培地に懸濁し、９ｃｍシャーレ上にて少量のドロップ
レットとして固化させた。これにＲ２−１培地とイネＯ
ｃ細胞（Baba A, Hasezawa S, Shono K : Cultivationo
frice protoplasts and their transformation mediate
d by Agrobacteriumspheroplast. Plant Cell Physio
l. 27:463-471(1986)）を加え、25℃の暗所で培養し
た。
【００５３】２週間後に液体培地とＯｃ細胞をのぞき、
Ｒ２−ｔ培地を加えて25℃の連続光下で培養した。１週
間後、培地を40ｍｇ/ ｌのハイグロマイシンを含むＲ２
−ｔ培地に交換し、更に培養した。１週間後、直径約0.
2 −0.5 ｍｍのカルスを含んでいるアガロースドロップ
レットを少量の滅菌水を加えて砕き、これを40ｍｇ/ｌ
のハイグロマイシンを含むＮ６−12培地に置床し、25℃
の連続光下で培養した。カルスが直径２ｍｍ以上になっ
たところで、40ｍｇ/ ｌのハイグロマイシンを含むＮ６
Ｓ３培地に移植し、更に培養を続けた。再分化し、高さ
が約10ｃｍ以上になった植物体をポットに移植し、温室
にて栽培した。
【００５４】培地組成 ２Ｎ６培地 （ｐＨ5.8 ） Ｎ６基本培地（Chu 1978 ） カザミノ酸 1000 ｍｇ/ ｍｌ ２，４−Ｄ 2.0 ｍｇ/ ｍｌ ショ糖 20000 ｍｇ/ ｍｌ ゲルライト 2000 ｍｇ/ ｍｌ
【００５５】Ｎ６液体培地 （ｐＨ5.8 ） Ｎ６基本培地 カザミノ酸 300 ｍｇ/ ｍｌ ２、４−Ｄ 1.0 ｍｇ/ ｍｌ ショ糖 30000 ｍｇ/ ｍｌ
【００５６】Ｒ２−１培地 （ｐＨ5.8 ） Ｒ２培地無機塩類（Ohira et al.1973） ＭＳ培地ビタミン類（Murashige and Skoog 1962） カザミノ酸 1000 ｍｇ/ ｍｌ ２，４−Ｄ 1.0 ｍｇ/ ｍｌ 没食子酸ｎ- プロピル 0.05 ｍｇ/ ｍｌ ショ糖 68500 ｍｇ/ ｍｌ グルコース 36000 ｍｇ/ ｍｌ
【００５７】Ｒ２−ｔ培地 （ｐＨ5.8 ） Ｒ２培地無機塩類 ＭＳ培地有機物 カザミノ酸 1000 ｍｇ/ ｍｌ ２，４−Ｄ 1.0 ｍｇ/ ｍｌ ショ糖 20000 ｍｇ/ ｍｌ グルコース 10000 ｍｇ/ ｍｌ
【００５８】Ｎ６−12培地 （ｐＨ5.8 ） Ｎ６基本培地 カザミノ酸 2000 ｍｇ/ ｍｌ ２、４−Ｄ 0.2 ｍｇ/ ｍｌ ６- ＢＡ 0.5 ｍｇ/ ｍｌ ＡＢＡ 5.0 ｍｇ/ ｍｌ ショ糖 20000 ｍｇ/ ｍｌ Ｄ−ソルビトール 30000 ｍｇ/ ｍｌ ゲルライト 2000 ｍｇ/ ｍｌ
【００５９】Ｎ６Ｓ３培地 １/ ２濃度のＮ６培地主要塩類 Ｎ６培地微量塩類 Ｎ６培地ビタミン類 ＡＡ培地アミノ酸類（Toriyama and Hinata 1985） カザミノ酸 1000 ｍｇ/ ｍｌ ＮＡＡ 0.2 ｍｇ/ ｍｌ カイネチン 1.0 ｍｇ/ ｍｌ ショ糖 20000 ｍｇ/ ｍｌ ゲルライト 3000 ｍｇ/ ｍｌ
【００６０】文献 Chu,C.-C.(1978)The N6 medium and its application t
o anther culture ofcereal crops. In Proc. Symp. Pl
ant Tissue Culture. Peking: SciencePress, pp.43-50 Murashige,T. and Skoog,F. (1962) A revised medium
for rapid growth andbio assay with tobacco tissue
culture. Physiol.Plant. 15:473-497. Ohira,K., Ojima,K. and Fujiwara,A. (1973) Studies
on the nutrition ofrice cell culture I. A simple,
defined medium for rapid growth insuspension cultu
re. Plant Cell Physiol. 14:1113-1121. Toriyama,K., Hinata,K. and Sasaki,T. (1986) Haploi
d and diploid plantregeneration from protoplasts o
f anther callus in rice. Theor.Appl.Genet. 73:16-1
9.
【００６１】３．形質転換イネにおけるＰＣＫタンパク
質の局在性材料および方法 人工気象室（28℃昼／22℃夜、長日16時間）で生育した
形質転換イネ緑葉（５〜10ｇ）の主脈を取り除きカミソ
リで0.5 〜１ｍｍに細断した。これを、0.8 ％セルラー
ゼオノヅカＲＳ、0.8 ％ファンセラーゼ（ヤクルト本
社）、0.25％ペクトリアーゼＹ-23 、150 ｍＭリン酸ナ
トリウム緩衝液( ｐＨ5.6)、0.3 ％ウシ血清アルブミ
ン、0.4 Ｍマンニトールからなる酵素液で30℃、１時間
消化した。酵素処理した組織を緩衝液（50ｍＭ Hepes-K
OHｐＨ7.0 、 0.33 Ｍソルビトール、２ｍＭ EDTA 、１
ｍＭ MgCl2、１ｍＭ MnCl2、0.1 ％ウシ血清アルブミ
ン）で洗浄した後、１ｍｇ／ｍｌイソアスコルビン酸ナ
トリウムを含む約10倍容の氷冷した緩衝液に懸濁し、ポ
リトロンホモジナイザー（商品名、スイス国、キネマチ
カ社）で破砕した。ポリトロンホモジナイザーでの破砕
は、最高出力で３秒を２回行なった。この破砕液を４層
のミラクロス（商品名、アメリカ国、カルビオケム社）
で濾過し、素早く遠心分離（6000×ｇに達したところで
減速）した。得られた沈澱を緩衝液に懸濁し、これを葉
緑体サンプルとした。このサンプルに50μｇ／ｍｌの濃
度となるようにトリプシンを加え氷中で30分間処理し
た。トリプシン処理後、葉緑体を10000 ×ｇで３分間遠
心分離して集めて50ｍＭ Hepes-KOH緩衝液( ｐＨ8.0)に
懸濁し、−80℃で凍結した後に室温で融解させて葉緑体
を破壊した。破壊葉緑体を10000 ×ｇで５分間遠心分離
し、得られた上清（葉緑体可溶性画分）をＳＤＳ- ＰＡ
ＧＥに供した。泳動後、ゲル中のタンパク質をニトロセ
ルロース膜に電気的に転写し、ウロクロア・パニコイデ
スのＰＣＫタンパク質に対するウサギ抗血清、パーオキ
シダーゼ標識ヤギ抗ウサギIgG 抗体（ＭＢＬ社）、ＨＲ
Ｐ発色キット（商品名、アメリカ国、バイオラド社）を
用いてＰＣＫタンパク質を検出した。
【００６２】結果 単離葉緑体の可溶性画分に、トランジットペプチドがプ
ロセシングされてできるサイズのＰＣＫタンパク質が検
出された。ＰＣＫタンパク質は単離葉緑体のトリプシン
処理によって分解されなかったことから、葉緑体内（ス
トロマ画分）に移行していると考えられる。
【００６３】４．形質転換イネのＰＣＫ活性の測定材料および方法 以下の操作は全て４℃で行なった。形質転換イネ（PKS1
2 、PKS18 ）の緑葉約0.2 ｇを１ｍｌの抽出緩衝液（50
ｍＭ HEPES-KOH ｐＨ7.0 、２ｍＭ MnCl2、２ｍＭ Mg
Cl2 、１ｍＭ EDTA 、 0.1％(v/v) ２- メルカプトエタ
ノール、１ｍＭPMSF 、１ｍＭベンズアミジン、１ｍＭ
６- アミノ- ｎ- カプロン酸、10％(w/v) グリセロー
ル、0.2 ％(w/v) イソアスコルビン酸ナトリウム、２％
(w/v) ポリクラールAT）で、乳鉢と乳棒を用いて摩砕し
た。磨砕液を、15000 ×ｇで20分間遠心分離し、得られ
た上清を予めカラム緩衝液（25ｍＭ HEPES-KOH ｐＨ7.
0、２ｍＭ MnCl2、２ｍＭ MgCl2 、0.1 ％(v/v) ２-
メルカプトエタノール、10％(w/v) グリセロール）で平
衡化しておいたＮＡＰ５（商品名）カラム（スウェーデ
ン国、ファルマシア社）に通して脱塩し、粗抽出液を得
た。磨砕液のクロロフィルの定量は、WintermansとdeMo
tsの方法（Wintermans JFGM, De Mots A : Spectrophot
ometric character-istics of chlorophylls a and b a
nd their pheophytins in ethanol. Biochem.Biophys.
Acta 109:448-453(1965)）に準じて行い、粗抽出液のタ
ンパク質の定量は、Bradfordの方法（Bradford MM : A
rapidand sensitive method for quantitation of micr
ogram quantities of proteinutilizing the principle
of protein-dye binding. Anal.Biochem. 72:248-254
(1976)）に準じたプロテインアッセイキット（商品名、
アメリカ国、バイオラド社）を用いて行なった。ホスホ
エノールピルビン酸カルボキシキナーゼ活性の測定は、
25ｍＭ HEPES-KOH ｐＨ7.5 、4 ｍＭ DTT、0.2 ｍＭオ
キザロ酢酸、１unitピルビン酸キナーゼ、0.2 ｍＭ AT
P、50μｌ粗抽出液を含む１ｍｌの反応液により、280
ｎｍのオキザロ酢酸の吸収の減少速度を求めることによ
り行なった。
【００６４】結果 形質転換イネおよび非形質転換イネ緑葉粗抽出液中のＰ
ＣＫ活性を測定したところ、ＰＣＫ活性が確認された。
対照である非形質転換イネではＰＣＫ活性はほとんど検
出されなかった。
【００６５】
【表２】 形質転換イネのホスホエノールピルビン酸カルボキシキ
ナーゼ活性 ─────────────────────── 形質転換体 酵素活性（units/mgクロロフィル） ─────────────────────── PKS12 1.61 PKS18 2.99 対照１ 0.00 対照２ 0.00 ───────────────────────
【００６６】以上の結果より、ウロクロア・パニコイデ
スから単離したＰＣＫタンパク質をコードするｃＤＮＡ
にイネルビスコ小サブユニットのトランジットペプチド
部分の配列を付加したキメラ遺伝子を導入した形質転換
イネにおいて、ＰＣＫタンパク質は活性を有した形で葉
緑体内に局在していることが示された。
【００６７】
【発明の効果】本発明により、Ｃ4 植物であるウロクロ
ア・パニコイデスのＰＣＫ遺伝子がクローニングされ、
その塩基配列が決定された。この遺伝子をＣ3 植物に導
入することにより、光合成の効率を高め、光エネルギー
をより有効に利用することができ、また植物の高温耐性
も高められるものと期待される。
