CN101313071B - 用于生产蛋白的转基因芦荟植物及其相关的方法 - Google Patents

Abstract

本发明可以提供转基因的芦荟植物和用于芦荟植物转化的重组构建体，本发明的方面可以被应用于其他单子叶植物。所述重组构建体可以包含一个或多个编码哺乳动物蛋白的DNA序列，和至少一个能够在芦荟植物中指导所述重组蛋白表达的启动子。本发明还提供用于构建和产生一个转基因芦荟植物的方法。本发明包括同时用数个目的基因转染一个芦荟植物的方法。本发明的所述芦荟植物的制备方法可以提供经济地并更安全地大量生产某些生物活性化合物的可能并且更容易为不富裕国家所接受，所述化合物包括用于疾病治疗、诊断和预防的生物药剂。所述芦荟植物产生方法还可以制备用作化妆品的蛋白。

Description

用于生产蛋白的转基因芦荟植物及其相关的方法

相关专利申请的交叉引用

本专利申请要求2005年9月26日提交的名称为“TRANSGENICALOEPLANTSFORPROCUTIONOFPROTEINSANDRELATEDMETHODS”并且指定序列号为60/720,540的美国临时申请的优先权和权益，该申请全文通过引用的方式纳入本文。

技术领域

本发明涉及转基因单子叶植物，并且更具体地涉及转基因芦荟植物，以及用于产生转基因芦荟植物的方法和组合物，和从所述转基因芦荟植物提取蛋白的方法。

背景技术

具有生物活性的蛋白有持续增长的市场，许多的所述生物活性蛋白被应用于治疗目的。目前已有超过160种市售的基于蛋白的药物。未来的两年，另外还有大约50种有希望被批准。现在对治疗性蛋白生产的需求已经超过了工业的产能。为了克服这个问题，预计所述工业的产能需要提高4-5倍。然而，这些治疗性蛋白的生产设备昂贵，并且其建造需要较长的时间。因此，需要更加低成本的生产方法，并且需要所述方法能够缩短达到大规模生产所需要的时间。

可以使用一些基于动物的蛋白生产方法。但是，这些方法经常会引入疾病造成的健康风险。这样的风险可能来自于疾病的交叉感染，所述疾病可以同时感染所述动物和例如人类患者的最终使用者。因此，存在一个对生产方法的需求，所述方法需要消除所述生产生物和所述终端使用者之间的交叉感染的可能性。

另外，许多现有的生产方法需要大量的处理，以从所述动物或产生治疗性蛋白的其他宿主生物中提取所述治疗性蛋白，并且使所述化合物处于患者可以利用的状态。经过纯化以后，可以将所述蛋白与佐剂或其他载体材料结合以稳定所述蛋白并且使患者可以利用。然而，涉及对治疗性蛋白处理的提取、纯化、在其他溶剂中的再悬浮的过程是复杂和繁琐的，并且可能不利于在对治疗有普遍需求的发展中国家中使用。因此，需要一个简化生产方法，所述方法可以消除或减少治疗性蛋白的提取后处理。

发明内容

根据本发明的组合物和方法可以解决上述的许多的需求和缺陷，并且将会提供另外的改进和优点，本领域技术人员通过阅读本发明公开的内容将会理解这些改进和优点。

在一方面，本发明可以提供一种稳定地整合目标基因的转基因芦荟植物。在另一方面，可以提供新的载体和构建体，以将目标DNA序列整合进芦荟植物的基因组中。所述目标序列可以编码一种生物活性的蛋白。所述生物活性的蛋白可以是干扰素、免疫球蛋白、淋巴因子、生长因子、激素、血液因子、组织相容性抗原、酶、化妆品用蛋白和其他哺乳动物蛋白，或其他目标蛋白。在某些方面，所述目标蛋白是人类蛋白。根据本发明的芦荟植物可以将目标基因转录并翻译成目标蛋白。在一方面，至少一些所述的目标蛋白可以易位到所述芦荟叶的中央部分。在其他方面，所述的目标蛋白可以包含一个信号序列以便于其易位到所述芦荟叶的中央部分。在其他方面，可以提供从芦荟植物上分离单细胞的新方法。仍然在其他的方面，本发明可以提供新的方法，所述方法用于将载体整合到芦荟植物中，并且再生这样的转基因芦荟植物。

根据本发明的产生哺乳动物蛋白的转基因芦荟植物可以提供用于生产目标蛋白的、更加经济的可行的选择，所述的目标蛋白例如各种生物活性的蛋白和化妆品用蛋白。在一方面，所述的目标蛋白可以定位于和/或集中在所述芦荟叶的凝胶中。所述的目标蛋白的这种定位可以简化从所述植物中移出所述蛋白。在这方面，所述的目标蛋白可以与位于所述芦荟叶中央部分的非变性凝胶被共提取。因此，本发明可以提供一种转基因植物，与例如烟草和玉米的大部分的转基因植物相比，通常可以更容易地从所述转基因植物获得目标蛋白。而且，本发明可以提供有效的蛋白分离方法。仍然在其他的方面，所述的目标蛋白可能不是特别地位于所述芦荟植物中。然而，所述芦荟植物的解剖学和生理学仍然可以提供生产目标蛋白的某些其他的优点，本领域的技术人员通过阅读本公开内容将可以理解这些优点。

