JP3149951B2 - イネ種子中のグルテリン量の低減方法 - Google Patents

イネ種子中のグルテリン量の低減方法

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    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
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    • C12N15/8251—Amino acid content, e.g. synthetic storage proteins, altering amino acid biosynthesis

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、イネ種子中におけるグルテリンの量を低減
させ、低グルテリン種子を得る方法に関する。
従来技術 高等植物の種子には乾燥重量当り、豆類では20〜30
％、穀類では10％程度のタンパク質が含まれている。こ
れらのうち、７〜８割を貯蔵タンパク質が占めている。
特にイネ種子中に含まれている貯蔵タンパク質は希酸や
希アルカリにのみ可溶なグルテリンと呼ばれる成分が約
80％を占め、主要な貯蔵タンパク質となっている。残り
は、有機溶媒に可溶なプロラミン（10〜15％）と、塩で
可溶なグロブリン（５〜10％）とで構成されている。
種子貯蔵タンパク質は食糧として重要なタンパク質資
源であり、栄養学的、タンパク質化学的見地から多くの
研究がなされてきた。このため、穀物ではトウモロコ
シ、コムギ、オオムギ等の貯蔵タンパク質遺伝子がクロ
ーニングされ、その遺伝子構造からアミノ酸配列が推定
されたり、さらに、遺伝子制御領域が解析されたりして
いる。
イネ種子貯蔵タンパク質のグルテリンのcDNAは既にク
ローニングされ、その塩基配列の解析からこのタンパク
質の完全一次構造が決定されている。さらに、このcDNA
をプローブとして当該タンパク質の遺伝子も単離されて
いる（特開昭63−91085号）。
この核由来遺伝子断片の５′上流域（グルテリンプロ
モーター領域）の機能を明らかにするために、該プロモ
ーターとレポーター遺伝子としてクロラムフェニコール
アセチルトランスフェラーゼ（CAT）遺伝子との融合遺
伝子がアグロバクテリウムを介してタバコに導入され
た。そして、これら形質転換タバコを用いてCATアッセ
イを行った結果、イネグルテリンプロモーターは種子胚
乳特異的、かつ、登熟期特異的に発現することが確認さ
れた（オキタら、Plant Molecular Biologogy,14,41−5
0（1989））。
ところで、加工好適米はタンパク質含量の低いことが
要求されている。醸造用の酒米においては胚乳周辺部に
多く存在しているタンパク質を減少させるために精白度
を高めることによってその目的を果たしている。米デン
プンの製造においては、純度を高めるためにアルカリ、
界面活性剤、さらに、超音波の利用によってタンパク質
を除去している。
また、米のタンパク質含量はその食味にも影響を与え
ており、いわゆるおいしい米はタンパク質含量が低い。
このような低タンパク質米に対しては、従来の交雑育種
法、あるいは、突然変異の誘発を利用した方法が行われ
てきた。
近年、植物組織培養技術の向上と遺伝子導入技術の開
発により形質転換植物の作出が報告されている。イネ科
植物においては、培養細胞より単離したプロトプラスト
をポリエチレングリコールで処理することにより外来遺
伝子を導入した例（特開昭63−287485号）や、電気パル
スを印加することにより外来遺伝子を導入した例が報告
されている（特開平１−181791号）。
また、形質転換イネで外来遺伝子を発現させるプロモ
ーターはその全ての例でカリフラワーモザイクウイルス
（CaMV）の35Sプロモーターが使われている。
タンパク質の合成の情報となるmRNAのようなある機能
を持ったRNAに対して相補的塩基配列を持つRNAがそのRN
Aの機能を抑制する働きがあることが知られている。こ
れはアンチセンスRNAと総称されるものであり、遺伝子
組換え技術の導入によって、アンチセンスRNAを人工的
に作り出す研究も進められている。
例えば、花色色素合成に関与しているチャルコン合成