【００６８】配列番号 :１ 配列の長さ : 2220 配列の型 :核酸 配列 CTCCACACCG CTTCCTCGGC GGCCGGCGCA CGTCGCTGCT CCCGACGCTC GAACGAG 57 ATG GCG TCG CCG AAC GGT GGT GTC ACG ACC TAT GAC TAC GAC GAC AGC 105 Met Ala Ser Pro Asn Gly Gly Val Thr Thr Tyr Asp Tyr Asp Asp Ser 1 5 10 15 GAC AGC GCG GCG CCG GTG CGC GCG CAG ACC ATC GAG GAG CTG CAT TCG 153 Asp Ser Ala Ala Pro Val Arg Ala Gln Thr Ile Glu Glu Leu His Ser 20 25 30 CTG CAG CGG AAG GCT GCC GCC ACG GCC AAG GAT AGC GCA TCG CCC CTG 201 Leu Gln Arg Lys Ala Ala Ala Thr Ala Lys Asp Ser Ala Ser Pro Leu 35 40 45 CAG TCC ATC AGC GCG TCA TTG GCG TCT ACG GCA CGT GAA TAT GGC CCC 249 Gln Ser Ile Ser Ala Ser Leu Ala Ser Thr Ala Arg Glu Tyr Gly Pro 50 55 60 AAC CTC GTC AAG GGT GAC CCG GAA GCG AAG GGC GCG CCG CCG GCG CCG 297 Asn Leu Val Lys Gly Asp Pro Glu Ala Lys Gly Ala Pro Pro Ala Pro 65 70 75 80 GTA AAG CAC CAG CAG GCC GCC GCC GCT GCC GCC ATC GCC GCC AGT GAC 345 Val Lys His Gln Gln Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ile Ala Ala Ser Asp 85 90 95 AGC TCC CTC AAG TTC ACC CAT GTC CTC TAC AAC CTC TCC CCC GCT GAG 393 Ser Ser Leu Lys Phe Thr His Val Leu Tyr Asn Leu Ser Pro Ala Glu 100 105 110 CTG TAC GAG CAG GCT TTC GGG CAA AAG AAG AGT TCG TTC ATC ACG TCG 441 Leu Tyr Glu Gln Ala Phe Gly Gln Lys Lys Ser Ser Phe Ile Thr Ser 115 120 125 ACC GGC GCG CTG GCC ACG CTG TCC GGC GCC AAG ACC GGT CGG TCG CCC 489 Thr Gly Ala Leu Ala Thr Leu Ser Gly Ala Lys Thr Gly Arg Ser Pro 130 135 140 AGG GAC AAG CGC GTC GTC AAG GAC GAC ACC ACC GCG CAG GAG CTG TGG 537 Arg Asp Lys Arg Val Val Lys Asp Asp Thr Thr Ala Gln Glu Leu Trp 145 150 155 160 TGG GGC AAG GGC TCG CCC AAC ATC GAG ATG GAC GAG CGC CAG TTC GTG 585 Trp Gly Lys Gly Ser Pro Asn Ile Glu Met Asp Glu Arg Gln Phe Val 165 170 175 ATC AAC AGG GAG CGG GCC CTG GAC TTC CTC AAC TCC CTG GAC AAG GTG 633 Ile Asn Arg Glu Arg Ala Leu Asp Phe Leu Asn Ser Leu Asp Lys Val 180 185 190 TAC GTC AAC GAC CAG TTC CTC AAC TGG GAC CCC GAG AAC CGC ATC AAG 681 Tyr Val Asn Asp Gln Phe Leu Asn Trp Asp Pro Glu Asn Arg Ile Lys 195 200 205 GTC CGG ATC ATC ACC TCC AGG GCG TAC CAC GCC CTC TTC ATG CAC AAC 729 Val Arg Ile Ile Thr Ser Arg Ala Tyr His Ala Leu Phe Met His Asn 210 215 220 ATG TGC ATC CGT CCC ACC GAG GAG GAG CTG GAG ACC TTC GGC ACG CCG 777 Met Cys Ile Arg Pro Thr Glu Glu Glu Leu Glu Thr Phe Gly Thr Pro 225 230 235 240 GAC TTC ACC ATT TAC AAC GCC GGG GAG TTC CCC GCC AAC CGT TAC GCC 825 Asp Phe Thr Ile Tyr Asn Ala Gly Glu Phe Pro Ala Asn Arg Tyr Ala 245 250 255 AAC TAC ATG ACG TCG TCG ACG AGC ATA AAC ATC AGC CTC GCT AGG AGG 873 Asn Tyr Met Thr Ser Ser Thr Ser Ile Asn Ile Ser Leu Ala Arg Arg 260 265 270 GAG ATG GTG ATC CTG GGC ACG CAG TAC GCT GGG GAG ATG AAG AAG GGC 921 Glu Met Val Ile Leu Gly Thr Gln Tyr Ala Gly Glu Met Lys Lys Gly 275 280 285 CTC TTC GGC GTC ATG CAC TAC CTC ATG CCC AAG CGC GGC ATC CTC TCG 969 Leu Phe Gly Val Met His Tyr Leu Met Pro Lys Arg Gly Ile Leu Ser 290 295 300 CTG CAC TCC GGG TGC AAC ATG GGC AAG GAA GGT GAC GTC GCC CTC TTC 1017 Leu His Ser Gly Cys Asn Met Gly Lys Glu Gly Asp Val Ala Leu Phe 305 310 315 320 TTC GGG CTC TCA GGT ACC GGG AAG ACG ACG CTG TCA ACT GAC CAC AAC 1065 Phe Gly Leu Ser Gly Thr Gly Lys Thr Thr Leu Ser Thr Asp His Asn 325 330 335 AGG CTC CTG ATC GGT GAT GAC GAG CAC TGC TGG AGC GAC AAT GGC GTC 1113 Arg Leu Leu Ile Gly Asp Asp Glu His Cys Trp Ser Asp Asn Gly Val 340 345 350 TCC AAC ATT GAG GGA GGT TGC TAT GCC AAG TGC ATC GAC CTG TCC AAG 1161 Ser Asn Ile Glu Gly Gly Cys Tyr Ala Lys Cys Ile Asp Leu Ser Lys 355 360 365 GAG AAA GAA CCT GAT ATC TGG AAC GCC ATC ACG TTT GGA ACA GTG CTG 1209 Glu Lys Glu Pro Asp Ile Trp Asn Ala Ile Thr Phe Gly Thr Val Leu 370 375 380 GAA AAC GTC GTC TTC AAC GAG CGC ACT CGT GAA GTT GAC TAC GCC GAC 1257 Glu Asn Val Val Phe Asn Glu Arg Thr Arg Glu Val Asp Tyr Ala Asp 385 390 395 400 AAA TCT ATC ACC GAG AAC ACC CGG GCC GCC TAC CCG ATC GAG TTC ATC 1305 Lys Ser Ile Thr Glu Asn Thr Arg Ala Ala Tyr Pro Ile Glu Phe Ile 405 410 415 CCC AAC GCC AAG ATC CCA TGC GTC GGG CCG CAC CCC AAG AAC GTC ATC 1353 Pro Asn Ala Lys Ile Pro Cys Val Gly Pro His Pro Lys Asn Val Ile 420 425 430 CTC CTG GCC TGC GAC GCG TAC GGC GTG CTC CCG CCG GTG AGC AAG CTC 1401 Leu Leu Ala Cys Asp Ala Tyr Gly Val Leu Pro Pro Val Ser Lys Leu 435 440 445 AAC CTG GCG CAG ACC ATG TAC CAC TTC ATC AGC GGC TAC ACT GCC ATC 1449 Asn Leu Ala Gln Thr Met Tyr His Phe Ile Ser Gly Tyr Thr Ala Ile 450 455 460 GTC GCC GGC ACG GAG GAC GGC GTC AAG GAG CCG ACG GCG ACC TTC TCG 1497 Val Ala Gly Thr Glu Asp Gly Val Lys Glu Pro Thr Ala Thr Phe Ser 465 470 475 480 GCC TGC TTC GGC GCG GCC TTC ATC ATG TAC CAC CCC ACC AAG TAC GCC 1545 Ala Cys Phe Gly Ala Ala Phe Ile Met Tyr His Pro Thr Lys Tyr Ala 485 490 495 GCC ATG CTC GCC GAG AAG ATG CAG AAG TAC GGC CGC ACC GGG TGG CTT 1593 Ala Met Leu Ala Glu Lys Met Gln Lys Tyr Gly Arg Thr Gly Trp Leu 500 505 510 GTC AAC ACC GGC TGG TCC GGC GGC AGG TAC GGT GTG GGC AAC AGG ATC 1641 Val Asn Thr Gly Trp Ser Gly Gly Arg Tyr Gly Val Gly Asn Arg Ile 515 520 525 AAG CTG CCG TAC ACC AGG AAG