JPH08322412A - アンチセンス遺伝子を導入した植物及びその作出方法 - Google Patents
アンチセンス遺伝子を導入した植物及びその作出方法Info
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- JPH08322412A JPH08322412A JP7151118A JP15111895A JPH08322412A JP H08322412 A JPH08322412 A JP H08322412A JP 7151118 A JP7151118 A JP 7151118A JP 15111895 A JP15111895 A JP 15111895A JP H08322412 A JPH08322412 A JP H08322412A
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- plant
- gene
- self
- slg
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- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【構成】 アンチセンスＳ糖タンパク質遺伝子を有する
植物、及び、該植物の作出方法、並びに、アンチセンス
Ｓ糖タンパク質遺伝子を利用した植物の形質転換法。 【効果】 自家不和合性を打破する方法を提供する。
植物、及び、該植物の作出方法、並びに、アンチセンス
Ｓ糖タンパク質遺伝子を利用した植物の形質転換法。 【効果】 自家不和合性を打破する方法を提供する。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、アンチセンスＳ糖タン
パク質遺伝子を有する植物、及び該植物の作出方法、並
びに、アンチセンスＳ糖タンパク質遺伝子を利用した植
物の形質転換法に関する。
パク質遺伝子を有する植物、及び該植物の作出方法、並
びに、アンチセンスＳ糖タンパク質遺伝子を利用した植
物の形質転換法に関する。
【０００２】
【従来の技術】アブラナ科植物の自家不和合性を制御し
ている遺伝子については、遺伝学、生理学、分子生物学
の見地から多くの研究がされてきた。半数以上の被子植
物が遺伝的多様性を広げるため、自家不和合性と呼ばれ
る機構を発達させている。自家不和合性とは、１つの花
に雌しべと雄しべを有する両全花において、自家受粉し
た花粉の発芽及び花粉管の伸長が阻害されて自家受精で
きない機構である。
ている遺伝子については、遺伝学、生理学、分子生物学
の見地から多くの研究がされてきた。半数以上の被子植
物が遺伝的多様性を広げるため、自家不和合性と呼ばれ
る機構を発達させている。自家不和合性とは、１つの花
に雌しべと雄しべを有する両全花において、自家受粉し
た花粉の発芽及び花粉管の伸長が阻害されて自家受精で
きない機構である。
【０００３】アブラナ科植物の自家不和合性は胞子体型
自家不和合性を示し、１遺伝子座のＳ複対立遺伝子系
（Ｓ1,Ｓ2,・・・・,Ｓi)により制御されている（Batem
an, A.j. Heredity 9: 52-68 (1955)）。雌しべと花粉
の遺伝子型が同じ場合不和合となる。このＳ遺伝子と対
応した柱頭側のＳ遺伝子特異物質の存在が、免疫学的手
法を用いて最初に確かめられた（Nasralla, M. E. and
D. H. Wallace. Heredity 22: 519-527 (1967), Hinat
a, K. et al Genetics 100: 649-697(1982)）。柱頭の
タンパク質の等電点電気泳動分析から、このＳ遺伝子特
異的タンパク質は、Ｓ糖タンパク質（S-locus specific
glycoprotein;以下「ＳＬＧ」という）と呼ばれ（Nish
io, T. and K. Hinata. Heredity 38: 391-396 (197
7)）、Ｓ遺伝子に対応して異なった等電点を有する糖タ
ンパク質で、Ｓヘテロ個体における発現量はＳホモ個体
の約半分で（Hinata, K and T. Nishio. Heredity 41:
93-100 (1978)）、このＳＬＧは例外なくＳ遺伝子と行
動をともにする（Nou et al. Jap. J.Genet 66: 227-23
9 (1991)）。ＳＬＧは開花数日前に発現が始まり、その
発現時期は自家不和合性の発現時期と一致していた。こ
の状況証拠から、ＳＬＧがＳ遺伝子の産物であり、自家
不和合性の認識反応に関連した第１候補である。
自家不和合性を示し、１遺伝子座のＳ複対立遺伝子系
（Ｓ1,Ｓ2,・・・・,Ｓi)により制御されている（Batem
an, A.j. Heredity 9: 52-68 (1955)）。雌しべと花粉
の遺伝子型が同じ場合不和合となる。このＳ遺伝子と対
応した柱頭側のＳ遺伝子特異物質の存在が、免疫学的手
法を用いて最初に確かめられた（Nasralla, M. E. and
D. H. Wallace. Heredity 22: 519-527 (1967), Hinat
a, K. et al Genetics 100: 649-697(1982)）。柱頭の
タンパク質の等電点電気泳動分析から、このＳ遺伝子特
異的タンパク質は、Ｓ糖タンパク質（S-locus specific
glycoprotein;以下「ＳＬＧ」という）と呼ばれ（Nish
io, T. and K. Hinata. Heredity 38: 391-396 (197
7)）、Ｓ遺伝子に対応して異なった等電点を有する糖タ
ンパク質で、Ｓヘテロ個体における発現量はＳホモ個体
の約半分で（Hinata, K and T. Nishio. Heredity 41:
93-100 (1978)）、このＳＬＧは例外なくＳ遺伝子と行
動をともにする（Nou et al. Jap. J.Genet 66: 227-23
9 (1991)）。ＳＬＧは開花数日前に発現が始まり、その
発現時期は自家不和合性の発現時期と一致していた。こ
の状況証拠から、ＳＬＧがＳ遺伝子の産物であり、自家
不和合性の認識反応に関連した第１候補である。
【０００４】Brassica campestrisの3つのＳ遺伝子系統
からＳＬＧが単離され、アミノ酸配列が決定された（Ta
kayama et al. Nature 326: 102-104 (1987), Isogai e
t al. Plant Cell Physiol 28: 1279-1291 (1987)）。
アミノ酸配列を比較すると、非常に類似しており、これ
らが同じ遺伝子座の対立遺伝子であると考えられた。こ
れらの糖タンパク質の糖鎖はＳＬＧ間で非常に類似し、
差異が見られないので、100を越すＳＬＧの特異性は糖
鎖ではなくタンパク質部分にある。
からＳＬＧが単離され、アミノ酸配列が決定された（Ta
kayama et al. Nature 326: 102-104 (1987), Isogai e
t al. Plant Cell Physiol 28: 1279-1291 (1987)）。
アミノ酸配列を比較すると、非常に類似しており、これ
らが同じ遺伝子座の対立遺伝子であると考えられた。こ
れらの糖タンパク質の糖鎖はＳＬＧ間で非常に類似し、
差異が見られないので、100を越すＳＬＧの特異性は糖
鎖ではなくタンパク質部分にある。
【０００５】現在までに自家不和合性系統のB.oleracea
において７つのＳＬＧ遺伝子のｃＤＮＡが（特開昭62-1
43688号）、 B.campestrisにおいて３つのＳＬＧ遺伝子
のｃＤＮＡが（Yamakawa et al. Biosci. Biotech. Bio
chem 58: 921-925 (1994), Watanabe et al. Plant Cel
l Physiol 35 (1994)）クローニングされ、アミノ酸配
列が推定された。更に、ＳＬＧ遺伝子ｃＤＮＡの3'非翻
訳領域をプローブとして、ＳＬＧに対応するゲノミック
クローンがB.oleraceaから３つ単離され（Nasrallah et
al. Proc. Natl. Acad. Sci. 85: 5551-5555 (198