酵素のアンチセンスRNAを産生する組換えペチュニアを
作製し、野生型とは花色の異なるペチュニアが得られて
いる（欧州特許公開第341885号）。また、トマト果実の
軟質化に重要な役割を果たしているポリガラクツロナー
ゼ遺伝子が導入されたアンチセンスRNAによって発現が
抑制され、野生型よりも保存の効くトマトが作り出され
ている（欧州特許公開第891115号）。
しかし、これまでアンチセンスRNAの技術を種子貯蔵
タンパク質の低減に応用した例はない。
米中の胚芽や糠にはタンパク質、脂質、灰分、ビタミ
ンが多く、これらが麹菌や酵母の生育を急進させて酒質
の調和を崩し、また、醸造酒の着色、雑味成分となっ
て、酒質を劣化させている。従って、精米によってこれ
ら有害成分を取り去っている。そして、とう精するにつ
れ、糠にその含量の多い脂質、灰分及びグロブリンは大
きく減少するが、逆に、米の貯蔵タンパク質であるグル
テリンやプロラミンは胚乳内部にも存在するため、その
組成比が増加してしまう。
ところで、酒米の育種は現在、早生、短稈化を目標に
行われているが、一般に、早生、短稈品種はタンパク質
含量が高く、早生、短稈でかつ、画期的な低蛋白性を有
する品種の育成は従来の技術では極めて困難である。さ
らに、突然変異の誘発を利用した方法は多大数の植物体
を処理する必要があり、その中から低タンパク個体を選
抜するには非常に多くの労力と時間を要する。
また、種子貯蔵タンパク質の品質の改善を目指す場
合、現存する貯蔵タンパク質を特異的に効率良く低減さ
せる必要がある。
従来、形質転換植物において、外来遺伝子を発現させ
るためには、通常、CaMVの35Sプロモーターが使われて
いる。
しかし、形質転換イネにおいては、CaMV35Sプロモー
ターの転写活性は弱く、特に、グルテリン遺伝子が発現
している胚乳中では、その転写活性はさらに弱い（シマ
モトら、Mol.Gen.Genet.220:389−392（1990））。この
ため、グルテリンアンチセンスRNAを作らせるプロモー
ターとして、CaMV35Sプロモーターを用いては効率良い
グルテリンタンパク質の低減は期待できない。
発明の開示 本発明の目的は、従来の交雑育種法や突然変異誘発法
よりも容易、確実にイネ種子中のグルテリンの量を低減
させることができる方法を提供することである。
本願発明者らは、鋭意研究の結果、イネにグルテリン
に対するアンチセンスRNAの鋳型となる遺伝子及び該遺
伝子の上流に位置し、該遺伝子の発現を制御する、グル
テリンプロモーターを導入し、該遺伝子を種子中で転写
させることにより種子中のグルテリンの量を低減させる
ことに成功し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は、グルテリンのmRNAに対して相補
的な塩基配列を有するmRNAの鋳型となる遺伝子及び該遺
伝子の上流に位置し、該遺伝子の発現を制御する、グル
テリンプロモーターをイネに導入し、該遺伝子を種子中
において転写させることにより、前記グルテリンのmRNA
の翻訳を阻害して種子中における前記グルテリンを低減
させる方法を提供する。また、本発明は、上記本発明の
方法によりグルテリンが低減された種子を提供する。
本発明により、遺伝子工学的手法により、種子中のグ
ルテリンの量を低減する方法及びグルテリン量が低減さ
れた種子が提供された。本発明の方法は、従来の交雑育
種や突然変異誘発を利用する方法に比べて容易に、か
つ、確実に行うことができる。
図面の簡単な説明 図１はグルテリンのロモーターの塩基配列を示す図、 図２は本発明の実施例においてクローニングされた、
グルテリンプロモーター及びグルテリン遺伝子を含むDN
A断片の塩基配列を示す図、 図３は本発明の実施例において、形質転換に用いる組
換えプラスミドベクターを作製するために中間体として
作製した組換えプラスミドベクターの遺伝子地図、 図４及び図５は本発明の実施例において、形質転換に
用いた組換えプラスミドベクターの遺伝子地図、 図６及び図８は対照の米粒20粒のグルテリン量（対グ
ロブリン比）を示すヒストグラム、 図７及び図９は本発明の方法を適用した米粒20粒のグ
ルテリン量（対グロブリン比）を示すヒストグラムであ
る。
発明を実施するための最良の形態 本発明の方法では、グルテリンのmRNAに対するアンチ
センスRNAを種子内において生産させ、種子中のグルテ
