JP2018532405A - 種子製造における変更された特性を有するアブラナ属植物 - Google Patents

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Abstract

本発明は、花数、さや数が増加、および千粒重（ＴＳＷ）が増加した植物に関する。より詳細には、本発明は、サイトカイニンオキシダーゼ５またはサイトカイニンオキシダーゼ５および３の発現が機能低下しているアブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）植物に関する。変異体ＣＫＸアレルを含んでなるアブラナ属植物、およびＣＫＸ発現が低下しているアブラナ属植物を提供する。花数、さや数またはＴＳＷが増加したアブラナ属植物を製造する方法および手段も提供する。

Description

本発明は、アブラナ属植物および部分、詳細には、変更された花数、さや数および種子産生特性を有するブラシカ・ナプス（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）植物に関する。本発明は、ブラシカ・ナプス（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）由来のサイトカイニンオキシダーゼ（ＣＫＸ）をコードする核酸、およびブラシカ・ナプス（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）植物において花、さやおよび種子産生に影響を及ぼすその誘発多様体アレル（対立遺伝子）にも関する。
農業の生産性向上は、ヒト集団の成長および農業に割り当てることができる最適特性を有する土地空間の継続的減少を考慮して食品、飼料および他の植物由来製品に対する高まる需要を満足するための絶え間ない目標である。
サイトカイニンは、植物成長および発育のあらゆる側面に影響を及ぼす植物ホルモンである。これは、シュート分裂組織の形成および活性を刺激し、シンク組織を確立することができ、葉の老化を遅らせ、根の成長および分岐を抑制し、種子発芽およびストレス反応に役割を果たす（Mok and Mok, 2001, Ann. Rev. Plant Physiol. Mol. Biol. 52, 89-118）。サイトカイニンの化学および生理機能、同様に、サイトカイニン生合成、代謝、およびシグナル伝達の調節は広範に研究されている。
サイトカイニンオキシダーゼ（ＣＫＸ）は、サイトカイニンデヒドロゲナーゼとも呼ばれ、植物ホルモンサイトカイニンのホメオスタシスを調節する。これらは、サイトカイニンイソペンテニルアデニン、ゼアチン、および酸化的側鎖開裂による単一酵素工程におけるそのリボシドの不可逆分解を触媒する。アラビドプシス・タリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）のゲノムは７つのＣＫＸ遺伝子をコードするが、コメのゲノムは少なくとも１０メンバーのＣＫＸファミリーを含んでなる。個々のＣＫＸタンパク質は、その触媒特性、その細胞内局在性ならびにそのタイミング、発育段階および組織に関する発現パターンにおいて異なる。ＣＫＸ酵素は、ほとんどのサイトカイニン異化の原因となり、ホルモンを不活化する。ＣＫＸタンパク質レベル変化またはＣＫＸ活性の機能性およびその後の変化は組織内のサイトカイニン濃度を変化させるので、ＣＫＸ酵素は局所サイトカイニンレベルの制御において重要であり、サイトカイニン依存過程の調節に寄与する。（Schmuelling et al., 2003, J. Plant Res. 116, 241-252）。ＣＫＸ遺伝子発現およびＣＫＸタンパク質の調節は、バイオ技術応用において植物の形態、生化学、生理および発育を改変するために使用されてきた。
国際公開第２００１／９６５８０号は、植物サイトカイニンオキシダーゼの発現または植物もしくは植物部分中の活性サイトカイニンレベルを低減する別のタンパク質の発現を含む、根成長の刺激および／または側根もしくは不定根の形成促進および／または根の屈地性の改変する方法について記載している。新規植物サイトカイニンオキシダーゼタンパク質、サイトカイニンオキシダーゼタンパク質をコードする核酸配列、ならびにこのような配列を含んでなるベクター、宿主細胞、トランスジェニック細胞および植物も記載されている。この文献は、収量の増加および／または早期活力の増強および／または根／シュート比の変更および／または倒伏に対する耐性向上および／または乾燥耐性向上および／または外植体のインビトロ成長反応の促進および／または細胞運命の変更および／または植物発育および／または植物形態および／または植物生化学および／または植物生理を含む根関連特性の改良するためのこれらの配列の使用についても記載している。上記方法におけるこれらの配列の使用についてさらに記載する。サイトカイニンオキシダーゼタンパク質と相互作用するタンパク質および化合物を同定方法および得る方法、ならびに植物成長調節物質または除草剤としてのこのような化合物の使用も開示する。
国際公開第２００３／０５０２８７号も、植物サイトカイニンオキシダーゼの発現または植物もしくは植物部分中の活性サイトカイニンレベルを低減する別のタンパク質の発現を含む、根成長の刺激および／または側根もしくは不定根の形成促進および／または根の屈地性の改変する方法について記載している。種子の大きさおよび／または重量、胚の大きさおよび／または重量、ならびに子葉の大きさおよび／または重量の増加方法も提供する。方法は、植物サイトカイニンオキシダーゼの発現または植物もしくは植物部分中の活性サイトカイニンレベルを低減する別のタンパク質の発現を含む。この文献は、新規植物サイトカイニンオキシダーゼタンパク質、サイトカイニンオキシダーゼタンパク質をコードする核酸配列、ならびに前記配列を含んでなるベクター、宿主細胞、トランスジェニック細胞および植物についてさらに記載している。収量の増加および／または早期活力の増強および／または根／シュート比の変更および／または倒伏に対する耐性向上および／または乾燥耐性向上および／または外植体のインビトロ成長反応の促進および／または細胞運命の変更および／または植物発育および／または植物形態および／または植物生化学および／または植物生理を含む根関連特性の改良するためのこのような配列の使用も開示する。最終的に、記載されている技術は、上記方法、ならびにサイトカイニンオキシダーゼタンパク質と相互作用するタンパク質および化合物を同定および得るための方法におけるこのような配列の使用ならびに植物成長調節物質または除草剤としてのこのような化合物の使用にも関する。
国際公開第２００５／１２３９２６号は、植物の種子収量を増加するための方法および組成物について記載している。方法は、種子のアリューロンおよび／または胚におけるサイトカイニンオキシダーゼの発現を含む。種子のアリューロンおよび／または胚における発現を活発にすることができるプロモーター、ならびにこのような配列を含んでなる宿主細胞、トランスジェニック細胞および植物と機能的に連結しているサイトカイニンオキシダーゼをコードする核酸を含んでなるベクターがさらに記載されている。収量を増大するためのこれらの配列の使用も提供される。
米国特許出願公開第２００６／１２３５０７号は、単離することに成功し、連鎖分析により同定された子実用植物の着粒数（穎花、果実、および種子を含む）の増減を調節するＣＫＸ遺伝子について記載している。加えて、植物の着粒数（穎花、果実、および種子を含む）を増加するためのこの遺伝子を利用する育種方法も発見した。
米国特許出願公開第２０１３／０１４２９１号は、サイトカイニンオキシダーゼ様配列（トウモロコシ由来）および使用方法について記載している。この配列を、根発育の調節、花の発育の調節、葉および／またはシュートの発育の調節、種子の大きさおよび／または重量の調節、非生物的ストレス下の耐性の調節、ならびに病原体に対する耐性の調節を含む種々の方法において使用することができる。
Ｃｅｒｖｉｎｋｏｖａら（2013 J. Exp. Bot. 64, 2805-2815）は、異所的に増強したサイトカイニンオキシダーゼ／デヒドロゲナーゼ遺伝子発現を有するタバコ植物の乾燥および熱ストレス耐性の増強について記載した。
Ｋoeｌｌｍｅｒら（2014, Plant J. 78, 359-371）は、アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）由来の細胞基質サイトカイニンオキシダーゼ／デヒドロゲナーゼ（ＣＫＸ７）の過剰発現が根成長および木部分化の特異的変化を引き起こすことを報告した。
国際公開第２０１１／００４００３号は、少なくともＣＫＸ３遺伝子およびサイトカイニンオキシダーゼ／デヒドロゲナーゼをコードし、ＣＫＸ３と異なる１つのさらなる遺伝子における分裂を含んでなる単離植物細胞および植物、ならびに、このような植物の製造方法ならびに植物の種子収量および／または草高の増加方法を対象とする。
Ｂａｔｒｉｎａら（2011, The Plant Cell 23, 69-80）は、シュート頂端分裂組織の大きさおよび活性を転写制御因子および植物ホルモンサイトカイニンを含む低分子質量シグナルにより調節することを報告している。分裂組織のサイトカイニン状態は、サイトカイニンオキシダーゼ／デヒドロゲナーゼ（ＣＫＸ）酵素により触媒されるホルモンの代謝分解を含む異なる因子に依存する。この文献では、ＣＫＸ３およびＣＫＸ５はアラビドプシス・タリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）の生殖分裂組織の活性を調節することを報告している。中央部ＷＵＳＣＨＥＬ（ＷＵＳ）ドメインにおいてＣＫＸ３は発現されるが、ＣＫＸ５は、より広い分裂細織的発現を示す。アラビドプシス・タリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）のｃｋｘ３ ｃｋｘ５二重変異体は、より大きな花序および花の分裂組織を形成する。ＷＵＳドメインの大きさ増大および原基形成促進は、幹細胞ニッチェの規定および細胞分化の遅延におけるサイトカイニンの二重機能を示す。これと一致して、分裂組織周辺において発現されるサイトカイニンシグナル伝達、アラビドプシスヒスチジンリン酸転移タンパク質６（ＡＲＡＢＩＤＯＰＳＩＳ ＨＩＳＴＩＤＩＮＥ ＰＨＯＳＰＨＯＴＲＡＮＳＦＥＲ ＰＲＯＴＥＩＮ ６）の負の制御因子遺伝子の変異は、分化のさらなる遅延を引き起こした。最終細胞分化はｃｋｘ３ ｃｋｘ５花においても遅延し、より多くの細胞を生成し、より大きくなり、花器官の大きさの調節におけるサイトカイニンの役割を確証した。さらに、ｃｋｘ３ ｃｋｘ５胎座組織のより高い活性は、長角果当たりの種子セットの増加をもたらす過剰胚珠を確立した。共に、結果は生殖発育におけるサイトカイニンの重要な役割を実証する。サイトカイニン含有率増加は、収量因子としてシンク強度の関連性を強調して、アラビドプシス・タリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）の種子収量を約５５％増加させた。
Ｓｏｎｇら（2015 J. Exp. Bot. 66 pp 5067-5082）は、ブラシカ・ナプス（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）遺伝子の発現パターンが、葉、花、長角果、および種子発育において、ＩＰＴ、ＣＫＸ、ショ糖輸送体、細胞壁インベルターゼおよびアミノ酸パーミアーゼ遺伝子ファミリーメンバーに関係していることを報告している。この出版物は、ブラシカ・ナプス（Ｂ． ｎａｐｕｓ）のサイトカイニン分解のための遺伝子ファミリー（ＢｎＣＫＸ１〜ＢｎＣＫＸ７）、ならびにブラシカ・オレラセ（Ｂ． ｏｌｅｒａｃｅ）およびブラシカ・ラパ（Ｂ． ｒａｐａ）由来のホモログの同定を報告している。公開されている配列の受託番号はない（補足データ別紙１はこのような番号を一覧しているが）。ＢｎＣＫＸ２および４を、栄養成長およびバイオマス生産のために繁殖される茎葉アブラナ（ブラシカ・ナプス（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）ｃｖ．グリーンランド）の茎葉収量および品質に影響を及ぼさないで種子収量を改良するために、ＴＩＬＬＩＮＧ、ＥｃｏＴＩＬＬＩＮＧおよびＭＡＳの標的として同定した。
従って、ブラシカ・ナプス（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）の花産生、さや産生および種子産生、ならびに種子特性を改変するために使用することができるブラシカ・ナプス（Ｂ． ｎａｐｕｓ）由来ＣＫＸ３およびＣＫＸ５遺伝子の非機能的多様体アレルに対する必要性が依然と存在する。
本発明者らは、前記植物中の「機能的に発現」される、すなわち、アブラナ属植物中で機能的（生物活性）ＣＫＸ５またはＣＫＸ５およびＣＫＸ３タンパク質をもたらすＣＫＸ５またはＣＫＸ５およびＣＫＸ３遺伝子の数および／または種類を制御することにより、植物当たりの花、さやおよび種子の数を調節することができることを見出した。
機能的ＣＫＸ５またはＣＫＸ５およびＣＫＸ３タンパク質レベルの減少をもたらすＣＫＸ５またはＣＫＸ５およびＣＫＸ３遺伝子の特定の誘発された多様体アレルを組合わすことにより、植物当たりの花の数を増加することができ、詳細には、主枝上の花の数を温室または圃場試験条件下増加することができる。さらに、主枝上のさやの数を圃場試験条件下増加することができ、同様に、主枝上の種子の数を増加することができる。千粒重（Thousand Seed Weight）（ＴＳＷ）の増加も行うことができ、詳細には、より高いＴＳＷを得るが、これをより低い種子数の収量で相殺する他のアプローチとは逆に、種子収量に対する有意な負の効果がなくより高いＴＳＷを達成することができる。
１つの実施形態では、そのゲノム内に少なくとも１つの変異体ＣＫＸ５アレル（対立遺伝子）を含んでなる、少なくとも１つのＣＫＸ５遺伝子を含んでなるアブラナ属植物を提供し、特に、前記変異体ＣＫＸ５アレルは：配列番号１９または配列番号２３と少なくとも９０％の配列同一性を含むヌクレオチド配列；配列番号２０または配列番号２３と少なくとも９０％の配列同一性を含むコード配列を含んでなるヌクレオチド配列；および配列番号２１または配列番号２４と少なくとも９０％の配列同一性を含むアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列からなる群から選択される核酸配列を含んでなるＣＫＸ５遺伝子の変異アレルである。
アブラナ属植物は２つのＣＫＸ５遺伝子を含んでなり、ブラシカ・ナプス（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）、ブラシカ・ユンセア（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｊｕｎｃｅａ）およびブラシカ・カリナタ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｃａｒｉｎａｔａ）からなる群から選択してもよい。植物は、少なくとも２つの変異体ＣＫＸ５アレル、または少なくとも３つの変異体ＣＫＸ５アレル、または少なくとも４つの変異体ＣＫＸ５アレルを含んでなり得る。
特定の実施形態では、変異体ＣＫＸ５アレルを：配列番号１９の４６５位または配列番号２０の４６５位に対応する位置においてＧ〜Ａ置換を含んでなる変異体ＣＫＸ５アレル；配列番号１９の３９９位または配列番号２０の３９９位に対応する位置においてＧ〜Ａ置換を含んでなる変異体ＣＫＸ５アレル；および配列番号２２の４６５位または配列番号２３の３９９位に対応する位置においてＧ〜Ａ置換を含んでなる変異体ＣＫＸ５アレルから選択してもよい。
さらに別の実施形態では、植物は、少なくとも２つの変異体ＣＫＸ３アレルをそのゲノム内にさらに含んでなる、少なくとも２つのＣＫＸ３遺伝子をさらに含んでもよく、特に、前記変異体ＣＫＸ３アレルは：配列番号７、配列番号１０、配列番号１３または配列番号１６と少なくとも９０％配列同一性を含むヌクレオチド配列；配列番号８、配列番号１１、配列番号１４または配列番号１７と少なくとも９０％配列同一性を含むコード配列を含んでなるヌクレオチド配列；および配列番号９、配列番号１２、配列番号１５または配列番号１８と少なくとも９０％配列同一性を含むアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列からなる群から選択される核酸配列を含んでなるＣＫＸ３遺伝子の変異アレルである。
アブラナ属植物は、４つのＣＫＸ３遺伝子を含んでもよく、前記アブラナ属植物は、ブラシカ・ナプス（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）、ブラシカ・ユンセア（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｊｕｎｃｅａ）およびブラシカ・カリナタ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｃａｒｉｎａｔａ）からなる群から選択され、少なくとも２つの変異体ＣＫＸ３アレル、または少なくとも３つの変異体ＣＫＸ３アレル、または少なくとも４つの変異体ＣＫＸ３アレル、または少なくとも５つの変異体ＣＫＸ３アレル、または少なくとも６つの変異体ＣＫＸ３アレル、または少なくとも７つの変異体ＣＫＸ３アレル、または少なくとも８つの変異体ＣＫＸ３アレルをさらに含んでもよい。
特定の実施形態では、変異体ＣＫＸ３アレルを：配列番号７の２２４４位もしくは配列番号８の１０９３位に対応する位置においてＣ〜Ｔ置換を含んでなる変異体ＣＫＸ３アレル；配列番号１０の２４８２位もしくは配列番号１１の１１６８位に対応する位置においてＣ〜Ｔ置換を含んでなる変異体ＣＫＸ３アレル；配列番号１３の１８９３位もしくは配列番号１４の８７６位に対応する位置においてＧ〜Ａ置換を含んでなる変異体ＣＫＸ３アレル；または配列番号１６の２１７１位もしくは配列番号１７の９８２位に対応する位置においてＣ〜Ｔ置換を含んでなる変異体ＣＫＸ３アレルから選択してもよい。
アブラナ属植物は、変異体ＣＫＸ３アレルおよび／または変異体ＣＫＸ５アレルに関してホモ接合であり得る。
このような植物は、増加した植物の主枝上のさや数もしくは花数など、増加した植物当たりの花数、増加した植物当たりのさや数または増加した千粒重（ＴＳＷ）を有していてもよい。
本発明は、本明細書に記載した変異アレルの存在を特徴とする植物の植物細胞、さや、種子、または子孫も提供する。
本発明は、アブラナ属ＣＫＸ３またはＣＫＸ５遺伝子の変異アレルをさらに提供し、該ＣＫＸ５遺伝子は：配列番号１９または配列番号２３と少なくとも９０％の配列同一性を含むヌクレオチド配列；（ｂ）配列番号２０または配列番号２３と少なくとも９０％の配列同一性を含むコード配列を含んでなるヌクレオチド配列；および配列番号２１または配列番号２４と少なくとも９０％の配列同一性を含むアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列からなる群から選択され；該ＣＫＸ３遺伝子は：配列番号７、配列番号１０、配列番号１３または配列番号１６と少なくとも９０％配列同一性を含むヌクレオチド配列；配列番号８、配列番号１１、配列番号１４または配列番号１７と少なくとも９０％配列同一性を含むコード配列を含んでなるヌクレオチド配列；および配列番号９、配列番号１２、配列番号１５または配列番号１８と少なくとも９０％配列同一性を含むアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列からなる群から選択される。
さらに別の実施形態では、
ａ．配列番号１９の４６５位または配列番号２０の４６５位に対応する位置においてＧ〜Ａ置換を含んでなる変異体ＣＫＸ５アレル；
ｂ．配列番号１９の３９９位または配列番号２０の３９９位に対応する位置においてＧ〜Ａ置換を含んでなる変異体ＣＫＸ５アレル；および
ｃ．配列番号２２の４６５ま位たは配列番号２３の３９９位に対応する位置においてＧ〜Ａ置換を含んでなる変異体ＣＫＸ５アレル；
ｄ．配列番号７の２２４４位または配列番号８の１０９３位に対応する位置においてＣ〜Ｔ置換を含んでなる変異体ＣＫＸ３アレル；
ｅ．配列番号１０の２４８２位または配列番号１１の１１６８位に対応する位置においてＣ〜Ｔ置換を含んでなる変異体ＣＫＸ３アレル；
ｆ．配列番号１３の１８９３位または配列番号１４の８７６位に対応する位置においてＧ〜Ａ置換を含んでなる変異体ＣＫＸ３アレル；
ｇ．配列番号１６の２１７１位または配列番号１７の９８２位に対応する位置においてＣ〜Ｔ置換を含んでなる変異体ＣＫＸ３アレル
からなる群から選択される変異アレルを提供する。
本発明は、次の機能的に連結したＤＮＡフラグメントを含んでなるキメラ遺伝子も提供する：
（ａ）植物発現可能なプロモーター；
（ｂ）転写された場合に１つ以上のＣＫＸ５またはＣＫＸ５およびＣＫＸ３遺伝子またはタンパク質の発現または活性を阻害するＲＮＡまたはタンパク質分子を産生するＤＮＡ領域；ならびに必要に応じて
（ｃ）転写終結およびポリアデニル化に関与する３’末端領域。
本発明のさらに別の実施形態は、生物サンプル中の、本明細書に記載の変異体ＣＫＸ５またはＣＫＸ３アレルの同定方法に関し、これは前記生物サンプル中に存在する核酸の変異体ＣＫＸ５またはＣＫＸ３の特定領域の存在を決定することを含む。
本発明のさらに別の実施形態は、アブラナ属植物、植物性素材または種子中の、本明細書に記載の変異体ＣＫＸ５またはＣＫＸ３アレルの接合性状態の決定方法に関し、これは前記植物、植物性素材または種子のゲノムＤＮＡ中の変異体および／または対応する野生型ＣＫＸ３もしくはＣＫＸ５の特定領域の存在を決定することを含む。
本発明は、少なくとも２つのプライマーのセットを含んでなり、生物サンプル中の、本明細書に記載の変異体ＣＫＸ３またはＣＫＸ５アレルの同定キットも提供し、前記セットは：
（ａ）前記プライマーの１つは変異アレルの５’または３’隣接領域を特異的に認識し、前記プライマーの他方は変異体ＣＫＸ３またはＣＫＸ５アレルの変異体領域を特異的に認識する、プライマーセット、ならびに
（ｂ）前記プライマーの１つは変異体ＣＫＸ３またはＣＫＸ５アレルの５’または３’隣接領域を特異的に認識し、前記プライマーの他方は、それぞれ、変異体ＣＫＸ３またはＣＫＸ５アレルの３’または５’隣接領域と変異体領域との間の連結領域を特異的に認識する、プライマーセット
からなる群から選択されかまたは前記キットは少なくとも１つのプローブのセットを備え、前記プローブは：
（ａ）変異体ＣＫＸ３またはＣＫＸ５アレルの変異体領域を特異的に認識するプローブ、および
（ｂ）変異体ＣＫＸ３またはＣＫＸ５アレルの変異体領域の間の３’または５’隣接領域の間の連結領域を特異的に認識するプローブ
からなる群から選択される。
（ａ）記載された方法を用いて、少なくとも１つの選択された変異体ＣＫＸ３またはＣＫＸ５アレルを含んでなる第一植物を同定すること、
（ｂ）少なくとも１つの選択された変異体ＣＫＸ３またはＣＫＸ５アレルを含まない第二植物と該第一植物とを交配し、前記交配種からＦ１雑種種子を集めること、
（ｃ）必要に応じて、記載された方法を用いて、少なくとも１つの選択された変異体ＣＫＸ３またはＣＫＸ５アレルを含んでなるＦ１植物を同定すること、
（ｄ）少なくとも１つの世代（ｘ）について、少なくとも１つの選択された変異体ＣＫＸ３またはＣＫＸ５アレルを含まない該第二植物と少なくとも１つの選択された変異体ＣＫＸ３またはＣＫＸ５アレルを含んでなる該Ｆ１植物とを戻し交配し、前記交配種からＢＣｘ種子を集めること、ならびに
（ｅ）記載された方法に従った方法を用いて、少なくとも１つの選択された変異体ＣＫＸ３またはＣＫＸ５アレルを含んでなるＢＣｘ植物を全世代において同定すること、
を含む、本明細書に記載の少なくとも１つの選択された変異体ＣＫＸ３またはＣＫＸ５アレルを１つの植物から別の植物へ移動する方法も提供する。
さらに別の実施形態では、本発明は、少なくとも１つの変異体ＣＫＸ５もしくは１つの変異体ＣＫＸ５および１つの変異体ＣＫＸ３アレルをアブラナ属植物に導入；または本明細書に記載のキメラ遺伝子をアブラナ属植物に導入することを含む、植物当たりの花数の増加方法を提供する。
さらに別の実施形態では、本発明は、少なくとも１つの変異体ＣＫＸ５もしくは１つの変異体ＣＫＸ５および１つの変異体ＣＫＸ３アレルをアブラナ属植物に導入；または本明細書に記載のキメラ遺伝子をアブラナ属植物に導入することを含む、植物当たりのさや数の増加方法を提供する。
さらに別の実施形態では、本発明は、少なくとも１つの変異体ＣＫＸ５もしくは１つの変異体ＣＫＸ５および１つの変異体ＣＫＸ３アレルをアブラナ属植物に導入；または本明細書に記載のキメラ遺伝子をアブラナ属植物に導入することを含む、ＴＳＷの増加方法を提供する。
特定の実施形態では、本発明は：
配列番号１９の４６５位または配列番号２０の４６５位に対応する位置においてＧ〜Ａ置換を含んでなる変異体ＣＫＸ５アレルを含んでなり、前記アレルを含んでなる参照種子が受託番号ＮＣＩＭＢ４２４６４で２０１５年１０月５日にＮＣＩＭＢ Ｌｉｍｉｔｅｄに寄託されている、アブラナ属植物；
配列番号１９の３９９位または配列番号２０の３９９位に対応する位置においてＧ〜Ａ置換を含んでなる変異体ＣＫＸ５アレルを含んでなり、前記アレルを含んでなる参照種子が受託番号ＮＣＩＭＢ４２４６５で２０１５年１０月５日にＮＣＩＭＢ Ｌｉｍｉｔｅｄに寄託されている、アブラナ属植物；
配列番号２２の４６５位または配列番号２３の３９９位に対応する位置においてＧ〜Ａ置換を含んでなる変異体ＣＫＸ５アレルを含んでなり、前記アレルを含んでなる参照種子が受託番号ＮＣＩＭＢ４２４６４で２０１５年１０月５日にＮＣＩＭＢ Ｌｉｍｉｔｅｄに寄託されている、アブラナ属植物；
配列番号７の２２４４位または配列番号８の１０９３位に対応する位置においてＣ〜Ｔ置換を含んでなる変異体ＣＫＸ３アレルを含んでなり、前記アレルを含んでなる参照種子が受託番号ＮＣＩＭＢ４２４６４で２０１５年１０月５日にＮＣＩＭＢ Ｌｉｍｉｔｅｄに寄託されている、アブラナ属植物；
配列番号１０の２４８２位または配列番号１１の１１６８位に対応する位置においてＣ〜Ｔ置換を含んでなる変異体ＣＫＸ３アレルを含んでなり、前記アレルを含んでなる参照種子が受託番号ＮＣＩＭＢ４２４６４で２０１５年１０月５日にＮＣＩＭＢ Ｌｉｍｉｔｅｄに寄託されている、アブラナ属植物；
配列番号１３の１８９３位または配列番号１４の８７６位に対応する位置においてＧ〜Ａ置換を含んでなる変異体ＣＫＸ３アレルを含んでなり、前記アレルを含んでなる参照種子が受託番号ＮＣＩＭＢ４２４６４で２０１５年１０月５日にＮＣＩＭＢ Ｌｉｍｉｔｅｄに寄託されている、アブラナ属植物；
配列番号１６の２１７１位または配列番号１７の９８２位に対応する位置においてＣ〜Ｔ置換を含んでなる変異体ＣＫＸ３アレルを含んでなり、前記アレルを含んでなる参照種子が受託番号ＮＣＩＭＢ４２４６４で２０１５年１０月５日にＮＣＩＭＢ Ｌｉｍｉｔｅｄに寄託されている、アブラナ属植物
からなる群から選択されるアブラナ属植物を提供する。
さらに別の実施形態では、本発明は、本明細書に記載の変異体ＣＫＸ５もしくは変異体ＣＫＸ５および変異体ＣＫＸ３アレルまたは本明細書に記載のキメラ遺伝子を使用して、アブラナ属植物における植物当たりの花数、植物当たりの花さや数を増加もしくはＴＳＷを増加させるかまたはナタネ油(oilseed rape oil)もしくはアブラナシードケーキ(oilseed rape seed cake)を製造することを提供する。
アラビドプシス・タリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）からのＡｔＣＫＸ３（配列番号３）；ＢｎＣＫＸ３−Ａ１野生型アレル（配列番号９）；ＢｎＣＫＸ３−Ａ１ ＹＩＩＮ５０１アレル（配列番号２５）；ＢｎＣＫＸ３−Ａ２野生型アレル（配列番号１２）およびＢｎＣＫＸ３−Ａ２ ＹＩＩＮ５０２アレル（配列番号２６）によりコードされたタンパク質のアミノ酸配列のアライメント。箱および矢印は表１に示したように保存モチーフおよび部位を表す。
アラビドプシス・タリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）由来のＡｔＣＫＸ３（配列番号３）；ＢｎＣＫＸ３−Ｃ１野生型アレル（配列番号１５）；ＢｎＣＫＸ３−Ｃ１ ＹＩＩＮ５２１アレル（配列番号２７）；ＢｎＣＫＸ３−Ｃ２野生型アレル（配列番号１８）およびＢｎＣＫＸ３−Ｃ１ ＹＩＩＮ５３１アレル（配列番号２８）によりコードされたタンパク質のアミノ酸配列のアライメント。箱および矢印は表１に示したように保存モチーフおよび部位を表す。
アラビドプシス・タリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）由来のＡｔＣＫＸ５（配列番号６）；ＢｎＣＫＸ５−Ａ１野生型アレル（配列番号２１）；ＢｎＣＫＸ５−Ａ１ ＹＩＩＮ８０１アレル（配列番号２９）；ＢｎＣＫＸ５−Ａ１ ＹＩＩＮ８０５アレル（配列番号３０）；ＢｎＣＫＸ３−Ｃ１野生型アレル（配列番号２４）またはＢｎＣＫＸ３−Ｃ１ ＹＩＩＮ８１１アレル（配列番号３１）によりコードされたタンパク質のアミノ酸配列のアライメント。箱および矢印は表２に示したように保存モチーフおよび部位を表す。
発明の具体的説明
一般的定義
本明細書で使用するとき、アブラナ属「果実」は、受精時成長して、発育種子を含む「（種子）さや」または「長角果」になる融合心皮からなる雌ずい群から発育するアブラナ属植物の器官を表す。
「作物」は、ブラシカ・ナプス（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）（ＡＡＣＣ、２ｎ＝３８）、ブラシカ・ユンセア（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｊｕｎｃｅａ）（ＡＡＢＢ、２ｎ＝３６）、ブラシカ・カリナタ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｃａｒｉｎａｔａ）（ＢＢＣＣ、２ｎ＝３４）、ブラシカ・ラパ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｒａｐａ）（ｓｙｎ．Ｂ．カンペストリス）（ＡＡ、２ｎ＝２０）、ブラシカ・オレラセ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅ）（ＣＣ、２ｎ＝１８）またはブラシカ・ニグラ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎｉｇｒａ）（ＢＢ、２ｎ＝１６）などの作物として栽培される植物種を表す。この定義は、アラビドプシス・タリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）などの雑草を包含しない。
