JPH06502759A - 組換えａｃｃシンターゼ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ９、請求項８に記載の細胞において、該細胞はバクテリア、イースト、藻類また は植物細胞であることを特徴とするホスト細胞。

１０、請求項５〜７に記載の発現ベクターを含むことを特徴とする植物性の物質 。

１１、請求項１０に記載の物質において、該物質は、植物性伝播物質であること を特徴とする植物性物質。

１２、請求項１０に記載の物質において、該物質はトランスジェニック植物であ ることを特徴とする植物性物質。

１３、請求項９の植物細胞から再生されたトランスジェニック植物。

１４、ＤＮＡの発現及びＡＣＣシンターゼの生成を可能とする条件下で請求項８ に記載の細胞を培養するステップと、培養からＡＣＣシンターゼを再生するステ ップと、を含むことを特徴とするＡＣＣシンターゼの調製方法。

１５、（ａ）その生成のために誘起された細胞または組織から部分純化誘起可能 なプロティンを調製するステップと； （ｂ）前記部分純化プロティンに対する抗体の第１組成物を調製するステップと ； （ｃ）前記抗体の第１組成物から、前記抗体の第１組成物を前記誘起されなかっ た細胞または組織と反応させることによって、前記部分的に純化された調製物内 を汚染する免疫反応性である抗体を除去し、前記誘起可能プロティンと免疫反応 性がある抗体の第２組成物を得るステップと：（ｄ）ｃＤＮＡ発現ライブラリー をスクリーニングして抗体の前記第２組成物と免疫反応させるステップであって 、前記発現ライブラリーは、前記プロティンの生成のために誘起された細胞また は組織から調製されるステップと：（ｅ）前記ライブラリーからの免疫反応性発 現コロニーを再生するステップと：を含むことを特徴とする、誘起プロティンを コード化するＤＮＡ配列を得る方法。

１６、組換えＡＣＣシンターゼ酵素。

１７、実質的に純粋な形態であり、高次植物（ｈｉｇｈｅｒ　ｐｌａｎｔ）から 派生した他のプロティンを含まないＡＣＣシンターゼ酵素。

１８、請求項１６のＡＣＣシンターゼと特異的に免疫反応する抗体組成物。

１９、請求項１７のＡＣＣシンターゼと特異的に免疫反応する抗体組成物。

２０　請求項１のＤＮＡの少なくとも一部分と相補的なヌクレオチド配列を含む 、ＡＣＣシンターゼをコードするｍＲＮＡの検出に有用なプローブ。

２１、ＡＣＣシンターゼをコードするｍＲＮＡ配列と相補的な配列のアンチセン スヌクレオチド配列。

２２、請求項２１に記載のアンチセンス配列を含み前記配列を発現可能な発現シ ステム。

２３、請求項二項２２載の発現システムにおいて、更に、アンチセンスヌクレオ チド配列へ実際に結合された核酸性のＲＮＡ内に転写されるＤＮＡを含む発現シ ステム。

２４、ＡＣＣＣＣシンターゼードする遺伝子配列に相補的なアンチセンスヌクレ オチド配列。

２５、請求項２４に記載のアンチセンス配列を含み該配列を発現可能な発現シス テム。

２６、ＡＣＣシンターゼモノマーと二量体を形成することが可能な突然変異した ＡＣＣＣＣシンターゼードするヌクレオチド配列。

２７、請求項２６に記載されたヌクレオチド配列を含み、該配列を発現可能な発 現システム。

２８　請求項２２．２３または２５に記載の発現システムをその物質内に含み、 十分なＡＣＣＣＣシンターゼ乏をもたらす特性を示すことのできるトランスジェ ニック植物。

２９、請求項２８に記載のトランスジェニック植物において、所望の特性は、成 熟に抵抗する果実の生成であることを特徴とするトランスジェニック植物。

３０、請求項２８に記載のトランスジェニック食物において、所望の特性は、老 化に対する耐性であることを特徴どするトランスジェニック植物。

３１、請求項２８に記載のトランスジェニック植物において、所望の特性は、通 常の時間枠内で発達しないことであることを特徴とするトランスジェニック植物 。

３２、請求項２６に記載の植物において、発現システムは、更に、アンチセンス ヌクレオチド配列へ実際に結合された核酸性のＲＮＡ内に転写されるＤＮＡを含 むことを特徴とする植物。

３３、請求項２２．２３または２５に記載の発現システムで植物物質をトランス フェクトしまたは形質転換するステップと、前記形質転換またはトランスフェク トされた物質から植物を培養するステップと、を含み、十分なＡＣＣシンターゼ 酵素の欠乏を生じさせる特性を示す植物の生成方法。

３４、請求項３３に記載の方法において、形質転換またはトランスフェクトされ た植物の所望の特性は、成熟果実の生成であることを特徴とする植物の生成方法 。

３５、請求項３３に記載の方法において、形質転換またはトランスフェクトされ た植物の記載された特性は、老化に対する耐性であることを特徴とする植物の生 成方法。

３６、請求項３３に記載の方法において、形質転換またはトランスフェクトされ た植物の所望特性は、通常の時間枠内において発達しないことであることを特徴 とする植物の生成方法。

３７、ＤＮＡ暗号付は配列の発現によって生成されたＡＣＣシンターゼが１−ア ミノンクロプロパン−１−カルボキシル酸（ＡＣＣ）の生成を行う条件下で請求 項９に記載の細胞を培養するステップと、前記ＡＣＣをエチレンへ変換するステ ップと、を含むことを特徴とするエチレンの生成方法。

３８、請求項３７に記載の方法において、ＡＣＣのエチレンへの変換は、ハイポ クロライド（ｈｙｐｏｃｈｌｏｒｉ　ｔｅ）を用いた処理を含むことを特徴とす るエチレンの生成方法。

３９、請求項３８に記載の方法に従って生成されたエチレンを、果実を成熟させ るために使用する方法。

４０、請求項の方法に従って生成されたエチレンを、エタノールを生成させるた めに使用する方法。

明細書 本発明は、高次植物におけるエチレン製造に必須である植物酵素ＡＣＣシンター ゼに関する。特に、本発明は、この酵素の製造及びその植物の成長制御特に植物 発生制御への使用のための組換え方法及び物質に関する。

背凧技術 酵素ＡＣＣシンターゼは、高次植物（ｈｉｇｈｅｒ　ｐｌａｎｔｓ）におけるエ チレン製造に必須のものである。エチレンは、果実成熟、種発芽、器官脱離、そ して葉及び７もの老化を含む植物成長における種々のイベントに関わることが周 知である。エチレン生成は、植物により完全に制御されており、アラキシンの適 用、巻回、無酸素条件、ウィルス感染、誘導因子処置、冷却、乾燥、及びカドミ ウム及びリチウムイオン等のイオンを含む種々の外部因子によって誘起される。

植物中のエチレン生成及び作用の研究が［植物生物学におけるエチレンＪ　（Ａ ｂｅｌｅｓＦ、Ｂ著、アカデミツクブレス社、ニューヨーク、１９８３年）等に 工己載されている。

また、高次植物中におけるエチレンの合成には、Ｓ−アデノシル　メチオニン（ ＡｄｏＭｅｔ）から１−アミノシクロプロパン−１−カルボキシル酸（ＡＣＣ） への変換である一定の制限ステップが含まれていることが周知である。この変換 は、酵素ＡＣＣＣＣシンターゼって触媒作用を受ける（ＥＣ４，４，１，１４） 。この酵素は、次の幾つかのソースから部分的に純化されてきた：　Ｎａｋｈｙ 　ｓ　ｉ　ｏ　ｌ　（１９８８）　λ９：９８９−９９０；Ｔｓａｉ、Ｄ、３． 、ｅｔｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ（１９８６）　８３ニア７５５−７７５ ９；Ｐｒ１ｖａｌｅ、Ｌ、Ｓ、、ｅｔ　ａｌ、、Ａｒｃｈ　Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｂ ｉ。

ｐｈｙｓ　（１９８７）２５３：３３３−３４０；　５ａｔｏ、Ｓ、、ｅｔ　ａ ｌ。

、Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ（１９８８）８８：１０９　１１４；　ＶａｎＡ ＣＣシンターゼのレベルがエチレンの生成を制御するので、この酵素のレベルの 制御によってエチレンレベルの制御が可能となり、従ってエチレンによって制御 される植物成長及び発達様態の調節が可能となる。ここで本発明によって得られ るＡＣＣシンターゼ遺伝子を使用できることによってこのような調節を可能とす る組換え物質を構成することが可能となる。更に、ＡＣＣシンターゼを使用でき ることによってこの化学物質の工業的製造に有用なエチレン前駆体及びその生成 物例えばエタノールの大規模生産が可能となる。

本発明に次いで、　ファン　デア　シュトラエテン　Ｄ他は、トマトからｃＤＮ Ａ符号化ＡＣＣシンターゼのクローニング及びシーケンスを報告した（Ｐｒ。

ｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ（１９９０）８７：４８５９−４８６ ３）。約５５ｋｄの開放読み出しフレームに対応したｃＤＮＡがＥ、ｃｏｌｉに おいて５５ｋｄペプチドを生成したが、このプロティンがＡＣＣシンターゼを表 すとすると、それはデータからは明瞭ではない。

発明の開示 本発明は、植物及のＡＣＣシンターゼのレベル及びその部分の制御を可能とする 組換え物質及び組換え技術、及びエチレンの大規模非石油依存性生成方法を提供 するものである。ズッキーニ（ｚｕｃｃｈｉｎｉ）のＡＣＣシンターゼをコード するｃＤＮＡの生殖によって、ズッキーニ及び高次植物中のＡＣＣシンターゼ範 囲からの交互のＡＣＣシンターゼに対応する組換え物質へアクセス可能となる。

これによって、商業的興味対象である種々の幅広い植物における成長及び活性が 制御可能となる。

従って、−の様態においては、本発明は、高次植物の酵素ＡＣＣシンターゼをコ ードするＤＮＡ配列から本質的に構成される純化及び分離された形態でのＤＮＡ に関する。他の態様においては、本発明は、前記ＡＣＣシンターゼをコードする ＤＮＡの発現に有効な発現システム、この発現システムで形質転換される組換え ホスト、及びこれらの形質転換されたホストを用いたＡＣＣシンターゼ製造方法 に関する。

他の様態においては、本発明は、アンチセンス構造におけるＡＣＣシンターゼの ためのコード化された配列を用いた、或いはＡＣＣシンターゼ遺伝子をその突然 変位形態と代替することによってＡＣＣシンターゼ生成を制御する方法に関する 。

他の様態においては、本発明は、符号化する純化プロティンを必要とすることな く誘起ｃＤＮＡを分離する新規な方法に関する。

図面の簡単な説明 図１は、ズッキーニＡＣＣシンターゼ酵素をコード化する２個のクローンの制限 マツプを示す図−図ＩＢはこれらのクローンの内の一つのヌクレオチド及び導出 されたアミノ酸配列を示す図である。

図２Ａ−２Ｃは、ズッキーニからのＡＣＣシンターゼの純化における各クロマト グラフィツクステップにおける溶出（溶離）パターンを示す図である。

図３は、ズッキーニからのＡＣＣシンターゼの純化における最終ステップの溶出 パターンを示す図である。

図４は、図３のフラクションの５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲルを示す図である 。

図５は、ズッキーニＡＣＣシンターゼをコード化するｃＤＮＡへのハイブリダイ ゼーションによって得られたゲノムクローンの制限マツプを示す図である。図５ Ａは、ゲノム上のコード化シーケンスの位置と検索されたクローンとの一致を示 す図である。図５Ｂは、ゲノム上の配列の制限マツプを示す図である。図５０は 、２個のズッキーニＡＣＣシンターゼ遺伝子ＣＰ−ＡＣＣＩＡ及びＣＰ−ＡＣＣ ＩＢの機能部分を示す図である。

図６は、ＣＰ−ＡＣＣＩＡを表すゲノムクローン完全ヌクレオチド配列及び導出 アミノ酸配列を示す図である。制御領域及びコード化領域双方が示されている。

図７は、ＣＰ−ＡＣＣＩＢを表すゲノムクリーンの完全ヌクレオチド配列及び導 出アミノ酸配列を示す図である。制御領域及びコード化領域双方が示されている 。

図８は、トマトＡＣＣシンターゼをコードするｅＤＮＡのヌクレオチド及び推定 アミノ酸配列を示す図である。

図９は、トマトＡＣＣシンターゼをコードするｃＤＮＡの種々のクローンの図及 び制限マツプを示す図である。

図１０は、ズッキーニゲノム配列ＣＰ−ＡＣＣＩＡによりコード化されたＡＣＣ シンターゼのアミノ酸配列とトマトゲノム配列ＡＣＣ２との比較を示す図である 。

図１１は、ＬＥ−ＡＣＣＩＡ、ＬＥ−ＡＣＣＩＢ及びＬＥ−ＡＣＣ３に対するコ ード化及び制御シーケンスを含むトマトゲノムに対するゲノムクローンのノくタ ーン及びその機能図を示す図である。

図１２は、ＬＥ−ＡＣＣ２に対する遺伝子のゲノムクローン及び組織化のノくタ ーンを示す図である。

図１３は、制御シーケンスおを含むＬＥ−ＡＣＣ２の完全ゲノム及び推定アミノ 酸配列を示す図である。

図１４は、ＡＣＣシンターゼに対する２個のゲノムズ・ソキーニクローン及び４ 個のゲノムトマトクローンからの推定アミノ酸配列の比較を示す図である。

図１５は、バクテリアにおけるトマトＡＣＣシンターゼの生成のためのノ〈クチ リア発現ベクターの結合領域及び制限マツプを示す図である。

図１６は、誘起ＩＰＴＧの存在及び不存在下における図１５のベクターで形質転 換されたバクテリア培養によるＡＣＣの生成を示す図である。

図１７は、バクテリア抽出物の２次元クロマトグラフィツクゲルのノ＼−フトー ン写真であり、バクテリア培養は正反不正方向におけるフード化配列を有するト マトＡＣＣンンターゼのための発現ベクターで形質転換されている図である。

図１８は、アンチセンス方向へ指向されたトマトＡＣＣシンターゼ遺伝子のため の発現ベクターの構成を示す図である。

図１９及び２０は、授粉からの経過日数の関数として、図１８のベクターで形質 転換されたトマトコチレドンから再発生したトマト植物によるエチレン生成を示 す図である。

発明を実施するための最良の形態 エチレン生成における制御因子としてのＡＣＣシンターゼの存在は、高次植物で は普遍的なものとして現れる。１９８９年９月１１日に申し込み者（ｓｕｂｓｃ ｒｉｂｅｒｓ）へ送付され、本願に盛り込まれた５ａｔｏ、Ｔ、及びＴｈｅ。

１ｏｇｉｓ、Ａ、、Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ（１９８９ ）８６　：　６６２１−６６２５に記載のように、本発明によるｃＤＮＡの再生 の結果、ズッキーニ中の多数の相同であるが異なるＡＣＣシンターゼをコード化 するが遺伝子族の存在が示された。種々のＡＣＣＣＣシンターゼ分化した植物の 種々の位置でのエチレン生成を制御し、果実の成熟や種子発芽等を個別に制御可 能とする。

更に、このｃＤＮＡ及び結果として生じるゲノムＤＮＡの有用性により、例えば トマト等を含む他の植物におけるＡＣＣＣＣシンターゼード化するＤＮＡの再生 を可能とする。種々のＡＣＣシンターゼは通常種々の植物組織内で活性的である が、ＤＮＡは完全に相同ではないためにアンチセンス戦略を用いる等の合成を制 御するための遺伝物質の使用は交差種を翻訳しない。

定義 ここで使用する用語「組換え」は、Ｍａｎｉａｔｉｓ他によって記載されたよう な制限酵素、リガーゼ、及び同様の組換え技術を用いた遺伝物質の操作によって 得られた核酸配列をいう。本願において使用する「組換え」とは、自然発生した 遺伝子組換えは含まない。

ここでいうｒＡＣＣシンターゼ」は、ＡｄｏＭｅｔからＡＣＣへの変換及びメチ ルチオアデノンン（ＭＴＡ）へ触媒作用を与えることが可能な全酵素を含む。

ンンターゼのアミノ酸配列は、高次植物中で固有に発生するアミノ酸配列とは同 【７あるいは同してはない。そのようなネイティブ配列の例は、ズッキーニ果実 であるカポチャ果（Ｃｕｃｕｒｂｉ　ｔａ　ｐｅｐｏ）中で発生する図１中に示 されている。自然発生する対立変異体（ａｌｌｅｌｉｃ　ｖａｒｉ、ａｎｔｓ） も、疑いなく同様に発生する。同様のプロティンが幅広い種々の高次植物中に存 在している。更に、人工的に誘起された突然変異もまた、活性を破壊しない限り 含まれる。一般に、保存（ｃｏｎｓｅｒｖａｔ　１ｖｅ）アミノ酸置換は、図示 されたように活性破壊に影響を及ぼすことなく主要構造中のアミノ酸の大部分に 対して生成される。このように、ここで使用されるＡＣＣシンターゼの定義は、 開示されたシーケンスの直接または間接操作によって派生するこれらの変異体（ ｖａｒｉａｎ　ｔ　ｓ）を含む。