リンのmRNAが翻訳されることを阻止する。
本発明の方法が適用される植物はイネである。グルテ
リン遺伝子は既にクローニングされており、その塩基配
列も公知であるので、イネのゲノミックDNAライブラリ
ーから該遺伝子をクローニングする操作は、グルテリン
のcDNAをプローブとして用いることにより常法に基づき
行うことができる。
グルテリンcDNAを、イネ植物内で複製可能なベクター
プラスミドに組み込み、これでイネ植物を形質転換する
ことにより、イネ植物内でグルテリンmRNAに対するアン
チセンスRNAを生産することができる。イネ植物内で複
製可能なベクタープラスミドはこの分野においてよく知
られており、例えば後述の実施例では市販のpUC19（メ
シングら、Gene,33:103−119（1985）、ファルマシア社
より市販）を用いている。後述の実施例で示すように、
アンチセンスRNAの生産量を高めるために、１つのベク
タープラスミド中に、２つ又はそれ以上のグルテリンcD
NAをアンチセンス方向に挿入することもできる。また、
植物細胞の形質転換方法自体もこの分野において周知で
あり、例えば、プロトプラストに電圧を印加して外来DN
Aを取り込ませるエレクトロポレーション法、又はプロ
トプラストにポリエチレングリコールを作用させる方法
により行うことができる。
従来技術の項で述べたが、従来、植物の形質転換にお
いては、植物内で発現させる外来性遺伝子のプロモータ
ーとして、CaMVの35Sプロモーターが用いられてきた。
しかしながら、CaMVの35Sプロモーターは、種子内での
活性が低く、従って、種子内のグルテリンの低減には不
向きである。本願発明者らは、グルテリンのプロモータ
ーが種子内において高い活性を有することを見出し、該
プロモーターを用いて種子中のグルテリンの低減に成功
した。該プロモーターの塩基配列は図１に示す通りであ
り、グルテリンの構造遺伝子の上流に存在する。
植物細胞の形質転換を行う際、アンチセンス方向に挿
入されたグルテリンcDNA及びグルテリンプロモーターを
有する組換えベクターの他に、マーカーとして例えば薬
剤耐性（後述の実施例ではハイグロマイシン耐性を利
用）を発現する遺伝子を別途導入しておくと便利であ
る。このようなマーカー遺伝子は形質転換細胞の選択に
のみ必要であり、選択が終われば不要となるので、グル
テリンcDNAを有する前記組換えベクターとは別の組換え
ベクターに挿入して形質転換することが好ましい。この
ようなマーカーとなるベクターのプロモーターはグルテ
リンプロモーターである必要はなく、従来から広く用い
られているCaMVの35Sプロモーターでよい。
得られた形質転換プロトプラストを再生し、これを常
法により培養して植物体を再生させ、そのDNAをサザン
ハイブリダイゼーション法で調べてグルテリンのアンチ
センス遺伝子を有しているものを選択することにより、
種子中のグルテリン量が低減された種子及びこのような
種子を実らせるイネを得ることができる。
以下、本発明を実施例に基づきさらに具体的に説明す
る。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるもので
はない。
［実施例］ 以下の実施例において、特に断りがない限り、ティ・
マニアティス（Molecular cloning,Cold Spring Harbor
（1982））記載の方法により行った。
（１）イネグルテリンの核DNAのクローニング及びグル
テリンのプロモーター領域を含む断片の単離（図３） イネ栽培品種ササニシキの緑葉から常法に従い核DNA
を抽出した（植物遺伝子工学マニュアル：講談社）。そ
の核DNAをBam HI処理した断片群にEMBL3ファージ（スト
ラタジーン社製）のBam HI部位に組み込み、さらに、イ
ンビトロパッケージング法により遺伝子ライブラリーを
作製した。
この遺伝子ライブラリーの中からグルテリンのcDNAを
プローブにしてグルテリンに対応する遺伝子を含む組換
体ファージを選抜した。この組換体ファージよりグルテ
リンに対応する遺伝子を含む断片を単離精製した後、そ
の遺伝子の塩基配列をサンガーらの方法（Proc.Natl.Ac
ad.Sci.USA,74:5463（1979））に従い決定した。決定し
た塩基配列を図２に示す。
塩基配列の解析結果より、グルテリンのプロモーター