8)）、B.campestrisからも１つが単離されている（Dwye
r et al. Plant Mol Biol 16: 481-486 (1991): 本発明
で使用したプロモーターを含む）。
において７つのＳＬＧ遺伝子のｃＤＮＡが（特開昭62-1
43688号）、 B.campestrisにおいて３つのＳＬＧ遺伝子
のｃＤＮＡが（Yamakawa et al. Biosci. Biotech. Bio
chem 58: 921-925 (1994), Watanabe et al. Plant Cel
l Physiol 35 (1994)）クローニングされ、アミノ酸配
列が推定された。更に、ＳＬＧ遺伝子ｃＤＮＡの3'非翻
訳領域をプローブとして、ＳＬＧに対応するゲノミック
クローンがB.oleraceaから３つ単離され（Nasrallah et
al. Proc. Natl. Acad. Sci. 85: 5551-5555 (198
8)）、B.campestrisからも１つが単離されている（Dwye
r et al. Plant Mol Biol 16: 481-486 (1991): 本発明
で使用したプロモーターを含む）。
【０００６】ＳＬＧと自家不和合性の関係を直接的に示
す証拠として自家和合性の突然変異体scf1が挙げられ
る。この突然変異体はＳＬＧ発現量の減少により自家和
合になったと考えられている（Nasrallah et al. Plant
J. 2: 497-506 (1992)）。近年トウモロコシからセリ
ン／スレオニン型レセプタープロテインキナーゼ遺伝子
がクローニングされ、その細胞外ドメインのアミノ酸配
列とBrassicaのＳＬＧのアミノ酸配列との間に高いホモ
ロジーがあることが示された（Walker,J. C.,and R. Zh
ang. Narure 345:743-746 (1990)）。この報告後B.oler
aceaのＳ6系統からＳ6系統のＳＬＧと89％の相同性のあ
る細胞外ドメイン、疎水性の膜貫通ドメインとプロテイ
ンキナーゼの触媒ドメインを有するプロテインキナーゼ
に対応する遺伝子がクローニングされた。この遺伝子は
Ｓレセプターキナーゼ（S-receptor Kinase;以下「ＳＲ
Ｋ」という）遺伝子と呼ばれ、これはＳ遺伝子座上に存
在した（Stein et al. Proc. Natl. Acad. Sci. 88: 88
16-8820 (1991)）。
す証拠として自家和合性の突然変異体scf1が挙げられ
る。この突然変異体はＳＬＧ発現量の減少により自家和
合になったと考えられている（Nasrallah et al. Plant
J. 2: 497-506 (1992)）。近年トウモロコシからセリ
ン／スレオニン型レセプタープロテインキナーゼ遺伝子
がクローニングされ、その細胞外ドメインのアミノ酸配
列とBrassicaのＳＬＧのアミノ酸配列との間に高いホモ
ロジーがあることが示された（Walker,J. C.,and R. Zh
ang. Narure 345:743-746 (1990)）。この報告後B.oler
aceaのＳ6系統からＳ6系統のＳＬＧと89％の相同性のあ
る細胞外ドメイン、疎水性の膜貫通ドメインとプロテイ
ンキナーゼの触媒ドメインを有するプロテインキナーゼ
に対応する遺伝子がクローニングされた。この遺伝子は
Ｓレセプターキナーゼ（S-receptor Kinase;以下「ＳＲ
Ｋ」という）遺伝子と呼ばれ、これはＳ遺伝子座上に存
在した（Stein et al. Proc. Natl. Acad. Sci. 88: 88
16-8820 (1991)）。
【０００７】ＳＲＫ遺伝子と自家不和合性の関係を直接
的に示す証拠として、自家和合性のB.napusと自家和合
性のB.oleraceaから単離したＳＲＫ遺伝子が挙げられ
る。自家和合性のB.napusから単離されたＳＲＫ遺伝子
はＳドメインの3'末端に１bp欠失が生じていた。この欠
失によりフレームシフトが起き、その結果としてＳＲＫ
遺伝子の翻訳産物が短くなり、自家和合になったと考え
られる（Goring et al.Plant Cell 5: 531-539 (199
3)）。Ｓ遺伝子座上の突然変異を持つ自家和合性のB.ol
eraceaではＳＬＧの発現は自家不和合のものと同程度で
あるが、ＳＲＫの発現は全く見られなかった。この突然
変異体のＳＲＫ遺伝子について詳細に検討してみると、
ＳＲＫ遺伝子の第１、第２エクソンが欠失していた（Na
srallah et al. Plant J. 5: 373-384 (1994)）。いず
れの場合もＳＲＫ遺伝子の機能を失っていた。
的に示す証拠として、自家和合性のB.napusと自家和合
性のB.oleraceaから単離したＳＲＫ遺伝子が挙げられ
る。自家和合性のB.napusから単離されたＳＲＫ遺伝子
はＳドメインの3'末端に１bp欠失が生じていた。この欠
失によりフレームシフトが起き、その結果としてＳＲＫ
遺伝子の翻訳産物が短くなり、自家和合になったと考え
られる（Goring et al.Plant Cell 5: 531-539 (199
3)）。Ｓ遺伝子座上の突然変異を持つ自家和合性のB.ol
eraceaではＳＬＧの発現は自家不和合のものと同程度で
あるが、ＳＲＫの発現は全く見られなかった。この突然
変異体のＳＲＫ遺伝子について詳細に検討してみると、
ＳＲＫ遺伝子の第１、第２エクソンが欠失していた（Na
srallah et al. Plant J. 5: 373-384 (1994)）。いず
れの場合もＳＲＫ遺伝子の機能を失っていた。
【０００８】以上のことから、アブラナ科植物の自家不
和合性反応は、ＳＬＧが花粉側からの認識物質と結合
し、ＳＲＫを介するリン酸化を介したシグナル伝達系に
情報が伝達され、その反応に引き続き花粉管の侵入・不
侵入が起こると考えられている。そこで、ＳＬＧとＳＲ
Ｋの発現を遺伝的抑制することにより、自家不和合性の
植物を自家和合に変えられる可能性がある。
和合性反応は、ＳＬＧが花粉側からの認識物質と結合
し、ＳＲＫを介するリン酸化を介したシグナル伝達系に
情報が伝達され、その反応に引き続き花粉管の侵入・不
侵入が起こると考えられている。そこで、ＳＬＧとＳＲ
Ｋの発現を遺伝的抑制することにより、自家不和合性の
植物を自家和合に変えられる可能性がある。
【０００９】近年、植物組織培養技術の向上と遺伝子導
入技術の開発により形質転換植物の作出が報告されてい
る。アブラナ科植物においてはアグロバクテリウムによ
り外来遺伝子を導入した例が報告されている。タンパク
質合成の情報となるｍＲＮＡに対して相補的な塩基配列
を有するＲＮＡが、そのＲＮＡの機能を抑制する働きが
あることが知られている。これはアンチセンスＲＮＡと
称されるものであり、遺伝子組換え技術の導入によっ
て、アンチセンスＲＮＡを人工的に作り出す研究も進め
られている（特開昭62-296880号）。
入技術の開発により形質転換植物の作出が報告されてい
る。アブラナ科植物においてはアグロバクテリウムによ
り外来遺伝子を導入した例が報告されている。タンパク
質合成の情報となるｍＲＮＡに対して相補的な塩基配列
を有するＲＮＡが、そのＲＮＡの機能を抑制する働きが
あることが知られている。これはアンチセンスＲＮＡと
称されるものであり、遺伝子組換え技術の導入によっ
て、アンチセンスＲＮＡを人工的に作り出す研究も進め
られている（特開昭62-296880号）。
【００１０】例えば、花色色素合成に関与しているカル
コン合成酵素のアンチセンスＲＮＡを生産する組換えペ
チュニアを作製し、野生型とは花色の異なるペチュニア
が得られている（欧州特許公開第341885号）。また、ト
マト果実の軟質化に重要な役割を果たしているポリガラ
クツロナーゼ遺伝子が、導入されたアンチセンスＲＮＡ
によって発現が抑制され、野生型よりも保存の効くトマ
トが作り出され、バイオトマトとして市場に出回ってい
る（欧州特許公開第891115号）。
コン合成酵素のアンチセンスＲＮＡを生産する組換えペ
チュニアを作製し、野生型とは花色の異なるペチュニア
が得られている（欧州特許公開第341885号）。また、ト
マト果実の軟質化に重要な役割を果たしているポリガラ