本明細書で使用するとき、「アブラナ属植物」は、異質四倍体もしくは複二倍体のブラシカ・ナプス（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）（ＡＡＣＣ、２ｎ＝３８）、ブラシカ・ユンセア（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｊｕｎｃｅａ）（ＡＡＢＢ、２ｎ＝３６）、ブラシカ・カリナタ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｃａｒｉｎａｔａ）（ＢＢＣＣ、２ｎ＝３４）、または二倍体のブラシカ・ラパ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｒａｐａ）（ｓｙｎ．Ｂ．カンペストリス）（ＡＡ、２ｎ＝２０）、ブラシカ・オレラセ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅ）（ＣＣ、２ｎ＝１８）またはブラシカ・ニグラ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎｉｇｒａ）（ＢＢ、２ｎ＝１６）を表す。
本明細書で使用するとき、「アブラナ作物」は、ブラシカ・ナプス（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）、ブラシカ・ユンセア（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｊｕｎｃｅａ）、ブラシカ・カリナタ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｃａｒｉｎａｔａ）、ブラシカ・ラパ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｒａｐａ）（ｓｙｎ．Ｂ．カンペストリス）、ブラシカ・オレラセ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅ）またはブラシカ・ニグラ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎｉｇｒａ）などの作物として栽培されたアブラナを表す。
「核酸配列」（または核酸分子）という語は、一本鎖または二本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡ分子、詳細には、本発明によるタンパク質またはタンパク質フラグメントをコードするＤＮＡを表す。「内在性核酸配列」は、植物細胞内の天然の核酸配列、例えば、アブラナ属細胞の核ゲノム内に存在するＣＫＸ３またはＣＫＸ５遺伝子の内在性アレルを表す。「単離核酸配列」は、もはやその天然の環境にない、例えば、インビトロまたは組換え細菌もしくは植物細胞内の核酸配列を表すために使用する。
「遺伝子」という語は、調節領域（例えば、プロモーター）と機能的に連結した、細胞内のＲＮＡ分子中に（例えば、イントロン配列を含んでなり成熟ｍＲＮＡにスプライシングされるか、または直接イントロン配列を含まないｍＲＮＡ中に）転写される領域（転写領域）を含んでなるＤＮＡ配列を意味する。従って、遺伝子は、プロモーター、例えば、翻訳開始に関与する配列を含んでなる５’リーダー配列、（タンパク質）コード領域（ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）および、例えば、転写終結部位を含んでなる３’非翻訳配列などのいくつかの機能的に連結した配列を含んでもよい。「内在性遺伝子」は、「外来遺伝子」、「トランスジーン」または「キメラ遺伝子」と区別するために使用し、特定の植物属、種もしくは品種の植物由来の遺伝子を表し、該遺伝子は形質転換によりこの植物に導入されない（すなわち、「トランスジーン」でない）が、通常、この属、種もしくは品種の植物中に存在するか、または通常の繁殖技術もしくは体細胞雑種、例えばプロトプラスト融合により通常に存在する別の植物属、種もしくは品種の植物由来のこの植物に導入される。同様に、遺伝子の「内在性アレル」は、植物形質転換により植物もしくは植物組織に導入されないが、例えば、植物変異誘発により生成および／または植物の天然集団のスクリーニング、もしくは遺伝子ターゲティングにより得られる。
「遺伝子の発現」または「遺伝子発現」は、適切な調節領域、特にプロモーターと機能的に連結したＤＮＡ領域をＲＮＡ分子へ転写する過程を表す。それから、ＲＮＡ分子は、例えば、ＲＮＡスプライシングおよび翻訳開始およびアミノ酸鎖（タンパク質）への翻訳、および翻訳終止コドンによる翻訳終結により細胞内で（翻訳後プロセス）さらに処理される。「機能的に発現された」という語は、機能タンパク質が産生されることを示すために本明細書で使用し；「機能的に発現されない」という語は、タンパク質が著しく減少するかまたは機能性（生物活性）が得られないこと、またはタンパク質が産生されないことを示すために本明細書で使用される（さらに下記参照）。
「タンパク質」という語は、作用、大きさ、三次元構造または起源の特定モードに関係なく、アミノ酸鎖からなる分子を表す。従って、ＣＫＸ３もしくはＣＫ５タンパク質の「フラグメント」または「部分」は、まだ「タンパク質」として表してもよい。「単離タンパク質」は、もはやその天然の環境にない、例えば、インビトロまたは組換え細菌もしくは植物細胞内のタンパク質を表すために使用する。「アミノ酸」は、タンパク質および酵素の主要な基本単位である。これらは、メッセンジャーＲＮＡがリボソームにより解読されながら、遺伝コードに従ってトランスファーＲＮＡによりタンパク質に組み込まれる。タンパク質の最終的組立て中および組立て後、アミノ酸含有物はタンパク質または酵素の空間特性および生化学特性を決定づける。アミノ酸主鎖はタンパク質の一次配列を決定するが、側鎖の性質がタンパク質の特性を決定する。本明細書で使用するとき、「類似アミノ酸」は、類似アミノ酸側鎖を有するアミノ酸、すなわち、極性、非極性または実質的に中性側鎖を有するアミノ酸を表す。本明細書で使用するとき、「非類似アミノ酸」は、異なるアミノ酸側鎖を表し、例えば、極性側鎖を有するアミノ酸は非極性側鎖を有するアミノ酸と類似ではない。極性側鎖は、通常、細胞内で見られる水性環境と相互作用することができるタンパク質表面上に存在する傾向がある（「親水性」アミノ酸）。一方、「非極性」アミノ酸は、類似の非極性隣接物と相互作用することができるタンパク質の中心部内に存在する傾向がある（「疎水性」アミノ酸）。極性側鎖を有するアミノ酸の例は、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、ヒスチジン、リジン、セリン、およびスレオニンである（疎水性であるシステイン以外全て親水性である）。非極性側鎖を有するアミノ酸の例は、アラニン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、およびトリプトファンである（中性であるグリシン以外全て疎水性である）。
本明細書において、「ＣＫＸ遺伝子」という語は、サイトカイニンを酸化分解する酵素（ＥＣ１．５．９９．１２およびＥＣ１．４．３．１８）であるサイトカイニンオキシダーゼ／デヒドロゲナーゼ（ＣＫＸ）タンパク質をコードする核酸配列を表す。例えば、活性サイトカイニンイソペンテニルアデニンの分解はアデニンおよび不飽和アルデヒド、３−メチル−２−ブテナールを産生する。ＣＫＸ酵素は、ＦＡＤ依存性オキシダーゼである。
本明細書で使用するとき、「アレル（対立遺伝子）」という語は、特定の座位において遺伝子の１つ以上の代替形態のいずれかを意味する。生物の二倍体（または複二倍体）細胞では、所与の遺伝子のアレルは、染色体上の特定の位置または座位（ｌｏｃｕｓ）（複数：座位（ｌｏｃｉ））に位置する。１つのアレルは相同染色体対の各染色体上に存在する。
本明細書で使用するとき、「相同染色体」という語は、同じ生物的特徴についての情報を含み、同じ座位に同じ遺伝子だがこれらの遺伝子のありうる異なるアレルを含む染色体を意味する。相同染色体は、減数分裂中、対になる染色体である。生物の全生物的特徴を示す「非相同染色体」は１組を形成し、細胞内の組数は倍数性と呼ばれる。二倍体生物は２組の非相同染色体を含み、各相同染色体は異なる親からら受け継がれる。複二倍体種では、必須２組の二倍体ゲノムが存在し、それにより２つのゲノムの染色体は「相同染色体」と呼ばれる（同様に、２つのゲノムの座位または遺伝子は相同座位または遺伝子と呼ばれる）。二倍体、または複二倍体植物種は、特定の座位において多数の異なるアレルを含んでもよい。
本明細書で使用するとき、「ヘテロ接合の」という語は、特定の座位に２つの異なるアレルが存在するが、細胞内の対応する相同染色体対上に個々に位置する場合に存在する遺伝子条件を意味する。逆に、本明細書で使用するとき、「ホモ接合の」という語は、特定の座位に２つの同じアレルが存在するが、細胞内の対応する相同染色体対上に個々に位置する場合に存在する遺伝子条件を意味する。
本明細書で使用するとき、「座位（ｌｏｃｕｓ）」（複数：座位（ｌｏｃｉ））は、例えば、遺伝子または遺伝マーカーが見られた場合、染色体上の特定の場所（単数）もしくは場所（複数）または部位を意味する。例えば、「ＣＫＸ３−Ａ１座位」は、ＣＫＸ３−Ａ１遺伝子（および２つのＣＫＸ３−Ａ１アレル）が見られ得るＡゲノムの染色体上の位置を表し；「ＣＫＸ３−Ａ２座位」は、ＣＫＸ３−Ａ２遺伝子（および２つのＣＫＸ３−Ａ２アレル）が見られ得るＡゲノムの染色体上の位置を表し；「ＣＫＸ３−Ｃ１座位」は、ＣＫＸ３−Ｃ１遺伝子（および２つのＣＫＸ３−Ｃ１アレル）が見られ得るＣゲノムの染色体上の位置を表し；「ＣＫＸ３−Ｃ２座位」は、ＣＫＸ３−Ｃ２遺伝子（および２つのＣＫＸ３−Ｃ２アレル）が見られ得るＣゲノムの染色体上の位置を表す。同様に、「ＣＫＸ５−Ａ１座位」は、ＣＫＸ５−Ａ１遺伝子（および２つのＣＫＸ５−Ａ１アレル）が見られ得るＡゲノムの染色体上の位置を表し、一方、「ＣＫＸ５−Ｃ１座位」は、ＣＫＸ５−Ｃ１遺伝子（および２つのＣＫＸ５−Ｃ１アレル）が見られ得るＣゲノムの染色体上の位置を表す。
本発明による「植物（単数）」または「植物（複数）」を表すときはいつでも、植物部分（細胞、組織または器官、種子さや、種子、根、葉、花、花粉、他などの切断部）、自家受粉または交配、例えば、雑種種子（２つの近交系親系統の交配により得られる）、交配植物およびそれ由来の植物部分などの、親の際立った特徴を保持する該植物の子孫（特に、果実裂開特性）が、別段の指示がない限り、本明細書に包含されると理解される。
「分子アッセイ」（または試験）は、本明細書において、１つ以上のＣＫＸ３またはＣＫＸ５座位における（例えば、ブラシカ・ナプス（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）について、１つ以上のＣＫＸ３−Ａ１、ＣＫＸ３−Ａ２、ＣＫＸ３−Ｃ１、ＣＫＸ３−Ｃ２、ＣＫＸ５−Ａ１、ＣＫＸ５−Ｃ１座位）における）１つ以上の特定のＣＫＸ３またはＣＫＸ５アレルの存在または非存在を（直接的または間接的に）決定するアッセイを表す。１つの実施形態では、いずれもの個々の植物中の座位において、特定の（野生型または誘発多様体）ＣＫＸ３および／またはＣＫＸ５アレルがホモ接合かヘテロ接合かを決定することを可能とする。
本明細書で使用するとき、「野生型（ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ）」（「ｗｉｌｄｔｙｐｅ」または「ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ」とも書く）は、通常、天然にある植物または遺伝子の典型的形態を表す。「野生型植物」は、天然集団におけるこのような植物の通常の表現型を有する植物を表す。「野生型アレル」は、野生型表現型を産生するのに必要な遺伝子のアレルを表す。対照的に、「誘発多様体植物」（または「変異体植物」）は、天然集団におけるこのような植物または人の介入、例えば、変異誘発により製造した植物の異なる表現型を有する植物を表し、「誘発多様体アレル」（または「変異アレル」）は、多様体（または変異体）表現型を産生するのに必要な遺伝子のアレルを表す。
本明細書で使用するとき、「野生型ＣＫＸ３」という語は、機能的ＣＫＸ３タンパク質をコードするアブラナ科植物、特に、アブラナ属植物内で見出される天然ＣＫＸ３アレルを意味する。本明細書で使用するとき、「野生型ＣＫＸ５」という語は、機能的ＣＫＸ５タンパク質をコードするアブラナ科植物、特に、アブラナ属植物内で見出される天然ＣＫＸ５アレルを意味する。
対照的に、本明細書で使用するとき、「多様体(variant)ＣＫＸ３」（または「誘発多様体(induced variant)ＣＫＸ３」または「変異体ＣＫＸ３」）は、機能的ＣＫＸ３タンパク質をコードしないＣＫＸ３アレル、すなわち、非機能的ＣＫＸ３タンパク質をコードするＣＫＸ３アレルを表し、これは、本明細書で使用するとき、対応する野生型機能的ＣＫＸ３タンパク質と比較して生物活性がないかもしくは著しく生物活性が低下したＣＫＸ３タンパク質、または全くＣＫＸ３タンパク質をコードしないことを表す。このような「変異体ＣＫＸ３アレル」（「完全ノックアウト」または「ヌル」アレルとも呼ばれる）は、その核酸配列中に１つ以上の変異を含み、それにより、該変異（複数可）はインビボで細胞内の機能的ＣＫＸ３タンパク質量（絶対または相対）の著しい減少をもたらす野生型ＣＫＸ３アレルである。本明細書で使用するとき、「完全ノックアウトＣＫＸ３アレル」は、変異体ＣＫＸ３アレルであり、その存在が少なくともこの植物の、特にその植物の主枝上の花数および／またはさや数の増加をもたらす（変異体ＣＫＸ５アレルなどの別のＣＫＸアレルとの組合せで強力に）。同様に、本明細書で使用するとき、「多様体ＣＫＸ５」（または「誘発多様体ＣＫＸ５」または「変異体ＣＫＸ５」）は、機能的ＣＫＸ５タンパク質をコードしないＣＫＸ５アレル、すなわち、非機能的ＣＫＸ５タンパク質をコードするＣＫＸ５アレルを表し、これは、本明細書で使用するとき、対応する野生型機能的ＣＫＸ５タンパク質と比較して生物活性がないかもしくは著しく生物活性が低下したＣＫＸ５タンパク質、または全くＣＫＸ５タンパク質をコードしないことを表す。このような「変異体ＣＫＸ５アレル」（「完全ノックアウト」または「ヌル」アレルとも呼ばれる）は、その核酸配列中に１つ以上の変異を含み、それにより、該変異（複数可）はインビボで細胞内の機能的ＣＫＸ５タンパク質量（絶対または相対）の著しい減少をもたらす野生型ＣＫＸ５アレルである。本明細書で使用するとき、「完全ノックアウトＣＫＸ５アレル」は、変異体ＣＫＸ５アレルであり、その存在が少なくともこの植物の、特にその植物の主枝上の花数および／またはさや数の増加をもたらす（変異体ＣＫＸ３アレルなどの別のＣＫＸアレルとの組合せで強力に）。
ＣＫＸ３タンパク質をコードする核酸配列の変異アレルを、本明細書において「ｃｋｘ３」（例えば、ブラシカ・ナプス（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）のため、それぞれ、ｃｋｘ３−ａ１、ｃｋｘ３−ａ２、ｃｋｘ３−ｃ１またはｃｋｘ３−ｃ２）として設計する。ＣＫＸ５タンパク質をコードする核酸配列の変異アレルを、「ｃｋｘ５」（例えば、ブラシカ・ナプス（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）のため、それぞれ、ｃｋｘ５−ａ１またはｃｋｘ５−ｃ１）として設計する。変異アレルは、天然で見られる（例えば、変異原の人の応用なしに自然に産生された）変異アレルである「天然変異体」かまたは、人の介入、例えば、変異誘発により誘発された「誘発変異体」のいずれかであり得る。
「完全ノックアウト変異体ＣＫＸ３アレル」は、例えば、その核酸配列の１つ以上の変異、例えば、１つ以上のナンセンスまたはミスセンス変異を含んでなる野生型ＣＫＸ３アレルである。詳細には、このような完全ノックアウト変異体ＣＫＸ３アレルは、ＣＫＸ３タンパク質の生物活性を低下もしくは完全になくすか、またはそれにより変異は好ましく著しく少量の機能性ＣＫＸ３タンパク質しか、もしくは全くＣＫＸ３タンパク質を産生しないような、ＣＫＸ３タンパク質またはＡｔＣＫＸ３（配列番号３）の１〜３１位に対応する位置におけるアミノ酸残基を含んでなるシグナルペプチド；ＡｔＣＫＸ３（配列番号３）の６６〜２４３位に対応する位置における残基を含んでなるＦＡＤ結合領域；ＡｔＣＫＸ３（配列番号３）の１００〜１０４位に対応する位置におけるアミノ酸を含んでなるＦＡＤ結合アミノ酸残基；ＡｔＣＫＸ３（配列番号３）の１０５〜１０６位に対応する位置におけるアミノ酸を含んでなるＦＡＤ結合アミノ酸残基；ＡｔＣＫＸ３（配列番号３）の１０５位に対応する位置におけるＦＡＤ結合ヒスチジン；ＡｔＣＫＸ３（配列番号３）の１１０位に対応する位置におけるＦＡＤ結合アミノ酸；ＡｔＣＫＸ３（配列番号３）の１６７位に対応する位置におけるＦＡＤ結合アミノ酸；ＡｔＣＫＸ３（配列番号３）の１７２位に対応する位置におけるＦＡＤ結合アミノ酸；ＡｔＣＫＸ３（配列番号３）の１７８〜１８２位に対応する位置におけるＦＡＤ結合アミノ酸；ＡｔＣＫＸ３（配列番号３）の２３３位に対応する位置におけるＦＡＤ結合アミノ酸；ＡｔＣＫＸ３（配列番号３）の４７６位に対応する位置におけるＦＡＤ結合アミノ酸；ＡｔＣＫＸ３（配列番号３）の２４４〜５１７位に対応する位置におけるサイトカイニン結合アミノ酸；ＡｔＣＫＸ３（配列番号３）の３７４〜３８５位に対応する位置におけるＧＩＷｅＶＰＨＰＷＬＮＬモチーフまたはＡｔＣＫＸ３（配列番号３）の５１２〜５１７位に対応する位置におけるＰＧＱｘＩＦモチーフなどの少なくとも１つの保存モチーフを欠失する短縮ＣＫＸ３タンパク質の産生を好適にもたらす変異を含んでなる野生型ＣＫＸ３アレルである。ヌクレオチド配列をコードする完全ＣＫＸ３を取り除く欠失、またはＣＫＸ３コード領域の５’末端を含む欠失により、後者を達成してもよい。
「完全ノックアウト変異体ＣＫＸ５アレル」は、例えば、その核酸配列の１つ以上の変異、例えば、１つ以上のナンセンスまたはミスセンス変異を含んでなる野生型ＣＫＸ５アレルである。詳細には、このような完全ノックアウト変異体ＣＫＸ５アレルは、ＣＫＸ５タンパク質の生物活性を低下もしくは完全になくすか、またはそれにより変異は好ましく著しく少量の機能性ＣＫＸ５タンパク質しか、もしくは全くＣＫＸ５タンパク質を産生しないような、ＣＫＸ５タンパク質またはＡｔＣＫＸ５（配列番号６）の１〜２４位に対応する位置におけるアミノ酸残基を含んでなるシグナルペプチド；ＡｔＣＫＸ５（配列番号６）の６３〜２４１位に対応する位置における残基を含んでなるＦＡＤ結合領域；ＡｔＣＫＸ５（配列番号６）の９７〜１０１位に対応する位置におけるアミノ酸を含んでなるＦＡＤ結合アミノ酸残基；ＡｔＣＫＸ５（配列番号６）の１０２〜１０３位に対応する位置におけるアミノ酸を含んでなるＦＡＤ結合アミノ酸残基；ＡｔＣＫＸ５（配列番号６）の１０２位に対応する位置におけるＦＡＤ結合ヒスチジン；ＡｔＣＫＸ５（配列番号６）の１０７位に対応する位置におけるＦＡＤ結合アミノ酸；ＡｔＣＫＸ５（配列番号６）の１６５位に対応する位置におけるＦＡＤ結合アミノ酸；ＡｔＣＫＸ３（配列番号６）の１７０位に対応する位置におけるＦＡＤ結合アミノ酸；ＡｔＣＫＸ５（配列番号６）の１７６〜１８０位に対応する位置におけるＦＡＤ結合アミノ酸；ＡｔＣＫＸ５（配列番号６）の２３１位に対応する位置におけるＦＡＤ結合アミノ酸；ＡｔＣＫＸ５（配列番号６）の４７９位に対応する位置におけるＦＡＤ結合アミノ酸；ＡｔＣＫＸ５（配列番号６）の２４２〜５２０位に対応する位置におけるサイトカイニン結合アミノ酸；ＡｔＣＫＸ５（配列番号６）の３７４〜３８５位に対応する位置におけるＧＩＷｅＶＰＨＰＷＬＮＬモチーフまたはＡｔＣＫＸ５（配列番号６）の５１５〜５２０位に対応する位置におけるＰＧＱｘＩＦモチーフなどの少なくとも１つの保存モチーフを欠失する短縮ＣＫＸ５タンパク質の産生を好適にもたらす変異を含んでなる野生型ＣＫＸ５アレルである。ヌクレオチド配列をコードする完全ＣＫＸ５を取り除く欠失、またはＣＫＸ５コード領域の５’末端を含む欠失により、後者を達成してもよい。
本発明に従って、「対応する位置」または「位（置）に対応する位置」は、ヌクレオチド／アミノ酸は指定した番号は異なるが、なお類似の隣接するヌクレオチド／アミノ酸を有し得ると理解するものとする。交換、欠失または付加され得る前記ヌクレオチド／アミノ酸も、用語「対応する位置」に含まれる。参照配列は、アラビドプシス・タリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）由来のＡｔＣＫＸ３またはＡｔＣＫＸ５配列であってもよい。アラビドプシス・タリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）由来のＣＫＸ３およびＣＫＸ５タンパク質の参照アミノ酸配列間の一致の表を、ブラシカ・ナプス（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）由来のＣＫＸ３およびＣＫＸ５タンパク質のアミノ酸配列と共に表１および２中に提供する。
所与のＣＫＸ３またはＣＫＸ５ヌクレオチド／アミノ酸配列中のヌクレオチド残基またはアミノ酸残基が別のＣＫＸ３またはＣＫＸ５ヌクレオチドまたはアミノ酸配列のヌクレオチド配列の特定の位置に対応するどうかを決定するために、当業者は、当技術分野において周知の手段および方法、例えば、手動またはベーシックローカルアライメントサーチツールを表すＢＬＡＳＴ（Altschul et al. (1990), Journal of Molecular Biology, 215, 403-410）もしくはＣｌｕｓｔａｌＷ（Thompson et al. (1994), Nucleic Acid Res., 22, 4673-4680）もしくは配列アライメント生成に適切な他の適切なプログラムなどのコンピュータプログラムのいずれかによるアライメントを使用することができる。アラビドプシス属およびアブラナ属ＣＫＸ３またはＣＫＸ５アミノ酸配列のアライメントについては、例えば、図１〜３参照。
「機能的ＣＫＸ３またはＣＫＸ５タンパク質の著しく低下した量」は、変異体ＣＫＸ３またはＣＫＸ５アレルを含まない細胞により産生された機能タンパク質量と比較したとき、変異体ＣＫＸアレルを含んでなる細胞により産生された、それぞれ、機能ＣＫＸ３またはＣＫＸ５タンパク質量を少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または１００％（すなわち、機能ＣＫＸ３またはＣＫＸ５タンパク質が細胞内で産生されない）減少することを表す。この定義は、インビボで生物活性を有しない「非機能」ＣＫＸ３もしくはＣＫＸ５タンパク質（例えば、短縮ＣＫＸ３またはＣＫＸ５タンパク質）の産生、機能ＣＫＸ３もしくはＣＫＸ５タンパク質の絶対量の減少（例えば、ＣＫＸ３またはＣＫＸ５遺伝子中の変異が理由で機能ＣＫＸ３またはＣＫＸ５タンパク質が作られない）、機能野生型タンパク質の活性と比較して著しく低下した生物活性を有するＣＫＸ３もしくはＣＫＸ５タンパク質（コードされたＣＫＸ３またはＣＫＸ５タンパク質の生物活性に不可欠である１つ以上のアミノ酸残基が別のアミノ酸残基の代わりになるＣＫＸ３またはＣＫＸ５タンパク質など）の産生および／または他の機能および／もしくは部分的機能ＣＫＸ３もしくはＣＫＸ５タンパク質に対するドミナントネガティブＣＫＸ３もしくはＣＫＸ５タンパク質の悪影響を包含する。
本明細書で使用するとき、「変異体ＣＫＸ３またはＣＫＸ５タンパク質」という語は、変異体ＣＫＸ３もしくはＣＫＸ５核酸配列によりコードされたＣＫＸ３もしくはＣＫＸ５タンパク質（「ｃｋｘ３またはｃｋｘ５アレル」）を表し、これにより、変異は、非変異体、野生型ＣＫＸ３もしくはＣＫＸ５配列によりコードされたＣＫＸ３もしくはＣＫＸ５タンパク質（それぞれ、「ＣＫＸ３アレル」、「ＣＫＸ５アレル」）の活性と比較して、インビボでのＣＫＸ３もしくはＣＫＸ５活性を著しく低下させ、および／または全くＣＫＸ３もしくはＣＫＸ５活性をなくす。
本明細書で使用するとき、「変異誘発」または「誘発多様性」は、植物細胞（例えば、複数のアブラナ属種子または花粉、他などの他の部分）を、化学物質（エチルメチルスルホネート（ＥＭＳ）、エチルニトロソ尿素（ＥＮＵ）、他）または電離放射線（中性子（高速中性子変異誘発、他など））、アルファ線、ガンマ線（コバルト６０源により供給されるなど）、Ｘ線、ＵＶ照射、他）、またはこれら２つ以上の組合せなどの変異誘発要因との接触など、細胞のＤＮＡ中の変異を誘発する技術に付す。従って、１つ以上のＣＫＸアレルの所望の変異誘発を、１つ以上の植物組織をエチルメチルスルホネート（ＥＭＳ）、エチルニトロソ尿素、他と接触させることによるなどの化学的手法の使用、Ｘ線、他などの物理的手法の使用、またはコバルト６０源により供給されるなどのガンマ線照射により行ってもよい。放射線照射により生じた変異が、大きな欠失または転座もしくは複雑な再配列などの他の肉眼的病斑（gross lesions）であることが多いが、化学的変異誘発により生じた変異は点変異などのより離散した病斑（lesions）であることが多い。例えば、ＥＭＳはグアニン塩基をアルキル化し、これは塩基不対合形成をもたらす：アルキル化グアニンはチミン塩基と対になり、Ｇ／ＣからＡ／Ｔへの転移を一次的にもたらす。変異誘発後、アブラナ属植物を、公知技術を用いて処理細胞から再生する。例えば、得られたアブラナ属種子を、従来の栽培手順に従って植えてもよく、自家受粉後、種子を植物上に生成する。あるいは、倍加半数体栄養分体を抽出して、例えば、Ｃｏｖｅｎｔｒｙら（1988, Manual for Microspore Culture Technique for Brassica napus. Dep. Crop Sci. Techn. Bull. OAC Publication 0489. Univ. of Guelph, Guelph, Ontario, Canada）により記載されているように、ホモ接合植物を直ぐに生成してもよい。現在または次世代におけるこのような自家受粉の結果として生成する追加の種子を収穫し、変異体ＣＫＸアレルの存在をスクリーニングしてもよい。特定の変異アレルをスクリーニングするいくつかの技術は公知である、例えば、Ｄｅｌｅｔｅａｇｅｎｅ（商標）（Delete-a-gene;Li et al., 2001, Plant J 27: 235-242）はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）アッセイを使用して高速中性子変異誘発により生じた欠失変異体をスクリーニングする；ＴＩＬＬＩＮＧ（ゲノム内標的誘発局部病斑；McCallum et al., 2000, Nat Biotechnol 18:455-457）はＥＭＳ誘発点変異を同定する、他。特定の変異体ＣＫＸ３またはＣＫＸ５アレルの存在をスクリーニングするさらなる技術は、以下の実施例に記載している。変異誘発は、ランダム変異誘発を含んでなることができ、または標的変異誘発を含んでなることができる。変異誘発は、エピジェネティックサイレンシングを引き起こすエピ変異ももたらし得る。
「遺伝子ターゲティング」という語は、本明細書において、相同組換え、誤対合修復または部位特異的変異誘発などの機構を使用する措定遺伝子組み換えを表す。内在性配列または植物細胞に前以て導入された配列を置換、挿入および欠失するために方法を使用することができる。遺伝子ターゲティングのための方法は、例えば、国際公開第２００６／１０５９４６号または国際公開第２００９／００２１５０号で見ることができる。
本明細書で使用するとき、植物に関連して使用する場合、「非天然」または「栽培した」は、人により改変されたゲノムを有する植物を意味する。トランスジェニック植物は、例えば、外来性核酸分子、例えば、転写される場合にＣＫＸ３またはＣＫＸ５遺伝子などの内在性遺伝子の発現を減少させることができる生物活性ＲＮＡ分子を産生する転写領域を含んでなるキメラ遺伝子を含有する非天然植物であり、従って、人により遺伝的に改変されている。加えて、変異誘発要因に暴露した結果として、内在性遺伝子中の変異、例えば、内在性ＣＫＸ３またはＣＫＸ５遺伝子（例えば、調節エレメントまたはコード配列中）を含有する植物も、人により遺伝的に改変されているので、非天然植物と見なす。さらに、例えば、その植物の、ブラシカ・ユンセア（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｊｕｎｃｅａ）またはブラシカ・ラパ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｒａｐａ）などの同じまたは別の種の植物を用いてマーカー利用育種および選抜または遺伝子移入などの指定育種方法の結果としてその特定の植物種で自然に起こらない、内在性遺伝子、例えば、内在性ＣＫＸ３またはＣＫＸ５遺伝子中の変異を含有する、ブラシカ・ナプス（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）などの特定の種の植物も非天然植物と見なす。対照的に、自然または天然変異のみ含有する植物、すなわち、人により遺伝的に改変していない植物は、本明細書で定義する「非天然植物」ではなく、従って、本発明に含まれない。非天然植物は、通常、天然植物と比較して変更されたヌクレオチド配列を有するが、非天然植物を、例えば、そのメチル化パターンの改変によりそのヌクレオチド配列を変更することなく、人により遺伝的に改変することができると当業者は理解する。
遺伝子またはタンパク質の「オルソログ」という語は、本明細書において、遺伝子またはタンパク質と同じ機能を有するが、（通常）種が、多様化遺伝子（すなわち、種分化により共通祖先から進化した遺伝子）を有する時点から配列において多様化している別の種で見られる相同遺伝子またはタンパク質を表す。従って、ブラシカ・ナプス（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）ＣＫＸ３またはＣＫＸ５遺伝子のオルソログを、配列比較（例えば、配列全体または特定のドメイン上の配列同一性割合に基づいて）および／または機能分析の両方に基づいて、他の植物種（例えば、他のアブラナ科植物などの他のさや植物種、またはファセオルス（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ）種、もしくはダイズ（グリシン・マックス（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ）などのマメ科植物）において同定してもよい。