与在细菌和酵母中的产生目标蛋白的常规方法相比，芦荟植物有各种优点。芦荟植物10的所述优点可以包括以某些方式加工蛋白的能力，所述方式不适合于简单的单细胞细菌和酵母，并且是产生具有所需形式的蛋白必须的。例如，这种加工可以包括化学修饰(例如通过糖基化)和某些蛋白的折叠。而且，与基于动物细胞的其他蛋白生产方法相比，芦荟植物生产可以提供显著的成本优势、规模优势和减少可能对人有害的污染的危险。

来自根据本发明的转基因芦荟植物的芦荟叶的中心部分的蛋白修饰凝胶从所述芦荟植物取出就可以被直接应用。这可以避免相对复杂的和昂贵的从天然植物材料中提取目标蛋白的过程。在某些方面，从所述叶中提取的凝胶不需要蛋白的提取或处理就可以被直接应用。所述凝胶可以以髓心的形式，所述髓心是从转基因芦荟植物的断裂叶的脱落部分机械地提取的。

本发明可以为具有生物活性和/或具有化妆品用途的人和其他哺乳动物蛋白的生产提供经济、可行的选择。

通过阅读本公开内容，本领域技术人员将会理解本发明的其他改进和优点。

附图说明

图1显示芦荟叶的横断面解剖的一个实例；

图2显示产生胼胝体组织的示例性方法；

图3用图表概述了产生转基因芦荟植物的各个步骤；

图4用图表显示包含序列信息的质粒载体的组件；

图5列出来自玉米的泛素启动子的序列信息，并且突出显示了所述泛素启动子区域；

图6A和6B显示根据本发明的方面的质粒载体系统的构建；

图7A至7C显示根据本发明的方面的另一个质粒载体系统的构建；

图8显示根据本发明的方面的另外一个质粒载体系统的构建；和

图9显示根据本发明的方面的整合系统的构建。

所有的附图的显示仅仅是为了易于解释本发明的基本教导；在阅读如下的说明之后，所述附图关于各种实施方案的数量、位置、序列、关系和组分的扩展将能够被本领域的技术人员解释或者将在所述技术人员的理解范围内。而且，在阅读如下的说明之后，用于实践本发明的各种方案、工具和组合物将在本领域的技术人员的理解范围内。

具体实施方式

本说明书中使用的，“一”或“一种”可能指一种或多种。如在权利要求中使用的，当与词语“包含”一块使用的时候，词语“一”或“一种”可能指一种或多于一种。如本文使用的“另一种”可能指至少第二种或更多。

本文使用的，一种“转化的芦荟细胞”指一种用稳定整合的、非天然的、重组DNA转化(例如农杆菌介导的转化或者通过使用包被有重组DNA的微粒或其他方法轰击)的植物细胞。本发明的一种转化的芦荟细胞可以是一种原始转化的以一种微生物或者作为一种子代植物细胞形式存在的植物细胞，所述子代植物细胞再生成分化的组织，例如再生成具有稳定整合的、非天然的重组DNA的转基因芦荟植物10，或者衍生自子代转基因芦荟植物10的种子或花粉。

本文使用的“转基因芦荟植物”指一种基因组被稳定整合的重组DNA改变的芦荟植物。一个转基因的芦荟植物10包括从一个原始转化的芦荟细胞再生的芦荟植物，以及来自转化的芦荟植物10的后代或杂交的子代转基因芦荟植物。

本文使用的“重组DNA”指经过基因工程改造并且在细胞外构建的DNA，包括含有天然存在的DNA、cDNA、合成的DNA和/或其他DNA。

本文使用的“启动子”指起始转录的调控DNA。“植物启动子”是能够起始芦荟细胞中的转录的启动子，不管它是否来自于芦荟细胞，例如，众所周知农杆菌启动子在芦荟细胞中起作用。因此，植物启动子包括从植物、植物病毒和细菌(例如农杆菌和短根瘤菌)获得的启动子DNA。受发育控制的启动子的实例包括优先在在特定组织中起始转录的启动子，所述组织例如叶、根或种子。这些启动子指的是“组织优选的”。仅仅在特定组织中起始转录的启动子指的是“组织特异性的”。一种“细胞类型”特异性的启动子主要地驱动在一种或多种器官中的特定细胞类型内的表达，例如在根或叶中的维管细胞。“可诱导的”或“可抑制的”启动子是一种受环境控制的启动子。可能影响诱导型启动子转录的环境条件的实例包括缺氧条件、或者特定的化学试剂、或者光的存在。组织特异性的、组织优选的、细胞类型特异性的和诱导型的启动子构成“非组成型”启动子的类。“组成型的”启动子是一种在大部分条件下有活性的启动子。所述启动子可能包含增强子或其他元件，所述其他元件影响转录的起始、转录的起始位点、转录的水平、转录的末端位点或者所产生的核糖核酸的任何的后处理。

本文使用的术语“遗传构建体”被限定为一段包含人工排列的至少两个DNA片段的DNA序列，所述DNA序列是为了产生一种转基因的芦荟植物。在一个具体的实施方案中，一个片段是一个调控序列，并且另一个片段编码一种基因产物。

本文使用的“有效连接(operablylinked)”的意思是在一个DNA构建体中联合两段或多段DNA片段，以至于一段的功能(如编码蛋白的DNA)被另一段调控(例如启动子、终止序列等)。

