JP3066073B2 - エンド―１，４―β―グルカナーゼ遺伝子及び植物におけるその利用 - Google Patents
エンド―１，４―β―グルカナーゼ遺伝子及び植物におけるその利用Info
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Description
【発明の詳細な説明】 関連出願 本出願は1990年４月20日に出願された米国特許出願第
07/511,417号の同時係属出願であり、この開示内容全体
は本明細書に参考として組入れてある。
07/511,417号の同時係属出願であり、この開示内容全体
は本明細書に参考として組入れてある。
発明の背景 発明の分野 本発明は一般に果実の軟化を引き下げるための方法に
関する。特に、これは１もしくは複数種のエンド−1,4
−β−グルカナーゼの活性を阻害することによる、果実
の軟化及び細胞壁の多糖類分解を引き下げるための方法
に関する。
関する。特に、これは１もしくは複数種のエンド−1,4
−β−グルカナーゼの活性を阻害することによる、果実
の軟化及び細胞壁の多糖類分解を引き下げるための方法
に関する。
情報開示 果実の発育の最終段階である成熟は、果実組織におけ
る多数の劇的代謝変化を包含している。この成熟プロセ
スの重要な態様は果実の軟化であり、これは主として細
胞壁の改質に由来すると考えられている。代謝活性にお
ける多数の微妙な変化がこの応答において含まれてい
る。
る多数の劇的代謝変化を包含している。この成熟プロセ
スの重要な態様は果実の軟化であり、これは主として細
胞壁の改質に由来すると考えられている。代謝活性にお
ける多数の微妙な変化がこの応答において含まれてい
る。
従来の技術は成熟−損傷突然変異体、例えばrin突然
変異体であって果実の成熟の研究に利用されているもの
を開示している。
変異体であって果実の成熟の研究に利用されているもの
を開示している。
TigchelaarのHortic.Sci,13:508−513,1978。しかし
ながら、果実の軟化を特異的にコントロールするための
このような突然変異体の利用は限られた有用性に出くわ
し、それはこのような突然変異体の多面的性質による。
ながら、果実の軟化を特異的にコントロールするための
このような突然変異体の利用は限られた有用性に出くわ
し、それはこのような突然変異体の多面的性質による。
ペクチンの分解にとって重要な酵素であるポリガラク
ツロナーゼの活性の上昇は果実の軟化に関与する。アン
チセンス方向においてポリガラクツロナーゼcDNAと連結
している植物プロモーターを含む組換構造体が作製され
ている。このような構造体を成熟果実におけるこの酵素
の活性を阻害せしめるためにトマトの中に挿入した。Sm
ithらNature,334:724−726,1988;SheelyらProc.Nat.Aca
d.Sci.85:8805−8809,1988;Hiattら、米国特許第4,801,
340号;Bridgesら、EPO公開番号第0,271,988号。このよ
うな構造体はポリガラクツロナーゼ活性を阻害すること
が示されているが、果実の軟化への影響は示されていな
い。Smithら、Plant Mol.14:369−379,1990。
ツロナーゼの活性の上昇は果実の軟化に関与する。アン
チセンス方向においてポリガラクツロナーゼcDNAと連結
している植物プロモーターを含む組換構造体が作製され
ている。このような構造体を成熟果実におけるこの酵素
の活性を阻害せしめるためにトマトの中に挿入した。Sm
ithらNature,334:724−726,1988;SheelyらProc.Nat.Aca
d.Sci.85:8805−8809,1988;Hiattら、米国特許第4,801,
340号;Bridgesら、EPO公開番号第0,271,988号。このよ
うな構造体はポリガラクツロナーゼ活性を阻害すること
が示されているが、果実の軟化への影響は示されていな
い。Smithら、Plant Mol.14:369−379,1990。
エンド−1,4−β−グルカナーゼは果実の軟化に関与
するその他の酵素であると考えられている。これは主要
半セルロース系ポリマー、キシログルカンを分解するこ
とで知られる。Hatfield and Nevins,Plant and Cell P
hysiol.,27:541−552,1986。エンド−1,4−β−グルカ
ナーゼをコードするcDNA及び遺伝子はアボカド（Christ
offersenら、Plant Molec.Biol.,3:385,1984）及びそら
豆（Tuckerら、Plant Physiol.88:1257,1988）からクロ
ーンされ、両者とも本明細書に参考として組入れてい
る。
するその他の酵素であると考えられている。これは主要
半セルロース系ポリマー、キシログルカンを分解するこ
とで知られる。Hatfield and Nevins,Plant and Cell P
hysiol.,27:541−552,1986。エンド−1,4−β−グルカ
ナーゼをコードするcDNA及び遺伝子はアボカド（Christ
offersenら、Plant Molec.Biol.,3:385,1984）及びそら
豆（Tuckerら、Plant Physiol.88:1257,1988）からクロ
ーンされ、両者とも本明細書に参考として組入れてい
る。
発明の概要 本発明は果実の軟化を引き下げ、且つ細胞壁ポリマー
の分解を阻害する方法であって、植物に、エンド−1,4
−β−グルカナーゼをコードするDNA配列に由来する少
なくとも20塩基対のDNAサブ配列に作動連結している植
物プロモーター配列を有する発現カセットを導入せしめ
ることを含んで成る方法に関し、ここでこのDNAサブ配
列はこのプロモーター配列と、発現にとって反対の配向
において（即ち、アンチセンス方向において）連結され
ている。このプロモーターは誘発性又は構成的のいづれ
でもよい。もし誘発性であるとき、これはトマトE8遺伝
子に由来するのが好ましい。もし構成的なら、これはカ
リフラワーモザイクウイルスの35Sプロモーターである
ことが好ましい。
の分解を阻害する方法であって、植物に、エンド−1,4
−β−グルカナーゼをコードするDNA配列に由来する少
なくとも20塩基対のDNAサブ配列に作動連結している植
物プロモーター配列を有する発現カセットを導入せしめ
ることを含んで成る方法に関し、ここでこのDNAサブ配
列はこのプロモーター配列と、発現にとって反対の配向
において（即ち、アンチセンス方向において）連結され
ている。このプロモーターは誘発性又は構成的のいづれ
でもよい。もし誘発性であるとき、これはトマトE8遺伝
子に由来するのが好ましい。もし構成的なら、これはカ
リフラワーモザイクウイルスの35Sプロモーターである
ことが好ましい。
本方法は前記の発現カセットに加えて、第２のグルカ
ナーゼ又はポリガラクツロナーゼをコードする遺伝子に
由来する少なくとも20塩基対のサブ配列に作動連結して
いる植物プロモーター配列を有する第２の発現カセット
を利用することによって改良することができる。このそ
の他のDNA配列もプロモーター配列と発現にとって反対
の配向において連結している。
ナーゼ又はポリガラクツロナーゼをコードする遺伝子に
由来する少なくとも20塩基対のサブ配列に作動連結して
いる植物プロモーター配列を有する第２の発現カセット
を利用することによって改良することができる。このそ
の他のDNA配列もプロモーター配列と発現にとって反対
の配向において連結している。
本方法に適切な経済的に重要な収穫植物はトマト及び
コショウを含む。この発現カセットは植物の中にいづれ
の試験管内操作、好ましくはアグロバクテリア（Agroba
cterium）を用いることによって導入できる。この発現
カセットは性交配によって植物の中に導入することもで
きる。
コショウを含む。この発現カセットは植物の中にいづれ
の試験管内操作、好ましくはアグロバクテリア（Agroba
cterium）を用いることによって導入できる。この発現
カセットは性交配によって植物の中に導入することもで
きる。
本発明は更に、エンド−1,4−β−グルカナーゼの活
性を阻害する方法であって、植物に、エンド−1,4−β
−グルカナーゼをコードするDNA配列に由来する少なく
とも20塩基対のDNAサブ配列に作動連結している植物プ
ロモーター配列を有する発現カセットを導入せしめるこ
とを含んで成る方法を提供し、ここでこのDNAサブ配列
はこのプロモーター配列と、発現にとって反対の配向に
おいて連結している。この酵素を阻止することにより、
細胞壁の多糖類の分解は阻害される。
性を阻害する方法であって、植物に、エンド−1,4−β
−グルカナーゼをコードするDNA配列に由来する少なく
とも20塩基対のDNAサブ配列に作動連結している植物プ
ロモーター配列を有する発現カセットを導入せしめるこ
とを含んで成る方法を提供し、ここでこのDNAサブ配列
はこのプロモーター配列と、発現にとって反対の配向に
おいて連結している。この酵素を阻止することにより、
細胞壁の多糖類の分解は阻害される。
本発明は更に、エンド−1,4−β−グルカナーゼをコ
ードするDNA配列に由来の少なくとも20塩基対のDNAサブ
配列と作動連結している植物プロモーター配列を含んで
成る発現カセットを提供し、ここでこのDNAサブ配列は
このプロモーター配列と、発現にとって反対の配向にお
いて連結している。このプロモーターは誘発性、典型的
にはE8プロモーターであっても、又は構成的、典型的に
はカリフラワーモザイクウイルスに由来していてもよ
い。
ードするDNA配列に由来の少なくとも20塩基対のDNAサブ
配列と作動連結している植物プロモーター配列を含んで
成る発現カセットを提供し、ここでこのDNAサブ配列は
このプロモーター配列と、発現にとって反対の配向にお
いて連結している。このプロモーターは誘発性、典型的
にはE8プロモーターであっても、又は構成的、典型的に
はカリフラワーモザイクウイルスに由来していてもよ
い。
植物、好ましくはトマトであって、エンド−1,4−β
−グルカナーゼをコードするDNA配列由来の少なくとも2
0塩基対のDNAサブ配列に作動連結している植物プロモー
ター配列を有し、ここでこのDNAサブ配列がこのプロモ
ーターと、発現にとって反対の配向において連結してい
る発現カセットを含んでいるものも提供する。
−グルカナーゼをコードするDNA配列由来の少なくとも2
0塩基対のDNAサブ配列に作動連結している植物プロモー
ター配列を有し、ここでこのDNAサブ配列がこのプロモ
ーターと、発現にとって反対の配向において連結してい
る発現カセットを含んでいるものも提供する。
本発明は更に、介在されていなく、エンド−1,4−β
−グルカナーゼをコードし、そして少なくとも一方の側
に非野生型DNAが隣接するDNA配列を提供する。このDNA
配列は典型的にはトマトに由来のDNA配列である。
−グルカナーゼをコードし、そして少なくとも一方の側
に非野生型DNAが隣接するDNA配列を提供する。このDNA
配列は典型的にはトマトに由来のDNA配列である。
更に、介在されていなく且つエンド−1,4−β−グル
カナーゼをコードするDNA配列と作動連結しているプロ
モーター配列を含んで成る発現カセットを提供する。こ
のDNA配列は典型的にはトマトに由来するcDNA配列であ
る。このプロモーター配列は原核及び真核生物の両者に
おいて機能する。
カナーゼをコードするDNA配列と作動連結しているプロ
モーター配列を含んで成る発現カセットを提供する。こ
のDNA配列は典型的にはトマトに由来するcDNA配列であ
る。このプロモーター配列は原核及び真核生物の両者に
おいて機能する。
本発明は更にエンド−1,4−β−グルカナーゼをコー
ドするDNA配列を植物から単離する方法であって、エン
ド−1,4−β−グルカナーゼcDNAから保存されている配
列を含んで成るオリゴヌクレオチドプローブによって植
物組織から作られたDNAライブラリーを釣り出すことを
含んで成る方法を提供する。このDNAライブラリーはゲ
ノム又はcDNAライブラリーのいづれでもよい。この好ま
しい保存配列は 最後に、トマトエンド−1,4−β−グルカナーゼ由来の
シグナルペプチドをコードするDNA配列と作動連結して
いるプロモーターを含んで成るDNA構造体を提供し、こ
こでこのDNA配列は成熟トマトエンド−1,4−β−グルカ
ナーゼをコードする配列以外と連結している。
ドするDNA配列を植物から単離する方法であって、エン
ド−1,4−β−グルカナーゼcDNAから保存されている配
列を含んで成るオリゴヌクレオチドプローブによって植
物組織から作られたDNAライブラリーを釣り出すことを
含んで成る方法を提供する。このDNAライブラリーはゲ
ノム又はcDNAライブラリーのいづれでもよい。この好ま
しい保存配列は 最後に、トマトエンド−1,4−β−グルカナーゼ由来の
シグナルペプチドをコードするDNA配列と作動連結して
いるプロモーターを含んで成るDNA構造体を提供し、こ
こでこのDNA配列は成熟トマトエンド−1,4−β−グルカ
ナーゼをコードする配列以外と連結している。
図面の簡単な説明 図１はpMLJ1:E8 anti PG/CL及びpMLJ1:CamVantiPG/CL
ベクターの作製を図示する。
ベクターの作製を図示する。
好ましい態様の説明 種々の農業的に重要な植物種において果実の軟化を引
き下げる改善された方法を提供する。この方法は、エン
ド−1,4−β−グルカナーゼ（グルカナーゼ）DNAとその
正常な発現にとって反対の配向において作動連結してい
る植物プロモーターを有する発現カセットを植物細胞に
形質転換せしめることを含んで成る。アンチセンス方向
においてその他のグルカナーゼDNA及び／又はポリガラ
クツロナーゼDNAを含んで成る発現カセットも利用され
うる。このグルカナーゼcDNAは植物又は細菌細胞におい
て、この遺伝子の発現にとって適正な配向において挿入
することもできる。更に、同一又は異なる植物種からそ
の他の遺伝子を単離するために利用することができるエ
ンド−1,4−β−グルカナーゼ遺伝子の保存領域を含ん
で成る核酸プローブを提供する。本発明によって提供さ
れるcDNA配列は、任意の外来遺伝子と融合せしめたグル
カナーゼシグナルペプチドを含んで成る、融合タンパク
質を発現することのできるベクターを作製するのに利用
できる。このことは、植物細胞からの外来遺伝子生成物
の分泌を提供する。
き下げる改善された方法を提供する。この方法は、エン
ド−1,4−β−グルカナーゼ（グルカナーゼ）DNAとその
正常な発現にとって反対の配向において作動連結してい
る植物プロモーターを有する発現カセットを植物細胞に
形質転換せしめることを含んで成る。アンチセンス方向
においてその他のグルカナーゼDNA及び／又はポリガラ
クツロナーゼDNAを含んで成る発現カセットも利用され
うる。このグルカナーゼcDNAは植物又は細菌細胞におい
て、この遺伝子の発現にとって適正な配向において挿入
することもできる。更に、同一又は異なる植物種からそ
の他の遺伝子を単離するために利用することができるエ
ンド−1,4−β−グルカナーゼ遺伝子の保存領域を含ん
で成る核酸プローブを提供する。本発明によって提供さ
れるcDNA配列は、任意の外来遺伝子と融合せしめたグル
カナーゼシグナルペプチドを含んで成る、融合タンパク
質を発現することのできるベクターを作製するのに利用
できる。このことは、植物細胞からの外来遺伝子生成物
の分泌を提供する。
成熟プロセス中の果実の軟化の速度のコントロールは
大いに経済的に重要である。トマトの場合において、果
実の軟化の阻止は、つるの上での成熟の間に新鮮な商品
トマトが堅くあり続けることを可能とする。つる上の成
熟トマトは緑色の間に採取されたものよりも優れた風味
及び色調を有する。果実の成熟は病原耐性を強めること
によって果実の品質も向上させる。このような特性はト
マトの果実のより長い貯蔵及び運送寿命を可能にする。