本明細書において、「品種（variety）」をＵＰＯＶ条約に準拠して使用し、最も低い公知のランクの単一の植物分類群内の植物グループ分けを表し、このグループ分けを所与の遺伝型または遺伝型の組合せから得られた特徴の発現により定義することができ、前記特徴の少なくとも１つの発現により他の植物グループ分けから区別することができ、伝搬不変（安定）であるためのその適性に関して単位として見なす。
「含んでなる」という語は、指定した部分、工程または構成要素の存在を規定すると解釈されるが、１つ以上の追加の部分、工程または構成要素の存在を排除しないものとする。従って、特定の形質を含んでなる植物は、追加の形質を含んでもよい。
単数の単語（例えば、植物または根）を表す場合、本明細書において、複数も含まれる（たとえば、複数の植物、複数の根）と理解される。従って、不定冠詞「ａ」または「ａｎ」により要素を表すのは、文脈が１つおよび１つだけの要素があることを明白に必要としない限り、１つより多い要素が存在する可能性を排除しない。従って、不定冠詞「ａ」または「ａｎ」は、通常、「少なくとも１つ」を意味する。
本発明の目的のため、パーセントで表した、２つの関連するヌクレオチドまたはアミノ酸配列の「配列同一性」は、比較した位置の数により割られた、同一の残基を有する２つの最適に配列された配列の位置の数（×１００）を表す。不一致、すなわち、残基が１つの配列に存在するが、他方には存在しないアライメントの位置は、非同一性残基を含む位置として見なされる。２つの配列の「最適アライメント」を、Ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｏｐｅｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｓｕｉｔｅ（EMBOSS, Rice et al., 2000, Trends in Genetics 16(6): 276-277；例えば、http://www.ebi.ac.uk/emboss/align/index.html参照）のＮｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈグローバルアライメントアルゴリズム（Needleman and Wunsch, 1970, J Mol Biol 48(3):443-53）に従って、初期設定（ギャップオープニングペナルティ＝１０（ヌクレオチド）／１０（タンパク質）およびギャップエクステンションペナルティ＝０．５（ヌクレオチド）／０．５（タンパク質））を用いて、全長にわたって２つの配列をアライメントすることにより見出す。ヌクレオチドに対しては使用する初期スコアマトリックスはＥＤＮＡＦＵＬＬであり、タンパク質に対して初期スコアマトリックスはＥＢＬＯＳＵＭ６２である。
本明細書で使用するとき、「実質的に同一」または「本質的に類似」は、上記定義の通り最適にアライメントする場合、（さらに下記の定義の通り）配列同一性の特定の最小割合を共有する配列を表す。
「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、所与のヌクレオチド配列と実質的に同一であるヌクレオチド配列を同定するために使用することができる。ストリンジェントな条件は配列依存性であり、異なる環境においては異なるだろう。概して、ストリンジェントな条件は、規定されたイオン強度およびｐＨにおいて特定の配列に対して熱融点（Ｔｍ）より約５℃低くなるように選択される。このＴｍは標的配列の５０％が完全に適正なプローブにハイブリダイズする温度（規定のイオン強度およびｐＨ下）である。通常、塩濃度がｐＨ７で約０．０２モル濃度であり、温度が少なくとも６０℃であるストリンジェントな条件が選択されるだろう。塩濃度を低くし、および／または温度を高くするとストリンジェンシーは高くなる。ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーションのためのストリンジェントな条件（例えば、１００ｎｔのプローブを用いたノーザンブロット）は、例えば、６３℃で２０分間、０．２Ｘ ＳＳＣにおいて少なくとも１回の洗浄、または均等な条件を含むものである。
「高ストリンジェントな条件」を、例えば、６ｘ ＳＳＣ（２０ｘ ＳＳＣは３．０Ｍ ＮａＣｌ、０．３Ｍ クエン酸Ｎａを含有する、ｐＨ７．０）、５ｘデンハート液（１００Ｘデンハート液は２％フィコール、２％ポリビニルピロリドン、２％ウシ血清アルブミンを含有する）、０．５％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ），および非特異的競合物として２０μｇ／ｍｌ変性キャリアＤＮＡ（一本鎖魚の精子ＤＮＡ、１２０〜３０００ヌクレオチドの平均長）を含有する水溶液中、６５℃でハイブリダイゼーションすることにより提供することができる。ハイブリダイゼーション後、高ストリンジェントな洗浄を、０．２〜０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、ハイブリダイゼーション温度における最終洗浄（約３０分）を含む複数の段階で行ってもよい。
「中程度にストリンジェントな条件」は、上記溶液中だが、約６０〜６２℃のハイブリダイゼーションと均等な条件を表す。中程度にストリンジェントな洗浄を、１ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、ハイブリダイゼーション温度において行ってもよい。
「低ストリンジェンシー」は、上記溶液中だが、約５０〜５２℃のハイブリダイゼーションと均等な条件を表す。低ストリンジェントな洗浄を、２ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、ハイブリダイゼーション温度において行ってもよい。Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）およびＳａｍｂｒｏｏｋとＲｕｓｓｅｌｌ（２００１）も参照。
「収量増加（Increased yield）」または「収穫量増加（increased harvested yield）」または「種子または子実収量（yield）増加」は、変異体ＣＫＸ５またはＣＫＸ３／ＣＫＸ５アレルを有しない同質遺伝型植物の同様の量から収穫された種子または子実の量と比較した場合、各々が本発明による変異体ＣＫＸ５またはＣＫＸ３／ＣＫＸ５アレルを含んでなる複数の植物から収穫されたより大量の種子または子実を表す。収量は、通常、ブッシェル／エーカーまたはｋｇ／ｈａ（ヘクタール）（グラム／試験やさらにグラム／植物など他の単位も使用してもよいが）などの面単位当たりの収穫された種子または子実の体積単位で表される。収量増加は、通常、パーセントで表され、これにより、参照またはコントロール植物の収量を１００％として、本発明による植物の収量はコントロール植物の収量に対して％で表される。収量増加は、少なくとも１０１％、少なくとも１０２％、少なくとも１０３％、少なくとも１０５％、少なくとも１０８％、少なくとも１１０％の収量であり得る。
「（種子の）千粒重（ＴＳＷ）」は、１０００個の種子または子実のグラム重量を表す。「千粒重増加」は、変異体ＣＫＸ５またはＣＫＸ３／ＣＫＸ５アレルを有しない同質遺伝型植物の同様の数から収穫された１０００個の種子または子実の重量と比較した場合、本発明による変異体ＣＫＸ５またはＣＫＸ３／ＣＫＸ５アレルを含んでなる植物から収穫された１０００個の種子のより大きな重量を表す。
「花数増加」または「主枝上の花数増加」は、植物上の花数、植物、好ましくは、変異体体ＣＫＸ５またはＣＫＸ３／ＣＫＸ５アレルを有しない同質遺伝型植物の主枝上のそれぞれにより大きな花数と比較した場合、植物上のより大きな花数、本発明による変異体ＣＫＸ５またはＣＫＸ３／ＣＫＸ５アレルを含んでなる植物の主枝上のそれぞれにより大きな花数を表す。
「さや数増加」または「主枝上のさや数増加」は、植物上のさや数、変異体体ＣＫＸ５またはＣＫＸ３／ＣＫＸ５アレルを有しない植物（同質遺伝型植物など）の主枝上のそれぞれにより大きなさや数と比較した場合、植物上のより大きなさや数、本発明による変異体ＣＫＸ５またはＣＫＸ３／ＣＫＸ５アレルを含んでなる植物の主枝上のそれぞれにより大きなさや数を表す。
詳細な説明
二倍体先祖由来のその起源によって本質的に２つの二倍体ゲノム（ＡおよびＣゲノム）を含む異質四倍体（複二倍体）種である、ブラシカ・ナプス（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）（ゲノムＡＡＣＣ、２ｎ＝４ｘ＝３８）。ブラシカ・ナプス（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）は、そのゲノム内に４つのＣＫＸ３遺伝子を含んでなる：２つのＣＫＸ３遺伝子はＡゲノム（以後、ＣＫＸ３−Ａ１およびＣＫＸ３−Ａ２と呼ぶ）上に位置し、２つのＣＫＸ３遺伝子はＣゲノム（以後、ＣＫＸ３−Ｃ１およびＣＫＸ３−Ｃ２と呼ぶ）上に位置する。ブラシカ・ナプス（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）は、そのゲノム内に２つのＣＫＸ５遺伝子を含んでなる：１つのＣＫＸ５遺伝子はＡゲノム（以後、ＣＫＸ５−Ａ１と呼ぶ）上に位置し、１つのＣＫＸ５遺伝子はＣゲノム（以後、ＣＫＸ５−Ｃ１と呼ぶ）上に位置する。ＣＫＸ５の変異アレルまたはＣＫＸ５およびＣＫＸ３の変異アレルの存在が植物当たりの花数、詳細には、主枝上の花数を増加させることは、本発明者らにより見出された。主枝上のさや数も増加させることができ、同様に、主枝上のさや当たりの種子数も増加させることができる。さらに、千粒重（ＴＳＷ）の増加を達成することができ、特に、種子収量に対する有意な負の効果なくより高いＴＳＷを達成することができる。
本出願は、ＣＫＸ５またはＣＫＸ５およびＣＫＸ３の発現が機能的に減少するアブラナ属植物に関する。機能的に減少した発現は、ＣＫＸ３／ＣＫＸ５タンパク質産生および／または活性の減少であり得る。
従って、第一態様では、そのゲノム内に少なくとも１つの変異体ＣＫＸ５アレルを含んでなることを特徴とする、少なくとも１つ、好ましくは２つのＣＫＸ５遺伝子を含んでなるアブラナ属植物を提供する。さらなる態様では、そのゲノム内に少なくとも１つの変異体ＣＫＸ５アレルおよび１つの変異体ＣＫＸ３を含んでなることを特徴とする、少なくとも１つのＣＫＸ５および少なくとも２つのＣＫＸ３遺伝子、好ましくは２つのＣＫＸ５遺伝子および４つのＣＫＸ３遺伝子を含んでなるアブラナ属植物を提供する。
さらなる態様では、変異体ＣＫＸ３アレルは：
−配列番号７、配列番号１０、配列番号１３または配列番号１６と少なくとも９０％配列同一性を含むヌクレオチド配列；
−配列番号８、配列番号１１、配列番号１４または配列番号１７と少なくとも９０％配列同一性を含むコード配列を含んでなるヌクレオチド配列；および
−配列番号９、配列番号１２、配列番号１５または配列番号１８と少なくとも９０％配列同一性を含むアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；および
変異体ＣＫＸ５アレルは、以下からなる群から選択される核酸配列を含んでなるＣＫＸ遺伝子の変異アレルである：
−配列番号１９または配列番号２３と少なくとも９０％配列同一性を含むヌクレオチド配列；
−配列番号２０または配列番号２３と少なくとも９０％配列同一性を含むコード配列を含んでなるヌクレオチド配列；および
−配列番号２１または配列番号２４と少なくとも９０％配列同一性を含むアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列
からなる群から選択される核酸配列を含んでなるＣＫＸ３遺伝子の変異アレルである。
さらなる態様では、本発明による植物は、２つのＣＫＸ５遺伝子および４つのＣＫＸ３遺伝子を含んでなるアブラナ属植物であり、前記アブラナ属植物は、ブラシカ・ナプス（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）、ブラシカ・ユンセア（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｊｕｎｃｅａ）およびブラシカ・カリナタ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｃａｒｉｎａｔａ）からなる群から選択される。別の実施形態では、本発明による植物は、少なくとも２つの変異体ＣＫＸ５アレル、または少なくとも３つの変異体ＣＫＸ５アレルまたは少なくとも４つの変異体ＣＫＸ５アレル、または少なくとも２つ、３つまたは４つの変異体ＣＫＸ５アレルおよび３つの変異体ＣＫＸ３アレル、または少なくとも４つの変異体ＣＫＸ３アレル、または少なくとも５つの変異体ＣＫＸ３アレル、または少なくとも６つの変異体ＣＫＸ３アレル、または少なくとも７つの変異体ＣＫＸ３アレル、または少なくとも８つの変異体ＣＫＸ３アレルを含んでなることを含む。
さらに別の実施形態では、本発明による植物は：
−配列番号１９の４６５位または配列番号２０の４６５位に対応する位置においてＧ〜Ａ置換を含んでなる変異体ＣＫＸ５アレル；
−配列番号１９の３９９位または配列番号２０の３９９位に対応する位置においてＧ〜Ａ置換を含んでなる変異体ＣＫＸ５アレル；
−配列番号２２の４６５位または配列番号２３の３９９位に対応する位置においてＧ〜Ａ置換を含んでなる変異体ＣＫＸ５アレル；
または植物は以下からなる群から選択される変異体ＣＫＸ３アレルを含んでなる：
−配列番号７の２２４４位または配列番号８の１０９３位に対応する位置においてＣ〜Ｔ置換を含んでなる変異体ＣＫＸ３アレル；
−配列番号１０の２４８２位または配列番号１１の１１６８位に対応する位置においてＣ〜Ｔ置換を含んでなる変異体ＣＫＸ３アレル；
−配列番号１３の１８９３位または配列番号１４の８７６位に対応する位置においてＧ〜Ａ置換を含んでなる変異体ＣＫＸ３アレル；
−配列番号１６の２１７１位または配列番号１７の９８２位に対応する位置においてＣ〜Ｔ置換を含んでなる変異体ＣＫＸ３アレル
からなる群から選択される変異体ＣＫＸ５アレルを含んでなる。
さらに別の実施形態では、本発明による植物は、少なくとも１つの多様体ＣＫＸ５タンパク質を含んでなり、該多様体ＣＫＸ５タンパク質は：
−配列番号２９に記載のアミノ酸配列；
−配列番号３０に記載のアミノ酸配列；または
−配列番号３１に記載のアミノ酸配列
から選択されるアミノ酸配列からなる。
該多様体ＣＫＸ５タンパク質に加えて、本発明による植物は、少なくとも１つの多様体ＣＫＸ３タンパク質を含んでなり、該多様体ＣＫＸ３タンパク質は：
−配列番号２５に記載のアミノ酸配列；
−配列番号２６に記載のアミノ酸配列；
−配列番号２７に記載のアミノ酸配列；または
−配列番号２８に記載のアミノ酸配列
から選択されるアミノ酸配列からなる。
またさらなる実施形態では、前記植物は変異体ＣＫＸ５アレルに対してホモ接合であるかまたは変異体ＣＫＸ５および変異体ＣＫ３アレルの両方に対してホモ接合である。さらに別の実施形態では、前記植物は、植物当たり花数が増加している。さらに別の実施形態では、前記植物は、植物当たりさや数が増加している。さらに別の実施形態では、前記植物は、ＴＳＷが増加している。
さらなる実施形態は、本発明による植物の植物細胞、さや、種子または子孫を提供する。
さらに別の実施形態では、少なくとも１つのＣＫＸ５遺伝子または少なくとも１つのＣＫＸ５および少なくとも１つのＣＫＸ３遺伝子の発現が減少する、アブラナ属植物を提供する。例えば、１つ以上のＣＫＸ５またはＣＫＸ５およびＣＫＸ３遺伝子の発現を阻害するＲＮＡを産生するＤＮＡ領域を含んでなる前記植物内へキメラ遺伝子を導入することにより、発現を減少させることができる。１つの実施形態では、前記植物はキメラ遺伝子、次の機能的に連結したＤＮＡフラグメントを含んでなるキメラ遺伝子を含んでなる：
ｉ．植物発現可能なプロモーター；
ｉｉ．転写された場合に１つ以上のＣＫＸ５またはＣＫＸ５およびＣＫＸ３遺伝子の発現を阻害するＲＮＡまたはタンパク質分子を産生するＤＮＡ領域；ならびに必要に応じて
ｉｉｉ．転写終結およびポリアデニル化に関与する３’末端領域。
前記ＤＮＡ領域は、コサプレッションによる１つ以上のＣＫＸ５またはＣＫＸ３遺伝子の発現を下方制御可能であるセンスＲＮＡ分子を産生し得る。転写されたＤＮＡ領域は、転写または転写後の標的植物または植物細胞内のＣＫＸ５またはＣＫＸ３遺伝子の発現を減少可能であるいわゆるセンスＲＮＡ分子を転写時に産生するだろう。転写されたＤＮＡ領域（および得られたＲＮＡ分子）は、植物細胞または植物に存在する１つ以上のＣＫＸ５またはＣＫＸ３遺伝子のヌクレオチド配列の部分と少なくとも９５％配列同一性を有する、好ましくは同一である少なくとも１９または２０連続のヌクレオチドを含んでなる。従って、このＤＮＡ領域は、ＣＫＸ３阻害性ＲＮＡについては配列番号７、８、１０、１１、１３、１４、１６または１７および／またはＣＫＸ５阻害性ＲＮＡについては配列番号１９、２０、２２または２３のヌクレオチド配列の少なくとも１９または２０連続のヌクレオチドを含んでなる。
前記ＤＮＡ領域は、１つ以上のＣＫＸ５またはＣＫＸ３遺伝子の発現を下方制御可能であるアンチセンスＲＮＡ分子も産生し得る。転写されたＤＮＡ領域は、転写または転写後の標的植物または植物細胞内のＣＫＸ５またはＣＫＸ３遺伝子の発現を減少可能であるいわゆるアンチセンスＲＮＡ分子を転写時に産生するだろう。転写されたＤＮＡ領域（および得られたＲＮＡ分子）は、植物細胞または植物に存在する１つ以上の機能ＣＫＸ５またはＣＫＸ３遺伝子のヌクレオチド配列の補体と少なくとも９５％配列同一性を有する少なくとも２０連続のヌクレオチドを含んでなる。従って、このＤＮＡ領域は、ＣＫＸ３阻害性ＲＮＡについては配列番号７、８、１０、１１、１３、１４、１６または１７および／またはＣＫＸ５阻害性ＲＮＡについては配列番号１９、２０、２２または２３のヌクレオチド配列の補体の少なくとも１９または２０連続のヌクレオチドを含んでなる。
ＣＫＸ５またはＣＫＸ３遺伝子の約２０ｎｔのアンチセンスまたはセンスＲＮＡ領域の最小ヌクレオチド配列は、２０ｎｔ〜標的遺伝子の大きさと同じ長さの大きさで変わるより大きなＲＮＡ分子内を構成し得る。従って、言及したアンチセンスまたはセンスヌクレオチド領域は、２１ｎｔ、４０ｎｔ、５０ｎｔ、１００ｎｔ、２００ｎｔ、３００ｎｔ、５００ｎｔ、１０００ｎｔ、またはさらに約１３００ｎｔなど、約２１ｎｔ〜約１３００ｎｔ長またはそれ以上の長さであり得る。さらに、本発明の目的のため、使用する阻害性ＣＫＸ５もしくはＣＫＸ３ ＲＮＡ分子のヌクレオチド配列またはトランスジーンのコード領域は、その発言が植物細胞内で減少させる標的である外来性ＣＫＸ５もしくはＣＫＸ３遺伝子と完全に同一であるかまたは相補性であることは必要としない。配列がより長いほど、全配列同一性のための必要条件はよりストリンジェントでない。従って、センスまたはアンチセンス領域は、外来性ＣＫＸ５もしくはＣＫＸ３遺伝子またはその補体のヌクレオチド配列と約４０％または５０％または６０％または７０％または８０％または９０％または１００％全配列同一性を有し得る。しかしながら、言及したように、アンチセンスまたはセンス領域は、外来性ＣＫＸ５またはＣＫＸ３遺伝子のヌクレオチド配列と約９５〜約１００％の配列同一性を有する２０連続のヌクレオチドのヌクレオチド配列を含んでなるべきである。約９５〜約１００％配列同一性の伸展は、約５０、７５または１００ｎｔであり得る。言及した長さおよび配列同一性間の全ての組合せを、センスおよび／またはアンチセンス配向の両方で行うことができるは明白であろう。
上記キメラ遺伝子がアンチセンスＲＮＡまたはセンスＲＮＡ媒介遺伝子発現レベル下方制御する効率を、異常非ポリアデニル化ＣＫＸ５またはＣＫＸ３阻害性ＲＮＡ分子の発現をもたらすＤＮＡ要素の含有によりさらに増強し得る。この目的に適切な１つのこのようなＤＮＡ要素は、国際公開第００／０１１３３号に記載されているように、自己スプライシングリボザイムをコードするＤＮＡ領域である。この効率は、国際公開第０３／０７６６１９号に記載されているように、核局在化または保留シグナルを有する生成したＲＮＡ分子を提供することによっても増強し得る。
前記ＤＮＡ領域は、ＣＫＸ５またはＣＫＸ３遺伝子発現を下方制御可能な二本鎖ＲＮＡ分子も産生し得る。ＤＮＡ領域の転写時、センスおよびアンチセンス領域間の従来の塩基対によりｄｓＲＮＡ分子を生成することができ、これにより、センスおよびアンチセンス領域は以前に記載したヌクレオチド配列になる。本発明による、ｄｓＲＮＡコードＣＫＸ５またはＣＫＸ３発現減少キメラ遺伝子は、例えば、国際公開第９９／５３０５０号（参照により本明細書に組み入れられる）の開示に従えば、センスおよびアンチセンスＲＮＡ領域間のスペーサー配列中に位置する異種イントロンなどのイントロンをさらに含み得る。このようなトランスジーンを構築するために、国際公開第０２／０５９２９４（Ａ１）号に記載のベクターを使用することができる。
前記ＤＮＡは、ＣＫＸ５またはＣＫＸ３ ｍＲＮＡの切断を導くことが可能なｍｉＲＮＡになるプレｍｉＲＮＡ分子も産生し得る。ｍｉＲＮＡは、植物内だが、他の真核生物内でも遺伝子発現を調節する内在性低分子ＲＮＡである。植物では、これら約２１ヌクレオチド長ＲＮＡを、ＤＩＣＥＲＬＩＫＥ１（ＤＣＬ１）の切断活性により内在性長プレｍｉＲＮＡのステムループ領域から処理する。植物ｍｉＲＮＡは、保存標的ｍＲＮＡと充分に相補性であり、これらの標的の切断を導く。ｍｉＲＮＡは、とりわけ、発現において関与する経路の複雑なネットワークの遺伝子発現を調節する際の主要成分であると思われる。
本明細書で使用するとき、「ｍｉＲＮＡ」は、ＲＩＳＣ複合体に積み込まれ標的ＲＮＡ分子の切断を指示することができる約２０〜２２ヌクレオチド長のＲＮＡ分子であり、この標的ＲＮＡ分子はｍｉＲＮＡ分子のヌクレオチド配列を本質的に相補するヌクレオチド配列を含んでなり、それにより、１つ以上の次のミスマッチが起こり得る：
−前記ｍｉＲＮＡの５’末端におけるヌクレオチドと、標的ＲＮＡ分子中の対応するヌクレオチド配列との間のミスマッチ；
−前記ｍｉＲＮＡの１位〜９位におけるヌクレオチドのいずれか１つと、標的ＲＮＡ分子中の対応するヌクレオチド配列との間のミスマッチ；
−前記ｍｉＲＮＡの１２位〜２１位におけるヌクレオチドのいずれか１つと、標的ＲＮＡ分子中の対応するヌクレオチド配列との間の３つのミスマッチであるが、但し、連続したミスマッチは２つまでしかない；
−ｍｉＲＮＡの１０位および１１位においてミスマッチは許されない（全てのｍｉＲＮＡの位置はｍｉＲＮＡ分子の５’末端から始まるように指示される）。
本明細書で使用するとき、「プレｍｉＲＮＡ」分子は、ｄｓＲＮＡステムおよび一本鎖ＲＮＡループを含んでなり、二本鎖ＲＮＡステム中にｍｉＲＮＡのヌクレオチド配列およびｍｉＲＮＡ＊のその補体配列をさらに含んでなる二次構造の形をとることができる約１００〜約２００ヌクレオチド、好ましくは約１００〜約１３０ヌクレオチドのＲＮＡ分子である。好ましくは、ｍｉＲＮＡおよびその補体は、ｍｉＲＮＡ ｄｓＲＮＡステムの遊離端から約１０〜約２０ヌクレオチドに位置する。一本鎖ループ領域の長さおよび配列は重要ではなく、例えば、３０〜５０ｎｔ長で大幅に変わってもよい。好ましくは、不対および対ＲＮＡ構造間の自由エネルギー差は、−２０〜−６０ｋｃａｌ／モル、特に約−４０ｋｃａｌ／モルである。ｍｉＲＮＡとｍｉＲＮＡ＊との間の相補性は完璧である必要はなく、不対ヌクレオチドの１〜３バルジは許容され得る。ＲＮＡ分子が形をとる二次構造を、ｍＦｏｌｄ、ＵＮＡＦｏｌｄおよびＲＮＡＦｏｌｄなどの当技術分野で常用のコンピューターアルゴリズムにより予測することができる。ＤＣＬ活性により遊離され、ＲＩＳＣ複合体にロードされるプレｍｉＲＮＡからのｄｓＲＮＡステムの特定の鎖を、５’末端における相補性の程度により決定し、それにより、５’末端において、切断されたｄｓＲＮＡステムの異なる鎖のヌクレオチド間の水素結合に最も関与しない鎖がＲＩＳＣ複合体にロードされ、標的ＲＮＡ分子分解の配列特異性を決定するだろう。しかしながら、経験的に、「間違った」鎖がＲＩＳＣ複合体にロードされるという理由で特定の合成プレｍｉＲＮＡ分子からのｍｉＲＮＡ分子が機能しない場合、プレｍｉＲＮＡ分子のｄｓＲＮＡステムそれぞれの鎖上のｍｉＲＮＡ分子およびその補体の位置の交換によりこの問題を解決することができることは直ちに明白になるだろう。当技術分野において公知であるように、２つの水素結合を含むＡとＵとの間の結合または２つの水素結合を含むＧとＵとの間の結合は、３つの水素結合を含むＧとＣとの間の結合より強くない。
ｍｉＲＮＡ分子はその天然プレｍｉＲＮＡ分子内を構成し得るが、対象の別のｍｉＲＮＡのヌクレオチド配列に対してこのような既存プレｍｉＲＮＡ分子から正常にプロセシングされたｍｉＲＮＡのヌクレオチド配列の交換により既存プレｍｉＲＮＡ分子足場中にこれらを導入することもできる。プレｍｉＲＮＡの骨格を完全に合成することもできる。同様に、合成ｍｉＲＮＡ分子は、既存プレｍｉＲＮＡ分子足場または合成プレｍｉＲＮＡ足場内を構成し、これらから処理してもよい。
ドミナントネガティブＣＫＸ５もしくはＣＫＸ３タンパク質をコードするＤＮＡコンストラクト植物、またはＣＫＸ５もしくはＣＫＸ３タンパク質に対する不活化抗体をコードするＤＮＡコンストラクト、または特定のＣＫＸ５もしくはＣＫＸ３結合ドメインおよびタンパク質切断活性を有するタンパク質などのＣＫＸ５もしくはＣＫＸ３タンパク質を特異的に不活化するタンパク質をコードするＤＮＡコンストラクトを含んでなるアブラナ属植物など、ＣＫＸ５もしくはＣＫＸ３タンパク質活性が低下する、少なくとも２つのＣＫＸ５もしくはＣＫＸ３遺伝子を含んでなるアブラナ属植物も本発明に好適である。「ＣＫＸ５またはＣＫＸ３タンパク質に対する不活化抗体」は、少なくとも、ＣＫＸ５またはＣＫＸ３ ＰＧＡＺタンパク質のいくつかのエピトープと特異的に結合し、標的タンパク質活性を阻害する抗体またはその部分である。ＣＫＸ５またはＣＫＸ３タンパク質活性を、例えば、ＣＫＸ５もしくはＣＫＸ３タンパク質のアグリゲート（例えば、国際公開第２００７／０７１７８９号参照）、または標的タンパク質の足場形成（例えば、国際公開第２００９／０３０７８０号）によっても低下させることができる。
少なくとも１つのＣＫＸ５またはＣＫＸ３遺伝子の発現が減少する、少なくとも２つのＣＫＸ５またはＣＫＸ３遺伝子を含んでなる前記アブラナ属植物は、例えば、４つのＣＫＸ５またはＣＫＸ３遺伝子を含んでなるアブラナ属植物であり得るが、前記アブラナ属植物は、ブラシカ・ナプス（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）、ブラシカ・ユンセア（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｊｕｎｃｅａ）およびブラシカ・カリナタ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｃａｒｉｎａｔａ）からなる群から選択される。前記アブラナ属植物では、少なくとも１つ、または少なくとも２つ、または少なくとも３つ、または４つのＣＫＸ５もしくはＣＫＸ３遺伝子の発現を減少することができる。
従って、第一態様では、そのゲノム内に少なくとも１つの変異体ＣＫＸ５アレルを含んでなることを特徴とする、少なくとも１つ、好ましくは２つのＣＫＸ５遺伝子を含んでなるアブラナ属植物を提供する。さらなる態様では、そのゲノム内に少なくとも１つの変異体ＣＫＸ５アレルおよび１つの変異体ＣＫＸ３を含んでなることを特徴とする、少なくとも１つのＣＫＸ５および少なくとも２つのＣＫＸ３遺伝子、好ましくは２つのＣＫＸ５遺伝子および４つのＣＫＸ３遺伝子を含んでなるアブラナ属植物を提供する。
少なくとも１つのＣＫＸ５遺伝子の発現が減少している、少なくとも１つのＣＫＸ５遺伝子、好ましくは２つのＣＫＸ５遺伝子を含んでなり、かつ、少なくともＣＫＸ３遺伝子の発現が減少している、少なくとも２つ、好ましくは４つのＣＫＸ３遺伝子を含んでなる前記アブラナ属植物は、例えば、２つのＣＫＸ５遺伝子を含んでなるアブラナ属植物であり得るが、前記アブラナ属植物はブラシカ・ナプス（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）、ブラシカ・ユンセア（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｊｕｎｃｅａ）およびブラシカ・カリナタ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｃａｒｉｎａｔａ）からなる群から選択される。前記アブラナ属植物では、少なくとも１つ、または少なくとも２つ、または少なくとも３つ、または４つのＣＫＸ３遺伝子の発現は減少し得、および／または少なくとも１つ、または２つのＣＫＸ５遺伝子の発現は減少し得る。本発明による植物は、本発明に従って、育種目的のために使用してもよい。
本発明の別の態様では、アブラナ属ＣＫＸ３またはＣＫＸ５遺伝子の変異アレルを提供し、該ＣＫＸ３遺伝子は：
−配列番号７、配列番号１０、配列番号１３または配列番号１６と少なくとも９０％配列同一性を含むヌクレオチド配列；
−配列番号８、配列番号１１、配列番号１４または配列番号１７と少なくとも９０％配列同一性を含むコード配列を含んでなるヌクレオチド配列；および
−配列番号９、配列番号１２、配列番号１５または配列番号１８と少なくとも９０％配列同一性を含むアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；および
該ＣＫＸ５遺伝子は以下からなる群から選択される核酸配列を含んでなる：
−配列番号１９、配列番号２２、配列番号２３と少なくとも９０％配列同一性でを含むあるヌクレオチド配列；
−配列番号２０または配列番号２３と少なくとも９０％配列同一性を含むコード配列を含んでなるヌクレオチド配列；および
−配列番号２１または配列番号２４と少なくとも９０％配列同一性を含むアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列
からなる群から選択される。
別の実施形態では、前記変異アレルは：
−配列番号１９の４６５位または配列番号２０の４６５位に対応する位置においてＧ〜Ａ置換を含んでなる変異体ＣＫＸ５アレル；
