MXPA98009091A - Plantas transgenicas con contenido aumentado deaminoacidos de azufre - Google Patents

Abstract

Se logra una semilla con contenido aumentado de aminoácidos conteniendo azufre, sin alergenicidad significativa en plantas transgénicas, tal como plantas de frijol de soya, que contienen un segmento de ADN heterólogo incorporando una o más copias de un gene que codifica para una prolamina de arroz de 10kDa o 16kDa o proteína de albúmina de girasol 2S.

Description

PLANTAS TRANSGÉNICAS CON CONTENIDO AUMENTADO DE AMINOÁCIDO DE AZUFRE CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a plantas transgénicas que tienen niveles elevados de aminoácidos que contienen azufre. Más específicamente, la invención se refiere a la producción de plantas transgénicas que contienen un segmento de ADN con una secuencia de codificación que corresponde a la de un gene para una prolamina de arroz rica en azufre o proteína de albúmina de girasol 2S. ANTECEDENTE DE LA INVENCIÓN Muchas formulaciones de alimento para animales están basadas en soya o maíz, las cuales proveen una fuente concentrada de proteína. La harina de soya, en particular, carece de aminoácidos esenciales que contienen azufre, metionina y cisteina, debido a que las proteínas más abundantes acumuladas en las semillas de soya son deficientes en estos aminoácidos. La suplementación del alimento para animales basados en soya o maíz para llegar a los niveles requeridos de aminoácidos esenciales que contienen azufre, es un gasto significativo agregado. El contenido de azufre de las formulaciones de alimento para animales basados en soya, se ha incrementado utilizando soya transformada para expresar el gene de albúmina 2S de la nuez de Brasil. La proteína de albúmina 2S de la nuez de Brasil, es una proteína de almacenamiento de semillas que tiene alto contenido de aminoácidos que contienen un azufre, conteniendo 18 por ciento molar de metionina y ocho por ciento molar de cisteina. Debido a que la albúmina 2S de la nuez de Brasil es altamente responsable de la alergenicidad de la nuez de Brasil, si embargo, el uso de la semilla de las plantas de soya transformadas para expresar el gene de albúmina 2S de la nuez de Brasil es un método no aceptable para elevar el contenido de azufre en alimentos para animales basados en soya. La albúmina 2S de la nuez de Brasil es un miembro de una superfamila de proteínas homologas que hipotéticamente tienen un(os) gene(s) ancestral(es) común(es). Kreis y otros, J. Mol. Biol 183: 499 (1985). Otras muchas semillas que tienen proteínas de almacenamiento de albúmina 2S son conocidas por contener alérgenos potentes. Meló y otros, Food & Agricultura! immunology 6-185 (1994). Esto no es sorprendente, dado el grado de homología de proteínas de almacenamiento de albúmina 2S. Las plantas monocotíledóneas también contienen proteínas de almacenamiento de semillas. Las proteínas de almacenamiento predominantes en la mayoría de los cereales agronómicamente importantes son las prolaminas. Los arroces y avenas son cultivos de cereales no usuales, en cuanto a que la proteína de almacenamiento principal es una globulina de tipo 11S, y solamente se encuentran pequeñas cantidades de proteínas de prolamina. Menos genes de monocotiledóneas, por varias razones, han sido introducidos exitosamente en plantas dicotiledóneas. Hay diferencias definitivas en la composición de las semillas, regulación de genes y procesamiento post-transcripcional de proteínas de almacenamiento en dicotiledóneas y monocotiledóneas. En particular, los promotores monocotiledóneos normalmente no funcionan bien en las dicotiledóneas. Otras preocupaciones se refieren a la estabilidad del gene rico en azufre en la semilla y afecta posiblemente al gene introducido en el desarrollo normal de las plantas Altenbach y otros, TIBTECH 8- 156 (1990). COMPENDIO DE LA INVENCIÓN Por lo tanto, es un objetivo de la presente invención proveer plantas que expresan una secuencia de ADN exogena que codifica una proteína que tiene alto contenido de aminoácidos que contienen azufre pero que no ocasionan una reacción alergénica en seres humanos o animales También es un objetivo de la presente invención proveer un método para incrementar el contenido de aminoácidos con alto contenido de azufre en un alimento para animales sin suplementación También es un objetivo de la presente invención proveer un enfoque para alterar una planta de manera que produzca semillas caracterizadas por niveles de aminoácidos que contienen azufre que tienen más que las plantas que no han sido alteradas de esta manera Para lograr estos y otros objetivos, se ha previsto, de acuerdo con un aspecto de la presente invención, una planta transgenica que contiene una molécula de ADN comprendido de (A) una secuencia de nucleótidos que corresponde a un gene de prolamida de arroz rico de azufre o gene de albúmina 2S de girasol rico en azufre y (B) un promotor, ligado operablemente a la secuencia de nucleótídos, para efectuar la expresión del mismo por la planta transgénica. Preferiblemente la planta transgénica es una planta de maíz o soya. Un gene de prolamina de arroz preferido es el gene de prolamina de arroz de 10 kDa rico en azufre, mientras que un gene de albúmina 2S de girasol preferido es SFA-7 y SFA-8, preferiblemente SFA-8. La invención también provee semillas producidas por las plantas transgénicas. Se provee un método para alterar una planta con el fin de producir semillas que contienen niveles de aminoácidos que contienen azufre que son superiores a aquellos de una planta no alterada, comprendiendo los pasos de (i) proveer células o tejidos de una planta transformada sin un vector de expresión que contiene una secuencia de nucleótidos que corresponde a un gene de prolamína de arroz rico en azufre o gene de albúmina 2S de girasol rico en azufre; (ii) propagar plantas de las células o tejidos transformados; y (iv) seleccionar la propagación adicional de aquellas plantas que producen prolaminas de arroz ricas en azufre o albúmina 2S de girasol rica en azufre. Un método también se provee para incrementar el