細胞壁分解の阻止は果実の粘性及び堅さを高めることに
よってトマトの果実の加工特性も向上させる。
大いに経済的に重要である。トマトの場合において、果
実の軟化の阻止は、つるの上での成熟の間に新鮮な商品
トマトが堅くあり続けることを可能とする。つる上の成
熟トマトは緑色の間に採取されたものよりも優れた風味
及び色調を有する。果実の成熟は病原耐性を強めること
によって果実の品質も向上させる。このような特性はト
マトの果実のより長い貯蔵及び運送寿命を可能にする。
細胞壁分解の阻止は果実の粘性及び堅さを高めることに
よってトマトの果実の加工特性も向上させる。
本発明は種々の農業上重要な種における１もしくは複
数種のグルカナーゼの活性を阻害することによって果実
の軟化を引き下げる方法を提供する。典型的な例におい
て、果実の成熟中にこの遺伝子の活性をコントロールす
るためのアンチセンスDNAを含んで成る発現カセットを
作り上げるためにトマトグルカナーゼ遺伝子由来のcDNA
を利用する。
数種のグルカナーゼの活性を阻害することによって果実
の軟化を引き下げる方法を提供する。典型的な例におい
て、果実の成熟中にこの遺伝子の活性をコントロールす
るためのアンチセンスDNAを含んで成る発現カセットを
作り上げるためにトマトグルカナーゼ遺伝子由来のcDNA
を利用する。
適切なベクターの中にアンチセンスcDNA配列を導入す
るために組換えDNA技術を利用し、これを次に適切な宿
主細胞に形質転換せしめる。典型的なケースにおいて、
究極宿主であるトマト細胞へのcDNAの搬送のための媒体
としてアグロバクテリア トウメファシエン（Agrobact
erium tumefaciens）を利用している。この形質転換細
胞から再生した植物は、該酵素の活性を阻害するアンチ
センスDNAを転写する。植物細胞において、cDNAは遺伝
子の発現を、mRNAの増加を妨げることによって阻害し、
これはこの遺伝子によってコードされるタンパク質のレ
ベルを引き下げる。Sheehyら、前記。
るために組換えDNA技術を利用し、これを次に適切な宿
主細胞に形質転換せしめる。典型的なケースにおいて、
究極宿主であるトマト細胞へのcDNAの搬送のための媒体
としてアグロバクテリア トウメファシエン（Agrobact
erium tumefaciens）を利用している。この形質転換細
胞から再生した植物は、該酵素の活性を阻害するアンチ
センスDNAを転写する。植物細胞において、cDNAは遺伝
子の発現を、mRNAの増加を妨げることによって阻害し、
これはこの遺伝子によってコードされるタンパク質のレ
ベルを引き下げる。Sheehyら、前記。
以下の説明は植物細胞において外来DNA配列を導入及
び発現するのに有用な種々の方法を詳細する。好ましい
方法の特定の例も説明する。
び発現するのに有用な種々の方法を詳細する。好ましい
方法の特定の例も説明する。
まとめると、アンチセンスグルカナーゼcDNAを調製す
るため及びそれらを植物細胞へと導入せしめるために必
要な操作は、１）成熟果実からmRNAを単離し、２）この
mRNAからcDNAを作り、３）所望の配列に関するcDNAをス
クリーンし、４）この所望の配列を植物プロモーター
と、このグルカナーゼ遺伝子の発現にとって反対の配向
において連結し、５）適切な宿主植物細胞を形質転換
し、そして６）この逆になっている配列を転写する細胞
を選び、そして再生せしめることを含む。
るため及びそれらを植物細胞へと導入せしめるために必
要な操作は、１）成熟果実からmRNAを単離し、２）この
mRNAからcDNAを作り、３）所望の配列に関するcDNAをス
クリーンし、４）この所望の配列を植物プロモーター
と、このグルカナーゼ遺伝子の発現にとって反対の配向
において連結し、５）適切な宿主植物細胞を形質転換
し、そして６）この逆になっている配列を転写する細胞
を選び、そして再生せしめることを含む。
I.一般方法 一般に、本明細書に用いている学術用語及び以下の詳
細の組換DNA技術における研究室行程はよく知られ且つ
当業界において一般的に利用されているものである。ク
ローニング、DNA及びRNA単離、増幅並びに精製のために
標準的な技術を利用した。DNAリガーゼ、DNAポリメラー
ゼ、制限エンドヌクレアーゼ等を含む一般的な酵素反応
はその製造者の仕様書に従って行った。このような技術
及び種々のその他の技術はSambrookら、Molecular Clon
ing−Ａ Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,C
old Spring Harbor,New York,1989に従って一般的に行
った。このマニュアル以後「Sambrook」として引用す
る。その他の一般的な文献を本明細書にわたって提供す
る。それらの方法は当業界においてよく知られているも
のと考え、そして読み手の便宜上提供した。その中に含
まれている全ての情報を本明細書に参考として組入れて
いる。
細の組換DNA技術における研究室行程はよく知られ且つ
当業界において一般的に利用されているものである。ク
ローニング、DNA及びRNA単離、増幅並びに精製のために
標準的な技術を利用した。DNAリガーゼ、DNAポリメラー
ゼ、制限エンドヌクレアーゼ等を含む一般的な酵素反応
はその製造者の仕様書に従って行った。このような技術
及び種々のその他の技術はSambrookら、Molecular Clon
ing−Ａ Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,C
old Spring Harbor,New York,1989に従って一般的に行
った。このマニュアル以後「Sambrook」として引用す
る。その他の一般的な文献を本明細書にわたって提供す
る。それらの方法は当業界においてよく知られているも
のと考え、そして読み手の便宜上提供した。その中に含
まれている全ての情報を本明細書に参考として組入れて
いる。
II.エンド−1,4−β−グルカナーゼcDNAの調製 種々のグルカナーゼ遺伝子からcDNAを調製するため、
成熟果実からまずmRNAを単離した。真核mRNAはその３′
末端に、ポリ−Ａ尾部として知られるアデニンヌクレオ
チド残基の鎖を有する。
成熟果実からまずmRNAを単離した。真核mRNAはその３′
末端に、ポリ−Ａ尾部として知られるアデニンヌクレオ
チド残基の鎖を有する。
次にオリゴｄ−Ｔヌクレオチドの短い鎖をこのポリ−
Ａ尾部にハイブリダイズさせ、そして逆転写酵素のプラ
イマーとして働かせた。この酵素はRNAを相補DNA（cDN
A）鎖の合成のための鋳型として利用する。次に第２のD
NA鎖を、鋳型としてこの第1cDNA鎖を利用して合成し
た。E.コリ（E.coli）における増幅のためのプラスミド
又はλファージベクターへの挿入のためにリンカーをこ
の二本鎖cDNAに付加した。
Ａ尾部にハイブリダイズさせ、そして逆転写酵素のプラ
イマーとして働かせた。この酵素はRNAを相補DNA（cDN
A）鎖の合成のための鋳型として利用する。次に第２のD
NA鎖を、鋳型としてこの第1cDNA鎖を利用して合成し
た。E.コリ（E.coli）における増幅のためのプラスミド
又はλファージベクターへの挿入のためにリンカーをこ
の二本鎖cDNAに付加した。
所望のcDNAを保有するクローンの同定は、核酸ハイブ
リダイゼーション又はもし発現ベクターを用いたなら、
コード化タンパク質の免疫学的検出のいづれかによって
行った。この細菌コロニーを次にニトロセルロースフィ
ルター上にレプリカプレートした。この細胞を溶解せし
め、そして所望のcDNAに相補性のオリゴヌクレオチド又
は所望のタンパク質に対する抗体のいづれかとプローブ
せしめた。
リダイゼーション又はもし発現ベクターを用いたなら、
コード化タンパク質の免疫学的検出のいづれかによって
行った。この細菌コロニーを次にニトロセルロースフィ
ルター上にレプリカプレートした。この細胞を溶解せし
め、そして所望のcDNAに相補性のオリゴヌクレオチド又
は所望のタンパク質に対する抗体のいづれかとプローブ
せしめた。
以下に詳細の典型的なケースにおいて、アボカド及び
そら豆の両者において見い出せる高く保存された領域
（Christoffersenら、前記及びTuckerら前記を参照のこ
と）を、トマト果実cDNAライブラリーをスクリーンする
ための同義性（degenerate）オリゴヌクレオチドプロー
ブを作製するために用いた。交差−ハイブリダイゼーシ
ョン実験は、グルカナーゼ遺伝子の種類（ファミリー）
がトマト果実の成熟中に発現されることを示唆した。こ
の種類の中の３種の遺伝子をtcl1,tcl2及びtcl3として
同定した。
そら豆の両者において見い出せる高く保存された領域
（Christoffersenら、前記及びTuckerら前記を参照のこ
と）を、トマト果実cDNAライブラリーをスクリーンする
ための同義性（degenerate）オリゴヌクレオチドプロー
ブを作製するために用いた。交差−ハイブリダイゼーシ
ョン実験は、グルカナーゼ遺伝子の種類（ファミリー）
がトマト果実の成熟中に発現されることを示唆した。こ
の種類の中の３種の遺伝子をtcl1,tcl2及びtcl3として
同定した。
tcl1cDNAのヌクレオチド配列（配列No.1）を以下の表
１に紹介する。このcDNAはアメリカンタイプカルチャー
コレクション、Rockville,Marylandに1990年４月20日に
寄託し、その承認番号はNo.68312である。表２はtcl2cD
NAの部分のヌクレオチド配列である（配列No.2）。この
配列は表１に紹介したtcl1ヌクレオチド配列におけるヌ
クレオチド319〜423に相当する。この配列は多数の方法
のうちのいづれにおいて利用できる。例えば、この配列
のフラグメントはその他の植物種から作り上げたゲノム
又はcDNAライブラリーにおけるその他のグルカナーゼ遺
伝子を同定するためのプローブとして利用できる。
１に紹介する。このcDNAはアメリカンタイプカルチャー
コレクション、Rockville,Marylandに1990年４月20日に
寄託し、その承認番号はNo.68312である。表２はtcl2cD
NAの部分のヌクレオチド配列である（配列No.2）。この
配列は表１に紹介したtcl1ヌクレオチド配列におけるヌ
クレオチド319〜423に相当する。この配列は多数の方法
のうちのいづれにおいて利用できる。例えば、この配列
のフラグメントはその他の植物種から作り上げたゲノム
又はcDNAライブラリーにおけるその他のグルカナーゼ遺
伝子を同定するためのプローブとして利用できる。
このcDNAは植物細胞におけるこのグルカナーゼ遺伝子
の発現を阻止するために、発現カセットにアンチセンス
方向において挿入することができる。このcDNA配列はそ
れ自体を、細菌又は植物細胞における発現のために発現
カセットに挿入することができる。細菌へのこの発現カ
セットの挿入は、エタノール又はメタノールへの植物組
織のバイオマス変換（biomass conversion）のために有
用である。
の発現を阻止するために、発現カセットにアンチセンス
方向において挿入することができる。このcDNA配列はそ
れ自体を、細菌又は植物細胞における発現のために発現
カセットに挿入することができる。細菌へのこの発現カ
セットの挿入は、エタノール又はメタノールへの植物組
織のバイオマス変換（biomass conversion）のために有
用である。
紹介する配列は、他のタンパク質に融合したグルカナ
ーゼ酵素の一部を含んで成る融合タンパク質の発現のた
めに利用することもできる。時に注目されるのはこのタ
ンパク質の一過性ペプチド配列である。当業界によく知
られている通り、細胞膜を通って輸送されたタンパク質
は約15〜30アミノ酸の長さの疎水性アミノ酸に富んだＮ
−末端配列を有する。膜の通過のプロセスの際、時折
り、このシグナル配列はシグナルペプチダーゼによって
切断される。Watsonら、Molecular Biology of the Gen
e,頁731,1987。従って、トマトのエンド−1,4−β−グ
ルカナーゼ遺伝子のシグナルペプチドコード化配列をそ
の他の外来性の構造遺伝子に連結させて、細胞壁へ外来
遺伝子生成物を輸送せしめることができうる。この外来
構造遺伝子は細菌、酵母、動物又は植物を含む任意の起
源に由来しうる。典型的には、このシグナルペプチドコ
ード化配列をその３′末端で、外来構造遺伝子への連結
のためのリンカーに、適切な解読枠において連結させる
であろう。対象の外来遺伝子は、炭水化物及び細胞壁代
謝酵素、例えばインベルターゼ、デキストラスクラー
ゼ、レバンスクラーゼを含む。疾患耐性に関与するタン
パク質、例えばキチナーゼ、ヒドロキシタンパク質に富
む糖タンパク質及びポリガラクツロナーゼ阻害タンパク
質をコードする遺伝子も対象となる。
ーゼ酵素の一部を含んで成る融合タンパク質の発現のた
めに利用することもできる。時に注目されるのはこのタ
ンパク質の一過性ペプチド配列である。当業界によく知
られている通り、細胞膜を通って輸送されたタンパク質
は約15〜30アミノ酸の長さの疎水性アミノ酸に富んだＮ
−末端配列を有する。膜の通過のプロセスの際、時折
り、このシグナル配列はシグナルペプチダーゼによって
切断される。Watsonら、Molecular Biology of the Gen
e,頁731,1987。従って、トマトのエンド−1,4−β−グ
ルカナーゼ遺伝子のシグナルペプチドコード化配列をそ
の他の外来性の構造遺伝子に連結させて、細胞壁へ外来
遺伝子生成物を輸送せしめることができうる。この外来
構造遺伝子は細菌、酵母、動物又は植物を含む任意の起
源に由来しうる。典型的には、このシグナルペプチドコ
ード化配列をその３′末端で、外来構造遺伝子への連結
のためのリンカーに、適切な解読枠において連結させる
であろう。対象の外来遺伝子は、炭水化物及び細胞壁代
謝酵素、例えばインベルターゼ、デキストラスクラー
ゼ、レバンスクラーゼを含む。疾患耐性に関与するタン
パク質、例えばキチナーゼ、ヒドロキシタンパク質に富
む糖タンパク質及びポリガラクツロナーゼ阻害タンパク
質をコードする遺伝子も対象となる。
III.ベクターの作製 所望の組換えベクターは、植物におけるアンチセンス
cDNAの転写を開始せしめるためにデザインされた発現カ
セットを含んで成りうる。細菌又はウイルス起源のそれ
に付随する配列もこのベクターが細菌又はファージ宿主
の中にクローンされるようにさせるために含ませる。
cDNAの転写を開始せしめるためにデザインされた発現カ
セットを含んで成りうる。細菌又はウイルス起源のそれ
に付随する配列もこのベクターが細菌又はファージ宿主
の中にクローンされるようにさせるために含ませる。
このベクターは好ましくは広域宿主範囲原核生物複製
起点を含む。この所望の構造体を保有する細菌細胞の選
別を可能とするために選別マーカーも含ませるべきであ
る。適切なる原核細胞選択マーカーには、抗生物質、例
えばカナマイシン又はテトラサイクリンに対する耐性が
含まれる。
起点を含む。この所望の構造体を保有する細菌細胞の選
別を可能とするために選別マーカーも含ませるべきであ
る。適切なる原核細胞選択マーカーには、抗生物質、例
えばカナマイシン又はテトラサイクリンに対する耐性が
含まれる。
その他の機能をコードするその他のDNA配列もこのベ
クターに存在させてよく、これは当業界に知られてい
る。例えば、アグロバクテリアの形質転換の場合、Ｔ−
DNA配列も植物染色体へのその後の転移のために含ませ
ることができる。
クターに存在させてよく、これは当業界に知られてい
る。例えば、アグロバクテリアの形質転換の場合、Ｔ−
DNA配列も植物染色体へのその後の転移のために含ませ
ることができる。
もし細菌におけるグルカナーゼcDNAの発現を所望する
なら、細菌性発現ベクターを用いることができる。細菌
への発現ベクターの挿入はエタノール又はメタノールへ
の植物組織のバイオマス変換において有用である。細菌