また、主要構造は後トランスレーション処理または後段の化学操作によって変化 させることができ、これによって、キャリア、固体支持体等の付加部分への共役 、システィンまたはプロリン等の酸化形態であるグルコシレージョン置換体等を 含む派生プロティンが得られる。これらの変化体は、そのＡｄｏＭｅｔをＡＣＣ 及びＭＴＡへ変換する能力が保持されている限り、ＡＣＣシンターゼの定義から プロティンを除去することはない。

このようにして、酵素がｒＡＣＣシンターゼ」であることは、次のように行われ るアッセイにおけるエチレンの生成を行う能力によって確認される：　テストさ れる酵素が、２００μＭのＡｄｏＭｅｔ、１０μＭのピリドキサールリン酸、２ ００ｍＨへベス（Ｈｅｐｅｓ）バッファ内で４０ｕｇのＢＳＡ％ｐＨ８，５で、 ３０分にわたって３０℃で６００μｌの総体積内で培養される。そして、形成さ に次亜塩素酸塩を用いたエチレンへの変換によってアッセイされる。ＡＣＣＣＣ シンターゼセスメントの他の形態を工夫することが可能であり、上記プロトコー ルに対するバリエーションもある程度可能であるが、上記のものがＡＣＣシンタ ーゼ活性の存在及びテストプロティンの分類をＡＣＣシンターゼとする定まった 基準となる。

トマト及びズッキーニ中のいくつかのＡＣＣシンターゼに対するアミノ酸配列を 図１．８及び１４に示す。本発明のＡＣＣシンターゼの好適な形態はここで示し たもの及び遺伝子の系統的突然変異によってそれらから派生するものを含む。。

このような系統的突然変異は、酵素のＡＣＣシンターゼ特性を向上させ、安定性 またはシェルフ寿命などのその活性の補助酵素の特性を向上させるのに望ましく 、或いはＡＣＣ活性の生体内（Ｉｎ　ｖｌｖｏ　）での制御に有用な不活性形態 を与えるのに有用である。

−ｉ二述のように、ｒＡＣＣンンターゼ」とは、上述のアッセイにより評価され る活性を有するプロティンを意味１７、「突然変異したＡＣＣＣＣシンターゼ、 この活性を必すしもａし八いがＡＣＣシンターゼをコードするＤＮＡの突然変異 により派生するプロティンを意味する。「突然変異から派生する」とは、位置特 定突然変異生成等を用いた初期物質ＡＣＣシンターゼをコードするＤＮＡからの 直接物理的派生、またはＡＣＣシンターゼの合成に関するか故意に異なる配列を 有するＤＮＡの合成による間接的派生、の双方を意味する。要求された長さのオ リゴヌクレオチドを構成する手段を使用可能であるので、ＤＮＡ５等はそれらの 個々の構成ヌクレオチドによって全体をまたは一部を構成可能である。

本願で使用する［高次植物ｊとは、その発達及び活性がエチレンにより制御され る植物をいう。これらには、すべての−殺植物及び種々の開花種が含まれる。

ＡＣＣシンターゼｃＤＮＡの初期分離 ＡＣＣ＞シターゼｃＤＮＡは、誘起可能プロティンへ適用可能な新規な方法を用 イタ見茫工１１−Ｏユ古ジ　■見更旦（ズッキーニ）から初期分離された。この 方法は、プローブの設計または単クローン抗体を調製するために純粋プロティン を必要と１２ない。すなわち、この方法は、誘起組織からのｃＤＮＡＤＮＡ発現 ライブ−＋１成及びプロティンの誘起可能特性を利用して純化された抗体調製を 用いた正クローンの確認に依存するものである。このように、概して、この方法 は、この生成のために誘起された細胞または組織から対象部分純化誘起プロティ ンを調製するステップと、これらの純化プロティンに対する抗体組成を調製する ステップと、を服務。抗体組成は、従来の方法により、抗血ｔｈの生成を向上さ せるように構成されたプロトコールによる適切なは乳類の免疫化により調製され る。

調製内にプロティン汚染物質に対するある種の抗体をも含む抗体の第１組成は、 その後純化され、所望のプロティンに対する抗体免疫反応性が濃縮された第２の 抗体組成かえられる。この濃縮は、第１：ＩＩ４製組成を非誘起組織からのプロ ティン抽出物と反応させることによって行われる。これによって、背景汚染物質 と免疫反応を起こす抗体を除去可能となる。この抗体純化調製は、その後、誘起 可能プロティンをコード化するために遺伝子を発現する組織から調製されたｃＤ ＮＡ発現ライブラリーをスクリーンする。純化された抗体調製は、このプロティ ンに対して免疫特定型であるから、正クローンの確認は簡素化される。この方法 のｃＤＮＡコード化ＡＣＣシンターゼの再生への適用は、ここでの例１に詳述さ れている。しかしながら、所望対象プロティンの分離及び純化を行わなくても、 あらゆる誘起可能プロティンに対するｃＤＮＡを得るために同様の方法を使用可 能である。

ＡＣＣシンターゼ族の拡大 ｃＤＮＡコード化ズッキーニＡＣＣシンターゼが使用可能であることによって、 同し植物ホスト即ちズッキーニ中に見いだされるＡＣＣシンターゼのバラエティ を与える多遺伝子族、及び高次植物の他種及びその対応する多遺伝子族からの他 のｃＤＮＡコード化ＡＣＣシンターゼ、の双方がアクセス可能となる。ｃ　ＤＮ Ａまたはその一部は、標準的な条件下でのハイブリダイゼーションによって付加 ゲノムまたはｃＤＮＡ配列ヘハイブリダイゼーションするためのプローブとして も使用される。ストリンジエンシーの典型的標準条件には、例４で述べられたよ うなものが含まれる。これらの再生された配列は、また、ＡＣＣシンターゼの発 現を起こさせるため、ＡＣＣシンターゼミュータントまたは「突然変異したＡＣ ＣＣＣシンターゼ起こさせるモディフィケーシヨンを行わせるため、そしてアン チセンスベクターを構成して自生ＡＣＣＣＣシンターゼ成を制御するため、にも 巧みに処理可能である。

ＡＣＣシンターゼの組換え生成 ＡＣＣシンターゼ遺伝子の使用可能性によって、それを種々の組換えシステムで 生成することが可能となる。原核及び真核システムを含む単細胞システム内にお けるこの酵素の組換え生成によって、合成されたＡＣＣの生成物であるエチレン 及びエタノールの組換え生成のためのツールが得られる。これらの化学物質の大 規模生成は、ＡＣＣからエチμ゛／及び５／またはエタノールへの化学的変換が その後続＜ＡＣＣの内因性生成を起こさせるＡＣＣンンターゼ酵素の適切な大規 模組換え生成を使用することによって遂行可能である。このような生成を経済的 に魅力あるものとするため、大藻類培養等内におけるような大規模生産が好適で ある。ＡＣＣシンターゼはまた、後述するように、増大量及びアンチセンスモー ド双方でトランスジェニック植物内で生成可能であり、これによってエチレン感 応性をもつ植物発達の様相を制御し、特に植物発生を遅延させることができる。

従って、この酵素の生成のためには、種々の発現システム及びホストを使用可能 である６Ｆ！々の原核性ホスト及び適切なベクターが当該技術分野で周知である 。

て典型的なバクテリアプロモータとしては、ｔ　ｒｐ、１ａｃＳ　ｔａｃ、及び β−ラクタマーゼブロモータが含まれる。容易に制御可能な誘導可能プロモータ であるλ−ファージプロモータもまた使用可能である。原核発現に対して適切な 多数の制御システムが当技術分野で周知である。

同様に、多数の組換えシステムが、イースト、昆虫細胞、は乳細胞、及び植物細 胞を含む真核性ホストにおける発現のために開発されてきた。これらのシステム は、十分に特徴化されており、適切な転写開始システム（プロモータ）及び要望 に応じて端末配列及びエンハンサ−の制御の下でのコード化配列の結さくを必要 とする。本発明のＡＣＣシンターゼ遺伝子に関して特に有用であるのは、植物内 で作用可能な発現システムである。これらには、組織−特定プロモータの制御Ｆ にあるシステム、あらゆる植物組織内で作用可能なプロモータを含むシステムな どが含まれる。

例えば転写開始領域は種々のオビン開始領域、例えばオクトビン、マンノビン、 ツバリン等を含む。植物ウィルスプロモータもまた使用可能であり、これにはカ リフラワーモザイクウィルス３５Ｓプロモータ等がある。さらには、リブローゼ ＝１．３−ジフォスファーテ　カルボキンラーゼ、フルーツー特定プロモータ、 熱衝撃プロモータ、種子特定プロモータ等もまた使用可能である。

カリフラワーモザイクウィルス（ＣａＭＶ）３５５プロモータは、多くの植物器 官において、タバコやペチュニアを含むトランスジェニック植物のゲノム内へ統 合（インチグレート）された時に多くの発達段階中において高度に活性であるこ とが示されており、単子葉類及び双子葉類双方の原形質体における発現を生成す ることが示された。

ＣａＭＶ３５Ｓプロモータは、食用部分をもつ少なくとも次の単子葉植物及び双 子葉植物において活性であることが示された：　ブラックベリー、ルブス；ブラ ックベリー／ラスブベリー混成、ルブス、及びレッドラスブベリー：　ニンジン ；　トウモロコシ；　ポテト；　コメ；　イチビ；　及びトマト。

ツバリンシンターゼ（Ｎｏｓ）プロモータは、食用部分を有する少なくとも次の 単子葉及び双子葉植物において活性であることが示された：リンゴ；　カリフラ ワー；　セロリ；　キュウリ：　ナスビ；　レタス；　ポテト；　ライムギ：イ チビ；　トマト；　及びクルミノキ。

器官特定プロモータもまた周知である。例えば、Ｅ８プロモータは、トマトフル ーツの成熟中に転写的にのみ活性化され、トマト果実の成熟中における遺伝子発 現をターゲットするために使用可能である（Ｄｅｉｋｍａｎ及びＦｌｓｃｈｅり の活性はトマト果実に限定されるものではなく、エチレンが生物学的過程を活性 化するあらゆるシステムに作用し得るものであると考えられる。

所望の対象器官に対する適切な他の器官特定プロモータが、周知の処理を用いて 分離可能である。これらの制御配列は、一般に所望器官においてのみ発現する遺 伝子と関わる。典型的な高次植物においては、各器官は、他の器官には存在しこ れらのｍＲＮＡは、まず適切なゲノム配列の再生のための適切なプローブを得る ために分離された。このゲノム配列は、自生的に付随する制御配列の存在を保持 する。アボカド果実に固有のｍＲＮＡを伴うｃＤＮＡを得るための技術の使用例 が、Ｃｈｒｉｓｔｏｆｆｅｒｓｅｎ他によるＰｌａｎｔ　Ｍｏ１ｅｅｕｌａＲＮ Ａは成熟アボカド果実から分離され、ｃＤＮＡライブラリーを生成するために使 用された。ライブラリー中のクローンは、成熟アボカド果実から分離された標識 ＲＮＡとハイブリダイズされたことが確認されたが、未熟アボカド果実から分離 された標識ＲＮＡとはハイブリダイズされないことが確認された。これらのクロ ーンの多くは、アボカド果実成熟のオンセットにおいて転写的に活性化される遺 伝子によってコード化されるｍＲＮＡを表している。

Ｇａｒｌａｎｄ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ社、ニューヨークに記載されている。こ の処理では、器官特定核酸配列のために濃縮されたｍＲＮＡがｃＤＮＡライブラ にも適用され、Ｅ８　ｃＤＮＡのクローンが得られた。

器官特定ｍＲＮＡをコードする遺伝子は、その後植物からのＤＮＡゲノム配列の ライブラリーを構成することによって分離される。ゲノムライブラリーは、器官 特定ＤＮＡクローンによってスクリーニングされ、配列が決定される。プロモー タがその後に分離される。これらの処理は、今では日常的なものと考えられてＣ ｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ、Ｃ０ １ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒに詳述されている。

構成プロモータかまたは所望の器官特定プロモータがその後、現在この分野で一 般的な標準技術を用いて遺伝子をコードするＡＣＣシンターゼまたはその突然変 異形態ヘリゲートされる。発現システムは、さらに、転写ターミネータ及び／ま たはエンハンサ−配列などの補助配列を用いることによって最適化される。

このようにして、植物中ての発現のため、組換え発現力セントは、ＡＣＣシンタ ーゼコード化配列に加えて、植物プロモータ領域、転写開始位置（もし転写され るコード化配列が−を欠くならば）、及び転写端配列を含む。カセットの５゜及 び３゛端における単独制限酵素位置は、通常先夜しているベクターへの挿入を容 易とするために含まれている。

真核遺伝子発現を制御する配列は、広く研究されてきた。プロモータ配列素子に は、ＴＡＴＡボックスコンセンサス配列（ＴＡＴＡＡＴ）が含まれ、これは通常 転写開始位置の上流における２０−３０の塩基対（ｂ　ｐ）である。はとんどの 例では、ＴＡＴＡボックスは正確な転写開始のために必要である。条約では（ｂ ｙ　ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎ）、開始位置は＋１と呼ばれる。５′（上流）方向へ 伸長する配列には負数が付され、３′（下流）方向へ伸長する配列には正数が付 されている。

植物では、ＴＡＴＡボックスのさらに上流の位置−８０から−１００においては 、トリヌクレオチドＧ（またはＴ）ＮＧを包囲する一連のアデニンを有するブｅ ｒｅｄｉ　ｔｈ　ａｎｄ　Ｈｏｌ　１ａｅｎｄｅｒ、ｅｄｓ、（１９ｇ３）ｐｐ 。

２２１−２２７）。環境信号に応答する組繊細部を与える他の配列または転写の 最大効率もまたプロモータ領域内に見いだすことができる。そのような配列はま た、しばしば転写開始位置の４００ｂｌ）内に見いだされるが、２０００ｂｐま たはそれ以上にまで伸長し得る。

異種プロモータ／構造遺伝子組み合わせの構成においては、プロモータは好適に は、その自然設定における転写開始位置からの距離と同じ異種転写開始位置から の距離に配置される。しかしながら、当該技術分野で周知であるように、この距 離のある程度の変化は、プロモータ機能に損失なく許容され得る。

上述のように、植物細胞中における転写を指向する多数のプロモータのうち、ど れでも適切である。プロモータは、構造性または誘起性のいずれでもよい。バク テリア起源のプロモータには、オクトビンシンターゼプロモータ、ツバリンシン ターゼプロモータ及びネイティブＴｉプラスミドから派生した他のブロモータィ ルスの３５Ｓ及び１９ＳＲＮＡプロモータが含まれる（０°Ｄｅｌｌ他、Ｎａ− ゼー１．３−ニリン酸塩カルボキンラーゼ小サブユニットプロモータ及びファセ オリンブロモータが含まれる。発現がエチレンにより誘起されるＥ８遺伝子及び 他の遺伝子からのプロモータ配列もまた使用可能である。Ｅ８プロモータの分離 及び配列は、本願に参考として盛り込んだＤｅｉｋｍａｎ及びＦｔｓｃｈｅｒｓ ＥＭＢＯＪ　（１９８８）ヱ：　３３１５−３３２０に詳述されている。

ブロモ−タン−ケンスに加え、発現カセットもまた、効率的端末を発生するため に横進的遺伝子の下流側に転写端末領域を含む必要がある。端末領域は、プロモ ータ配列と同じ遺伝子から得ることができ、あるいは異なる遺伝子から得ること も可能である。

構造遺伝子によってコード化されたｍＲＮＡが効率よく処理されるならば、ＲＮ Ａのボリアデニレーンヨンを指向するＤＮＡ配列もまた、ベクター構成に共通に おけるＡＣＣシンターゼをコードするＲＮＡの発現に重要である。ボリアデニれ らに限定はされない。

結果として生じた発現システムまたはカセットは、高次植物の形質転換に適した 組換えベクター内へ結合されるかそうでなければ該ベクター内へ含まれるように 構成される。ベクターはまた、通常はそれによって形質転換された植物細胞が培 養中で確認される選択可能マーカー遺伝子を含有する。通常、マーカー遺伝子は 抗生物質に対する耐性をコードする。これらのマーカーは、Ｇ４１８、ハイドロ マイシン、プレオマイシン、カナマイシン、及びゲンタミンンに対する抵抗を含 む。植物細胞を形質転換した後、ベクターを有するこれらの細胞は特定抗生物質 をＤｆＨする媒体上で成長するというその特性によって確認される。バクテリア またはウィルス起源の複製配列もまた通常含まれており、これによってバクテリ アまたはファージホスト内でベクターがクローンされ得る。好適には、複製の広 いホスト範囲原核起源が含まれる。バクテリアに対する選択可能マーカもまた含 まれることが好ましく、これによって所望構造をもつバクテリア細部の選択が可 能となる。適切な原核選択可能マーカーはまた、カナマイシンまたはテトラシフ リンなどの抗生物質に対する抵抗を含む。