contenido de aminoácidos que contienen azufre en un alimento para animales, preferiblemente sin suplementación, el cual comprende los pasos de (i) proveer semillas de una pluralidad de plantas, por lo menos algunas de las plantas contienen una molécula de ADN comprendida de una secuencia de nucleótidos que corresponden a un gene de prolamina de arroz rico en azufre o un gene de albúmina 2S de girasol rico en azufre, ligado operablemente a un promotor para efectuar la expresión de la secuencia de nucleótidos por las plantas; y (ii) procesar las semillas en un alimento para animales. El método da como resultado un producto de alimento que no ha sido suplementado por la adición de aminoácidos que contienen azufre y que contienen harina de soya o maíz obtenida de las semillas de plantas transgénicas. Otros objetivos, aspectos y ventajas de la presente invención serán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada. Sin embargo, se deberá entender que la descripción detallada y los ejemplos específicos, mientras que se indican las modalidades preferidas de la invención, se dan a manera de ilustración únicamente, dado que varios cambios y modificaciones dentro del espíritu y alcance de la invención serán evidentes para los expertos en la materia de esta descripción detallada. BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1, es la secuencia del nucleótidos y aminoácidos deducida de la albúmina 2S de girasol 8 (SFA-8). La Figura 2, es la secuencia de nucleótidos y aminoácidos deducida del clon de prolamina de 10 kDa. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LAS MODALIDADES PREFERIDAS La presente invención permite que la producción de plantas transgénicas tengan semillas caracterizadas por un alto contenido de aminoácidos que contienen azufre, en relación con las plantas que carecen de ADN heterólogo en cuestión. Por lo tanto, un contenido de azufre mejorado en soya (Glycine max) o maiz (Zea mays), por ejemplo, se logra, sin problemas de alergenicidad significativos transformando el material de soya o maíz con un segmento de ADN heterólogo que tiene una secuencia de nucleótidos que corresponde a una o más copias del un gene para una proiamina de 10 kDa o 16 kDa de arroz (Oryza sativa L) o una proteína de albúmina 2S de girasol (Helianthus annus L), que son ricas en azufre En vista de la similitud entre la proteína de albúmina 2S de la nuez de Brasil y su homólogo de girasol, es sorprendente que la proteína de albúmina 2S de girasol rica en azufre no ocasione problemas de alergenicidad También es sorprendente que un gene de prolamina de arroz, una monocotiledónea, se pueda expresar exitosamente en soya, una dicotiledónea, sin problemas de estabilidad Las proteínas de albúmina 2S de girasol rica en azufre se describen, por ejemplo, por Li I ley y otros, "Isolation and Ppmary Structure for a Novel Methionine-pch Protein from Sunflowerseeds (Helianthus annus /_), "en PROCEEDINGS OF THE WORLD CONGRESS ON VEGETABLE PROTEIN UTILIZATION IN HUMAN FOODS AND ANIMAL FEEDSTUFFS 497-502 (1989), y por Kortt y otros, Phytochemistry 29 2805 (1990), el contenido respectivo de las cuales se incorpora aquí por referencia. Ocho proteínas, denotadas albúminas de girasol (SFA) 1 a 8, se identifican en la fracción de albúmina 2S. Dos de estas, SFA-7 y SFA-8, son ricas azufre. Contienen aproximadamente ocho por ciento molar de cisteina y 16 por ciento molar de metionina. SFA-8 está presente en mayores cantidades que SFA-7 y por esta razón son las preferidas. La secuencia de nucleótidos de SFA-8 se muestran en la Figura 1. Matsumura y otros, Plant Molec. Biol. 12: 123 (1989), describe tres polipéptidos de prolamina aislados de semillas de arroz, denotados "10kDa", "13kDa" y "16kDa". Las proteínas de 10kDa y 16kDa son tales que son ricas en azufre. Un clon de longitud completa para la prolamina de 10kDa también es descrito, y esta modalidad se prefiere para usarse de acuerdo con la presente invención. La secuencia de nucleótidos del clon de 10 kDa se muestra en la Figura 2. De acuerdo con la presente invención, una molécula de ADN que comprende un vector de transformación/expresión se trata para incluir una secuencia de uno de los genes de albúmina 2S de girasol ricos en azufre o del gene de prolamina de arroz rico en azufre de 10kDa o 16kDa. El aislamiento y la clonación de estos genes por metodología normal se describe en Lilley y otros, Kortt y otros y Matsumura y otros, supra. Los genes de prolamina de arroz primero pueden modificarse para reflejar el uso de codones preferidos en dicotiledóneas antes de la introducción en la soya.

Los genes de albúmina 2S de girasol ricos en azufre y el gene de prolamina de arroz rico en azufre de 10kDa o 16kDa de la presente invención se pueden aislar a partir de una fuente natural o sintetizarse de una secuencia conocida. La secuencia se puede obtener formando un ADNc de ARNm. La secuencia también se puede derivar de una secuencia de ADN genómico. La secuencia puede subclonarse en un vector de elección. Cuando se aisla la albúmina 2S de girasol rica en azufre o el gene de prolamina de arroz de 10kDa o 16kDa rico en azufre del genoma, o la subclonación de estos genes, las metodologías utilizadas podrían incluir la identificación del gene por hibridización con sondas, RCP, síntesis de sonda/inicíador/gene sintético, secuenciación, clonación molecular y otras técnicas que son bien conocidas para los expertos en biología molecular. Una vez que el gene de elección ha sido aislado, una copia de su secuencia se coloca en un vector de expresión mediante métodos normales. Para una descripción general de los vectores de expresión de plantas, ver Gruber y otros, "Vectors for Plant Transformation," en METHODS IN PLANT MOLECULAR BIOLOGY AND BIOTECHNOLOGY 89-119 (CRC Press, 1993). Se prefiere insertar múltiples copias de un rollo de expresión que contiene el gene que será introducido en un vector de expresión, preferiblemente por lo menos cuatro copias. La selección de un vector de expresión apropiado dependerá del método para introducir el vector de expresión en las células huésped.