領域を含む断片を制限酵素Bam HI及びSpe Iで切り出
し、３′末端をエクソヌクレアーゼIII（タカラ社製）
で削っていき、グルテリンのプロモーター領域のみを含
む断片にした。その３′末端にBam HIリンカーを付加し
た後、プラスミドpUC19（上述）のBam HI部位へサブク
ローニングし、プラスミドpUCGPを得た（図３）。
（２）グルテリンアンチセンスRNAを転写し得るベクタ
ーの構築（図４、図５） 上記プラスミドpUCGPにおいて、グルテリンプロモー
ター領域を含む配列の下流のSma I及びSac I部位にグル
テリンの完全長cDNAをアンチセンスの方向に挿入した。
さらに、アンチセンスグルテリンcDNA配列の下流のSac
I及びEco RI部位に、Nosターミネーター（グッドマン
ら、Journal of Molecular and Applied Genetics:561
−573（1982））を挿入してグルテリンのアンチセンス
遺伝子を保持したプラスミドpANG2を作製した（図
４）。
さらに、グリテリンプロモーター、アンチセンスグル
テリンcDNA及びNosターミネーターを含んだ断片をEco R
I及びHind III処理により切り出し、その断片のEco RI
末端をクレノウ酵素処理により平滑した後、プラスミド
pANG2のHind III及びHinc II部位へ挿入し、環状化させ
た。このようにして、グルテリンアンチセンス遺伝子を
２個直列に配置させたプラスミドpANG3を作製した（図
５）。
（３）イネへの形質転換 イネ栽培品種、日本晴及びアキヒカリを温室で生育さ
せた植物体より葯を採取し、無水エタノール及び次亜塩
素酸ナトリウム水溶液で滅菌処理を行った後、AA培地
（ミュラーら、Mol.Gen.Genet.161:67−76（1978）,2,4
−D 1ppm、カイネチン0.2ppm、ジベレリン0.1ppm）で振
盪培養を25℃、暗黒、120rpmの条件下で行い培養細胞を
得た。
植え継ぎ４日目の培養細胞を１％セルラーゼRS、１％
マセロザイムＲ−10、0.1％ペクトリアーゼＹ−23、0.5
％ドリセラーゼ、0.4Mマニトール、pH5.8を含む酵素液
で30℃、２時間処理してプロトプラストを調製した。
得られたプロトプラストを0.1％MES、70mM KCl、5mM
MgCl2、0.4M マニトール、pH5.8を含むバッファーに
懸濁した。
この懸濁液にプロモーターとしてCaMV35S、外来遺伝
子としてハイグロマイシンフォスフォトランスフェラー
ゼ遺伝子及びCaMV由来のターミネーターを有するプラス
ミド50μg/ml、並びにグルテリンのアンチセンス遺伝子
を有するプラスミドpANG2又はpANG3 50μg/mlを添加
し、氷上で５分間冷却した後、滅菌したプラスチックセ
ルに移し、直流パルスを250μＦのコンデンサー、625V/
cmの電圧、400オームの抵抗を用いて印加した。
パルス印加後、氷上で20分間冷却した後、R2プロトプ
ラスト液体培地（オオヒラら、Plant Cell Physiol.14:
1113−1121（1973））で培養を25℃、照明下で行った。
R2液体培地で１〜２カ月培養後、20μg/mlハイグロマ
イシンＢを含むN6（チュら、Scientia Scinica 18:659
−663（1975））を基本とした増殖固体培地に置床し、
ハイグロマイシンに耐性を示すコロニーを選抜した。
１カ月後、このハイグロマイシン耐性コロニーをN6を
基本とした再分化固体培地に置床し、明所で１〜２カ月
間培養を続けると、芽及び根が現われ、やがて幼植物体
にまで生育した。
さらに、幼植物体をポットへ移して生育させたとこ
ろ、成熟した完全なイネ植物体が、日本晴23個体、アキ
ヒカリ10個体得られた。
（４）形質転換の確認 上記（３）で得られた植物帯の緑葉より常法に基づい
てDNAを抽出し、サザンハイブリダイゼイション法を行
い導入した遺伝子の存在を確認した。
その結果、日本晴23個体中、ハイグロマイシンフォス
フォトランスフェラーゼ遺伝子を保持している植物体は
20個体あり、そのうち、グルテリンアンチセンス遺伝子
をも保持している植物体は５個体あった。
また、アキヒカリ10個体中、ハイグロマイシンフォス
フォトランスフェラーゼ遺伝子を保持している植物体は
４個体で、そのうち、グルテリンアンチセンス遺伝子を