当技術分野において周知であるように、付加機能をコードする他のＤＮＡ配列も またベクター中に存在する。たとえば、アグロバクテリウムの形質転換の場合に は１、その後の植物染色体への転送のためにＴ−ＤＮＡ配列も含有される。

更に、ベクターはまた、当該技術分野において周知であるように、ＡＣＣシンタ ーゼプロティンをコード化する配列と他の対象分子をコード化する配列との間に 、融合プロティンを生じさせるフレーム内結合を含むように構成することも可能 である。

適切なベクターが得られると、トランスジェニック植物が調製される。この植物 は、所望の発現システムを有する。植物または植物細胞の形質転換には、多数の 技術を使用可能である。全てのタイプの植物は、「直接」形質転換に対して適切 な対象である。一般には、ジコットのみがアグロバクテリウム−介在感染を用い て形質転換可能である。

直接形質転換の形態においては、ベクターは、組換えＤＮＡを機械的に転送する ためにマイクロピペットを用いることで植物細胞内へ直接微細注入される（Ｃｒ ｏｓｓｗａｙ、Ｍｏｌ　Ｇｅｎ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（１９８５）２０２：１７９ −１８５）。他の形態では、遺伝子物質は、ポリエチレングリコールを用いて植 物細胞中へ転送され（Ｋ　ｒ　ｅ　ｎ　ｓ他、Ｎａｔｕｒｅ　（１９８２）２９ ６：７２−７４）　、あるいは小粒または分子のマトリックス内または表面上の いずれかに導入が要求されるＤＮＡを含む他の物質と融合される。これらの物質 とは、ミニ細胞、細胞、リソソームまたは他の融合可能リビソド面物質（）”ｒ ａｌｅｙ他、１８６３）。

ＤＮＡはまた、電気ポレーションによって植物細胞中へ導入することもできる（ Ｆｒｏｍｍ他、Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ（１９８５）８ ２　：　５８２４）。この技術では、植物プロトプラストは、発現カセットを含 むプラスミドの存在下で電気ポレートされる。高電界強度の電気インパルスは、 生体膜を可逆的に透過性とし、これによってプラスミドの導入を可能とする。電 気ボレートされた植物原形質体は、細胞壁をリフォームし、分割し、そして再生 する。

バクテリア感染により介在された形質転換に対しては、植物細胞が、予め導入さ れるＤＮＡによって形質転換されたＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａ ｃｉｅｎｓまたはＡ、リゾ遺伝子（Ａ、ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）で感染される。

ｅ　ｆ　ｃ　ｉ　ｅ　ｎ　ｓ−）及び毛根病（Ａ、ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）の原 因となる。クラウンゴール腫瘍及び毛根中の植物細胞は、オピンとして知られる アミノ酸誘導体を生成するために導入されている。オビンは、バクテリアによっ てのみ異化される。オビンの発現を担うバクテリア遺伝子は、キメラ発現カセッ トに対する制御素子の便利なソースである。更に、オビンの存在に対するアッセ イは、形質転換された組織を確認するために使用可能である。

非相同遺伝子配列は、Ａ、ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓのＴｉプラスミドまたはΔ工 ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓのＲｉプラスミドによって適切な植物細胞内へ導入可能で ある。ＴｉまたはＲｉプラスミドは、Ａｇｒｏｂａｅｔｅｒｉｕｍ　（アグロバ クテリウム）によって植物細胞へインフェクションされることによって伝達され 、植物ゲノム内へ安定的に組み込まれる（Ｓｃｈｅｌｌ、Ｊ、、５ｃｉｅｎｃｅ （１９８７）２３７：コ１７６−１１８３）。Ｔｉ及びＲｉプラスミドは、形質 転換された細胞の生成に必須の２つの領域を含む。一つは転送りＮＡ　（Ｔ−Ｄ ＮＡ）と呼ばれるもので、植物咳へ転送されて腫瘍または根形成を誘起する。他 方のものは、毒性（ｖｉＬ）領域と呼ばれ、Ｔ−ＤＮＡの転送に必須ではあるが それ自体は転送されない。Ｔ□ＤＮＡは、たとえｖｉｒ領域が異なるプラスミド 上にあっても、植物細胞内へ転送される（Ｈｏｅｋｅｍａ他、Ｎａｔｕｒｅ　（ １９８３）３０３　：１７９−１８９）、転送されたＤＮＡｖＡ域は、ソノ転送 サレル性能を侵されることなく、非相同ＤＮＡの挿入によって大きさを増大させ ることができる。このように、病気誘起性遺伝子が除去された改良ＴｉまたはＲ ｉプラスミドを、本発明の遺伝子構成物の適切な植物細胞内への転送のためのベ クターとして使用可能である。

一般に、組換えＴｉ及びＲｉプラスミドの構成の後、ｐＢＲ３２２などのより一 般的なバクテリアベクターを用いた方法が行われる。ネイティブプラスミド中に 時折見いだされ、時には外部配列から構成される副遺伝子素子を付加使用するこ とができる。これらには、「シャトルベクターＪ　（Ｒｕｖｋｕｍ及びＡｕ５ｕ 現在使用されている組換えＴｉ及びＲｉプラスミドベクターシステムには２つの 種類がある。一つは［共統合（ｃｏｉｎｔｅｇｒａｔｅ）Ｊとよばれ、対象遺ス ミドｐＧＶ２８５０を含む。第２のクラスまたは「２値」システムでは、対象２ １に記載されたようなｐＢＩＮ１９シャトルベクターによって例示されるよう１ プラスミドＰＡＬ４４０４によってｔ　ｒａｎｓ内に供給される。これらのベク ターのうち幾つかは市販されている。

Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍで植物細胞を形質転換するには２つの一般的方法が ある。すなわち、培養された単離原形質体を用いたＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕ二 の共培養、またはＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍを用いた非損傷細胞または組織の 形質転換である。第１の方法には、プロトプラストの培養及び続く培養された原 型質体からの植物の再生を可能とする確立した培養システムが必要となる。第２ の方法には、（ａ）コチレドン等の非損傷植物組織がＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉ− ■巴によって形質転換可能であること及び（ｂ）形質転換された細胞または組織 が植物全体の再生へと誘起可能であること、が必要となる。

はとんどのジコソト種はＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍによって形質転換可能であ る、またＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍに対する自然植物ホストである種は試験管 内（Ｉｎ　ｖｌｔｒｏ）で形質転換可能である。モノコチレドン植物及び特に穀 物は、Ａｇｒｏｂａｅｔｅｒｉ　ｍへの自然コストではない。これらをＡｇｒｏ ｂａｃ±ｅｒｉｕｍを用いて形質転換させる試みは、最近までは成功していなか った（Ｈｏｏｙｋａｓ−Ｖａｎ　Ｓｌｏｇｔｅｒｅｎ他、Ｎａｔｕｒｅ　（１９ ８４）１よ１　：　７６３−７６４）、しかしながら、ある種の単子葉類がＡｇ ｒｏｂａｃ形質転換される。

形質転換された細胞または植物の確認は、通常は形質転換されたベクター内に選 択可能マーカーを含有させること、あるいは成功するバクテリア感染の証拠をえ ること等によって達成される。

形質転換された植物細胞もまた周知の技術によって再生可能である。

１１ａｎ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、１．９８３）；及 びＰｒｅｓｓＳ　０ｒｌａｎｄｏ、Ｖｏｌ、Ｌ　１９８４、ａｎｄ　Ｖｏｌ、Ｉ Ｉ。

１９８６）に記載されている。実際にはすべての植物は、サトウキビ、砂糖大根 、綿、果樹、及び野菜の大部分の種を含むがこれらに限定されない培養された細 胞または組織から生殖可能であることが知られている。

再生のための手段は、植物の種によって異なるが、通常は形質転換されたプロト プラストの懸濁液または形質転換された外植片を含有するベトリブレートがまず 供給される。カルス組織が形成され、苗条がカルスから誘起されると共にその後 根付かせられる。あるいは、カルス組織内に体細胞胚形成が誘起され得る。これ らの体細胞胚は、植物を形成する自然胚として発芽する。培養媒体は、通常種々 のアミノ酸及び植物ホルモン、例えばアラキシン及びサイトキニンなどを含む。

また、特にコーンやアルファルファなどの種の媒体に対してはグルタミン酸やプ ロリンを付加することも有利である。効率よい再生は、媒体、遺伝型、及び培養 の経過に依存する。もしこれらの３種の変数が制御されたならば、再生は通常再 生成可能であると共に反復可能である。

ｔｒａｎｇｅｎｉｃ　ｗｈｏｌｅ植物を得るために形質転換された個々の細胞か ら再生可能な多数の植物が示されてきた。例えば、双子葉類では次のようなもキ 、Ｊｕｇｌａｎｓ　ｒｅｇｉａ；メロン、Ｃｕｃｕｍｉｓ　ｍｅｌｏ；ブドウ。

Ｖｉ　ｔ　ｉ　ｓ　ｙ　ｉ恵」−ｆ　ｅ　ｒａ　；？ンゴ、Ｍａｎｇｉｆｅｒａ 　１ｎｄｉｃａ。

更に、細胞からの全植物の生殖（必ずしも形質転換されない）が次のなかに観生 殖された植物は、標準土壌条件へ転送されて従来の方法で培養される。

発現カセットが生殖トランスジェニック植物内へ安定に組み込まれた後、有性交 配によって他の植物へ転送可能である。多数の標準育種技術のうちの任意のもの が交叉されるべき種に応じて使用可能である。

植物は、従来の処理にて成長され収穫される。

アンチセンスの発現 ＡＣＣシンターゼコード化配列が上述した発現システム内に正しい方向で配置さ れると、ＡＣＣシンターゼプロティンが生成される。しかしながら、逆方向に配 置されると、発現ベクターは、この酵素のｉｎｄｉｇｅｎｏｕｓ生成と干渉する アンチセンス作用をもつことになる。アンチセンス技術は、ＡＣＣシンターゼを コードするメツセンジャーＲＮＡへのハイブリダイゼーション、このｍＲＮＡの 生成における単ストランド中間体へのハイブリダイゼーシロン、またはＡＣＣシ ンターゼ遺伝子を含有するＤＮＡ複製（ｄｕｐｌｅｘ）とのｔｒｉｐｌｅｘ形成 を含む種々のレベルで作用できる。これらすべてのｍｏｄａ　１　ｉ　ｔ　ｉｅ ｓは、ＡＣＣシンターゼ生成のアンチセンス制御を作用させるために使用可能で ある。

後述する例８に示すように、トマト果実の成熟は、カリフラワー３５９プロモー タの制御下でベクター内に供給されたＡＣＣシンターゼコード化配列の適切なア ンチセンス発現によって制御及び禁止され得る。エチレンにより制御される他の 特性もまた、制御システム及び／またはコード化された特定ＡＣシンターゼの適 切な選択によって影響を受けることができる。

さらに、高次植物におけるＡＣＣシンターゼの活性形態が以下に示されている。

ＡＣＣシンターゼモノマーの突然変異形態を供給することによって、不活性モノ マーを得るためにｄｅｃｏｙを生成することが可能であり、これによって植物内 におけるＡＣＣシンターゼのレベルが調節されることとなる。本発明の付加実施 例には、突然変異したＡＣＣシンターゼ及びそのための発現システムが含まれる 。

次の各例は、本発明の例示するために掲げたもので、本発明がこれらに限定され るわけではない。

ズッキーニ果実におけるｃＤＮＡコード化ＡＣＣシンターゼは、次のように再が 調製された。ＡＣＣシンターゼの生成を誘起するため、スライスは誘起媒体（５ ０μＭリン酸カリウムバッファ、ｐＨ６，８；　０．５　ｍＭ　インドール酢酸 （ｉｎｄｏｌｅ　ａｃｅｔｉｃ　ａｃｉｄ；ＩＡＡ）；　０６１ｍＭベンジルア デニン（ＢＡ）；　５０ｍＭ　ＬｉＣ１；　０．６ｍＭ　アミノキシ酢酸（ａｍ ｉｎｏｏｘｙ　ａｃｅｔｉｃ　ａｃｉｄ；ＡＯＡ）；　及び５０μｇ／ｍｌｃｈ １ｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ）内で１８−２４時間にわたって培養された（同様 の条件で５０ｍＭｐｈｏｓｐｈａｔｅバッファ内に非誘起組織が調製された）。

Ｐｏ１ｙ（Ａ′″）ＲＮＡ　（ｍＲＮＡ）が上記のように調製された１８時間組 織から単離され、試験管内で、標識されたメチオニン（１０００Ｃｉ／μｍｏｌ より大きく）の存在下で、Ｔｈｅｏ　ｌ　ｏｇ　ｉ　ｓ、　Ａ、他によってＪ　 Ｍｏｌ　Ｂｉｏ　ｌ　（１９８５）１８３　：　５３−６８に記載されたように ｗｈｅａｔ　ｇｅｒｍｌｙｓａｔｅ内でトランスレートされ、これによってＡＣ Ｃシンターゼコード化ｍＲＮＡの存在が証明された。ｃＤＮＡライブラリーが、 Ｈｕｙｎｈ、Ｔ、Ｖ。

他によって°ＤＮＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ’、Ｇｌｏｖｅｒ 、Ｅ、ｅｄ、（１９８５）ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ、０ｘｆｏｒｄ、１：４９−８８ に記載されたように、　ｇｔ１１内で調製された。挿入サイズは、２００−５０ ０ｂｐ、であった。ライブラリーは、次のように調製された純粋ＡＣＣシンター ゼ抗血清でスクリーンされた。

ａｎｔ　１ｓｅｒａは、精製ＡＣＣシンターゼ調製を１５００−ｆｏｌｄするた めに調製された。精製ＡＣＣシンターゼは、Ｂｕｔｙｌ　Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ（ Ｔｏｙｏ　５ｏｄａ　Ｔｏｋｙｏ）　、５Ｐ−３ｅｐｈａｄｅｘ、及びＱＡＥ− ３ｅｐｈａｄｅｘへ順次ｂｏｕｎｄ及びこれらからｅｌｕｔｅする組織ｈｏｍ。

ｇｅｎａｔｅｓから調製される（より高度な精製は、Ｂｕｔｙｌ　Ｔｏｙｏｐｅ ａｒｔ、５ｅｐｈａｃｒｙｌ　Ｓ−３００、Ｂ　１ｏ−Ｇｅ　１−Ｈｔ、及び最 後にＦＰＬＣｍｏｎｏ−Ｑを含有するカラムを順次介して続いて行われるクロマ トグラフィーによって得ることができる。次の各ステップを全て適用することに よって、約６０００−ｆｏｌｄの純化が得られる）。抗体は、５０００ｎｍｏ　 １のＡＣＣシンターゼ活性／ｈｒ（Ｂｉｏ　Ｇｅ１−ＨＴカラムから得られたＡ ＣＣ／　ｈ　ｒ　／　ｍ　ｇプロティンの特定（ｓｐｅｃ　ｉ　ｆ　ｉｃ）活性 １５００ｎｍｏ　１で３週間間隔で４同の免疫化を含む免疫化プロトコールによ ってニューシーラントシロウサギ内−Ｃ調製された。生のアンチセーラム（２ｍ ｌ）が、そのままの非誘起Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ果実からの溶解性プロティンと結 合された１０ｍ１の５ｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂを用いて培養することによって精製 された。このステップは、ＡＣＣシンターゼ以外のプロティンと免疫反応を起こ す抗体を除去した。

６６個の免疫反応性クローンが、精製アンチセーラムをもつ１．４Ｘ１０５λｇ ｉｌ１組換えクローンをスクリーンすることによって分離された。再スクリーン 時、１つ０のみが事実上陽性であった。サザン解析では、１９のクローンがＡＣ ＣンンターゼｍＲＮＡを表したことが示された。−の選択されたクローンである ｐＡｃｃｌが５５．８ｋｄのポリペプチドをコード化する開放読み出しフレーム を有する。他の強免疫反応性クローンであるｐＡＣＣ７は遥かに短かった。図Ｉ Ａは、ｐＡｃｃｌ及びｐＡＣＣ７の制限マツプを示す。図ＩＢは、これらのクロ ーンに対する完全ヌクレオチド配列及びｄｅｄｕｃｅｄアミノ酸配列を示す。