性発現ベクターの作製は典型的には強力な細菌性プロモ
ーターの下流にcDNAを置くことによって行われる。利用
されうる細菌性プロモーターの例には、β−ラクタマー
ゼ、β−ガラクトシダーゼ及びファージλpLプロモータ
ーが含まれる。細菌におけるmRNAの翻訳の効率性はリボ
ソーム結合性部位の存在及びその転写開始コドンからの
距離に本質的に依存する。
なら、細菌性発現ベクターを用いることができる。細菌
への発現ベクターの挿入はエタノール又はメタノールへ
の植物組織のバイオマス変換において有用である。細菌
性発現ベクターの作製は典型的には強力な細菌性プロモ
ーターの下流にcDNAを置くことによって行われる。利用
されうる細菌性プロモーターの例には、β−ラクタマー
ゼ、β−ガラクトシダーゼ及びファージλpLプロモータ
ーが含まれる。細菌におけるmRNAの翻訳の効率性はリボ
ソーム結合性部位の存在及びその転写開始コドンからの
距離に本質的に依存する。
植物における発現のため、この組換発現カセットはこ
の所望の配列の他に、植物プロモーター領域、転写開始
部位（もしこの転写すべき配列がそれを欠いているな
ら）及び転写終結配列を含むであろう。このカセットの
５′及び３′末端での固有制限酵素部位は、典型的には
予め存在しているベクターへの容易な挿入を可能とする
ために含まれている。
の所望の配列の他に、植物プロモーター領域、転写開始
部位（もしこの転写すべき配列がそれを欠いているな
ら）及び転写終結配列を含むであろう。このカセットの
５′及び３′末端での固有制限酵素部位は、典型的には
予め存在しているベクターへの容易な挿入を可能とする
ために含まれている。
真核細胞遺伝子発現をコントロールする配列は既にか
なり研究されている。プロモーター配列因子にはTATAボ
ックス共通配列（TATAAT）が含まれ、これは通常転写開
始部位の20〜30塩基対（bp）上流にある。便宜により、
この開始部位を＋１と称する。５′（上流）方向に広が
る配列は負の数字で示し、そして３′（下流）方向に広
がる配列は正の数字で示す。
なり研究されている。プロモーター配列因子にはTATAボ
ックス共通配列（TATAAT）が含まれ、これは通常転写開
始部位の20〜30塩基対（bp）上流にある。便宜により、
この開始部位を＋１と称する。５′（上流）方向に広が
る配列は負の数字で示し、そして３′（下流）方向に広
がる配列は正の数字で示す。
植物において、TATAボックスから更に上流の−80〜−
100の位置にて、典型的にはトリヌクレオチドＧ（又は
Ｔ）NGを囲む一連のアデニンを有するプロモーター因子
が存在している。J.Messingら、Genetic Engineering i
n Plants,頁221−227（Kosage,Meredith and Hollaende
r編、1983）。組織特異性、環境シグナルへの応答又は
転写の最大効率性を授けるその他の配列もプロモーター
領域において見い出すことができる。このような配列は
通常転写開始部位の400bp以内に見い出せるが、200bp以
上離れていることもある。
100の位置にて、典型的にはトリヌクレオチドＧ（又は
Ｔ）NGを囲む一連のアデニンを有するプロモーター因子
が存在している。J.Messingら、Genetic Engineering i
n Plants,頁221−227（Kosage,Meredith and Hollaende
r編、1983）。組織特異性、環境シグナルへの応答又は
転写の最大効率性を授けるその他の配列もプロモーター
領域において見い出すことができる。このような配列は
通常転写開始部位の400bp以内に見い出せるが、200bp以
上離れていることもある。
異種間のプロモーター／構成遺伝子の組合せの作製に
おいて、このプロモーターは、その自然における転写開
始部位からとおよそ同じ距離でこの異種転写開始部位か
ら位置していることが好ましい。しかしながら当業界に
おいて知られている通り、この距離におけるある程度の
変更はプロモーター機能の損失を伴うことなく許容され
うる。
おいて、このプロモーターは、その自然における転写開
始部位からとおよそ同じ距離でこの異種転写開始部位か
ら位置していることが好ましい。しかしながら当業界に
おいて知られている通り、この距離におけるある程度の
変更はプロモーター機能の損失を伴うことなく許容され
うる。
この発現カセットに利用される特定のプロモーターは
本発明の非本質的な観点である。植物細胞において転写
をもたらす多数のプロモーターのうちのいづれも適切で
ありうる。このプロモーターは構成的であっても誘発性
であってもよい。細菌起源のプロモーターにはオクトパ
インシンターゼプロモーター、ノパリンシンターゼプロ
モーター及び天然Tiプラスミドに由来するその他のプロ
モーターが含まれる。Herrara−Estrellaら、Nature,30
3:209−213,1983。ウイルス性プロモーターにはカリフ
ラワーモザイクウイルスの35S及び19SRNAが含まれる。O
dellら、Nature,313:810−812,1985。可能な植物プロモ
ーターにはリブロース1,3−ビホスフェートカルボキシ
ラーゼ小サブユニットプロモーター及びフェーズオリン
（phaseolin）プロモーターが含まれる。E8遺伝子及び
その他の遺伝子であってその発現がエチレンによって誘
発されるもの由来のプロモーター配列も利用できる。E8
プロモーターの単離及び配列はDeikman and Fischer,EM
BO J.7:3315−3327,1988に詳しく説明され、これは本明
細書に参考として組入れている。
本発明の非本質的な観点である。植物細胞において転写
をもたらす多数のプロモーターのうちのいづれも適切で
ありうる。このプロモーターは構成的であっても誘発性
であってもよい。細菌起源のプロモーターにはオクトパ
インシンターゼプロモーター、ノパリンシンターゼプロ
モーター及び天然Tiプラスミドに由来するその他のプロ
モーターが含まれる。Herrara−Estrellaら、Nature,30
3:209−213,1983。ウイルス性プロモーターにはカリフ
ラワーモザイクウイルスの35S及び19SRNAが含まれる。O
dellら、Nature,313:810−812,1985。可能な植物プロモ
ーターにはリブロース1,3−ビホスフェートカルボキシ
ラーゼ小サブユニットプロモーター及びフェーズオリン
（phaseolin）プロモーターが含まれる。E8遺伝子及び
その他の遺伝子であってその発現がエチレンによって誘
発されるもの由来のプロモーター配列も利用できる。E8
プロモーターの単離及び配列はDeikman and Fischer,EM
BO J.7:3315−3327,1988に詳しく説明され、これは本明
細書に参考として組入れている。
プロモーター配列に加えて、この発現カセットは効率
的な終結を提供するためにこの構造遺伝子の下流に転写
終結領域も含むべきである。この終結領域はこのプロモ
ーター遺伝子と同一の遺伝子から得るか、又は異なる遺
伝子から得ることもできる。
的な終結を提供するためにこの構造遺伝子の下流に転写
終結領域も含むべきである。この終結領域はこのプロモ
ーター遺伝子と同一の遺伝子から得るか、又は異なる遺
伝子から得ることもできる。
もしこの構造遺伝子によってコードされるmRNAが効率
的に翻訳されるなら、ポリアデニル化配列も一般にこの
ベクター構造体に付加する。Alber and Kawasaki,Molo
and Appl.Genet,1:419−434,1982。ポリアデニル化は植
物細胞におけるグルカナーゼcDNAの発現にとって重要で
ある。ポリアデニル化配列にはアグロバクテリア オク
トパインシンターゼシグナル（Gielenら、EMBO J.3:835
−846,1984）又はノパリンシンターゼシグナル（Depick
erら、Mol.and Appl.Genet,1:561−573,1982）が含まれ
るが、それらに限定されない。
的に翻訳されるなら、ポリアデニル化配列も一般にこの
ベクター構造体に付加する。Alber and Kawasaki,Molo
and Appl.Genet,1:419−434,1982。ポリアデニル化は植
物細胞におけるグルカナーゼcDNAの発現にとって重要で
ある。ポリアデニル化配列にはアグロバクテリア オク
トパインシンターゼシグナル（Gielenら、EMBO J.3:835
−846,1984）又はノパリンシンターゼシグナル（Depick
erら、Mol.and Appl.Genet,1:561−573,1982）が含まれ
るが、それらに限定されない。
このベクターは典型的には選択マーカーも含み、これ
によって形質転換された植物細胞は培養において同定さ
れうる。通常、このマーカー遺伝子は抗生物質耐性をコ
ードするであろう。このようなマーカーにはG418、ヒグ
ロマイシン、ブレオマイシン、カナマイシン及びゲンタ
マイシンに対する耐性が含まれる。植物細胞を形質転換
せしめた後、このベクターを有するこれらの細胞は特定
の抗生物質を含む培養中における増殖するその能力によ
って同定されるであろう。
によって形質転換された植物細胞は培養において同定さ
れうる。通常、このマーカー遺伝子は抗生物質耐性をコ
ードするであろう。このようなマーカーにはG418、ヒグ
ロマイシン、ブレオマイシン、カナマイシン及びゲンタ
マイシンに対する耐性が含まれる。植物細胞を形質転換
せしめた後、このベクターを有するこれらの細胞は特定
の抗生物質を含む培養中における増殖するその能力によ
って同定されるであろう。
IV.植物細胞におけるエンド−1,4−β−グルカナーゼア
ンチセンスcDNAの転写 A.試験管内操作による植物細胞の形質転換 1. 直接的形質転換 上記のベクターは、この組換DNAを機械的に搬送する
マイクロピペットの利用によって植物細胞の中に直接的
にマイクロインジェクトすることができる。Grossway,M
ol.Gen.Genetics,202:179−185,1985。この遺伝子物質
はポリエチレングリコールを用いて植物細胞に入れるこ
ともできる。Krensら、Nature,296,72−74,1982。
ンチセンスcDNAの転写 A.試験管内操作による植物細胞の形質転換 1. 直接的形質転換 上記のベクターは、この組換DNAを機械的に搬送する
マイクロピペットの利用によって植物細胞の中に直接的
にマイクロインジェクトすることができる。Grossway,M
ol.Gen.Genetics,202:179−185,1985。この遺伝子物質
はポリエチレングリコールを用いて植物細胞に入れるこ
ともできる。Krensら、Nature,296,72−74,1982。
核酸セグメントのその他の導入方法は、小ビーズもし
くは粒子内又は表面上のいづれかに核酸を有する小粒子
による高速弾道貫入法である。Kleinら、Nature,327,70
−73,1987。
くは粒子内又は表面上のいづれかに核酸を有する小粒子
による高速弾道貫入法である。Kleinら、Nature,327,70
−73,1987。
更なる導入の他の方法は、ミニ細胞、細胞、リソソー
ム又は他の融合性脂質表層化体のいづれかのその他のも
のとのプロプラストの融合である。Fraleyら、Proc.Nat
l.Acad.Sci.USA,79,1859−1863,1982。
ム又は他の融合性脂質表層化体のいづれかのその他のも
のとのプロプラストの融合である。Fraleyら、Proc.Nat
l.Acad.Sci.USA,79,1859−1863,1982。
このDNAはエレクトロポレーションによって植物細胞
に導入することもできる。Frommら、Proc.Natl.Acad.Sc
i.USA,82:5824（1985）。この技術において、植物のプ
ロトプラストを発現カセットを含むプラスミドの存在下
においてエレトクロポレートせしめる。高電場の強さの
電気的衝撃は生体膜を可逆的に浸透性にし、プラスミド
の導入を可能にする。エレトクロポレートされた植物プ
ロトプラストはその細胞壁を修復し、分裂し、そして再
生する。
に導入することもできる。Frommら、Proc.Natl.Acad.Sc
i.USA,82:5824（1985）。この技術において、植物のプ
ロトプラストを発現カセットを含むプラスミドの存在下
においてエレトクロポレートせしめる。高電場の強さの
電気的衝撃は生体膜を可逆的に浸透性にし、プラスミド
の導入を可能にする。エレトクロポレートされた植物プ
ロトプラストはその細胞壁を修復し、分裂し、そして再
生する。
2. ベクターの形質転換 カリフラワーモザイクウイルス（CaMV）は植物細胞に
アンチセンスDNAを導入するためのベクターとして利用
されうる（Hohnら、1982“Molecular Biology of Plant
tumors"Academic Press,new York、頁549−560;Howell
の米国特許第4,407,956号）。詳細されている方法に従
うと、CaMVウイルス性DNAゲノム全体を親細菌性プラス
ミドに挿入して組換DNA分子を作り、これは細菌におい
て増幅されうる。クローニングの後、この組換えプラス
ミドを、所望の配列をこのプラスミドのウイルス部分に
おける固有制限部位に導入せしめることによって更に改
質せしめる。この組換プラスミドの改質ウイルス部分を
次に親細菌性プラスミドから切り出し、そして植物細胞
又は植物を感染せしめるのに用いる。
アンチセンスDNAを導入するためのベクターとして利用
されうる（Hohnら、1982“Molecular Biology of Plant
tumors"Academic Press,new York、頁549−560;Howell
の米国特許第4,407,956号）。詳細されている方法に従
うと、CaMVウイルス性DNAゲノム全体を親細菌性プラス
ミドに挿入して組換DNA分子を作り、これは細菌におい
て増幅されうる。クローニングの後、この組換えプラス
ミドを、所望の配列をこのプラスミドのウイルス部分に
おける固有制限部位に導入せしめることによって更に改
質せしめる。この組換プラスミドの改質ウイルス部分を
次に親細菌性プラスミドから切り出し、そして植物細胞
又は植物を感染せしめるのに用いる。
植物細胞の中にDNAを導入する他の方法は、この遺伝
子によって予め形質転換せしめたアグロバクテリア ト
ウメファシエン又はA.リソゲン（A.rhizogenes）によっ
て植物細胞を感染させることである。当業界に知られる
適切な条件のもとで、この形質転換植物細胞を増殖させ
て苗条又は根を形成し、そして更に植物へと発育させ
る。
子によって予め形質転換せしめたアグロバクテリア ト
ウメファシエン又はA.リソゲン（A.rhizogenes）によっ
て植物細胞を感染させることである。当業界に知られる
適切な条件のもとで、この形質転換植物細胞を増殖させ
て苗条又は根を形成し、そして更に植物へと発育させ
る。
アグロバクテリアはグラム陰性科リゾビアシー（Rhiz
obiaceae）の代表的な属である。この種はクラウンゴー
ル（A.トウメファシエン）及び毛状根病（A.リゾゲン）
の原因である。クラウンゴール腫瘍及び毛状根における
植物細胞はオパインとして知られるアミノ酸誘導体を生
産するように誘発され、これは細菌によってのみ異化代
謝される。オパインの発現の原因である細菌性遺伝子は
キメラ発現カセットに関するコントロール因子の便利な
起源である。更に、オパインの存在のアッセイは形質転
換組織の同定に利用できる。
obiaceae）の代表的な属である。この種はクラウンゴー
ル（A.トウメファシエン）及び毛状根病（A.リゾゲン）
の原因である。クラウンゴール腫瘍及び毛状根における
植物細胞はオパインとして知られるアミノ酸誘導体を生
産するように誘発され、これは細菌によってのみ異化代
謝される。オパインの発現の原因である細菌性遺伝子は
キメラ発現カセットに関するコントロール因子の便利な