−配列番号１９の３９９位または配列番号２０の３９９位に対応する位置においてＧ〜Ａ置換を含んでなる変異体ＣＫＸ５アレル；
−配列番号２２の４６５位または配列番号２３の３９９位に対応する位置においてＧ〜Ａ置換を含んでなる変異体ＣＫＸ５アレル；
−配列番号７の２２４４位または配列番号８の１０９３位に対応する位置においてＣ〜Ｔ置換を含んでなる変異体ＣＫＸ３アレル；
−配列番号１０の２４８２位または配列番号１１の１１６８位に対応する位置においてＣ〜Ｔ置換を含んでなる変異体ＣＫＸ３アレル；
−配列番号１３の１８９３位または配列番号１４の８７６位に対応する位置においてＧ〜Ａ置換を含んでなる変異体ＣＫＸ３アレル；
−配列番号１６の２１７１位または配列番号１７の９８２位に対応する位置においてＣ〜Ｔ置換を含んでなる変異体ＣＫＸ３アレル
からなる群から選択される。
アブラナ属植物中の変異体および野生型ＣＫＸアレルの生成および配合方法も提供し、それにより、これらの植物において花数もしくはさや数またはＴＳＷを増加させる。変異体ＣＫＸアレルを他の植物に移植するためのこれらの植物の使用も、記載した植物のいずれかの植物生成物であるので、本発明の実施形態である。加えて、ＣＫＸ遺伝子および／またはアレルを配合または検出するためのマーカー利用選抜（ＭＡＳ）用キットおよび方法を提供する。本発明の実施形態の各々は本明細書中下記に詳細に記載する。
本発明による核酸
機能ＣＫＸ３およびＣＫＸ５タンパク質をコードする野生型ＣＫＸ３およびＣＫＸ５核酸配列およびアブラナ科、詳細にはブラシカ種、特にブラシカ・ナプス（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）由来のＣＫＸ３およびＣＫＸ５遺伝子の変異体ＣＫＸ３およびＣＫＸ５核酸配列（１つ以上の変異、好ましくは、コードされたＣＫＸ３もしくはＣＫＸ５タンパク質の生物活性がなくなるかもしくは著しく減少する、またはＣＫＸ３もしくはＣＫＸ５タンパク質が産生される変異を含んでなる）も提供する。例えば、Ａおよび／またはＣゲノムを含んでなるブラシカ種は、ＣＫＸ３−ＡもしくはＣＫＸ３−ＣまたはＣＫＸ５−ＡもしくはＣＫＸ５−Ｃ遺伝子の異なるアレルを含んでなり得るが、これは本発明に従って単一植物において同定および配合することができる。加えて、変異誘発または遺伝子ターゲティング方法を使用して野生型ＣＫＸ３およびＣＫＸ５アレルの変異を発生させることができ、これにより、本発明による用途に変異ＣＫＸ３およびＣＫＸ５アレルを生成する。特定のＣＫＸ３およびＣＫＸ５アレルは交配および選抜により植物中で好適に配合するので、１つの実施形態では、ＣＫＸ３および／またはＣＫＸ５核酸配列を植物内（すなわち、内生的に）、例えば、アブラナ属植物、好ましくはブラシカ・ナプス（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）と交配することができるかまたは「合成」ブラシカ・ナプス（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）植物を製造するために使用することができるアブラナ属植物内に提供する。異なるブラシカ種間のハイブリダイゼーションは、例えば、Ｓｎｏｗｄｏｎ（2007, Chromosome research 15: 85-95）にあるように当技術分野において記載されている。例えば、種間ハイブリダイゼーションを、例えば、ブラシカ・ナプス（Ｂ． ｎａｐｕｓ）（ＡＡＣＣ）のＣゲノムからブラシカ・カリナタ（Ｂ． ｃａｒｉｎａｔａ）（ＢＢＣＣ）のＣゲノムに、またはさらに、例えば、ブラシカ・ナプス（Ｂ． ｎａｐｕｓ）（ＡＡＣＣ）のＣゲノムからブラシカ・ユンセア（Ｂ． ｊｕｎｃｅａ）（ＡＡＢＢ）のＢゲノムに遺伝子を移動するために使用することができる（これらのＣおよびＢゲノム間の非正統的組換えの散発的イベントにより）。「再合成」または「合成」ブラシカ・ナプス（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）系統を、元先祖、ブラシカ・オレラセ（Ｂ． ｏｌｅｒａｃｅ）（ＣＣ）およびブラシカ・ラパ（Ｂ． ｒａｐａ）（ＡＡ）の交配により産生することができる。例えば、胚救出技術またはプロトプラスト融合により、ブラシカ作物種とその近縁との間の交配において、種間、および属間の不適合障壁の克服に成功することができる（例えば、上記Ｓｎｏｗｄｏｎ参照）。
しかしながら、これらを、植物もしくは植物部分中内在的にどの配列が存在するか、配列が機能的、非機能的タンパク質をコードするかどうか、またはタンパク質を全くコードしないか（例えば、下記のように組換え宿主細胞内の発現により）を決定するために、かつ、機能的および変異アレルの所望の組合せを有する植物を生成するために選抜および１つの植物から別の植物への特定のアレルの移動のために使用することができるので、単離ＣＫＸ３およびＣＫＸ５核酸配列（例えば、クローニングにより植物から単離またはＤＮＡ合成により合成的に製造）、同様にその多様体およびこれらのいずれかのフラグメントも、本明細書中に提供する。
ＣＫＸ３およびＣＫＸ５の核酸配列を、配列リストに示す通り、ブラシカ・ナプス（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）（ＢｎＣＫＸ３−Ａ１、ＢｎＣＫＸ３−Ａ２、ＢｎＣＫＸ３−Ｃ１、およびＢｎＣＫＸ３−Ｃ２；ＢｎＣＫＸ５−Ａ１およびＢｎＣＫＸ５−Ｃ１）から単離した。野生型ＣＫＸ３およびＣＫＸ５配列を示すが、一方、これらの配列およびこれらと本質的に類似の配列の変異体ＣＫＸ配列を下記、および実施例中、野生型ＣＫＸ３およびＣＫＸ５配列を参照して本明細書中に記載する。ブラシカ・ナプス（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）、ブラシカ・ラパ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｒａｐａ）、ブラシカ・オレラセ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅ）およびブラシカ・ニグラ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎｉｇｒａ）由来のゲノムＣＫＸ３およびＣＫＸ５タンパク質コードＤＮＡは、４つのイントロンを含む。
本発明による「ＢｎＣＫＸ３−Ａ１核酸配列」または「ＢｎＣＫＸ３−Ａ１多様体核酸配列」は、配列番号９と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、９８％、９９％もしくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列、または配列番号７と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％の配列同一性を有するかまたは配列番号８と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％の配列同一性を有するｃＤＮＡ配列を有する核酸配列である。これらの核酸配列を、配列リストに示したＣＫＸ３配列と「本質的に類似」または「本質的に同一」であると言ってもよい。
本発明による「ＢｎＣＫＸ３−Ａ２核酸配列」または「ＢｎＣＫＸ３−Ａ２多様体核酸配列」は、配列番号１２と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、９８％、９９％もしくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列、または配列番号１０と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％の配列同一性を有するかまたは配列番号１１と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％の配列同一性を有するｃＤＮＡ配列を有する核酸配列である。これらの核酸配列を、配列リストに示したＣＫＸ配列と「本質的に類似」または「本質的に同一」であると言ってもよい。
本発明による「ＢｎＣＫＸ３−Ｃ１核酸配列」または「ＢｎＣＫＸ３−Ｃ１多様体核酸配列」は、配列番号１５と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、９８％、９９％もしくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列、または配列番号１３と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％の配列同一性を有するかまたは配列番号１４と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％の配列同一性を有するｃＤＮＡ配列を有する核酸配列である。これらの核酸配列を、配列リストに示したＣＫＸ配列と「本質的に類似」または「本質的に同一」であると言ってもよい。
本発明による「ＢｎＣＫＸ３−Ｃ２核酸配列」または「ＢｎＣＫＸ−Ｃ２多様体核酸配列」は、配列番号１８と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、９８％、９９％もしくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列、または配列番号１６と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％の配列同一性を有するかまたは配列番号１７と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％の配列同一性を有するｃＤＮＡ配列を有する核酸配列である。これらの核酸配列を、配列リストに示したＣＫＸ配列と「本質的に類似」または「本質的に同一」であると言ってもよい。
本発明による「ＢｎＣＫＸ５−Ａ１核酸配列」または「ＢｎＣＫＸ５−Ａ１多様体核酸配列」は、配列番号２１と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、９８％、９９％もしくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列、または配列番号１９と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％の配列同一性を有するかまたは配列番号２０と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％の配列同一性を有するｃＤＮＡ配列を有する核酸配列である。これらの核酸配列を、配列リストに示したＣＫＸ３配列と「本質的に類似」または「本質的に同一」であると言ってもよい。
本発明による「ＢｎＣＫＸ５−Ｃ１核酸配列」または「ＢｎＣＫＸ５−Ｃ１多様体核酸配列」は、配列番号２４と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、９８％、９９％もしくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列、または配列番号２２と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％の配列同一性を有するかまたは配列番号２３と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％の配列同一性を有するｃＤＮＡ配列を有する核酸配列である。これらの核酸配列を、配列リストに示したＣＫＸ配列と「本質的に類似」または「本質的に同一」であると言ってもよい。
従って、本発明は、多様体およびそのフラグメント（さらに下記に定義するように）を含む野生型機能ＣＫＸ３およびＣＫＸ５タンパク質をコードする核酸配列の両方、同様に、これらのいずれかの変異体核酸配列を提供し、それにより、核酸配列中の変異は、野生型ＣＫＸ３またはＣＫＸ５タンパク質と比較して挿入、欠失または置換されている１つ以上のアミノ酸を好適にもたらす。好ましくは、核酸配列中の変異（複数可）は、１つ以上のアミノ酸変化（すなわち、野生型アミノ酸配列に対して１つ以上のアミノ酸が挿入、欠失および／または置換される）をもたらし、それにより、ＣＫＸ３またはＣＫＸ５タンパク質の生物活性は著しく低下または完全に消滅する。ＣＫＸ３もしくはＣＫＸ５タンパク質の生物活性の著しい低下または完全な消滅は、本明細書において、ＣＫＸ３もしくはＣＫＸ５タンパク質の基質結合活性および／または触媒能の低下または消滅を表し、この結果、変異体ＣＫＸ３もしくはＣＫＸ５タンパク質を発現する植物の花数、さや数および／またはＴＳＷが対応する野生型ＣＫＸ３もしくはＣＫＸ５タンパク質を発現する植物と比較して増加する。
植物、詳細にはアブラナ属植物の特定のＣＫＸアレル／タンパク質の機能を決定するため、植物上の花数を、下記の実施例中本明細書中に記載したように数を数えることにより、および／または、例えば、ＣＫＸ５またはＣＫＸ５およびＣＫＸ３の変異により分裂組織、特に花の分裂組織が影響を受けるかどうか、および如何に影響を受けるかを調査するために顕微鏡試験を行うことにより決定することができる。あるいは、特定のＣＫＸ３またはＣＫＸ５アレル／タンパク質の機能を、当技術分野において公知の組換えＤＮＡ技術、例えば、宿主細胞（例えば、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）などの細菌）内のＣＫＸ３またはＣＫＸ５発現および、例えば基質結合活性もしくはイソペンテニルアデニンなどのサイトカイニンの酸化のインビトロ触媒の評価により評価することができる。
内在性および単離核酸配列の両方を本明細書中に提供する。プライマーまたはプローブとしての用途および本発明の別の態様（さらに下記参照）に従ったキットの構成要素としての用途のための上記定義したＣＫＸ３またはＣＫＸ５配列およびＣＫＸ３またはＣＫＸ５多様体核酸配列のフラグメントも提供する。ＣＫＸ３もしくはＣＫＸ５またはＣＫＸ核酸配列もしくはその多様体の「フラグメント」（定義した通り）は、それぞれのＣＫＸもしくはＣＫＸ配列（または多様体配列）の少なくとも１０、１２、１５、１８、２０、５０、１００、２００、５００、８００、１０００、または１５００の隣接ヌクレオチドなどの様々な長さであってよい。
機能ＣＫＸ３またはＣＫＸ５タンパク質をコードする核酸配列
配列リストに示した核酸配列は、ブラシカ・ナプス（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）由来の野生型機能ＣＫＸ３またはＣＫＸ５タンパク質をコードする。従って、これらの配列は、これらが単離されるアブラナ属植物に対して内因性である。他のアブラナ属作物種、品種、育種系統または野生登録物を、同じＣＫＸ３またはＣＫＸ５タンパク質またはその多様体をコードする他のＣＫＸ３またはＣＫＸ５アレルについてスクリーニングしてもよい。例えば、核酸ハイブリダイゼーション技術（例えば、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件を用いたサザンブロット解析など）またはＰＣＲベース技術を使用して、様々なブラシカ・ナプス（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）品種、系統またはアクセッションなどの他のアブラナ属植物に対して内因性のＣＫＸ３またはＣＫＸ５アレルを同定してもよいだけでなく、ブラシカ・ユンセア（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｊｕｎｃｅａ）（特に、Ａゲノム上のＣＫＸ３またはＣＫＸ５またはアレル）、ブラシカ・カリナタ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｃａｒｉｎａｔａ）（特に、Ｃゲノム上のＣＫＸ３またはＣＫＸ５アレル）およびブラシカ・ラパ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｒａｐａ）（特に、Ａゲノム上のＣＫＸ３またはＣＫＸ５アレル）およびブラシカ・オレラセ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅ）（特に、Ｃゲノム上のＣＫＸ３またはＣＫＸ５アレル）植物、器官および組織も他の野生型ＣＫＸ３またはＣＫＸ５アレルについてスクリーニングすることができる。ＣＫＸ３またはＣＫＸ５アレルの存在について、このような植物、植物器官または組織をスクリーニングするために、配列リストに示すＣＫＸ３またはＣＫＸ５核酸配列もしくは多様体またはこれらのいずれかのフラグメントを使用してもよい。例えば、全配列またはフラグメントを、プローブまたはプライマーとして使用してもよい。例えば、特定のまたは縮重プライマーを使用して、植物、植物器官または組織のゲノムＤＮＡ由来のＣＫＸ３またはＣＫＸ５タンパク質をコードする核酸配列を増幅してもよい。これらのＣＫＸ３またはＣＫＸ５核酸配列を単離して、標準的分子バイオ技術を用いて配列決定してもよい。それから、バイオインフォマティクス解析を使用して、例えば、配列がどのＣＫＸ３またはＣＫＸ５アレルに対応しているか、およびどのＣＫＸ５またはＣＫＸ３タンパク質もしくはタンパク質多様体が配列によりコードされるかを決定するためにアレル（複数可）の特性を決定してもよい。
核酸配列が機能ＣＫＸ３またはＣＫＸ５タンパク質を、当技術分野で公知の組換えＤＮＡ技術、例えば、完全ノックアウトｃｋ３もしくはｃｋｘ５変異アレル（または両方）についてホモ接合であるアラビドプシス属（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）植物、または両方の完全ノックアウトｃｋ３もしくはｃｋｘ５変異アレル、もしくはＣＫＸ３−Ａ１、ＣＫＸ３−Ａ２、ＣＫＸ３−Ｃ１および／もしくはＣＫＸ３−Ｃ２遺伝子および／もしくはＣＫＸ５−Ａ１およびＣＫＸ５−Ｃ１についてホモ接合であるブラシカ・ナプス（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）植物を用いた遺伝的相補性試験により分析することができる。
加えて、ＣＫＸ３もしくはＣＫＸ５核酸配列およびその多様体（またはこれらのいずれかのフラグメント）を、本質的に類似の配列について核酸データベースをスクリーニングすることにより、コンピューターを利用して同定してもよい。同様に、核酸配列を化学的に合成してもよい。本発明による核酸分子のフラグメントも提供するが、これはさらに下記に記載する。
変異体ＣＫＸ３またはＣＫＸ５タンパク質をコードする核酸配列
野生型核酸配列に対して１つ以上のヌクレオチド欠失、挿入または置換を含んでなる核酸配列は、このような変異体核酸分子のフラグメントであるので、本発明の別の実施形態である。このような変異体核酸配列（ｃｋｘ３またはｃｋｘ５配列と呼ぶ）を、さらに下記に記載するように、様々な公知の方法を用いて生成および／または同定することができる。また、このような核酸分子を、内在および単離の形態の両方で提供する。１つの実施形態では、変異（複数可）は、コードされたＣＫＸ３またはＣＫＸ５タンパク質のアミノ酸配列中の１つ以上の変化（欠失、挿入および／または置換）をもたらす（すなわち、「サイレント変異」ではない）。別の実施形態では、核酸配列中の変異（複数可）は、野生型タンパク質に対してコードされたＣＫＸ３またはＣＫＸ５タンパク質の生物活性の著しい低下または完全な消失をもたらす。
従って、核酸分子は：
（ａ）別のアミノ酸のアミノ酸による置換をもたらす核酸配列の変化である「ミスセンス変異」；
（ｂ）中途終止コドンを導入して翻訳終結（短縮タンパク質をもたらす）をもたらす核酸配列の変化である「ナンセンス変異」または「終止コドン変異」；植物遺伝子は翻訳終止コドン「ＴＧＡ」（ＲＮＡのＵＧＡ）、「ＴＡＡ」（ＲＮＡのＵＡＡ）および「ＴＡＧ」（ＲＮＡのＵＡＧ）を含み；従って翻訳される成熟ｍＲＮＡ中にあるこれらのコドンの１つをもたらすいずれかのヌクレオチド置換、挿入、欠失が翻訳を終結する；
（ｃ）核酸のコード配列中に付加されている１つ以上のコドンによる、１つ以上のアミノ酸の「挿入変異」；
（ｄ）核酸のコード配列中に欠失さした１つ以上のコドンによる、１つ以上のアミノ酸の「欠失変異」；
（ｅ）変異の異なるフレーム下流において翻訳される核酸配列をもたらす「フレームシフト変異」
などの１つ以上の変異を含んでなり得る。フレームシフト変異は、１つ以上のヌクレオチドの挿入、欠失または重複などの様々な原因を有し得るが、この数は３で割り切れない。
既に言及したように、核酸配列中の変異（複数可）は、インビボで著しく低下した生物活性を含むかもしくは全く生物活性のない変異体タンパク質を好適にもたらすか、またはタンパク質を産生しないことが望ましい。基本的に、野生型タンパク質に対して少なくとも１つのアミノ酸挿入、欠失および／または置換をもたらすいずれもの変異は、生物活性の著しく低下させるかまたは全く生物活性を有しなくすることができる。しかしながら、タンパク質の特定の部分の変異は、短縮タンパク質をもたらす変異などの変異体ＣＫＸ３もしくはＣＫＸ５の低下した機能をよりもたらすと思われ、これにより、ＦＡＤ結合モチーフ、サイトカイニン結合モチーフ、ＧＩＷｅＶＰＨＰＷＬＮＬモチーフ、および／もしくはＰＧＱｘＩＦモチーフなどの機能ドメインの重要な部分を欠くと理解される。
アラビドプシス属およびアブラナ属ＣＫＸ３およびＣＫＸ５タンパク質配列中の保存モチーフのアミノ酸位置および触媒残基を、表１および２に示す。
ＣＫＸ３およびＣＫＸ５核酸配列、特に、本発明のアブラナ属ＣＫＸ３およびＣＫＸ５核酸およびアミノ酸配列を含むアラビドプシス属ＣＫＸ３およびＣＫＸ５核酸（配列番号１、２、４および５）ならびにアミノ酸（配列番号３および６）配列の最適アライメントは、これらのアブラナ属配列中の対応する保存ドメインおよびアミノ酸の位置の決定を可能とする（アブラナ属ＣＫＸ３およびＣＫＸ５配列について表１および２参照）。
従って、１つの実施形態では、上記変異の種類のいずれかの１つ以上を含んでなる核酸配列を提供する。別の実施形態では、１つ以上の終止コドン（ナンセンス）変異、１つ以上のミスセンスおよび／または１つ以上のフレームシフト変異を含んでなるｃｋｘ３／ｃｋｘ５配列を提供する。上記変異体核酸配列のいずれかは、このような配列を内在的に含んでなる植物および植物部分であるので、それ自体（単離された形態）で提供される。下記、本明細書中の表では、最も好ましいｃｋｘ３／ｃｋｘ５アレルを記載し、１つ以上のｃｋｘ３／ｃｋｘ５アレルを含んでなるブラシカ・ナプス（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）種子の種子寄託は示しているように寄託している。
本明細書で使用するとき、ＣＫＸ３またはＣＫＸ５アレルのナンセンス変異は、それにより１つ以上の翻訳終止コドンが対応する野生型ＣＫＸ３またはＣＫＸ５アレルのコードＤＮＡおよび対応するｍＲＮＡ配列に導入される、ＣＫＸ３またはＣＫＸ５アレルの変異である。翻訳終止コドンは、ＴＧＡ（ｍＲＮＡのＵＧＡ）、ＴＡＡ（ＵＡＡ）およびＴＡＧ（ＵＡＧ）である。従って、コード配列中のインフレーム終止コドンの生成をもたらすいずれもの変異（欠失、挿入または置換）は、アミノ酸鎖の翻訳および切断を終結させるだろう。１つの実施形態では、ナンセンス変異を含んでなる変異体ＣＫＸ３またはＣＫＸ５アレルは、インフレーム終止コドンが、ＣＡＧからＴＡＧへ、ＴＧＧからＴＡＧへ、ＴＧＧからＴＧＡへ、またはＣＡＡからＴＡＡへの変異など、一塩基置換によりＣＫＸ３またはＣＫＸ５コドン配列中に導入されるＣＫＸ３またはＣＫＸ５アレルである。別の実施形態では、ナンセンス変異を含んでなる変異体ＣＫＸ３またはＣＫＸ５アレルは、インフレーム終止コドンが、ＣＡＧからＴＡＡへ、ＴＧＧからＴＡＡへ、ＴＧＧからＴＡＡへ、またはＣＧＧからＴＡＧもしくはＴＧＡへの変異など、二塩基置換によりＣＫＸ３またはＣＫＸ５コドン配列中に導入されるＣＫＸ３またはＣＫＸ５アレルである。さら別の実施形態では、ナンセンス変異を含んでなる変異体ＣＫＸ３またはＣＫＸ５アレルは、インフレーム終止コドンが、ＣＧＧからＴＡＡへの変異など、三塩基置換によりＣＫＸ３またはＣＫＸ５コドン配列中に導入されるＣＫＸ３またはＣＫＸ５アレルである。短縮タンパク質は、変異のコードＤＮＡ下流によりコードされるアミノ酸（すなわち、ＣＫＸ３またはＣＫＸ５タンパク質のＣ末端部分）を欠き、変異のコードＤＮＡ上流によりコードされるアミノ酸（すなわち、ＣＫＸ３またはＣＫＸ５タンパク質のＮ末端部分）を維持する。１つの実施形態では、ナンセンス変異を含んでなる変異体ＣＫＸ３またはＣＫＸ５アレルは、ナンセンス変異が配列番号３の５１２〜５１７に対応する位置におけるＰＧＱＸＩＦモチーフの前どこにでも存在するＣＫＸ３またはＣＫＸ５ｅである結果、少なくとも保存ドメインＰＧＱＸＩＦは欠いている。野生型ＣＫＸ３またはＣＫＸ５タンパク質と比較して変異体ＣＫＸ３またはＣＫＸ５タンパク質がより短縮されているほど、該切断は、ＣＫＸ３またはＣＫＫＸ５タンパク質の活性の著しい低下または全く活性がなくなる程度が大きくなる。従って、別の実施形態では、約５１７未満または５１８、または５１６（完全にサイトカイニン結合部位を欠く）、約２４４未満または２４５、または２４３（完全にサイトカイニン結合部位を欠く）、約２３３未満、または２３４アミノ酸（２３３位におけるＦＡＤ結合アミノ酸を欠く）またはさらに少ないアミノ酸長の短縮タンパク質をもたらすナンセンス変異を含んでなる変異体ＣＫＸ３またはＣＫＸ５アレル。保存領域および特定のＹＩＩＮアレル中にもはや存在しないドメインを示す表１および２参照。
実施例において本明細書に記載したように、完全にサイトカイニン結合モチーフ、ＧＩＷｅＶＰＨＰＷＬＮＬモチーフ、およびＰＧＱｘＩＦモチーフを欠いている配列番号３（ＹＩＩＮ５０１）の３６４位に対応または配列番号３の３８９位に対応する位置において切断されるＣＫＸアレルならびに実施例の最長短縮ＣＫＸタンパク質である配列番号３の４７６位または配列番号６の４７９位に対応する位置におけるＦＡＤ結合部位が、花数およびＴＳＷの増加に寄与することは明白であろう。従って、特定の実施形態では、本発明によるＣＫＸ３またはＣＫＸ５アレルは、ＧＩＷｅＶＰＨＰＷＬＮＬモチーフ、およびＰＧＱｘＩＦモチーフ、ならびに４７６位に対応する位置においてＦＡＤ結合部位を欠いている短縮タンパク質をコードする。
明らかに、変異は上に示したものに限定されず、類似の終結変異が配列リストに示したものおよび上表に表したもの以外のｃｋｘ３／ｃｋｘ５アレル中に存在し得ると理解される。
本明細書で使用するとき、ＣＫＸ３またはＣＫＸ５アレル中のミスセンス変異は、それにより１つ以上のコドンが対応する野生型ＣＫＸ３またはＣＫＸ５アレルのコードＤＮＡおよび対応するｍＲＮＡ配列に変化するＣＫＸ３またはＣＫＸ５アレル中のいずれもの変異（欠失、挿入または置換）であり、変異体ＣＫＸ３またはＣＫＸ５アレルタンパク質中の１つ以上の他のアミノ酸の代わりに野生型ＣＫＸ３またはＣＫＸ５アレルタンパク質中の１つ以上のアミノ酸の置換をもたらす。１つ実施形態では、ミスセンス変異を含んでなる変異体ＣＫＸ３またはＣＫＸ５アレルは、上または表１もしくは２に示した１つ以上の保存アミノ酸が置換されるＣＫＸ３またはＣＫＸ５アレルである。例えば、配列番号３の１００〜１０４、１０５〜１０６、１１０、１５３、１６７、１７２、１７８〜１８２、２３３、４７６、３７４〜３８５または５１２〜５１７位に対応する位置におけるアミノ酸の置換をもたらすミスセンス変異は、ＣＫＸ３タンパク質の活性を著しく低下させるかまたは全く活性をなくさせるとより思われる。同様に、例えば、配列番号６の９７〜１０１、１０２〜１０３、１０７、１６５、１７０、１７６〜１８０、２３１、４７９、３７４〜３８５または５１５〜５２０位に対応する位置におけるアミノ酸の置換をもたらすミスセンス変異は、ＣＫＸ５タンパク質の活性を著しく低下させるかまたは全く活性をなくさせるとより思われる。
本明細書で使用するとき、ＣＫＸ３またはＣＫＸ５アレル中のフレームシフト変異は、変異の異なるフレーム下流において翻訳される核酸配列をもたらすＣＫＸ３またはＣＫＸ５アレル中の変異（欠失、挿入、重複など）である。１つの実施形態では、フレームシフト変異を含んでなる変異体ＣＫＸ３もしくはＣＫＸ５アレルは、配列番号３の５１２位もしくは配列番号６の５１５位に対応するＰＧＱｘＩＦモチーフの第一アミノ酸をコードするコドンのフレームシフト変異上流を含んでなる、または配列番号３の３７４位もしくは配列番号６の３７４位に対応するＧＩＷｅＶＰＨＰＷＬＮＬモチーフの第一アミノ酸をコードするコドンのフレームシフト変異上流を含んでなる、または配列番号３の２４４位もしくは配列番号６の２４２位に対応するサイトカイニン結合モチーフの第一アミノ酸をコードするコドンのフレームシフト変異上流を含んでなる、または配列番号３の６６位もしくは配列番号６の６３位に対応するＦＡＤモチーフの第一アミノ酸をコードするコドンのフレームシフト変異上流を含んでなる、または配列番号３の１００〜１０４、１０５〜１０６、１１０、１５３、１６７、１７２、１７８〜１８２、２３３、４７６、３７４〜３８５もしくは５１２〜５１７位に対応するもしくは配列番号６の９７〜１０１、１０２〜１０３、１０７、１６５、１７０、１７６〜１８０、２３１、４７９、３７４〜３８５もしくは５１５〜５２０位に対応する位置におけるアミノ酸におけるＦＡＤ結合アミノ酸をコードするコドンのフレームシフト変異上流を含んでなる変異体ＣＫＸ３もしくはＣＫＸ５アレルである。
変異体ＣＫＸ３またはＣＫＸ５アレルは、ＣＫＸ３またはＣＫＸ５タンパク質を産生しないＣＫＸ３またはＣＫＸ５アレルでもあり得る。タンパク質を産生しない変異アレルの例は、ｍＲＮＡ産生をなくすプロモーター領域中の変異、ｍＲＮＡの分解をもたらす終止コドン変異（ナンセンス変異依存分解機構；例えば、Baker and Parker, 2004, Curr Opin Cell Biol 16:293参照）、ＲＮＡ分解をもたらすスプライス部位変異（例えば、Isken and Maquat, 2007, Genes Dev 21:1833参照）、またはタンパク質が産生されないようになるＡＴＧ開始コドン変異もしくは欠失を含んでなる配列をコードするタンパク質中の変異、または配列をコードするタンパク質（の部分）の欠如をもたらす遺伝子の総欠失を有するアレルである。