図ＩＢに示すように、ｐＡＣＣ７は、ｐＡＣＣ］の配列の部分と同じである。

開放読み出しフレームは、５５．７７９ｋｄポリペプチドに対応する４９３アミ ノ酸のプロティンをコード化する。

５ｇｔ１１ライブラリーからの陽性クローンもまた、次のように免疫プロッティ ングのための精製アンチセーラムをさらに調製するために使用可能である二発現 ライブラリーからの陽性コーンは、Ｅ、ｃｏｌｔ　５ｔｒａｉｎ　Ｙｌ、０９０ 上にｐｌａｔｅされ、９０−ｍｍプレート毎に１０”　ｐｌａｑｕｅ−ｆｏｒｍ ｉｎｇ単位が得られた。１０ｍＭイソプロピルβ−Ｄ−チオガラクト−ピラノシ ド（ＩＰＴＧ）が４２℃での２時間に亘る培養後にｌａｗｎ上に横たえられ、そ の後３７℃でさらに２時間にわたって培養された。

フィルタは、その後ＴＢＳＴ（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　ＨＣＩ、ｐＨ８，Ｏ；０゜ １４Ｍ　ＮａＣ１；　０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）内で３０分にわたってソーク （ｓｏａｋ）された；　２％ミルクプロティン及びその後フィルタ毎に２時間に わたって５ｍｌの希釈された（１　＋　５００）精製ＡＣＣシンターゼアンチセ ーラム（以下参照）で処理することによってＡＣＣシンターゼ発現が試験された 。

それぞれをＴＢＳＴで５回１０分間にわたって洗浄した後、境界抗体は、０゜２ Ｎｉグリシン　塩酸バッファ、ｐＨ２，３，１％ミルクプロティンを含有、で室 温で３分間にわたって振ることによって希釈された。抗体溶液は、中和され、免 疫プロッティングに使用される。

ＡＣＣシンターゼは、以下に示すように、マルチステッププロトコールに従って 、誘起されたＣｕｃｕｒｂｉｔａホモジエネートから６０００−ｆｏｌｄ純化さ れた。純化に使用された種々のバッファは次の通りである：バソフｙＡ：Ｔｒｉ ｓ−ＨＣＩ　１００ｍＭ、ｐＨ８，０Ｓ　ＥＤＴＡ２０ｍＭ。

ｐｙｒｉｄｏｘａｌ　ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　１０ＭＭ、ＰＭＳＦ０．５ｍＭ、β −メルカプトエタノール２０ｍＭ；　バッファＢ：　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　２０ｍ Ｎ１、ｐＨ８，０，ＥＤＴＡｌｏｍＭ、ｐｙｒｉｄｏｘａｌ　ｐｈｏｓｐｈａｔ ｅ１０μＬｉ、ＤＴＴ　Ｏ，５ｍＭ；　バッフｙＣ：　Ｎａ−ａｃｅｔａｔｅ２ ０ｍＭ、ｐＨ６，０、ｐｙｒｉｄｏｘａｌ　ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　１０℃１Ｍ、 ＥＤＴＡｌｏｍＭＳＤＴＴ　０．５ｍＭ；　バッフｙＤ：　Ｋ−ｐｈｏｓｐｈａ ｔｅｌｏｍＭ、　ｐＨ８，０、ｐｙｒｉｄｏｘａｌ　ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　１０ 　μＭ。

ＥＤＴＡ　１ｍＭ、ＤＴＴ　０．５ｍＭ；　バッファＥ：　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ２ ０ｍ〜１、ｐＨ８，０、ｐｙｒｉｄｏｘａｌ　ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　５μＭ、Ｅ ＤＴＡ　１ｍＭ、ＤＴＴ　０．５ｍＭ；　バッフｙＦ：　Ｈｅｐｅｓ　ＫＯＨ５ ００ｍＭＳ　ｐＨ８，５、ｐｙｒｉｄｏｘａｌ　ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　４０ＭＭ 。

Ｂ５Ａ４００　ｇ／ｍｌ。

全ての操作は、４℃゛−Ｃ行われた。クロマトグラフィツクｅｌｕｔｉｏｎは、 ＡＣＣシンターゼ活性に対して、２８０　ｎ　ｍの吸光度でアッセイされた。

誘起媒体内で２４時間にわたって培養された１０ｋｇのＣｕｃｕｒｂｉｔａスラ イスは、液体Ｎ２て冷却され、２リツトルのバッファＡと２００ｇのポリビニル ポリピロリドンとで１ガロンＷａｒｎｉｎｇブレンダ内で１分間にわたり中間速 度で２ｋｇのバッチ内で均質化された。ホモゲネートは、１７．０００Ｘｇで３ （−１分にわたって遠心分離された。」二清は、マイクロクロス（ｃｌｏｔｈ） の−一及びナイロレクロスの一層（′う〔−）　ｍメッシュ）によりろ過された 。

Ｂｕｔｙｌ　Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ　Ｆｒａｅｔｉｏ＋１ａｔｉｏｎ固体硫酸了ン モニウノ・は、４０９６飽相を達成するためにかくはんされた上記」二清にゆっ くりと付加された。上ｔ〜温溶液、１５分間かくはんされ、そ１．て硫酸アンモ ニウムによって４００６に飽和されたバッファＢと予め平衡された３０［〕ｍｍ のｐａｃｋｅｄ　Ｂｕｔｙｌ　（ブチル）　Ｔｏｙｏｐｅａｒ１６５０Ｍ　疎水 性アフィニディマトリックスが付加された。懸濁液は、時々、更に３０分間かく はんされた。マトリックスは、ｎ１ｔｅｘナイロンクロス（３０ｍメツシュ）て ろ過されることによって再生され、そして溶液は手で５ｑａｅｅｚｅアウトされ た。その後、マトリックスは２枚のＷｈａｔｍａｎフィルタ紙＃１を用いた真空 フィルタ内に配置され、４０％硫酸アンモニウムを含有した５００ｍ１ｌのバラ （２度）することによって、ｂａ　ｔ　ｃｈｗｉ　ｓ　ｅにマトリックスから溶 出された。

合成された溶出液は、１０リツトルのバッファＢに対して３６時間にわたり３回 透析された。

５Ｐ−５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ上記透析されたフラクシ ョンは、１７０００Ｘｇで３０分間遠心分離を行うことによって清浄化された。

体積は、バッファＢの４リツトルに調節され、ｐＨは５％酢酸のｐＨ６，０とさ れた。バッファＣと平衡された２リツトルのバックされたＳＰ−セファデックス Ｃ−５０が付加され、懸濁液は６０分間かくはんされた。マトリックスは、２枚 のＷｈａｔｍａｎフィルタベーパ＃１を介したろ過によって再生されると共に、 ２リツトルのバッファＣで洗浄っされた。吸収されたプロティンは、ＩＭＫＣＩ を含む１リツトルのバッファＢで２度ｂａｔｃｈｗｉｓｅに溶離された。溶離物 は、＃ＩＷｈａｔｍａｎフィルタベーパを介して吸引されることによって再生さ れ、そして固体硫酸アンモニウムが４０％飽和を達成するために付加された。そ の後、６７７７８７４０％硫酸アンモニウムと平衡された１　００ｍ　ｌのブチ ルＴｏｙｏｐｅａ　ｒ　１−ｐａｃｋｅｄマトリックスが溶出液へ付加された。

懸濁液は、３０分にわたってかくはんされ、そしてマトリックスはＮ１ｔｅｘナ イロン布（３０ｌｔ　ｍメツシュ）の層を介したろ過によって収集された。マト リックスは、小量のバラフッ８フ４０％硫酸アンモニウム中で再懸濁され、カラ ム内（２，５Ｘ２０ｃｍ）へ注がれた。吸収されたプロティンはバッファＢで溶 出され、カラムの流量は重力下であった。高Ａ２８０のフラクションはプールさ れ、４リツトルのバッファＢに対して終夜透析された。この透析中に、３回バッ ファを交換した。

バッフｙＢで平衡されたバックされた４００ｍ１のＱＡＥ−５ｅｐｈａｄｅｘが ５Ｐ−３ｅｐｈａｄｅｘフラクシヨネーシヨンからのｄｉａｌｙｚａｔｅへ付加 され、懸濁液が６０分間にわたってゆっくりとかくはんされた。マトリックスは 、ろ過装置内のｍｌｒａｃｌｏｔｈ層を介したろ過によって再生され、非吸収プ ロティンを除去するために５００ｍ１のバッファＢで洗浄された。マトリックス は、小量のバッファＢ内で再懸濁され、カラム（４Ｘ　３０　ｃ　ｍ）内へ注が れた。

プロティンは、０．２Ｍ　ＫＣＩを含むバッファＢで溶出された。

Ｂｕｔｙｌ　Ｔｏｙｏｐｅａｒｌクローｚトゲラフイー固体硫酸アンモニウムが 溶出液（１００ｍｌまでの）へ付加され、４０％飽和が得られ、溶液は少なくと も４時間にわたって４℃に保持された。懸濁液は、３０分にわたって３０．００ ０Ｘｇで遠心分離され、上清は、バラフッ８フ４０％硫酸アンモニウムで平衡さ れたＢｕｔｙｌ　Ｔｏｙｏｐｅａｒｌカラム（１，５Ｘ１４ｃｍ）上に適用され た。全プロティン溶液がカラムを通過した後、４００ｍ１線形傾きで溶出された ：１．ｍｌ／ｍｉｎの流率のバッファＢ内で０〜４０％の硫酸アンモニウム。

図２Ａは、溶出パターンを示す。固体硫酸アンモニウムは、酵素活性フラクショ ンへ添加され、８０％飽和が達成された。そして、溶液は、少なくとも４時間に わたり４℃で培養された。ｐｒｅｃｉｐｉ　ｔａｔｅは４℃で３０分にわたる３ ０．０００Ｘｇての遠心分離によって収集され、そして３ｍｌのバッファＤ内に 溶解された。

５ｅｐｈａｃｒｙｌ　Ｓ−３００クロマトグラフィー上記によって結果として得 られたプロティン溶液は、バッファＤと平衡された５ｅｐｈａｃｒｙｌ　Ｓ−３ ００のカラム（２，５Ｘ１００ｃｍ）へ適用された。

カラムは、０．５ｍｌ／ｍｉｎの流率でバッファＤて溶出された。図２Ｂは、溶 出パターンを示す。

５ｅｐｈａｃｒｙｌステツプからの活性フラクションは、合成されて、バッファ Ｄと平衡したＢｉｏ　Ｇｅ１−ＨＡカラム（０，７５Ｘ１４ｃｍ）上へ適用され た。カラムはバッファＤてＡ２１１０＝０となるまで洗浄され、その後２００ｍ １の線形傾きで溶離された：　０．１ｍｌ／ｍｉｎの流率てバッファＤ内の１０ −１００ｍＭ燐酸カリウム。図２０は、溶離パターンを示す。活性フラクション は、収集されてＣｅｎ　ｔ　ｒ　ｉ　ｃｏｎ２０フィルタレ−ジョン装置で濃縮 された。そして、これに伴って、濃縮されたプロティン溶液のバッファはバッフ ァＥへ変更された。

ＦＰＬＣｍｏｎｏ−０クロマトグラフィーＢｉｏ　Ｇｅ１−ＨＴカラムからの濃 縮活性フラクション（−０，５ｍ１）が単−ＱＨ５１５カラムへ適用された。カ ラムは、Ａ２８０”０となるまで、０．　１ＭＫＣｌを含有するバッファＥで洗 浄された。カラムは、その後１５ｍ１線形傾きで溶出された：　バッファＥ内に おける０、１−０．４ＭＫＣｌ０傾きの流率は、０．５ｍｌ／ｍｉｎであった。

図３は、溶離パターンを示す。

表１は、全体純化シーケンス及び連続する各ステップにおける特性活性の増大を 示す。処理全体としては、７．５％の回復の６０００ｆｏｌｄ純化となった。

酵素は、プロティンの３５．５９０ｎｍｏ　ＩＡＣＣ生成／　ｈ　ｒ　／　ｍ　 ｇの特定活性を有する。

最も高いＡＣＣシンターゼ活性を有するｍｏｎｏＱカラムからのフラクション１ ６及び１７上に導かれた５ＤＳ−ＰＡＧＥは、プロティンは完全に純粋ではなか ったことを示した（図４）。しかしながら、それは、４６ｋｄバンド中にＡＣＣ シンターゼ活性が存在することを証明した。電気泳動は、同量の２ＸＳＤＳ装荷 バツフアと混合された７、５ｍｌの溶離されたフラクションを１０％のポリアク リルアミドへ適用し、鍛着色することによって導かれた。ＡＣＣＣＣシンターゼ 活性むバンドを決定するため、同様のゲルがｒｕｎされ、このゲルは厚さ３ｍｍ のスライスに切断され、ＡＣＣＣＣシンターゼ活性ライスの半分に定められた。

他の半分は、銀で着色された。

純化されたＡＣＣシンターゼもまた、溶離クロマトグラフィー　０　セファクリ ルＳ−３００のサイズを受けた。このプロトコールにおいては、ＡＣＣシンター ゼは８６ｋｄの主として溶出された。これは、Ｃｕｃｕｒｂｉ　ｔａＡＣＣシン ターゼが、２個の同じ４６ｋｄサブユニツトから成ることを示唆している。さら に、特徴化は、ＡＣＣＣＣシンターゼ活性って最適のｐＨは９．５であり、等電 点はｍｏｎｏ−Ｐ　Ｈ５／２ＯＦＰＬＣカラムクロマトグラフィーを用いて５て 評価された。ＡｄｏＭｅｔに対するＫｍは１６．７ｍＭであり、ビリドキサル燐 酸は共因子である。酵素は、−２０℃または一８０℃で１年以上にわたって安定 である。

例３ ＡＣＣシンターゼをコードするズッキーニゲノムクローンの単離４日経過した精 気を失った凍結ズッキーニ実生が、１５％サッカロース、５０ｍＭＴｒ　ｉ　５ −ＨＣＬ　ｐＨ８，５，５０ｍＭ　ＥＤＴＡ−Ｎａ、０．２５ＭＮａＣｌ中で均 質化された。核は４℃で１０分間にわたり４．０００ｒｐｍで遠心分離されるこ とによってベレツトされた。そして、核ＤＮＡは、ＣｓＣ１臭化エチジウム平行 濃度傾き遠心分離によって分離された。再生されたＤＮＡは、５ａｕ３Ａで消化 され、０．５％低低溶融アロローゼ上電気泳動にて分離された。

サイズが２０ｋｂに対応するＤＮＡは、ＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ　ｃｕｔ　Ｅ８ ３）よ７０：８２７−８４２；Ｒａｌｅｉｇｈ、Ｅ、Ａ、他、Ｐｒｏｃ　Ｎａヨ ーＮ５戸ｄ　Ｓｃｌ　ＵＳＡ（１９８６）８３：　９０７０−９０７４；Ｍａｎ ｉａｔｉｓ、Ｔ、他、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　（１９８２）Ｃｏ ｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒ ｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ）。結合混合体はパッケージされ、そしてライブラ リーはＥ、ｃｏｌｉ　ストレイン　Ｋ２Ｏ２上で平板培養し、ニックｔｒａｎｓ ｌａｔｅｄ　ＡＣＣＩ　ｃＤＮＡ（全長ズソキー＝ｃＤＮＡ）クローンで、Ｂｅ ｎｔｏｎ、Ｄ、他により５ｃｉｅｎｃｅ　（１９７７）１９６：１７９−１８３ に記載にようにスクリーンすることで、増幅させることなくスクリーンされた。

分離されたゲノム配列は、制限エンドヌクレアーゼでマツプされ、そしてＡＣＣ ｌ　ｃＤＮＡとハイブリダイズする適切なりＮＡフラグメントがｐＵｃ１８及び ｐＵｃ１９プラスミド内へサブクローンされた。再生された種々のゲノムクロー ンの制限解析後の結果が図５Ａ−５Ｃに示されている。図に示すように、ゲノム クローンは同しＤＮＡストランド上に存在するが、逆方向に指向している。ＣＰ −ＡＣＣＩＡ及びＣＰ−ＡＣＣＩＢの各々は、４個のイントロンを含む。これら のクローンの完全ゲノム配列は、それぞれ図６及び７に示されている。図６及び ７に示すように、全上流制限配列は、クローン内にコード化されている。

例４ ＡＣＣシンターゼをコードするトマトｃＤＮＡの再生Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ 　ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ　ｃ、ｖ、Ｒｕｔｇｅｒｓは、タバコモザイクウィルス から解放を確保するためにプロトコールを用いてグリーンハウス内で一年を通じ た種がら成長した。果実は冷凍され、総ＲＮＡは、Ｃｈｏｍｃｙｎｚｋ　ｉ、ｐ 、他によるＡｎａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍ（１９８７）１６２：１５６−１５９に記 載の処理を用いて分離された。約５ｇｍの粉末凍結果実組織が使用された。Ｐｏ 　ｌ　ｙ　（Ａ）”　ＲＮＡが、Ｔｈｅｏｌｏｇｉｓ　Ａ、他により↓　ＭｏＩ 　Ｂ−世（１９８５）よ及且　５３−５８に記載されたようにオリゴ（ｄＴ）セ ルロースクロマトグラフィーを用いて分離され、ｃＤＮＡライブラリーが、Ｈｕ ｙｎｈ、Ｔ、Ｖ、他によってｃＤＮＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ＋　Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ（１９８５）（Ｇｌｏｖｅｒ、 、Ｄ、Ｍ、ｅｄ、）、ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ、、Ｌｏｎｄｏｎ、４９−７８に記載 されたようにλｇｔｌｏ内へ組み込まれた。５００ｂｐよりも大きなｃＤＮＡは 、Ｃルブレッサ遺伝子のＥｃｏＲ１位置内へ挿入された。パッケージされたＤＮ Ａは、ｐｈａｇｅ含有挿入物の選択のためにＣ６００の派生物であるＣ６００Ｈ ＦＬ上ヘブレートされた。