本文使用的术语“转录”被限定为从一个DNA模板生成一个RNA分子。

本文使用的术语“翻译”被限定为从一个RNA模板生成一个多肽。

本文使用的“表达的”指产生的，例如，当一个蛋白的对应的DNA被转录成mRNA时，所述mRNA被翻译成一个蛋白，所述蛋白在植物细胞中表达。

本发明可以提供表达各种目标蛋白的新转基因芦荟植物10、可以提供产生转基因芦荟植物10的方法和组合物、可以提供从所述转基因芦荟植物10中提取蛋白的方法，并且可以提供来自所述转基因芦荟植物10的组分与目标蛋白的新组合物。根据本发明产生的目标蛋白可以包含一个分泌信号，以帮助所述蛋白在所述髓心18中或者在芦荟叶12的髓心中蓄积。在一方面，这种蓄积可以至少部分地出现在转基因芦荟植物10的叶的musalegenous细胞中。

所述髓心18或芦荟叶12的浆包含所述叶的组分，当从所述芦荟叶12提取所述组分的时候，所述叶的组分通常至少部分地指的是“凝胶”。本文使用的“凝胶”将指所提取的髓心18和其他相关物质，在从所述芦荟叶12中提取髓心18的时候所述相关物质伴随于所述髓心18，而不管后续处理的程度。根据本发明的一个或多个方面，来自所述芦荟叶12的凝胶可以有修饰组分。在一个具体方面，所述凝胶的组分可以被修饰为包含至少一种外源性的蛋白组分，并被称为“蛋白修饰凝胶”。提取含有相关的目的蛋白的蛋白修饰凝胶可以提供容易获得的蛋白和/或有效的蛋白分离的方法。根据本发明产生和/或提取的蛋白修饰凝胶不需要进行蛋白提取就可以直接被应用。

出于示例性目的，本发明的方面通常显示在图1至8中。本发明可以提供转基因植物、组合物，以及通常可以被应用于百合家族的芦荟属的方法。典型地，对本发明的描述参考了在物种中的应用，所述物种选自于芦荟(Aloevera)(库拉索芦荟)、开普芦荟(Aloeferox)、木立芦荟(Aloearborescence)。所述芦荟属通常包括一组大的无茎、丛生、多质单子叶植物。这些植物通常指用于本公开内容目的的芦荟植物10。

芦荟植物产生的各种化合物已经被应用于药用目的。当存在于一种蛋白修饰凝胶中的时候，这些化合物可以补充根据本发明的转基因的芦荟植物10的生物活性蛋白的药学性质。图1显示转基因的芦荟植物10的芦荟叶12的横断面。所述转基因的芦荟植物10的叶包含一种容易提取的凝胶状蛋白混合物、碳水化合物和所述凝胶中包含的水，所述凝胶主要来自于髓心18。该凝胶状混合物主要位于芦荟叶12的中心区域。已经显示所述凝胶中的各种化合物具有多种药用性质和应用。在一方面，所述凝胶和/或髓心18可以稳定转基因的芦荟植物10产生的、并且位于所述凝胶和/或髓心18中的转基因蛋白。

图1特别地显示表皮14、皮层或叶肉16和髓心或髓18。所述表皮14形成所述叶的外层细胞。在本发明的一个方面，一个转基因的芦荟植物10可以包含位于一种或多种这些组织中的芦荟细胞，所述细胞暂时地或稳定地整合一种遗传的构建体，所述遗传构建体被所述芦荟细胞表达。所述皮层16包含富含叶绿体，以及维管束、木质部和韧皮部的细胞。所述髓心18是海绵状的薄壁组织并且至少部分地代表所述凝胶，所述薄壁组织几乎仅由大的皮层细胞组成，所述凝胶可以有助于整合或蓄积一种或多种目标转基因蛋白。

所述表皮14通常由单外层细胞组成。就在所述表皮14的下面是包含维管束网络的皮层16。所述维管束的外支撑通常由鞘细胞提供。所述维管束由三种常见的管状结构组成：木质部、韧皮部和相关的大的中柱鞘管。所述木质部将水和矿物质从所述植物的根运送到叶。所述韧皮部在整个植物中运输淀粉和其他合成的物质。所述中柱鞘管包含一种胶乳或树液，所述胶乳或树液含有非常多的轻泻剂蒽醌，特别是芦荟素。所述蒽醌吸收太阳的紫外线，并且防止所述芦荟叶12的中央部分过热，所述芦荟叶12通常的功能是作为所述芦荟植物的水贮藏器官。所述维管束的中柱鞘部分附着到所述表皮14上，而所述维管束的剩余部分突出到所述髓心18中。所述芦荟叶12的最里面和主要部分是髓心18，所述髓心18至少部分地组成所述凝胶。为了提取凝胶，通常认为所述表皮14和皮层16可以包括含有凝胶的鞘。所述提取的凝胶(包含大量的髓心18)通常是稠的并粘的物质，所述物质在历史上为了医学的目的已经被局部应用于皮肤上，例如作为一种烧伤和创伤的治疗物。

所述凝胶通常的功能是作为所述芦荟植物的物质的蓄积器。所述皮层16通常合成多种碳水化合物和糖蛋白，所述碳水化合物和糖蛋白是所述芦荟植物需要的。过量合成的碳水化合物通常被转运到髓心18，与水和某些矿物质一块储存。所述碳水化合物被韧皮部管转运到髓心18的皮层16的细胞的大液泡。然后，因为渗透压的原因水被所述碳水化合物吸收，从而使所述髓心18作为所述芦荟植物的水贮藏器官。