も保持している植物体は２個体あった。
（５）形質転換イネ植物体の種子の分析 上記（４）でグルテリンアンチセンス遺伝子の保持が
確認された植物体を稔実するまで生育させた後、完熟種
子を採取した。
その種子を１粒ずつ乳鉢で粉砕した後、４％SDS、6M
尿素を含むバッファーに懸濁した。その懸濁液を遠心分
離した上清を16％ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分
離し、さらに、ゲルをクマシーブルーで染色した。染色
後のゲルはデンシトメーターにかけ、クマシーブルーの
染色度合いを数値化し、１粒ごとにおけるグルテリンの
含有量を算出した。
対照として、形質転換していない日本晴及びアキヒカ
リについてのグルテリン含有量も同様にして算出した。
結果を図６ないし図９に示す。図６は日本晴の対照に
ついての結果、図７は本発明の方法により形質転換され
た日本晴についての結果、図８はアキヒカリの対照につ
いての結果、図９は本発明の方法により形質転換された
アキヒカリについての結果を示し、これらはランダムに
選んだ20粒の分析結果をヒストグラムで示したものであ
る。なお、グルテリンの含有量は１粒中における26キロ
ダルトングロブリン含有量を１としたときのグルテリン
の含有量で示した。
日本晴の対照のグルテリン含有量の分布において95％
信頼区間（6.5〜8.42）よりも低い値を示す米粒が日本
晴形質転換体には20粒中10粒あった。これらは環境変異
では起こり得ないグルテリン含有量の低減を示すもので
あることから、グルテリンアンチセンス遺伝子によるグ
ルテリン含有量の低減効果が明らかである。
グルテリンアンチセンス遺伝子を導入した当代の植物
体より得られた種子は、形質転換体のヒストグラムでも
明らかなようにグルテリン含有量にばらつきが生じる。
これはメンデル遺伝によって種子がF2分離を起こしたた
めである。
そこで、形質転換日本晴において、グルテリン量の低
減の顕著な米粒と変化の見られない米粒、それぞれ５粒
ずつを選び精度を高めた条件でグルテリン量及びグロブ
リン量の分析を行った。結果を下記表１及び表２に示
す。
また、アキヒカリ対照のグルテリン含有量の分布にお
いても95％信頼区間（9.14〜13.02）よりも低い値を示
す米粒がアキヒカリ形質転換体には24粒中10粒あった。
同様に、アキヒカリにおいてもグルテリンアンチセンス
遺伝子によるグルテリン含有量の低減効果が明らかであ
る。
さらに、形質転換アキヒカリにおいて、日本晴の場合
と同様、グルテリンの低減の顕著な米粒と変化の見られ
ない米粒、それぞれ５粒ずつを選び精度を高めた条件で
分析を行った。結果を表３及び表４に示す。
フロントページの続き (56)参考文献 Ｃｏｌｉｎ Ｒ．Ｂｉｒｄ ｅｔ ａ ｌ．，Ｂｉｏｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇ ｙ，Ｖｏｌ．９，Ｐ．635−639（1991) Ｃ．Ｒａｍａｃｈ ａｎｄ ｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｂｏｔａｎ ｙ，Ｖｏｌ．41，Ｐ．393−399（1990)

Claims (3)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】グルテリンのmRNAに対して相補的な塩基配
    列を有するmRNAの鋳型となる遺伝子及び該遺伝子の上流
    に位置し、該遺伝子の発現を制御する、グルテリンプロ
    モーターをイネに導入し、該遺伝子を種子中において転
    写させることにより、前記グルテリンのmRNAの翻訳を阻
    害して種子中における前記グルテリンを低減させる方
    法。
  2. 【請求項２】pANG2又はpANG3でイネを形質転換すること
    により行われる請求の範囲第１項記載の方法。
  3. 【請求項３】請求の範囲第１項又は第２項に記載された
    方法によりグルテリンが低減された種子。
JP50657392A 1992-03-24 1992-03-24 イネ種子中のグルテリン量の低減方法 Expired - Fee Related JP3149951B2 (ja)

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