Un vector de expresión normal contiene- elementos de ADN procarióticos que codifican un origen de replicación bacteriano y un gene de resistencia a antibiótico para proveer el crecimiento y selección del vector de expresión en el huésped bacteriano, un sitio de clonación para la inserción de la secuencia de ADN exógena, elementos de ADN eucarióticos que controlan la iniciación de transcripción de la secuencia de ADN exógena, tal como un promotor y un mejorador opcional, y elementos de ADN que controlan el procesamiento de transcripciones, tales como una secuencia de terminación-poliadenilación El vector también podría contener secuencias adicionales que son necesarias para permitir la integración eventual del vector en un cromosoma La expresión de la secuencia del gene está bajo el control de un promotor Ejemplos de promotores adecuados son el promotor para la subunidad pequeña de r?bulosa-1 ,5-b?s-fosfato carboxilasa promotores de plásmidos que inducen el tumor de Agrobacterium tumefaciens, tales como los promotores de nopalma sintasa y octopina sintasa y promotores vírales tales como los promotores 19S y 35S del virus de mosaico de coliflor (CaMV) o el promotor 35S del virus de mosaico de escrofulapa El promotor puede ser constitutivo o inducible Especialmente se prefieren los promotores "preferidos para tejidos de semillas" o "específicos para tejidos de semillas", es decir promotores que promueven la alta expresión del segmento de ADN heterologo en el tejido de semilla en donde se desea el control de genes que están implicados en el metabolismo de las semillas y hay poca o ninguna expresión en otras partes de la planta. La manufactura de proteínas ricas en azufre u otras partes de la planta gasta innecesariamente la energía de las plantas. Ejemplos conocidos de promotores preferidos para tejidos de semillas, o específicos para tejidos de semillas, incluyen el promotor de soya de ß-conglicinina, también conocido como la proteína 7S, que promueve la transcripción dirigida a la semilla (Bray, Planta 172: 364 (1987)) y los promotores dirigidos a semillas de los genes de zeina del endosperma de maíz (Pedersen y otros, Cell 29: 1015 (1982)). Los promotores dicotiledóneos se prefieren para usarse en soya y un promotor particularmente preferido es el promotor de faseolina de frijol. Además de un promotor adecuado, uno o más mejoradores son útiles en la invención para aumentar la transcripción del segmento de ADN introducido. El mejorador, o elemento similar al mejorador, se puede insertar en el promotor para proveer niveles superiores de transcripción. Ejemplos de dichos mejoradores incluyen, entre otros, los mejoradores vírales inter alia, como aquellos dentro del promotor 35S, como se muestra en Odell y otros. Plant Mol. Biol. 10: 263-72 (1988), y un mejorador de un gene de opina como se describe por Fromm y otros, Plant Cell 1: 977 (1989) Los genes marcadores selecionables en proximidad física al segmento de ADN introducido, se utilizan para permitir que las células transformadas se recuperen ya sea por selección o tamización genética positiva Los genes marcadores seleccionables también permiten que se mantenga la presión de selección sobre una población de plantas transgénicas para asegurar que el segmento de ADN introducido y sus promotores y mejoradores de control se retengan por la planta transgénica. Muchos de los genes marcadores seleccionables positivos comúnmente utilizados para la transformación de plantas, se han aislado de las bacterias y codifican las enzimas que destoxifican metabólicamente un agente químico selectivo que puede ser antibiótico o un herbicida. Otros genes marcadores de selección positiva codifican un blanco alterado que no es sensible al inhibidor Un gene marcador de selección preferido para la transformación de plantas es el gene de neomicma fosfotransferasa (nptll), aislado de Tn5, que confiere resistencia a la canamicina cuando se coloca bajo el control de las señales reguladoras de plantas. Fraley y otros, Proc. Nat I Acad Sci USA 80 4803 (1983) Otro marcador seleccionable útil es el gene de higromicina fosfotransferasa el cual confiere resistencia al antibiótico de higromicina Vanden Elzen y otros, Plant Mol Biol 5 299 (1985) Los genes marcadores seleccionables positivos adicionales, de origen bacteriano que confiere resistencia a antibióticos, incluyen gentamicina acetil transferasa, estreptomicina fosfotransferasa am?nogl?cos?do-3'-aden?l transferasa y la determinante de resistencia a bleomicina Hayford y otros, Plant Physiol 86 1216 (1988), Jones y otros, Mol. Gen. Genet. 210: 86 (1987); Svab y otros, Plant Mol. Biol. 14: 197 (1990); Hille y otros, loe. cit. 7: 171 (1986). Otros genes marcadores seleccionables positivos para la transformación de planta no son de origen bacteriano. Estos genes incluyen dihidrofolato reductasa de ratones, 5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato sintasa de plantas y acetolactato sintasa de plantas. Eichholtz y otros, Somatic Cell Mol. Genet. 13: 67 (1987); Shah y otros, Science 233: 478 (1986); Charest y otros, Plant Cell Rep. 8: 643 (1990). Otra clase de genes marcadores útiles para transformación de plantas con la secuencia de ADN requiere tamizar las células de plantas presuntivamente transformadas en lugar de dirigir la selección genética de células transformadas para la resistencia a una substancia tóxica tal como un antibiótico Estos genes son particularmente útiles para cuantificar o visualizar el patrón espacial de expresión de la secuencia de ADN en tejidos específicos y frecuentemente se denominan como genes reporteros debido a que pueden fusionarse a un gene o secuencia reguladora para la investigación de la expresión de genes Los genes comúnmente utilizados para tamizar las células presuntivamente transformadas incluyen ß-glucoronidasa (GUS), ß-galactosidasa, luciferasa y cloramfenicol acetiltransferasa. Jefferson Plant Mol Biol Rep 5 387 (1987); Teeri y otros, EMBO J 8. 