クツロナーゼ遺伝子が、導入されたアンチセンスＲＮＡ
によって発現が抑制され、野生型よりも保存の効くトマ
トが作り出され、バイオトマトとして市場に出回ってい
る（欧州特許公開第891115号）。
【００１１】配偶体型自家不和合性を示すペチュニアで
も、Ｓ遺伝子と行動を共にする遺伝子がクローニングさ
れた。この遺伝子に対応するタンパク質はRNase活性を
有することからＳ-RNaseと名付けられた。Ｓ-RNase遺伝
子のアンチセンス遺伝子を導入した組換えペチュニア
は、自家和合性となり自家受粉でも受精可能になってい
る（Lee et al. Nature 367: 560 (1994)）。
も、Ｓ遺伝子と行動を共にする遺伝子がクローニングさ
れた。この遺伝子に対応するタンパク質はRNase活性を
有することからＳ-RNaseと名付けられた。Ｓ-RNase遺伝
子のアンチセンス遺伝子を導入した組換えペチュニア
は、自家和合性となり自家受粉でも受精可能になってい
る（Lee et al. Nature 367: 560 (1994)）。
【００１２】しかし、S-RNaseは、アブラナ科のＳＬＧ
とはアミノ酸配列の相同性が低く、Ｓ遺伝子に対応する
タンパク質は、配偶体型自家不和合性植物と胞子体型自
家不和合性植物とでは全く異なるものと考えられた。こ
れまでのところアンチセンスＲＮＡ技術を胞子体自家不
和合性植物に応用した例はない。油科ナタネ（B.napu
s）は自家和合性であるが、カナダ、インドなどで栽培
される油科ナタネ（B.campestris）は自家不和合性であ
る。そのため採種には雄性不稔系統を用いたＦ1 採種が
行われている。この際、雄性不稔系統を用いたＦ1採種
量が低いことや、雄性不稔系統と花粉親系統間のＳ遺伝
子型の一致などが問題となり、遺伝的に雄性不稔系統を
自家和合性に変え、採種量を増加させる方法が望まれて
いる。
とはアミノ酸配列の相同性が低く、Ｓ遺伝子に対応する
タンパク質は、配偶体型自家不和合性植物と胞子体型自
家不和合性植物とでは全く異なるものと考えられた。こ
れまでのところアンチセンスＲＮＡ技術を胞子体自家不
和合性植物に応用した例はない。油科ナタネ（B.napu
s）は自家和合性であるが、カナダ、インドなどで栽培
される油科ナタネ（B.campestris）は自家不和合性であ
る。そのため採種には雄性不稔系統を用いたＦ1 採種が
行われている。この際、雄性不稔系統を用いたＦ1採種
量が低いことや、雄性不稔系統と花粉親系統間のＳ遺伝
子型の一致などが問題となり、遺伝的に雄性不稔系統を
自家和合性に変え、採種量を増加させる方法が望まれて
いる。
【００１３】アブラナ科野菜の多くは自家不和合性を利
用した一代雑種品種（Ｆ1）が主流になっている。その
反面、Ｆ1親品種の育成や原種採種の過程で自家不和合
性は障害となっている。自家不和合性を示すＦ1親品種
の原種採種は蕾交配や炭酸ガス処理などで行われてい
る。しかし、蕾交配で原種採種を行う際、熟練した交配
手の確保、交配労力、交配手の賃金等が問題となる。ま
た、炭酸ガス処理で原種採種を行う際、蕾交配に比較し
て原種採種の効率は良く、原種採種労力コストは低くな
る。しかし、炭酸ガス発生装置等を常設するために採種
面積が限定される点や系統により炭酸ガス効果が一定で
はなく安定した原種量を確保できない場合もある。そこ
で、これらの方法よりも廉価でより効率の良い方法の開
発が望まれている。
用した一代雑種品種（Ｆ1）が主流になっている。その
反面、Ｆ1親品種の育成や原種採種の過程で自家不和合
性は障害となっている。自家不和合性を示すＦ1親品種
の原種採種は蕾交配や炭酸ガス処理などで行われてい
る。しかし、蕾交配で原種採種を行う際、熟練した交配
手の確保、交配労力、交配手の賃金等が問題となる。ま
た、炭酸ガス処理で原種採種を行う際、蕾交配に比較し
て原種採種の効率は良く、原種採種労力コストは低くな
る。しかし、炭酸ガス発生装置等を常設するために採種
面積が限定される点や系統により炭酸ガス効果が一定で
はなく安定した原種量を確保できない場合もある。そこ
で、これらの方法よりも廉価でより効率の良い方法の開
発が望まれている。
【００１４】また、自家不和合性を有する野菜の純系育
種に際しても同様の問題が生じている。一般にアンチセ
ンスによる目的遺伝子の抑制には、目的遺伝子の約10倍
の発現量のアンチセンスＲＮＡを組織特異的に発現させ
る必要性がある。このため、ＳＬＧアンチセンスＲＮＡ
を作らせるプロモーターとして、ＳＬＧプロモーター単
独では効率の良いＳＬＧ及びＳＲＫの低減は期待できな
い。
種に際しても同様の問題が生じている。一般にアンチセ
ンスによる目的遺伝子の抑制には、目的遺伝子の約10倍
の発現量のアンチセンスＲＮＡを組織特異的に発現させ
る必要性がある。このため、ＳＬＧアンチセンスＲＮＡ
を作らせるプロモーターとして、ＳＬＧプロモーター単
独では効率の良いＳＬＧ及びＳＲＫの低減は期待できな
い。
【００１５】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、ＳＬ
Ｇ遺伝子の発現を抑制した形質転換植物を作出し、集団
採種及び雄性不稔系統を用いたＦ1 採種における採種量
を増加させる方法を提供すると共に、従来の蕾交配や炭
酸ガス処理よりも、廉価でより効率よく、自殖種子を獲
得する方法を提供することである。
Ｇ遺伝子の発現を抑制した形質転換植物を作出し、集団
採種及び雄性不稔系統を用いたＦ1 採種における採種量
を増加させる方法を提供すると共に、従来の蕾交配や炭
酸ガス処理よりも、廉価でより効率よく、自殖種子を獲
得する方法を提供することである。
【００１６】
【課題を解決するための手段】本願発明者らは、上記課
題を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、アンチセンスＳ
糖タンパク質遺伝子をエンハンサーとともに、植物のゲ
ノムＤＮＡ中に組み込むことにより、自家不和合性の植
物を自家和合性に形質転換できることを見出し、本発明
を完成した。
題を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、アンチセンスＳ
糖タンパク質遺伝子をエンハンサーとともに、植物のゲ
ノムＤＮＡ中に組み込むことにより、自家不和合性の植
物を自家和合性に形質転換できることを見出し、本発明
を完成した。
【００１７】即ち、本発明の第一は、アンチセンスＳ糖
タンパク質遺伝子を有することを特徴とする植物であ
る。また、本発明の第二は、アンチセンスＳ糖タンパク
質遺伝子と遺伝子のエンハンサーとを含むベクターを構
築し、該ベクターを植物のゲノムＤＮＡに組み込むこと
を特徴とするアンチセンスＳ糖タンパク質遺伝子を有す
る植物の作出方法である。
タンパク質遺伝子を有することを特徴とする植物であ
る。また、本発明の第二は、アンチセンスＳ糖タンパク
質遺伝子と遺伝子のエンハンサーとを含むベクターを構
築し、該ベクターを植物のゲノムＤＮＡに組み込むこと
を特徴とするアンチセンスＳ糖タンパク質遺伝子を有す
る植物の作出方法である。
【００１８】更に、本発明の第三は、アンチセンスＳ糖
タンパク質遺伝子と遺伝子のエンハンサーとを含むベク
ターを構築し、該ベクターを自家不和合性の植物のゲノ
ムＤＮＡに組み込み、該植物を自家和合性に形質転換す
ることを特徴とする植物の形質転換法である。以下、本
発明を詳細に説明する。 〔作出される植物の種類〕植物の種類としては、胞子体
型自家不和合性の植物であれば特に限定されない。具体
的には、アブラナ科、ヒルガオ科、キク科植物等を挙げ
ることができる。これらの中でもアブラナ科植物が好ま
しく、特にブラシカ属植物が好ましい。 〔作出された植物の特徴となる遺伝子もしくは特性〕本
発明の植物の特徴は、ゲノムＤＮＡ中にアンチセンスＳ
ＬＧ遺伝子を有することである。ここで、アンチセンス
ＳＬＧ遺伝子とは、アンチセンスＲＮＡを転写しうる遺
伝子のことをいい、プロモーターにＳＬＧ遺伝子のｃＤ
ＮＡを逆向きにつなぐことにより得られる。このアンチ
センスＳＬＧ遺伝子から転写されるアンチセンスＲＮＡ
は、ＳＬＧ遺伝子のｍＲＮＡと対合し、翻訳を阻害し、
ＳＬＧ遺伝子の発現を抑制する。このため、アンチセン