起源である。更に、オパインの存在のアッセイは形質転
換組織の同定に利用できる。
異種遺伝子配列はA.トウメファシエンのTiプラスミド
又はA.リゾゲンのRiプラスミドの手段によって適切な植
物細胞に導入せしめることができる。このTi又はRiプラ
スミドはアグロバクテリアによる感染に基づいて植物細
胞に移され、そしてこれは植物ゲノムの中に安定的に組
込まれる。J.Schell,Science,237:1176−1183,1987。
又はA.リゾゲンのRiプラスミドの手段によって適切な植
物細胞に導入せしめることができる。このTi又はRiプラ
スミドはアグロバクテリアによる感染に基づいて植物細
胞に移され、そしてこれは植物ゲノムの中に安定的に組
込まれる。J.Schell,Science,237:1176−1183,1987。
Ti及びRiプラスミドは形質転換細胞の製造のために本
質的な二つの領域を含む。このうちの一方は転移DNA
（Ｔ−DNA）と呼ばれ、これは植物の核に移転され、そ
して腫瘍又は根の形成を誘発する。他方はヴイルレンス
（vir）領域と呼ばれ、これはＴ−DNAの転移にとって本
質的であるがそれ自身は転移されない。このＴ−DNA
は、このvir領域が異なるプラスミド上にあるときでさ
えも植物細胞に転移されうる。Hoekemaら、Nature,303:
179−189,1983。この転移されたDNA領域は、その転移さ
れる能力が影響されることなく、異種DNAの挿入によっ
てそのサイズが増大することができる。疾患の原因とな
る遺伝子の欠失せしめた改質Ti又はRiプラスミドが、本
発明の遺伝子構造体の適切な植物細胞への導入のための
ベクターとして利用できる。一般的な以下の方法におい
て組換Ti及びRiプラスミドの作製は、典型的には一般的
な細菌ベクター、例えばpBR322と一緒に利用される。天
然プラスミドに時折り見い出せる及び外来配列から時折
り作製されるアセクサリー遺伝子因子が更に利用でき
る。これらは「シャトルベクター」（Ruvkun and Ausub
el,1981,Nature 298:85−88）、プロモーター（Lawton
ら、1987,Plant Mol.Biol.9:315−324）及び選別因子と
しての抗生物質耐性のための構造遺伝子（Fraleyら、Pr
oc.Nat.Acad.Sci.,80:4803−4807,1983）が含まれるが
それらに限定されない。
質的な二つの領域を含む。このうちの一方は転移DNA
（Ｔ−DNA）と呼ばれ、これは植物の核に移転され、そ
して腫瘍又は根の形成を誘発する。他方はヴイルレンス
（vir）領域と呼ばれ、これはＴ−DNAの転移にとって本
質的であるがそれ自身は転移されない。このＴ−DNA
は、このvir領域が異なるプラスミド上にあるときでさ
えも植物細胞に転移されうる。Hoekemaら、Nature,303:
179−189,1983。この転移されたDNA領域は、その転移さ
れる能力が影響されることなく、異種DNAの挿入によっ
てそのサイズが増大することができる。疾患の原因とな
る遺伝子の欠失せしめた改質Ti又はRiプラスミドが、本
発明の遺伝子構造体の適切な植物細胞への導入のための
ベクターとして利用できる。一般的な以下の方法におい
て組換Ti及びRiプラスミドの作製は、典型的には一般的
な細菌ベクター、例えばpBR322と一緒に利用される。天
然プラスミドに時折り見い出せる及び外来配列から時折
り作製されるアセクサリー遺伝子因子が更に利用でき
る。これらは「シャトルベクター」（Ruvkun and Ausub
el,1981,Nature 298:85−88）、プロモーター（Lawton
ら、1987,Plant Mol.Biol.9:315−324）及び選別因子と
しての抗生物質耐性のための構造遺伝子（Fraleyら、Pr
oc.Nat.Acad.Sci.,80:4803−4807,1983）が含まれるが
それらに限定されない。
アグロバクテリアによって形質転換されることがで
き、そして完全植物へと再生することができる全ての植
物細胞は本発明に従って形質転換されて所望のDNAを含
む形質転換完全植物を提供することができる。植物細胞
をアグロバクテリアによって形質転換するには二通りの
一般的な方法がある： （１）アグロバクテリアを単離化プロトプラストと一緒
に培養する、又は （２）完全細胞もしくは組織のアグロバクテリアによる
形質転換。
き、そして完全植物へと再生することができる全ての植
物細胞は本発明に従って形質転換されて所望のDNAを含
む形質転換完全植物を提供することができる。植物細胞
をアグロバクテリアによって形質転換するには二通りの
一般的な方法がある： （１）アグロバクテリアを単離化プロトプラストと一緒
に培養する、又は （２）完全細胞もしくは組織のアグロバクテリアによる
形質転換。
方法（１）はプロトプラストの培養及びその後の培養
プロトプラストの植物再生を可能とする樹立された培養
系を必要とする。
プロトプラストの植物再生を可能とする樹立された培養
系を必要とする。
方法（２）は、（ａ）完全植物組織、例えば子葉がア
グロバクテリアによって形質転換されうること、及び
（ｂ）形質転換細胞又は組織が誘発されて完全植物へと
再生できることを必要とする。
グロバクテリアによって形質転換されうること、及び
（ｂ）形質転換細胞又は組織が誘発されて完全植物へと
再生できることを必要とする。
ほとんどの双子葉植物の種はアグロバクテリアによっ
て形質転換されうる。アグロバクテリアにとって天然の
植物宿主である全ての種は試験官内で形質転換されう
る。単子葉植物、特に殻類はアグロバクテリアの天然宿
主でない。アグロバクテリアを用いるそれらの形質転換
の試みは最近まで成功していなかった。Hooykas−Van S
logterenら、Nature 311:763−764,1984。一の単子葉植
物はアグロバクテリアによって形質転換されうる実証が
出てきている。新規なる実験手法を利用することによ
り、殻類の種、例えばライ麦（de la Penaら、Nature 3
25:274−276,1987）、トウモロコシ（Rhodesら、Scienc
e 240:204−207,1988）及びコメ（Shimamotoら、Nature
338:274−276,1987）が現在形質転換されうる。
て形質転換されうる。アグロバクテリアにとって天然の
植物宿主である全ての種は試験官内で形質転換されう
る。単子葉植物、特に殻類はアグロバクテリアの天然宿
主でない。アグロバクテリアを用いるそれらの形質転換
の試みは最近まで成功していなかった。Hooykas−Van S
logterenら、Nature 311:763−764,1984。一の単子葉植
物はアグロバクテリアによって形質転換されうる実証が
出てきている。新規なる実験手法を利用することによ
り、殻類の種、例えばライ麦（de la Penaら、Nature 3
25:274−276,1987）、トウモロコシ（Rhodesら、Scienc
e 240:204−207,1988）及びコメ（Shimamotoら、Nature
338:274−276,1987）が現在形質転換されうる。
B.形質転換植物細胞の選別及び再生 形質転換の後、該アンチセンスDNAを含んで成る形質
転換植物細胞又は植物を同定しなくてはならない。選択
マーカー、例えば前記したものが典型的に利用される。
形質転換植物細胞はこの細胞を適切な抗生物質を含む増
殖培地において増殖せしめることによって選別できる。
オパインの存在もこの植物がアグロバクテリアによって
形質転換されているかどうかのために利用できうる。
転換植物細胞又は植物を同定しなくてはならない。選択
マーカー、例えば前記したものが典型的に利用される。
形質転換植物細胞はこの細胞を適切な抗生物質を含む増
殖培地において増殖せしめることによって選別できる。
オパインの存在もこの植物がアグロバクテリアによって
形質転換されているかどうかのために利用できうる。
形質転換された細胞を選別した後、所望の異種遺伝子
の発現を確認することができる。挿入されたDNAによっ
てコードされるmRNAの簡単な検出は当業界によく知られ
た方法、例えばノーザンブロットハイブリダイゼーショ
ンによって行われうる。同様に挿入された配列はサザン
ブロットハイブリダイゼーションによっても同定でき
る。例えば前記したSambrookを参照のこと。
の発現を確認することができる。挿入されたDNAによっ
てコードされるmRNAの簡単な検出は当業界によく知られ
た方法、例えばノーザンブロットハイブリダイゼーショ
ンによって行われうる。同様に挿入された配列はサザン
ブロットハイブリダイゼーションによっても同定でき
る。例えば前記したSambrookを参照のこと。
該アンチセンスDNAの存在の確認の後、完全植物の再
生が所望される。プロトプラストが単離でき、且つ完全
に再生した植物を得るように培養できる全ての植物は本
発明によって形質転換されうる。いくつかの適切な植物
には、例えば以下の属、イチゴ（Fragaria）、ミヤコグ
サ（Lotus）、ウマゴヤシ（Medicago）、イガマメ（Ono
brychis）、シャクジクソウ（Trifolium）、レイショウ
コウ（Trigonella）、サザケ（Vigna）、ミカン（Citru
s）、アマ（Linum）、フロウソウ（Geranium）、イモノ
キ（Manihot）、ニンジン（Daucus）、シロイヌナズサ
（Arabidopsis）、アブラナ（Brassica）、ダイコン（R
aphanus）、シロガラシ（Sinapis）、オオカミナスビ
（Atropa）、トウモロコシ（Capsicum）、チョウセンア
サガオ（Datura）、ヒヨス（Hyoscyamus）、トマト（Ly
copersicon）、タバコ（Nicotiana）、ナス（Solanu
m）、シクバネアサガオ（Petunia）、ジギタリス（Digi
talis）、ハナハッカ（Majorana）、チコリー（Cichori
um）、ヒマワリ（Helianthus）、アキノノゲシ（Lactuc
a）、スズメノチャヒキ（Bromus）、クサスギガラ（Asp
aragus）、キンギョウソウ（Antirrhinum）、ヘレロカ
リス（Hererocallis）、アフリカウンラン（Nemesi
a）、テンジクアオイ（Pelargoniumu）、キビ（Panicu
m）、チカラシバ（Pennisetum）、キンポウゲ（Ranuncu
lus）、キオン（Senecio）、サルメンバナ（Salpigloss
is）、キュウリ（Cucumis）、ルリマガリバナ（Browaal
ia）、ダイズ（Glycine）、ドクムギ（Lolium）、トウ
モロコシ（Zea）、コムギ（Triticum）、モロコシ（Sor
ghum）、リンゴ（Malus）、オランダミツバ（Apium）、
及びチョウセンアサガオ（Datura）由来の種が含まれ
る。
生が所望される。プロトプラストが単離でき、且つ完全
に再生した植物を得るように培養できる全ての植物は本
発明によって形質転換されうる。いくつかの適切な植物
には、例えば以下の属、イチゴ（Fragaria）、ミヤコグ
サ（Lotus）、ウマゴヤシ（Medicago）、イガマメ（Ono
brychis）、シャクジクソウ（Trifolium）、レイショウ
コウ（Trigonella）、サザケ（Vigna）、ミカン（Citru
s）、アマ（Linum）、フロウソウ（Geranium）、イモノ
キ（Manihot）、ニンジン（Daucus）、シロイヌナズサ
（Arabidopsis）、アブラナ（Brassica）、ダイコン（R
aphanus）、シロガラシ（Sinapis）、オオカミナスビ
（Atropa）、トウモロコシ（Capsicum）、チョウセンア
サガオ（Datura）、ヒヨス（Hyoscyamus）、トマト（Ly
copersicon）、タバコ（Nicotiana）、ナス（Solanu
m）、シクバネアサガオ（Petunia）、ジギタリス（Digi
talis）、ハナハッカ（Majorana）、チコリー（Cichori
um）、ヒマワリ（Helianthus）、アキノノゲシ（Lactuc
a）、スズメノチャヒキ（Bromus）、クサスギガラ（Asp
aragus）、キンギョウソウ（Antirrhinum）、ヘレロカ
リス（Hererocallis）、アフリカウンラン（Nemesi
a）、テンジクアオイ（Pelargoniumu）、キビ（Panicu
m）、チカラシバ（Pennisetum）、キンポウゲ（Ranuncu
lus）、キオン（Senecio）、サルメンバナ（Salpigloss
is）、キュウリ（Cucumis）、ルリマガリバナ（Browaal
ia）、ダイズ（Glycine）、ドクムギ（Lolium）、トウ
モロコシ（Zea）、コムギ（Triticum）、モロコシ（Sor
ghum）、リンゴ（Malus）、オランダミツバ（Apium）、
及びチョウセンアサガオ（Datura）由来の種が含まれ
る。
培養プロトプラストからの植物再生はEvansら、Handb
ook of Plant Cell Cultures,Vol.1:（MacMillan Publi
shing Co.New York,1983）；並びにVasil I.R.（ed.）,
Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants,A
cad.Press,Orlando,Vol.I,1984、及びVol.III,1986に詳
細されている。
ook of Plant Cell Cultures,Vol.1:（MacMillan Publi
shing Co.New York,1983）；並びにVasil I.R.（ed.）,
Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants,A
cad.Press,Orlando,Vol.I,1984、及びVol.III,1986に詳
細されている。
実用的な全ての植物が培養細胞又は組織から再生され
うることが知られており、それにはさとうきび、てんさ
い、わた、果実樹及びマメ類が含まれるがそれらに限定
されない。
うることが知られており、それにはさとうきび、てんさ
い、わた、果実樹及びマメ類が含まれるがそれらに限定
されない。
再生の手段は植物の種間で変わるが、一般に形質転換
プロトプラストの懸濁物又は形質転換外植体を含むペト
リ皿をまず用意する。カルス組織が形成され、次いで苗
条がカルスより誘発され、そしてその後発根する。一
方、胚形成がカルス組織において誘発されうる。これら
の胚は天然の胚のように発芽して植物を形成する。この
培養培地は一般に種々のアミノ酸並びにホルモン、例え
ばオーキシン及びサイトカイニンを含みうる。この培地
にグルタミン酸及びプロリンを加えることが、特にトウ
モロコシ及びムラサキウマゴヤシのような種にとって有
利でもある。効率的な再生は培地、ゲノムタイプ及び培
養物の履歴に依存するであろう。この３種の変異因子が
コントロールされたなら、再生は通常再現よく、且つ反
復性である。
プロトプラストの懸濁物又は形質転換外植体を含むペト
リ皿をまず用意する。カルス組織が形成され、次いで苗
条がカルスより誘発され、そしてその後発根する。一
方、胚形成がカルス組織において誘発されうる。これら
の胚は天然の胚のように発芽して植物を形成する。この
培養培地は一般に種々のアミノ酸並びにホルモン、例え
ばオーキシン及びサイトカイニンを含みうる。この培地
にグルタミン酸及びプロリンを加えることが、特にトウ
モロコシ及びムラサキウマゴヤシのような種にとって有
利でもある。効率的な再生は培地、ゲノムタイプ及び培
養物の履歴に依存するであろう。この３種の変異因子が
コントロールされたなら、再生は通常再現よく、且つ反
復性である。
該発現カセットが遺伝子導入植物に安定的に組込まれ
た後、これを性交配によって他の植物に伝搬することが
できる。多数の標準的な繁殖技術のいづれもが、交配す