343 (1989), Koncz y otros, Proc Nat'l Acad Sci USA 84 131 (1987), De Block y otros, EMBO J 3 1681 (1984). Otro enfoque para la identificación de eventos de transformación relativamente raros ha sido utilizar un gene que codifica un regulador constitutivo dominante de la ruta de pigmentación de antocianina de Zea mays. Ludwín y otros, Science 247: 449 (1990). Con el fin de crear un vector de expresión que contiene el gene o genes de interés, un primer rollo de expresión se hace insertando un gene de albúmina 2S de girasol clonado o de prolamina de arroz en un plásmido bajo el control de una secuencia reguladora. El rollo de expresión resultante se puede ligar asimismo para producir un rollo de expresión con una repetición seguida del gene clonado. Una unión adicional puede llevarse a cabo para generar una construcción que contiene cuatro copias seguidas del gene. Una o más copias del rollo de expresión que contiene el segmento de ADN introducido que corresponde al gene del girasol de albúmina 2S rico en azufre o gene de prolamina de arroz de 10kDa o 16kDa rico en azufre que se transfiere a un vector de expresión. En una modalidad preferida, el vector también contiene un gene que codifica un marcador de selección que está ligado funcionalmente a los promotores que controlan la iniciación de transcripción. Preferiblemente, un plásmido de Ti desarmado se utiliza como un vector para secuencias de ADN extrañas. Para generar una planta transgénica, un vector de expresión que contiene un gene de girasol de albúmina 2S rico en azufre o gene de prolamina de arroz de 10kDa o 16kDa rico en azufre se puede introducir en protoplastos; en tejidos intactos, tales como embriones inmaduros y meristemas; en cultivos de callos o células aisladas. Preferiblemente, los vectores de expresión se insertan en tejidos intactos, particularmente explantes derivados de nodos hipocotilos o cotiledonarios de una semilla germinada. A este respecto, un explante es una pieza de tejido que se toma de una planta donadora y es capaz de producir callos en el cultivo. El tejido hipocotilo es aquella porción del tallo de un embrión de la planta o una plántula debajo de los cotiledones y por arriba de la raíz. Un cotiledón es una hoja embriónica y un nodo cotiledonario es aquella parte de la plántula entre el eje embriónico y los cotiledones que definen botánicamente la división de hipocotilo y el epicotilo o brote embriónico. Se proveen métodos generales para el cultivo de tejidos de plantas, por ejemplo, por Miki y otros, "Procedures for Introducing Foreign DNA into Plants," en METHODS IN PLANT MOLECULAR BIOLOGY AND BIOTECHNOLOGY 67-88 (CRC Press 1993). Un método preferido para introducir un vector de expresión en tejido de planta es la infección directa o cocultivo de tejidos de plantas con A. tumefaciens que contiene un vector de expresión con el gene de interés y elementos reguladores asociados. Horsch y otros, Science 227: 1229 (1985). Un vector de expresión preferido es el vector pARC12 (p1830), un plásmido que es parte de un sistema de plásmido de Ti binario de A. tumefaciens y que contiene nopalina sintasa/neomicina fosfotransferasa II (NPTII) como un promotor y marcador seleccionable para células de plantas transformadas.

El vector de expresión preferiblemente se transforma en A tumefaciens utilizando una técnica de congelación-descongelación, como se describe en PLANT MOLECULAR BIOLOGY (Gelvin and Schilperoort, eds., Kluwer Academic Publishers, 1988) Después de que se confirma que una cepa de A. tumefaciens contiene una copia completa de la construcción, la construcción puede transferirse a la planta blanco. Un modelo adecuado para demostrar la transformación de una planta por los genes de albúmina 2S de girasol ricos en azufre y genes de prolamina de arroz ricos en azufre es la transformación mediada por Agrobacterium de la planta de tabaco, Nícotíana tabacum. En este modelo, una cepa de Agrobacterium que está confirmada que contiene la construcción se utiliza para inocular plantas de tabaco heridas para generar los eventos transgénicos Spielmann y otros Mol Gen Genet 205 34 (1986) Cuando se utiliza Agrobacterium para transferir un vector de expresión a la soya, la inducción de los genes de virulencia (vir) en Agrobacterium conduce a la transformación mejorada Las células de soya cultivadas carecen o tienen una cantidad limitante de las moléculas de señal necesarias para iniciar los procesos de transformación y la inducción de los genes vir es necesaria para lograr transformación exitosa Se pueden utilizar varios parámetros físicos para inducir los genes vir Se pueden utilizar varios compuestos, individualmente o en combinación, para inducir el gene vir Ilustrativo de dichos compuestos son compuestos fenólicos tales como acetosiringona, a-hidroxiacetosiringona, acetovanilona, siringaldehido, ácido siringico y ácido sinapinico. Las bajas temperaturas y bajo pH durante el cocultivo también conduce a la transformación mejorada, presumiblemente como un resultado de un efecto sobre los genes vir. Las temperaturas debajo de 26° dan como resultado la transformación más efectiva, y una temperatura de aproximadamente 20° es preferida. La regulación a un pH por debajo de 6.0, preferiblemente un pH de aproximadamente 5.5, mejora la eficiencia de transformación. La transformación de soya por Agrobacterium también depende de la concentración de bacterias en el inoculo. En general, los números superiores de bacterias dan como resultando mayores eventos de transformación. Preferiblemente se utiliza un período de inoculación de por lo menos 30 minutos y una concentración de bacterias de por lo menos 3x108 células viables/ml. Para la transformación de maíz, las técnicas diferentes a la transformación mediada por Agrobacterium son preferidas. Una metodología especialmente preferida a este respecto abarca someter un meristemo de maíz expuesto a bombardeo biolístico, con el fin de dirigirse a las células del meristemo no diferenciadas para la transformación, como se describió en la solicitud internacional PCT 96/04392. De acuerdo con este enfoque, el tejido del meristemo se manipula después del bombardeo con el fin de agrandar los sectores transgénicos, ya sea a través de la selección y/o a través de efectuar una proliferación de tejido de los brotes o múltiples mepstemos por sí mismos. La población de los brotes así obtenidas se tamizan entonces, por medio de un análisis de enriquecimiento no letal para identificar cualesquiera sectores quiméricos que contribuirán a la transmisión de la línea germinal, o quimeras periclinales no seccionadas que por definición transmitirán la progenie. El incrementado en el cultivo, bajo selección, mejora los prospectos para las conversiones sectoral-periclinal y también selecciona las conversiones de L1 a L2 que, a través de un cambio en posición, finalmente contribuyen a la línea germinal. Después de tamizar, las plantas transgénicas se establecen a partir de los explantes transformados por técnicas convencionales conocidos por el artesano experto. La técnica preferida es el cultivo de explantes transformados en medio de contraselección líquido, seguido por transferencia al medio de selección solidificado. El proceso se repite como se describe en la técnica para identificación por marcadores transgénicos tales como ß-glucuronidasa (gus). McCabe y otros, Bio/Technology 6: 922 (1988). Los brotes se inducen en explantes transgénicos por métodos conocidos. Wright y otros, Plant Cell Rep. 5: 150 (1986); Barwale y otros, Planta 167: 473 (1986). Los brotes se cortan y, por la adición de ácido piroglutámico a un medio de crecimiento enriquecido con hormonas, se inducen fácilmente los brotes. Las plantas reproductivas maduras completas, se producen después de la transferencia al cultivo de invernadero en el suelo.