スＳＬＧ遺伝子が柱頭で発現している植物では、自家不
和合性に関与するＳＬＧ及びＳＲＫの発現量が減少する
ので、自家不和合性が打破され、自家受精が可能とな
る。 〔植物の作出過程〕本発明の植物は、プロモーターにｃ
ＤＮＡを逆向きにつないだアンチセンスＳＬＧ遺伝子、
エンハンサーの２者を含むベクターを構築し、該ベクタ
ーを植物のゲノムＤＮＡに組み込むことにより作出する
ことができる。
タンパク質遺伝子と遺伝子のエンハンサーとを含むベク
ターを構築し、該ベクターを自家不和合性の植物のゲノ
ムＤＮＡに組み込み、該植物を自家和合性に形質転換す
ることを特徴とする植物の形質転換法である。以下、本
発明を詳細に説明する。 〔作出される植物の種類〕植物の種類としては、胞子体
型自家不和合性の植物であれば特に限定されない。具体
的には、アブラナ科、ヒルガオ科、キク科植物等を挙げ
ることができる。これらの中でもアブラナ科植物が好ま
しく、特にブラシカ属植物が好ましい。 〔作出された植物の特徴となる遺伝子もしくは特性〕本
発明の植物の特徴は、ゲノムＤＮＡ中にアンチセンスＳ
ＬＧ遺伝子を有することである。ここで、アンチセンス
ＳＬＧ遺伝子とは、アンチセンスＲＮＡを転写しうる遺
伝子のことをいい、プロモーターにＳＬＧ遺伝子のｃＤ
ＮＡを逆向きにつなぐことにより得られる。このアンチ
センスＳＬＧ遺伝子から転写されるアンチセンスＲＮＡ
は、ＳＬＧ遺伝子のｍＲＮＡと対合し、翻訳を阻害し、
ＳＬＧ遺伝子の発現を抑制する。このため、アンチセン
スＳＬＧ遺伝子が柱頭で発現している植物では、自家不
和合性に関与するＳＬＧ及びＳＲＫの発現量が減少する
ので、自家不和合性が打破され、自家受精が可能とな
る。 〔植物の作出過程〕本発明の植物は、プロモーターにｃ
ＤＮＡを逆向きにつないだアンチセンスＳＬＧ遺伝子、
エンハンサーの２者を含むベクターを構築し、該ベクタ
ーを植物のゲノムＤＮＡに組み込むことにより作出する
ことができる。
【００１９】このベクターは、以下のようにして構築す
ることができる。まず、ＳＬＧ遺伝子のｃＤＮＡを本来
の向きと逆向きにしてプロモーターと連結させる。プロ
モーターと連結させるｃＤＮＡは、例えば、プラスミド
ベクターｐＵＣＳ8に含まれており、このプラスミドベ
クターは、奈良先端科学技術大学院大学細胞間情報学研
究室より入手することができる。プロモータとしては、
植物内で導入遺伝子を発現する際に常用されているＣａ
ＭＶの３５Ｓのプロモータを使用することもできるが、
該プロモーターは柱頭での活性が低く、柱頭でのＳＬＧ
の発現を抑えるのには向いていない。このため、本発明
においては、ゲノムＳＬＧ遺伝子中に含まれるＳＬＧ遺
伝子のプロモーターを使用することが好ましい。ＳＬＧ
遺伝子のプロモーターは、公知のＳＬＧ遺伝子のｃＤＮ
ＡやゲノムＤＮＡの塩基配列を基にプライマーを合成
し、ＰＣＲ法により合成することができる。また、該プ
ロモータを含むベクターも入手可能なので、これを直接
利用することもできる。例えば、ＳＬＧ遺伝子のＳ8 系
統のプロモータを含むプラスミドベクターｐＳＬＧ8ｐ
ｒｏは、奈良先端科学技術大学院大学細胞間情報学研究
室より入手することができる。
ることができる。まず、ＳＬＧ遺伝子のｃＤＮＡを本来
の向きと逆向きにしてプロモーターと連結させる。プロ
モーターと連結させるｃＤＮＡは、例えば、プラスミド
ベクターｐＵＣＳ8に含まれており、このプラスミドベ
クターは、奈良先端科学技術大学院大学細胞間情報学研
究室より入手することができる。プロモータとしては、
植物内で導入遺伝子を発現する際に常用されているＣａ
ＭＶの３５Ｓのプロモータを使用することもできるが、
該プロモーターは柱頭での活性が低く、柱頭でのＳＬＧ
の発現を抑えるのには向いていない。このため、本発明
においては、ゲノムＳＬＧ遺伝子中に含まれるＳＬＧ遺
伝子のプロモーターを使用することが好ましい。ＳＬＧ
遺伝子のプロモーターは、公知のＳＬＧ遺伝子のｃＤＮ
ＡやゲノムＤＮＡの塩基配列を基にプライマーを合成
し、ＰＣＲ法により合成することができる。また、該プ
ロモータを含むベクターも入手可能なので、これを直接
利用することもできる。例えば、ＳＬＧ遺伝子のＳ8 系
統のプロモータを含むプラスミドベクターｐＳＬＧ8ｐ
ｒｏは、奈良先端科学技術大学院大学細胞間情報学研究
室より入手することができる。
【００２０】このようにして得られたアンチセンスＳＬ
Ｇ遺伝子を植物ゲノムＤＮＡ中にそのまま組み込むこと
によってもｍＲＮＡの翻訳をある程度阻止することもで
きるが、好ましくは、プロモーターの上流にエンハンサ
ーを連結させる。ここで、用いるエンハンサーとして
は、植物の外来遺伝子導入に常用されるものを使用する
ことができるが、好ましくは、ＣａＭＶの３５Ｓプロモ
ーターのエンハンサーを使用する。該エンハンサーは、
プラスミドｐΔ３５Ｓｐｒｏに含まれており、このプラ
スミドベクターは奈良先端科学技術大学院大学細胞間情
報学研究室より入手することができる。
Ｇ遺伝子を植物ゲノムＤＮＡ中にそのまま組み込むこと
によってもｍＲＮＡの翻訳をある程度阻止することもで
きるが、好ましくは、プロモーターの上流にエンハンサ
ーを連結させる。ここで、用いるエンハンサーとして
は、植物の外来遺伝子導入に常用されるものを使用する
ことができるが、好ましくは、ＣａＭＶの３５Ｓプロモ
ーターのエンハンサーを使用する。該エンハンサーは、
プラスミドｐΔ３５Ｓｐｒｏに含まれており、このプラ
スミドベクターは奈良先端科学技術大学院大学細胞間情
報学研究室より入手することができる。
【００２１】次に、上記のアンチセンスＳＬＧ遺伝子、
及びエンハンサーを適当なベクターに挿入し、アグロバ
クテリウムを用いて植物細胞を形質転換する。ここで用
いるベクターとしては、植物の外来遺伝子導入に常用さ
れるものを使用することができるが、好ましくはｐＢＩ
１２１のようなバイナリーベクターを用いる。アグロバ
クテリウムのT-ＤＮＡはライトボーダー側から植物のゲ
ノムに組み込まれるので、ライトボーダー側にアンチセ
ンス遺伝子、プロモータ、エンハンサーを配置し、レフ
トボーダー側に選抜マーカーとして薬剤耐性を発現する
遺伝子を配置する。このように、薬剤耐性遺伝子をベク
ターに配置することにより、アンチセンス遺伝子が導入
された植物体を効率よく選抜することが可能になる。こ
こで用いる選抜マーカー遺伝子としては、例えば、カナ
マイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子など
を挙げることができる。
及びエンハンサーを適当なベクターに挿入し、アグロバ
クテリウムを用いて植物細胞を形質転換する。ここで用
いるベクターとしては、植物の外来遺伝子導入に常用さ
れるものを使用することができるが、好ましくはｐＢＩ
１２１のようなバイナリーベクターを用いる。アグロバ
クテリウムのT-ＤＮＡはライトボーダー側から植物のゲ
ノムに組み込まれるので、ライトボーダー側にアンチセ
ンス遺伝子、プロモータ、エンハンサーを配置し、レフ
トボーダー側に選抜マーカーとして薬剤耐性を発現する
遺伝子を配置する。このように、薬剤耐性遺伝子をベク
ターに配置することにより、アンチセンス遺伝子が導入
された植物体を効率よく選抜することが可能になる。こ
こで用いる選抜マーカー遺伝子としては、例えば、カナ
マイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子など
を挙げることができる。
【００２２】上記のように構築されたベクターは、大腸
菌に導入した後、大腸菌からアグロバクテリウムに移
す。アグロバクテリウムとしては、植物の外来遺伝子導
入に常用されるものであればどのようなものでもよく、
例えば、Agrobacterium tumefasience EH101株（Hood e
t al. J.Bacteriol 168:1291-1301）を用いることがで
きる。アグロバクテリウムにベクターを導入する方法
は、特別な方法を用いる必要はなく、例えば、エレクト
ロポレーション法によって行うことができる。具体的に
は、Current Protocols in Molecular Biology: Wiley
Interscience記載の大腸菌のエレクトロポレーション法