通过沿其纵轴破碎芦荟叶12并且挤压所述叶，将周围的鞘中的所述凝胶通过所述断裂面挤出来，可以相对容易地提取所述凝胶。可以将其他的物质与所述凝胶一块从所述叶组织中提取出来。

方法概述

根据一个或多个本发明的转基因的芦荟植物10通常包含一种或多种DNA构建体，所述DNA构建体稳定地整合在所述植物中以表达一种或多种目标蛋白。根据一个或多个本发明产生一个转基因的芦荟植物可以涉及各种新的组合物和方法。典型地，开发一种或多种DNA构建体以在所述转基因的芦荟植物10中表达一种或多种蛋白。在一方面，单独一种构建体可以表达一种mRNA。在另一方面，单独一种构建体可以表达多种mRNA。在又另一方面，多种构建体可以产生多种mRNA。每种mRNA可以产生一种或多种多肽。

为了将所述构建体引入到所述芦荟植物中，芦荟细胞或未分化的胼胝体组织通常被应用，如图2的一般性地显示。所述芦荟细胞和胼胝体组织典型地来自于根或叶分生组织，或者来自于一个芦荟植物的种子。使用许多如图3中图表显示的技术和/或构建体，将所述DNA构建体引入所述芦荟细胞中。通过阅读本公开内容，本领域的技术人员将会知晓某些技术。可以使用各种技术筛选已整合有所需构建体的芦荟细胞或胼胝体组织。典型地，所述DNA构建体将包含一种选择性标记。一旦将目标构建体稳定地引入所述芦荟细胞或胼胝体组织，通常从所述芦荟细胞或胼胝体组织产生芦荟的小植物。可以发育成为包含所述DNA构建的活的转基因的芦荟植物10的芦荟小植物可以组成型地表达或者诱导性地表达目标的一种或多种目标蛋白。依赖于所产生的特定的蛋白和/或是否存在所述蛋白相关的信号序列，目标蛋白可以在所述转基因的芦荟植物10的局部，或者在所述转基因的芦荟植物10的全株中普遍存在。依赖于所述特定的构建体和/或相关的目标蛋白，然后可以通过无性或者有性的方式繁殖所述转基因的芦荟植物10。可以使用许多技术以从所述转基因的芦荟植物10中分离所述蛋白。然后可以进一步地分离和/或进一步地处理所述蛋白。这些处理可以包括酶修饰、化学修饰、掺入合适的佐剂，这些处理以及其他处理对本领域的技术人员来说通过阅读本公开内容后是可以知晓的。在一个方面，可以处理所述蛋白，将它从一种非活性(前体)的形式转变成一种活性形式，以进行所述特定蛋白的具体的应用，。

细胞的分离

如图2中的示例性序列所示，在整合目标构建体之前，通常从一个芦荟植物中分离芦荟细胞或者芦荟细胞群。通常基于其再生能力来选择用于DNA构建体的芦荟细胞类型。可以使用来自芦荟植物的茎分生组织或根分生组织的分生细胞或者来自芦荟种子的胚的芦荟细胞。然而，所述芦荟植物的许多部分保持再生或形成胼胝体组织的能力，并且也可以使用所述部分。通常可以使用许多技术分离所述细胞，本领域的技术人员通过阅读本公开内容将会知晓所述技术。典型地，使用解剖刀机械地从所述芦荟植物分离所述细胞。或者，其他机械的或非机械的技术可以被应用于分离目标细胞，这是本领域的技术人员通过阅读本公开内容后可以知晓的。一旦分离了合适的芦荟细胞或者芦荟细胞群，通常使所述芦荟细胞在培养基中生长以形成胼胝体组织。虽然某些技术不需要所述芦荟细胞首先生长成胼胝体组织，但是所述胼胝体组织提供了未分化芦荟细胞的集合的来源，所述未分化芦荟细胞保持产生转基因的芦荟植物10的能力。所述胼胝体组织通常在固体培养基上生长。然而，所述胼胝体组织也可以被置于液体培养基中，并且悬浮生长。

所述分生细胞可以从芦荟植物的根尖或叶中分离。分生芦荟细胞也可以从顶端分生组织中分离。典型地，用于分离所述组织的芦荟植物是年轻健康的芦荟植物。通常选择的所述芦荟植物不高于八(8)英寸，并具有六(6)个或少于6个的出生茎。通常通过切割成段在一个芦荟植物的茎上形成创伤。所述创面可以刺激所述芦荟细胞生长。通常，所述胼胝体将主要在所述切表面上开始生长。为了从芦荟叶12分离芦荟细胞，通常从新生枝的远端切段。然后将所述段部分置于生长培养基上。枝顶端分生组织源自于距新生芦荟植物的底端一英寸处的切割。将所述芦荟叶12从所述切面去除，并且防止所述段。在所述“切口”中发现所述分生组织芦荟细胞。通过它们在培养皿上不断生长—形成胼胝体组织或再生枝的能力“选择”或“分离”它们。一旦分离所述分生组织芦荟细胞，就将它们培养在合适的培养基上，并且处于促进胼胝体组织形成的条件下。