ATC ATC GAC GCC ATC CAC TCC GGC GAG 1689 Lys Leu Pro Tyr Thr Arg Lys Ile Ile Asp Ala Ile His Ser Gly Glu 530 535 540 CTC CTC ACC GCC AAC TAC AAG AAG ACC GAG GTG TTC GGG CTG GAG ATC 1737 Leu Leu Thr Ala Asn Tyr Lys Lys Thr Glu Val Phe Gly Leu Glu Ile 545 550 555 560 CCC ACC GAG ATC AAC GGC GTG CCG TCG GAA ATC CTC GAC CCC GTC AAC 1785 Pro Thr Glu Ile Asn Gly Val Pro Ser Glu Ile Leu Asp Pro Val Asn 565 570 575 ACC TGG ACG GAC AAG GCC GCG TAC AAG GAG ACT CTC CTG AAG CTT GCC 1833 Thr Trp Thr Asp Lys Ala Ala Tyr Lys Glu Thr Leu Leu Lys Leu Ala 580 585 590 GGG CTC TTC AAG AAC AAC TTC GAG GTG TTC GCC AGC TAC AAG ATC GGG 1881 Gly Leu Phe Lys Asn Asn Phe Glu Val Phe Ala Ser Tyr Lys Ile Gly 595 600 605 GAC GAC AAC AGC CTG ACC GAA CAG ATC CTT GCC GCA GGC CCC AAC TTC 1929 Asp Asp Asn Ser Leu Thr Glu Gln Ile Leu Ala Ala Gly Pro Asn Phe 610 615 620 TGATTCCAAG CAATGGATCC GGAACGGCGA GGCGTTGGAG TTGGTTCAGA ATGAACCAGT 1989 GGTGCGTGTG TGCGTGCGTG TGTTACGATG ATGATGATGA TGGCGAAAAA AAAACTGTTG 2049 GACTGATGAT GTGCCAACAT GGAGTAGACC AGCTCTGTAT GCTATCATGT GTGTGTGGTG 2109 TTGTTACCTG TGGTTTGTTC TATCTGGGCG TGGTCCTGGT GTAAATCTGT ATGCCTGTTC 2169 GGCGGCCTGG TCCTGGTGTA AATCTGGGCG TGCTTTGCAT CTTGCCCGTG T 2220
【００６９】配列番号 :２ 配列の長さ : 2245 配列の型 :核酸 配 列 CCTCGGCGGC CGGCGCACGT CGCTGCTCCC GACGCTCGAA CGAG ATG GCG TCG CCG 56 Met Ala Ser Pro 1 AAC GGT GGT GTC ACG ACC TAC GAC TAC CAC GAC AGC GAC AGC GCG GCG 104 Asn Gly Gly Val Thr Thr Tyr Asp Tyr His Asp Ser Asp Ser Ala Ala 5 10 15 20 CCG GTG AAC GCG CAG ACC ATC GAA GAG CTG CAT TCG CTG CAG CGG AAG 152 Pro Val Asn Ala Gln Thr Ile Glu Glu Leu His Ser Leu Gln Arg Lys 25 30 35 GCT GCC ACC ACG ACC AAG GAT GGC GCA TCG CCC CTG CAG TCC ATC AGC 200 Ala Ala Thr Thr Thr Lys Asp Gly Ala Ser Pro Leu Gln Ser Ile Ser 40 45 50 GCG TCA TTG GCG TCT CTG GCA CGT GAA TAT GGC CCC AAC CTC GTC AAG 248 Ala Ser Leu Ala Ser Leu Ala Arg Glu Tyr Gly Pro Asn Leu Val Lys 55 60 65 GGT GAC CCG GAA GCG ACC AAG GGC GCG CCG CCG GTG CCG ATA AAG CAC 296 Gly Asp Pro Glu Ala Thr Lys Gly Ala Pro Pro Val Pro Ile Lys His 70 75 80 CAG CAG CCC TCC GCC GCC GCT GCC ACC ATC GCC GCC AGC GAC AGC TCC 344 Gln Gln Pro Ser Ala Ala Ala Ala Thr Ile Ala Ala Ser Asp Ser Ser 85 90 95 100 CTC AAG TTC ACC CAT GTC CTC TAC AAC CTC TCC CCC GCT GAG TTG TAC 392 Leu Lys Phe Thr His Val Leu Tyr Asn Leu Ser Pro Ala Glu Leu Tyr 105 110 115 GAG CAG GCT TTC GGC CAA AAG AAG AGT TCG TTC ATC ACG TCG ACC GGC 440 Glu Gln Ala Phe Gly Gln Lys Lys Ser Ser Phe Ile Thr Ser Thr Gly 120 125 130 GCG CTG GCC ACG CTG TCC GGC GCC AAG ACC GGC CGG TCG CCC AGG GAC 488 Ala Leu Ala Thr Leu Ser Gly Ala Lys Thr Gly Arg Ser Pro Arg Asp 135 140 145 AAG CGT GTC GTC AAG GAC GAG ACC ACC TCA CAG GAG CTC TGG TGG GGC 536 Lys Arg Val Val Lys Asp Glu Thr Thr Ser Gln Glu Leu Trp Trp Gly 150 155 160 AAG GGC TCG CCC AAC ATC GAG ATG GAC GAG CGC CAG TTC GTG ATC AAC 584 Lys Gly Ser Pro Asn Ile Glu Met Asp Glu Arg Gln Phe Val Ile Asn 165 170 175 180 AGG GAG CGG GCC CTG GAC TAC CTC AAC TCA CTG GAC AAG GTG TAC GTC 632 Arg Glu Arg Ala Leu Asp Tyr Leu Asn Ser Leu Asp Lys Val Tyr Val 185 190 195 AAC GAC CAG TTC CTC AAC TGG GAC TCG GAG AAC CGC ATC AAG GTC CGC 680 Asn Asp Gln Phe Leu Asn Trp Asp Ser Glu Asn Arg Ile Lys Val Arg 200 205 210 ATC ATC ACC TCC AGG GCG TAC CAC GCC CTC TTT ATG CAC AAC ATG TGC 728 Ile Ile Thr Ser Arg Ala Tyr His Ala Leu Phe Met His Asn Met Cys 215 220 225 ATC CGG CCC ACG GAA GAG GAG CTG GAG AGC TTC GGC ACG CCG GAC TTC 776 Ile Arg Pro Thr Glu Glu Glu Leu Glu Ser Phe Gly Thr Pro Asp Phe 230 235 240 ACC ATT TAC AAC GCC GGG GAG TTC CCC GCC AAC CGT TAC GCC AAC TAC 824 Thr Ile Tyr Asn Ala Gly Glu Phe Pro Ala Asn Arg Tyr Ala Asn Tyr 245 250 255 260 ATG ACG TCG TCG ACG AGC ATA AAC ATC AGC CTC GCT AGG AGG GAG ATG 872 Met Thr Ser Ser Thr Ser Ile Asn Ile Ser Leu Ala Arg Arg Glu Met 265 270 275 GTA ATC CTG GGC ACG CAG TAC GCC GGG GAG ATG AAG AAG GGG CTC TTT 920 Val Ile Leu Gly Thr Gln Tyr Ala Gly Glu Met Lys Lys Gly Leu Phe 280 285 290 GGC GTC ATG CAC TAC CTC ATG CCC AAG CGA GGC ATC CTC TCG CTG CAC 968 Gly Val Met His Tyr Leu Met Pro Lys Arg Gly Ile Leu Ser Leu His 295 300 305 TCC GGG TGC AAC ATG GGC AAG GAG GGT GAC GTC GCC CTC TTC TTT GGG 1016 Ser Gly Cys Asn Met Gly Lys Glu Gly Asp Val Ala Leu Phe Phe Gly 310 315 320 CTC TCA GGT ACC GGG AAG ACG ACG CTG TCA ACT GAC CAC AAT AGG CTC 1064 Leu Ser Gly Thr Gly Lys Thr Thr Leu Ser Thr Asp His Asn Arg Leu 325 330 335 340 CTG ATC GGT GAT GAC GAG CAC TGC TGG AGC GAC AAT GGC GTC TCC AAC 1112 Leu Ile Gly Asp Asp Glu His Cys Trp Ser Asp Asn Gly Val Ser Asn 345 350 355 ATT GAG GGA GGT TGC TAT GCC AAG TGC ATT GAC CTG TCC CAG GAG AAG 1160 Ile Glu Gly Gly Cys Tyr Ala Lys Cys Ile Asp Leu Ser Gln Glu Lys 360 365 370 GAA CCT GAT ATC TGG AAC GCC ATC AAG TTT GGA ACT GTG CTG GAG AAC 1208 Glu Pro Asp Ile Trp Asn Ala Ile Lys Phe Gly Thr Val Leu Glu Asn 375 380 385 GTC GTC TTC AAC GAG CGC ACT CGT GAA GTT