を適宜修正して行うことができる。
菌に導入した後、大腸菌からアグロバクテリウムに移
す。アグロバクテリウムとしては、植物の外来遺伝子導
入に常用されるものであればどのようなものでもよく、
例えば、Agrobacterium tumefasience EH101株（Hood e
t al. J.Bacteriol 168:1291-1301）を用いることがで
きる。アグロバクテリウムにベクターを導入する方法
は、特別な方法を用いる必要はなく、例えば、エレクト
ロポレーション法によって行うことができる。具体的に
は、Current Protocols in Molecular Biology: Wiley
Interscience記載の大腸菌のエレクトロポレーション法
を適宜修正して行うことができる。
【００２３】形質転換したアグロバクテリウムは、ベク
ターに配置した薬剤耐性遺伝子に対応する薬剤を含む培
地中で培養する。この培養により、前記ベクターが導入
されたものだけを選抜することができる。アグロバクテ
リウムを用いて植物を形質転換する方法は、Radkeらの
方法（Radke et al., Plant Cell Rep.11:499-505(199
2)）に従って行うことができる。即ち、播種から数日経
過した胚軸を取り出し、これを適当なフィーダーレーヤ
ー細胞による前培養を行った後、アグロバクテリウムの
培養液に浸す。次いで、再びフィーダーレーヤー細胞と
共培養を行った後、抗生物質を含む培地中で培養し、発
根、成熟させて植物体を得る。
ターに配置した薬剤耐性遺伝子に対応する薬剤を含む培
地中で培養する。この培養により、前記ベクターが導入
されたものだけを選抜することができる。アグロバクテ
リウムを用いて植物を形質転換する方法は、Radkeらの
方法（Radke et al., Plant Cell Rep.11:499-505(199
2)）に従って行うことができる。即ち、播種から数日経
過した胚軸を取り出し、これを適当なフィーダーレーヤ
ー細胞による前培養を行った後、アグロバクテリウムの
培養液に浸す。次いで、再びフィーダーレーヤー細胞と
共培養を行った後、抗生物質を含む培地中で培養し、発
根、成熟させて植物体を得る。
【００２４】植物体にアンチセンスＳＬＧ遺伝子が導入
されているかどうかは、植物体よりゲノムＤＮＡを抽出
し、サザンハイブリダイゼーションを行うことにより確
認できる。以下、本発明を実施例に基づきさらに具体的
に説明する。もっとも、本発明は下記の実施例に限定さ
れるものではない。
されているかどうかは、植物体よりゲノムＤＮＡを抽出
し、サザンハイブリダイゼーションを行うことにより確
認できる。以下、本発明を実施例に基づきさらに具体的
に説明する。もっとも、本発明は下記の実施例に限定さ
れるものではない。
【００２５】
〔実施例１〕アンチセンスＳＬＧ遺伝子導入ベクターの
設計と構築 アンチセンス遺伝子はＳ8 系統のＳＬＧ遺伝子（以下、
「ＳＬＧ8 」という）のｃＤＮＡをＳＬＧ8 プロモータ
ーの後ろに逆向きに導入することで得られる。ＳＬＧ8
プロモーターは柱頭または葯特異的な発現を示すことが
知られている（Sato et al.,Plant Cell 3:867-876(199
1)）。完全長のＳＬＧ8 遺伝子ｃＤＮＡ断片（約1.5k
b）を含むプラスミドｐＵＣＳ8（図１）（Yamakawa et
al., Biosci. Biotech. Biochem. 58:921-925、奈良先
端科学技術大学院大学細胞間情報研究室より入手）をEc
o RIで切断後、平滑末端処理を行いさらにBam HIで切断
することで約1.3kbの完全長ｃＤＮＡを切り出した。こ
の断片を、ＳＬＧ8 ゲノムＤＮＡのプロモーター領域約
1.9kbを含むプラスミドp ＳＬＧ8ｐｒｏ（図１）（奈良
先端科学技術大学院大学細胞間情報研究室より入手）を
Not Iで切断後平滑末端処理を行い、続いてBam HIで切
断した部位に、導入してアンチセンスＳＬＧ遺伝子ｐＡ
ＮＴＩ１（図１）を作製した。
設計と構築 アンチセンス遺伝子はＳ8 系統のＳＬＧ遺伝子（以下、
「ＳＬＧ8 」という）のｃＤＮＡをＳＬＧ8 プロモータ
ーの後ろに逆向きに導入することで得られる。ＳＬＧ8
プロモーターは柱頭または葯特異的な発現を示すことが
知られている（Sato et al.,Plant Cell 3:867-876(199
1)）。完全長のＳＬＧ8 遺伝子ｃＤＮＡ断片（約1.5k
b）を含むプラスミドｐＵＣＳ8（図１）（Yamakawa et
al., Biosci. Biotech. Biochem. 58:921-925、奈良先
端科学技術大学院大学細胞間情報研究室より入手）をEc
o RIで切断後、平滑末端処理を行いさらにBam HIで切断
することで約1.3kbの完全長ｃＤＮＡを切り出した。こ
の断片を、ＳＬＧ8 ゲノムＤＮＡのプロモーター領域約
1.9kbを含むプラスミドp ＳＬＧ8ｐｒｏ（図１）（奈良
先端科学技術大学院大学細胞間情報研究室より入手）を
Not Iで切断後平滑末端処理を行い、続いてBam HIで切
断した部位に、導入してアンチセンスＳＬＧ遺伝子ｐＡ
ＮＴＩ１（図１）を作製した。
【００２６】次に、アンチセンス遺伝子とエンハンサー
配列を連結するため、ｐＡＮＴＩ１をSac IIで切断後、
平滑末端処理を行い、さらにHind IIIで切断してアンチ
センス遺伝子部分を切り出した。この断片を、Eco RV処
理で5'上流域-100〜-1を切除して基本転写因子を除いた
ＣａＭＶ ３５Ｓプロモーター領域を含むプラスミドｐ
Δ３５Ｓｐｒｏ（図１）（奈良先端科学技術大学院大学
細胞間情報研究室より入手）をXho Iで切断後平滑末端
処理を行い、続いてHind IIIで切断した部位に、導入し
てｐＡＮＴＩ２（図１）を作製した。
配列を連結するため、ｐＡＮＴＩ１をSac IIで切断後、
平滑末端処理を行い、さらにHind IIIで切断してアンチ
センス遺伝子部分を切り出した。この断片を、Eco RV処
理で5'上流域-100〜-1を切除して基本転写因子を除いた
ＣａＭＶ ３５Ｓプロモーター領域を含むプラスミドｐ
Δ３５Ｓｐｒｏ（図１）（奈良先端科学技術大学院大学
細胞間情報研究室より入手）をXho Iで切断後平滑末端
処理を行い、続いてHind IIIで切断した部位に、導入し
てｐＡＮＴＩ２（図１）を作製した。
【００２７】さらに、これをKpn Iで切断後平滑末端処
理を行い、Sac IIで切断してエンハンサー、アンチセン
ス遺伝子部分を切り出した。この断片を、植物導入ベク
ターであるｐＢＩ １２１（Clontec 社製）をSac I で
切断後平滑末端処理を行い、Sac IIで部分分解を行った
部位に、挿入してｐＡＮＴＩ３（図１）を作製した。さ
らにカナマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシンＢ耐性
遺伝子を含むプラスミドｐＫＨ１をSac I、Kpn Iで切断
後、平滑末端処理を行って両遺伝子を切り出し、ｐＡＮ
ＴＩ３をEco RIで切断後平滑末端処理を行った部位に挿
入してアンチセンス遺伝子導入ベクターｐＡＮＴＩ４
（図１）を作製した。なお、このｐＡＮＴＩ４を含む大
腸菌（E.coli pANTI4 ）は工業技術院生命工学工業技術
研究所に受託番号FERM P-14922として寄託されている
（寄託日平成７年５月１５日）。 〔実施例２〕アグロバクテリウムの形質転換 植物へ遺伝子を導入する手法として植物病原菌のアグロ
バクテリウムを用いたバイナリーベクター法による遺伝
子の組み換えを行った。アグロバクテリウム株はAgroba
cterium tumefasience EHA101株（Hood et al., J.Bact
eriol 168:1291-1301）を用い、遺伝子導入法としてエ
レクトロポレーション法を採用した。
理を行い、Sac IIで切断してエンハンサー、アンチセン
ス遺伝子部分を切り出した。この断片を、植物導入ベク
ターであるｐＢＩ １２１（Clontec 社製）をSac I で
切断後平滑末端処理を行い、Sac IIで部分分解を行った
部位に、挿入してｐＡＮＴＩ３（図１）を作製した。さ
らにカナマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシンＢ耐性
遺伝子を含むプラスミドｐＫＨ１をSac I、Kpn Iで切断
後、平滑末端処理を行って両遺伝子を切り出し、ｐＡＮ
ＴＩ３をEco RIで切断後平滑末端処理を行った部位に挿
入してアンチセンス遺伝子導入ベクターｐＡＮＴＩ４
（図１）を作製した。なお、このｐＡＮＴＩ４を含む大
腸菌（E.coli pANTI4 ）は工業技術院生命工学工業技術
研究所に受託番号FERM P-14922として寄託されている
（寄託日平成７年５月１５日）。 〔実施例２〕アグロバクテリウムの形質転換 植物へ遺伝子を導入する手法として植物病原菌のアグロ
バクテリウムを用いたバイナリーベクター法による遺伝
子の組み換えを行った。アグロバクテリウム株はAgroba
cterium tumefasience EHA101株（Hood et al., J.Bact
eriol 168:1291-1301）を用い、遺伝子導入法としてエ
レクトロポレーション法を採用した。
【００２８】コンピテントセルの調製、アグロバクテリ
ウムの遺伝子導入法は大腸菌のエレクトロポレーション
法を基に若干の改良を加えた（Current Protocols in M
olecular Biology : Wiley Interscience）。コンピテ
ントセルの調製は本培養を16〜24時間行ったものを用い
た。大腸菌で調製したプラスミドｐＡＮＴＩ４ 50μg/m
L １μLを、予め氷中で溶解したcompetent cell液に加
えよく混合した。これをプラスチックセルに移し直流パ
ルスの設定を2.5kv、25μFのコンデンサー、400オーム
の抵抗にして形質転換を行った。形質転換後、直ちに１
mlのＳＯＣ培地を加えパスツールピペットを用いて培養
液をエッペンドルフチューブに移し30℃で２時間穏やか
に振盪培養した。そして培養液100μL を50μg/mLハイ
グロマイシンＢを添加したＬＢ培地上に塗り広げて37℃
で24h 培養を行い陽性コロニーを検出し、サザン分析に
よってプラスミドの存在を確認した。 〔実施例３〕 Brassicaの形質転換 実験はRadke（Radke et al., Plant Cell Rep.11:499-5
05(1992)）記載の方法を基に改良を加えて行った。
ウムの遺伝子導入法は大腸菌のエレクトロポレーション
法を基に若干の改良を加えた（Current Protocols in M
olecular Biology : Wiley Interscience）。コンピテ
ントセルの調製は本培養を16〜24時間行ったものを用い
た。大腸菌で調製したプラスミドｐＡＮＴＩ４ 50μg/m
L １μLを、予め氷中で溶解したcompetent cell液に加
えよく混合した。これをプラスチックセルに移し直流パ
ルスの設定を2.5kv、25μFのコンデンサー、400オーム
の抵抗にして形質転換を行った。形質転換後、直ちに１
mlのＳＯＣ培地を加えパスツールピペットを用いて培養
液をエッペンドルフチューブに移し30℃で２時間穏やか
に振盪培養した。そして培養液100μL を50μg/mLハイ
グロマイシンＢを添加したＬＢ培地上に塗り広げて37℃
で24h 培養を行い陽性コロニーを検出し、サザン分析に
よってプラスミドの存在を確認した。 〔実施例３〕 Brassicaの形質転換 実験はRadke（Radke et al., Plant Cell Rep.11:499-5
05(1992)）記載の方法を基に改良を加えて行った。
【００２９】B. rapa ssp. oleifera（syn. B. camestr
is）の一品種"Candle"（東北大学農学部植物育種学研究
室より入手）を無菌播種後、４−６日経過している実生
から胚軸を切り出した。胚軸は中央部分を選んで１cm長
に切り出した。これをタバコのフィーダーレーヤー細胞
（奈良先端科学技術大学院大学細胞間情報研究室より入
手）による前培養を行った。培地はＭＳ培地に１mg/L
2.4-Dと10mM グルコースを添加したものを用い、25℃、
約3000lux、の条件で18−24h培養した。この外植片を24
h培養したアグロバクテリウムの培養液に10分間浸し、
余計な液をろ紙で除いた後、再びフィーダーplateに戻
し先の条件で２日間共培養を行った。次に外植片をＢ５
培地に１mg/L 2.4-Dと500μg/mLカルベニシリン、25μg
/mlカナマイシンを添加したものに移し、25℃、約3000
lux、16h light、8h darkの条件で３−４日培養した。
温度、光量、照射時間に関して以後もこの条件で培養を
行った。
is）の一品種"Candle"（東北大学農学部植物育種学研究
室より入手）を無菌播種後、４−６日経過している実生
から胚軸を切り出した。胚軸は中央部分を選んで１cm長
に切り出した。これをタバコのフィーダーレーヤー細胞
（奈良先端科学技術大学院大学細胞間情報研究室より入
手）による前培養を行った。培地はＭＳ培地に１mg/L
2.4-Dと10mM グルコースを添加したものを用い、25℃、
約3000lux、の条件で18−24h培養した。この外植片を24
h培養したアグロバクテリウムの培養液に10分間浸し、
余計な液をろ紙で除いた後、再びフィーダーplateに戻
し先の条件で２日間共培養を行った。次に外植片をＢ５
培地に１mg/L 2.4-Dと500μg/mLカルベニシリン、25μg
/mlカナマイシンを添加したものに移し、25℃、約3000
lux、16h light、8h darkの条件で３−４日培養した。
温度、光量、照射時間に関して以後もこの条件で培養を
行った。
【００３０】次にＢ５培地に１mg/L ゼアチン(Zeati
n)、5mg/l AgNO3、500 μg/ml カルベニシリンと10μg/
ml カナマイシンを添加した培地上に１プレート当たり4
0−45外植片を置床し培養した。本培地で２週間培養し
た後、AgNO3を含まない上記培地に移した。以後シュー
トを形成するまで１週間ごとに新しい培地に交換した。
４−９週間後、外植片から分化したシュートを切り出
し、Ｂ５培地に300μg/mL カルベニシリンと50μg/mL
カナマイシンを添加したものに移し２週間培養した。シ
ュートは5mm以上の大きさになったものを切り出した。
n)、5mg/l AgNO3、500 μg/ml カルベニシリンと10μg/
ml カナマイシンを添加した培地上に１プレート当たり4
0−45外植片を置床し培養した。本培地で２週間培養し
た後、AgNO3を含まない上記培地に移した。以後シュー
トを形成するまで１週間ごとに新しい培地に交換した。
４−９週間後、外植片から分化したシュートを切り出
し、Ｂ５培地に300μg/mL カルベニシリンと50μg/mL
カナマイシンを添加したものに移し２週間培養した。シ
ュートは5mm以上の大きさになったものを切り出した。
【００３１】２週間後、Ｂ５培地に２mg/L インドール-
3-酪酸(indole-3-butyric acid) 、300 μg/mL カルベ
ニシリンと50μg/mL カナマイシンを添加したものに移
したところ10日ほどで根の形成がみられた。さらにシュ
ートをポットに移して生育させたところ成熟した完全な
植物体が３個体得られた。 〔実施例４〕形質転換体の確認 上記実施例３で得られた３個体の植物体の緑葉よりPich
ら（Pich et al., Nude Acid Res.21:3328(1993)）記載
の方法を用いてゲノムＤＮＡを抽出し、サザンハイブリ
ダイゼーション法を行い導入した遺伝子の存在を確認し
た。その結果、３個体中１個体がカナマイシン耐性遺伝
子およびＳＬＧ8 遺伝子を保持していることが確認され
た。 〔実施例５〕形質転換アブラナ植物体の分析 アンチセンスＳＬＧ遺伝子の導入によって自家不和合性
の形質に変化を与えたかどうかを確認するため自家受粉
を行った。その結果、種子形成率が80％程度と形質転換
していないCandleにおける種子形成率１−３％(5/317=
0.0157)の値と異なる結果を得た。また自家受粉時にお
ける花粉管の伸長を観察した。受粉後２時間経過した雌
ずいをエタノール：酢酸＝３：１に混合した固定液中に