べき種に応じて利用できる。
た後、これを性交配によって他の植物に伝搬することが
できる。多数の標準的な繁殖技術のいづれもが、交配す
べき種に応じて利用できる。
V.定義 「エンド−1,4−β−グルカナーゼ」又は「グルカナ
ーゼ」なる語は、β−1,4−グルカン結合を切断し且つ
カルボキシメチルセルロースを分解することのできる植
物酵素のクラスの構成員を称する。このような酵素は結
晶性セルロースを分解せず、そしてそれ故一定の細菌性
セルラーゼと区別できる。このクラスは、それぞれの構
成員がアミノ酸配列GGYYDAGDN又はCWERPEDMDと実質的に
相同な高く保存された領域を含むことで同定されうる。
ーゼ」なる語は、β−1,4−グルカン結合を切断し且つ
カルボキシメチルセルロースを分解することのできる植
物酵素のクラスの構成員を称する。このような酵素は結
晶性セルロースを分解せず、そしてそれ故一定の細菌性
セルラーゼと区別できる。このクラスは、それぞれの構
成員がアミノ酸配列GGYYDAGDN又はCWERPEDMDと実質的に
相同な高く保存された領域を含むことで同定されうる。
各植物の種はグルカナーゼ異質対立遺伝子の種類を含
む。このグルカナーゼ種類における遺伝子は例えばその
ヌクレオチド配列、その発現の一過性パターン及びそれ
らが発現される組織によって同定できる。典型的には、
本発明のグルカナーゼ遺伝子の発現は（例えばmRNAのレ
ベルによって測定される通り）、一般に果実の成熟の発
育を追う。
む。このグルカナーゼ種類における遺伝子は例えばその
ヌクレオチド配列、その発現の一過性パターン及びそれ
らが発現される組織によって同定できる。典型的には、
本発明のグルカナーゼ遺伝子の発現は（例えばmRNAのレ
ベルによって測定される通り）、一般に果実の成熟の発
育を追う。
「DNA配列」なる語は、５′から３′末端へと読まれ
るデオキシリボヌクレオチド塩基の一本鎖又は二本鎖ポ
リマーを称する。これは自己複製プラスミド、感染性DN
Aのポリマー及び非機能的DNAを含む。
るデオキシリボヌクレオチド塩基の一本鎖又は二本鎖ポ
リマーを称する。これは自己複製プラスミド、感染性DN
Aのポリマー及び非機能的DNAを含む。
「プロモーター」なる語は、構造遺伝子から上流にあ
り、そしてRNAポリメラーゼ及びその他の転写を開始せ
しめるタンパク質を認識且つ結合するのに関与する領域
を称する。「植物プロモーター」とは植物細胞において
転写を開始せしめることのできるプロモーターである。
り、そしてRNAポリメラーゼ及びその他の転写を開始せ
しめるタンパク質を認識且つ結合するのに関与する領域
を称する。「植物プロモーター」とは植物細胞において
転写を開始せしめることのできるプロモーターである。
「植物」なる語は完全植物、植物の器官（例えば葉、
茎、根等）、種子及び植物細胞を含んでいる。
茎、根等）、種子及び植物細胞を含んでいる。
「適切なる宿主」なる語は、組換えプラスミド、DNA
配列又は組換え発現カセットと調和し、そしてプラスミ
ドが複製でき、そのゲノムに組込まれることができ、又
は発現されることができることを可能とする微生物又は
細胞を称する。
配列又は組換え発現カセットと調和し、そしてプラスミ
ドが複製でき、そのゲノムに組込まれることができ、又
は発現されることができることを可能とする微生物又は
細胞を称する。
「発現」なる語は、構造遺伝子が転写且つ翻訳され、
これによってタンパク質が合成されることを称する。
これによってタンパク質が合成されることを称する。
「構成的」プロモーターとは、ほとんどの環境的条
件、及び発育又は細胞分化の状態のもとで活性であるプ
ロモーターである。
件、及び発育又は細胞分化の状態のもとで活性であるプ
ロモーターである。
「誘発性」プロモーターとはより厳格な環境又は発育
のコントロール下にあるプロモーターである。誘発性プ
ロモーターによる転写に影響を及ぼしうる環境条件の例
は、嫌気性条件又は光の存在を含む。発育コントロール
下にあるプロモーターの例には、一定の組織においての
み転写を開始するプロモーター、例えば成熟果実におい
てエチレンによって誘発されるE8遺伝子由来のプロモー
ターが含まれる。
のコントロール下にあるプロモーターである。誘発性プ
ロモーターによる転写に影響を及ぼしうる環境条件の例
は、嫌気性条件又は光の存在を含む。発育コントロール
下にあるプロモーターの例には、一定の組織においての
み転写を開始するプロモーター、例えば成熟果実におい
てエチレンによって誘発されるE8遺伝子由来のプロモー
ターが含まれる。
「発現にとって反対の配向」なる語は、天然の配向に
対して逆さまの状態において発現カセットに挿入され
た、構造遺伝子由来の二本鎖DNA配列を称する。特に、
正常では「鋳型鎖」である鎖はコード鎖となり、そして
その逆もまた同じである。
対して逆さまの状態において発現カセットに挿入され
た、構造遺伝子由来の二本鎖DNA配列を称する。特に、
正常では「鋳型鎖」である鎖はコード鎖となり、そして
その逆もまた同じである。
「介在されていない」なる語は介在する非翻訳配列を
欠く解放解読枠を含むDNA配列を称する。
欠く解放解読枠を含むDNA配列を称する。
「非野生型DNA」なる語は、天然環境において一定のD
NAと隣り合っていないDNA配列を称する。
NAと隣り合っていないDNA配列を称する。
以下の実験結果を限定でなく例示を目的として提供す
る。
る。
例Ｉ 本例はグルカナーゼcDNAの単離及び植物細胞の形質転
換のために適切なアンチセンス発現ベクターの作製を詳
細する。例示のみの目的のため、例示のベクターはtcl1
アンチセンスDNAを含んで成る。その他のグルカナーゼ
遺伝子もこの開示した方法において有意なる改質を伴う
ことなく利用できることが理解されるであろう。
換のために適切なアンチセンス発現ベクターの作製を詳
細する。例示のみの目的のため、例示のベクターはtcl1
アンチセンスDNAを含んで成る。その他のグルカナーゼ
遺伝子もこの開示した方法において有意なる改質を伴う
ことなく利用できることが理解されるであろう。
A.トマトンエンド−1,4−β−クルカナーゼcDNAの調製 1. cDNAライブラリーの作製 ベクター用cDNAライブラリーを標準の方法を用いて調
製した。このライブラリーは、本明細書に参考として組
入れた、Alexanderら、Gene,31:79−89,1984の方法によ
って、成熟トマト果実ポリ−ARNA由来のベクターpARC7
のクローニングにおいて調製した。
製した。このライブラリーは、本明細書に参考として組
入れた、Alexanderら、Gene,31:79−89,1984の方法によ
って、成熟トマト果実ポリ−ARNA由来のベクターpARC7
のクローニングにおいて調製した。
2. cDNAライブラリーのスクリーニング a.コロニーの増殖 赤い成熟トマト由来のcDNAライブラリーを含むHB 101
細胞を希釈し、そして10mlのルリア培地（LB）当り約50
00のコロニーを提供する希釈液を作った。小分けした10
mlの凍結細菌懸濁物を10枚の132mmのニトロセルローフ
ィルター上で吸引濾過し、次にそのコロニー側を100μg
/mlのアンピシリンを含むLB−寒天プレート上に置い
た。コロニーが約0.5mmの直径となるまでこのプレート
を37℃でインキュベートした。
細胞を希釈し、そして10mlのルリア培地（LB）当り約50
00のコロニーを提供する希釈液を作った。小分けした10
mlの凍結細菌懸濁物を10枚の132mmのニトロセルローフ
ィルター上で吸引濾過し、次にそのコロニー側を100μg
/mlのアンピシリンを含むLB−寒天プレート上に置い
た。コロニーが約0.5mmの直径となるまでこのプレート
を37℃でインキュベートした。
b.レプリカプレーティング マスターフィルターをこのプレートから取り出し、番
号付けをし、そして黒インクで配向マークを付けた。新
たなフィルターを新鮮なLBプレート上で濡らし、そして
これを各マスターフィルターの上に載せ、そして配向マ
ークをレプリケートにコピーせしめた。このコロニー転
写の工程を第２の新たなフィルターで繰り返し、一枚の
マスターフィルター当り二枚のレプリカフィルターを作
った。コロニーが約0.5mmとなるまでレプリケートをLB
−寒天プレート上で37℃で増殖させ、その後150μg/ml
のクロラムフェニコールを有するLB寒天を含むプレート
に移した。これを37℃で12時間増殖させた。
号付けをし、そして黒インクで配向マークを付けた。新
たなフィルターを新鮮なLBプレート上で濡らし、そして
これを各マスターフィルターの上に載せ、そして配向マ
ークをレプリケートにコピーせしめた。このコロニー転
写の工程を第２の新たなフィルターで繰り返し、一枚の
マスターフィルター当り二枚のレプリカフィルターを作
った。コロニーが約0.5mmとなるまでレプリケートをLB
−寒天プレート上で37℃で増殖させ、その後150μg/ml
のクロラムフェニコールを有するLB寒天を含むプレート
に移した。これを37℃で12時間増殖させた。
c.細菌性コロニー溶解 プレートからレプリカフィルターを取り、そしてコロ
ニー側を上にして室温にて、0.5 MのNaOH/1.5 MのNaCl
で濡らしたWhatman 3MM紙のシート上に置いた。10分
後、フィルターを乾いた3MM紙上にブロットし、そして1
MのトリスpH7/1.5 MのNaClで濡らした3MM紙に２分間転
写させた。このフィルターを3xのSSCに15分浸し、乾い
た3MM紙に載せ、そして風乾し、真空のもとで２時間、8
0℃で熱した。
ニー側を上にして室温にて、0.5 MのNaOH/1.5 MのNaCl
で濡らしたWhatman 3MM紙のシート上に置いた。10分
後、フィルターを乾いた3MM紙上にブロットし、そして1
MのトリスpH7/1.5 MのNaClで濡らした3MM紙に２分間転
写させた。このフィルターを3xのSSCに15分浸し、乾い
た3MM紙に載せ、そして風乾し、真空のもとで２時間、8
0℃で熱した。
d.オリゴヌクレオチドプローブへのハイブリダイゼーシ
ョン この熱したフィルターから細菌の塊を、3xのSSC/0.1
％のSDSで62℃で24時間洗うことで除去し、その間この
洗浄液は新鮮な洗浄液で３回交換した。このフィルター
をまとめて、6xのSSC、1xのデンハーツ溶液、0.5％のSD
S、0.05％のNaPPi及び0.1mg/mlの煮沸し且つ氷冷したサ
ケ精子DNAと37℃で一夜予備ハイブリダイズさせた。こ
の20枚のフィルターを次に２グループのハイブリダイゼ
ーションのためのレプリケートに分けた。
ョン この熱したフィルターから細菌の塊を、3xのSSC/0.1
％のSDSで62℃で24時間洗うことで除去し、その間この
洗浄液は新鮮な洗浄液で３回交換した。このフィルター
をまとめて、6xのSSC、1xのデンハーツ溶液、0.5％のSD
S、0.05％のNaPPi及び0.1mg/mlの煮沸し且つ氷冷したサ
ケ精子DNAと37℃で一夜予備ハイブリダイズさせた。こ
の20枚のフィルターを次に２グループのハイブリダイゼ
ーションのためのレプリケートに分けた。
２種類の26塩基オリゴヌクレオチドプローブをDNA合
成装置にて合成した。プローブ配列は、グルカナーゼの
二つの領域に相当し、これはそら豆分離帯グルカナーゼ
及びアボカド果実グルカナーゼにおけるアミノ酸レベル
にて完全に保存されていた。オリゴヌクレオチドを10mM
のトリスEDTA（TE）pH8に溶解し、そしてTE−飽和ブタ
ノールで抽出した；これを次に酢酸アンモニウム中で0.
3 Mに調整し、そして４容量のエタノールによって、−8
0℃で沈澱させた。DNAを遠心により集め、そしてTE pH
8中で1mg/mlにした。
成装置にて合成した。プローブ配列は、グルカナーゼの
二つの領域に相当し、これはそら豆分離帯グルカナーゼ
及びアボカド果実グルカナーゼにおけるアミノ酸レベル
にて完全に保存されていた。オリゴヌクレオチドを10mM
のトリスEDTA（TE）pH8に溶解し、そしてTE−飽和ブタ
ノールで抽出した；これを次に酢酸アンモニウム中で0.
3 Mに調整し、そして４容量のエタノールによって、−8
0℃で沈澱させた。DNAを遠心により集め、そしてTE pH
8中で1mg/mlにした。
１μｇのそれぞれのオリゴヌクレオチドをT4DNAポリ
メラーゼラベリングシステム（Bethesda Research Lab
s）によって、その製造者によって供給されたプロトコ
ールに従い、32P−ATPで末端ラベルした。各プローブの
比活性は５×107cpm/μｇを超えていた。
メラーゼラベリングシステム（Bethesda Research Lab
s）によって、その製造者によって供給されたプロトコ
ールに従い、32P−ATPで末端ラベルした。各プローブの
比活性は５×107cpm/μｇを超えていた。
レプリカフィルターのそれぞれのセットを、15mlのハ
イブリダイゼーション緩衝液及び煮沸且つ氷冷せしめた
放射性標識したプローブの一方を含むハイブリダイゼー
ションバッグの中で42℃にて一夜インキュベートした。
ハイブリダイゼーション媒体は6xのSSC、1xのデンハー
ツ溶液、0.05％のNaPPi及び0.1mg/mlの煮沸且つ氷冷し
たサケ精子DNAである。
イブリダイゼーション緩衝液及び煮沸且つ氷冷せしめた
放射性標識したプローブの一方を含むハイブリダイゼー
ションバッグの中で42℃にて一夜インキュベートした。
ハイブリダイゼーション媒体は6xのSSC、1xのデンハー
ツ溶液、0.05％のNaPPi及び0.1mg/mlの煮沸且つ氷冷し
たサケ精子DNAである。
これらのフィルターを42℃で、6xのSSC、0.05％のNaP
Pi中で数時間、緩衝液を数回変えながら洗った。これら
を次にKodak X−Ｏ−Mat ARフィルムに、−80℃で24時
間、増強スクリーンを用いながら暴露せしめた。このフ
ィルムを現像し、そしてグルカナーゼプローブ配列を含
むクローンを、対応のマスタープレート上の配向マーク
とこのフィルム上のそれとを比較することで同定した。
Pi中で数時間、緩衝液を数回変えながら洗った。これら
を次にKodak X−Ｏ−Mat ARフィルムに、−80℃で24時
間、増強スクリーンを用いながら暴露せしめた。このフ
ィルムを現像し、そしてグルカナーゼプローブ配列を含
むクローンを、対応のマスタープレート上の配向マーク
とこのフィルム上のそれとを比較することで同定した。
e.推測グルカナーゼクローンの第２スクリーニング グルカナーゼオリゴヌクレオチドプローブによって同
定したコロニーを無菌のつまようじによって拾い、1ml
のLBに分散し、そして37℃で2.5時間振騰させながらイ
ンキュベートした。この懸濁物を次に500,000倍に希釈
し、そして8mmのニトロセルロースフィルターを介して
小分けした5mlの氷冷LB中で吸引濾過した。これらを37
℃で、100μg/mlのアンピシリンを含むLB寒天上で８時
間増殖させ、次いで150μg/mlのクロラムフェニコール
を含むLB寒天プレートに移した。次にこれらを37℃で12
時間インキュベートした。このフィルターを上記の段階
３及び４の通りに、放射性標識したオリゴヌクレオチド
プローブによって処理且つスクリーンした。この第２ス
クリーンにおいて同定した28種のグルカナーゼクローン
それぞれの単一コロニーを3mlのLBアンピシリンに移
し、そして237℃で一夜増殖させた。交差ハイブリダイ
ゼーション実験は、このクローンが３つの異なるクラス
tcl1,tcl2及びtcll3へまとめることができることを示し
た。
定したコロニーを無菌のつまようじによって拾い、1ml
のLBに分散し、そして37℃で2.5時間振騰させながらイ
ンキュベートした。この懸濁物を次に500,000倍に希釈
し、そして8mmのニトロセルロースフィルターを介して
小分けした5mlの氷冷LB中で吸引濾過した。これらを37
℃で、100μg/mlのアンピシリンを含むLB寒天上で８時
間増殖させ、次いで150μg/mlのクロラムフェニコール