GAC TAC GCC GAC AAA TCT 1256 Val Val Phe Asn Glu Arg Thr Arg Glu Val Asp Tyr Ala Asp Lys Ser 390 395 400 ATC ACC GAG AAC ACC CGG GCC GCC TAC CCG ATC GAG TTC ATC CCC AAC 1304 Ile Thr Glu Asn Thr Arg Ala Ala Tyr Pro Ile Glu Phe Ile Pro Asn 405 410 415 420 GCC AAG ATC CCG TGC GTC GGG CCG CAC CCC AAG AAC GTC ATC CTC CTG 1352 Ala Lys Ile Pro Cys Val Gly Pro His Pro Lys Asn Val Ile Leu Leu 425 430 435 GCG TGC GAC GCG TAC GGC GTG CTC CCG CCG GTG AGC AAG CTC AAC CTG 1400 Ala Cys Asp Ala Tyr Gly Val Leu Pro Pro Val Ser Lys Leu Asn Leu 440 445 450 GCG CAG ACC ATG TAC CAC TTC ATC AGC GGC TAC ACC GCC ATC GTC GCC 1448 Ala Gln Thr Met Tyr His Phe Ile Ser Gly Tyr Thr Ala Ile Val Ala 455 460 465 GGC ACA GAG GAC GGC GTC AAG GAG CCG ACG GCC ACA TTC TCG GCC TGC 1496 Gly Thr Glu Asp Gly Val Lys Glu Pro Thr Ala Thr Phe Ser Ala Cys 470 475 480 TTC GGC GCG GCC TTC ATC ATG TAC CAC CCC ACC AAG TAC GCA GCC ATG 1544 Phe Gly Ala Ala Phe Ile Met Tyr His Pro Thr Lys Tyr Ala Ala Met 485 490 495 500 CTC GCC GAG AAG ATG CAG AAG TAC GGC GCC ACC GGG TGG CTT GTC AAC 1592 Leu Ala Glu Lys Met Gln Lys Tyr Gly Ala Thr Gly Trp Leu Val Asn 505 510 515 ACT GGC TGG TCC GGC GGC AGG TAC GGT GTG GGC AAC AGG ATC AAG CTG 1640 Thr Gly Trp Ser Gly Gly Arg Tyr Gly Val Gly Asn Arg Ile Lys Leu 520 525 530 CCG TAC ACC AGG AAG ATC ATC GAC GCC ATC CAC TCC GGC GAG CTC CTC 1688 Pro Tyr Thr Arg Lys Ile Ile Asp Ala Ile His Ser Gly Glu Leu Leu 535 540 545 AAC GCC AGC TAC AAG AAG ACC GAG GTG TTC GGG CTG GAG ATC CCC ACC 1736 Asn Ala Ser Tyr Lys Lys Thr Glu Val Phe Gly Leu Glu Ile Pro Thr 550 555 560 GCG ATC AAC GGC GTG CCG TCG GAA ATT CTC GAC CCC GTC AAC ACC TGG 1784 Ala Ile Asn Gly Val Pro Ser Glu Ile Leu Asp Pro Val Asn Thr Trp 565 570 575 580 ACG GAC AAG GCC GCG TAC AAG GAG ACG CTC CTG AAG CTT GCC GGG CTC 1832 Thr Asp Lys Ala Ala Tyr Lys Glu Thr Leu Leu Lys Leu Ala Gly Leu 585 590 595 TTC AAG AAC AAC TTC GAG GTG TTC GCC AGC TAC AAG ATC GGG AAC AAC 1880 Phe Lys Asn Asn Phe Glu Val Phe Ala Ser Tyr Lys Ile Gly Asn Asn 600 605 610 AAC AGC CTG ACA GAA CAG ATC CTC GCC GCA GCG CCC AAC TTC 1922 Asn Ser Leu Thr Glu Gln Ile Leu Ala Ala Ala Pro Asn Phe 615 620 625 TGATTCCAAG CAATGGATCT GGAACGGCGA GGCGATGGAG TTGGTTCAGA ATAAACCGGT 1982 GGTGCGTGCG TGCGTGTGTT ACGATGATGA TGATGGCAAA AAAAAAAACT GTTGGACTGA 2042 TTATGTGCCA ACATGCAGTA GACCAGCTCT GTATGCTATC ATGTGTGTGT GGTGGTGTTA 2102 CCTGTAAGGT TTGTTCTATC AGCTGGTTCG GCGGCCTGGT TCTGGTGTAA ATCTGGGCGT 2162 GCTTTGCATC TTGCCCGTGT ATTCCCTCTT GTTTCAGAAT TTGAATATAT ACTATCTTAT 2222 TTCCAAAAAA AAAAAAAAAA AAA 2245
【００７０】配列番号 :３ 配列の長さ : 2109 配列の型 :核酸 配 列 ATG GCC CCC TCC GTG ATG GCG TCG TCG GCC ACC ACC GTC GCT CCC TTC 48 Met Ala Pro Ser Val Met Ala Ser Ser Ala Thr Thr Val Ala Pro Phe 1 5 10 15 CAG GGG CTC AAG TCC ACC GCC GGC ATG CCC GTC GCC CGC CGC TCC GGC 96 Gln Gly Leu Lys Ser Thr Ala Gly Met Pro Val Ala Arg Arg Ser Gly 20 25 30 AAC TCC AGC TTC GGC AAC GTC AGC AAT GGC GGC AGG ATC AGG TGC ATG 144 Asn Ser Ser Phe Gly Asn Val Ser Asn Gly Gly Arg Ile Arg Cys Met 35 40 45 CAG TCT AGA TCT CTG GCA CGT GAA TAT GGC CCC AAC CTC GTC AAG GGT 192 Gln Ser Arg Ser Leu Ala Arg Glu Tyr Gly Pro Asn Leu Val Lys Gly 50 55 60 GAC CCG GAA GCG ACC AAG GGC GCG CCG CCG GTG CCG ATA AAG CAC CAG 240 Asp Pro Glu Ala Thr Lys Gly Ala Pro Pro Val Pro Ile Lys His Gln 65 70 75 80 CAG CCC TCC GCC GCC GCT GCC ACC ATC GCC GCC AGC GAC AGC TCC CTC 288 Gln Pro Ser Ala Ala Ala Ala Thr Ile Ala Ala Ser Asp Ser Ser Leu 85 90 95 AAG TTC ACC CAT GTC CTC TAC AAC CTC TCC CCC GCT GAG TTG TAC GAG 336 Lys Phe Thr His Val Leu Tyr Asn Leu Ser Pro Ala Glu Leu Tyr Glu 100 105 110 CAG GCT TTC GGC CAA AAG AAG AGT TCG TTC ATC ACG TCG ACC GGC GCG 384 Gln Ala Phe Gly Gln Lys Lys Ser Ser Phe Ile Thr Ser Thr Gly Ala 115 120 125 CTG GCC ACG CTG TCC GGC GCC AAG ACC GGC CGG TCG CCC AGG GAC AAG 432 Leu Ala Thr Leu Ser Gly Ala Lys Thr Gly Arg Ser Pro Arg Asp Lys 130 135 140 CGT GTC GTC AAG GAC GAG ACC ACC TCA CAG GAG CTC TGG TGG GGC AAG 480 Arg Val Val Lys Asp Glu Thr Thr Ser Gln Glu Leu Trp Trp Gly Lys 145 150 155 160 GGC TCG CCC AAC ATC GAG ATG GAC GAG CGC CAG TTC GTG ATC AAC AGG 528 Gly Ser Pro Asn Ile Glu Met Asp Glu Arg Gln Phe Val Ile Asn Arg 165 170 175 GAG CGG GCC CTG GAC TAC CTC AAC TCA CTG GAC AAG GTG TAC GTC AAC 576 Glu Arg Ala Leu Asp Tyr Leu Asn Ser Leu Asp Lys Val Tyr Val Asn 180 185 190 GAC CAG TTC CTC AAC TGG GAC TCG GAG AAC CGC ATC AAG GTC CGC ATC 624 Asp Gln Phe Leu Asn Trp Asp Ser Glu Asn Arg Ile Lys Val Arg Ile 195 200 205 ATC ACC TCC AGG GCG TAC CAC GCC CTC TTT ATG CAC AAC ATG TGC ATC 672 Ile Thr Ser Arg Ala Tyr His Ala Leu Phe Met His Asn Met Cys Ile 210 215 220 CGG CCC ACG GAA GAG GAG CTG GAG AGC TTC GGC ACG CCG GAC TTC ACC 720 Arg Pro Thr Glu Glu Glu Leu Glu Ser Phe Gly Thr Pro Asp Phe Thr 225 230 235 240 ATT TAC AAC GCC GGG GAG TTC CCC GCC AAC CGT TAC GCC AAC TAC ATG 768 Ile Tyr Asn Ala Gly Glu Phe Pro Ala Asn