従って、本発明による変異体ＣＫＸ３もしくはＣＫＸ５アレルは、配列番号７、配列番号１０、配列番号１３、配列番号１６、配列番号１９もしくは配列番号２２と９０％以上だが１００％未満の配列同一性を含むヌクレオチド配列を含んでなることができ；または配列番号８、配列番号１１、配列番号１４、配列番号、配列番号１７、配列番号２０もしくは配列番号２３と９０％以上だが１００％未満の配列同一性を含むコード配列を含んでなるヌクレオチド配列を含んでなることができ；または配列番号９、配列番号１２、配列番号１５、配列番号１８、配列番号２１もしくは配列番号２４と９０％以上だが１００％未満の配列同一性を含むアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含んでなることができる。前記９０％以上は、少なくとも９０％、または少なくとも９３％、または少なくとも９５％、または少なくとも９６％、または少なくとも９７％、または少なくとも９８％、または９９％であり得る。しかしながら、本発明による変異体ＣＫＸ３またはＣＫＸ５アレルは、上記配列と１００％配列同一性を含むヌクレオチド配列を含むことができない。さらに、本発明による変異体ＣＫＸ３またはＣＫＸ５アレルは、例えば、野生型ＣＫＸ３またはＣＫＸ５遺伝子の一部または全部が欠失する場合など、上記配列と９０％より低い配列同一性を含んでなることができる。このような場合、変異体ＣＫＸ３もしくはＣＫＸ５アレルは、野生型ＣＫＸ３もしくはＣＫＸ５アレルの遺伝子座位に対応する遺伝子座位も表してもよく、ＣＫＸ３もしくはＣＫＸ５アレルは野生型アレルと１００％未満の配列同一性を有して存在するか、またはＣＫＸ３もしくはＣＫＸ５遺伝子の一部もしくは完全なＣＫＸ３もしくはＣＫＸ５遺伝子が欠失する。
本発明によるアミノ酸配列
アブラナ科、特に、アブラナ属、特に、ブラシカ・ナプス（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）、ブラシカ・ラパ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｒａｐａ）、ブラシカ・オレラセ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅ）およびブラシカ・ニグラ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎｉｇｒａ）だけでなく他のアブラナ属作物種由来の野生型（機能）ＣＫＸ３またはＣＫＸ５アミノ酸配列および変異体ＣＫＸ３またはＣＫＸ５アミノ酸配列（１つ以上の変異、好ましくはＣＫＸ３またはＣＫＸ５タンパク質の生物活性を著しく低下させるかまたは全く生物活性をなくさせる変異）の両方を提供する。例えば、Ａおよび／またはＣゲノムを含んでなるブラシカ種は、異なるＣＫＸ３−ＡもしくはＣＫＸ５−ＡまたはＣＫＸ３−ＣもしくはＣＫＸ５−Ｃアミノ酸をコードし得る。加えて、変異誘発または遺伝子ターゲティング方法を使用して野生型ＣＫＸ３またＣＫＸ５アレルの変異を発生させることができ、これにより、さらなるＣＫＸ３またはＣＫＸ５タンパク質をコードすることができる変異アレルを生成する。１つの実施形態では、野生型および／または変異体ＣＫＸ３またはＣＫＸ５アミノ酸配列を、アブラナ属植物内で（すなわち、内在的に）提供する。しかしながら、単離ＣＫＸ３またはＣＫＸ５アミノ酸配列（例えば、植物から単離または合成的に製造）、ならびにその多様体およびこれらのいずれかのフラグメントも本明細書中で提供する。
ＣＫＸ３もしくはＣＫＸ５タンパク質の著しく低下した生物活性または全く生物活性がないことは、野生型ＣＫＸ３もしくはＣＫＸ５アレルによりコードされる機能ＣＫＸ５またはＣＫＸ３タンパク質などの機能ＣＫＸ５もしくはＣＫＸ３タンパク質と比較して、少なくとも１０％、もしくは少なくとも２０％、もしくは少なくとも４０％、もしくは少なくとも６０％、もしくは少なくとも８０％、もしくは少なくとも９０％、もしくは少なくとも９５％、もしくは少なくとも９８％の低下、またはタンパク質活性を検出することができない１００％の低下であり得る。サイトカイニンオキシダーゼ活性を、例えば、Liberos-Minotta and Tipton (1995) Analytical Biochemistry 231, 339-341またはFrebort et al.(2002) Analytical Biochemistry 306, 1-7（両方とも参照することにより保温明細書に組み入れられる）により記載されているように決定することができる。
ＣＫＸ３およびＣＫＸ５タンパク質のアミノ酸配列を、配列リストに示したように、ブラシカ・ナプス（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）から単離した。野生型ＣＫＸ３およびＣＫＸ５配列を示すが、一方、これらの配列およびこれらと本質的に類似の配列の変異体ＣＫＸ３およびＣＫＸ５配列を野生型ＣＫＸ３およびＣＫＸ５配列を参照して下記本明細書中に記載する。
上記のように、本明細書に記載のアブラナ属のＣＫＸ３またはＣＫＸ５タンパク質は約５２０アミノ酸長であり、いくつかの構造ドメインおよび機能ドメインを含んでなる。
本発明による「ＢｎＣＫＸ３−Ａ１アミノ酸配列」または「ＢｎＣＫＸ３−Ａ１多様体アミノ酸配列」は、配列番号９と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列である。これらのアミノ酸配列を、配列リストに示したＣＫＸ３配列と「本質的に類似」または「本質的に同一」であると言ってもよい。
本発明による「ＢｎＣＫＸ３−Ａ２アミノ酸配列」または「ＢｎＣＫＸ３−Ａ２多様体アミノ酸配列」は、配列番号１２と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列である。これらのアミノ酸配列を、配列リストに示したＣＫＸ３配列と「本質的に類似」または「本質的に同一」であると言ってもよい。
本発明による「ＢｎＣＫＸ３−Ｃ１アミノ酸配列」または「ＢｎＣＫＸ３−Ｃ１多様体アミノ酸配列」は、配列番号１５と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列である。これらのアミノ酸配列を、配列リストに示したＣＫＸ３配列と「本質的に類似」または「本質的に同一」であると言ってもよい。
本発明による「ＢｎＣＫＸ３−Ｃ２アミノ酸配列」または「ＢｎＣＫＸ３−Ｃ２多様体アミノ酸配列」は、配列番号１８のいずれか１つと少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列である。これらのアミノ酸配列を、配列リストに示したＣＫＸ３配列と「本質的に類似」または「本質的に同一」であると言ってもよい。
本発明による「ＢｎＣＫＸ５−Ａ１アミノ酸配列」または「ＢｎＣＫＸ５−Ａ１多様体アミノ酸配列」は、配列番号２１と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列である。これらのアミノ酸配列を、配列リストに示したＣＫＸ５配列と「本質的に類似」または「本質的に同一」であると言ってもよい。
本発明による「ＢｎＣＫＸ５−Ｃ１アミノ酸配列」または「ＢｎＣＫＸ５−Ｃ１多様体アミノ酸配列」は、配列番号２４と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列である。これらのアミノ酸配列を、配列リストに示したＣＫＸ５配列と「本質的に類似」または「本質的に同一」であると言ってもよい。
従って、本発明は、多様体およびそのフラグメント（さらに下記に定義するように）を含む野生型機能ＣＫＸ３またはＣＫＸ５タンパク質のアミノ酸配列の両方、同様に、これらのいずれかの変異体アミノ酸配列を提供し、それにより、アミノ酸配列中の変異は、対応する野生型ＣＫＸ３またはＣＫＸ５タンパク質の生物活性と比較したとき、ＣＫＸ３またはＣＫＸ５タンパク質の生物活性を著しく低下させるかまたは完全になくさせる。ＣＫＸ３もしくはＣＫＸ５タンパク質の生物活性の著しい低下または完全な消滅は、本明細書において、基質結合活性または触媒活性の低下または消滅を表し、この結果、変異体ＣＫＸ３もしくはＣＫＸ５タンパク質を発現する植物の花数、さや数および／またはＴＳＷが、対応する野生型植物の花数、さや数および／またはＴＳＷに匹敵する対応する野生型ＣＫＸ３もしくはＣＫＸ５タンパク質を発現する植物と比較して増加する。
内在性および単離アミノ酸配列の両方を本明細書中に提供する。上記定義したＣＫＸ３またはＣＫＸ５アミノ酸配列およびＣＫＸ３またはＣＫＸ５多様体アミノ酸配列のフラグメントも提供する。ＣＫＸ３またはＣＫＸ５アミノ酸配列またはその多様体の「フラグメント」（定義の通り）は、ＣＫＸ３またはＣＫＸ５配列（または多様体配列）の少なくとも１０、１２、１５、１８、２０、５０、１００、１５０、１７５、２００、１５０、３００、３５０または４００隣接アミノ酸など、様々な長さであってよい。ＣＫＸ３タンパク質のこのようなフラグメントの例は、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７または配列番号２８のいずれか１つのアミノ酸配列からなるものである。ＣＫＸ５タンパク質のこのようなフラグメントの例は、配列番号２９、配列番号３０または配列番号３１のいずれか１つのアミノ酸配列からなるものである。
機能ＣＫＸ３またはＣＫＸ５タンパク質のアミノ酸配列
配列リストに示したアミノ酸配列は、ブラシカ・ナプス（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）由来の野生型機能ＣＫＸ３またはＣＫＸ５タンパク質である。従って、これらの配列は、これらが単離されるアブラナ属植物に対して内因性である。他のアブラナ属作物種、品種、育種系統または野生登録物を、上記のように、同じアミノ酸配列またはその多様体を用いて、他の機能ＣＫＸ３またはＣＫＸ５タンパク質についてスクリーニングしてもよい。
加えて、ＣＫＸ３もしくはＣＫＸ５アミノ酸配列およびその多様体（またはこれらのいずれかのフラグメント）を、本質的に類似の配列についてアミノ酸データベースをスクリーニングすることにより、コンピューターを利用して同定してもよい。本発明によるアミノ酸分子のフラグメントも提供する。
変異体ＣＫＸ３またはＣＫＸ５タンパク質のアミノ酸配列
野生型アミノ酸配列に対して１つ以上のアミノ酸欠失、挿入または置換を含んでなるアミノ酸配列は、このような変異体アミノ酸分子のフラグメントであるので、本発明の別の実施形態である。このような変異体アミノ酸配列を、上記のように、様々な公知の方法を用いて生成および／または同定することができる。また、このようなアミノ酸分子を、内在および単離の形態の両方で提供する。
１つの実施形態では、アミノ酸配列中の変異（複数可）は、野生型タンパク質に対してＣＫＸ３またはＣＫＸ５タンパク質の生物活性を著しく低下または完全に消失させる。上記のように、基本的に、野生型タンパク質に対して少なくとも１つのアミノ酸挿入、欠失および／または置換をもたらすいずれもの変異は、生物活性の著しく低下させるかまたは全く生物活性を有しなくすることができる。しかしながら、タンパク質の特定の部分の変異は、短縮タンパク質をもたらす変異などの変異体ＣＫＸ３もしくはＣＫＸ５の低下した機能をよりもたらすと思われ、これにより、表１もしくは２に記載した保存ドメインの主要部分を欠いているかまたは置換されていると理解される。
従って、１つの実施形態では、１つ以上の欠失または挿入変異を含んでなる変異体ＣＫＸ３またはＣＫＸ５タンパク質を提供し、これにより、欠失（複数可）または挿入（複数可）は、インビボで著しく低下した活性を有するかまたは全く活性を有しない変異体タンパク質を産生させる。このような変異体ＣＫＸ３またはＣＫＸ５タンパク質は、少なくとも１つ、少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、１０、２０、３０、５０、１００、１００、１５０、１７５、１８０、２００、２５０、３００、３５０、４００またはそれ以上のアミノ酸を、野生型ＣＫＸ３またはＣＫＸ５タンパク質と比較して欠失または挿入し、それにより、欠失（複数可）または挿入（複数可）は、インビボで著しく低下した活性を有するかまたは全く活性を有しない変異体タンパク質を産生させる。
別の実施形態では、切断されて、これにより、該切断がインビボで著しく低下した活性を有するかまたは全く活性を有しない変異体タンパク質を産生させる、変異体ＣＫＸ３またはＣＫＸ５タンパク質を提供する。このような短縮ＣＫＸ３またはＣＫＸ５タンパク質は、対応する野生型ＣＫＸ３またはＣＫＸ５タンパク質のＣ末端部の機能ドメインを欠き、対応する野生型ＣＫＸ３またはＣＫＸ５タンパク質のＮ末端部を維持する対応するＣＫＸ３またはＣＫＸ５タンパク質である。従って、１つの実施形態では、それまでを含むがＰＧＱｘＩＦモチーフの第一アミノ酸（配列番号３の５１２位に対応する位置）を含まない対応する野生型ＣＫＸ３またはＣＫＸ５タンパク質のＮ末端部を含んでなる短縮ＣＫＸ３またはＣＫＸ５タンパク質を提供する。野生型タンパク質と比較して変異体タンパク質がより短縮されているほど、該切断は、ＣＫＸ３またはＣＫＸ５タンパク質の活性の著しい低下または全く活性がなくなる程度が大きくなる。従って、別の実施形態では、ＦＡＤ結合モチーフの一部または全部を欠いている、および／またはサイトカイニン結合モチーフ（上記のような）の一部または全部を欠いている対応する野生型ＣＫＸ３またはＣＫＸ５タンパク質のＮ末端部を含んでなる短縮ＣＫＸ３またはＣＫＸ５タンパク質を提供する。
さらに別の実施形態では、１つ以上の置換変異を含んでなる変異体ＣＫＸ３またはＣＫＸ５タンパク質を提供し、これにより、置換（複数可）は、インビボで著しく低下した活性を有するかまたは全く活性を有しない変異体タンパク質を産生させる。このような変異体ＣＫＸ３またはＣＫＸ５タンパク質は、これにより上記特定の機能、基質結合もしくは触媒機能を有する保存アミノ酸残基が置換されるＣＫＸ３またはＣＫＸ５タンパク質である。従って、１つの実施形態では、サイトカイニン結合モチーフ、ＦＡＤ結合モチーフ、ＧＩＷｅＶＰＨＰＷＬＮＬモチーフ、またはＰＧＱｘＩＦモチーフなどの生物機能を有する保存アミノ酸残基の置換を含んでなる変異体ＣＫＸ３またはＣＫＸ５タンパク質を提供する。
本発明による方法
当技術分野において従来用いられている方法の範囲、例えば、ｃｋｘ３またはｃｋｘ５ゲノムまたはｃＤＮＡの一部または全部を増幅するＰＣＲベース方法を用いて変異体ｃｋｘ３またはｃｋｘ５アレルを生成（例えば、変異誘発または遺伝子ターゲティングにより誘発）および／または同定してもよい。
変異誘発後、公知技術を用いて、植物を処理した種子から成長し、または処理した細胞から再生する。例えば、変異誘発した種子を、従来の栽培手順に従って植えてもよく、自家受粉後、種子を植物上に生成する。あるいは、倍加半数体栄養分体を処理した小胞子または花粉細胞から抽出して、例えば、Ｃｏｖｅｎｔｒｙら（1988, Manual for Microspore Culture Technique for Brassica napus. Dep. Crop Sci. Techn. Bull. OAC Publication 0489. Univ. of Guelph, Guelph, Ontario, Canada）により記載されているように、ホモ接合植物を直ぐに生成してもよい。現世代または次世代におけるこのような自家受粉の結果として生成した追加の種子を収穫し、当技術分野において従来用いられている技術、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）ベース技術（ｃｋｘ３／ｃｋｘ５アレルの増幅）またはハイブリダイゼーションベース技術、例えば、サザンブロット解析、ＢＡＣライブラリースクリーニングなど、および／またはｃｋｘ３／ｃｋｘ５アレルの直接的配列決定を用いて、変異体ＣＫＸ３またはＣＫＸ５アレルの存在についてスクリーニングしてもよい。変異体ＣＫＸ３またはＣＫＸ５アレル中の点変異（いわゆる、一塩基遺伝子多型またはＳＮＰ）の存在をスクリーニングするため、当技術分野において従来用いられているＳＮＰ検出方法を使用することができ、例えば、オリゴライゲーションベース技術、一塩基伸長法ベース技術またはＴＩＬＬＩＮＧなどの制限酵素部位の差に基づいた技術がある。
上記のように、特定の野生型ＣＫＸ３またはＣＫＸ５アレルの変異誘発（自然ならびに誘発）は、得られた変異体ＣＫＸ３またはＣＫＸ５アレル中の１つ以上の欠失、挿入、または置換ヌクレオチド（以後、「変異領域」と呼ぶ）の存在をもたらす。従って、変異体ＣＫＸ３またはＣＫＸ５アレルを、野生型ＣＫＸ３またはＣＫＸ５アレル中の１つ以上の欠失、挿入、または置換ヌクレオチドの位置および構成により特徴付けることができる。１つ以上のヌクレオチドが、それぞれ、挿入、欠失、または置換されている野生型ＣＫＸ３またはＣＫＸ５アレル中の部位は、本明細書において、「変異領域または配列」とも呼ぶ。本明細書で使用するとき、「５’または３’隣接領域または配列」は、少なくとも２０ｂｐ、好ましくは５０ｂｐ、少なくとも７５０ｂｐ、少なくとも１５００ｂｐ、５０００ｂｐ以下の１つ以上の欠失、挿入、もしくは置換ヌクレオチドを含むＤＮＡと異なるＤＮＡの変異体（または対応する野生型）ＣＫＸ３もしくはＣＫＸ５アレル、好ましくは、変異体ＣＫＸ３もしくはＣＫＸ５アレル（または対応する野生型ＣＫＸ３またはＣＫＸ５アレル）中の変異領域の直ぐ上流、かつ、変異領域と隣接する（「５’隣接領域または配列」）か、あるいは変異領域の直ぐ下流、かつ変異領域と隣接する（「３’隣接領域または配列」）かいずれかに位置する変異体（または対応する野生型）ＣＫＸ３もしくはＣＫＸ５アレル由来のＤＮＡ中のＤＮＡ領域または配列を表す。本明細書で使用するとき、「連結領域」は、変異領域および５’または３’隣接領域が互いに結合する変異体（または対応する野生型）ＣＫＸ３もしくはＣＫＸ５アレル中のＤＮＡ領域を表す。従って、「変異領域と、５’または３’隣接領域との間の連結領域をスパニングする配列」は、それと隣接する変異配列ならびに隣接配列を含んでなる。
多様体ＣＫＸ３またはＣＫＸ５アレルを、花数、さや数またはさや当たりの種子のＱＴＬを同定および内在するＣＫＸ遺伝子を同定することにより同定してもよい。同様に、多様体ＣＫＸ３またはＣＫＸ５アレルを、花数、さや数またはさや当たりの種子またはシュートもしくは花序分裂組織の大きさについて表現型としてスクリーニングおよび内在するＣＫＸ３またはＣＫＸ５遺伝子／アレルの同定により同定してもよい。
特定の変異体ＣＫＸ３もしくはＣＫＸ５アレルまたは特定の変異体ＣＫＸ３またはＣＫＸ５アレルを含んでなる植物もしくは植物性素材、または特定の変異体ＣＫＸ３またはＣＫＸ５アレルを含んでなる植物性素材を含んでなる産生物は、変異領域を含んでなるゲノム領域の特定の制限酵素地図、分子マーカーまたは隣接領域および／もしくは変異領域の配列などの対応する野生型ＣＫＸ３もしくはＣＫＸ５アレルのゲノムの特徴と比較して、特定の変異体ＣＫＸ３もしくはＣＫＸ５アレルの特定のゲノムの特徴に基づいている。
一旦、特定の変異体ＣＫＸ３またはＣＫＸ５アレルを配列決定したら、分子バイオ技術によってサンプルの核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ)中の変異体ＣＫＸ３またはＣＫＸ５アレルの５’隣接領域、３’隣接領域および／または変異領域内の配列を特異的に認識するプライマーおよびプローブを開発することができる。例えば、ＰＣＲ法を開発して、生物サンプル（植物サンプル、植物性素材または植物性素材を含んでなる産生物）中の変異体ＣＫＸ３またはＣＫＸ５アレルを同定することができる。このようなＰＣＲは、少なくとも２つの特異的「プライマー」に基づく：それぞれ、１つは変異体ＣＫＸ３もしくはＣＫＸ５アレルの５’もしくは３’隣接領域内の配列を認識し、他方は変異体ＣＫＸ３もしくはＣＫＸ５アレルの３’もしくは５’隣接領域内の配列を認識する；または１つは変異体ＣＫＸ３もしくはＣＫＸ５アレルの５’もしくは３’隣接領域内の配列を認識し、他方は変異体ＣＫＸ３もしくはＣＫＸ５アレルの変異領域内の配列を認識する；またはそれぞれ、１つは変異体ＣＫＸ３もしくはＣＫＸ５アレルの５’もしくは３’隣接領域内の配列を認識し、他方は特定の変異体ＣＫＸ３もしくはＣＫＸ５アレル（さらに下記に記載するように）の３’もしくは５’隣接領域と変異領域との間の連結領域をスパニングする配列を認識する。
本発明による変異体ＣＫＸ３またはＣＫＸ５アレルを同定する適切な方法は、生物サンプルを少なくとも２つのプライマーのセットを用いた増幅反応アッセイに付すことを含む方法であり、前記セットは：
（ａ）前記プライマーの１つは変異体ＣＫＸ３またはＣＫＸ５アレルの５’または３’隣接領域を特異的に認識し、前記プライマーの他方は変異体ＣＫＸ３またはＣＫＸ５アレルの変異体領域を特異的に認識する、プライマーセット、ならびに
（ｂ）前記プライマーの１つは変異体ＣＫＸ３またはＣＫＸ５アレルの５’または３’隣接領域を特異的に認識し、前記プライマーの他方は、それぞれ、変異体ＣＫＸ３またはＣＫＸ５アレルの３’または５’隣接領域と変異体領域との間の連結領域を特異的に認識する、プライマーセット
からなる群から選択される。
プライマーは、最適化されたＰＣＲ条件下、５’もしくは３’隣接領域、変異領域内の配列、または特定の変異体ＣＫＸ３もしくはＣＫＸ５アレルの３’もしくは５’隣接領域と変異料金との間の連結領域をスパニングする配列を「特異的に認識」する１５〜３５ヌクレオチドの配列を好適に有する結果、特定のフラグメント（「変異体ＣＫＸ３もしくはＣＫＸ５特定フラグメント」または特異的アンプリコン）を特定の変異体ＣＫＸ３もしくはＣＫＸ５アレルを含んでなる核酸サンプルから増幅される。これは、最適化されたPCR条件下、標的化された変異体ＣＫＸ３またはＣＫＸ５アレルのみが増幅され、植物ゲノム内の他の配列は増幅されないことを意味する。
本発明に適切なＰＣＲプライマーは、次のものであってよい：
−特定の変異体ＣＫＸ３もしくはＣＫＸ５アレルまたはその補体の５’もしくは３’隣接領域から選択される少なくとも１７連続ヌクレオチド、好ましくは２０連続ヌクレオチドのヌクレオチド配列（すなわち、例えば、上記ナンセンス変異、ミスセンス変異もしくはフレームシフト変異と５’もしくは３’の隣接する配列または上表中に示した終止コドン変異もしくは上記に示した置換変異もしくはその補体と５’もしくは３’ の隣接する配列など、本発明の変異体ＣＫＸ３もしくはＣＫＸ５アレル中において欠失、挿入もしくは置換された１つ以上のヌクレオチドと５’もしくは３’の隣接する配列）を含んでなる１７ｎｔ〜約２００ｎｔの長さの範囲であるオリゴヌクレオチド（５’の隣接配列を認識するプライマー）；または
−少なくとも１７連続ヌクレオチド、好ましくは、特定の変異体ＣＫＸ３もしくはＣＫＸ５アレルまたはその補体の変異領域の配列から選択される少なくとも１７連続ヌクレオチド、好ましくは２０ヌクレオチドのヌクレオチド配列（すなわち、例えば、本発明のＣＫＸ３もしくはＣＫＸ５遺伝子中の挿入もしくは置換されたヌクレオチドまたはその補体の配列）を含んでなる１７ｎｔ〜約２００ｎｔの長さの範囲のオリゴヌクレオチド（変異配列を認識するプライマー）。
プライマーは、当然、言及した１７連続ヌクレオチドより長くてもよく、例えば、１８、１９、２０、２１、３０、３５、５０、７５、１００、１５０、２００ｎｔ長またはさらに長くてもよい。プライマーは、言及した隣接および変異配列のヌクレオチド配列から選択されるヌクレオチド配列から完全になり得る。しかしながら、その５’末端（すなわち、３’位置の１７連続ヌクレオチドの外側）におけるプライマーのヌクレオチド配列はあまり重要な意味をもたない。従って、プライマーの５’配列は、隣接または変異配列から選択されるヌクレオチド配列からなり得るが、必要に応じて、いくつか（例えば、１、２、５、１０）のミスマッチを含み得る。プライマーの５’配列は、例えば、制限酵素認識部位を示すヌクレオチド配列などの隣接または変異配列とは無関係のヌクレオチド配列からさらに完全になり得る。ミスマッチを含むこのような無関係の配列または隣接ＤＮＡ配列は、好ましくは１００以下の長さ、より好ましくは５０以下の長さまたはさらに２５以下の長さのヌクレオチドであるべきである。
さらに、適切なプライマーは、隣接配列と変異配列との間の連結領域（すなわち、例えば、それぞれ、上記本発明のＣＫＸ３もしくはＣＫＸ５遺伝子中のナンセンス、ミスセンスもしくはフレームシフト変異を５’もしくは３’の隣接する配列と、ナンセンス、ミスセンスもしくはフレームシフト変異の配列との間の連結領域、または上に示したように可能性のある終止コドン変異または上に示した置換変異を５’もしくは３’ の隣接する配列と、終止コドン変異もしくは置換変異の配列との間の連結領域などの、本発明の変異体ＣＫＸ３もしくはＣＫＸ５アレル中の欠失、挿入もしくは置換された１つ以上のヌクレオチドを５’もしくは３’ の隣接する配列と、挿入もしくは置換された１つ以上のヌクレオチドの配列または欠失した１つ以上のヌクレオチドをそれぞれ３’もしくは５’ の隣接する配列との間の連結領域）をスパニングするヌクレオチド配列を含んでなるかまたは該ヌクレオチド配列からなり得るが、但し、該ヌクレオチドの配列は全く変異領域由来でも隣接領域由来でもない。
適切に選択されたＰＣＲプライマー対は、互いに相補する配列も含まないことは当業者にはすぐに明白になろう。
本発明の目的のため、「配列番号Ｘで示されるヌクレオチド配列の補体」は、シャルガフの法則（Ａ＜−＞Ｔ；Ｇ＜−＞Ｃ）に従ったその相補ヌクレオチドによりヌクレオチドを置換し、５’から３’への方向、すなわち、示したヌクレオチド配列の反対方向に配列を読むことにより示されたヌクレオチド配列から誘導することができるヌクレオチド配列である。
特定の変異体ＣＫＸ３またはＣＫＸ５アレルを同定するのに適切なプライマーの例は、実施例に記載する。
本明細書で使用するとき、「Ｘ位〜Ｙ位の配列番号Ｚのヌクレオチド配列」は、ヌクレオチド両末端を含むヌクレオチド配列を示す。
好ましくは、増幅したフラグメントは、５０〜５００ヌクレオチド長、または１００〜３５０ヌクレオチド長など、５０〜１０００ヌクレオチド長を有する。特定のプライマーは、特定の変異体ＣＫＸ３もしくはＣＫＸ５アレルの５’もしくは３’隣接領域内の配列、変異領域内の配列、または３’もしくは５’隣接領域と変異領域との間の連結領域をスパニングする配列と８０〜１００％同一である配列を有してもよいが、但し、ミスマッチは最適化されたＰＣＲ条件下これらのプライマーを含む特定の変異体ＣＫＸ３もしくはＣＫＸ５アレルの特異的同定をさらに可能とする。しかしながら、許容可能なミスマッチの範囲は実験的に容易に決定することができ、当業者に公知である。
「変異体ＣＫＸ３またはＣＫＸ５特定フラグメント」の欠失および／または同定を、様々な方法、例えば、ゲル後のサ寸法推定もしくはキャピラリー電気泳動または蛍光ベース検出法により行うことができる。変異体ＣＫＸ３またはＣＫＸ５特異的フラグメンを直接的に配列決定してもよい。増幅ＤＮＡフラグメントを検出する他の配列特異的方法も当技術分野において公知である。
「ＰＣＲ応用マニュアル」（「ＰＣＲ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｍａｎｕａｌ」）（Roche Molecular Biochemicals, 3rd Edition, 2006）および他の参考文献など、標準ＰＣＲプロトコルが当技術分野で記載されている。特異的プライマー配列を含む、ＰＣＲ用最適条件は、各特定の変異体ＣＫＸ３またはＣＫＸ５アレルのため、「ＰＣＲ同定プロトコル」に規定されている。しかしながら、ＰＣＲ同定プロトコルのいくつかのパラメーターは、特定の実験室条件に調節する必要があり得るが、同様な結果を得るためにはわずかにのみ修正し得る。例えば、ＤＮＡ製造のための異なる方法の使用は、例えば、使用するプライマー量、ポリメラーゼ、ＭｇＣｌ２濃度またはアニーリング条件の調節を必要とし得る。同様に、他のプライマーの選択は、ＰＣＲ同定プロトコルのための他の最適条件に影響し得る。しかしながら、これらの調節は当業者に明白であり、上前述のものなど、現在のＰＣＲ応用マニュアルにさらに詳細に述べられている。
特定の変異体ＣＫＸ３またはＣＫＸ５アレルを同定するためのＰＣＲ同定プロトコルの例を、実施例に記載する。
あるいは、特定のプライマーを使用して、生物サンプル中の特定の変異体ＣＫＸ３またはＣＫＸ５アレルを同定するための「特異的プローブ」として使用することができる変異体ＣＫＸ３またはＣＫＸ５特定フラグメントを増幅することができる。核酸中のその対応するフラグメントを有するプローブのハイブリダイゼーションを可能とする条件下、生物サンプルの核酸をプローブと接触させると、核酸／プローブハイブリッドを生成する。このハイブリッドの生成を検出することができ（例えば、核酸またはプローブの標識化）、これにより、このハイブリッドの生成は、特定の変異体ＣＫＸ３またはＣＫＸ５アレルの存在を示す。特定プローブとのハイブリダイゼーション（固相担体上または溶液中のいずれかで）に基づくこのような同定方法は、当技術分野において記載されている。特定プローブは、好ましくは、最適条件下、特定の変異体ＣＫＸ３またはＣＫＸ５アレル（以後、「変異体ＣＫＸ３またはＣＫＸ５特定領域」と呼ぶ）の５’もしくは３’隣接領域および／または変異領域内の領域に特異的にハイブリダイズする配列である。好ましくは、特定プローブは、特定領域のヌクレオチド配列と少なくとも８０％、好ましくは８０〜８５％、より好ましくは８５〜９０％、特に好ましくは９０〜９５％、最も好ましくは９５％〜１００％同一（または相補性）である１０〜１０００ｂｐ、５０〜６００ｂｐ、１００〜５００ｂｐ、１５０〜３５０ｂｐの配列を含んでなる。好ましくは、特定プローブは、特定の変異体ＣＫＸ３またはＣＫＸ５アレルの特定領域と同一（または相補性）である約１３〜約１００隣接ヌクレオチドの配列を含んでなる。
変異体ＣＫＸ３またはＣＫＸ５アレルを同定する適切な方法は、少なくとも１つの特定プローブを用いてハイブリダイゼーションアッセイに生物サンプルを付すことを含む方法であり、前記プローブは：
（ａ）変異体ＣＫＸ３またはＣＫＸ５アレルの変異体領域を特異的に認識するプローブ、および
（ｂ）変異体ＣＫＸ３またはＣＫＸ５アレルの３’または５’隣接領域と変異体領域との間の連結領域を特異的に認識するプローブ
からなる群から選択される。
本発明に適切な特定プローブは、次のものであってよい：