λｇｔ１０組換えファージの単位を形成する約１０６ブラークが、Ｃ６００を用 いてＩ　Ｘ　１０’　／８５ｍｍ　ベトリ皿ヘブレートされた。上述のようにニ トロセルロースフィルタへトランスファーした後、３０％ホルムアミド、５Ｘ　 ５ｓＰＥ　（ＩＸ　５ＳＰＥは０．１．８Ｍ　ＮａＣ１１］ＯｍＭ　ｓｏｄｉｕ ｍ　ｐｈｏｓｐｈａｇｅ、ｐＨ７，０，１ｍＭ　ｓｏｄｉｕｍ　ＥＤＴＡ）、５ Ｘ　ＢＦＰ　（ＩＸ　ＢＦＰは、０．ｏ２％ｗ／ｖウシ血清アルブミン、０．０ ２％　ポリビニル　ピロリドン）（ＭＴ−３６０ｋｄ）、０．０２　Ｆｉｃｏｌ ｌ　（ＭＴ−４００ｋｄ）　、１００ｍｇ／ｍ１Ｍｆ性サケ精子ＤＮＡ、　及び ０．１９６ＳＤＳ）。

例１において調整されたズッギー二ＰＡＣＣＩのゲル純化１．８ｋｂ　Ｅｃ。

ＲＩ７ラグメントは、Ｆｅｉｎｂｅｒｇ、Ａ、Ｐ、他によってＡｎａｌ　Ｂｉ。

ｃｈｅｍ　（１９８３）１３２　：　６−１３に記載されたように、ランダムｈ ｅｘａｍｅｒ印刷及びａ−３２Ｐ　ｄＣＴＰを用いて２Ｘ１０　ｃｐｍ／ｍｇの 特性活性ヘラベルされた。ラベルされたプローブは、開始物質から分離され、λ ｇｔｌＯライブラリをプローブするために使用された。

プローブは室温で１０分間にわたり０．２５量（ｖｏｌｕｍｅｓ）のＩＭＮａＯ Ｈで変性され、０．２５１ｉ（ｖｏｌｕｍｅｓ）の２ＭＴｒｉｓ　ＨＣＩ、ｐＨ ７，２で中和され、ｌＸｌ０　ｃｐｍ／ｍ＋でハイブリダイズされた。

２４時間にわたるハイブリダイゼーションの後、フィルタは３０％ホルムアミド 、５Ｘ　５ＳＰＥ、０．１％　ＳＤＳ中で３７℃’？’２０分間にわタッチ一度 洗浄すレ、そ（７）後２Ｘ　５ＳＰＥ、０．１％ＳＤＳ中で１０分間にわたって ５０℃で４回洗浄された。最後の洗浄は、２Ｘ　５ＳＰＥ中で５０’Ｃで１ｏ分 間にわたって行われた。

洗浄後、フィルタは空気乾燥され、サランラップで被覆され、そして−７０’Ｃ でＸ線フィルムへ露光された。

このハイブリダイゼーションを用い、トマトがらの全長ｃＤＮＡであるｐｔＡＣ Ｃが再生された。トマトのＡＣＣｌの完全ｃＤＮＡ配列であるｐ　ｔＡＣＣｌを 図８に示す。付加クロー〉が、ｐｔＡｃｃｌの３゛端におけるラベルされた０゜ ５５ｋｂ　Ｈｉｎｄｌｌｌ／ＥｅｏＲＩフラグメントの２ｘ１０６Ｃｐｍを用い て再生された。

ハイブリダイゼーションの条件は、Ｃ６００上のλｇｔｌＯライブラリの２×１ ０ｐｆｕを用いて使用された。ここで、ニトロセルロース血小板は４２℃で５０ Ｇ６７＊ルム７ミド、５ＸＳＳＰＥ、５Ｘ　ＢＰＦ、５００ｍｇ／ｍｌ熱変性サ ケ精ＦＤＮＡで１２時間にわたってプレハイブリダイゼーションされた。フィル タはその後１８時間にわたって４２℃でプローブを用いて５０％フォルムアミド 、５　Ｘ　５ＳＰＥ、ＩＸ　ＢＦＰ、１００ｍｇ／ｍｌ熱変性サケ精子ＤＮＡ内 でこのプローブを用いてハイブリダイズされた。フィルタは４２℃ｄｅ５０％フ ォルムアミド、５Ｘ　５ＳＰＥ、０．２％ＳＤＳ中で３０分ニわたり２回洗浄さ れ、その後０．ＩＸ　５ＳＰＥ中で３０分間にわたり２度洗浄された。多数の付 加クローンが、図９に示すようにｐｔＡｃｃｌの上記部分を用いて再生された。

ＡＣＣシンターゼをコードしたズッキーニとトマトのｃＤＮＡのアミノ酸配列の 比較を図１０に示す。図示したように、がなりの相同性がこれらの配列間に存在 するが、これらは同一ではない。

例５ ＡＣＣＣＣシンターゼードしたトマトゲノムＤＮＡの再生ゲ２ツムＤＮＡは、Ｄ ａ　ｖ　ｉ　ｓ、　Ｒ，Ｗ、他によりＭｅｔｈ　Ｅｎｚｙｍｏｌ（１，９８０） ６５　：４０４−４１．１により記載された方法の改良を用いてｅｔｉｏｌａｔ ｅｄ　Ｒｕｔｇｅｒｓ　ｓｅｅｄｌｉｎｇｓがら分離された。簡単にいえば、ｓ ｅｅｄｌｉｎｇｓは、２２℃で５ＥＪ間にわたって暗室内で加湿フィルタ紙上に 成長した。５０ｇ冷凍ｈｙｐｏｃｏｔｙｌ及びンードコート除去されたコチｌノ トン組織がコーヒグラインダでグラインドされた。粉末となった組織は、２００ ｍ１のアイスコールド抽出バッフｙ　（５０ｍＭ　Ｔｒ　ｉ　５−ＨＣＩ、ｐＨ ８゜０．５０ｍｋｉ　ＮａＥＤＴＡ、０．２５Ｍ　ＮａＣ１，１５％　スクロー ス（Ｗ／■））へ付加され、手持ちがラスーガラスホモゲナイザを用いて氷上で 均質化された。核は、４℃で１０分間にわたって２０ｏｏｘｇでｐｅｌｌｅｔｅ ｄされた。生の核を塩なしの１００ｍ１コールド抽出バツフア内に再懸濁させた 。ヌクレイを１ｙｓｅするため、１０ｍ１の１ｏ％Ｎａ５ａｒｃｏｓ　ｉｎｅが 付加され、懸濁液はゆっくりと反転され１０分間氷上で培養され、その後１２０ ｇのＣｓＣ１が付加され、ゆっくりと振ることによって溶解された。ｄｅｂｒｉ ｓを除去するため、溶液は２６．０００Ｘｇで２０分間にわたって４℃で遠心分 離され、上澄みはＭｉｒａｅｌｏｔｈによってデカントされた。

エチジウムプロミド（１０ｍｇ／ｍｌ）が０．４ｍｇ／ｍｌの最終濃度となるよ うに付加され、溶液の濃度は１．５５ｇ／ｍｌとなるよう調節された。平衡遠心 分離は、２０℃で４８時間にわたり４０．０００ｒｐｍでベックマンＲ１７０ロ ータ内て行われた。ＤＮＡはさらに、２０℃で１６時間にわたり５０，０００ｒ ｐｍでＶＴｉ６５０−タ内で第２ラウンドの平衡遠心分離によって更に純化され た。エチジウムプロミドは、５ＭＮａＣｌを含有する水で飽和されたインプロパ ツールで′ＤＮＡから抽出され、ＤＮＡはＣｓＣｌを除去するためにＴＥ　（ｐ Ｈ７，５）の５０００ｖｏ　ｌｕｍｅに対して２回透析された。一般的な収量は 、１５Ｍｇ／ｇ生成重量組織であった。

２個のゲノムライブラリが構成され、一つは１５−２３ｋｂ　５ａｕ３Ａの部分 的に消化されたλＥＭＢＬ３内のＤＮＡをもち、他方はλ２００１内への完全Ｈ ｉｎｄｌＩＩ消化後の６−８ｋｂ　ＤＮａをもツ。λＥＭＢＬ３内に構成された ライブラリに対しては、１００μｇのゲノムＤＮＡが３００μｌの媒体塩バッフ ァ　（ＭＳＢ）＋２ｍＭのｄ　ｉ　ｔ　ｈ　ｉ　ｏ　ｔ　ｈ　ｒ　ｅ　ｉ　ｔ　 ｏ　Ｉ　（ＤＴＴ）中で３７℃で１．５単位のＳ　ａ　ｕ　３Ａで消化された（ １．Ｘ　ＭＳＢは、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣＩＳｐＨ７，５，５０ｍＭ　Ｎａ Ｃ１，１０ｍＭ　ＭｇＳＯ４である）。

反応の１／３ずつ、それぞれ７．５分、〕Ｏ分、１２．５分の時点で除去された 。

各時間点において、消化は０、ｌｖｏｌｕｍｅの０．５ＮａＥＤＴＡＳｐＨ８゜ Ｏを付加し水上で保存することによって停止した。ＤＮＡは、０．８ボルト／Ｃ ■で２４時間１．ごｔ）たる電気泳動によって０．５％低低溶湿温アガローゼゲ ルにサイズフラクンヨノされた。アガローゼゲル電気泳動バッファはＩＸ　ＴＡ Ｅ、４０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨｏＡＣ，ｐＨ８，０，２ｍＭ　ＮａＷＤＴＡであっ た。ゲルは、室温で３時間にわたー）て、０、うＭＮａＣｌを含有するＩＸ　Ｔ ＡＥ／＜ノファ内に浸されｔ：。ＤＮＡは、３６５ｒ＋ｍ紫外線て可視化され、 １５１５−２３ｋｂイド１／ンジが削除された。アガローゼは６５℃で１５分間 にわたって溶融され、ＴＥ　（ｐＨ７，５）−飽和フェノールで２度抽出され、 そして３７℃へ前加温された。水性相は、エーテルで３回抽出され、ＥｔＯＨの ２ボリユームが付加された。−２０℃で一夜おいた後、ＤＮＡは遠心分離によっ て収集され、ＴＥ。

ｐＨ７，５中で溶解された。２μｇのＥＭＢＬ３アーム及び２μｇサイズの選択 されたＤＮＡが６μｌの最終体積中で合成され、１μｍのＩＯＸ　リガーゼバッ ファ（ＩＸ　リガーゼバッファは６６ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、ｐＨ７，５５ｍ Ｍ　ＭｇＣｌ、、）が付加され、そ１２て付着端が１５分間にわたってアニール された。混合体は氷上で迅速に冷却され、それぞれ１μｍの１０ｍＡＴＰ及び５ ０ｍＭＤＴＴが付加された。反応は１μｍ　（８単位）の７４　ＤＮＡリガーゼ で開始され、１４℃で一夜培養された。Ｉｉｇａｔｉｏｎの１／３は、メーカー に従ってＧｉｇａｐａｋ　Ｇｏｌｄ　（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ）でパッケージさ れた。

約ｌＸ１０６ｐｆｕがＣ６００１て滴定された時に得られた。

Ｈ１ｎｄ１１１ライブラリーに対しては、２００μｇのゲノムＤＮＡが３．６ｍ ｌ　ＩＸ　ＭＳＢ内で４００単位の酵素で４時間にわたって３７℃で消化された 。ＤＮＡは、０．０８９６の低溶融温度アガローゼゲル上で分離され、６−８ｋ ｂサイズ範囲のＤＮＡが上述のように分離された。このＤＮＡの１μｇが上述し たように１０　ｌｌｌの最終ボリューム中で０．５μｇの２００１アームへ結合 された。このリゲーションの１／３はＧｉｇａｐａｋ　Ｇｏｌｄでパッケージさ れ、５ｘ１０’　ｐ　ｆ　ｕｌ！に８０２上にプレートされた時に得られた。

共にＥＭＢＬＪ内にある、Ｂｇｌｌｌの完全消化ライブラリー及びトマトカルチ ベータＶ　Ｆ　３６からのゲノムＤＮＡのＭｂｏ１部分消化ライブラリーは、Ｃ １Ｃｏｒｒ及びＢ、Ｂａｋｅｒにより与えられた。これらのライブラリー及びλ ２００１内のＨ４ｎｄｌｌｌ完全消化ライブラリーは、ホストに８０２上でプレ ートされ、上述したようにｐｔＡｃｃｌ　ｃＤＮＡで厳密にプローブされ、これ によってｃＤＮＡに対応したクローンが得られる。他の遺伝子に対応するクロー ンは、ＥＭＢＬ３中のＳ　ａ　ｕ　３Ａ部分消化ライブラリーをあまり厳密でな い状態でｃＤＮＡでプルービングすることによって得られた。２個の別個のスク リーニングにおいて、ファージは小ストＣ６００上またはＴＣ４１０上でプレー トされ、リフトされそして上述したようにニトロセルロースへ固定された。低ス トリンジエンシーのプレハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーションは 、３０％フォルムアミド、５Ｘ　５ＳＰＥ、５Ｘ　ＢＦＰ、１００１１ｇ／ｍｌ 変性サケ精子ＤＮＡ、０．２％ＳＤＳ中て３７℃てそれぞれ１８時間にわたって 行われた。

プローブは、１１０６ｃｐ／ｍｌの濃度で行われた。洗浄は３０％フォルムアミ ド、５Ｘ　５ＳＰＥ、０．２％ＳＤＳ中で３７℃で２０分にわたって２度行われ 、２Ｘ　５ＳＰＥ、０．２％、ＳＤＳ中で４２℃で２０分にわたり２回行われた 。

フィルタは、上述したように４８時間にわたってＸ線フィルムへ露光された。

制限酵素として、ファージＤＮＡのλクローン、２．５μｇの酵素消化は、５０ μｌの高塩バッフｙ　（Ｈ３Ｂ）（ＩＸ　Ｈ３Ｂは、１００ｍＭ　ＮａＣ１，５ ０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　（ｐＨ７，５）、１０ｍＭ　Ｍｇ５Ｏ，）中で適切 な酵素で消化された。ゲノムＤＮＡゲルプロットに対しては、７．１５μｇのゲ ノムＤＮＡが、８０単位のＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄｌＩＩまたは４０単位のＢｇ ｌＩｔを含む１００　１のＩＸ　Ｈ８Ｂ中で３７℃で６時間にわたって消化され た。

消化されたＤＮＡは、厚さ１ｃｍ、０．８％アガローゼ　ゲル上で装荷され、０ ．５ｇ／ｍｌ臭化エチジウムを含有するＬＸ　ＴＡＥ　バッファ中で３Ｖ／ｃｍ で電気泳動された。電気泳動後、ゲルは撮影され、ＤＮＡは０．２５Ｍ　ＨＣＩ の２回の１５分処理でニック（ｎｉｃｋ）され、０．５Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ ｐＨ７，５）、１．５Ｍ　ＮａＣ１の２回の２０分処理で変性され、そして０゜ ５Ｍ　Ｔｒｔｓ−ＨＣＩ　（ｐＨ７，５）、１．５Ｍ　ＮａＣ１の２回の２０分 処理で中和された。核酸は、２ＯＸ　５ＳＰＥ中でＮｙｔｒａｎナイロン膜へト ランスファーされた。