从种子分离所述胚的芦荟细胞通常包括去除所述种皮以暴露所述胚，并且从所述胚机械地剥离目标芦荟细胞。所述芦荟种子经典型地灭菌处理，并且除去所述种子的外壳。为了从芦荟植物或者芦荟胚机械地移出所述芦荟细胞，通常可以使用解剖刀。一旦从所述种皮中分离胚的芦荟细胞，就将它们培养在合适的培养基上，并且处于促进胼胝体组织形成的条件下。

当需要胼胝体组织时，所述分离的芦荟细胞通常在有利于胼胝体组织的条件下生长，这是本领域的技术人员通过阅读本公开内容可以知晓的。典型地，将所述分离的芦荟细胞在合适的固体营养培养基中放置并生长，以在转化之前形成直径大约为1cm大小的胼胝体组织。芦荟细胞通常生长在摄氏23-26度下。合适的培养基包括基础固体或液体培养基，所述培养基将通常包含补充的无机营养素—常量元素(例如氮、硫、磷、钙、镁和钾)和微量元素(例如铁、硼、钴、铜、碘、锰、钼和锌)；包括糖(蔗糖或麦芽糖)和维生素以及辅因子(硫胺素、烟酸、生物素、吡哆素、尤其是肌醇)的有机营养素；氨基酸(例如脯氨素和酪蛋白水解产物)；以及主要是生长素的源(通常是(NAA)，1-萘乙酸；(IAA)，吲哚-3-醋酸；或(2，4-D)，2，4-二氯苯氧代乙酸)和细胞分裂素的源(通常为(BAP)6-苄氨基嘌呤)的生长调节剂。这些培养基和维生素通常是以预配制的组合物的形式市售，所述组合物具有各种浓度的无机营养素和维生素，并且已知有MS培养基(Murashige-Skoog)、Gamborg培养基或ChuN6培养基。另外，在培养皿(Petridishe)上生长的细胞通常需要固体基质载体，例如在所述生长培养基中加入琼脂。

DNA构建体的形成

合适的DNA构建体通常被引入到由分离的芦荟细胞衍生的胼胝体组织，以通过形成转基因的芦荟植物10产生目标蛋白。也可以将DNA构建体引入分离的芦荟细胞或成熟的芦荟细胞，这是本领域的技术人员通过阅读本公开内容后可以知晓的。为了增殖所述构建体并且将其引入所述芦荟细胞，DNA构建体通常被整合进入载体(例如质粒或病毒)中。一种示例性质粒载体可以包括由Invitrogen(Carlsbad，California)生产的商品名为pZErO的质粒，出于示例性目的显示在图4的图表中，并且，例如可以包含该质粒的一种或多种功能组件。

根据本发明的DNA构建体可以包括能够在芦荟细胞中起作用的启动子序列、编码目的蛋白的序列、终止序列和能够在芦荟细胞中起作用的翻译起始和终止位点。当正确地配置并组合这些组件的时候，它们可以在芦荟细胞中启动DNA的转录和mRNA的翻译，以及它们各自的终止。所述DNA构建体还可以包括分泌信号。另外，一些目标蛋白，例如干扰素，可以包含一个天然的或合成的结构域，所述结构域指引干扰素的分泌。当所述蛋白离开所述细胞的时候这些分泌信号通常会被切下来，或者在某些情况下这些分泌信号可以保持在所述蛋白上而基本上不影响所述蛋白的功能。可以将分泌信号加到各种需要分泌信号来进行易位的蛋白上。这些分泌信号可以来自于各种植物的分泌序列。所述DNA构建体或一种相关载体也可以包含至少一种可选标记。在一方面，所述DNA构建体可以包含用于所述载体在细菌中的增殖的第一可选标记，和一种用于在芦荟细胞中生长的可选标记。另外，所述DNA构建体可以包含其他的调控元件，所述元件也是为了在所述芦荟植物10中的特定芦荟细胞中表达。其他构建体元件可以包含额外的调控元件，例如增强转录的5’端引导序列和内含子、3’端非翻译区(例如多腺苷酸化信号和位点)、运输肽的DNA。目标DNA序列(例如编码目标治疗蛋白的序列)的扩增可以通过多聚酶链反应来实现(参见编号为4,683,202和5,928,906的美国专利，均通过引用纳入本文)。通过阅读本公开内容，本领域的技术人员将会明白，使用本领域的技术人员已知的方法可以修饰所述DNA构建体以改变它们的功能，所述DNA构建体包括启动子序列、调控序列、稳定序列、靶向序列和/或终止序列。

如上文所述，通常可以使用一种在芦荟细胞中起作用的启动子。所述启动子通常包含调控蛋白和分子可以结合的遗传元件。这些蛋白通常包括RNA聚合酶和其他转录因子。所述启动子可以在一个功能位置和/或方向上与核酸序列可操作地连接，以控制该序列的转录起始和/或表达。可以将所述启动子与或者不与一个“增强子”连接，所述增强子是指一种顺式作用调控序列，所述调控序列涉及一段核酸序列的转录激活。