５時間浸した後、１N 水酸化ナトリウム水溶液中60℃で
1.5時間処理した。これを0.01％アニリンブルーを含む
２％リン酸カリウム水溶液に２時間浸し、蛍光顕微鏡で
観察した。対照として形質転換していないCandleに関し
ても同様の実験を行った。結果を図２に示す。図２ａは
形質転換体における自家受粉の結果、図２ｂはコントロ
ールにおける自家受粉の結果である。コントロールでは
花粉管の伸長が抑制され、しかも乳頭突起細胞上には自
家不和合性の現象にともなって観察されるカロース栓の
形成が観察されている。一方、形質転換体では花粉管の
伸長が観察され、またカロース栓の形成は観察されなか
った。しかし花粉管の数は1柱頭当たり50-100本程度と
他家受粉を行った場合の花粉管数（１柱頭当たり200本
以上）に比べてやや低かった。 〔実施例６〕形質転換アブラナ植物体のＳＬＧの転写レ
ベルでの分析 形質転換体から開花2日前の柱頭50個を採取し、Micro-F
astTrack (Invitrogen社)を用いて1.5μgのｍＲＮＡの
抽出を行い、ノーザンハイブリダイゼーション法を行っ
てＳＬＧの転写レベルでの変化を調べた。プローブはＳ
ＬＧ8 遺伝子ｃＤＮＡ（奈良先端科学技術大学院大学細
胞間情報研究室より入手）を用い、対象として形質転換
していないCandleを用いて同様の条件でｍＲＮＡの調製
を行い、ノーザンハイブリダイゼーションを行った。結
果を図3に示す。レーン１がコントロールを、レーン２
が形質転換体を示す。図３ａはイメージングプレートに
感光後2時間の結果であり、図３ｂは感光後12時間経過
した結果を示している。長時間の感光はＳＬＧに比べて
200分の１程度の発現量であるＳＲＫを検出するために
行った。形質転換体ではＳＬＧの発現は観察されるもの
のコントロールと比較して非常に低い値であった。また
ＳＬＧだけでなくＳＬＧと相同な細胞外ドメインを有す
るＳＲＫの発現量も低下していることが示唆された。 〔実施例７〕形質転換アブラナ植物体のＳＬＧの翻訳レ
ベルでの分析 形質転換体から開花直後の柱頭５個を採取し、エッペン
ドルフチューブに入れ、氷温下で50mM Tris-HCl （pH
7.5）緩衝液を加えアクリル棒を用いて磨細した後、120
00rpm. 20min. 4℃で遠心した。その上清をとり、10％
ＳＤＳ、2-メルカプトエタノール、ブロモフェノールブ
ルー（ＢＰＢ）を加えて混合し、12％ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動で分離した。ゲル中の分離したタンパク
質をＰＶＤＦ膜（Millipore）に転写し、抗Ｓ8モノクロ
ーナル抗体を用いてＳＬＧの検出を行った。
3-酪酸(indole-3-butyric acid) 、300 μg/mL カルベ
ニシリンと50μg/mL カナマイシンを添加したものに移
したところ10日ほどで根の形成がみられた。さらにシュ
ートをポットに移して生育させたところ成熟した完全な
植物体が３個体得られた。 〔実施例４〕形質転換体の確認 上記実施例３で得られた３個体の植物体の緑葉よりPich
ら（Pich et al., Nude Acid Res.21:3328(1993)）記載
の方法を用いてゲノムＤＮＡを抽出し、サザンハイブリ
ダイゼーション法を行い導入した遺伝子の存在を確認し
た。その結果、３個体中１個体がカナマイシン耐性遺伝
子およびＳＬＧ8 遺伝子を保持していることが確認され
た。 〔実施例５〕形質転換アブラナ植物体の分析 アンチセンスＳＬＧ遺伝子の導入によって自家不和合性
の形質に変化を与えたかどうかを確認するため自家受粉
を行った。その結果、種子形成率が80％程度と形質転換
していないCandleにおける種子形成率１−３％(5/317=
0.0157)の値と異なる結果を得た。また自家受粉時にお
ける花粉管の伸長を観察した。受粉後２時間経過した雌
ずいをエタノール：酢酸＝３：１に混合した固定液中に
５時間浸した後、１N 水酸化ナトリウム水溶液中60℃で
1.5時間処理した。これを0.01％アニリンブルーを含む
２％リン酸カリウム水溶液に２時間浸し、蛍光顕微鏡で
観察した。対照として形質転換していないCandleに関し
ても同様の実験を行った。結果を図２に示す。図２ａは
形質転換体における自家受粉の結果、図２ｂはコントロ
ールにおける自家受粉の結果である。コントロールでは
花粉管の伸長が抑制され、しかも乳頭突起細胞上には自
家不和合性の現象にともなって観察されるカロース栓の
形成が観察されている。一方、形質転換体では花粉管の
伸長が観察され、またカロース栓の形成は観察されなか
った。しかし花粉管の数は1柱頭当たり50-100本程度と
他家受粉を行った場合の花粉管数（１柱頭当たり200本
以上）に比べてやや低かった。 〔実施例６〕形質転換アブラナ植物体のＳＬＧの転写レ
ベルでの分析 形質転換体から開花2日前の柱頭50個を採取し、Micro-F
astTrack (Invitrogen社)を用いて1.5μgのｍＲＮＡの
抽出を行い、ノーザンハイブリダイゼーション法を行っ
てＳＬＧの転写レベルでの変化を調べた。プローブはＳ
ＬＧ8 遺伝子ｃＤＮＡ（奈良先端科学技術大学院大学細
胞間情報研究室より入手）を用い、対象として形質転換
していないCandleを用いて同様の条件でｍＲＮＡの調製
を行い、ノーザンハイブリダイゼーションを行った。結
果を図3に示す。レーン１がコントロールを、レーン２
が形質転換体を示す。図３ａはイメージングプレートに
感光後2時間の結果であり、図３ｂは感光後12時間経過
した結果を示している。長時間の感光はＳＬＧに比べて
200分の１程度の発現量であるＳＲＫを検出するために
行った。形質転換体ではＳＬＧの発現は観察されるもの
のコントロールと比較して非常に低い値であった。また
ＳＬＧだけでなくＳＬＧと相同な細胞外ドメインを有す
るＳＲＫの発現量も低下していることが示唆された。 〔実施例７〕形質転換アブラナ植物体のＳＬＧの翻訳レ
ベルでの分析 形質転換体から開花直後の柱頭５個を採取し、エッペン
ドルフチューブに入れ、氷温下で50mM Tris-HCl （pH
7.5）緩衝液を加えアクリル棒を用いて磨細した後、120
00rpm. 20min. 4℃で遠心した。その上清をとり、10％
ＳＤＳ、2-メルカプトエタノール、ブロモフェノールブ
ルー（ＢＰＢ）を加えて混合し、12％ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動で分離した。ゲル中の分離したタンパク
質をＰＶＤＦ膜（Millipore）に転写し、抗Ｓ8モノクロ
ーナル抗体を用いてＳＬＧの検出を行った。
【００３２】対照として、形質転換していないCandleお
よびBrassica campestris Ｓ8ホモ系統株を用い、同様
の条件でＳ糖タンパク質の検出を行った。結果を図４に
示す。レーン１がコントロール、レーン２が形質転換
体、レーン３がＳ8ホモ系統体である。コントロールのC
andleおよびＳ8ホモ系統株では抗Ｓ8モノクローナル抗
体と反応するバンドが55kd付近に数本見られるが、形質
転換体では検出されなかった。また等電点電気泳動によ
るＳ糖タンパク質の検出を行った。形質転換体から開花
直後の柱頭30個を採取し、エッペンドルフチューブに入
れ、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動の場合と
同様の操作を行って粗抽出液を回収した。粗抽出液をポ
リアクリルアミド薄層ゲル板（Ampholine PAG plates p
H 3.5-9.5; LKB）で泳動し、タンパク質を分離した。ゲ
ルからＰＶＤＦ膜にタンパク質の転写を行い、抗Ｓ8モ
ノクローナル抗体を用いてＳ糖タンパク質の検出を行っ
た。対照として、形質転換していないCandleおよびBras
sica campestris Ｓ8ホモ系統株を用い、同様の条件で
Ｓ糖タンパク質の検出を行った。結果を図５に示す。レ
ーン１がコントロール、レーン２が形質転換体、レーン
３がＳ8ホモ系統体である。コントロールのＳ8ホモ系統
株ではpI 8.45付近に、またCandleではpI 8.15付近に抗