Las semillas de las plantas transgénicas de acuerdo con la invención contienen niveles significativos de aminoácidos que contienen azufre, particularmente metionina. La expresión de los genes ricos en azufre se logró por una disminución concomitante en actividades de inhibidores de tripsina y quimiotripsina. Estos inhibidores endógenos son relativamente ricos en aminoácidos que contienen azufre y la sobreexpresión de los genes introducidos puede agotarse de las combinaciones de azufre libres normales en la semillas, dando como resultado que el azufre se recupere de las proteínas endógenas. Las plantas transgénicas parecen acumular las proteínas heterólogas a costa de ciertas proteínas endógenas para mantener una condición homeostática Los cambios no producen efecto aparente sobre la viabilidad de la planta transgénica o sobre la proteína de semilla total. Los análisis de las proteínas de semillas de las plantas transgénicas revelan proteínas precursoras no grandes, surgiriendo que la proteína transgénica está siendo procesada completamente dado que podría estar en la planta de origen Los análisis de aminoácidos de semillas de plantas transgénicas no muestran cambios significativos comparado con los controles, excepto por los niveles incrementados de metionina Mientras que la presente invención ha sido descrita en detalle con respecto a las modalidades particulares preferidas se deberá entender que dicha descripción se presenta a manera de ilustración y no de limitación Se pueden hacer muchos cambios y modificaciones dentro del alcance de la presente invención sin alejarse del espíritu de la misma y la invención incluye todas las modificaciones. Por lo tanto, mientras A. tumefaciens es un vector preferido, se pueden utilizar otros tipos de vectores para la transformación por procedimientos tales como transferencia de genes directa, como se describió, por ejemplo, en la solicitud de PCT número WO 85/01856 y la solicitud Europea número 0 275 069; la transformación de protoplastos in vitro, que es el tema de la patente de E.U.A. número 4,684,611, por ejemplo; transformación mediada por virus de plantas, ilustrada en la solicitud Europea número 0 67 553 y patente de E.U.A. número 4,407,956; y transformación mediada por liposomas de acuerdo con la patente de E.U.A. número 4,536,475, entre otras descripciones. Los métodos de transferencia directa también se pueden emplear, tales como suministro mediado por microproyectiles, inyección de ADN y electroporación. Ver, por ejemplo, Gruber y otros, y Miki y otros, ambas citadas antes, y Klein y otros, Bio/Technology 10: 268 (1992). La presente invención además se describe por referencia al siguiente ejemplo ilustrativo. EJEMPLO: TRANSFORMACIÓN MEDIADA POR AGROBACTERIUM DE TABACO O SOYA PARA PRODUCIR UNA PLANTA TRANSGÉNICA QUE TIENE UNA CONCENTRACIÓN SUPERIOR DE AMINOÁCIDOS QUE CONTIENEN AZUFRE A. Creación del vector de expresión que contiene genes de albúmina 2S de girasol y prolamina de arroz ricos en azufre Los clones de ADNc de longitud completa para las proteínas de prolamina de arroz de 10kDa y de SFA-8 de girasol se obtuvieron utilizando RT-RCP con ADNc de un primer hilo como patrón y los iniciadores específicos para genes diseñados contra las secuencias publicadas. Ver Matsumura y otros y Lilley y otros, supra. Los productos de RCP resultantes se subclonaron en pBluescript SKII y se confirmaron por análisis de secuencia. Los genes se transfirieron en p4752, que contiene las secuencias reguladoras 5' y 3' de faseolina. Sengupta-Gopalan y otros, Proc. Nat'l Acad. Sci USA 82 3320 (1985). Los rollos de expresión resultantes contuvieron SFA-8 (p6445) y prolamma de arroz de 10kDa (p6465) bajo control de las secuencias reguladoras de faseolina p6445 y p6465 se ligaron de nuevo a sí mismas para producir p6668 y p6670, respectivamente, que contuvieron repeticiones seguidas de los rollos de expresión Un grupo final de ligaciones se llevo a cabo con p6668 y p6670 para generar p7518 y p7519, respectivamente, construcciones de las cuales contienen cuatro copias seguidas de los rollos de expresión Las construcciones que contienen las cuatro copias seguidas se transfirieron después al vector binario pARC12 (p1830), un vector que contienen el marcador seleccionable de NPTII para la selección de plantas Los vectores binarios resultantes par 4X SFA-8 y 4X prolamina de arroz de 10kDa denotaron p6704 y p7499 respectivamente Estos vectores se transformaron en la cepa Agrobacterium tumefaciens LBA4404 por un método de congeiacion-descongelación (PLANT MOLECULAR BIOLOGY, op cit ), y se confirmó la presencia de una copia completa de la construcción de 4X. B. Preparación de explantes, transformación y recuperación de plantas transgénicas Tabaco Las plantas de tabaco (Nicotiana tabacum) var. Xanthii, se cultivaron de 1 cm de explantes aplicables o auxiliares sobre OMS, de acuerdo con Murashige y otros, Physiologia Plantarum, 15:473 (1962), en una Caja Magenta (Magenta Corp., Chicago, lll) a 27°C con un fotoperíodo de 16 horas de luz/8 horas de obscuridad. Las primeras cuatro hojas completamente expandidas de bajo del ápice (hojas 3, 4, 5, ó 6) se removieron. Las hojas se colocaron, una a la vez, en una caja petri de 100 mm con varios discos de filtro Whatman #1, de 7 cm, empapados con medio líquido. Un orificio, de corcho #2. puntiagudo, estéril (0.5 cm i.d) se utilizó para picar los discos de hojas, evitando la nervadura central y las venas. Los discos se mantuvieron sobre el papel filtrado a una humedad del 100% en una caja petri separada con filtros Whatman y medio líquido. Los cultivos durante la noche de A. tumefaciens LBA4404 alojando p6704 y p7499, respectivamente, se desarrollaron hasta la fase log en un medio Mínimo A conteniendo tetracíclina, 1.0 µg/ml. Los cultivos se combinaron y se midieron a una densidad óptica de 550 nm. La densidad de cultivo se ajustó por dilución por medio líquido aproximadamente 5 x 10s bacterias/ml.