自然地，使用一种启动子和/或增强子是重要的，所述启动子和/或增强子在表达必需的芦荟植物10的至少一种细胞类型中可以有效地指导所述DNA片段表达。那些分子生物学领域的技术人员通常知晓启动子、增强子和细胞型组合在蛋白表达中的用途，例如参见Sambrooketal.(1989)，通过引用的方式纳入本文中。所述使用的启动子可以是组成型的、组织特异性的、诱导型的和/或在合适的条件下起作用的启动子，以指导所述引入的DNA片段的高水平的表达，这对于大规模生产重组蛋白和/或肽是有利的。所述启动子可以是异源的或者内源的。所述DNA构建体通常需要能够在芦荟细胞中起作用的转录和翻译起始和终止调控信号。可以使用大量的调控转录起始的序列。控制转录起始的DNA序列可以来自于农杆菌、病毒或植物。来自花椰菜花叶病毒的35S病毒转录起始区域(35S-CaMV)可以被用于芦荟植物10。可以被应用于芦荟植物10的植物启动子还可以包括来自各种单子叶或双子叶植物的核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶(RUBISCO)小亚基启动子或者来自玉米的泛素启动子。可以使用其他合适启动子，并且这是本领域的技术人员通过阅读本公开内容后可以知晓的。如果需要诱导型调控，那么结构域可以来自不同的来源，使得来自一个来源的调控区域与来自另一个来源的RNA多聚酶结合结构域组合。表达的调控可以是在转基因的芦荟植物的10发育的特定阶段、在所述转基因的芦荟植物10的特定部分(如根、叶、种子、花、树液)中，或者可以是在植物部分和发育阶段的组合中。对一个特定发育阶段或组织的表达调控可能需要其他的DNA元件，这是本领域的技术人员通过阅读本公开内容后是可以知晓的。

许多在植物细胞中有活性的启动子已经在文献中有所描述，并且可能被应用于芦荟细胞中。它们包括存在于植物基因组中的启动子，以及其他来源的启动子，包括：根瘤土壤杆菌的根瘤诱导质粒上携带的胭脂碱合酶(NOS)启动子和章鱼碱合酶(OCS)启动子；和例如花椰菜花叶病毒的花椰菜花叶病毒启动子。另外，在各种参考文献中也已经鉴定了各种其他的启动子，所述参考文献包括但不限于编号为5,858,742和5,322,938的美国专利，所述专利公开了来自于花椰菜花叶病毒(CaMV35S)的组成型启动子版本；编号为5,641,876的美国专利，所述专利公开了一种水稻肌动蛋白启动子；公布号为2002/0192813A1的美国专利申请，所述申请公开了在有效植物表达载体设计中有用的5’，3’和内含子元件；序列号为09/757,089的美国专利申请，所述申请公开了一种玉米叶绿体醛缩酶启动子；序列号为08/706,946的美国专利申请，所述申请公开了一种水稻谷蛋白启动子；序列号为09/757,089的美国专利申请，所述申请公开了一种玉米醛缩酶(FDA)启动子；和序列号为No.60/310,370的美国专利申请，所述申请公开了一种烟胺合酶启动子，所有这些专利和专利申请通过引用的方式纳入本文。这些和大量的在植物细胞中发挥功能的其他启动子可以被应用于转基因芦荟植物中，用于表达目标治疗蛋白。

作为一个具体的实例，可以使用来自玉米的所述泛素启动子(SEQ.ID.NO.44)。所述来自玉米的泛素启动子是一个大的元件，接近2kb长，它由至少三段普通区域组成。所述的启动子的序列在图5中给出，并且标出了特别相关的特征。所述泛素启动子的第一段位于最5’端，并包含基质结合区(MAR)，所述MAR是与组蛋白和其他核蛋白相互作用的元件，并且作为“伸向环外的”侧翼序列，使之更易于接近所述细胞转录装置。它们也协助将转录元件彼此分开，这对于防止在一个位置起始的转录“通读”到第二个序列是重要的。这可以有利于减少形成反义信使的危险。

所述第二段包含增强子元件和真正的启动子。所述增强子元件结合转录因子，所述转录因子负责指导所述转录装置(polII复合体)结合启动子并且起始化转录。虽然“启动子”具体地指与所述核心转录起始装置相互作用必需的必要DNA元件，但是所述术语启动子更广泛地被应用于包括涉及转录起始的所有的DNA元件，并且在这种情况下，所述“泛素启动子”被泛指目标克隆基因5’端的2kb区域或其修饰。

第三段包含一段大约1kb的内含子。内含子是转录的基因的区域，所述区域被通过剪接的步骤从最终翻译的信使(mRNA)中去除。也已经发现，通过备选的增强子元件以及通过促进RNA信使从核到细胞质的易位(部分地与剪接相关的过程)增加蛋白的翻译，内含子可以直接地影响基因表达。然而，在转基因系统中存在内含子不一定总是导致RNA表达或者蛋白翻译水平的提高。在某些方面，所述泛素内含子可以被修饰以减少所述载体的总大小，并且以评估它们对所述芦荟中的转基因表达的作用。

在本发明的其他方面，可能需要在所述芦荟植物的绿色组织中优先表达。这种用途需要的启动子可以包括那些来自于如拟南芥核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶(Rubisco)小亚基(Fischhoffetal.(1992)PlantMoIBiol.20：81-93)、醛缩酶和丙酮酸正磷酸双激酶(PPDK)(Taniguchietal.(2000)PlantCellPhysiol.41(1)：42-48)的基因的启动子。