Ｓ8モノクローナル抗体と反応するバンドがみられる
が、形質転換体では検出されなかった。
よびBrassica campestris Ｓ8ホモ系統株を用い、同様
の条件でＳ糖タンパク質の検出を行った。結果を図４に
示す。レーン１がコントロール、レーン２が形質転換
体、レーン３がＳ8ホモ系統体である。コントロールのC
andleおよびＳ8ホモ系統株では抗Ｓ8モノクローナル抗
体と反応するバンドが55kd付近に数本見られるが、形質
転換体では検出されなかった。また等電点電気泳動によ
るＳ糖タンパク質の検出を行った。形質転換体から開花
直後の柱頭30個を採取し、エッペンドルフチューブに入
れ、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動の場合と
同様の操作を行って粗抽出液を回収した。粗抽出液をポ
リアクリルアミド薄層ゲル板（Ampholine PAG plates p
H 3.5-9.5; LKB）で泳動し、タンパク質を分離した。ゲ
ルからＰＶＤＦ膜にタンパク質の転写を行い、抗Ｓ8モ
ノクローナル抗体を用いてＳ糖タンパク質の検出を行っ
た。対照として、形質転換していないCandleおよびBras
sica campestris Ｓ8ホモ系統株を用い、同様の条件で
Ｓ糖タンパク質の検出を行った。結果を図５に示す。レ
ーン１がコントロール、レーン２が形質転換体、レーン
３がＳ8ホモ系統体である。コントロールのＳ8ホモ系統
株ではpI 8.45付近に、またCandleではpI 8.15付近に抗
Ｓ8モノクローナル抗体と反応するバンドがみられる
が、形質転換体では検出されなかった。
【００３３】上記実施例５、６、７の結果はアンチセン
スＳＬＧ遺伝子の導入による内在性のＳＬＧおよびＳＲ
Ｋ遺伝子の発現低下とそれに伴う自家不和合性の低減を
示している。得られた形質転換体はＳＬＧおよびＳＲＫ
の発現を完全には打破できなかったため部分的な自家不
和合性を有していると考えられる。アンチセンス遺伝子
の導入とそれに伴う形質の部分的な変化は種々の報告が
なされており（van der Krol et al., 1988）、上記の
結果は妥当であると結論づけた。これらの結果からアン
チセンス遺伝子を用いた自家不和合性の打破または低減
の有用性は明らかである。
スＳＬＧ遺伝子の導入による内在性のＳＬＧおよびＳＲ
Ｋ遺伝子の発現低下とそれに伴う自家不和合性の低減を
示している。得られた形質転換体はＳＬＧおよびＳＲＫ
の発現を完全には打破できなかったため部分的な自家不
和合性を有していると考えられる。アンチセンス遺伝子
の導入とそれに伴う形質の部分的な変化は種々の報告が
なされており（van der Krol et al., 1988）、上記の
結果は妥当であると結論づけた。これらの結果からアン
チセンス遺伝子を用いた自家不和合性の打破または低減
の有用性は明らかである。
【００３４】
【発明の効果】本発明により、遺伝子工学的手法によ
り、ＳＬＧ及びＳＲＫの発現量を低減させ、自家不和合
性を打破する方法が提供される。本発明の方法は、従来
の蕾交配や炭酸ガス処理を利用する方法に比べ、確実
に、かつ、低コストで行うことができる。
り、ＳＬＧ及びＳＲＫの発現量を低減させ、自家不和合
性を打破する方法が提供される。本発明の方法は、従来
の蕾交配や炭酸ガス処理を利用する方法に比べ、確実
に、かつ、低コストで行うことができる。
【図１】 アンチセンスＳＬＧ遺伝子導入ベクターの設
計と構築の概要を示す図である。
計と構築の概要を示す図である。
【図２】 形質転換アブラナ植物体の生物の形態を示す
写真である。
写真である。
【図３】 ＳＬＧ遺伝子のｍＲＮＡの電気泳動を示す写
真である。
真である。
【図４】 ＳＬＧの電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を示
す写真である。
す写真である。
【図５】 ＳＬＧの電気泳動（ＩＥＦ）を示す写真であ
る。
る。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 磯貝 彰 奈良県生駒市高山町8916−５ 奈良先端技 術大学院大学 バイオサイエンス学科 (72)発明者 日向 康吉 宮城県仙台市青葉区堤通雨宮町１−１ 東 北大学農学部 植物育種学研究室
Claims (6)
- 【請求項１】 アンチセンスＳ糖タンパク質遺伝子を有
することを特徴とする植物。 - 【請求項２】 植物が、ブラシカ（Brassica）属に属す
る植物であることを特徴とする請求項１記載の植物。 - 【請求項３】 アンチセンスＳ糖タンパク質遺伝子と遺
伝子のエンハンサーとを含むベクターを構築し、該ベク
ターを植物のゲノムＤＮＡに組み込むことを特徴とする
アンチセンスＳ糖タンパク質遺伝子を有する植物の作出
方法。 - 【請求項４】 植物が、ブラシカ（Brassica）属に属す
る植物であること特徴とする請求項３記載の作出方法。 - 【請求項５】 アンチセンスＳ糖タンパク質遺伝子と遺
伝子のエンハンサーとを含むベクターを構築し、該ベク
ターを自家不和合性の植物のゲノムＤＮＡに組み込み、
該植物を自家和合性に形質転換することを特徴とする植
物の形質転換法。 - 【請求項６】 植物が、ブラシカ（Brassica）属に属す
る植物であることを特徴とする請求項５記載の植物の形
質転換法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7151118A JPH08322412A (ja) | 1995-05-26 | 1995-05-26 | アンチセンス遺伝子を導入した植物及びその作出方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7151118A JPH08322412A (ja) | 1995-05-26 | 1995-05-26 | アンチセンス遺伝子を導入した植物及びその作出方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH08322412A true JPH08322412A (ja) | 1996-12-10 |
Family
ID=15511764
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP7151118A Pending JPH08322412A (ja) | 1995-05-26 | 1995-05-26 | アンチセンス遺伝子を導入した植物及びその作出方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH08322412A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1998035052A1 (en) * | 1997-02-07 | 1998-08-13 | University Of Guelph | Production of self-compatible brassica hybrids using a self-incompatible pollination control system |
-
1995
- 1995-05-26 JP JP7151118A patent/JPH08322412A/ja active Pending
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| MIKHALL E NASRALLAH MUTHUGAPATTI K KANDASAMY=1992 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1998035052A1 (en) * | 1997-02-07 | 1998-08-13 | University Of Guelph | Production of self-compatible brassica hybrids using a self-incompatible pollination control system |
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