トランスファー完了後、核酸は１．２ジユールの２５４μｍ紫外線で固定された 。膜は５０ｍ１の５０９６ホルムアミド、５Ｘ　５ＳＰＥ、１．０％ＳＤＳ及び １００μｇ／ｍｌ熱変性サケ精子ＤＮＡ中で４２℃で１２時間にわたってプレハ イブリダイゼーションされた。ハイブリダイゼーションは、３０　ｍ　ｌの５０ ％ホルムアミド、５Ｘ　５ＳＰＥ、ＩＸ　ＢＦＰ、１０％デキストラン　サルフ ェイ）　（Ｍ丁−４００ｋｄ）　、０．２％ＳＤＳ、及び５０μｇ／ｍｌの熱変 性サケ精子ＤＮＡ中で４２℃で１８時間にわたって行われた。ゲノムＤＮＡを用 いたフィルタは２．ＯＸＩＯ６ｃｐｍ／ｍｌてノ・イブリダイズされ、λＤＮＡ をもつフィルタは、５ｘ１０５ランダムヘキサマーラベルされた１、８ｋｂ　ｐ ｔＡｃｃｌｃＤＮＡと１１イブリダイズされた。ハイブリダイゼーション後、膜 は０．ｌＸ５ＳＰＥ及び０．２９６　ＳＤＳ中で５５℃で２０分にわたって２回 洗浄され、乾燥され、プラスチックラップ内にラップされ、そしてＫｏｄａｋＸ Ｒ−５Ｘ線フィルム士に配置された。　ＤＮＡゲルプロットは、インテンシフア イヤスクリーンを用いて１２−２４時間にわたり一７０℃にさらされた。

トマトから最盛された４個の異なるゲノムクローンに対応するクローンを図１１ 及び１２に示す。図１１Ａは、３個の個別遺伝子ＬＥ−ＡＣＣＩＡ；　ＬＥ−Ａ ＣＣＩＢ；　及びＬＥ−ＡＣＣ３として確認された連続した３個のゲノムクロー うを小す。図１２は、ＬＥ−ＡＣＣ２で確認されたゲノムクローンを示す。図１ ３は、ＬＥ−ＡＣＣ２の完全ヌクレオチド配列を示す。

図１４は、２個はズッキーニからそして４個はトマトからそれぞれ生殖された討 ６個のゲノムクローンによりコード化されｊ−アミ、ノ酸配列を比較したもので ある。再び、保ｆｔされた配ダリが見いだされ、そしてかなりの同一性があるが 、配列中には数多くの）口達が存在している。

ズッキーニからのｐＡｃｃｌは、発現ベクターｐＫＫ２２３−３のＥｃｏＲＩＪ −ストレインＪＭ１０７内へ導入された。形質転換体は、ＬＢ媒媒体石アンピン リン（５１）ｍｇ／ｍ＋）の存在下で３７℃で４時間にわたって成長された。Ｉ ＰＴＧは１ｍＭへ付加され、培養は２時間にわたって３７℃で培養された。ＡＣ Ｃシンターゼ活性及びＡＣＣ形成がアッセイされた。１．７ｋｂ　ＥｃｏＲＩ　 ｃＤＮＡフラグメントが正しい指向性でｐＫＫ２２３３−３内へ挿入され、形質 転換されたＥ、ｃｏｌｉが上述のように培養されると、ＡＣＣシンターゼ活性は ２０ｎｍｏｌ／ｈ／ｍｇプロティンでＩＰＴＧの非存在下及び４２ｎｍｏｌ／ｈ ／ｍｇてＩ　ＰＴＧの存在下で生成された。１００ｍ１の培養に対するＡＣＣ形 成は、Ｉ　ＰＴＧなしでは２２８０ｎｍｏ　ｌでありＩＰＴＧが存在する場合は ４０７０ｎｍｏｌであった。１−７ｋｂフラグメントが逆方向に挿入された時に は、ＡＣＣシンターゼ活性もＡＣＣ生成も観察されなかった。

トマトＡＣＣシンターゼに対する同様の後生が、Ｅ、ｃｏｌｉ中のトマトｃＤＮ Ａの発現をテストするために使用された。プロティンはＬａｃＺ遺伝子の一部と の融合として合成される結合部における配列を図１５に示す。

この結合を含むベクターの構成のため、ｐＥＴＣ３Ｃ（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ。

Ａ、　Ｈ，他　Ｇｅｎｅ　（１９８７）５６：１２５−１５５）が、ＥｃｏＲＩ 及びＥＣｏＲＶて切断しＫｌｅｎｏｗて充填してＴ７ブロモータ下流の３７５ｂ ｐフラグメントが除去される。結果としてえられる再すゲートされたプラスミド は、ｐＰＯ７と命名された。ｐＰＯ７は、ＢａｍＨＩ及びＮｄｅｌで切断され、 そして大ＤＮＡセグメントは純粋化されそして中間プラスミドｐｐｏｃ＋をえる ためにＥｅｏＲＩ位置を含むＢａＭＨＩ／Ｎｄｅｌポリリンカーヘリゲートされ た。

ｐｔＡｃｃｌからの１．４ｋｂ　ＥｃｏＲＩフラグメントは、その後ｐＰＯ９の ＥｃｏＲＩ内ヘリゲートされ、図１５に示された結合かえられ、ｐＰＯ４６とに 使用された（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ他（ｓｕｐｒａ）Ｌ培養は、生成終夜培養を２ ｘ　ＴＹへ福釈することによって誘起され（Ｍａｎｉａｔｉｓ他（ｓｕｐｒａ） ）、そして３７℃で６００μｍにおいて０．　７−０．８の吸光度となるまで成 長された。ＩＰＴＧは、２ｍＭの最終濃度へ付加され、成長は更に２時間続けら れた。細胞が収潰され、組換えポリペプチドがＮａｇａｉ、に、及びＴｈｏｇｅ ｒｓｅｎ、Ａ、Ｃ，によりＭｅｔｈ　Ｅｎｚｙｍｏｌ　（１９８７）よユニ：４ ６１−４８１に記載されたようにして純化された。

図１６は、ＩＰＴＧの存在Ｆ及び非存在下でｔＡｃｃ−含有ベクターで形質転換 された培養のｎｒｎｏｌ／１５μｌ内てのＡＣＣンンターゼの合成を示す。因に 示されるごとく、ｃＤＮＡがアンチセンス方向にリゲートされると、ＩＰＴＧが 存在するときもしないときにもＡ　ＣＣ＞ンターゼは生成されない（固体スクエ ア）、、ｃＤＮＡが１トシ、い方向へ指向された時、１８０分後に２ｒ＋ｍｏｌ 　ＡＣＣシンターゼが１５μｌ後にＩＰＴＧの存在下で生成され（固体サークル ）、モしてＩＰＴＧ不存在下では０．５ｎｍｏｌと１．Ｏｎｍｏｌとの間であっ た（オーブンサークル）。

標識されたＣ　−カルポギシルー標識されたＳ−アデノシル−メチオニンを用い たＡＣＣの製造が図１７に示されている。これらの図において、＃１はメチオニ ン、＃２がｍｅｔｈｉｏｎｙｌ　５ｕｌｆｉｔｅ、　＃３はｍｅｔｈｉｏｎｙｌ ｓｕｌｆｏｘｉｄｅであり、モして＃４は確認されていない。ＡＣＣは明確にラ ベルされた。図１．７Ａは、ＩＰＴＧの非存在下での結果を示す。わずかなＡＣ Ｃが形成されている。図１７Ｃは、ｃＤＮＡがまちがった方向ヘリゲートされた 時の結果を示ず。ＡＣＣは形成されない。図１７Ｂは、ｃＤＮＡの正しい指向性 が用いられた時のラベルされたＡＣＣの生成を示す。大量のＡＣＣが生成される 。

ｃＤＮＡクローンＡＣＣＩを表すＥｃｏＲ１フラグメントは、イースト発現ベク ターｐＢＮ１２５８のＥｃｏＲ１位置内へサブクローンされ（ジョンストン、Ｍ 。

他　Ｎ軍旦−鼾−−、Ｃｅ　ｌ−！−−−−邸＝ｉ　ｏｐ　（１９８４）　」− ：　１４４０−１４４８）　、イースｌ−スＩ・Ｌイ；ＹＭ２０６１内へ導入さ れた。イースト細胞は、３７℃で２４時間にわたってＹＩ）媒体上で成長された （Ｓｈｅｒｍａｎ、Ｆ、他　Ｍｅｔｈｏｄ上−１ｎ−Ｖ−！−リｔ　−Ｇｅｎｅ ｔｉｃｓ　（１９７９）　Ｃｏ１ｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａ ｔｏｒｙ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｉ（ａｒｂ。

ｒ、ＮＹ）。媒体は、２％ガラクトースまたは２９６グルコースを含有していた 。

この培養後、細胞は収穫され、上澄みは媒体内へ解放されたＡＣＣに対してアッ セイされた。ｐｅｌｌｅｌｅｄ細胞は５ｇｍガラスビードを含ａしたバッファ中 で再懸濁され、３０秒間にわたって１Ｏ回ｖ　ｏ　ｒ　ｔ　ｅ　ｘ−ｎｉ　ｉ　 ｘ　ｅ　ｄされ、そして３分にわたって２０００８ｇで遠心分離された。この上 澄みもまた収集された。

固体硫酸アンモニラ１１が付加されて８０％飽和が達成され、沈澱物が収集され て２ｍｌ（７）２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、ｐＨ８，０，１０Ｍ　ビリドクサ ルホスフ、−１−１１０ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．５ｍＭ　ｄｉ　ｔｈｉｏｔｈｒｅ ｉ　ｔｏｌ内で溶解され、そして同じバッファに対して透析された。ＡＣＣは、 ベクターの構成に関わりなく、２％グルコースを含む媒体内では生成されなかっ た。制御ホストベクター及びアンチセンス方向へ挿入されたＡＣＣＩ　ｃＤＮＡ を用いた制御ベクターもまた、細胞抽出物にＡＣＣを生成しなかった。しがしな がら、２％のガラクトースを含有していた時には、ｃＤＮＡを正しい方向に含有 しているｐＢＭ−ＡＣＣｌは、生成抽出物内にＡＣＣの生成及び抽出されたプロ ティン中にＡＣＣ活性を示した。ＡＣＣシンターゼ活性は、生成抽出物中では２ ．６ｎｍ。

１−’ｈｒ／ｍｇプロティンであった。培養１００ｍ１に対１．て３５４ｎｍｏ ｌのＡＣＣが形成された。

トマトの成熟は、トマト植物をトマトＡＣＣシンターゼ遺伝子のアンチセンス構 造を用いて防止可能であることが示され、従−）てこのトマトＡＣＣシンターゼ 遺伝子は、内性ＡＣＣシンターゼの合成を推定的に抑制した。ｃＤＮＡクローン がカリフラワーＣＡＭＶ３５Ｓプロモータの制御下で逆センス方向へ挿入され、 トマト血小板をＡ、ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ　ｍｅｃｌｉａｔｅｄ方法を用いて 形質転換するために使用された。再生された植物は、成熟せずｐｏｌｌｉｎａｔ ｉＯｎ後の時間にエチレンを生成しないトマトを生成し、エチレンは制御植物中 で生成された。

アンチセンスベクターは次のように構成された二３５ＳプロモータがｐＪＯ２４ Ｄからの３０２ｂｐフラグメントとしてえられた（Ｏｗ、　Ｄ、　Ｗ、　、Ｐ　 ｒ　ｏ　ｃＮａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ（１９８７）８４：４８７０− ４８７４）。プラスミドｐＪ０２４Ｄは、Ｈｉｎｄｌｌ！で消化され、Ｋｌｅｎ ｏｗ断片で処理され、そしてその後ＢａｍＨＩで切断されてゲル電気泳動によっ て３０２ｂｐフラグメントが分離された。これは、Ｘｂａｌて消化することによ ってｐｔＡＣＣＩからコード化配列を切り出し、Ｋｌｅｎｏｗで充填し、そして ＢａｒｎＨＩで切断することによって’３．５ｋｂのトマトＡＣＣシンターゼｃ ＤＮＡにけっさくされた。２個のＢａｍＨｌフラグメントがけっさくされ、結果 として得られた１ＯｇａｔｉｏｎはクローニングのためにＥ、ｃｏｌｉ　５ｔａ ｉｎ　ＤＨ５Ａへ形質転換された。生殖されたプラスミドは、ｐ　Ｐ　（１３３ ２と命名された。

プラスミドｐＰＯ３２は、５ａｃｌ及びＳ　ａ　１−１によって部分的に消化さ れ、そして消化は、５ａ１１／５ａｃｌ消化されたｐＢ１１０１２値Ｔｉベクタ ー（Ｃ１ｏｎｅｔｅｃｈ）へ結果された。ｐＢｌｌｏｌは更に、図１７に示すよ うにＮ０８３’端未配列を含む。結果として生じるヘクターはｐＰＯ３５と呼ば れ、クローニングのためにｇニーεｏｌ−ｉＤＨ５Ａへ形質転換された。結合部 における配列は配列解析によって証明された。

ｐＰ（Ｉう５またはＡＣＣンンターゼ遺伝子のない制御ベクターは、純化されて 次に筒中に記す標準処理によってアグロバクテリウム株ＬＢＡ４４０４内へ導入 された。　Δ、　−杏巴Ｐ−ｉＬＡ−９−プＡｙ　ＬＢＡ−４４０４（２ｍｌ） が２８℃でＬＢｂｒｏｔｈ内で一夜成長され、これが５ｆ）ｍｌのＬＢ　ｂｒｏ ｔｈを接種するために使用され、これによって所望の培養が得られた。接種され た媒体は２８℃で０Ｄ６ｏｏが０．５−１．０となるまで成長された。細胞は遠 心分離によって収集され、ｐｅｌｌｅｔは１．ｍｌ、２０ｍＭの水冷Ｃａ　Ｃｌ 　２溶液中で再懸濁された。１００μｍの細胞＠濁液へ１μｍのｐＰＯ３５ＤＮ Ａが付加され、この混合体が水上で３０分間にわたり、液体窒素内での瞬間凍結 （ｓｎａｐ−ｆｒｅｅｚｉｎｇ）に先だって、培養された。細胞は、その後３７ ℃で５分間にわたって解凍され、１ｍｌのＬＢを接種するために使用された。撹 拌による２８℃での２時間の成長後、１００ｕｌの培養がＬ　Ｂ　＋　Ｋ　ａ　 ｎ　ｓｏ媒体上てプレート（ｐｌａｔｅ）された。２−３１１で５２８℃でコロ ニーが現れた。細胞は、いくつかのコロニーを取り出してＬＢ＋Ｋａ口５ｏ媒体 上でストリーキング（ｓｔｒｅａｋｉｎｇ）することによって再培養された。再 度、３−４コロニーが独立のストリークス（ｓ　ｔ　ｒｅａｋｓ）から取り出さ れ、■、ｆ３　＋　Ｋ　ａ　ｎ　５０中の５ｍｌ培養が成長された。これらの培 養の静！ト相は、トマト植物のトランスフェクションに使用された。

細胞は、後の使用のために１５％グリセロールを用いて−８０”Ｃで冷凍保存可 能である。

ホスト植物の調製 トマト種子は７０％エタノールで２分間にわたって混合処理することがら成るプ ロトコールを用いて殺菌された。次いで、１０％次亜塩素酸ナトリウム及び０゜ １％ＳＤＳを用いて１０分間混合処理され、次いで１％次亜塩素酸ナトリウム、 ０．１％ＳＤＳを用いて３０分間混合処理され、殺菌水３Ｘを用いて各回２分間 の洗浄が行われた。

発芽のため、０．８ｇの殺菌種子が充填されたマゼンタボックス中のシードジャ ーミネーション培地（Ｓｅｅｄ　Ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　Ｍｅｄｉｕｍ）内に 配置され、成長室中で低光で２週間にわたって成長された。マゼンタボックスは ３０ｍ１の媒体を含有した１゜ ２週間後、種子が発芽すると、コチレドンチップを切断しその後茎を切断するこ とによって実生のためにコチレドンは切開された。この処理は、５−５−１Ｏの ＭＳＯを含有する大きなベトリ皿内て行われた２゜収穫されたコチレドンは、タ バコフィーダプレートのアバキシャルサイドアップ（ａｂａｘｉａｌ　５ｉｄｅ 　ｕｐ）に配置され、４８時間にわたり成長された。

フィーダプレートは、２５℃で１ｌ３０−１５０ｒｐで振って調製された液体媒 体内のタバコ細胞懸濁液から調製された３゜懸濁液は３−５日毎に１：１０の希 釈度で新鮮媒体へ移された。１ｍｌの高速分割培養がフィーダプレート上に配置 され、フィルタ紙とに塗られ、そして成長室内で低光内に配置された。フィーダ プレートは、１０ｍ１のフィーダ媒体で補足された４゜ｐＰ０３５ヘクターを含 むアグロバクテリウムは、株の弔−コロニーでカナマイシンを含む５０ｍ１ＬＢ 内へインキュベートされた。培養は、３０℃で飽和（６００ｎｍでＯＤ＞２．０ ）まて激しく振ることによって成長された。５ｔｒａｉｎは２４時間未満て完全 成長するように選択された。培養は、その後ＭＳＯて５ｘ１０８細胞／ｍｌにま で希釈され、そしてプラスチック管内で５０ｍ１部分ヘタｌ側Ｉされｆ、：。