Arg Tyr Ala Asn Tyr Met 245 250 255 ACG TCG TCG ACG AGC ATA AAC ATC AGC CTC GCT AGG AGG GAG ATG GTA 816 Thr Ser Ser Thr Ser Ile Asn Ile Ser Leu Ala Arg Arg Glu Met Val 260 265 270 ATC CTG GGC ACG CAG TAC GCC GGG GAG ATG AAG AAG GGG CTC TTT GGC 864 Ile Leu Gly Thr Gln Tyr Ala Gly Glu Met Lys Lys Gly Leu Phe Gly 275 280 285 GTC ATG CAC TAC CTC ATG CCC AAG CGA GGC ATC CTC TCG CTG CAC TCC 912 Val Met His Tyr Leu Met Pro Lys Arg Gly Ile Leu Ser Leu His Ser 290 295 300 GGG TGC AAC ATG GGC AAG GAG GGT GAC GTC GCC CTC TTC TTT GGG CTC 960 Gly Cys Asn Met Gly Lys Glu Gly Asp Val Ala Leu Phe Phe Gly Leu 305 310 315 320 TCA GGT ACC GGG AAG ACG ACG CTG TCA ACT GAC CAC AAC AGG CTC CTG 1008 Ser Gly Thr Gly Lys Thr Thr Leu Ser Thr Asp His Asn Arg Leu Leu 325 330 335 ATC GGT GAT GAC GAG CAC TGC TGG AGC GAC AAT GGC GTC TCC AAC ATT 1056 Ile Gly Asp Asp Glu His Cys Trp Ser Asp Asn Gly Val Ser Asn Ile 340 345 350 GAG GGA GGT TGC TAT GCC AAG TGC ATC GAC CTG TCC AAG GAG AAA GAA 1104 Glu Gly Gly Cys Tyr Ala Lys Cys Ile Asp Leu Ser Lys Glu Lys Glu 355 360 365 CCT GAT ATC TGG AAC GCC ATC ACG TTT GGA ACA GTG CTG GAA AAC GTC 1152 Pro Asp Ile Trp Asn Ala Ile Thr Phe Gly Thr Val Leu Glu Asn Val 370 375 380 GTC TTC AAC GAG CGC ACT CGT GAA GTT GAC TAC GCC GAC AAA TCT ATC 1200 Val Phe Asn Glu Arg Thr Arg Glu Val Asp Tyr Ala Asp Lys Ser Ile 385 390 395 400 ACC GAG AAC ACC CGG GCC GCC TAC CCG ATC GAG TTC ATC CCC AAC GCC 1248 Thr Glu Asn Thr Arg Ala Ala Tyr Pro Ile Glu Phe Ile Pro Asn Ala 405 410 415 AAG ATC CCA TGC GTC GGG CCG CAC CCC AAG AAC GTC ATC CTC CTG GCC 1296 Lys Ile Pro Cys Val Gly Pro His Pro Lys Asn Val Ile Leu Leu Ala 420 425 430 TGC GAC GCG TAC GGC GTG CTC CCG CCG GTG AGC AAG CTC AAC CTG GCG 1344 Cys Asp Ala Tyr Gly Val Leu Pro Pro Val Ser Lys Leu Asn Leu Ala 435 440 445 CAG ACC ATG TAC CAC TTC ATC AGC GGC TAC ACT GCC ATC GTC GCC GGC 1392 Gln Thr Met Tyr His Phe Ile Ser Gly Tyr Thr Ala Ile Val Ala Gly 450 455 460 ACG GAG GAC GGC GTC AAG GAG CCG ACG GCG ACC TTC TCG GCC TGC TTC 1440 Thr Glu Asp Gly Val Lys Glu Pro Thr Ala Thr Phe Ser Ala Cys Phe 465 470 475 480 GGC GCG GCC TTC ATC ATG TAC CAC CCC ACC AAG TAC GCC GCC ATG CTC 1488 Gly Ala Ala Phe Ile Met Tyr His Pro Thr Lys Tyr Ala Ala Met Leu 485 490 495 GCC GAG AAG ATG CAG AAG TAC GGC CGC ACC GGG TGG CTT GTC AAC ACC 1536 Ala Glu Lys Met Gln Lys Tyr Gly Arg Thr Gly Trp Leu Val Asn Thr 500 505 510 GGC TGG TCC GGC GGC AGG TAC GGT GTG GGC AAC AGG ATC AAG CTG CCG 1584 Gly Trp Ser Gly Gly Arg Tyr Gly Val Gly Asn Arg Ile Lys Leu Pro 515 520 525 TAC ACC AGG AAG ATC ATC GAC GCC ATC CAC TCC GGC GAG CTC CTC ACC 1632 Tyr Thr Arg Lys Ile Ile Asp Ala Ile His Ser Gly Glu Leu Leu Thr 530 535 540 GCC AAC TAC AAG AAG ACC GAG GTG TTC GGG CTG GAG ATC CCC ACC GAG 1680 Ala Asn Tyr Lys Lys Thr Glu Val Phe Gly Leu Glu Ile Pro Thr Glu 545 550 555 560 ATC AAC GGC GTG CCG TCG GAA ATC CTC GAC CCC GTC AAC ACC TGG ACG 1728 Ile Asn Gly Val Pro Ser Glu Ile Leu Asp Pro Val Asn Thr Trp Thr 565 570 575 GAC AAG GCC GCG TAC AAG GAG ACT CTC CTG AAG CTT GCC GGG CTC TTC 1776 Asp Lys Ala Ala Tyr Lys Glu Thr Leu Leu Lys Leu Ala Gly Leu Phe 580 585 590 AAG AAC AAC TTC GAG GTG TTC GCC AGC TAC AAG ATC GGG GAC GAC AAC 1824 Lys Asn Asn Phe Glu Val Phe Ala Ser Tyr Lys Ile Gly Asp Asp Asn 595 600 605 AGC CTG ACC GAA CAG ATC CTT GCC GCA GGC CCC AAC TTC TGATTCCAAG 1873 Ser Leu Thr Glu Gln Ile Leu Ala Ala Gly Pro Asn Phe 610 615 620 CAATGGATCC GGAACGGCGA GGCGTTGGAG TTGGTTCAGA ATGAACCAGT GGTGCGTGTG 1933 TGCGTGCGTG TGTTACGATG ATGATGATGA TGGCGAAAAA AAAACTGTTG GACTGATGAT 1993 GTGCCAACAT GGAGTAGACC AGCTCTGTAT GCTATCATGT GTGTGTGGTG TTGTTACCTG 2053 TGGTTTGTTC TATCTGGGCG TGGTCCTGGT GTAAATCTGT ATGCCTGTTC GGCGGC 2109
【図面の簡単な説明】
【図１】ウロクロア・パニコイデスの完全長ｃＤＮＡ配
列ＰＣＫ１を得るために用いたｃＤＮＡ断片の位置と長
さを示す図である。
【図２】ウロクロア・パニコイデスの完全長ｃＤＮＡ配
列ＰＣＫ２を得るために用いたｃＤＮＡ断片の位置と長
さを示す図である。
【図３】ＰＣＫ１とＰＣＫ２がコードするアミノ酸配列
を比較して示す図である。
【図４】イネの形質転換に用いた組換えベクターの挿入
ＤＮＡ部分を示す遺伝子地図である。
【図５】イネ形質転換体におけるＰＣＫタンパク質の局
在性を示す模式図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ //(Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｃ Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 9/88 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 パトリック・エム・フィネガン オーストラリア国・ブリスベン・キュー 4001・ジョージストリート２ クィーン ズランド・ユニバーシティ・オブ・テク ノロジー、スクール・オブ・ライフサイ エンス、センター・フォー・モレキュラ ー・バイオテクノロジー内 (72)発明者 ジェイムズ・エヌ・バーネル オーストラリア国・タウンズビル・キュ ー１ディー．4811・ジェームズ・クッ ク・ユニバーシティ・オブ・ノース・ク ィーンズランド (56)参考文献 ＭＡＴＳＹＯＫＡ，Ｍ． ｅｔ ａ ｌ．， Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅ ｔ．， ｖｏｌ．225． ｐｐ．411− 419 （991) ＨＵＤＳＰＥＴＨ，Ｒ．Ｌ． ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏ ｌ．， ｖｏｌ．12， ｐｐ．579−589 （1989) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 15/09 ZNA A01H 5/00 ZNA ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＰＩＲ／ＧｅｎｅＳ ｅｑ ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／Ｇ ｅｎｅＳｅｑ ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ)