−特定の変異体ＣＫＸ３もしくはＣＫＸ５アレルまたはその補体の５’もしくは３’隣接領域から選択される少なくとも１３連続ヌクレオチドのヌクレオチド配列（すなわち、例えば、上記ナンセンス変異、ミスセンス変異もしくはフレームシフト変異と５’もしくは３’の隣接する配列または上表中に示した終止コドン変異もしくは上記に示した置換変異もしくはその補体と５’もしくは３’の隣接する配列など、本発明の変異体ＣＫＸ３もしくはＣＫＸ５アレル中において欠失、挿入もしくは置換された１つ以上のヌクレオチドと５’もしくは３’の隣接する配列）、またはそれと少なくとも８０％配列同一性を有する配列を含んでなる１３ｎｔ〜約１０００ｎｔの長さの範囲であるオリゴヌクレオチド（５’隣接配列を認識するプローブ）；または
−少なくとも１３連続ヌクレオチド、好ましくは、特定の変異体ＣＫＸ３もしくはＣＫＸ５アレルまたはその補体の変異配列から選択される少なくとも１３連続ヌクレオチドのヌクレオチド配列（すなわち、例えば、本発明のＣＫＸ３もしくはＣＫＸ５遺伝子中の挿入もしくは置換されたヌクレオチドまたはその補体の配列）またはそれと少なくとも８０％配列同一性を有する配列を含んでなる１３ｎｔ〜約１０００ｎｔの長さの範囲のオリゴヌクレオチド（変異配列を認識するプローブ）。
プローブは、言及した隣接および変異配列のヌクレオチド配列から選択されるヌクレオチド配列から完全になり得る。しかしながら、その５’または３’末端におけるプローブのヌクレオチド配列はあまり重要な意味をもたない。プローブの５’または３’末端配列は、隣接配列または変異配列から選択されるヌクレオチド配列からなってもよいが、必要に応じて、隣接配列とも変異配列とも関係ないヌクレオチド配列からなってもよい。このような無関係配列は、好ましくは、５０以下の長さ、より好ましくは２５以下の長さまたはさらに２０もしくは１５以下の長さのヌクレオチドであるべきである。
さらに、適切なプローブは、隣接配列と変異配列との間の連結領域（すなわち、例えば、それぞれ、上記本発明のＣＫＸ３もしくはＣＫＸ５遺伝子中のナンセンス、ミスセンスもしくはフレームシフト変異を５’もしくは３’の隣接する配列と、ナンセンス、ミスセンスもしくはフレームシフト変異の配列との間の連結領域、または上表に示したように可能性のある終止コドン変異または上記置換変異を５’もしくは３’の隣接する配列と、可能性のある終止コドンもしくは置換変異の配列との間の連結領域などの、本発明の変異体ＣＫＸ３もしくはＣＫＸ５アレル中の欠失、挿入もしくは置換された１つ以上のヌクレオチドを５’もしくは３’の隣接する配列と、挿入もしくは置換された１つ以上のヌクレオチドの配列または欠失した１つ以上のヌクレオチドをそれぞれ３’もしくは５’の隣接する配列との間の連結領域）をスパニングするヌクレオチド配列を含んでなるかまたは該ヌクレオチド配列からなり得るが、但し、該ヌクレオチドの配列は全く変異領域由来でも隣接領域由来でもない。
特定の変異体ＣＫＸ３またはＣＫＸ５アレルを同定するのに適切な特定プローブの例は、実施例に記載する。
特定プローブにハイブリダイズする「変異体ＣＫＸ３またはＣＫＸ５特定領域」の欠失および／または同定を、様々な方法、例えば、ゲル電気泳動後の寸法推定または蛍光ベース検出法により行うことができる。特定プローブにハイブリダイズする「変異体ＣＫＸ３またはＣＫＸ５特定領域」を検出する他の配列特異的方法も当技術分野において公知である。
あるいは、１つ以上の変異体ｃｋｘ５アレルまたはｃｋｘ５およびｃｋｘ３アレルを含んでなる植物もしくは植物部分を、高速中性子変異誘発（Li and Zhang, 2002, Funct Integr Genomics 2:254-258によりレビュー）、ヘテロ二本鎖分析により塩基対変化を検出する変性高速液体クロマトグラフィーを用いたＥＭＳ誘発点変異を同定するＴＩＬＬＩＮＧ（Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｌｏｃａｌ Ｌｅｓｉｏｎｓ ＩＮ Ｇｅｎｏｍｅｓ）法により発生させた欠失変異をスクリーニングするＰＣＲを使用する「Delete-a-gene（商標）」法（McCallum et al., 2000, Nat Biotech 18:455, and McCallum et al. 2000, Plant Physiol. 123, 439-442）、他などの他の方法を用いて生成および同定をすることができる。上記のように、ＴＩＬＬＩＮＧは、変異についてハイスループットスクリーニングを使用する（例えば、変異−野生型ＤＮＡヘテロ二本鎖のＣｅｌ １切断およびシークエンシングゲルシステムを用いた検出を用いて）。従って、１つ以上の変異体ｃｋｘ５アレルまたはｃｋｘ３アレルを含んでなる植物もしくは植物部分を同定するためのＴＩＬＬＩＮＧならびにこのような植物、植物器官、組織および種子を発生および同定する方法の使用は、本明細書に含まれる。従って、１つの実施形態では、本発明による方法は、植物種子の変異誘発（例えば、ＥＭＳ変異誘発）、植物個体またはＤＮＡの貯蔵、対象の領域のＰＣＲ増幅、ヘテロ二本鎖形成およびハイスループット検出、変異植物の同定、変異体ＰＣＲ産物の配列決定の工程を含む。他の変異誘発および選択方法も同様に使用してこのような変異体植物を発生してもよいと理解される。
ＣＫＸ３またはＣＫＸ５アレルの誘発変異の代わりに、天然（自然発生）変異アレルを当技術分野で公知の方法により同定してもよい。例えば、ＥＣＯＴＩＬＬＩＮＧを使用して（Henikoff et al. 2004, Plant Physiology 135(2):630-6）複数の植物または植物部分を天然変異体ｃｋｘ３／ｃｋｘ５アレルについてスクリーニングしてもよい。上記変異誘発技術に関して、好ましくは、Ａおよび／またはＣゲノムを含んでなるブラシカ種をスクリーニングし、続いて、同定されたｃｋｘ３／ｃｋｘ５アレルを交配（種間交雑または種内交配）および選択によりブラシカ・ナプス（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）などの他のブラシカ種に導入することができる。ＥＣＯＴＩＬＬＩＮＧでは、育種系統または近縁種内の天然多型を、植物の個体または貯蔵物をｃｋｘ３／ｃｋｘ５標的のＰＣＲ増幅、ヘテロ二本鎖形成およびハイスループット分析に使用する上記ＴＩＬＬＩＮＧ方法によりスクリーニングする。引き続き、その後育種プログラムで使用して所望の変異アレルを組み込むことができる必要な変異を有する個々の植物を選択することができる。
それから、同定した変異アレルを配列決定することができ、この配列を野生型アレルと比較して変異（複数可）を同定することができる。必要に応じて、前述の通り機能性を試験することができる。このアプローチを用いて、複数の変異体ｃｋｘ３／ｃｋｘ５アレル（およびこれらの１つ以上を含んでなるアブラナ属植物）を同定することができる。それから、所望の変異アレルを、さらに後述するように交配および選択方法により所望の野生型アレルと組み合わせることができる。最終的に、所望の数の変異体ｃｋｘ３／ｃｋｘ５および所望の数の野生型ＣＫＸ３またはＣＫＸ５アレルを含んでなる単一植物を生成する。
特定の変異体ＣＫＸ３またはＣＫＸ５アレルの検出のためのＰＣＲプライマーまたは特定プローブとして適切なオリゴヌクレオチドを使用して特定の変異体ＣＫＸ３またはＣＫＸ５アレルの接合性状態を決定する方法を開発することもできる。
特定の変異体ＣＫＸ３またはＣＫＸ５アレルの接合性状態を決定するため、ＰＣＲベースアッセイを開発して変異体および／または対応する野生型ＣＫＸ３またはＣＫＸ５特定アレルの存在を決定することができる。
特定の変異体ＣＫＸ３またはＣＫＸ５アレルの接合性状態を決定するため、野生型ＣＫＸ３またはＣＫＸ５アレルを特異的に認識する２つのプライマーを、それらが互いの方向に向かいプライマー間に位置する変異領域を有するように設計することができる。これらのプライマーは、それぞれ、５’および３’の隣接配列を特異的に認識するプライマーであってよい。プライマーのこのセットは、変異体、ならびに対応する野生型ＣＫＸ３またはＣＫＸ５アレルの同時診断ＰＣＲ増幅を可能とする。
あるいは、特定の変異体ＣＫＸ３またはＣＫＸ５アレルの接合性状態を決定するため、野生型ＣＫＸ３またはＣＫＸ５アレルを特異的に認識する２つのプライマーを、それらが互いの方向に向かい、それらの１つが変異領域を特異的に認識するように設計することができる。これらのプライマーは、それぞれ、野生型ＣＫＸ３またはＣＫＸ５アレルの５’または３’隣接領域および変異領域を特異的に認識するプライマーであってもよい。変異体ＣＫＸ３またはＣＫＸ５アレルの変異領域の配列を特異的に認識する第三のプライマーを一緒に備えるこのプライマーセットは、変異体ＣＫＸ３またはＣＫＸ５遺伝子、ならびに野生型ＣＫＸ３またはＣＫＸ５遺伝子の同時診断ＰＣＲ増幅を可能とする。
あるいは、特定の変異体ＣＫＸ３またはＣＫＸ５アレルの接合性状態を決定するため、野生型ＣＫＸ３またはＣＫＸ５アレルを特異的に認識する２つのプライマーを、それらが互いの方向に向かい、それらの１つが５’または３’隣接領域と変異領域との間の連結領域を特異的に認識するように設計することができる。これらのプライマーは、５’または３’の隣接配列および、それぞれ、野生型ＣＫＸ３またはＣＫＸ５アレルの変異領域と３’または５’隣接領域との間の連結領域を特異的に認識するプライマーであってよい。それぞれ、変異体ＣＫＸ３またはＣＫＸ５アレルの変異領域と３’または５’隣接領域との間の連結領域を特異的に認識する第三プライマーを一緒に備えるこのプライマーセットは、変異体ＣＫＸ３またはＣＫＸ５遺伝子、ならびに野生型ＣＫＸ３またはＣＫＸ５遺伝子の同時診断ＰＣＲ増幅を可能とする。
あるいは、特定の変異体ＣＫＸ３またはＣＫＸ５アレルの接合性状態を、変異体および野生型ＣＫＸ３またはＣＫＸ５アレルを特異的に認識する代替のプライマーセットを使用することにより決定することができる。
変異体ＣＫＸ３またはＣＫＸ５アレルの接合性状態を決定する適切な方法は、少なくとも２つ「または少なくとも３つのプライマーのセットを用いた増幅反応に、前記植物、またはその細胞、部分、種子もしくは子孫のゲノムＤＮＡを付すことを含み、前記プライマーの少なくとも２つは野生型ＣＫＸ３またはＣＫＸ５アレルを特異的に認識し、前記少なくとも２つのプライマーは：
（ａ）変異体および野生型ＣＫＸ３またはＣＫＸ５アレルの５’または３’隣接領域を特異的に認識する第一プライマー、および野生型ＣＫＸ３またはＣＫＸ５アレルの変異領域を特異的に認識する第二プライマー、ならびに
（ｂ）変異体および野生型ＣＫＸ３またはＣＫＸ５アレルの５’または３’隣接領域を特異的に認識する第一プライマー、および、それぞれ、野生型ＣＫＸ３またはＣＫＸ５アレルの３’または５’隣接領域と変異領域との間の連結領域を特異的に認識する第二プライマー
からなる群から選択され、前記プライマーの少なくとも２つは、変異体ＣＫＸ３またはＣＫＸ５アレルを特異的に認識し、前記少なくとも２つのプライマーは：
（ａ）変異体および野生型ＣＫＸ３またはＣＫＸ５アレルの５’または３’隣接領域を特異的に認識する第一プライマー、および変異体ＣＫＸ３またはＣＫＸ５アレルの変異領域を特異的に認識する第三プライマー、ならびに
（ｂ）変異体および野生型ＣＫＸ３またはＣＫＸ５アレルの５’または３’隣接領域を特異的に認識する第一プライマー、および、それぞれ、変異体ＣＫＸ３またはＣＫＸ５アレルの３’または５’隣接領域と変異領域との間の連結領域を特異的に認識する第三プライマー
からなる群から選択される。
植物が変異体ＣＫＸ３もしくはＣＫＸ５遺伝子または対応する野生型ＣＫＸ３もしくはＣＫＸ５遺伝子に関してホモ接合である場合、上記診断ＰＣＲアッセイは変異体もしくは野生型ＣＫＸ３もしくはＣＫＸ５アレルのいずれかに関して典型的、好ましくは典型的長さの単一ＰＣＲ産物を生じさせるだろう。植物が変異体ＣＫＸ３またはＣＫＸ５アレルに関してホモ接合である場合、２つの特定ＰＣＲ産物は、変異体および野生型ＣＫＸ３またはＣＫＸ５アレルの両方の増幅を反映すると思われる。
野生型および変異体ＣＫＸ３もしくはＣＫＸ５特定ＰＣＲ産物の同定は、例えば、ゲルまたはキャピラリー電気泳動法後の寸法推定（例えば、野生型および変異体ＣＫＸ３もしくはＣＫＸ５アレルから増幅したフラグメント間の寸法差をもたらすいくつかの挿入または欠失したヌクレオチドを含んでなる変異体ＣＫＸ３もしくはＣＫＸ５アレルに対して、結果前記フラグメントをゲル上で可視的に分離することができる）により；ゲルまたはキャピラリー電気泳動法後の２つの異なるフラグメントの存在または非存在を評価して、これにより変異体ＣＫＸ３もしくはＣＫＸ５アレルの診断ＰＣＲ増幅を野生型ＣＫＸ３もしくはＣＫＸ５アレルの診断ＰＣＲ増幅と分離して必要に応じて行うこともできることにより；増幅フラグメントの直接配列決定により；または蛍光ベース検出法により行うことができる。
特定の変異体ＣＫＸ３またはＣＫＸ５アレルの接合状態を決定するのに適切なプライマーの例を実施例に記載する。
あるいは、特定の変異体ＣＫＸ３またはＣＫＸ５アレルの接合性状態を決定するため、ハイブリダイゼーションベースアッセイを開発して変異体および／または対応する野生型ＣＫＸ３またはＣＫＸ５特定アレルの存在を決定することができる。
特定の変異体ＣＫＸ３またはＣＫＸ５アレルの接合性状態を決定するため、野生型ＣＫＸ３またはＣＫＸ５アレルを認識する２つの特定プローブを、各プローブがＣＫＸ３またはＣＫＸ５野生型アレル内の配列を特異的に認識し、かつ、変異領域がプローブにより認識された配列間に位置するように設計することができる。これらのプローブは、それぞれ、５’および３’隣接配列を特異的に認識するプローブであってよい。これらのプローブの１つまたは好ましくは両方の使用は、変異体、ならびに対応する野生型ＣＫＸ３またはＣＫＸ５アレルの同時診断ハイブリダイゼーションを可能とする。
あるいは、特定の変異体ＣＫＸ３またはＣＫＸ５アレルの接合性状態を決定するため、野生型ＣＫＸ３またはＣＫＸ５アレルを認識する２つの特定プローブを、それらの１つが変異領域の上流または下流、好ましくは変異の上流のＣＫＸ３またはＣＫＸ５野生型アレル内の配列を特異的に認識し、かつ、それらの１つが変異領域を特異的に認識するように設計することができる。これらのプローブは、それぞれ、野生型ＣＫＸ３またはＣＫＸ５アレルの５’または３’隣接領域、好ましくは５’隣接領域および変異領域を特異的に認識するプローブであってもよい。必要に応じて、変異体ＣＫＸ３またはＣＫＸ５アレルの変異領域の配列を特異的に認識する第三プローブと一緒に、これらのプローブの１つまたは好ましくは両方の使用は、変異体および野生型ＣＫＸ３またはＣＫＸ５遺伝子の診断ハイブリダイゼーションを可能とする。
あるいは、特定の変異体ＣＫＸ３またはＣＫＸ５アレルの接合性状態を決定するため、野生型ＣＫＸ３またはＣＫＸ５アレルを認識する特定プローブを、プローブが野生型ＣＫＸ３またはＣＫＸ５アレルの５’または３’隣接領域、好ましくは５’隣接領域と変異領域との間の連結領域を特異的に認識するように設計することができる。必要に応じて、野生型ＣＫＸ３またはＣＫＸ５アレルの５’または３’隣接領域、好ましくは５’隣接領域と変異領域との間の連結領域を特異的に認識する第二プローブと一緒に、このプローブは、変異体および野生型ＣＫＸ３またはＣＫＸ５遺伝子の診断ハイブリダイゼーションを可能とする。
あるいは、特定の変異体ＣＫＸ３またはＣＫＸ５アレルの接合性状態を、変異体および野生型ＣＫＸ３またはＣＫＸ５アレルを特異的に認識する代替のプローブセットを使用することにより決定することができる。
変異体ＣＫＸ３またはＣＫＸ５アレルの接合性状態を決定する適切な方法は、少なくとも２つの特定プローブのセットを用いたハイブリダイゼーションアッセイに、前記植物、またはその細胞、部分、種子もしくは子孫のゲノムＤＮＡを付すことを含み、前記特定プローブの少なくとも１つは野生型ＣＫＸ３またはＣＫＸ５アレルを特異的に認識し、前記少なくとも１つのプローブは：
（ａ）変異体および野生型ＣＫＸ３またはＣＫＸ５アレルの５’または３’隣接領域を特異的に認識する第一プローブ、および野生型ＣＫＸ３またはＣＫＸ５アレルの変異領域を特異的に認識する第二プローブ、
（ｂ）変異体および野生型ＣＫＸ３またはＣＫＸ５アレルの５’または３’隣接領域を特異的に認識する第一プローブ、および、それぞれ、野生型ＣＫＸ３またはＣＫＸ５アレルの３’または５’隣接領域と変異領域との間の連結領域を特異的に認識する第二プローブ、ならびに
（ｃ）野生型ＣＫＸ３またはＣＫＸ５アレルの５’または３’隣接領域と変異体領域との間の連結領域を特異的に認識するプローブ
からなる群から選択され、前記特定プローブの少なくとも１つは、変異体ＣＫＸ３またはＣＫＸ５アレルを特異的に認識し、前記少なくとも１つのプローブは：
（ａ）変異体および野生型ＣＫＸ３またはＣＫＸ５アレルの５’または３’隣接領域を特異的に認識する第一プローブ、および変異体ＣＫＸ３またはＣＫＸ５アレルの変異領域を特異的に認識する第三プローブ、
（ｂ）変異体および野生型ＣＫＸ３またはＣＫＸ５アレルの５’または３’隣接領域を特異的に認識する第一プローブ、および変異体ＣＫＸ３またはＣＫＸ５アレルの５’または３’隣接領域と変異領域との間の連結領域を特異的に認識する第三プローブ、ならびに
（ｃ）変異体ＣＫＸ３またはＣＫＸ５アレルの５’または３’隣接領域と変異体領域との間の連結領域を特異的に認識するプローブ
からなる群から選択される。
植物が変異体ＣＫＸ３もしくはＣＫＸ５遺伝子または対応する野生型ＣＫＸ３もしくはＣＫＸ５遺伝子に関してホモ接合である場合、上記診断ハイブリダイゼーションアッセイは変異体もしくは野生型ＣＫＸ３もしくはＣＫＸ５アレルのいずれかに関して典型的、好ましくは典型的長さの１つ以上のハイブリダイズするＤＮＡ（制限）フラグメントなどの単一特定ハイブリダイゼーション生成物を生じさせるだろう。植物が変異体ＣＫＸ３またはＣＫＸ５アレルに関してホモ接合である場合、２つの特定ハイブリダイゼーション生成物は、変異体および野生型ＣＫＸ３またはＣＫＸ５アレルの両方のハイブリダイゼーションに反映すると思われる。
野生型および変異体ＣＫＸ３もしくはＣＫＸ５特定ハイブリダイゼーション生成物の同定は、例えば、ゲルまたはキャピラリー電気泳動法後の寸法推定（例えば、野生型および変異体ＣＫＸ３もしくはＣＫＸ５アレルからのハイブリダイズするＤＮＡ（制限）フラグメント間の寸法差をもたらすいくつかの挿入または欠失したヌクレオチドを含んでなる変異体ＣＫＸ３もしくはＣＫＸ５アレルに対して、結果前記フラグメントをゲル上で可視的に分離することができる）により；ゲルまたはキャピラリー電気泳動法後の２つの異なる特定ハイブリダイゼーション生成物の存在または非存在を評価して、これにより変異体ＣＫＸ３もしくはＣＫＸ５アレルの診断ハイブリダイゼーション野生型ＣＫＸ３もしくはＣＫＸ５アレルの診断ハイブリダイゼーションと分離して必要に応じて行うこともできることにより；ハイブリダイズするＤＮＡ（制限）フラグメントの直接配列決定により；または蛍光ベース検出法により行うことができる。
特定の変異体ＣＫＸ３またはＣＫＸ５アレルの接合状態を決定するのに適切なプローブの例を実施例に記載する。
さらに、ＰＣＲまたはハイブリダイゼーションベース増幅方法と異なる特定の変異体ＣＫＸ３またはＣＫＸ５アレルに対して特異的な検出方法も、本明細書で提供した特定の変異体ＣＫＸ３またはＣＫＸ５アレル特定配列情報を用いて開発することができる。このような代替の検出方法としては、インベーダー（Ｉｎｖａｄｅｒ）（商標）技術としても公知である特定の核酸構造の侵入的開裂に基づく線形単一増幅検出方法（例えば、米国特許第５，９８５，５５７号、“Invasive Cleavage of Nucleic Acids”, 6,001,567 “Detection of Nucleic Acid sequences by Invader Directed Cleavage、またはLyamichev et al., 1999, Nature Biotechnology 17: 292に記載されているように、参照により本明細書に組み入れられる）、ＴａｑｍａｎなどのＲＴ−ＰＣＲベース検出方法、またはＳＮＰｌｅｘなどの他の検出方法が挙げられる。手短に言えば、インベーダー（商標）技術では、標的変異配列を、例えば、変異配列のヌクレオチド配列または３’隣接領域と変異領域との間の連結領域をスパニングする配列を含んでなる標識化第一核酸オリゴヌクレオチド、および変異配列と直下流かつ隣接する５’隣接配列を含んでなる第二核酸オリゴヌクレオチドでハイブリダイズしてもよく、第一および第二オリゴヌクレオチドは少なくとも１つのヌクレオチドにより重なっている。さらに、標的変異配列を、例えば、変異配列のヌクレオチド配列または５’隣接領域と変異領域との間の連結領域をスパニングする配列を相補する標識化第一核酸オリゴヌクレオチド、および変異配列と直下流かつ隣接する３’隣接配列を相補する第二核酸オリゴヌクレオチドでハイブリダイズしてもよく、第一および第二オリゴヌクレオチドは少なくとも１つのヌクレオチドにより重なっている。このハイブリダイゼーションにより生成された二本鎖または三本鎖構造は、標的配列を未変化としたまま酵素（Ｃｌｅａｖａｓｅ（登録商標））を含む選択的プローブ切断を可能とする。その後、切断された標識化プローブを、さらなるシグナル増幅をもたらす中間工程を経て強力に検出する。さらなる実施形態では、第一核酸オリゴヌクレオチドは、その５’末端において標的変異体と相補でないかまたは対応していない５’フラップ、ならびに該フラップの直下流において３’隣接領域と変異領域との間の連結領域を含んでなり、該変異配列は前記連結領域の５’末端にあり、前記第二核酸オリゴヌクレオチドは、該変異領域の直上流かつ隣接する５’隣接配列、ならびに５’隣接配列の直下流のその３’末端においていずれかのヌクレオチドであり得る１つの追加のヌクレオチドを含んでなる。別の実施形態では、第一核酸オリゴヌクレオチドは、その５’末端において標的変異体または野生型配列と相補性でもなく対応もしていない５’フラップ、ならびに該フラップの直下流において５’隣接領域と変異領域との間の連結領域と相補性である配列を含んでなり、該変異配列の補体は前記連結領域の５’末端にあり、前記第二核酸オリゴヌクレオチドは変異領域の直上流かつ隣接する３’隣接配列、ならびに３’隣接配列の補体の直下流のその３’末端においていずれかのヌクレオチドであり得る１つの追加のヌクレオチドと相補性である。第一オリゴヌクレオチドの連結領域に対応するかまたは相補性である配列の長さは、少なくとも５、または少なくとも８、または少なくとも１０，または少なくとも１５、または少なくとも２０、または少なくとも２５、または少なくとも３０、または少なくとも４０、または少なくとも５０ヌクレオチドであってよい。第二オリゴヌクレオチドの隣接配列に対応するかまたは相補性である配列の長さは、少なくとも５、または少なくとも８、または少なくとも１０，または少なくとも１５、または少なくとも２０、または少なくとも２５、または少なくとも３０、または少なくとも４０、または少なくとも５０ヌクレオチドであってよい。第一オリゴヌクレオチドの５’フラップの長さは、少なくとも３、または少なくとも５、または少なくとも８、または少なくとも１０，または少なくとも１５、または少なくとも２０ヌクレオチドであってよい。
変異体ＣＫＸ３またはＣＫＸ５アレルを同定する適切な方法は、生物サンプルを：
（ａ）変異配列または３’隣接領域と変異領域との間の連結領域をスパニングするヌクレオチド配列を含んでなる標識化第一核酸オリゴヌクレオチド、ならびに変異配列の直下流かつ隣接する５’隣接配列を含んでなる第二核酸オリゴヌクレオチドであって、第一および第二オリゴヌクレオチドは少なくとも１つのヌクレオチドにより重なっている前記第一および第二核酸オリゴヌクレオチド、または
（ｂ）変異配列または５’隣接領域と変異領域との間の連結領域をスパニングするヌクレオチド配列と相補性である標識化第一核酸オリゴヌクレオチド、ならびに変異配列の直下流かつ隣接する３’隣接配列と相補性である第二核酸オリゴヌクレオチドであって、第一および第二オリゴヌクレオチドは少なくとも１つのヌクレオチドにより重なっている
ものとハイブリダイゼーションアッセイに付すことを含む方法である。
変異体ＣＫＸ３またはＣＫＸ５アレルを、ＣＫＸ３またはＣＫＸ５アレルの配列を決定することによっても同定することができる。配列決定を当技術分野において公知の方法により行うことができる。
本明細書で使用するとき、「キット」は、本発明の方法を実施する目的、より詳細には、生物サンプル中の特定の変異体ＣＫＸ３もしくはＣＫＸ５アレルを同定または特定の変異体ＣＫＸ３もしくはＣＫＸ５アレルを含んでなる植物性素材の接合性状態を決定する目的のための試薬のセットを表す。より詳細には、本発明のキットの好ましい実施形態は、特定の変異体ＣＫＸ３もしくはＣＫＸ５アレルを同定するための上記少なくとも２つの特定プライマー、または接合性状態を決定するための少なくとも２つもしくは３つの特定プライマーを備える。必要に応じて、キットは、ＰＣＲ同定プロトコルにおける本明細書に記載の他の試薬をさらに備えることができる。あるいは、本発明の別の実施形態に従って、キットは、特定の変異体ＣＫＸ３もしくはＣＫＸ５アレルの同定のため、生物サンプルの核酸と特異的にハイブリダイズして上記のようにその中の特定の変異体ＣＫＸ３もしくはＣＫＸ５アレルの存在を同定する少なくとも１つの特定プローブ、または接合性状態決定のため、少なくとも２つもしくは３つの特定プローブを備えることができる。必要に応じて、キットは、特定プローブを用いて、生物サンプル中の特定の変異体ＣＫＸ３もしくはＣＫＸ５アレルの同定のため、他の試薬（これに限定されないが、ハイブリダイズ用バッファー 、増幅用バッファー、標識）をさらに備えることができる。
本発明のキットを使用することができ、その構成要素は、品質管理（例えば、種子ロットの純度）の目的、植物性素材または、これに限定されないが食品もしくは飼料生産物などの植物性素材を含んでなるもしくは由来の材料中の特定の変異体ＣＫＸ３もしくはＣＫＸ５アレルの存在もしくは非存在の検出のため、特異的に調節することができる。
本明細書で使用するとき、「プライマー」という語は、ＰＣＲなどの鋳型依存過程における新生核酸の合成をプライムすることができるいずれもの核酸を包含する。典型的には、プライマーは１０〜３０ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドであるが、より長い配列を使用することができる。プライマーは、一本鎖の形態が好ましいが、二本鎖の形態で準備してもよい。プローブをプライマーとして使用することができるが、標的ＤＮＡまたはＲＮＡと結合するように設計し、増幅過程で使用する必要はない。
本明細書で使用するとき、「認識する」という語は、特定プライマーを表す場合、特定プライマーが方法に記述されている条件下（ＰＣＲ同定プロトコルの条件など）、特定の変異体ＣＫＸ３またはＣＫＸ５アレル中の核酸配列に特異的にハイブリダイズして、それにより、ポジティブおよびネガティブコントロールの存在により特異性が決定されるという事実を表す。
本明細書で使用するとき、「ハイブリダイズする」という語は、特定プローブを表す場合、特定プローブが標準ストリンジェントな条件下特定の変異体ＣＫＸ３またはＣＫＸ５アレルの核酸配列中の特定領域と結合するという事実を表す。本明細書で使用するとき、標準ストリンジェントな条件は、本明細書に記載されたハイブリダイゼーションのための条件または、例えば、以下の工程を含むことができるＳａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）により記載されたように従来のハイブリダイズする条件（Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbour Laboratory Press, NY）を表す：１）フィルター上に植物ゲノムＤＮＡフラグメントまたはＢＡＣライブラリーＤＮＡを固定し、２）６Ｘ ＳＳＣ、５Ｘ デンハート試薬、０．５％ＳＤＳおよび２０μｇ／ｍｌの変性キャリアＤＮＡ中６５℃で１〜２時間フィルターをプレハイブリダイズし、３）標識化したハイブリダイゼーションプローブを添加し、４）１６〜２４時間インキュベートし、５）６Ｘ ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中６８℃で３０分間１回フィルターを洗浄し、６）２Ｘ ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中６８℃で３回（３０ｍｌ中３０分間を２回および５００ｍｌ中１０分間を１回）フィルターを洗浄し、および７）−７℃でＸ線フィルムに４〜４８時間フィルターを暴露する。
本明細書で使用するとき、「生物サンプル」は、植物、植物性素材または植物性素材を含んでなる生産物のサンプルである。好ましくは、生物サンプルは、ＤＮＡまたはＲＮＡなどの核酸を含有する。「植物」という語は、成熟のいずれもの段階における植物組織、ならびにこのような植物から採取したかまたはこのような植物から誘導されたいずれもの細胞、組織、または器官を包含するものとし、限定されないが、いずれもの種子、葉、茎、花、根、単細胞、配偶子、細胞培養液、組織培養液またはプロトプラストが挙げられる。本明細書で使用するとき、「植物性素材」は、植物から得られたかまたは誘導された物質を表す。植物性素材を含んでなる生産物は、食品、飼料または植物性素材を使用して製造された、または植物性素材が混入し得る他の生産物に関する。本発明に関連して、このような生物サンプルを、サンプル中の核酸の存在を暗示する特定の変異体ＣＫＸ３またはＣＫＸ５アレルに対して特異的な核酸の存在について試験すると理解される。従って、生物サンプル中の特定の変異体ＣＫＸ３またはＣＫＸ５アレルを同定するための本明細書において言う方法は、特定の変異体ＣＫＸ３またはＣＫＸ５アレルを含んでなる核酸の生物サンプルにおける同定に関する。
本発明は、１つの植物中の特定のＣＫＸ３またはＣＫＸ５アレルの組合せ、１つの植物から別の植物への１つ以上の特定の変異体ＣＫＸ３またはＣＫＸ５アレルの移動、１つ以上の特定の変異体ＣＫＸ３またはＣＫＸ５アレルを含んでなる植物、これらの植物から得られた子孫、ならびにこれらの植物由来の植物細胞、植物部分、および種子にも関する。
従って、本発明の１つの実施形態では、１つの植物における２つ以上の選択された変異体ＣＫＸ３またはＣＫＸ５アレルの組合せ方法を提供し、該方法は次の工程を含む：
（ａ）上記のように、各々が１つ以上の選択された変異体ＣＫＸ３またはＣＫＸ５アレルを含んでなる２つ以上の植物を生成および／または同定すること、
（ｂ）１つ以上の選択された変異体ＣＫＸ３またはＣＫＸ５アレルを含んでなる第一植物を、１つ以上の他の選択された変異体ＣＫＸ３またはＣＫＸ５アレルを含んでなる第二植物と交配し、交配物からＦ１種子を集め、および必要に応じて、上記のように、第二植物由来の１つ以上の選択された変異体ＣＫＸ３またはＣＫＸ５アレルを含む第一植物由来の１つ以上の選択された変異体ＣＫＸ３またはＣＫＸ５アレルを含んでなるＦ１植物を同定すること、