フ１−ダ−；Ｌ、、、−４の２個からのフチ１ノドンが各管−１Ｓｃｒａｐｅさ れ、１０−３０分間にわたっでゆっくりＪゴｏｅｋされた。コチレドンはその後 バクテリア培養からクハー〕ゴイ〜ダブレー　Ｉ・」二の殺菌フィルタベーパａ ｂａｘｉａｌ　５ｉｄｅ　ｕｐ内・〜取り外され、成長室内で低光で４８時間に わたって培養された。

フチレドンは、その後カルス誘導培地（Ｃａｌｌｕｓ　Ｉｎｄｕｃｉｎｇ　Ｍｅ ｄｉｕｍ）へａｘｉａｌ　５ｉｄｅ　ｕｐ）ランスファーされた。

Ｃａ１ｌｕｓ　Ｉｎｄｕｃｉｎｇ　Ｍｅｄｉｕｍ内では、約４枚のプレートが各 ｍａｇｅｎｔａ　ｂｏｘ毎に使用され、外植体が満たされた。ｂｏｘは３週間に わたって成長室内に配置され、コチレドンの表面にカルスの小塊が形成された。

外植体は、３週間毎に媒体を誘起するカルスを含有するｆ　ｒｅｓｈプレートへ トランスファーされる。

ｃａｌｌＬが２ｍｌを超えると、それらは５ｈｏｏｔ誘起媒体を含むプレートへ トランスファーされた５゜ 裏構造が明らかとなると、５ｈｏｏｔはｃａｌｌｉからｄｉｓｓｅｃｔされ、５ ｈｏｏｔｓは根誘起媒体含有プレートへトランスファーされた６゜ｖｉｇｏｒｏ ｕｓルートシステムが植物に形成された後、ｐｌａｎｔｌｅｔｓは土へトランス ファーされた。これを行うために、それらはプレートから取り出され、可能な限 り寒天を除去して、カバー付きｍａｇｅｎｔａｂｏｘに適合する小び−とボット 内の高ピートコンテント土壌内に配置された。ｓｅｅｄｌｉｎｇ葉がボックスの 頂部に達すると、リッドがゆるめられて４−５日間にわたってゆ７くりを開かれ た。植物は、その後光カート及びより大きなｐｏｔへ移され、加湿状態に保持さ れた。

再生されたトマト植物は開花し、授粉されることができる。再生植物からの種子 が再ｐｌａｎｔｅｄされ、成熟するまで成長した。これらの第１世代植物の花は 授粉され、トマトが発達され、授粉後特定期日にわたってガスクロマトグラフィ ーによってエチレンが測定された。図１９は、２組の個別植物Ｖｌ、１−４（制 御ベクターを含む）及びＡｌＩ２−２４（アンチセンスベクターを含む）、ソＬ ｒ図２０ｉ、ｔＶ　１．　１−６　（ｆｉ（Ｉ御ヘク９　ｆａム）　及ヒＡ　Ｉ 　１．　２−７　（７ンチセンスベククーを含む）、をそれぞれ示す。これらの 図に示すように両方の場合において、制御ベクターで形質転換された制御植物が 、プロピレンまたは空気の存在下で授粉後約５０日経過後に、最大３ｇ／ｇフル ーツ／ｈまでの高レベルエチレンを生成した。しかしながら、双方の場合におい て、アンチセンスｐＰ０３５ベクターで形質転換された植物にはエチレンは生成 されなかった。さらに、エチレンを生成しなかったトマトも成熟せず、−力制御 植物はこのとき成熟した。

（脚注） １．５ｅｅｄ　Ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　Ｍｅｄｉｕｍは、各リットルに２．１ ６ｇのＭｕｒａｓｈｉｇｅ−５ｋｏｏｇ塩；　２０℃、３０ｇサッカロースで保 存されていた２ｍｌの５００Ｘ　Ｂ５ビタミン、及びＩＮ　ＫＯＨとされ８ｇの 寒天を含有する９８０ｍ１の水を含む。媒体は、マゼンタボックスを充填する前 に５００ｍ１部分内に高圧滅菌釜で処理される。

２、ＭＳＯは、各リットルに４．３ｇのＭｕｒａｓｈｉｇｅ−８ｋｏｏｇ塩、２ ｍｌの５００　ｘ　Ｂ５ビタミン：　３０ｇのスクロース及びＩＮのＫＯＨで生 成され最終ｐＨが５．８の９８０ｍ１の水を含む。

３、タバコ懸濁液媒体は、１リツトル中に４゜３ｇｃ７）Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ− ５ｋｏｏｇ塩、２ｍｌの５００Ｘ　Ｂ５ビタミン、３０ｇの３％スクロース、１ ０μｍの一２０℃で保存された０、５ｍｇ／ｍ１カイネチン溶液、２ｍｌの２ｍ ｇ／ｍ１ｐｃＰＡ溶液、及びｐＨ５，８とされかつ２５０ｍ１フラスコ毎に５０ ｍ１部分内に高圧滅菌釜で処理するためにＩＮのＫＯＨ中で生成された９８０ｍ １の水、を含む。

４、フィーダ媒体は、０．４３ｇ　Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ−８ｋｏｏｇ塩、２ｍｌ 　５００Ｘ　Ｂ５ビタミン、３０ｇの５ｕｃｒｏｓｅ及び９８０ｍ１の水がこＨ 中のＩＮを５．８のｐＨとして０．８％のａｇａｒを含む。上記成分は２個の５ ００ｍ１部分内でａｕｔｏｃｌａｖｅされ、注入時に１／ｍ！ベンジルアデニン （ＢＡ）及び０−２ｇ／ｍｌの１ｎｄｏｌｅ　ａｃｅｔｉｃ酸を得るためｃａａ ｃｔｔｔｃａａＡＴＧＧＧＧＴＴＴＣＡＴＣＡＡＡＴＣＧＡＣＧＡＡＡＧＧＡＡ ＣＣＡＡＣ＋ＣＴＣＴＴＣＭ　Ｇ　ＦＨＯＩＤＥＲＮＯＡＬ ＤＧＩＪＫＡＹＤＮＤＰＦＨＰＥＮ）ＪＰＭＩＶＣＩＪＩＲＫＨＰＥＡＳＩＣＴ 　ρＣＴ　Ｔ　ＡＣＣＡＧＡＧＴ　Ｔ　Ｔ　ＣＧＡＡＡＴ　Ｃ，ＣＡＡＴ　ＴＧ ＣＡＡＡＴ　Ｔ　Ｔ　ＴＡＴ　ＧＣＧ（、ＡＡＡＧＴＡＡｆ、Ａf ＬＰＥＦＲＮＡＩＡＮＦＭＧＫＶＲ ＡＮＭＫＶＫＧＶＩ　Ｉ　ＴＮＰＳＮＰＴＡＣＧＣＡＣＡＡＣＧＴＡＣ［ｌ、Ａ ＣＣＧＴＧＡＣＡＣＴＣＴＴＡＡＡＡＣＣＣＴＣＧＴＣＡＣＣＴＴＴＧＴＧ　７ ００しＧＴＴＹＤＲＤＴＬＫＴＬＶＴＦＶ ＡＡＴＣＡＡＣＡＣＧＡＣＡＴＴＣＡＣ丁ＴＡＡＴＡＴＧＣＧＡＴＧＡＡＡＴＡ ＴＡＣＴＣＴＣＣＣＡＣＴＧＴＦＩＧ、　１Ｂ（ｉ） ＡＧＣＡＴＴ［：、ＣＡＡＧＡＡＧ（、ＡＧＣＴＣＡＴＣＣＡＴＡＴＴＣＴＴＴ ＡＴＡＧＣＴＴＧＴＣＣＡＡＡＧＡＣＥＨＣに　に　ＥＬＩ）４１ＬＹＳＬＳＫ ＤＡＴＧＧＧＣＣＴＣＣＣＴＧＧＴＴＴＴＣＧＡＧＴＴＧＧＡＡＴＴＡＴＴＴＡ ＴＴＣＴＴＡＣＡＡＣＧＡＴＧＴ　９００ＭＧＬ　ρ　ＧＦＲＶＧＩ　ＩＹｓＹ ＮＤＶＣＧＴＣＧＴＣＣＧＣＣＧＴＧＣＴＣＧＧＣＡＧＡＴＧＴＣＧＡＧＣＴＴ ＣＧＧＣＣＴＣＧＴＣＴＣＧＴＣＣＣＶＶＲＲＡＲＱＭＳＳＦＧＬＶＳＳ ＡＧＡＣＴＣＡＡＣＡＴＴＴＧＣＴＣＧＣＣＧＣＣＡＴＧＣＴＴＴＣＣＧＡＣＧ ＡＧＧＡＣＴＴＴＧＴＣＧＡＣ１０００ＱＴＱＨＬＬＡＡＭＬＳＤＥＤＦＶＤ Ａ１０００ＱＴＱＨＬＬＡＡ、ＡＧＡＡＣＴＣＧＡＡＧＣＧＴＧＴＧＧＧＣＧＡ ＧＡＧＧＣＡＴＧＣＡＡＧＧＴＴＫＦＬＡＥＮＳＫＲＶＧＥＲＨＡＲＦ ＣＡＣＡＡＡＡＧＡＡＴＴＧＧＡＴＡＡＡＡＴＧＧＧＧＡＴＣＡＣＴＴＧＣＴＴ ＧＡＡＣＡＧＣＡＡＴＧＣＴＣ、１１００ＴＫＥＬＤ　に　ＭＧＩＴＣＬＮＳＮ ＡＧＡＧＴＴＴＴＴＧＴＧＴＧＧＡＴＧＧＡＴＣＴＡＣＧＧＡＧＧＣＴＡＴＴＡ ＡＡＡ（、ＡＣＣＡＡＡＣＣＴＴＣＧＶＦＶＷＭＤＬＲＲＬＬＫＤＱＴＦ ＡＡＡＧＣＴＧＡＡＡＴＧＧＡＧＣＴＴＴＧＣ，ＣＧＴＧＴＧＡＴＴＡＴＣＡＡ ＴＧＡＡＧＴＣＡＡＧＣＴＣＡＡ　１２００ＫＡＥＭＥＬＩＪＲＶＩ　ＩＮＥＶ ＫＬＮＴＧＴＴＴＣＴＣＣＴＧＧＣＴＣＡＴＣＣＴＴＴＣＡＴＧＴＣＡＣＴＧＡ ＧＣＣＡＧＧＴＴ　ＧＧＴＴＴＣＣ，ＡＣＶＳＰＧＳＳＦＨＶＴＥＰＧＷＦＲ ＴＴＴＧＴＴＴＣＧＣＡＡＡＣＡＴＧＧＡＣＧＡＣＡＡＣＡＣＣＧＴＴＧＡＣＣ ，ＴＴＧＣＴＣＴＣＡＡＴＡＣ，Ａ　１３００ＶＣＦＡＮＭＤＤＮＴＶＤＶＡＬ ）ＪＲＡＴＣＣＡＴＡＧＣＴＴＴＧＴＣＧＡＡＡＡＣＡＴＣＧＡＣＡＡ（、ＡＡ ＧＧＡＡＧＡＣＡＡＴＡＣＣＧＴＴＧＣＩＨ５ＦＶＥ）ＪＩＤＫＫＥＤＮＴＶＡ ＡＡＴＧＣＣＡＴＣＧＡＡＡＡＣＧＡＧＧＣＡＴＣＧＡＧＡＴＡＡＴＡＡＧＴＴ ＡＣＣＡＴＴＧＡＧＣＴＴＣＴ　１４００ＭＰＳＫＴＲＨＲＤＮＫＬＲＬＳＦ ＣＣＴＴＣＴＣＡＧＧＧＡＧＡＡ（、ＡＴＡＣＧＡＣＧＡＧＧＧＣＡＡＣＧＴＴ ＣＴＴＡＡＣＴＣＡＣＣＧＣＡＣＳＦＳＧＲＲＹＤＥＧＮＶＬ）ＪＳＰＨＡＣＧ ＡＴＧＴＣＧＣＣＴＣＡＣＴＣＧＣＣＧＴＴＡＧＴＡＡＴＡＧＣＡＡＡＡＡＡＴ ＴＡＡｔｔａａａａａｃ　１５００ＴＭＳＰＨＳＰＬＶＩＡＫ）Ｊ ａｔｔｔｔｔｃａａａａｔａｔｔｃａｔａｃｃａｔｔｃａｔａｔａｇｔｔｔｔｔ ｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｇｇｇｔｃａａｔｇｔｔｇａｃｔａａａｇｔｔ ａｃｇｔａｔａｔｔｔｔｔｔｃｃａｃａｇｔｇｇａｔａｔｇａ　１６００ｔｇ　 ｔ　ａａａｃ　ｔ　ｔ　ｃａｔａｔ　ｔ　ｔ　ｔ　ｔ　ｔｇｇｔｇｇｇａｔｇｇ ｔｇａｔａｇａ　ｔｇｔａａｔｇｔ　ａｔ　ｔ　ｔｇ■ （−−−−）Ｗ　＃　ｌ○Ｘ （−）■某遁■ユ田００８乙 Ｄａ 一各゛　・・−ｍ−−６７ −２０，１ Ｔ（ＪＣｍＣＣＧＡＣＧＡＧＧＡＣＴＴＴＧＴ（ＧＡＣ＾ＡＡＴＴＴＣＴＴＧＣ ＣらＡＧＡＡ口ＴＣＧＡＡＧＦＩＧ、６Ｄ ＦＩＧ、６Ｅ ＧＩＩＰＶＨＣＮＳＳＮＮＦＱＶＴＥ ＧＧＣＡ［１ＣＣＴＴＡＧＡＡＡＴＡＧＣＣＴＡＴＡＡＡＡＡＧＧＣ丁ＣＡＡＧ ＡＧＧＣＣＡＡＣ＾ＴＣＡＡＡＧＡＡＬＥ　ＩＡＹＫＫＡＱＥＡＮＭＫ ＴＧＡＡ［ｌｉＧＧＴＧＴＴＡＴＡＡＴＣＡＣＣＡＡＴＣＣＣＴＣＡＡＡＴＣＣ ＣＴＴＡＧＧＣＡＣＭＣＧＴＡＣＶ　Ｋ　Ｇ　Ｖ　Ｉ　Ｉ　Ｔ　Ｎ　Ｐ　Ｓ　Ｎ 　Ｐ　Ｌ　Ｇ　Ｔ　Ｔ　ＹＧＡＣＣＧＴＧＡＣＡＣＴＣＴＴＡＡＡＡＣＣＣＴＣ ＧＴＣＡＣＣＴＴＴＧＴ（ｌｉＡＡＴＣＡＡＣＡＣＧＡＣＡＴＤＲＤＴＬＫＴＬ ＶＴＦＶＮＱＩ−ＩＤＩＴＣＡＣＴＴＡＡＴＡＴＧＣ［’１ｉＡＴＧＡＡＡ　丁 ＡＴＡＣＴＣＴＧＣＣＡＣＴＧＴＣＴＴＣＭＡＧＣＣＣＣＡＡＥＩＹＡＡＴＶＦ ＤＴＰＱＦＶＳＩ ＦＩＧ、８Ａ ＣＴＧＡＡ＾ＴＣＣＴＣＧＡＴＧＡＡＣＡＧＧＡＡＡＴＧＡＣＴＴＡＣＴＧＣＡ ＡＣＡＡＡＧＡＴＴ丁Ａ（ＩＩＴＴ　９００ＡＥ　ＩＬＤＥＱＥＭＴＹＣＮＫＤ ＬＶＣＡＣＡＴＣＧＴＣＴＡＣＡＧＴＣＴＴＴＣＡＡＡＡＧＡＣＡＴ（：＋ＧＧ ＧＴＴＡＣＣＡＧＧＡＴＴＴＡＧＡＧＴＨＩＶＹＳＬＳＫＤＭＧＬＰＧＦＲＶ ＣＧＧＡＡＴＣＡＴＡＴＡＴＴＣＴＴＴＴＡＡＣＧＡＣＧＡＴＧｉＴＣＧＴＴＡ Ａ１丁ＧＴＧＣＴＡＧＡＡＡＡＡ　１０００（ＪＩＩＹＳＦＮＤＩＩＶＶＮＣＡ Ｉ’２ＫＴＧＴＣＧＡＧＴＴＴＣＧＧＴＴＴＡＧＴＡＴＣＴＡＣＡＣＡＡＡＣＧ ＣＡＡＴＡ丁ＴＴＴＴＴＡ（ＩＩｃＬＩＧｃＡＭＳＳｒｆ：１ＬＶＳＴＱＴＱＹ ＦＬＡＡＡＴＧＣＴＡＴＣＧ［：１ＡＣＧＡＡＡＡＡＴＴＣＧＴＣＧＡＴ＾ＡＴ ＴＴＴＣＴＡＡ（ｌｌＡ［ＩＡＡＡＧｃ［ｌｌｃ［ＪＡＴ　１１００ＭＬＳＤＥ ＫＦＶＤＮｒＬＲＥＳＡＭ ＧＡＧＧＴＴＡＧＧＴＡＡＡＡＧＧＣＡＣＡＡＡＣＡＴＴＴＴＡＣＴ＾ＡＴＧＧ ＡＣＴＴＧＡＡＧＴＡＧＴＧＧＲ’ＬＧＫＲＨＫＨＦＴＮＧＬＥＶＶ ＧＡＡＴＴＡＡＡＴＧＣＴＴＧＡＡＡＡＡＴＡＡＴ（ｌｉｃＧ（ｌｉＧＧＣＴＴ ＴＴＴＴＧＴＴＧＧＡＴＧＧＡＴＴＴＧ　１２００Ｇ　ＩＫＣＬＫＮＮＡＧＬＦ ＣＷＭＤＬＣＧＴＣＣＡＣＴｎＴＡＡＧＧＧＡＡＴＣＧＡＣＴＴＴＣＧＡＴＡＧ Ｃ［１ＡＡＡＴＧＴＣ［１ＴＴＡＴＧＧＡ［ｉＲＰＬＬＲＥＳＴＦＤＳＥＭＳＬ 　讐　ＲＡＧＴＴＡＴＴＡＴＡＡＡＣＧＡＴＧＴＴＡＡＧＣＴＴＡＡＣＧＴＣＴ ＣＧＣＣＴＧＧ＾ＴＣＴＴＣＧＴＴＴＧ　１３００Ｖ　Ｉ　ＩＮＤＶＫＬＮＶＳ ＰＧＳＳＦＡＡＴＧＴＣＡＡＧＡ（ｌｉｃｃＡ（ＥＧＧＴＧＧＴＴＣＣＧＡＧＴ ＴＴＧＴＴｎＧＣＡＡＡＴ＾ＴＧＧへＴＧＡＴＥＣＱＥＰＧＷＦＩ２ＶＣＦＡＮ ＭＤＤＧＧＡＡＣＧＧＴＴＧＡＴＡＴＴ［１ｉＣＧＣＴＣＧＣＧＡＧＧＡＴＴＣ ＧＧＡＧＧＴＴＣＧＴＡＧＧＴＧＴＴＧＡ　１４００ＫＮＮＬＲＬＳＦＳＫＲＭ ＹＤＥＳＶ ＦＩＧ、８Ｃ ＦＩＧ、１０ ＦＩＧ、１３Ａ ＦＩＧ、１３Ｂ Ｔ５＾＾ＧＧＡＡＴ　ＣＭＡ　ＴＣＡＴＴＣＡＡＧＧＣＣＡＴ　Ｔ　ＧＣＣＭＣ Ｔ　Ｔ　Ｔ　ＣＡＡＧＡ　ＴＴＡＴＣＡＴＧＥＧＩＫＳＦＫＡＩＡＮＦＯＤＹＮ ＴＴＴＧＡＴＣＣ＾［ＪＡＡＡＧＡＧＴＴ（ｌＴＴＡＴＧＧＣＴＧＧＴＧＧＴＩ ＪＣＣＡＣＴＧ［１へＧＣＴＡＡＴＧへＦＤＰＥＲＶＶＭＡＧＧＡＴＧＡＮＥ ＧＡＣＡＡＴＴＡＴＡＴＴＴＴＧＴＴＴ［１ＧＣＴＧ＾ＴＣＣＴＧＧＣＧＡＴＧ Ｃ＾丁ＴＴＴＴＡＧＴＡＣＣＴＴＴ　Ｉ　ＩｒＣＬＡＤＰＧＤＡＦＬＶＰＮＰＳ ＮＰＬＧＴＴＬＤＫＤＴＬＫ ＦＩＧ、１３Ｃ ＦＩＧ、１３Ｄ ＦＩＧ、１３Ｅ ＦＩＧ、１４Ａ ＦＩＧ、１４Ｂ 時間 ＦＩＧ、　１６ ３５ＳプロモータがアンチセンストマトＡＣＣシンターゼを活性化する一一仁ト ーＶ１．１−４空気 −１）−Ｖｌｌ−４プロピレン ーベ）−Ａ１．２−２４空気 ＋　Ａｌ１．２−２４プロピレン ＦＩＧ、１９ 受粉後のトマト果実の経過日数 −べ上−Ｖｌ、１−６空気 −ＩＰ−Ｖｌ、１−６プロピレン ーベ）−Ａ１１．２−７空気 −ｅ−Ａ１１．２−７　フｏヒレン ＦＩＧ、２０ 国際調査報告 ｌｍｗ＋ｔ１１．Ａ−ｍ−，ＰＣＩ’／　ｌｊｓ　９１　／　０６４５３１Ａｌ ＃１１ｍＭｌ１　ａｅ、＃ｈｅｓ　ｌｌｅ、　ＰＣＴ　／　ＵＳ９１　／　０６ ４５３１ｍ・ＣＭＩｗａ１１１１＾剰−（ａｂ＋−軸・ＰＣＴ／ＵＳ９１１０６ ４；１ＰＣＴ／ＵＳ９１１０６４５３ Ａｆｔ：ｌｃｈｍｅｒＨｔＩ）ＰＣＴ／ＩＳＡ／２１０Ｓｅａｒｃｈ＋ｌ！ｒｔ ｎ！ ＪＣＣ５ｙｎｔｈａｓｅ−ｅ＊ＬＩＩＶＪｌｅｎ１５ＩＯ１ｌｎＪＩＯ ｌｕｃｃｈｔｎｔ ｌＶｃＯｐｅｒｒｌｃｕｍ （ｕ（ＬＩｒｌ’ｌｌ＋＋１ ａｎｔｉｂｏｄ？ １＋ｂｒａｒン Ｓ口ｒ：ｅｎ’ ＋ｎｄＬＩＣ’ ｌａｍｈｄａｇｔｌ　１ 号＋１ｉ ａｌｔ＋ｎ＋ｔｖ　ｐｕｒｔｒン ；ｕｂ覧「３Ｃ【ン ｕｎｉｎｄｕｃ′／ 汽ゴ／ＵＳｔ＋１０６４１０ ６４Ｓ３Ａｔｔａｃｈ 〜 Ｇｒｏｕｐ　１．　ｃｌａｉｍｓ　ｌ　−９，１４，２０，ａｎｄ　３７−３８ ．　ｄｒａｖｎ　ｔｏ　ｐｕｒｉｆｉｅｄ　ＤＮＡｅｎｃｏｄｉｎｇ　ＡＣＣ５ ｙｎｔｈａｓｅ、　ｅｘｐｒｅｓｓｒｏｎ　ｖｅｃｔｏｒｓ、　ｐｒｏｂｅｓ、 　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｈ盾唐煤@ｃｅｌｌｓ ｃｈｅｒｅ　ｔｈｅ　ｈｏｓｔ　ｃｅｌｌ　ｉｓ　ＩＩｐｌａｎｔ、　ｍｅｔｈ ｏｄ　ｏｒ　ｕｓｉｎｇ　ｐｌａｎｔ　ｈｏｓｔ　ｃｅｌｌ刀@Ｉｏ　ｐｒｅｐ ａｒｅ　ＡＣＣ ＝ｖｎ＋ｈａｓｅ、　ａｎｄ　ｍｅｔｈｏｄ　ｒｙ（ｕｓｅ　ｔｏ　ｐｒｏｄｕ ｃｅ　ｅｔｈｙｌｅｎｅ　ｕｓｉｎｇ　ｐｌａｎｔ　ｈｏｓ煤@ｃｅｌｌｓ Ｇｒｏｕｐ　Ｉｌ、　ｃｌａｉｍｓ　ｌ　−９，１４，２０，ａｎｄ　３７−３ ８．ｄｒａｖｎ　ｔｏ　ｐｕｒｉｆｉｅｄ　ＤＮＡｅｎｃｏｄｌｎｇ　ＡＣＣ５ ｙｎｔｈｉｓｅ、　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｖｅｃｔｏｒｓ、ｐｒｏｂｅｓ、　 ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｈｏ唐煤@ｃｅｌｌｓ ｖｈｅｒｅ　ｔｈｅ　ｈｏｓｔ　ｃｅｌｌ　ｉｓ　＊　ｂａｃｔｅｒｉａ、　ｍ ｅｔｈｏｄ　ｏｒ　ｕｓｉｎｇ　ｂａｃｔｅｒｉａｌ　ｈｏ唐煤@ｃｅｌｌｓ　 ｔ。