Los discos de las hojas se inocularon sumergiéndolos individualmente en una suspensión de Agrobacterium que aloja la construcción 4X. Cada disco se mantuvo sumergido en la suspensión durante 05 - 1.0 segundos para asegurar que todos los bordes fueran infectados. Cada disco se colocó entonces en un filtro sobre el medio de cultivo que induce la regeneración de brotes en una caja petri. El medio se suplemento con fitohormonas e incluyó sales principales y micronutrientes MS (Murashiga, op cit ) suplementado con sacarosa, 3.0% p/v; ácido acético de naftaleno (NAA), 0 1 mg/L y 6-benc?laminopurina (BAP), 1 0 mg/L El medio se reguló a pH 57 el filtro se secó lo suficiente para debilitar el inoculo en exceso Se colocaron en las placas de diez a doce discos por 7 cm de filtro por 100 mm de placa Las cajas petp se cubrieron con película de parafina y se mantuvieron bajo luz tenue 28°C durante dos días Después de dos días, los explantes se cambiaron a un medio de contraselección de líquidos, un medio que tiene la misma composición básica que la utilizada durante el co-cultivo, pero con la adición de cefotaxima, 500µg/ml y vancomicina, 100 µg/ml Los discos se lavaron con agitación giratoria continua suave durante 3-6 horas con por lo menos un cambio de medio liquido Los discos se colocaron entonces sobre medio solido, un medio que tiene la misma composición básica que la utilizada durante el cocultivo, pero con la adición de vancomicina, 100 µg/ml y carbenicilina, 500 µ/ml El liquido en exceso se evaporó antes de colocar en la placa de diez a doce discos por 100 mm de placa. Los explantes fueron cultivos de 3 días a 28°C con luz tenue. Los discos se transfirieron a un medio de selección sólido, un medio que tiene la misma composición básica que la utilizada durante el cocultivo, pero con la adición de vancomicina, 100 µg/ml, carbenicilina, 500 µg/ml; y canamicina, 100 µg/ml. Los discos se cultivaron a 26°C en luz alta con un fotoperíodo de 16 horas de luz/8 horas de obscuridad Los sectores transformados se volvieron visibles aproximadamente dos semanas después Los brotes aparecieron pronto junto al callo y estos se removieron de los callos y se colocaron sobre el medio libre de hormona para formar raices Soya Las semillas de soya (Glycine max), var PHI9341, se esterilizaron en su superficie por exposición a gas cloro evolucionado en una jarra de campana de vidrio El gas se produjo agregando 35 ml de ácido clorhídrico (34-37% p/p) a 100 ml de hipoclopto de sodio (525% p/p) La exposición fue durante 16-20 horas en un recipiente de aproximadamente 28 3 litros en volumen La semilla con la superficie esterilizada se almaceno en cajas petp a temperatura ambiente La semilla se germinó colocando en placas de un medio solidificado de agar con 1/10 de resistencia de acuerdo con Gamborg (medio basado B5 con orgánicos mínimos, Sigma Chemical Co , cat No G5893, 0 32 gm/L, sacarosa, 02% p/v y acido 2-[N-morfol?no)etansulfón?co) (MES), 3 0 mM sin reguladores de crecimiento de plantas y cultivando a 28°C con una longitud de un día de 16 horas e iluminación fluorescente blanco frío de aproximadamente 20 µEm2S1. Después de tres o cuatro días, la semilla se preparó para cocultivo. La cubierta de las semillas se removió y el radiculo de elongación se removió 3-4 mm debajo de los cotiledones. Diez semillas preparadas se mantuvieron en cada una de las cajas petri. Los cultivos durante la noche de A. tumefaciens LBA4404 alojando p6704 y p7499, respectivamente, se desarrollaron hasta la fase log en medio Mínimo A conteniendo tetraciclina, 1.0 µg/ml. Los cultivos se combinaron y se midió una densidad óptica a 550 nm. Una cantidad de cultivo suficiente para recuperar la sedimentación entre 1.0 y 2.0 x 1010 células, fue O.D. 550 1.0 = 1.4 x 109 células/ml, se colocó en un tubo de centrifuga cónico de 15 ml y se hizo girar hacia abajo a 6000 g durante 10 minutos. Después de la centrifugación el sobrenadante se decantó y los tubos se mantuvieron a temperatura ambiente hasta que se necesitó el inoculo, pero no más de una hora.