を含むLB寒天プレートに移した。次にこれらを37℃で12
時間インキュベートした。このフィルターを上記の段階
３及び４の通りに、放射性標識したオリゴヌクレオチド
プローブによって処理且つスクリーンした。この第２ス
クリーンにおいて同定した28種のグルカナーゼクローン
それぞれの単一コロニーを3mlのLBアンピシリンに移
し、そして237℃で一夜増殖させた。交差ハイブリダイ
ゼーション実験は、このクローンが３つの異なるクラス
tcl1,tcl2及びtcll3へまとめることができることを示し
た。
f.グルカナーゼクローンのサザン分析 ミニプレプDNAをKraftら、Biotechniques 6（６）:54
4−546（本明細書に参考として組入れる）の方法によっ
て細菌培養物から単離した。次にこのDNAをSma I制限酵
素によって2.5時間、標準の条件のもとで消化し、それ
らの個々のpArcベクターからクローン化グルカナーゼイ
ンサートを遊離させた。消化生成物を、アボカドグルカ
ナーゼcDNA及びトマトポリガラクツロナーゼcDNAクロー
ンをそれぞれ陽性及び陰性コントロールとして用いて、
1.2％のアガロースゲルでサイズ分画した。250mlのHC
l、それに続く0.5 MのNaOH/1.5 MのNaCl及び最後に0.5
Mのトリス/3MのNaClでのインキュベーションの後、この
ゲルをニトロセルロースにブロットし、そして前記した
通りに末端ラベルされた各オリゴヌクレオチドプローブ
とプローブさせた。最も大きいグルカナーゼインサート
は1.8キロベースと見積もられ、既に特徴付けされてい
る1.9kBのアボカドグルカナーゼcDNAと類似していた。p
TCL1と命名したこのクローンをシーケンシングのために
選んだ。
4−546（本明細書に参考として組入れる）の方法によっ
て細菌培養物から単離した。次にこのDNAをSma I制限酵
素によって2.5時間、標準の条件のもとで消化し、それ
らの個々のpArcベクターからクローン化グルカナーゼイ
ンサートを遊離させた。消化生成物を、アボカドグルカ
ナーゼcDNA及びトマトポリガラクツロナーゼcDNAクロー
ンをそれぞれ陽性及び陰性コントロールとして用いて、
1.2％のアガロースゲルでサイズ分画した。250mlのHC
l、それに続く0.5 MのNaOH/1.5 MのNaCl及び最後に0.5
Mのトリス/3MのNaClでのインキュベーションの後、この
ゲルをニトロセルロースにブロットし、そして前記した
通りに末端ラベルされた各オリゴヌクレオチドプローブ
とプローブさせた。最も大きいグルカナーゼインサート
は1.8キロベースと見積もられ、既に特徴付けされてい
る1.9kBのアボカドグルカナーゼcDNAと類似していた。p
TCL1と命名したこのクローンをシーケンシングのために
選んだ。
3. tcl1のシーケンシング a.サブクローニング 前記のコロニーから調製したミニプレプDNAのSma I消
化は、pArcベクターから1.8kb（見積サイズ）のグルカ
ナーゼクローンを遊離させた。消化生成物を0.4容量の
酢酸アンモニウム及び２容量のエタノールで沈殿させ、
そして1xのDNAサンプル緩衝液に再懸濁させた。この生
成物を低融点アガロースゲル上に載せ、インサートを電
気泳動によって80Vでベクターから分離させた。このイ
ンサートをゲルから切り出し、そしてゲルスライスとし
て−20℃で必要となるまで保存した。DNA濃度はインサ
ートと一定の標準品間の臭化エチジウム染色の相対強度
から推定した。
化は、pArcベクターから1.8kb（見積サイズ）のグルカ
ナーゼクローンを遊離させた。消化生成物を0.4容量の
酢酸アンモニウム及び２容量のエタノールで沈殿させ、
そして1xのDNAサンプル緩衝液に再懸濁させた。この生
成物を低融点アガロースゲル上に載せ、インサートを電
気泳動によって80Vでベクターから分離させた。このイ
ンサートをゲルから切り出し、そしてゲルスライスとし
て−20℃で必要となるまで保存した。DNA濃度はインサ
ートと一定の標準品間の臭化エチジウム染色の相対強度
から推定した。
ブルースクリプトベクター（SK＋）（stratagene In
c.,La Jolla,CA）を標準条件のもとで30℃でSma I消化
によって線状にした。2.5時間後、消化したベクターを
フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（2
5:24:1）で１回、そしてクロロホルム−イソアミルアル
コール（24:1）で１回抽出し、そして0.4容量の酢酸ア
ンモニウム及び2.5容量のエタノールで沈殿させた。ペ
レット化したDNAを500μｌの500mMのトリス、0.1mMのED
TA、pH8に入れ、そしてブラント末端化DNAフラグメント
のため、Boehringer Mannheimの仔牛小腸アルカリ性ホ
スファターゼによりその製造者の仕様書に従って脱リン
酸化せしめた。脱リン酸したベクターを前記した酢酸ア
ンモニウム/EtOH沈殿によって集め、そして水で100μg/
mlにした。
c.,La Jolla,CA）を標準条件のもとで30℃でSma I消化
によって線状にした。2.5時間後、消化したベクターを
フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（2
5:24:1）で１回、そしてクロロホルム−イソアミルアル
コール（24:1）で１回抽出し、そして0.4容量の酢酸ア
ンモニウム及び2.5容量のエタノールで沈殿させた。ペ
レット化したDNAを500μｌの500mMのトリス、0.1mMのED
TA、pH8に入れ、そしてブラント末端化DNAフラグメント
のため、Boehringer Mannheimの仔牛小腸アルカリ性ホ
スファターゼによりその製造者の仕様書に従って脱リン
酸化せしめた。脱リン酸したベクターを前記した酢酸ア
ンモニウム/EtOH沈殿によって集め、そして水で100μg/
mlにした。
脱リン酸化ベクターを15℃で12時間、低融点アガロー
スゲルからの溶融グルカナーゼインサートにリゲートさ
せた。リゲート条件は各45μｌのリゲーションに関して
以下の通りである：全DNA濃度に１μｇ、インサート：
ベクター＝2.1（モルベースに基づく）、T4DNAリガーゼ
＝100ユニットml、最終PEG濃度＝５％。
スゲルからの溶融グルカナーゼインサートにリゲートさ
せた。リゲート条件は各45μｌのリゲーションに関して
以下の通りである：全DNA濃度に１μｇ、インサート：
ベクター＝2.1（モルベースに基づく）、T4DNAリガーゼ
＝100ユニットml、最終PEG濃度＝５％。
リゲーション混合物をTE 8.0で100μｌにし、そして2
00μｌの新たに融解したXL1ブルーコンピテント細胞に
加えた。氷上で30分後、この細胞を５分間42℃で熱ショ
ックにかけ、そして37℃に予め温めた2XL培地4mlに加え
た。この細胞をオービタルシェーカー上で100rpmにて10
0分間、37℃で振騰し、次いで氷に移した。適当に小分
けしたこの細胞を次に100μg/mlのアンピシリン及び50
μg/mlのテトラサイクリンを含むLB寒天プレート上にま
いた。このプレートは100μｌの〔50μｌの100mMのIPT
G、20μｌの20mg/mlのＸ−gal、30μｌのLB〕を予めま
いてある。
00μｌの新たに融解したXL1ブルーコンピテント細胞に
加えた。氷上で30分後、この細胞を５分間42℃で熱ショ
ックにかけ、そして37℃に予め温めた2XL培地4mlに加え
た。この細胞をオービタルシェーカー上で100rpmにて10
0分間、37℃で振騰し、次いで氷に移した。適当に小分
けしたこの細胞を次に100μg/mlのアンピシリン及び50
μg/mlのテトラサイクリンを含むLB寒天プレート上にま
いた。このプレートは100μｌの〔50μｌの100mMのIPT
G、20μｌの20mg/mlのＸ−gal、30μｌのLB〕を予めま
いてある。
このプレートを次に37℃で一夜インキュベートし、こ
れによって形質転換コロニー（白色）は非形質転換コロ
ニー（青色）と区別できるようになった。ミニプレプDN
Aを前記の通りにこの形質転換体から単離し、そしてSma
Iで消化してインサートを遊離させた。約1.8kbの１種
類のグルカナーゼ形質転換体が1.5％のアガロースゲル
での消化生成物の電気泳動分離によって同定された。二
本鎖ミニプレプDNAをシーケンシングのために前記の通
りに調製した。
れによって形質転換コロニー（白色）は非形質転換コロ
ニー（青色）と区別できるようになった。ミニプレプDN
Aを前記の通りにこの形質転換体から単離し、そしてSma
Iで消化してインサートを遊離させた。約1.8kbの１種
類のグルカナーゼ形質転換体が1.5％のアガロースゲル
での消化生成物の電気泳動分離によって同定された。二
本鎖ミニプレプDNAをシーケンシングのために前記の通
りに調製した。
b.シーケンシング 第１鎖のシーケンシングにおいて利用するための種々
の長さの二本鎖DNA鋳型を、製造者によって供給された
エラーゼ−Ａ−ベースキット（Erase−Ａ−Base kit）
（Promega）プロトコールに詳細の通りに、グルカナー
ゼミニプレプDNAのエキソヌクレアーゼ消化によって作
り上げた。シーケンシングは製造者によって供給された
シーケナーゼキット（United States Biochemical C
o.）プロトコールにおいて完全に説明されているジデオ
キシ法（Sangerら、Proc.Nat.Acad.Sci.USA 74:5463−5
467）によって行った。リバースM13プライマーはPharma
ciaより購入した。
の長さの二本鎖DNA鋳型を、製造者によって供給された
エラーゼ−Ａ−ベースキット（Erase−Ａ−Base kit）
（Promega）プロトコールに詳細の通りに、グルカナー
ゼミニプレプDNAのエキソヌクレアーゼ消化によって作
り上げた。シーケンシングは製造者によって供給された
シーケナーゼキット（United States Biochemical C
o.）プロトコールにおいて完全に説明されているジデオ
キシ法（Sangerら、Proc.Nat.Acad.Sci.USA 74:5463−5
467）によって行った。リバースM13プライマーはPharma
ciaより購入した。
作製したシーケンスデーターはMicrogenieシーケンス
分析コンピュータープログラム（Beckman Instruments,
Inc.）を用いて入力及び分析し、その鎖20種以上の小さ
な配列の重複より成った。
分析コンピュータープログラム（Beckman Instruments,
Inc.）を用いて入力及び分析し、その鎖20種以上の小さ
な配列の重複より成った。
B.ベクターの作製 ４種の異なるベクターを作製した。１つのベクター、
E8antiCLはトマトE8遺伝子由来のプロモーター及びtcl1
アンチセンスDNAを含んでいた。このプロモーターはト
マトの果実の成熟中において誘発性である。第２のベク
ター、CaMVantiCLはカリフラワーモザイクウイルス35S
プロモーター及びtcl1アンチセンスDNAを含む。このプ
ロモーターは構成的である。他の２種のベクターは同様
の手法で作製したが、ただしポリガラクツロナーゼアン
チセンスDNA及び適切なプロモーターを付加した。この
後者の２種のベクターの構成を図１に図示する。
E8antiCLはトマトE8遺伝子由来のプロモーター及びtcl1
アンチセンスDNAを含んでいた。このプロモーターはト
マトの果実の成熟中において誘発性である。第２のベク
ター、CaMVantiCLはカリフラワーモザイクウイルス35S
プロモーター及びtcl1アンチセンスDNAを含む。このプ
ロモーターは構成的である。他の２種のベクターは同様
の手法で作製したが、ただしポリガラクツロナーゼアン
チセンスDNA及び適切なプロモーターを付加した。この
後者の２種のベクターの構成を図１に図示する。
1. E8antiCL 2.0kbのE8プロモーターフラグメントを、pE8mutRN2.0
をNcolによって切断することによって単離した。このpE
8mutRN2.0の調製は、本明細書に参考として組入れた、G
iovaninnoniらのThe Plant Cell,1:53−63,1989に詳細
されている。Ncol制限部位の５′突き出しをDNAポリメ
ラーゼの大きなフラグメント（クレノウフラグメント）
によってブラント末端とし、そしてEcoR1制限エンドヌ
クレアーゼによって消化した。得られる2.0kbのEcoR1/
補完Ncolフラグメントを、EcoR1及びSmal制限エンドヌ
クレアーゼによって切断したpUC118にリゲートさせた。
ここで得られる構造体、pE8mutRN2.0（＋）は、本来のN
col制限部位並びにこのNcol制限部位の下流にBamH1,Xba
l,Sal1,Pst1,Sph1及びHind III部位を有する。
をNcolによって切断することによって単離した。このpE
8mutRN2.0の調製は、本明細書に参考として組入れた、G
iovaninnoniらのThe Plant Cell,1:53−63,1989に詳細
されている。Ncol制限部位の５′突き出しをDNAポリメ
ラーゼの大きなフラグメント（クレノウフラグメント）
によってブラント末端とし、そしてEcoR1制限エンドヌ
クレアーゼによって消化した。得られる2.0kbのEcoR1/
補完Ncolフラグメントを、EcoR1及びSmal制限エンドヌ
クレアーゼによって切断したpUC118にリゲートさせた。
ここで得られる構造体、pE8mutRN2.0（＋）は、本来のN
col制限部位並びにこのNcol制限部位の下流にBamH1,Xba
l,Sal1,Pst1,Sph1及びHind III部位を有する。
ブルースクリプトM13f（SK＋）ベクター（Stratagene
Inc., la Jolla,CA）のSma I部位にクローンした1.8kbのエン
ド−1,4−β−グルカナーゼcDNAを、BamH1及びKpn1によ
る消化によって遊離させ、その後アガロースゲルで精製
した。このフラグメントを次にBamH1/Kpn1消化pUC118に
リゲートし、pUCCL1.8を作った。pUCC1.8の1.8kbのBamH
1/Sst1cDANインサートを制限エンドヌクレアーゼ消化に
よって遊離させ、そしてアガロースゲル電気泳動によっ
て精製した。
Inc., la Jolla,CA）のSma I部位にクローンした1.8kbのエン
ド−1,4−β−グルカナーゼcDNAを、BamH1及びKpn1によ
る消化によって遊離させ、その後アガロースゲルで精製
した。このフラグメントを次にBamH1/Kpn1消化pUC118に
リゲートし、pUCCL1.8を作った。pUCC1.8の1.8kbのBamH
1/Sst1cDANインサートを制限エンドヌクレアーゼ消化に
よって遊離させ、そしてアガロースゲル電気泳動によっ
て精製した。
ここで得られた1.8kbのBamH1/Sst1フラグメントを、p
B1121（Clonetech Inc.,Palo Alto,CA）より精製した0.
25kbのSst1/EcoR1アグロバクテリアノパリンシンターゼ
遺伝子転写ターミネーターフラグメント（植物において
遺伝子転写の直接的終結が可能）との３分子リゲーショ
ンに用い、次いでBamH1及びEcoR1によって切断したpUC1
18にリゲートさせた。ここで得られるpUCantiCL−ter構
造体は、グルカナーゼcDNAがその５′末端にてSst1部位
リゲーションを介して融合したノパリンシンターゼ遺伝
子転写終結フラグメントを含んでいる。この2.05kbのan
tiCL−terフラグメントを、pLCantiCL−terよりBamH1に
よる消化、その後のEcoR1による部分消化によって単離
した。次にこの2.05kbの生成物をアガロースゲルで精製
した。
B1121（Clonetech Inc.,Palo Alto,CA）より精製した0.