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ｐｒｏｄｕｃｅ　ｆｒｕｉｔｓ、　ｖｅｇｅｔａｂｌｅｓ　ｏｒ　ｎｕｔｓＰｃ Ｔ／ＬＦｉ９＋１０６４５．ｔ フロントページの続き （５１）Ｉｎｔ、Ｃ１，’　識別記号　庁内整理番号ＣＩ　２　Ｎ　１／２１　 ７２３６−４Ｂ９／８８　９１６１−４Ｂ Ｃ１２Ｐ　１３１００　８９３１−４ＢＧＯＩＮ　３３１５３　Ｄ　８３１０− ２ＪＩ

Claims (40)

【特許請求の範囲】
1. １．高次植物のＡＣＣシンターゼをコード化するＤＮＡ配列を含む単離されたＤ ＮＡ配列。
2. ２．請求項１に記載のＤＮＡにおいて、コード化されたＡＣＣシンターゼは、植 物であるカボチャ果（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａｐｅｐｏ）またはトマトの果実（Ｌｙ ｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎｅｓｃｕＩｅｎｔｕｍ）であることを特徴とする分離ＤＮ Ａ配列。
3. ３．請求項１に記載のＤＮＡ配列において、図１に示すヌクレオチド配列を含む ことを特徴とする単離されたＤＮＡ配列。
4. ４．請求項１に記載のＤＮＡ配列において、図６、７、８または１３に示すヌク レオチド配列のうちの一を含むことを特徴とする単離されたＤＮＡ配列。
5. ５．請求項１に記載のＤＮＡ配列を含む発現ベクターにおいて、該ベクターは、 適した条件下において、高次植物（ｈｉｇｈｅｒｐｌａｎｔ）のＡＣＣシンター ゼを発現することが可能であることを特徴とする発現ベクター。
6. ６．請求項５に記載の発現ベクターにおいて、発現されたＡＣＣシンターゼは、 植物であるカボチャ果（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａｐｅｐｏ）またはトマトの果実（Ｌ ｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）であることを特徴とする発現ベ クター。
7. ７．請求項５に記載の発現ベクターにおいて、ＤＮＡ配列は、（ａ）請求項３に 記載の配列；あるいは（ｂ）標準的なハイブリダイゼーシヨン条件下で、請求項 ４に記載の配列にハイブリダイゼーシヨンすることが可能である配列；（ｃ）請 求項４に記載の配列；あるいは（ｄ）（ａ）または（ｃ）の配列の自然発生ａｌ ｌｅｉｃｖａｒｉａｎｔを暗号化する配列であることを特徴とする発現ベクター 。
8. ８．請求項５〜７のいずれかに記載の発現システムによって形質転換されたホス ト細胞。
9. ９．請求項８に記載の細胞において、該細胞はバクテリア、イースト、藻類また は植物細胞であることを特徴とするホスト細胞。
10. １０．請求項５〜７に記載の発現ベクターを含むことを特徴とする植物性の物質 。
11. １１．請求項１０に記載の物質において、該物質は、植物性伝播物質であること を特徴とする植物性物質。
12. １２．請求項１０に記載の物質において、該物質はトランスジェニック植物であ ることを特徴とする植物性物質。
13. １３．請求項９の植物細胞から再生されたトランスジェニック植物。
14. １４．ＤＮＡの発現及びＡＣＣシンターゼの生成を可能とする条件下で請求項８ に記載の細胞を培養するステップと、培養からＡＣＣシンターゼを再生するステ ップと、を含むことを特徴とするＡＣＣシンターゼの調製方法。
15. １５．（ａ）その生成のために誘起された細胞または組織から部分純化誘起可能 なプロテインを調製するステップと； （ｂ）前記部分純化プロテインに対する抗体の第１組成物を謂製するステップと ； （ｃ）前記抗体の第１組成物から、前記抗体の第１組成物を前記誘起されなかっ た細胞または組織と反応させることによって、前記部分的に純化された調製物内 を汚染する免疫反応性である抗体を除去し、前記誘起可能プロテインと免疫反応 性がある抗体の第２組成物を得るステップと；（ｄ）ｃＤＮＡ発現ライブラリー をスクリーニングして抗体の前記第２組成物と免疫反応させるステップであって 、前記発現ライブラリーは、前記プロテインの生成のために誘起された細胞また は組織から調製されるステップと；（ｅ）前記ライブラリーからの免疫反応性発 現コロニーを再生するステップと；を含むことを特徴とする、誘起プロテインを コード化するＤＮＡ配列を得る方法。
16. １６．組換えＡＣＣシンターゼ酵素。
17. １７．実質的に純粋な形態であり、高次植物（ｈｉｇｈｅｒｐｌａｎｔ）から派 生した他のプロテインを含まないＡＣＣシンターゼ酵素。
18. １８．請求項１６のＡＣＣシンターゼと特異的に免疫反応する抗体組成物。
19. １９．請求項１７のＡＣＣシンターゼと特異的に免疫反応する抗体組成物。
20. ２０．請求項１のＤＮＡの少なくとも一部分と相補的なヌクレオチド配列を含む 、ＡＣＣシンターゼをコードするｍＲＮＡの検出に有用なプローブ。
21. ２１．ＡＣＣシンターゼをコードするｍＲＮＡ配列と相補的な配列のアンチセン スヌクレオチド配列。
22. ２２．請求項２１に記載のアンチセンス配列を含み前記配列を発現可能な発現シ ステム。
23. ２３．請求項２２に記載の発現システムにおいて、更に、アンチセンスヌクレオ チド配列へ実際に結合された核酸性のＲＮＡ内に転写されるＤＮＡを含む発現シ ステム。
24. ２４．ＡＣＣシンターゼをコードする遺伝子配列に相補的なアンチセンスヌクレ オチド配列。
25. ２５．請求項２４に記載のアンチセンス配列を含み該配列を発現可能な発現シス テム。
26. ２６．ＡＣＣシンクーゼモノマーと二量体を形成することが可能な突然変異した ＡＣＣシンターゼをコードするヌクレオチド配列。
27. ２７．請求項２６に記載されたヌクレオチド配列を含み、該配列を発現可能な発 現システム。
28. ２８．請求項２２、２３または２５に記載の発現システムをその物質内に含み、 十分なＡＣＣシンターゼの欠乏をもたらす特性を示すことのできるトランスジェ ニック植物。
29. ２９．請求項２８に記載のトランスジェニック植物において、所望の特性は、成 熟に抵抗する果実の生成であることを特徴とするトランスジェニック植物。
30. ３０．請求項２８に記載のトランスジェニック食物において、所望の特性は、老 化に対する耐性であることを特徴とするトランスジェニック植物。
31. ３１．請求項２８に記載のトランスジェニック植物において、所望の特性は、通 常の時間枠内で発達しないことであることを特徴とするトランスジェニック植物 。
32. ３２．請求項２６に記載の植物において、発現システムは、更に、アンチセンス ヌクレオチド配列へ実際に待合された核酸性のＲＮＡ内に転写されるＤＮＡを含 むことを特徴とする植物。
33. ３３．請求項２２、２３または２５に記載の発現システムで植物物質をトランス フェクトしまたは形質転換するステップと、前記形質転換またはトランスフェク トされた物質から植物を培養するステップと、を含み、十分なＡＣＣシンターゼ 酵素の欠乏を生じさせる特性を示す植物の生成方法。
34. ３４．請求項３３に記載の方法において、形質転換またはトランスフェクトされ た植物の所望の特性は、成熟果実の生成であることを特徴とする植物の生成方法 。
35. ３５．請求項３３に記載の方法において、形質転換またはトランスフェクトされ た植物の記載された特性は、老化に対する耐性であることを特徴とする植物の生 成方法。
36. ３６．請求項３３に記載の方法において、形質転換またはトランスフエクトされ た植物の所望特性は、通常の時間枠内において発達しないことであることを特徴 とする植物の生成方法。
37. ３７．ＤＮＡ暗号付け配列の発現によって生成されたＡＣＣシンターゼが１−ア ミノシクロプロパン−１−カルボキシル酸（ＡＣＣ）の生成を行う条件下で請求 項９に記載の細胞を培養するステップと、前記ＡＣＣをエチレンへ変換するステ ップと、を含むことを特徴とするエチレンの生成方法。
38. ３８．請求項３７に記載の方法において、ＡＣＣのエチレンヘの変換は、ハイポ クロライト（ｈｙｐｏｃｈｌｏｒｉｔｅ）を用いた処理を含むことを特徴とする エチレンの生成方法。
39. ３９．請求項３８に記載の方法に従って生成されたエチレンを、果実を成熟させ るために使用する方法。
40. ４０．請求項の方法に従って生成されたエチレンを、エタノールを生成させるた めに使用する方法。