如前所述，可以改变所述启动子以包含多个“增强子序列”，以协助增强基因表达。这样的增强子是本领域中已知的。通过在这样的构建体中包含一个增强子序列，可以增强所选蛋白的表达。虽然这些增强子通常存在于一个在真核细胞中有功能的启动子的转录起始的5’端，但是也可以将它们插入到所述编码序列的上游(5’)或下游(3’)。在某些情况下，这些5’端增强元件是内含子。作为增强子特别有用的是水稻肌动蛋白1(参见编号为5,641,876的美国专利)和水稻肌动蛋白2基因的5’端内含子、玉米乙醇脱氢酶基因内含子、玉米热休克蛋白70基因内含子(编号为5,593,874的美国专利)和玉米皱缩1基因。

根据本发明的方面的构建体可以包含一个3’端元件，所述元件通常包含一个多腺苷信号和位点。众所周知的3’端元件包括那些来自于根癌农杆菌基因的3’端元件，如nos3’、tml3’、tmr3’、tms3’、ocs3’、tr73’，例如在编号为6,090,627的美国专利中公开的，通过引用的方式纳入本文；来自如小麦(Triticumaesevitum)热休克蛋白17(Hsp173’)、小麦泛素基因、小麦果糖-1，6-二磷酸酶基因、水稻谷蛋白基因、水稻乳酸脱氢酶基因和水稻β微管蛋白基因的植物基因的3’端元件，所有这些元件都在美国公布的专利申请2002/0192813A1中公开，该文献通过引用的方式纳入本文；和豌豆(Pisumsativum)核酮糖二磷酸羧化酶基因(rbs3’)，以及来自宿主植物内部的基因的3’端元件。

可以被整合进所述DNA构建体中的结构基因编码一种目标蛋白。所述结构基因可以是一个哺乳动物基因或哺乳动物基因的一部分。目标结构基因可以编码干扰素、免疫球蛋白、淋巴因子、生长因子、激素、血液因子、组织相容性抗原、酶或其他蛋白。出于示例性目的，干扰素α-2的序列被作为SEQ.ID.NO.33列出。结构基因也可以编码标记蛋白，例如来自水母的绿色荧光蛋白(GFP)。可以修饰所述结构基因的DNA序列以使其在芦荟植物10中高水平表达。所述芦荟植物10的密码子偏好可能不同于用于分离所述结构基因的原始物种的密码子偏好。可以改造天然的结构基因以优化所述芦荟植物10中编码的蛋白的产生。此外，可以改造所述结构基因的DNA序列以在芦荟植物10中提供合适的糖基化，所述糖基化不影响所述蛋白的结构。

可以通过能够在芦荟植物10中起作用的各种转录和翻译终止序列提供转录和翻译的终止。在一方面，所述终止序列可以包括来自于农杆菌的胭脂碱合酶(NOS)基因的序列。在另一方面，所述终止序列可以衍生自芦荟本身的基因和蛋白的终止序列。

在所述DNA构建体中经常整合一个标记基因。利用所述标记基因，可以从所有不包含所述标记基因的细胞群中选择包含目标基因结构的细胞。标记基因可以包括酶或其他蛋白，所述其他蛋白提供卡那霉素、氯霉素、G418和庆大霉素等抗性。如果以例如农杆菌作为一种载体，那么可能还需要其他特异性的DNA序列。如果所述DNA被定位于特定的细胞类型，那么可以有其他区域。

如上文所述，所述DNA构建体也可以包括一种分泌信号。构建体还可以包含编码一种信号肽的易位序列，所述信号肽可以定位所述治疗蛋白，用于将所述蛋白从产生它的细胞中移出。在文献中已经鉴定了多种信号序列，所述信号序列在植物中发挥作用，更具体地说是在如芦荟植物的单子叶植物中发挥作用。这些信号序列可以被可操作地整合进入所述构建体中或者目标基因中。在一个方面，可以使用来自于水稻(Oryzasativa)的α淀粉酶分泌序列(SEQ.IDNO.29)。对这个信号序列的特征的描述参见″Thealpha-amylasegenesinOryzasativa″MoIGenGenet.，1990April；221(2)：235-44，它的全文通过引用的方法纳入本文。或者，一些目标基因——例如干扰素——可以包含一个结构域(天然的或合成的)，所述结构域指导干扰素的分泌。所述分泌信号在所述蛋白离开细胞时被切掉，或者在某些情况下，可以被所述蛋白保留而基本上不影响所述蛋白的功能。分泌信号可以被加到各种需要分泌信号进行易位的蛋白上。这些分泌序列可以衍生自各种植物分泌序列。

图6A至6B显示构建体的示例性集合，所述构建体用于从芦荟植物产生蛋白。用pzUI(TGC9)标记所述质粒构建体。TGC9包含启动人干扰素α-2和pzUEK(TGC12)(SEQ.ID.NO.38)表达的全长的泛素启动子、启动包含eGFP(增强的绿色荧光蛋白)(SEQ.ID.NO.31)和卡那霉素抗性蛋白的融合蛋白表达的全长的泛素启动子。所述融合蛋白将两个蛋白(选择和显示)的筛选性质合并为一。