25kbのSst1/EcoR1アグロバクテリアノパリンシンターゼ
遺伝子転写ターミネーターフラグメント（植物において
遺伝子転写の直接的終結が可能）との３分子リゲーショ
ンに用い、次いでBamH1及びEcoR1によって切断したpUC1
18にリゲートさせた。ここで得られるpUCantiCL−ter構
造体は、グルカナーゼcDNAがその５′末端にてSst1部位
リゲーションを介して融合したノパリンシンターゼ遺伝
子転写終結フラグメントを含んでいる。この2.05kbのan
tiCL−terフラグメントを、pLCantiCL−terよりBamH1に
よる消化、その後のEcoR1による部分消化によって単離
した。次にこの2.05kbの生成物をアガロースゲルで精製
した。
ここで得られる2.05kbのEcoR1/BamH1フラグメントをp
E8mutRN2.0から単離した2.0kbのEcoR1/BamH1フラグメン
ト及びEcoR1によって切断したpUC118と３分子リゲーシ
ョンにおいて利用した。得られる構造体pE8antiCLは、E
8プロモーターがグルカナーゼcDNAクローンの３′末端
に融合し、その５′末端がノパリンシンターゼ遺伝子の
転写終結フラグメントに融合しているものを含む。この
cDNAと転写ターミネーター配列との間に位置する内在Ec
oR Iを部位をEcoR1制限エンドヌクレアーゼによる部位
消化によって除去し、次いでこのEcoR1 5′突き出しを
クレノウ酵素によって補完し、次いでこの補完したEcoR
1制限エンドヌクレアーゼ部位をリゲートせしめた。こ
の内在EcoR1部位の欠失は、得られる構造体、pE8antiCL
−R1の制限エンドヌクレアーゼ地図化によって確認し
た。pE8antiCL−R1の4.0kbのインサートをEcoR1制限エ
ンドヌクレアーゼによって遊離し、アガロースゲル電気
泳動によって精製し、そして下記の３章に詳細のアグロ
バクテリアＴ−DNA共組込み（conintegrative）シャト
ルベクターpMLJ1のEcoR1部位にリゲートせしめた。得ら
れた構造体をpMLJ1:E8antiCLと称した。
E8mutRN2.0から単離した2.0kbのEcoR1/BamH1フラグメン
ト及びEcoR1によって切断したpUC118と３分子リゲーシ
ョンにおいて利用した。得られる構造体pE8antiCLは、E
8プロモーターがグルカナーゼcDNAクローンの３′末端
に融合し、その５′末端がノパリンシンターゼ遺伝子の
転写終結フラグメントに融合しているものを含む。この
cDNAと転写ターミネーター配列との間に位置する内在Ec
oR Iを部位をEcoR1制限エンドヌクレアーゼによる部位
消化によって除去し、次いでこのEcoR1 5′突き出しを
クレノウ酵素によって補完し、次いでこの補完したEcoR
1制限エンドヌクレアーゼ部位をリゲートせしめた。こ
の内在EcoR1部位の欠失は、得られる構造体、pE8antiCL
−R1の制限エンドヌクレアーゼ地図化によって確認し
た。pE8antiCL−R1の4.0kbのインサートをEcoR1制限エ
ンドヌクレアーゼによって遊離し、アガロースゲル電気
泳動によって精製し、そして下記の３章に詳細のアグロ
バクテリアＴ−DNA共組込み（conintegrative）シャト
ルベクターpMLJ1のEcoR1部位にリゲートせしめた。得ら
れた構造体をpMLJ1:E8antiCLと称した。
2.CaMVantiCL カリフラワーモザイクウイルス35S転写ユニットの調
節配列をpB I121から、Sph I及びBamH1による消化、そ
の後のアガロースゲル精製によって単離した。得られた
0.8kbのSph I/BamH IフラグメントをpUCantiCL−terの
2.05kbのBamH I/EcoR Iフラグメント（前記）とSph1及
びEcoR1によって消化したpUC118との３分子リゲーショ
ンに利用した。ここで得られる構造体をEcoR1で部分消
化し、そしてクレノウ酵素との補完反応、その後のリゲ
ーションにかけ、このcDNAの５′末端と植物転写終結配
列の間に位置する内在EcoR1制限エンドヌクレアーゼ部
位を除去した。このcDNAと転写終結配列の間のEcoR1部
位が除かれたことを確認するために制限エンドヌクレア
ーゼ地図化を採用した。得られる構造体をpCaMVantiCL
−Ｓと称した。pCaMVantiCL−ＳをSph1で消化した。Sph
1消化により得られる３′突き出しをT4DNAポリメラーゼ
を用いて補完し、EcoR1リンカー（BRL,Bethesda,Maryla
nd）にリゲートさせた。ここで得られた構造体をpCaCVa
ntiCLと称した。pCaMVantiCLの2.85kbのインサートをEc
oR1制限エンドヌクレアーゼによる消化、その後のアガ
ロースゲル精製によって単離し、そしてpMLJ1のEcoR1部
位にリゲートさせてpMLJ1:CaMVantiCLを作り上げた。
節配列をpB I121から、Sph I及びBamH1による消化、そ
の後のアガロースゲル精製によって単離した。得られた
0.8kbのSph I/BamH IフラグメントをpUCantiCL−terの
2.05kbのBamH I/EcoR Iフラグメント（前記）とSph1及
びEcoR1によって消化したpUC118との３分子リゲーショ
ンに利用した。ここで得られる構造体をEcoR1で部分消
化し、そしてクレノウ酵素との補完反応、その後のリゲ
ーションにかけ、このcDNAの５′末端と植物転写終結配
列の間に位置する内在EcoR1制限エンドヌクレアーゼ部
位を除去した。このcDNAと転写終結配列の間のEcoR1部
位が除かれたことを確認するために制限エンドヌクレア
ーゼ地図化を採用した。得られる構造体をpCaMVantiCL
−Ｓと称した。pCaMVantiCL−ＳをSph1で消化した。Sph
1消化により得られる３′突き出しをT4DNAポリメラーゼ
を用いて補完し、EcoR1リンカー（BRL,Bethesda,Maryla
nd）にリゲートさせた。ここで得られた構造体をpCaCVa
ntiCLと称した。pCaMVantiCLの2.85kbのインサートをEc
oR1制限エンドヌクレアーゼによる消化、その後のアガ
ロースゲル精製によって単離し、そしてpMLJ1のEcoR1部
位にリゲートさせてpMLJ1:CaMVantiCLを作り上げた。
3.E8antiPG/CL ブルースクリプトM13＋（SK＋）ベクターのSma I部位
にクローンした、pBSPG1.9（Dellapennaら、Plant Phys
iology 90:1372−1377,1989、本明細書に参考として組
入れた）の1.7kbの全長トマト果実ポリガラクツロナー
ゼcDNAインサートをSal1及びSst1制限エンドヌクレアー
ゼによる消化によって遊離させ、次いでアガロースゲル
精製にかけた。得られる1.7kbのフラグメントを0.25kb
のSst1/EcoR1アグロバクテリアノパリンシンターゼ遺伝
子転写終結配列（前記）及びSal1/EcoR1消化pUC118との
３分子リゲーションにおいて利用した。ここで得られる
構造体をpUCantiPG−terと称し、そしてこれはポリガラ
クツロナーゼcDNAの５′末端がノパリンシンターゼ転写
終結配列とそのSst1部位にて融合しているものより成
る。
にクローンした、pBSPG1.9（Dellapennaら、Plant Phys
iology 90:1372−1377,1989、本明細書に参考として組
入れた）の1.7kbの全長トマト果実ポリガラクツロナー
ゼcDNAインサートをSal1及びSst1制限エンドヌクレアー
ゼによる消化によって遊離させ、次いでアガロースゲル
精製にかけた。得られる1.7kbのフラグメントを0.25kb
のSst1/EcoR1アグロバクテリアノパリンシンターゼ遺伝
子転写終結配列（前記）及びSal1/EcoR1消化pUC118との
３分子リゲーションにおいて利用した。ここで得られる
構造体をpUCantiPG−terと称し、そしてこれはポリガラ
クツロナーゼcDNAの５′末端がノパリンシンターゼ転写
終結配列とそのSst1部位にて融合しているものより成
る。
pUCantiPG−terの1.95kbのインサートをSal1及びEcoR
1制限エンドヌクレアーゼによる消化によって遊離し、
次いでアガロース精製にかけた。得られた1.95kbのSal1
/EcoR1フラグメントを、pE8mutRN2.0（＋）（前記）由
来の2.0kbのEcoR1/Sal1 E8プロモーターフラグメント及
びpUCE8antiPGとの３分子リゲーションに用いた。
1制限エンドヌクレアーゼによる消化によって遊離し、
次いでアガロース精製にかけた。得られた1.95kbのSal1
/EcoR1フラグメントを、pE8mutRN2.0（＋）（前記）由
来の2.0kbのEcoR1/Sal1 E8プロモーターフラグメント及
びpUCE8antiPGとの３分子リゲーションに用いた。
pUCEantiPGの3.95kbのインサートをEcoR1制限エンド
ヌクレアーゼによる消化の後のアガロースゲル精製によ
って単離し、次いでこの3.95kbのアンチセンス遺伝子の
両側に相接する５′EcoR1突き出しのDNAポリメラーゼ
（クレノウ）補完を行った。この共組込み植物形質転換
ベクター、pMLJ1の固有Sal1制限部位をSal1によって切
断し、そしてクレノウ酵素で補完した。このブラント末
端化した3.95kbのE8antiPGフラグメントをpMLJ1のブラ
ント末端化Sal1部位にリゲートし、pMLJ1:E8antiPGを作
った。pMLJ1:E8natiPGをこのpMLJ1配列の固有EcoR1部位
において切断した。pE8antiCL−R1（前記）の4.05kbの
インサートをEcoR1によって遊離させ、そしてアガロー
スゲル電気泳動によって精製した。ここで得られる4.05
kのE8antiCL−R1フラグメントをこのpMLJ1:E8antiPGのE
coR1部位にリゲートさせ、pMLJ1:E8antiPG/CLを作った
（図２参照）。
ヌクレアーゼによる消化の後のアガロースゲル精製によ
って単離し、次いでこの3.95kbのアンチセンス遺伝子の
両側に相接する５′EcoR1突き出しのDNAポリメラーゼ
（クレノウ）補完を行った。この共組込み植物形質転換
ベクター、pMLJ1の固有Sal1制限部位をSal1によって切
断し、そしてクレノウ酵素で補完した。このブラント末
端化した3.95kbのE8antiPGフラグメントをpMLJ1のブラ
ント末端化Sal1部位にリゲートし、pMLJ1:E8antiPGを作
った。pMLJ1:E8natiPGをこのpMLJ1配列の固有EcoR1部位
において切断した。pE8antiCL−R1（前記）の4.05kbの
インサートをEcoR1によって遊離させ、そしてアガロー
スゲル電気泳動によって精製した。ここで得られる4.05
kのE8antiCL−R1フラグメントをこのpMLJ1:E8antiPGのE
coR1部位にリゲートさせ、pMLJ1:E8antiPG/CLを作った
（図２参照）。
4.CaMVantiPG/CL カリフラワーモザイクウイルス35S転写ユニットの調
節配列を前記の通りにpB I121から単離した。pUCantiPG
−ter（前記）の1.95kbのインサートをEcoR1による消化
及びBamH1による部分消化、その後の得られる1.95kbの
フラグメントのアガロースゲル精製によって単離した。
CaMV35Sプロモーター由来の0.8kbのSph1/BamH1フラグメ
ントを、pLCantiPG−terの1.95kbのBamH1/EcoR1インサ
ートと、Sph1及びEcoR1制限エンドヌクレアーゼによっ
て消化したpUC118との３分子リゲーションにおいて利用
し、pUCCaMVantiPG−Ｓと称する構造体を作った。pUCCa
MVantiPG−ＳをSph Iで消化した。Sph i消化に由来する
３′突き出しをT4DNAポリメラーゼを用いて補完し、そ
してEcoR1リンカー（BRL,Bethesda,Maryland）にリゲー
トさせた。得られる構造体をpUCCaMVantiPGと称し、そ
してこれはpUC118のEcoR1の部位にクローンされた2.75k
bのCaMVantiPG遺伝子を含む。
節配列を前記の通りにpB I121から単離した。pUCantiPG
−ter（前記）の1.95kbのインサートをEcoR1による消化
及びBamH1による部分消化、その後の得られる1.95kbの
フラグメントのアガロースゲル精製によって単離した。
CaMV35Sプロモーター由来の0.8kbのSph1/BamH1フラグメ
ントを、pLCantiPG−terの1.95kbのBamH1/EcoR1インサ
ートと、Sph1及びEcoR1制限エンドヌクレアーゼによっ
て消化したpUC118との３分子リゲーションにおいて利用
し、pUCCaMVantiPG−Ｓと称する構造体を作った。pUCCa
MVantiPG−ＳをSph Iで消化した。Sph i消化に由来する
３′突き出しをT4DNAポリメラーゼを用いて補完し、そ
してEcoR1リンカー（BRL,Bethesda,Maryland）にリゲー
トさせた。得られる構造体をpUCCaMVantiPGと称し、そ
してこれはpUC118のEcoR1の部位にクローンされた2.75k
bのCaMVantiPG遺伝子を含む。
pCaMVantiCLの2.85kbのインサートを、EcoR1制限エン
ドヌクレアーゼによる消化及びクレノウ酵素による５′
EcoR1突き出しの補完の後にアガロースゲル電気泳動に
よって単離した。pMLJ1の固有Sal1部位をSal1によって
切断し、そしてクレノウ酵素によって補完した。2.85kb
のブラント末端CaMVantiCLフラグメントをpMLJ1:CaMVan
tiCLのEcoR1部位にリゲートし、pMLJ1:CaMVantiPG/CLを
作った（図２参照）。
ドヌクレアーゼによる消化及びクレノウ酵素による５′
EcoR1突き出しの補完の後にアガロースゲル電気泳動に
よって単離した。pMLJ1の固有Sal1部位をSal1によって
切断し、そしてクレノウ酵素によって補完した。2.85kb
のブラント末端CaMVantiCLフラグメントをpMLJ1:CaMVan
tiCLのEcoR1部位にリゲートし、pMLJ1:CaMVantiPG/CLを
作った（図２参照）。
5.アンチセンス遺伝子構造体の共組込み 三親株交配をVan Hauteら、EMBO J.2:411−417,1983
（本明細書に参考として組入れる）に詳細の当業界によ
く知られる方法に従って、行った。三親株交配に用いた
シャトルベクターは本発明にとっては本質的でない。こ
こで用いた特定なるシャトルベクターpMLJ1は、DeBloch
らEMBO J.3:1681−1689,1984に詳細のものに由来する。
（本明細書に参考として組入れる）に詳細の当業界によ
く知られる方法に従って、行った。三親株交配に用いた
シャトルベクターは本発明にとっては本質的でない。こ
こで用いた特定なるシャトルベクターpMLJ1は、DeBloch
らEMBO J.3:1681−1689,1984に詳細のものに由来する。
pGV3850,pGV3850;E8antiCL及びpGV3850:CaMVantiCLへ
のアンチセンス遺伝子構造体の共組込みをもたらす、 pMLJ1:E8antiCL,pMLJ1:CaMVantiCL,pMLJ1:E8antiPG/C
L又はpMLJ1:CamVantiPG/CLを有するE.コリ（株JM109）
と、共組込み植物形質転換ベクターのpGV3850（このベ
クターはZambryskiらのEMBO J.2;2143,1983（本明細書
に参考として組入れた）に詳しく記載されている）を含
むアグロバクテリア トウメファシエン、及びヘルパー
E.コリ株pGJ23との三親株交配を、アンチセンスエンド
−1,4−β−グルカナーゼ配列のトマトゲノムへの挿入
のために利用した。
のアンチセンス遺伝子構造体の共組込みをもたらす、 pMLJ1:E8antiCL,pMLJ1:CaMVantiCL,pMLJ1:E8antiPG/C
L又はpMLJ1:CamVantiPG/CLを有するE.コリ（株JM109）
と、共組込み植物形質転換ベクターのpGV3850（このベ
クターはZambryskiらのEMBO J.2;2143,1983（本明細書
に参考として組入れた）に詳しく記載されている）を含
むアグロバクテリア トウメファシエン、及びヘルパー
E.コリ株pGJ23との三親株交配を、アンチセンスエンド
−1,4−β−グルカナーゼ配列のトマトゲノムへの挿入
のために利用した。
C.アンチセンスエンド−1,4−β−クルカナーゼ構造体
によるトマトの形質転換 方法の概要 簡単に述べると、無菌の子葉断片を、Ｔ−DNA内に遺
伝子導入植物においてカナマイシン耐性を授けることの
できるネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子
（NTP11）を含むTiプラスミドを含んでいるアグロバク
テリアで感染する。この共組込みアグロバクテリア ト
ウメファシエンTiベクター、pGV380であって、pMLJ1:E8
antiCL,pMLJ1:CaMVantiCL,pMLJ1:E8antiPG/CL又はpMLJ
1:CaMVantiiPG/CLが個々にそれに組込まれているもの
を、個々のトマトゲノムの中に２種のアンチセンス遺伝
子構造体を移すために用いた。トマト（リコパ−シコン
エスクレンタムCVアイルサクレイグ〔Lycopersicon e
sculentum cv Ailsa Craig）子葉断片のこの細菌との培
養をタバコフィーダープレート上で48時間行った。苗条
の再生は再生培地において誘発せしめた。この段階よ
り、アグロバクテリアの増殖を阻止するたの（セフォタ
キシム）及び形質転換植物細胞を選別するため（カナマ
イシン）抗生物質を用いた。最後に、苗条を発根培地に
移し、その後、土壌に植え、そして温室の中で成育させ
た。
によるトマトの形質転換 方法の概要 簡単に述べると、無菌の子葉断片を、Ｔ−DNA内に遺
伝子導入植物においてカナマイシン耐性を授けることの
できるネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子
（NTP11）を含むTiプラスミドを含んでいるアグロバク
テリアで感染する。この共組込みアグロバクテリア ト
ウメファシエンTiベクター、pGV380であって、pMLJ1:E8
antiCL,pMLJ1:CaMVantiCL,pMLJ1:E8antiPG/CL又はpMLJ
1:CaMVantiiPG/CLが個々にそれに組込まれているもの
を、個々のトマトゲノムの中に２種のアンチセンス遺伝
子構造体を移すために用いた。トマト（リコパ−シコン
エスクレンタムCVアイルサクレイグ〔Lycopersicon e
sculentum cv Ailsa Craig）子葉断片のこの細菌との培
養をタバコフィーダープレート上で48時間行った。苗条
の再生は再生培地において誘発せしめた。この段階よ
り、アグロバクテリアの増殖を阻止するたの（セフォタ
キシム）及び形質転換植物細胞を選別するため（カナマ
イシン）抗生物質を用いた。最後に、苗条を発根培地に
移し、その後、土壌に植え、そして温室の中で成育させ
た。
1.フィーダー細胞の管理 タバコキサンチ（tobacco Xanthi）懸濁培養物を維持
するため、細胞を週に一回40メッシュフィルターで濾過
した。10mlの濾液を500mlのフラスコの中の100mlの新鮮
なキサンチン培地に加えた。
するため、細胞を週に一回40メッシュフィルターで濾過
した。10mlの濾液を500mlのフラスコの中の100mlの新鮮
なキサンチン培地に加えた。
2.トマト種子の発芽 50mlのビーカーの中で約50個の種子を70％のEtOH 20m