Claims (26)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 配列表の配列番号１に示されるアミノ酸
    配列又は該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミ
    ノ酸が付加、欠失、挿入若しくは置換されておりかつホ
    スホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ活性を有す
    るポリペプチドをコードする、クローン化されたＤＮ
    Ａ。
  2. 【請求項２】 配列表の配列番号１に示されるアミノ酸
    配列をコードする請求項１記載のＤＮＡ。
  3. 【請求項３】 配列表の配列番号１に示されるアミノ酸
    配列の５７番目のセリン以降のアミノ酸配列又は該アミ
    ノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が付加、欠
    失、挿入若しくは置換されておりかつホスホエノールピ
    ルビン酸カルボキシキナーゼ活性を有するポリペプチド
    をコードする、クローン化されたＤＮＡ。
  4. 【請求項４】 配列表の配列番号１に示されるアミノ酸
    配列の５７番目のセリン以降のアミノ酸配列をコードす
    る請求項３記載のＤＮＡ。
  5. 【請求項５】 配列表の配列番号１に示されるアミノ酸
    配列の６１番目のグルタミン酸以降のアミノ酸配列又は
    該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が付
    加、欠失、挿入若しくは置換されておりかつホスホエノ
    ールピルビン酸カルボキシキナーゼ活性を有するポリペ
    プチドをコードする、クローン化されたＤＮＡ。
  6. 【請求項６】 配列表の配列番号１に示されるアミノ酸
    配列の６１番目のグルタミン酸以降のアミノ酸配列をコ
    ードする請求項５記載のＤＮＡ。
  7. 【請求項７】 配列表の配列番号１に示されるアミノ酸
    配列の６６番目のロイシン以降のアミノ酸配列又は該ア
    ミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が付加、
    欠失、挿入若しくは置換されておりかつホスホエノール
    ピルビン酸カルボキシキナーゼ活性を有するポリペプチ
    ドをコードする、クローン化されたＤＮＡ。
  8. 【請求項８】 配列表の配列番号１に示されるアミノ酸
    配列の６６番目のロイシン以降のアミノ酸配列をコード
    する請求項７記載のＤＮＡ。
  9. 【請求項９】 配列表の配列番号１に示されるアミノ酸
    配列の６９番目のグリシン以降のアミノ酸配列又は該ア
    ミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が付加、
    欠失、挿入若しくは置換されておりかつホスホエノール
    ピルビン酸カルボキシキナーゼ活性を有するポリペプチ
    ドをコードする、クローン化されたＤＮＡ。
  10. 【請求項１０】 配列表の配列番号１に示されるアミノ
    酸配列の６９番目のグリシン以降のアミノ酸配列をコー
    ドする請求項９記載のＤＮＡ。
  11. 【請求項１１】 配列表の配列番号１に示されるアミノ
    酸配列の７５番目のグリシン以降のアミノ酸配列又は該
    アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が付
    加、欠失、挿入若しくは置換されておりかつホスホエノ
    ールピルビン酸カルボキシキナーゼ活性を有するポリペ
    プチドをコードする、クローン化されたＤＮＡ。
  12. 【請求項１２】 配列表の配列番号１に示されるアミノ
    酸配列の７５番目のグリシン以降のアミノ酸配列をコー
    ドする請求項１１記載のＤＮＡ。
  13. 【請求項１３】 配列表の配列番号１に示される塩基配
    列の対応部分の塩基配列を有する請求項１ないし１２の
    いずれか１項に記載のＤＮＡ。
  14. 【請求項１４】 配列表の配列番号２に示されるアミノ
    酸配列又は該アミノ酸配列において１若しくは数個のア
    ミノ酸が付加、欠失、挿入若しくは置換されておりかつ
    ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ活性を有
    するポリペプチドをコードする、クローン化されたＤＮ
    Ａ。
  15. 【請求項１５】 配列表の配列番号２に示されるアミノ
    酸配列をコードする請求項１４記載のＤＮＡ。
  16. 【請求項１６】 配列表の配列番号２に示されるアミノ
    酸配列の５７番目のセリン以降のアミノ酸配列又は該ア
    ミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が付加、
    欠失、挿入若しくは置換されておりかつホスホエノール
    ピルビン酸カルボキシキナーゼ活性を有するポリペプチ
    ドをコードする、クローン化されたＤＮＡ。
  17. 【請求項１７】 配列表の配列番号２に示されるアミノ
    酸配列の５７番目のセリン以降のアミノ酸配列をコード
    する請求項１６記載のＤＮＡ。
  18. 【請求項１８】 配列表の配列番号２に示される塩基配
    列の対応部分の塩基配列を有する請求項１４ないし１７
    のいずれか１項に記載のＤＮＡ。
  19. 【請求項１９】 配列表の配列番号３に示されるアミノ
    酸配列又は該アミノ酸配列において１若しくは数個のア
    ミノ酸が付加、欠失、挿入若しくは置換されておりかつ
    ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ活性を有
    するポリペプチドをコードする、クローン化されたＤＮ
    Ａ。
  20. 【請求項２０】 配列表の配列番号３に示されるアミノ
    酸配列をコードする請求項１９記載のＤＮＡ。
  21. 【請求項２１】 配列表の配列番号３に示されるアミノ
    酸配列の５２番目のセリン以降のアミノ酸配列又は該ア
    ミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が付加、
    欠失、挿入若しくは置換されておりかつホスホエノール
    ピルビン酸カルボキシキナーゼ活性を有するポリペプチ
    ドをコードする、クローン化されたＤＮＡ。
  22. 【請求項２２】 配列表の配列番号３に示されるアミノ
    酸配列の５２番目のセリン以降のアミノ酸配列をコード
    する請求項２１記載のＤＮＡ。
  23. 【請求項２３】 配列表の配列番号３に示される塩基配
    列の対応部分の塩基配列を有する請求項１９ないし２２
    のいずれか１項に記載のＤＮＡ。
  24. 【請求項２４】 請求項１ないし２３のいずれか１項に
    記載のＤＮＡを含み、宿主細胞中で該ＤＮＡを発現する
    ことができる組換えベクター。
  25. 【請求項２５】 請求項２４記載の組換えベクターで形
    質転換され、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナ
    ーゼを産生する植物。
  26. 【請求項２６】 イネである請求項２５記載の植物。
JP13600095A 1994-07-09 1995-05-10 ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼをコードするｄｎａ、それを含む組換えベクター及び形質転換植物 Expired - Fee Related JP3521161B2 (ja)