（ｃ）必要に応じて、全ての選択された変異体ＣＫＸ５またはＣＫＸ５およびＣＫＸ３アレルを含んでなるＦ１植物を得るまで、工程（ｂ）を繰り返し、
（ｄ）必要に応じて、
−上記のように、変異体ＣＫＸ３またはＣＫＸ５アレルの接合性状態の決定により選択された変異体ＣＫＸ３またはＣＫＸ５アレルに関してホモ接合かまたはヘテロ接合であるＦ１植物を同定すること、または
−次の工程の１つを実施することにより、１つ以上の選択された変異体ＣＫＸ３またはＣＫＸ５アレルに関してホモ接合である植物を生成すること：
−上記のように、１つ以上の選択された変異体ＣＫＸ３またはＣＫＸ５アレルを含んでなるＦ１植物の処理した小胞子または花粉細胞由来の倍加半数体植物を抽出すること、
−１つ以上の世代に対し、１つ以上の選択された変異体ＣＫＸ３またはＣＫＸ５アレルを含んでなるＦ１植物を自家受粉し（ｙ）、自家受粉からのＦ１ Ｓｙ種子を集め、および上記のように、１つ以上の変異体ＣＫＸ３またはＣＫＸ５アレルに関してホモ接合であるＦ１ Ｓｙ植物を同定すること。
本発明の別の実施形態では、１つの植物から別の植物への１つ以上の変異体ＣＫＸ３またはＣＫＸ５アレルの移動方法を提供し、該方法は次の工程を含む：
（ａ）上記のように、１つ以上の選択された変異体ＣＫＸ３またはＣＫＸ５アレルを含んでなる第一植物を生成および／または同定すること、または上記のように、１つの植物中の１つ以上の選択された変異体ＣＫＸ３またはＣＫＸ５アレルの組合せにより第一植物を生成すること（第一植物は１つ以上の変異体ＣＫＸ３またはＣＫＸ５アレルに関してホモ接合またはヘテロ接合である）、
（ｂ）１つ以上の変異体ＣＫＸ３またはＣＫＸ５アレルを含んでなる第一植物を、１つ以上の変異体ＣＫＸ３またはＣＫＸ５アレルを含まない第二植物と交配し、交配物からＦ１種子を集め（第一植物がこの変異体ＣＫＸ３またはＣＫＸ５アレルに関してホモ接合であった場合、種子は変異体ＣＫＸ３またはＣＫＸ５アレルに関してホモ接合であり、第一植物がこの変異体ＣＫＸ３またはＣＫＸ５アレルに関してヘテロ接合であった場合、種子の半分は変異体ＣＫＸ３またはＣＫＸ５アレルに関して不対性、すなわち、含まない）、および必要に応じて上記のように１つ以上の選択された変異体ＣＫＸ３またはＣＫＸ５アレルを含んでなるＦ１植物を同定すること、
（ｃ）１つ以上の世代（ｘ）に対し、１つ以上の選択された変異体ＣＫＸ３またはＣＫＸ５アレルを含んでなるＦ１植物を、１つ以上の選択された変異体ＣＫＸ３またはＣＫＸ５アレルを含まない第二植物と戻し交配し、交配物からＢＣｘ種子を集め、上記のように、全世代において１つ以上の選択された変異体ＣＫＸ３またはＣＫＸ５アレルを含んでなるＢＣｘ植物を同定すること、
（ｄ）必要に応じて、次の工程の１つを実施することにより、１つ以上の選択された変異体ＣＫＸ３またはＣＫＸ５アレルに関してホモ接合であるＢＣｘ植物を生成すること：
−上記のように、１つ以上の所望の変異体ＣＫＸ３またはＣＫＸ５アレルを含んでなるＢＣｘ植物の処理した小胞子または花粉細胞由来の倍加半数体植物を抽出すること、
−１つ以上の世代に対し、１つ以上の所望の変異体ＣＫＸ３またはＣＫＸ５アレルを含んでなるＢＣｘ植物を自家受粉し（ｙ）、自家受粉からのＢＣｘ Ｓｙ種子を集め、および上記のように、１つ以上の所望の変異体ＣＫＸ３またはＣＫＸ５アレルに関してホモ接合であるＢＣｘ Ｓｙ植物を同定すること。
前記１つの植物から別の植物への１つ以上の変異体ＣＫＸ３またはＣＫＸ５アレルの移動方法は、１つの植物中の１つ以上の変異体ＣＫＸ３またはＣＫＸ５アレルを組合せるためにも適切であり、少なくとも２つの選択された変異体ＣＫＸ３またはＣＫＸ５アレルの前記組合せ方法は、次の工程を含む：
（ａ）各々が少なくとも１つの選択された変異体ＣＫＸ３またはＣＫＸ５アレルを含む少なくとも２つの植物を同定し、
（ｂ）該少なくとも２つの植物を交配し、少なくとも１つの交配物からＦ１雑種種子を集め、および
（ｃ）必要に応じて、少なくとも２つの選択された変異体ＣＫＸ３またはＣＫＸ５アレルを含んでなるＦ１植物を同定する。
前記少なくとも１つの選択された変異体ＣＫＸ３またはＣＫＸ５アレルを含んでなる前記植物を、本明細書に記載した方法を用いて同定することができる。
本発明の１つの態様では、第一および第二植物は、アブラナ科植物、詳細にはアブラナ属植物、特にブラシカ・ナプス（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）植物または別のアブラナ属作物種からの植物である。本発明の別の態様では、第一植物は、アブラナ科植物、詳細にはアブラナ属植物、特にブラシカ・ナプス（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）植物または別のアブラナ属作物種からの植物であり、第二植物は、アブラナ科育種系統、詳細にはアブラナ属育種系統、特にブラシカ・ナプス（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）育種系統または別のアブラナ属作物種からの育種系統からの植物である。本明細書で使用するとき、「育種系統」は、好ましくは、ハイブリッド子孫を産生するために使用する好ましい遺伝型および／または表現型による他の植物系統から区別可能なホモ接合植物系統である。
本発明のさらに別の実施形態では、植物、詳細には、この花数、さや数またはＴＳＷが増加する、ブラシカ・ナプス（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）植物などのアブラナ属作物の製造方法を提供し、上記のように、１つのアブラナ属植物中にまたは植物へ、本発明による変異体ＣＫＸ５またはＣＫＸ５およびＣＫＸ３アレルを組合せおよび／または移動することを含む。
少なくとも１つの変異体ＣＫＸ５アレルもしくは少なくとも１つの変異体ＣＫＸ５および変異体ＣＫＸ３アレルをアブラナ属植物中に導入すること、または本発明によるキメラ遺伝子をアブラナ属植物に導入することを含む、花数、さや数もしくはＴＳＷの増加方法も、本明細書において提供する。
１つのアブラナ属植物中にまたは植物へ、本発明による変異体ＣＫＸ３またはＣＫＸ５アレルを組合せおよび／または移動することを含む本明細書に記載した方法を用いて、変異体ＣＫＸ３またはＣＫＸ５アレルを、前記アブラナ属植物中に導入することができる。変異体ＣＫＸ３またはＣＫＸ５アレルを、例えば、変異誘発または遺伝子ターゲティングによっても導入することができる。前記方法は、本明細書に記載した方法を用いて、変異体ＣＫＸ３またはＣＫＸ５アレルの存在を同定することをさらに含むことができる。
本発明によるキメラ遺伝子を、形質転換を用いて、アブラナ属植物中に導入することができる。
花数、さや数またはＴＳＷの増加方法は：
（ａ）１つ以上のキメラ遺伝子を有する植物細胞を準備してトランスジェニック植物を作製することであって、前記キメラ遺伝子は次の機能的に連結したＤＮＡフラグメントを含んでなる、前記準備してトランスジェニック植物を作製すること：
ｉ．植物発現可能なプロモーター；
ｉｉ．転写された場合、１つ以上のＣＫＸ５遺伝子／タンパク質または２つのＣＫＸ５および１つ以上のＣＫＸ３遺伝子またはタンパク質の発現またはタンパク質活性を阻害するＲＮＡまたはタンパク質分子を産生するＤＮＡ領域；ならびに必要に応じて
ｉｉｉ．転写終結およびポリアデニル化に関与する３’末端領域；
（ｂ）前記トランスジェニック植物細胞からトランスジェニック植物系統の集団を再生すること；ならびに
（ｃ）前記トランスジェニック植物系統の集団内の花数が増加した植物系統を同定すること
を含み得る。
キメラ遺伝子の製造手法は、当技術分野において周知である。キメラ遺伝子およびこのようなキメラ遺伝子を含んでなるベクター、特に植物形質転換に適切な製造方法は、米国特許第４，９７１，９０８号、米国特許第４，９４０，８３５号、米国特許第４，７６９，０６１号および米国特許第４，７５７，０１１号に記載されている。キメラ遺伝子は、１つ以上の追加の核酸配列を含んでいてもよい。
前記キメラ遺伝子を、形質転換により前記アブラナ属植物に導入してもよい。本明細書において「形質転換」という語は、植物または植物細胞もしくは植物細胞を含む組織、プロトプラスト、カルス、根、塊茎、種子、茎、葉、実生、胚および花粉など、レシピエント宿主中に核酸を導入（または移動）することを表す。形質転換した核酸配列を含む植物を「トランスジェニック植物」と呼ぶ。形質転換、トランスジェニックおよび組換えは、異種核酸分子（例えば、発現カセットまたは組換えベクター）を導入した植物などの宿主生物を表す。形質転換核酸を植物のゲノム中に安定に組み込むことができる。
本明細書で使用するとき、「トランスジェニック植物」という言い回しは、植物のゲノム、例えば、核ゲノムまたは色素体ゲノム中に安定に導入された形質転換核酸を有する植物を表す。言い換えれば、形質転換核酸配列を含む植物を「トランスジェニック植物」と呼ぶ。形質転換および組換えは、異種核酸分子（例えば、本明細書に記載のプロモーター、キメラ遺伝子またはベクター）を導入した植物などの宿主生物を表す。核酸を植物のゲノム中に安定に組み込むことができる。
形質転換方法は当技術分野において周知であり、アグロバクテリウム媒介形質転換が挙げられる。ワタのアグロバクテリウム媒介形質転換は、例えば、米国特許第５，００４，８６３号、米国特許第６，４８３，０１３号および国際公開第２０００／７１７３３号に記載されている。粒子衝突によっても植物を形質転換してもよい：金またはタングステンの粒子をＤＮＡで被覆してから若い植物細胞または植物胚中に撃ち込む。この方法は植物色素体の形質転換も可能とする。ウイルス形質転換（形質導入）を、ウイルスゲノムの性質に応じて、遺伝子の一時的または安定した発現のために使用してもよい。所望の遺伝子物質を適切な植物ウイルス中にパッケージして、改変ウイルスを植物に感染可能にする。感染された植物の子孫はウイルスを含まず、挿入された遺伝子も含まない。ウイルス形質転換のための適切な方法は、例えば、国際公開第９０／１２１０７号、国際公開第０３／０５２１０８号または国際公開第２００５／０９８００４号に記載されまたはさらに詳細に述べられている。当技術分野で周知のさらに適切な方法は、顕微注射、無傷細胞のエレクトロポレーション、ポリエチレングリコール媒介プロトプラスト形質転換、プロトプラストのエレクトロポレーション、リポソーム媒介形質転換、珪素ホイスカー媒介形質転換などである。前記トランスジーンを前記植物細胞のゲノム中に安定に組み込んでもよく、形質転換植物細胞を得る。それから、この方法で得られた形質転換植物細胞を成熟した稔性形質転換植物中に再生してもよい。
本発明の１つの態様では、本発明による植物は、上記（４つのＣＫＸ３および２つのＣＫＸ５アレル）のように、アブラナ属植物中にまたは植物へ本発明による６つの変異アレルを組合せおよび／または移動することにより花数の増加またはＴＳＷの増加を増加する、少なくとも１つのＣＫＸ５遺伝子、少なくとも２つのＣＫＸ３遺伝子を含んでなるアブラナ属植物である。
本発明のさらに別の実施形態では、少なくとも２つのＣＫＸ５および少なくとも４つのＣＫＸ３遺伝子を含んでなるハイブリッドアブラナ属作物種子または植物、詳細には、その花数またはＴＳＷが増加するハイブリッドブラシカ・ナプス（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）種子または植物の製造方法を提供し、次の工程を含む：
（ａ）上記のように、ホモ接合状態で第一および第二の選択された変異体ＣＫＸ５アレルを含んでなる第一植物、およびホモ接合状態で少なくとも１つの選択された変異体ＣＫＸアレルを含んでなる第二植物を生成および／または同定すること、
（ｂ）第一および第二植物を交配し、交配物からＦ１雑種種子を集めること。
本発明の１つの態様では、第一および第二の選択された変異体ＣＫＸ５アレルは、第三の選択された変異体ＣＫＸ３またはＣＫＸ５アレルと同じ変異体ＣＫＸ５アレルであってもよく、その結果、Ｆ１雑種種子は１つの変異体ＣＫＸ５アレルに関してホモ接合であり、その他に関してヘテロ接合である。本発明の別の態様では、第一植物を雄親植物として使用し、第二植物を雌親植物として使用する。
本発明による「植物（単数）」または「植物（複数）」を表すときはいつでも、植物部分（細胞、組織または器官、種子さや、種子、根、葉、花、花粉、他などの切断部）、自家受粉または交配、例えば、雑種種子（２つの近交系親系統の交配により得られる）、交配植物およびそれ由来の植物部分などの、親の際立った特徴を保持する該植物の子孫（特に、果実裂開特性）が、別段の指示がない限り、本明細書に包含されると理解される。
いくつかの実施形態では、本発明の植物細胞、すなわち、少なくとも１つの変異体ＣＫＸ５または少なくとも１つの変異体ＣＫＸ３もしくはＣＫＸ５アレルを含んでなる植物細胞、または少なくとも１つのＣＫＸ５もしくは少なくとも１つのＣＫＸ５および１つのＣＫＸ３遺伝子の発現が減少する植物細胞、ならびに本発明の方法に従って生成した植物細胞は、非増殖細胞であり得る。
本発明に従って得られた植物を従来の育種法で使用して同じ特徴を有する植物をより多く産生、または同じもしくは近縁植物種の他の品種または交配植物中の少なくとも１つのＣＫＸ５の発現が減少した少なくとも１つの変異体ＣＫＸ５アレルの存在の特徴を導入することができる。得られた植物を、種苗の作製用にさらに使用することができる。本発明に従った植物をさらに使用して、配偶子、種子（粉砕種子およびシードケーキを含む）、種油、胚、接合体あるいは細胞体のいずれか、本発明の方法により得られた植物の子孫もしくは雑種を製造することができる。本発明による植物から得られた種子も本発明に包含される。
本明細書で使用するとき、「種苗作製」は、さらなる植物、植物部分または種子を製造する当技術分野で公知のいずれもの手段に関し、とりわけ、栄養生殖法（例えば、高取り法または取り木、株分け、（芽）接ぎ、微細繁殖法、ストロンまたはランナー、球根、子実、塊茎および根茎などの貯蔵器官、（挿し木、種子の）発根または挿し木、ツインスケーリング）、有性生殖（別の植物との交配）および無性生殖（例えば、無配偶生殖、体細胞雑種）が挙げられる。
本明細書で使用するとき、「含んでなる（含む、備える）（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、指定した数字、整数、工程または構成要素を言った通り規定するが、１つ以上の数字、整数、工程または構成要素、またはその群の存在または追加を除外するものではないと解釈すべきである。従って、例えば、ヌクレオチドまたはアミノ酸の配列を含んでなる核酸またはタンパク質は実際に述べたものより多いヌクレオチドまたはアミノ酸を含んでもよく、すなわち、より大きな核酸またはタンパク質に組み込まれていてもよい。機能的または構造的に明確である核酸を含んでなるキメラ遺伝子は、追加のＤＮＡ領域などを含んでもよい。
１４２キロバイト（マイクロソフトＷｉｎｄｏｗｓ（登録商標）で測定した大きさ）であるファイル名「ＢＣＳ１５−２０１２ ＳＴ２５．ｔｘｔ」に含まれる配列リストは４５個の配列を含み、配列番号１〜配列番号４５は電子申請により本明細書と一緒に提出され、参照することにより本明細書に組み入れられるものとする。
明細書および実施例中、次の配列を参照する：
配列
配列番号１：アラビドプシス・タリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）ＣＫＸ３ゲノム配列 Ａｔ５ｇ５６９７０
配列番号２：アラビドプシス・タリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）ＣＫＸ３ ｃＤＮＡ配列（コード配列）
配列番号３：アラビドプシス・タリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）ＣＫＸ３アミノ酸配列
配列番号４：アラビドプシス・タリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）ＣＫＸ５ ゲノム配列 Ａｔ１ｇ７５４５０
配列番号５：アラビドプシス・タリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）ＣＫＸ５ ｃＤＮＡ配列（コード配列）
配列番号６：アラビドプシス・タリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）ＣＫＸ５アミノ酸配列
配列番号７：ブラシカ・ナプス（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）ＣＫＸ３−Ａ１ゲノム配列
配列番号８：ブラシカ・ナプス（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）ＣＫＸ３−Ａ１ ｃＤＮＡ配列（コード配列）
配列番号９：ブラシカ・ナプス（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）ＣＫＸ３−Ａ１ アミノ酸配列
配列番号１０：ブラシカ・ナプス（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）ＣＫＸ３−Ａ２ゲノム配列
配列番号１１：ブラシカ・ナプス（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）ＣＫＸ３−Ａ２ ｃＤＮＡ配列（コード配列）
配列番号１２：ブラシカ・ナプス（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）ＣＫＸ３−Ａ２ アミノ酸配列
配列番号１３：ブラシカ・ナプス（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）ＣＫＸ３−Ｃ１ゲノム配列
配列番号１４：ブラシカ・ナプス（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）ＣＫＸ３−Ｃ１ ｃＤＮＡ配列（コード配列）
配列番号１５：ブラシカ・ナプス（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）ＣＫＸ３−Ｃ１ アミノ酸配列
配列番号１６：ブラシカ・ナプス（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）ＣＫＸ３−Ｃ２ゲノム配列
配列番号１７：ブラシカ・ナプス（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）ＣＫＸ３−Ｃ２ ｃＤＮＡ配列（コード配列）
配列番号１８：ブラシカ・ナプス（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）ＣＫＸ３−Ｃ２ アミノ酸配列
配列番号１９：ブラシカ・ナプス（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）ＣＫＸ５−Ａ１ゲノム配列
配列番号２０：ブラシカ・ナプス（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）ＣＫＸ５−Ａ１ ｃＤＮＡ配列（コード配列）
配列番号２１：ブラシカ・ナプス（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）ＣＫＸ５−Ａ１ アミノ酸配列
配列番号２２：ブラシカ・ナプス（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）ＣＫＸ５−Ｃ１ゲノム配列
配列番号２３：ブラシカ・ナプス（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）ＣＫＸ５−Ｃ１ ｃＤＮＡ配列（コード配列）
配列番号２４：ブラシカ・ナプス（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）ＣＫＸ５−Ｃ１ アミノ酸配列
配列番号２５：ブラシカ・ナプス（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）ＣＫＸ３−Ａ１ ＹＩＩＮ５０１アミノ酸配列
配列番号２６：ブラシカ・ナプス（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）ＣＫＸ３−Ａ１ ＹＩＩＮ５１２アミノ酸配列
配列番号２７：ブラシカ・ナプス（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）ＣＫＸ３−Ｃ１ ＹＩＩＮ５２１アミノ酸配列
配列番号２８：ブラシカ・ナプス（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）ＣＫＸ３−Ｃ２ ＹＩＩＮ５３１アミノ酸配列
配列番号２９：ブラシカ・ナプス（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）ＣＫＸ５−Ａ１ ＹＩＩＮ８０１アミノ酸配列
配列番号３０：ブラシカ・ナプス（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）ＣＫＸ５−Ａ１ ＹＩＩＮ８０５アミノ酸配列
配列番号３１：ブラシカ・ナプス（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）ＣＫＸ５−Ｃ１ ＹＩＩＮ８１１アミノ酸配列
配列番号３２：ＫＡＳＰプライマーＢｎＣＫＸ３−Ａ１ ＷＴアレル
配列番号３３：ＫＡＳＰプライマーＢｎＣＫＸ３−Ａ１ ＹＩＩＮ５０１アレル
配列番号３４：ＫＡＳＰプライマーＢｎＣＫＸ３−Ａ２ ＷＴアレル
配列番号３５：ＫＡＳＰプライマーＢｎＣＫＸ３−Ａ２ ＹＩＩＮ５１２アレル
配列番号３６：ＫＡＳＰプライマーＢｎＣＫＸ３−Ｃ１ ＷＴアレル
配列番号３７：ＫＡＳＰプライマーＢｎＣＫＸ３−Ｃ１ ＹＩＩＮ５２１アレル
配列番号３８：ＫＡＳＰプライマーＢｎＣＫＸ３−Ｃ２ ＷＴアレル
配列番号３９：ＫＡＳＰプライマーＢｎＣＫＸ３−Ｃ２ ＹＩＩＮ５３１アレル
配列番号４０：ＫＡＳＰプライマーＢｎＣＫＸ５−Ａ１ ＷＴアレル
配列番号４１：ＫＡＳＰプライマーＢｎＣＫＸ５−ＹＩＩＮ８０１ ＷＴアレル
配列番号４２：ＫＡＳＰプライマーＢｎＣＫＸ５−Ａ１ ＷＴアレル
配列番号４３：ＫＡＳＰプライマーＢｎＣＫＸ５−Ａ１ ＹＩＩＮ８０５アレル
配列番号４４：ＫＡＳＰプライマーＢｎＣＫＸ５Ｃ１ ＷＴアレル
配列番号４５：ＫＡＳＰプライマーＢｎＣＫＸ５−Ｃ１ ＹＩＩＮ８１１アレル
実施例において、特に指定しない限り、全ての組換えＤＮＡ技術を、Sambrook and Russell (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, in Volumes 1 and 2 of Ausubel et al. (1994) Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols, USA and in Volumes I and II of Brown (1998) Molecular Biology LabFax, Second Edition, Academic Press (UK)に記載されている標準プロトコルに従って行う。植物分子作業のための標準材料および方法は、Plant Molecular Biology Labfax (1993) by R.D.D. Croy, jointly published by BIOS Scientific Publications Ltd (UK) and Blackwell Scientific Publications, UKに記載されている。ポリメラーゼ連鎖反応のための標準材料および方法は、Dieffenbach and Dveksler (1995) PCR Primer: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, and in McPherson at al. (2000) PCR - Basics: From Background to Bench, First Edition, Springer Verlag, Germanyに見出すことができる。
実施例１−ＣＫＸ３およびＣＫＸ５遺伝子のＤＮＡ配列の単離
ブラシカ・ナプス（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）由来のＣＫＸ３およびＣＫＸ５ヌクレオチド配列を、次のように決定した。
ブラシカ・ナプス（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）由来のゲノムＤＮＡを、標準手順を用いて単離した。記載のアラビドプシス・タリアナ（Ａ． ｔｈａｌｉａｎａ）ＣＫＸ３およびＣＫＸ５遺伝子配列に基づきプライマーを用いてブラシカ・ナプス（Ｂ． ｎａｐｕｓ）ゲノムＤＮＡに対してＰＣＲにより、ＣＫＸ３およびＣＫＸ５遺伝子のフラグメントを単離した。ＰＣＲ産物をクローニングし、配列を決定した。
その後、ＰＣＲ産物からのＣＫＸ３およびＣＫＸ５配列を、ブラシカ・ナプス（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）系統の社内配列データベースのＢＬＡＳＴホモロジー検索においてクエリーとして使用した。４つのＣＫＸ３遺伝子をブラシカ・ナプス（Ｂ． ｎａｐｕｓ）において同定し、２つのＣＫＸ５遺伝子を同定した。ＣＫＸ３およびＣＫＸ５配列の遺伝子およびコード領域を、ＥＳＴ配列情報を用い、アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）ＣＫＸ３遺伝子Ａｔ５ｇ５６９７０およびＣＫＸ５遺伝子Ａｔ１ｇ７５４５０配列情報と比較して決定した。アブラナ属ＣＫＸ３およびＣＫＸ５配列は５つのエクソンを有する。
配列番号７、１０、１３および１６は、それぞれ、ブラシカ・ナプス（Ｂ． ｎａｐｕｓ）のＢｎＣＫＸ３−Ａ１、Ｂｎ ＣＫＸ３−Ａ２、Ｂｎ ＣＫＸ３−Ｃ１およびＢｎ ＣＫＸ３−Ｃ２のゲノム配列である。配列番号８、１１、１４および１７は、それぞれ、Ｂｎ ＣＫＸ３−Ａ１、Ｂｎ ＣＫＸ３−Ａ２、Ｂｎ ＣＫＸ３−Ｃ１およびＢｎ ＣＫＸ３−Ｃ２のｃＤＮＡ（コード）配列である。Ｂｎ ＣＫＸ３−Ａ１、Ｂｎ ＣＫＸ３−Ａ２、Ｂｎ ＣＫＸ３−Ｃ１およびＢｎ ＣＫＸ３−Ｃ２によりコードされたタンパク質のアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号９、１２、１５および１８にある。
配列番号１９および２２は、それぞれ、ブラシカ・ナプス（Ｂ． ｎａｐｕｓ）のＢｎＣＫＸ５−Ａ１およびＢｎ ＣＫＸ５−Ｃ１のゲノム配列である。配列番号２０および２３は、それぞれ、ＢｎＣＫＸ５−Ａ１およびＢｎ ＣＫＸ５−Ｃ１のｃＤＮＡ（コード）配列である。ＢｎＣＫＸ５−Ａ１およびＢｎ ＣＫＸ５−Ｃ１によりコードされたタンパク質のアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号２１および２４にある。
実施例２−変異体ＣＫＸ３およびＣＫＸ５アレルの生成および単離
実施例１で同定したブラシカ・ナプス（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）のＣＫＸ３およびＣＫＸ５遺伝子の変異を次のように生成し同定した：
−優良な春のアブラナ育種系統から３０，０００個の種子（Ｍ０種子）を脱イオン水または蒸留水中湿った濾紙上で２時間予め水分を吸収させた。種子の半分を０．８％ＥＭＳに暴露し、半分を１％ＥＭＳ（Ｓｉｇｍａ社：Ｍ０８８０）に暴露し、４時間インキュベートした。
−変異誘発種子（Ｍ１種子）を３回洗浄し、換気フード内で一夜乾燥した。３０，０００個のＭ１植物を土壌で成長させて自家受粉してＭ２種子を生成した。Ｍ２種子を各個別のＭ１植物に対して収穫した。
−異なるＭ１植物由来の４８００個のＭ２植物を２回成長させて、ＣＴＡＢ法（Doyle and Doyle, 1987, Phytochemistry Bulletin 19:11-15）に従ってＤＮＡサンプルを各個別のＭ２植物の葉サンプルから調製した。
−ＣＫＸ３およびＣＫＸ５遺伝子のタンパク質コード領域中の終止コドンの導入または別のアミノ酸の導入を引き起こすＣＫＸ３およびＣＫＸ５遺伝子中の点変異の存在について、標準配列決定法（ＬＧＣ）による直接配列決定およびＮｏｖｏＳＮＰソフトウエア（ＶＩＢ、アントワープ）を用いた点変異の存在についての配列解析により、ＤＮＡサンプルをスクリーニングした。
−表３に示した変異体ＣＫＸ３およびＣＫＸ５遺伝子アレルをこのように同定した。
実施例３−変異体アブラナ属ＣＫＸ５またはＣＫＸ５およびＣＫＸ３アレルを含んでなるアブラナ属植物の同定
実施例２で同定されたＣＫＸ３およびＣＫＸ５遺伝子の変異を含んでなるアブラナ属植物を次のように同定した：
−Ｍ２植物のＤＮＡサンプル中に同定された各変異体ＣＫＸ３またはＣＫＸ５遺伝子について、ＣＫＸ３またはＣＫＸ５変異を含んでなるＭ２植物と同じＭ１植物由来の少なくとも５０のＭ２植物を成長させて、ＤＮＡサンプルを各個別のＭ２植物の葉サンプルから調製した。
−実施例４において上記のように同定されたＣＫＸ３またはＣＫＸ５点変異の存在について、ＤＮＡサンプルをスクリーニングした。
−同じ変異を含んでなるヘテロ接合およびホモ接合（電気泳動図に基づいて決定）Ｍ２植物を自家受粉させて、Ｍ３種子を収穫した。
実施例４−温室条件下の変異体アブラナ属ＣＫＸ５およびＣＫＸ３アレルを含んでなるアブラナ属植物の分析
全ＣＫＸ５およびＣＫＸ３遺伝子の変異に関してホモ接合であるアブラナ属植物を完全に成熟するまで温室条件下で成長させた。強制受粉技術を用いないで（自家受粉袋なし、花粉媒介昆虫なし）、生育箱条件下、全ＣＫＸ５およびＣＫＸ３遺伝子の変異に関してホモ接合であるアブラナ属植物に対して花のカウント数の結果一覧。特定の目的は、植物当たりの花数および枝全体の効果分布に対するＣＫＸ５／ＣＫＸ３個変異体の絶対効果を決定することであった。
次のアブラナ属植物を試験した：
次の変数を採点し、試験において測定した：
変数のためのＡＮＯＶＡ解析（ランダムブロック効果で）から総合的推定の概要を表４に示したが、変異系統と対応する野生型分離個体との間の対比（＊）および野生型分離個体（ＷＴＳ）と野生型（ＷＴ）対照との間の対比（＊＊）に関する有意性試験（ｐ＜０．０５）を含む。なお、統計的差異がないことは均等であることを意味しない。