Los ¡noculos se llevaron en lotes de manera que cada placa de semilla se trató con una pella recién resuspendida de A. tumefaciens alojando la construcción 4X. Una a la vez la pellas se resuspendieron en 20 ml de medio de inoculo. El medio de inoculo consistió de sales B5 (B4893), 3.2 gm/L, sacarosa, 2.0% p/v, BAP, 44 µM; y ácido indolbutírico (IBA), 0.5 µM Se agregaron 100 µM de Acetosiringona (AS) y el medio se reguló a pH 5.5 con MES, 10 mM.

La mezcla se resuspendió revolviendo y ei inoculo se vertió en una caja petri conteniendo semilla preparada y los nodos cotiledonarios se maceraron con sangre quirúrgica con un bisturí. Este se logro dividiendo la semilla a la mitad por sección longitudinal a través del ápice del brote, conservando los dos cotiledones completos. Las dos mitades del ápice del brote se rompieron en sus cotiledones respectivos separándolas con un bisturí. El nodo cotiledonario se maceró entonces con el bisturí haciendo cortes repetidos a lo largo del eje de simetría. Se tuvo cuidado de no cortar completamente a través del explante al lado adaxial. Veinte explantes se prepararon en casi cinco minutos y se incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente sin agitación. Las placas adicionales se prepararon durante este tiempo. Después de 30 minutos los explantes se transfirieron a las placas del mismo medio solidificado con Geirite (Merck & Co., Inc.), 0.2% p/v. Los explantes se embebieron con el lado adaxial hacia arriba y se nivelaron con la superficie del medio y se cultivaron a 22°C durante tres días bajo luz fluorescente blanca, fría, aproximadamente 20 µEm2S1. Después de tres días, los explantes se cambiaron al medio de contraselección líquido. El medio de contraselección consistió de sales B4 (G5893), 3.2 gm/l; sacarosa, 2.0% p/v; BAP, 5,0 µM, IBA. 0.5 µM; vancomicina, 200 µ/ml; cefotaxima, 500 µg/ml y se reguló a pH 5.7 con MES, 3 mM. Se lavaron diez explantes en cada caja petp con agitación giratoria lenta constante a temperatura ambiente durante cuatro días El medio de contraselección se reemplazó cuatro veces Los explantes se picaron en el medio de selección solidificado de agarosa. El medio de selección consistió de sales B5 (G5893), 32 gm/L; sacarosa 2.0% p/v; BAP, 5.0 µM; IBA 0.5 µM; sulfato de canamicina, 50 µg/ml; vancomicina 100 µg/ml; cefotaxima, 30 µg/ml, timentina, 30 µg/ml y se reguló a pH 5.7 con MES, 30 mM El medio de selección se solidificó con agarosa SeaKem, 0.3% p/v. Los explantes se embebieron en el medio, con el lado adaxial hacia abajo y se cultivaron a 28°C durante un día de 16 horas de largo y luz fluorescente blanca, fría, de 60-80 µEm2S1 Después de dos semanas, los explantes se lavaron con medio líquido sobre el agitador giratorio Esta vez el lavado se condujo durante la noche en el medio de contraselección conteniendo sulfato de canamicina 50 µg/ml Se picaron los explantes del siguiente día en medio de selección solidificado con agarosa De nuevo se embebieron en el medio, con el lado adaxial hacia abajo y se cultivaron como antes durante otras dos semanas Después de un mes sobre medio selectivo, el tejido transformado se volvió visible como sectores verdes de tejido de regeneración contra un fondo de tejido menos saludable blanqueado Los explantes en los vectores verdes se descartaron, los explantes con sectores verdes se transfirieron al medio de elongación El medio de elongación consistió de sales B5 (G5893), 32 gm/L sacarosa, 2.0% p/v; IBA, 3.3 µM; ácido gibberelico 1.7 µM; vancomicina, 100 µg/ml; cefotaxima, 30 µg/ml; timentina, 30 µg/ml y se reguló a pH 5.7 con MES, 30.0 mM. El medio de elongación se solidificó con gelrita, 0.2 % p/v. Los explantes se embebieron con el lado adaxial hacia arriba y se cultivaron como antes. El cultivo se continuó contra este medio con transferencias a placas frescas cada dos semanas. Cuando los brotes fueron de 0.5 cm de longitud se cortaron en la base y se colocaron en medio de formación de raíces en tubos de ensayo de 13 x 100 mm. El medio de formación de raíces consistió de sales B5 (G5893), 3.2 gm/L; sacarosa, 15 gm/L; ácido nicotínico 20 µM; ácido piroglutámico (PGA), 900 mg/L y IBA, 10 µM. El medio se reguló a pH 5.7 con MES 3.0 mM y se solidificó con GeIRite, 0.2% p/v. Después de diez días los brotes se transfirieron al mismo medio sin IBA o PGA. Los brotes formaron raíces y se mantuvieron en estos tubos bajo las mismas condiciones ambientales quelantes. Una vez que el sistema de raíces estaba bien establecido, la plántula se transfirió a una mezcla de suelo estéril en estudios de plantas (INC Biomedícals, Inc.; catálogos Números 26-720 y 1-02). La temperatura, fotoperíodo e intensidad de luz permanecieron igual que antes. Bajo estas condiciones los regenerantes se volvieron vigorosos, algo pequeños, pero la mayoría fueron plantas normales. Cuando sus sistemas de raíces bien una esquina de la planta se corto y las plantas se endurecieron gradualmente en una cámara ambiental o invernadero. Finalmente se sembraron en una mezcla de suelo y se desarrollaron hasta su madurez, teniendo la semilla, en un invernadero. C. Análisis de semillas producidas por plantas transgénicas Las semillas maduras de varias líneas transgénicas independientes conteniendo genes de SFA-8 o de prolamina de arroz de 10 kDa se extrajeron en regulador de 2X Laemmli. Las proteínas se cuantificaron utilizando un equipo Lowry modificado de Bio-Rad utilizando albúmina de suero de bovino como una normal. Las cantidades iguales de proteína se cargaron en geles de Tris-glicina-poliacrilamida de 4-20%. Las normales de peso molecular en la escala de 3-116 kD se obtuvieron de Novex y se corrieron a lo