Priority Applications (11)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP13600095A JP3521161B2 (ja) 1994-07-09 1995-05-10 ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼをコードするｄｎａ、それを含む組換えベクター及び形質転換植物
EP95924518A EP0723012B1 (en) 1994-07-09 1995-07-06 Dna coding for phosphoenolpyruvate carboxykinase, recombinant vector containing the same, and transgenic plant
PCT/JP1995/001356 WO1996001895A1 (fr) 1994-07-09 1995-07-06 Adn codant pour la phosphoenolpyvurate-carboxykinase, vecteur recombine le contenant et plantes transgeniques
KR1019960701223A KR960705043A (ko) 1994-07-09 1995-07-06 포스포에놀피루브산 카르복시키나아제를 코오드하는 dna, 그것을 함유하는 재조합된 벡터 및 형질전환식물(dna coding for phosphoenolpyruvate carboxykinase, recombinant vector containing the same, and transgenic plant)
BR9506038A BR9506038A (pt) 1994-07-09 1995-07-06 Dna clonato vetor recombinante e planta
AU28989/95A AU686410B2 (en) 1994-07-09 1995-07-06 Dna coding for phosphoenolpyruvate carboxykinase, recombinant vector containing the same, and transgenic plant
US08/617,801 US5880334A (en) 1994-07-09 1995-07-06 DNA encoding phosphoenolpyruvate carboxykinase, recombinant vector and transformed plant containing the same
AT95924518T ATE286972T1 (de) 1994-07-09 1995-07-06 Für phosphoenolpyruvatcarboxykinase kodierende dna, sie enthaltender rekombinanter vektor und transgene pflanze
DE69533918T DE69533918T2 (de) 1994-07-09 1995-07-06 Für phosphoenolpyruvatcarboxykinase kodierende dna, sie enthaltender rekombinanter vektor und transgene pflanze
CA002171470A CA2171470A1 (en) 1994-07-09 1995-07-06 Dna encoding phosphoenolpyruvate caboxykinase, recombinant vector and transformed plant containing the same
CN95190782A CN1100874C (zh) 1994-07-09 1995-07-06 编码磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的dna及其应用,含所述dna的重组载体和植物细胞