全ＣＫＸ５およびＣＫＸ３遺伝子の変異に関してホモ接合であるアブラナ属植物の両系統は、花数の極めて有意な増加を示している。花数の増加は花枝全体にわたって均等に分かれている。
実施例５−圃場条件下の変異体アブラナ属ＣＫＸ５およびＣＫＸ３アレルを含んでなるアブラナ属植物の分析
全ＣＫＸ５、全ＣＫＸ３遺伝子ならびに全ＣＫＸ５およびＣＫＸ３遺伝子の変異に関してホモ接合であるアブラナ属植物を、欧州および北米の様々な地域において圃場条件下で成長させた。
次のアブラナ属植物を試験した：
次の変数を採点し、試験において測定した：
変数のためのＡＮＯＶＡ解析（ランダムブロック効果で）から総合的推定の概要を、欧州の圃場試験については表５に、北米の圃場試験については表６に示したが、変異系統と対応する野生型分離個体との間の対比（＊）および野生型分離個体（ＷＴＳ）と野生型（ＷＴ）対照との間の対比（＊＊）に関する有意性試験（ｐ＜０．０５）を含む。なお、統計的差異がないことは均等であることを意味しない。
概して、次の結論を引き出すことができる：
ａ．主枝上のより多い花（側枝は考慮していない）
ｂ．主枝上のより多いさや
ｃ．主枝上のより多いさや当たりの種子（側枝は測定せず）
ｄ．より多いＴＳＷ（主枝＋側枝の種子芽）
ｅ．種子収量に対する限定効果のみ
ｆ．プロット間の植物密度のばらつきおよび各プロット内の植物距離が理由であり得る植物当たりの種子収量に対する実証可能な効果はない。
より詳細には：
ａ．変異体ｃｋｘ３／ｃｋｘ５ ６ｘ（１）は、主枝上の花数（２９％）およびさや数（３３％）の最多の増加を示すが、主枝上のＴＳＷの増加は１１％、およびさや当たりの種子数の増加は１３％のみである。種子収量に対する効果はない。
ｂ．両ＣＫＸ５変異体は、種子収量に対する効果なく、主枝上のＴＳＷ、花数およびさや数に対する中間効果を示す。他の変異体に関するパラメーターの結果と直接的相関性のない主枝上のさや当たりの種子数に対するＹＩＩＮ８０５／ＹＩＩＮ８１１の最高ランキングは明白でない。
実施例６−変異体ＣＫＸ５およびＣＫＸ３遺伝子の検出および／または（優良）アブラナ属系統への移動
ＣＫＸ５またはＣＫＸ３アレルの点変異を含んでなる植物に選択するため、実施例２に記載したものなど、当技術分野において公知の標準配列決定技術による直接配列決定を使用することができる。あるいは、ＰＣＲベースアッセイを、ＣＫＸ５またはＣＫＸ３アレルの特定点変異を含んでなる植物を特定の点変異を含まない植物と区別するために開発することができる。実施例２において同定された変異アレルの存在または非存在および接合性状態を検出するため、次のＫＡＳＰアッセイを開発した（表３参照）。
−鋳型ＤＮＡ：
−ホモ接合またはヘテロ接合変異体アブラナ属植物の葉物質から単離されたゲノムＤＮＡ（変異体ＣＫＸ５またはＣＫＸ３アレルを含んでなる、以後「ＣＫＸｘ−Ｘｘ−ＹＩＩＮｘｘｘ」と呼ぶ）。
−野生型ＤＮＡコントロール：野生型アブラナ属植物の葉材料から単離したゲノムＤＮＡ（以後「ＷＴ」と呼ぶ、変異体ＣＫＸ５またはＣＫＸ３アレルの野生型均等物を含んでなる）。
−ポジティブＤＮＡコントロール：ＣＫＸｘ−Ｘｘ−ＹＩＩＮｘｘｘを含んでなることが知られているホモ接合変異体アブラナ属植物の葉材料から単離したゲノムＤＮＡ。
−変異体および対応する野生型標的ＣＫＸ５またはＣＫＸ３遺伝子のためのプライマーおよびプローブを表７に示す。
実施例７：温室条件下の変異体アブラナ属ＣＫＸ５およびＣＫＸ３アレルを含んでなるアブラナ属植物のさらなる分析
全ＣＫＸ５およびＣＫＸ３遺伝子の変異に関してホモ接合であるアブラナ属植物を温室条件下で成長させて表現型を決定した。なお、実施例４における温室試験で使用したより大きな鉢で植物を成長させた。より小さな鉢でのより密度の高い成長は、より的確に圃場条件に反映する。
次のアブラナ属植物を試験した：
次の変数を採点し、試験において測定した：
次の変数を算出した：
変数のためのＡＮＯＶＡ解析から総合的推定の概要を表8に示したが、変異系統と対応する野生型分離個体との間の対比（＊）および野生型分離個体と野生型対照との間の対比（＊＊）に関する有意性試験（ｐ＜０．０５）を含む。なお、統計的差異がないことは均等であることを意味しない。
ＣＫＸ変異体は、主枝および２つの第一側枝上のさや数（ＮＰＯＤ）に対する効果の増大を示し、より高い総数のさやをもたらす。効果はより低い枝に対してより低くなり、さらに中間の側枝の高さにおいてネガティブ効果をもたらす結果であるが、これらの最も低い枝における少量の生育したさやが理由でさやの総量に対する有意な効果を有しない最も低い枝において再び示している。さやの総数（ＰＰＯＤ）に対する各枝の分布に対する効果を見れば、主枝は、野生型における現状よりさらに優性になる。
さや数に対する効果増大を、主枝および最初の４本の側枝上での花の減少およびさやの発育不全により強化する。
主枝の優性効果増大は主枝上のより高い種子収量重量をもたらすが、全側枝上の収量重量の減少をもたらし、これは総種子収量重量の減少をもたらす。これは、植物はずっと少ない側枝を有しより高い植物密度で成長するので、圃場試験における種子収量に対するネガティブ効果が強くないからであると説明することができる。
主枝上の種子数に対する中立的効果は、種子がより大きいことを示し、これは種子重量結果により確認される。種子重量（大きさ）増大を、全枝に対して観察することができる。
本発明の異なる実施形態を次の項に纏める：
１．そのゲノム内に少なくとも１つの変異体ＣＫＸ５アレルを含んでなる少なくとも１つのＣＫＸ５遺伝子を含んでなるアブラナ属植物。
２．前記変異体ＣＫＸ５アレルは：
（ａ）配列番号１９または配列番号２３と少なくとも９０％配列同一性を含むヌクレオチド配列；
（ｂ）配列番号２０または配列番号２３と少なくとも９０％配列同一性を含むコード配列を含んでなるヌクレオチド配列；および
（ｃ）配列番号２１または配列番号２４と少なくとも９０％配列同一性を含むアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列
からなる群から選択される核酸配列を含んでなるＣＫＸ５遺伝子の変異アレルである、項１に記載の植物。
３．２つのＣＫＸ５遺伝子を含んでなるアブラナ属植物であり、前記アブラナ属植物は、ブラシカ・ナプス（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）、ブラシカ・ユンセア（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｊｕｎｃｅａ）およびブラシカ・カリナタ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｃａｒｉｎａｔａ）からなる群から選択される、項１または２に記載の植物。
４．少なくとも２つの変異体ＣＫＸ５アレル、または少なくとも３つの変異体ＣＫＸ５アレル、または少なくとも４つの変異体ＣＫＸ５アレルを含んでなる、項１〜３のいずれか一項に記載の植物。
５．前記変異体ＣＫＸ５アレルが：
（ａ）配列番号１９の４６５位または配列番号２０の４６５位に対応する位置においてＧ〜Ａ置換を含んでなる変異体ＣＫＸ５アレル；
（ｂ）配列番号１９の３９９位または配列番号２０の３９９位に対応する位置においてＧ〜Ａ置換を含んでなる変異体ＣＫＸ５アレル；および
（ｃ）配列番号２２の４６５位または配列番号２３の３９９位に対応する位置においてＧ〜Ａ置換を含んでなる変異体ＣＫＸ５アレル
からなる群から選択される、項１〜４のいずれか一項に記載の植物。
６．変異体ＣＫＸ５アレルに関してホモ接合である、項１〜５のいずれか一項に記載の植物。
７．そのゲノム内に少なくとも２つの変異体ＣＫＸ３アレルをさらに含んでなる、少なくとも２つのＣＫＸ３遺伝子をさらに含んでなる、項１〜６のいずれか一項に記載の植物。
８．前記変異体ＣＫＸ３アレルが：
（ａ）配列番号７、配列番号１０、配列番号１３または配列番号１６と少なくとも９０％配列同一性を含むヌクレオチド配列；
（ｂ）配列番号８、配列番号１１、配列番号１４または配列番号１７と少なくとも９０％配列同一性を含むコード配列を含んでなるヌクレオチド配列；および
（ｃ）配列番号９、配列番号１２、配列番号１５または配列番号１８と少なくとも９０％配列同一性を含むアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列
からなる群から選択される核酸配列を含んでなるＣＫＸ３遺伝子の変異アレルである、項７に記載の植物。
９．４つのＣＫＸ３遺伝子を含んでなるアブラナ属植物であり、前記アブラナ属植物が、ブラシカ・ナプス（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）、ブラシカ・ユンセア（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｊｕｎｃｅａ）およびブラシカ・カリナタ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｃａｒｉｎａｔａ）からなる群から選択される、項７または８に記載の植物。
１０．少なくとも２つの変異体ＣＫＸ３アレル、または少なくとも３つの変異体ＣＫＸ３アレル、または少なくとも４つの変異体ＣＫＸ３アレル、または少なくとも５つの変異体ＣＫＸ３アレル、または少なくとも６つの変異体ＣＫＸ３アレル、または少なくとも７つの変異体ＣＫＸ３アレル、または少なくとも８つの変異体ＣＫＸ３アレルを含んでなる、項７〜９のいずれか一項に記載の植物。
１１．前記変異体ＣＫＸ３アレルが：
配列番号７の２２４４位または配列番号８の１０９３位に対応する位置においてＣ〜Ｔ置換を含んでなる変異体ＣＫＸ３アレル；
配列番号１０の２４８２位または配列番号１１の１１６８位に対応する位置においてＣ〜Ｔ置換を含んでなる変異体ＣＫＸ３アレル；
配列番号１３の１８９３位または配列番号１４の８７６位に対応する位置においてＧ〜Ａ置換を含んでなる変異体ＣＫＸ３アレル；
配列番号１６の２１７１位または配列番号１７の９８２位に対応する位置においてＣ〜Ｔ置換を含んでなる変異体ＣＫＸ３アレル
からなる群から選択される、項７〜１０のいずれか一項に記載の植物。
１２．変異体ＣＫＸ３アレルに関してホモ接合である、項１〜５のいずれか一項に記載の植物。
１３．少なくとも１つのＣＫＸ５遺伝子の発現が減少する、少なくとも２つのＣＫＸ５遺伝子を含んでなるアブラナ属植物。
１４．植物当たりの花数を増加した、項１〜１３のいずれか一項に記載の植物。
１５．千粒重を増加した、項１〜１３のいずれか一項に記載の植物。
１６．項１〜１５のいずれか一項に記載の植物の植物細胞、さや、種子、または子孫。
１７．アブラナ属ＣＫＸ３またはＣＫＸ５遺伝子の変異アレルであって、前記ＣＫＸ５遺伝子が：
（ａ）配列番号１９または配列番号２３と少なくとも９０％配列同一性を含むヌクレオチド配列；
（ｂ）配列番号２０または配列番号２３と少なくとも９０％配列同一性を含むコード配列を含んでなるヌクレオチド配列；および
（ｃ）配列番号２１または配列番号２４と少なくとも９０％配列同一性を含むアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列からなる群から選択され；前記ＣＫＸ３遺伝子が：
（ｄ）配列番号７、配列番号１０、配列番号１３または配列番号１６と少なくとも９０％配列同一性を含むヌクレオチド配列；
（ｅ）配列番号８、配列番号１１、配列番号１４または配列番号１７と少なくとも９０％配列同一性を含むコード配列を含んでなるヌクレオチド配列；および
（ｆ）配列番号９、配列番号１２、配列番号１５または配列番号１８と少なくとも９０％配列同一性を含むアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列
からなる群から選択される、前記変異アレル。
１８． ａ．配列番号１９の４６５位または配列番号２０の４６５位に対応する位置においてＧ〜Ａ置換を含んでなる変異体ＣＫＸ５アレル；
ｂ．配列番号１９の３９９位または配列番号２０の３９９位に対応する位置においてＧ〜Ａ置換を含んでなる変異体ＣＫＸ５アレル；および
ｃ．配列番号２２の４６５位または配列番号２３の３９９位に対応する位置においてＧ〜Ａ置換を含んでなる変異体ＣＫＸ５アレル；
ｄ．配列番号７の２２４４位または配列番号８の１０９３位に対応する位置においてＣ〜Ｔ置換を含んでなる変異体ＣＫＸ３アレル；
ｅ．配列番号１０の２４８２位または配列番号１１の１１６８位に対応する位置においてＣ〜Ｔ置換を含んでなる変異体ＣＫＸ３アレル；
ｆ．配列番号１３の１８９３位または配列番号１４の８７６位に対応する位置においてＧ〜Ａ置換を含んでなる変異体ＣＫＸ３アレル；
ｇ．配列番号１６の２１７１位または配列番号１７の９８２位に対応する位置においてＣ〜Ｔ置換を含んでなる変異体ＣＫＸ３アレル
からなる群から選択される、項１７に記載の変異アレル。
１９．次の機能的に連結したＤＮＡフラグメントを含んでなるキメラ遺伝子：
（ａ）植物発現可能なプロモーター；
（ｂ）転写された場合に１つ以上のＣＫＸ５またはＣＫＸ５およびＣＫＸ３遺伝子またはタンパク質の発現または活性を阻害するＲＮＡまたはタンパク質分子を産生するＤＮＡ領域；ならびに必要に応じて
（ｃ）転写終結およびポリアデニル化に関与する３’末端領域。
２０．生物サンプル中に存在する核酸の変異体ＣＫＸ５またはＣＫＸ３の特定領域の存在を決定することを含む、前記生物サンプル中の項１７または１８に記載の変異体ＣＫＸ５またはＣＫＸ３アレルの同定方法。
２１．植物、植物性素材または種子のゲノムＤＮＡ中の変異体および／または対応する野生型ＣＫＸ３もしくはＣＫＸ５の特定領域の存在を決定することを含む、アブラナ属植物、植物性素材または種子中の項１７または１８に記載の変異体ＣＫＸ３もしくはＣＫＸ５アレルの接合性状態の決定方法。
２２．少なくとも２つのプライマーのセットを備え、前記セットが：
（ａ）前記プライマーの１つは変異アレルの５’または３’隣接領域を特異的に認識し、前記プライマーの他方は変異体ＣＫＸ３またはＣＫＸ５アレルの変異体領域を特異的に認識する、プライマーセット、ならびに
（ｂ）前記プライマーの１つは変異体ＣＫＸ３またはＣＫＸ５アレルの５’または３’隣接領域を特異的に認識し、前記プライマーの他方は、それぞれ、変異体ＣＫＸ３またはＣＫＸ５アレルの３’または５’隣接領域と変異体領域との間の連結領域を特異的に認識する、プライマーセット
からなる群から選択される、生物サンプル中の項１７または１８に記載の変異体ＣＫＸ３またはＣＫＸ５アレルを同定するためのキットかまたは前記キットは、少なくとも１つのプローブのセットを備え、前記プローブは：
（ａ）変異体ＣＫＸ３またはＣＫＸ５アレルの変異体領域を特異的に認識するプローブ、および
（ｂ）変異体ＣＫＸ３またはＣＫＸ５アレルの３’または５’隣接領域と変異体領域との間の連結領域を特異的に認識するプローブ
からなる群から選択される、前記キット。
２３． （ａ）項２２に記載の方法を用いて、少なくとも１つの選択された変異体ＣＫＸ３またはＣＫＸ５アレルを含んでなる第一植物を同定すること、
（ｂ）少なくとも１つの選択された変異体ＣＫＸ３またはＣＫＸ５アレルを含まない第二植物と該第一植物とを交配し、前記交配種からＦ１雑種種子を集めること、
（ｃ）必要に応じて、項２２に記載の方法を用いて、少なくとも１つの選択された変異体ＣＫＸ３またはＣＫＸ５アレルを含んでなるＦ１植物を同定すること、
（ｄ）少なくとも１つの世代（ｘ）について、少なくとも１つの選択された変異体ＣＫＸ３またはＣＫＸ５アレルを含まない該第二植物と少なくとも１つの選択された変異体ＣＫＸ３またはＣＫＸ５アレルを含んでなる該Ｆ１植物とを戻し交配し、前記交配種からＢＣｘ種子を集めること、ならびに
（ｅ）項２２に記載の方法に従った方法を用いて、少なくとも１つの選択された変異体ＣＫＸ３またはＣＫＸ５アレルを含んでなるＢＣｘ植物を全世代において同定すること
の工程を含む、項１７または１８に記載の少なくとも１つの選択された変異体ＣＫＸ３またはＣＫＸ５アレルを、１つの植物から別の植物への移動方法。
２４． ａ．少なくとも１つの変異体ＣＫＸ５アレルもしくは少なくとも１つの変異体ＣＫＸ５アレルおよび１つの変異体ＣＫＸ３アレルをアブラナ属植物に導入すること；または
ｂ．項１９のキメラ遺伝子をアブラナ属植物に導入すること
を含む、植物当たりの花数の増加方法。
２５． ａ．少なくとも１つの変異体ＣＫＸ５アレルもしくは少なくとも１つの変異体ＣＫＸ５アレルおよび１つの変異体ＣＫＸ３アレルをアブラナ属植物に導入すること；または
ｂ．項１９のキメラ遺伝子をアブラナ属植物に導入すること
を含む、アブラナ属植物の千粒重の増加方法。
２６． ａ．少なくとも１つの変異体ＣＫＸ５アレルもしくは少なくとも１つの変異体ＣＫＸ５アレルおよび１つの変異体ＣＫＸ３アレルをアブラナ属植物に導入すること；または
ｂ．項１９のキメラ遺伝子をアブラナ属植物に導入すること
を含む、植物当たりのさや数の増加方法。
２７．種子の製造方法であって、前記方法が項１６に記載の種子を種まきし、前記種子から植物を成長させて、前記植物から種子を収穫することを含む、前記方法。
２８． 配列番号１９の４６５位または配列番号２０の４６５位に対応する位置においてＧ〜Ａ置換を含んでなる変異体ＣＫＸ５アレルを含んでなり、前記アレルを含んでなる参照種子が受託番号ＮＣＩＭＢ４２４６４で２０１５年１０月５日にＮＣＩＭＢ Ｌｉｍｉｔｅｄに寄託されている、アブラナ属植物；
配列番号１９の３９９位または配列番号２０の３９９位に対応する位置においてＧ〜Ａ置換を含んでなる変異体ＣＫＸ５アレルを含んでなり、前記アレルを含んでなる参照種子が受託番号ＮＣＩＭＢ４２４６５で２０１５年１０月５日にＮＣＩＭＢ Ｌｉｍｉｔｅｄに寄託されている、アブラナ属植物；
配列番号２２の４６５位または配列番号２３の３９９位に対応する位置においてＧ〜Ａ置換を含んでなる変異体ＣＫＸ５アレルを含んでなり、前記アレルを含んでなる参照種子が受託番号ＮＣＩＭＢ４２４６４で２０１５年１０月５日にＮＣＩＭＢ Ｌｉｍｉｔｅｄに寄託されている、アブラナ属植物；
配列番号７の２２４４位または配列番号８の１０９３位に対応する位置においてＣ〜Ｔ置換を含んでなる変異体ＣＫＸ３アレルを含んでなり、前記アレルを含んでなる参照種子が受託番号ＮＣＩＭＢ４２４６４で２０１５年１０月５日にＮＣＩＭＢ Ｌｉｍｉｔｅｄに寄託されている、アブラナ属植物；
配列番号１０の２４８２位または配列番号１１の１１６８位に対応する位置においてＣ〜Ｔ置換を含んでなる変異体ＣＫＸ３アレルを含んでなり、前記アレルを含んでなる参照種子が受託番号ＮＣＩＭＢ４２４６４で２０１５年１０月５日にＮＣＩＭＢ Ｌｉｍｉｔｅｄに寄託されている、アブラナ属植物；
配列番号１３の１８９３位または配列番号１４の８７６位に対応する位置においてＧ〜Ａ置換を含んでなる変異体ＣＫＸ３アレルを含んでなり、前記アレルを含んでなる参照種子が受託番号ＮＣＩＭＢ４２４６４で２０１５年１０月５日にＮＣＩＭＢ Ｌｉｍｉｔｅｄに寄託されている、アブラナ属植物；
配列番号１６の２１７１位または配列番号１７の９８２位に対応する位置においてＣ〜Ｔ置換を含んでなる変異体ＣＫＸ３アレルを含んでなり、前記アレルを含んでなる参照種子が受託番号ＮＣＩＭＢ４２４６４で２０１５年１０月５日にＮＣＩＭＢ Ｌｉｍｉｔｅｄに寄託されている、アブラナ属植物
からなる群から選択されるアブラナ属植物。
２９．アブラナ属植物において、植物当たりの花数を増加、植物当たりのさや数を増加またはＴＳＷを増加するための、項１７もしくは１８に記載の変異体ＣＫＸ５アレルもしくは変異体ＣＫＸ５アレルおよび変異体ＣＫＸ３アレルまたは項１９に記載のキメラ遺伝子の使用。
３０．ナタネ油(oilseed rape oil)またはアブラナシードケーキ(oilseed rape seed cake)を製造するための、項１〜１５のいずれか一項に記載のアブラナ属植物、または項２７に記載の種子の使用。
３１． ａ．項１〜１５のいずれか一項に記載の植物もしくはその部分または項２７に記載の種子を得ること、および
ｂ．前記植物またはその部分から前記食品、飼料、または工業製品を調製すること
を含む、食品、飼料、または工業製品の製造方法。
３２． ａ．前記食品もしくは飼料が油、ミール、子実、デンプン、小麦粉もしくはタンパク質であり；または
ｂ．前記工業製品がバイオ燃料、工業薬品、医薬品もしくは栄養補助食品である、
項３１に記載の方法。

Claims (15)

  1. 少なくとも１つの変異体ＣＫＸ５アレルをそのゲノム内に含んでなる、少なくとも１つのＣＫＸ５遺伝子を含むアブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）植物であって、該変異体ＣＫＸ５アレルは下記からなる群から選択される核酸配列を含んでなるＣＫＸ５遺伝子の変異アレルである、植物：
    （ａ）配列番号１９または配列番号２３と少なくとも９０％配列同一性を含むヌクレオチド配列；
    （ｂ）配列番号２０または配列番号２３と少なくとも９０％配列同一性を含むコード配列を含んでなるヌクレオチド配列；および
    （ｃ）配列番号２１または配列番号２４と少なくとも９０％配列同一性を含むアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列。
  2. ２つのＣＫＸ５遺伝子を含んでなるアブラナ属植物であり、該アブラナ属植物が、ブラシカ・ナプス（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）、ブラシカ・ユンセア（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｊｕｎｃｅａ）およびブラシカ・カリナタ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｃａｒｉｎａｔａ）からなる群から選択される、請求項１に記載の植物。
  3. 前記変異体ＣＫＸ５アレルが下記からなる群から選択される、請求項１または２に記載の植物：
    （ａ）配列番号１９の４６５位または配列番号２０の４６５位に対応する位置においてＧ〜Ａ置換を含んでなる変異体ＣＫＸ５アレル；
    （ｂ）配列番号１９の３９９位または配列番号２０の３９９位に対応する位置においてＧ〜Ａ置換を含んでなる変異体ＣＫＸ５アレル；および
    （ｃ）配列番号２２の４６５位または配列番号２３の３９９位に対応する位置においてＧ〜Ａ置換を含んでなる変異体ＣＫＸ５アレル。
  4. 少なくとも２つの変異体ＣＫＸ３アレルをそのゲノム内にさらに含んでなる、少なくとも２つのＣＫＸ３遺伝子をさらに含んでなり、前記変異体ＣＫＸ３アレルが下記からなる群から選択される核酸配列を含んでなるＣＫＸ３遺伝子の変異アレルである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の植物：
    （ａ）配列番号７、配列番号１０、配列番号１３または配列番号１６と少なくとも９０％配列同一性を含むヌクレオチド配列；
    （ｂ）配列番号８、配列番号１１、配列番号１４または配列番号１７と少なくとも９０％配列同一性を含むコード配列を含んでなるヌクレオチド配列；および
    （ｃ）配列番号９、配列番号１２、配列番号１５または配列番号１８と少なくとも９０％配列同一性を含むアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列。
  5. ４つのＣＫＸ３遺伝子を含んでなるアブラナ属植物であり、前記アブラナ属植物は、ブラシカ・ナプス（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）、ブラシカ・ユンセア（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｊｕｎｃｅａ）およびブラシカ・カリナタ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｃａｒｉｎａｔａ）からなる群から選択される、請求項３または４に記載の植物。
  6. 前記変異体ＣＫＸ３アレルが下記からなる群から選択される、請求項５に記載の植物：
    配列番号７の２２４４位または配列番号８の１０９３位に対応する位置においてＣ〜Ｔ置換を含んでなる変異体ＣＫＸ３アレル；
    配列番号１０の２４８２位または配列番号１１の１１６８位に対応する位置においてＣ〜Ｔ置換を含んでなる変異体ＣＫＸ３アレル；
    配列番号１３の１８９３位または配列番号１４の８７６位に対応する位置においてＧ〜Ａ置換を含んでなる変異体ＣＫＸ３アレル；
    配列番号１６の２１７１位または配列番号１７の９８２位に対応する位置においてＣ〜Ｔ置換を含んでなる変異体ＣＫＸ３アレル。
  7. 植物当たりの増加した花数を有するか、または植物当たりの増加したさや数もしくは主枝上の増加したさや数を有するか、または増加した千粒重を有する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の植物。
  8. 請求項１〜７のいずれか一項に記載の植物の植物細胞、さや、種子、または子孫。
  9. アブラナ属ＣＫＸ３またはＣＫＸ５遺伝子の変異アレルであって、前記ＣＫＸ５遺伝子が下記からなる群から選択される、変異アレル：
    （ａ）配列番号１９または配列番号２３と少なくとも９０％配列同一性を含むヌクレオチド配列；
    （ｂ）配列番号２０または配列番号２３と少なくとも９０％配列同一性を含むコード配列を含んでなるヌクレオチド配列；および
    （ｃ）配列番号２１または配列番号２４と少なくとも９０％配列同一性を含むアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列からなる群から選択され；前記ＣＫＸ３遺伝子が下記からなる群から選択される：
    （ｄ）配列番号７、配列番号１０、配列番号１３または配列番号１６と少なくとも９０％配列同一性を含むヌクレオチド配列；
    （ｅ）配列番号８、配列番号１１、配列番号１４または配列番号１７と少なくとも９０％配列同一性を含むコード配列を含んでなるヌクレオチド配列；および
    （ｆ）配列番号９、配列番号１２、配列番号１５または配列番号１８と少なくとも９０％配列同一性を含むアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列。
  10. 下記からなる群から選択される、請求項９に記載の変異アレル：
    ａ．配列番号１９の４６５位または配列番号２０の４６５位に対応する位置においてＧ〜Ａ置換を含んでなる変異体ＣＫＸ５アレル；
    ｂ．配列番号１９の３９９位または配列番号２０の３９９位に対応する位置においてＧ〜Ａ置換を含んでなる変異体ＣＫＸ５アレル；および
    ｃ．配列番号２２の４６５位または配列番号２３の３９９位に対応する位置においてＧ〜Ａ置換を含んでなる変異体ＣＫＸ５アレル；
    ｄ．配列番号７の２２４４位または配列番号８の１０９３位に対応する位置においてＣ〜Ｔ置換を含んでなる変異体ＣＫＸ３アレル；
    ｅ．配列番号１０の２４８２位または配列番号１１の１１６８位に対応する位置においてＣ〜Ｔ置換を含んでなる変異体ＣＫＸ３アレル；
    ｆ．配列番号１３の１８９３位または配列番号１４の８７６位に対応する位置においてＧ〜Ａ置換を含んでなる変異体ＣＫＸ３アレル；
    ｇ．配列番号１６の２１７１位または配列番号１７の９８２位に対応する位置においてＣ〜Ｔ置換を含んでなる変異体ＣＫＸ３アレル。
  11. アブラナ属植物に、少なくとも１つの変異体ＣＫＸ５アレルまたは少なくとも１つの変異体ＣＫＸ５アレルおよび１つの変異体ＣＫＸ３アレルを導入する工程を含む、植物当たりの花数を増加、千粒重を増加または植物当たりのさや数を増加する方法。
  12. 下記からなる群から選択されるアブラナ属植物：
    配列番号１９の４６５位または配列番号２０の４６５位に対応する位置においてＧ〜Ａ置換を含んでなる変異体ＣＫＸ５アレルを含んでなり、前記アレルを含んでなる参照種子が受託番号ＮＣＩＭＢ４２４６４でＮＣＩＭＢ Ｌｉｍｉｔｅｄに寄託されている、アブラナ属植物；
    配列番号１９の３９９位または配列番号２０の３９９位に対応する位置においてＧ〜Ａ置換を含んでなる変異体ＣＫＸ５アレルを含んでなり、前記アレルを含んでなる参照種子が受託番号ＮＣＩＭＢ４２４６５でＮＣＩＭＢ Ｌｉｍｉｔｅｄに寄託されている、アブラナ属植物；
    配列番号２２の４６５位または配列番号２３の３９９位に対応する位置においてＧ〜Ａ置換を含んでなる変異体ＣＫＸ５アレルを含んでなり、前記アレルを含んでなる参照種子が受託番号ＮＣＩＭＢ４２４６４でＮＣＩＭＢ Ｌｉｍｉｔｅｄに寄託されている、アブラナ属植物；
    配列番号７の２２４４位または配列番号８の１０９３位に対応する位置においてＣ〜Ｔ置換を含んでなる変異体ＣＫＸ３アレルを含んでなり、前記アレルを含んでなる参照種子が受託番号ＮＣＩＭＢ４２４６４でＮＣＩＭＢ Ｌｉｍｉｔｅｄに寄託されている、アブラナ属植物；
    配列番号１０の２４８２位または配列番号１１の１１６８位に対応する位置においてＣ〜Ｔ置換を含んでなる変異体ＣＫＸ３アレルを含んでなり、前記アレルを含んでなる参照種子が受託番号ＮＣＩＭＢ４２４６４でＮＣＩＭＢ Ｌｉｍｉｔｅｄに寄託されている、アブラナ属植物；
    配列番号１３の１８９３位または配列番号１４の８７６位に対応する位置においてＧ〜Ａ置換を含んでなる変異体ＣＫＸ３アレルを含んでなり、前記アレルを含んでなる参照種子が受託番ＮＣＩＭＢ４２４６４でＮＣＩＭＢ Ｌｉｍｉｔｅｄに寄託されている、アブラナ属植物；
    配列番号１６の２１７１位または配列番号１７の９８２位に対応する位置においてＣ〜Ｔ置換を含んでなる変異体ＣＫＸ３アレルを含んでなり、前記アレルを含んでなる参照種子が受託番号ＮＣＩＭＢ４２４６４でＮＣＩＭＢ Ｌｉｍｉｔｅｄに寄託されている、アブラナ属植物。
  13. アブラナ属植物において、植物当たりの花数を増加、植物当たりのさや数を増加またはＴＳＷを増加するための、請求項９または１０に記載の変異体ＣＫＸ５アレル、または変異体ＣＫＸ５アレルおよび変異体ＣＫＸ３アレルの使用。
  14. ナタネ油またはアブラナシードケーキを製造するための、請求項１〜６および１２のいずれか一項に記載のアブラナ属植物、またはこのような植物の種子の使用。
  15. 下記を含む、食品、飼料、または工業製品の製造方法：
    ａ．請求項１〜６または１２のいずれか一項に記載の植物またはその部分を得ること、および
    ｂ．前記植物またはその部分から食品、飼料、または工業製品を調製すること。
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