l中で２分間撹拌し、そして無菌水ですすいだ。これら
を次に５分間、２滴のツイーン80を含む20％の漂白剤中
で撹拌し、そして無菌蒸留H2Oで４回すすいだ。
l中で２分間撹拌し、そして無菌水ですすいだ。これら
を次に５分間、２滴のツイーン80を含む20％の漂白剤中
で撹拌し、そして無菌蒸留H2Oで４回すすいだ。
無菌のピンセットを用い、12〜15個の種子を各プレー
トに入れた。このペトリ皿をパラフィルム及びアルミホ
イルで包み、25℃で成育させた。５日後（このとき種子
は約60％の発芽率に達していた）、これらをアルミホイ
ルから取り出し、そして2500luxのもとで、16時間の光
射時間によって成育させた。実生は全部で８日間かけて
成育した。
トに入れた。このペトリ皿をパラフィルム及びアルミホ
イルで包み、25℃で成育させた。５日後（このとき種子
は約60％の発芽率に達していた）、これらをアルミホイ
ルから取り出し、そして2500luxのもとで、16時間の光
射時間によって成育させた。実生は全部で８日間かけて
成育した。
3.フィーダープレートの調製 8g/の寒天を有する約40mlのキサンチ懸濁培養培地
の厚みのあるペトリ皿を利用した。1mlの厚みのあるキ
サンチ懸濁培養物（７日目）を各フィーダープレートに
ピペットした。このプレートをパラフィルムでシール
し、そして成育チャンバー（25℃）の中で、光の照らし
た棚の上で12時間インキュベートした。
の厚みのあるペトリ皿を利用した。1mlの厚みのあるキ
サンチ懸濁培養物（７日目）を各フィーダープレートに
ピペットした。このプレートをパラフィルムでシール
し、そして成育チャンバー（25℃）の中で、光の照らし
た棚の上で12時間インキュベートした。
4.フィーダープレートへの子葉の放置 無菌のWhatman ＃１フィルターを各フィーダー細胞プ
レート上に置いた。子葉を外科用メスによってペトリ皿
の中の一滴の無菌水の中で切断した。この外科用メスは
やさしく揺らして切断を行い、これによって組織の破れ
及び傷つけを最小にした。子葉の末端のみを切除した。
切断した子葉を逆さまにして（切断部位を下に）フィー
ダープレート上のフィルター上に載せた。約50個の子葉
断片を各プレートに置いた。このプレートをパラフィル
ムでシールし、そして成育チャンバーの中に16時間置い
た。
レート上に置いた。子葉を外科用メスによってペトリ皿
の中の一滴の無菌水の中で切断した。この外科用メスは
やさしく揺らして切断を行い、これによって組織の破れ
及び傷つけを最小にした。子葉の末端のみを切除した。
切断した子葉を逆さまにして（切断部位を下に）フィー
ダープレート上のフィルター上に載せた。約50個の子葉
断片を各プレートに置いた。このプレートをパラフィル
ムでシールし、そして成育チャンバーの中に16時間置い
た。
5.形質転換アグロバクテリアによる感染 pMLJ1:E8antiCL及びpMLJ1:CaMVantiCLを含むアグロバ
クテリアの10mlの一夜培養物を25μg/mlのスペクチノマ
イシンを有するYE8培地に増殖させた。アグロバクテリ
ア一夜培養物を種子発芽培地の中で590のO.D.へと、４
倍希釈した。0.5mlの希釈細菌をペトリ皿に小分けし、
次いであらかじめタバコフィーダー細胞と一緒に培養し
た30個の子葉断片を加えた。このアグロバクテリア／子
葉混合物を濡れるまで膨潤させた。子葉は細菌中で５分
間濡らした。この子葉を一度無菌ペーパータオルでぬぐ
った。この子葉を同じフィーダープレートに逆さまにし
て戻し、そして皿に48時間一緒に培養した。
クテリアの10mlの一夜培養物を25μg/mlのスペクチノマ
イシンを有するYE8培地に増殖させた。アグロバクテリ
ア一夜培養物を種子発芽培地の中で590のO.D.へと、４
倍希釈した。0.5mlの希釈細菌をペトリ皿に小分けし、
次いであらかじめタバコフィーダー細胞と一緒に培養し
た30個の子葉断片を加えた。このアグロバクテリア／子
葉混合物を濡れるまで膨潤させた。子葉は細菌中で５分
間濡らした。この子葉を一度無菌ペーパータオルでぬぐ
った。この子葉を同じフィーダープレートに逆さまにし
て戻し、そして皿に48時間一緒に培養した。
6.再生 細菌と一緒に培養した後、子葉を正しい面を上にして
再生培地に置いた。この子葉の先端はこの寒天の中に巻
き下がり、傷ついた表面がこの薬剤と直接接触すること
を確実にするようになるであろう。15個の子葉断片を各
プレートに置いた。
再生培地に置いた。この子葉の先端はこの寒天の中に巻
き下がり、傷ついた表面がこの薬剤と直接接触すること
を確実にするようになるであろう。15個の子葉断片を各
プレートに置いた。
10日以内にカルスはこの感染化子葉の先端にて見られ
るようになった。子葉断片を２週間ごとに新鮮なプレー
トに移し換えた。苗条及び濃緑色のカルスを苗条用培地
（再生培地と同じであるが、ただしゼアチンの濃度は0.
1mg/mlに下げている）に移し換えた。６週間後（３回の
移し換え）、全てのカルス及び苗条を苗条用培地に移し
換えた。
るようになった。子葉断片を２週間ごとに新鮮なプレー
トに移し換えた。苗条及び濃緑色のカルスを苗条用培地
（再生培地と同じであるが、ただしゼアチンの濃度は0.
1mg/mlに下げている）に移し換えた。６週間後（３回の
移し換え）、全てのカルス及び苗条を苗条用培地に移し
換えた。
苗条成形のため、TM5苗条用培地を利用した（Shashi
n,Theor.Appl.Gen.69:235−240,1985）。カナマイシン
及びセファトキシムのレベルはれぞれ25mg/及び125mg
/に下げている。
n,Theor.Appl.Gen.69:235−240,1985）。カナマイシン
及びセファトキシムのレベルはれぞれ25mg/及び125mg
/に下げている。
苗条が満足たる根へと発育した後、これを土壌に移し
換えた。植物を土壌に移し換えるには、スパチュラを用
いてほとんどの寒天をかき払ってていねいに寒天から取
り出した。この根を温水中にすすいでできる限り寒天を
取り除いた。それらをGA−７ボックスの中に入れた粘土
ポットの中に植えた。このボックスのカバーを徐々に数
日かけて開け、そしてそれらを１回の給水置きに1/2強
度のHoagland溶液で給水した。２週間後、この植物を成
育チャンバーの中で完全に解放し、そして大きなポット
の中に移植し、そして温室に移した。
換えた。植物を土壌に移し換えるには、スパチュラを用
いてほとんどの寒天をかき払ってていねいに寒天から取
り出した。この根を温水中にすすいでできる限り寒天を
取り除いた。それらをGA−７ボックスの中に入れた粘土
ポットの中に植えた。このボックスのカバーを徐々に数
日かけて開け、そしてそれらを１回の給水置きに1/2強
度のHoagland溶液で給水した。２週間後、この植物を成
育チャンバーの中で完全に解放し、そして大きなポット
の中に移植し、そして温室に移した。
7.培地 a.キサンチ懸濁培養培地 ストック １本のKC MS塩（MM100） 4.3 g ｉ−イソシトール 100 mg スクロース 30 g KH2PO4 2ml 100 mg/ml チアミン 1.3ml 1mg/ml ２、４−Ｄ 2ml 100 mg/ml カイネチン 0.4ml 0.25mg/ml KOHでpH5.5 H2Oで１ 100mlのアリコートを500mlのフラスコに入れる フラスコに栓をし、そしてアルミホイルでキャップ
する オートクレーブで20分 b.種子発芽のためのプレート MS培地 1 pkg.KC MM−100 ３％のスクロース 30gのスクロース 800mlのH2O KOHでpH5.7 容量は１ 8gのバクトアガーを添加（0.8％の寒天） 20分のオートクレーブ 厚みのあるペトリ皿に注ぐ（１皿当り約30ml） c.再生培地 １リットル用： 4.3gのMS塩（KC MM−100） 30gのグルコース 0.59gのMES 2mlの500xのガンボルグ（Gamborgs）ビタミン（以下
参照） 1NのKOHでpH5.8 容量は１リットル 8gノ組織培養級寒天 オートクレーブで20分 50℃に冷却 1mgの無菌ゼアチン（トランス、異性体） 300mg/mlのセフォトキシム（Calbiochem Cat＃2193
80） 50mg/mlのカナマイシン：を添加 500xのガンボルグビタミン： 5gのミオーイソシトール 0.5gのチアミンHCL 50mgのニコチン酸 50mgのピリドキシンHCl 100mlの無菌水 セフォトキシムは光感受性である。これは光に長い間
当ると黄色に変色する。従ってセフォトキシムを含むプ
レートは利用の前日に作成する。
する オートクレーブで20分 b.種子発芽のためのプレート MS培地 1 pkg.KC MM−100 ３％のスクロース 30gのスクロース 800mlのH2O KOHでpH5.7 容量は１ 8gのバクトアガーを添加（0.8％の寒天） 20分のオートクレーブ 厚みのあるペトリ皿に注ぐ（１皿当り約30ml） c.再生培地 １リットル用： 4.3gのMS塩（KC MM−100） 30gのグルコース 0.59gのMES 2mlの500xのガンボルグ（Gamborgs）ビタミン（以下
参照） 1NのKOHでpH5.8 容量は１リットル 8gノ組織培養級寒天 オートクレーブで20分 50℃に冷却 1mgの無菌ゼアチン（トランス、異性体） 300mg/mlのセフォトキシム（Calbiochem Cat＃2193
80） 50mg/mlのカナマイシン：を添加 500xのガンボルグビタミン： 5gのミオーイソシトール 0.5gのチアミンHCL 50mgのニコチン酸 50mgのピリドキシンHCl 100mlの無菌水 セフォトキシムは光感受性である。これは光に長い間
当ると黄色に変色する。従ってセフォトキシムを含むプ
レートは利用の前日に作成する。
d.発根誘発のためのTM5 ポテトビタミン（200x） 成分 量／リットル ミオ−イノシトール 20 g ケアミン−HCL 100 mg ピリドキシン−HCl 100 mg ニコチン酸 1 g グリシン 500 mg ビオチン 10 mg 葉酸 100 mg 溶液を透明化するためにpH5.8〜6.0に調整。
−20℃で保存。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 フィッシャー，ロバート，エル. アメリカ合衆国，カリフォルニア 94530，エルセリート，スコット スト リート 1423 (72)発明者 ラシュブルック，コラリ アメリカ合衆国，カリフォルニア 95620，ディクソン，ドイル レーン 7975 (72)発明者 ジョバンニ，ジェームズ アメリカ合衆国，カリフォルニア 94123，サンフランシスコ，ピアース ストリート 3519 (56)参考文献 Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂ ｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．９，Ｐ．197− 203（1987) Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ, Ｖｏｌ．88，Ｐ．1257−1262（1988) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 15/00 A01H 5/00 C12N 5/00 C12N 9/00 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (6)
- 【請求項１】下記配列表 で表されるアミノ酸配列を有するトマトエンド−1,4−
β−グルカナーゼタンパク質をコードする単離された核
酸配列。 - 【請求項２】請求項１に記載の単離された核酸配列にお
いて、 請求項１に記載の配列表で表されるヌクレオチド配列を
有することを特徴とする核酸配列。 - 【請求項３】請求項１に記載の核酸配列に作動結合され
たプロモーター配列を含んでなる単離された発現ベクタ
ー。 - 【請求項４】請求項３に記載の単離された発現ベクター
であって、 請求項２の核酸配列を含んでなることを特徴とする発現
ベクター。 - 【請求項５】請求項３の発現ベクターをトマト植物の細
胞の中に導入するステップを含んでなる遺伝子導入トマ
ト植物を作る方法。 - 【請求項６】請求項５に記載の遺伝子導入トマト植物を
作る方法であって、 請求項４の発現ベクターをトマト植物の細胞の中に導入
するステップを含んでなる方法。
Applications Claiming Priority (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US07/511,417 US5168064A (en) | 1990-04-20 | 1990-04-20 | Endo-1,4-β-glucanase gene and its use in plants |
| US07/687,466 US5328999A (en) | 1990-04-20 | 1991-04-18 | Endo-1,4-β-glucanase genes and their use in plants |
| US511,417 | 1991-04-18 | ||
| US687,466 | 1991-04-18 | ||
| PCT/US1991/002702 WO1991016426A1 (en) | 1990-04-20 | 1991-04-19 | ENDO-1,4-β-GLUCANASE GENES AND THEIR USE IN PLANTS |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06504904A JPH06504904A (ja) | 1994-06-09 |
| JP3066073B2 true JP3066073B2 (ja) | 2000-07-17 |
Family
ID=24034818
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3508650A Expired - Fee Related JP3066073B2 (ja) | 1990-04-20 | 1991-04-19 | エンド―１，４―β―グルカナーゼ遺伝子及び植物におけるその利用 |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US5168064A (ja) |
| EP (1) | EP0528897A4 (ja) |
| JP (1) | JP3066073B2 (ja) |
| AU (1) | AU652366B2 (ja) |
| BR (1) | BR9106363A (ja) |
| CA (1) | CA2080924C (ja) |
| IE (1) | IE911338A1 (ja) |
| IL (1) | IL97989A (ja) |
| WO (1) | WO1991016426A1 (ja) |
Families Citing this family (37)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5585545A (en) * | 1990-04-20 | 1996-12-17 | The Regents Of The University Of California | Endo-1,4-β-glucanase genes and their use in plants |
| US5852172A (en) * | 1991-06-13 | 1998-12-22 | University Of Waterloo | Cold tolerances in plants |
| US6020540A (en) * | 1993-04-14 | 2000-02-01 | Cornell Research Foundation, Inc. | Gene encoding endochitinase |
| US6512166B1 (en) | 1991-06-17 | 2003-01-28 | Cornell Research Foundation, Inc. | Combinations of fungal cell wall degrading enzyme and fungal cell membrane affecting compound |
| ZA931333B (en) * | 1992-02-28 | 1994-08-25 | Unilever Plc | Recombinant plant enzyme. |
| US5821398A (en) * | 1992-12-15 | 1998-10-13 | Commonwealth Scientific & Industrial Research Org. | DNA molecules encoding inducible plant promoters and tomato ADH2 enzyme |
| WO1994021794A1 (en) * | 1993-03-22 | 1994-09-29 | Zeneca Limited | Dna, dna constructs, cells and plants derived therefrom |
| GB9306726D0 (en) * | 1993-03-31 | 1993-05-26 | Neckerson Biocem Limited | Plant molecular biology |
| US5530187A (en) * | 1993-07-16 | 1996-06-25 | The Salk Institute For Biological Studies | Transgenic plants containing multiple disease resistance genes |
| US5858774A (en) * | 1994-05-12 | 1999-01-12 | The Research Foundation Of State University Of New York | Antisense DNA constructs for expression of hybrid MRNAs driven by inducible, tissue-specific promoters |
| US5945580A (en) * | 1996-04-19 | 1999-08-31 | Dna Plant Technology Corporation | Capsicum hemicellulase polynucleotides and polypeptides |
| AU728348B2 (en) * | 1996-09-12 | 2001-01-04 | Syngenta Participations Ag | Transgenic plants expressing cellulolytic enzymes |
| IL121404A0 (en) * | 1997-07-27 | 1998-01-04 | Yissum Res Dev Co | Transgenic higher plants of altered structural morphology |
| PL343064A1 (en) | 1998-03-20 | 2001-07-30 | Benitec Australia Ltd | Control of gene expression |
| AUPP249298A0 (en) | 1998-03-20 | 1998-04-23 | Ag-Gene Australia Limited | Synthetic genes and genetic constructs comprising same I |
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