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP18075694 1994-07-09
JP6-180756 1994-07-09
JP13600095A JP3521161B2 (ja) 1994-07-09 1995-05-10 ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼをコードするｄｎａ、それを含む組換えベクター及び形質転換植物

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JPH0880197A JPH0880197A (ja) 1996-03-26
JP3521161B2 true JP3521161B2 (ja) 2004-04-19

Family

ID=26469700

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP13600095A Expired - Fee Related JP3521161B2 (ja) 1994-07-09 1995-05-10 ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼをコードするｄｎａ、それを含む組換えベクター及び形質転換植物

Country Status (11)

Country Link
US (1) US5880334A (ja)
EP (1) EP0723012B1 (ja)
JP (1) JP3521161B2 (ja)
KR (1) KR960705043A (ja)
CN (1) CN1100874C (ja)
AT (1) ATE286972T1 (ja)
AU (1) AU686410B2 (ja)
BR (1) BR9506038A (ja)
CA (1) CA2171470A1 (ja)
DE (1) DE69533918T2 (ja)
WO (1) WO1996001895A1 (ja)

Families Citing this family (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ID21006A (id) * 1997-02-10 1999-04-08 Japan Tobacco Inc Siklus c4 jenis pck
JP3210960B2 (ja) 1997-03-11 2001-09-25 農林水産省農業生物資源研究所長 Ｃ４植物の光合成酵素を発現するｃ３植物体
US7135617B2 (en) * 1998-07-02 2006-11-14 Calgene Llc Diacylglycerol acyl transferase proteins
CA2307060C (en) * 1998-08-24 2006-02-14 Japan Tobacco Inc. Nucleic acids having promoter activity and transgenic plants containing the same
US6178919B1 (en) * 1998-12-28 2001-01-30 Lam Research Corporation Perforated plasma confinement ring in plasma reactors
US7053203B1 (en) * 1999-05-25 2006-05-30 Natl. Institute of Agrobiological Sciences Gene controlling ethylene synthesis
CA2441265A1 (en) * 2001-03-16 2002-09-26 Basf Plant Science Gmbh Sugar and lipid metabolism regulators in plants
FR2823064B1 (fr) * 2001-04-04 2004-05-28 Biogemma Fr Procede d'obtention de plantes c4 a metabolisme carbone modifie
FR2823063B1 (fr) * 2001-04-04 2004-05-28 Biogemma Fr Procede d'obtention de plantes c4 a metabolisme carbone modifie
CA2492205A1 (en) * 2002-07-31 2004-02-05 Monsanto Technology, Llc Diacylglycerol acyltransferase nucleic acid sequences and associated products
US7534602B2 (en) * 2003-12-12 2009-05-19 Food Industry Research & Development Institute Promoters and usage thereof

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2673642B1 (fr) * 1991-03-05 1994-08-12 Rhone Poulenc Agrochimie Gene chimere comprenant un promoteur capable de conferer a une plante une tolerance accrue au glyphosate.
US5591616A (en) * 1992-07-07 1997-01-07 Japan Tobacco, Inc. Method for transforming monocotyledons

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ＨＵＤＳＰＥＴＨ，Ｒ．Ｌ． ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．， ｖｏｌ．１２， ｐｐ．５７９−５８９ （１９８９）
ＭＡＴＳＹＯＫＡ，Ｍ． ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．， ｖｏｌ．２２５． ｐｐ．４１１−４１９ （９９１）

Also Published As

Publication number Publication date
AU2898995A (en) 1996-02-09
EP0723012B1 (en) 2005-01-12
CN1100874C (zh) 2003-02-05
EP0723012A1 (en) 1996-07-24
US5880334A (en) 1999-03-09
CN1134171A (zh) 1996-10-23
JPH0880197A (ja) 1996-03-26
KR960705043A (ko) 1996-10-09
CA2171470A1 (en) 1996-01-25
AU686410B2 (en) 1998-02-05
DE69533918T2 (de) 2005-12-01
DE69533918D1 (de) 2005-02-17
EP0723012A4 (en) 1997-06-25
WO1996001895A1 (fr) 1996-01-25
ATE286972T1 (de) 2005-01-15
BR9506038A (pt) 1997-10-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP0633317B1 (fr) Séquence d'ADN isolée pouvant servir de zone terminatrice dans un gène chimère utilisable pour la transformation des plantes
JP3149951B2 (ja) イネ種子中のグルテリン量の低減方法
JP2911450B2 (ja) 除草性グルタミンシンテターゼ阻害剤に対し耐性の植物細胞
JPH06502759A (ja) 組換えａｃｃシンターゼ
JP3521161B2 (ja) ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼをコードするｄｎａ、それを含む組換えベクター及び形質転換植物
CA2266626A1 (en) Expression of globin proteins in plants
AU729520B2 (en) PCK-Type C4 cycle
EP1498027B1 (en) Plant with improved organogenesis and method of constructing the same
CN112458097B (zh) 金属硫蛋白DaMT2a及其编码基因的应用
US6239332B1 (en) Constructs and methods for enhancing protein levels in photosynthetic organisms
JP5787413B2 (ja) 塊茎生産能または匍匐枝形成能が野生株に比して向上している匍匐枝形成植物の作製方法、当該方法によって作製された匍匐枝形成植物
WO2007086282A1 (ja) ストレス応答性遺伝子が導入された形質転換植物
CN113481210B (zh) 棉花GhDof1.7基因在促进植物耐盐中的应用
CN112143737B (zh) OsbZIP62-VP64融合表达改良水稻农艺性状的应用
WO2006057306A1 (ja) ストレス耐性及び／又は生産性を改良したイネ科植物、及びその作出方法
CN114085854A (zh) 一种水稻抗旱、耐盐基因OsSKL2及其应用
CN114621978B (zh) 拟南芥糖基转移酶ugt84a1在促进植物叶片生长方面的应用
KR102443895B1 (ko) 식물의 건조 스트레스 내성 반응에 관여하는 신규 유전자 및 이의 용도
KR101064590B1 (ko) 인산결핍조건에서 발현되는 벼 탈인산화효소 유전자 ＯｓＰＡＰ１ 및 형질전환 식물체
CN113061172B (zh) 一种植物耐盐性相关的lip1蛋白质及其相关生物材料与应用
KR102072276B1 (ko) 식물의 저온 스트레스 저항성을 증진시키는 신규 유전자 및 이의 용도
KR20170034771A (ko) 토마토로부터 분리된 PNGase T 유전자로 형질전환된 식물체 및 이를 이용하여 PNGase T 단백질을 생산하는 방법
JP2004016201A (ja) 花芽形成抑制遺伝子及び早期開花性が付与された植物
AU2007237226B2 (en) Plants with improved morphogenesis and method of constructing the same
JP4119200B2 (ja) アデニン・リボースリン酸転移酵素（ａｐｒｔ）からなる形質転換体獲得効率向上剤および植物の初期成育向上剤

Legal Events

Date Code Title Description
A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20040202

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

LAPS Cancellation because of no payment of annual fees