largo de las muestras de proteína. Los geles se corrieron en duplicado con una siendo transferida electroforéticamente a la membrana de PVDF Immobilon para análisis Western y las otras siendo utilizadas para tinsión de Coomassie. Los análisis Western se llevaron a cabo utilizando anticuerpos purificados por afinidad contra albúmina 2S de girasol o prolamina de arroz y la señal se detectó por el sistema de detección Quimioluminiscente de luz Western de Tropix, Inc. (Bedford, MA) conforme a las instrucciones del fabricante. La composición total de aminoácidos se puede determinar por hidrólisis de ácidos de tabaco o harina de soya por protocolos normales. Las proteínas de las semillas también se pueden analizar para actividad inhibidora de tripsina de acuerdo con los protocolos descritos previamente de Kollipara y otros, J. Agricul. Food Chem. 40:2356 (1992). Los análisis inhibidores de quimiotripsina similares se pueden realizar de acuerdo con Geiger, Chymotrypsin. En "Methods of Enzimatic Analysis," pp. 99-109 (1984). Los análisis de proteínas de semillas de 6 líneas de tabaco transgénicas independientes que contienen el gene para SFA-8 revelaron una banda que coemigró con SFA-8 purificado. No se detectaron señales en las muestras de proteína de tabaco no transformado. Comparando la intensidad de la banda inmunodetectada a una serie de dilusión de SFA-8 purificado, la proteína de SFA-8 transgénica acumulada como un porcentaje de proteína de semilla total se calculó que es de 5-10%. No se detectaron proteínas precursoras grandes, indicando que la transgénica se procesó como normalmente se hace en el girasol. Los resultados similares se obtuvieron para plantas de tabaco transgénicas expresando el gene de prolamina de arroz. Se detectó una banda que coemigró con la prolamina de arroz purificada en todas las líneas de tabaco transgénicas. No se detectaron señales en las muestras de proteína de tabaco no transformado. Utilizando una serie de dilusión de prolamina de arroz purificada como una normal, la proteína de prolamina de arroz transgénica acumulada como un porcentaje de la proteína de semilla total se calculó que es de 1-5%. Sorprendentemente, no se detectaron precursores más grandes, indicando que la planta de tabaco transgénica, una dicotiledona. procesó la proteína de la misma manera que el arroz, una monocolídonea.

Claims (15)

1. REIVINDICACIONES 1. Una planta transgénica que contiene una molécula de ADN comprendida de (A) una secuencia de nucleótidos que corresponde a un gene de prolamida de arroz rico en azufre o gene de albúmina 2S de girasol rico en azufre (B) un promotor, ligado operablemente a la secuencia de nucleótidos, para efectuar la expresión del mismo por la planta transgénica
2. 2. Una planta transgénica de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la planta es una planta de soya.
3. 3. Una planta transgénica de acuerdo con la reivindicación 2, en donde la secuencia de nucleótidos corresponde a un gene de prolamina de arroz de 10kDa rico en azufre.
4. 4. Una planta transgéníca de acuerdo con la reivindicación 3, en donde la secuencia de nucleótidos es un gene de prolamina de arroz de 10kDa rico en azufre como se muestra en la Figura 2.
5. 5. Una planta transgénica de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la secuencia de nucleótidos corresponde a uno de SFA-7 y SFA-8.
6. 6. Una planta transgénica de acuerdo con la reivindicación 5, en donde la secuencia de nucleótidos es SFA-8.
7. 7. Una planta transgéníca de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la planta es una planta de maíz.
8. 8. Una semilla producida por una planta de acuerdo con la reivindicación 1
9. 9. Un método para incrementar el contenido de aminoácidos que contienen azufre en un alimento para animales, comprendido los paso de (i) proveer semillas de una pluralidad de plantas, por lo menos algunas de las plantas conteniendo una molécula de ADN comprendida de una secuencia de nucleótidos que corresponden a un gene de prolamina de arroz rico en azufre o un gene de albúmina 2S de girasol rico en azufre, ligado operablemente a un promotor para efectuar la expresión de la secuencia de nucleótidos por las plantas; y (ii) procesar las semillas en un alimento para animales.
10. 10. Un método de acuerdo con la reivindicación 8, en donde las plantas son plantas de soya.
11. 11. Un método de acuerdo con la reivindicación 10, en donde la secuencia de nucleótidos corresponde a un gene de prolamina de arroz de 10kDa rico en azufre.
12. 12. Un método de acuerdo con la reivindicación 9, en donde la secuencia de nucleótidos corresponde a un gene de albúmina 2S de girasol rico en azufre.
13. 13. Un producto de alimento que contiene harina de soya obtenida de la semilla de una planta transgénica de acuerdo con la reivindicación 1.
14. 14. Un producto de alimento de acuerdo con la reivindicación 13, en donde el producto de alimento no tiene que ser suplementado por la adición de aminoácidos que contienen azufre.
15. 15. Un método para alterar una planta con el fin de producir semillas que contienen niveles de aminoácidos que contienen azufre que son superiores de aquellos de una planta no alterada, comprendiendo los pasos de (i) proveer células o tejidos de una planta transformada sin un vector de expresión que contiene una secuencia de nucleótidos que corresponde a un gene de prolamina de arroz rico en azufre o gene de albúmina 2S de girasol rico en azufre; (¡i) propagar plantas de las células o tejidos transformados; y (iv) seleccionar la propagación adicional de aquellas plantas que producen prolaminas de arroz ricas en azufre o albúmina 2S de girasol rica en azufre.