如图所示，使用每条都包含两个不同限制性内切酶位点(引物序列见表I)的PCR引物，通过PCR扩增人干扰素α-2基因产生所述质粒pzI(TGC8)。所述扩增的干扰素(IFN)基因具有5’端的PstI和BamHI侧位点，以及3’端的SacI和XhoI侧位点。所述PCR生成的IFN然后作为一个PstI/XhoI片段克隆进pZErO载体以产生所述构建体pzI(TGC8)，并且为后续的克隆引入所述BamHI和SacI。这个构建体包含全长的IFNα基因和其信号序列，负责指导IFN蛋白从所述细胞的分泌。这显示在滑动图(slide)3上。对这些PCR生成的克隆测序以确定不存在任何的DNA突变。

如图所示，通过将IFNα-2基因克隆到所述全长的泛素启动子的下游产生所述质粒载体pzUI(TGC9)。将所述IFN的PstI/XhoI片段从pzI(TGC8)中释放，并且与pzU(TGC1)连接以产生所述构建体pzUI(TGC9)。这在滑动图3上显示。

如图所示，使用包含BamHI(5’端)和XhoI(3’端)限制性内切酶位点(引物序列见表I)的引物进行eGFP基因的PCR扩增。这个PCR产生的eGFP基因没有终止密码子(以最终使一种eGFP-kan融合蛋白可以被表达)。因此，翻译不在所述eGFP序列末端终止。用限制性内切酶BamHI和XhoI消化所述PCR扩增的片段，并且连接到pZErO的BamHI和XhoI位点中，产生pzEnostop(TGC10)。这显示在滑动图3上。对这些PCR生成的克隆测序以确定不存在任何的DNA突变。

如图所示，pzEK(TGC11)形成一种eGFP基因和卡那霉素抗性基因之间的融合构建体。将eGFP以BamHI/XhoI片段形式从pzEnostop(TGC10)释放，并且与pzK(TGC4)连接以产生所述构建体pzEK(TGC11)。所述eGFP基因被克隆到阅读框内，并且在kan/nos(SEQ.ID.NO.35)的5’端。

如图所示，包含eGFP/kan/nos盒的来自pzEK(TGC11)的BamHI/XbaI片段被克隆到pzUI(TGC9)的BamHI和XbaI位点，以使eGFP/kan融合基因可以表达。所述IFN序列因此被去除。这个新构建体(pzUEK(TGC12))从全长的泛素启动子(在滑动图4中描述)开始表达所述eGFP/kan融合蛋白。该融合蛋白保持每个单独的蛋白的特性，并且因此明显同时具有显示标记和选择性试剂双功能。

图7A至7C显示一个其他示例性构建体集合，所述构建体用于从芦荟植物产生目标蛋白。所示载体使两种基因可以作为一个转录子表达，虽然所述转录子仍然被翻译成两个不同的蛋白。为了实现这个目的，通过插入IRES元件(内部核糖体进入序列)(SEQ.ID.NO.34)将两个基因彼此分开。所述IRES元件可为核糖体附着和翻译提供一个第二内部位点。所述第二位点使转录子克隆到所述IRES元件的3’端，以独立地翻译。这些载体，即pzUSEIrK(TGC18)(SEQ.ID.NO.43)和pzUIIrK(TGC19)(SEQ.ID.NO.39)被分步骤地构建，最终使eGFP或IFN(分别地)与所述卡那霉素抗性标记同时表达。

如图所示，通过首先使用包含BamHI(5’端)和SacI(3’端)限制性内切酶位点(引物序列见表I)的引物进行eGFP基因的PCR扩增来产生pzEnostart(TGC13)载体。该PCR产物作为一个BamHI/SacI片段被克隆进pZErO。在这个构建体中的所述eGFP基因缺少ATG翻译起始位点，因为该蛋白是作为与所述α淀粉酶信号序列(见构建体pzSE，TGC14)的融合体表达的。这显示在滑动图5上。对这些PCR生成的克隆测序以确定不存在任何DNA的突变。

如图所示，合成所述α淀粉酶基因的信号序列的一条链，然后通过使用PCR(引物序列见表I)进行填补生成双链。然后，用限制性内切酶PstI和BamHI消化并克隆进pzEnostart(TGC13)。这显示在滑动图5上。所述信号序列被克隆到阅读框中，eGFP的5’端，并且为信号序列eGFP融合体提供翻译起始位点。对产生的pzSE(TGC14)克隆测序以确定不存在任何的DNA突变。

如图所示，构建所述载体pzUSE(TGC15)以将α淀粉酶信号序列(ss)-eGFP融合体与具有泛素启动子相连接。来自pzSE(TGC14)的包含所述ss-eGFP的基因盒被作为一个PstI/SacI片段克隆到pzUI(TGC9)中。这替代所述IFN基因盒(通过用限制性内切酶PstI和sacI消化从pzUI(TGC9)释放)产生pzUSE(TGC15)。这显示在滑动图5上。

如图所示，使用包含SacI(5’端)和XhoI(3’端)限制性内切酶位点的引物进行PCR扩增从pIRES2-EGFP(Clntech，BDBiosciences)产生IRES元件。所扩增的IRES元件作为一个SacI/XhoI片段被克隆到pZErO中以形成pzIr(TGC16)。这显示在滑动图6上。对这些PCR生成的克隆测序以确定不存在任何的DNA突变。

如图所示，然后将来自pzIr(TGC16)的IRES元件作为一个SacI/XhoI片段克隆到pzK(TGC4)中以形成pzIrK(TGC17)。因此，定位所述kan/nos基因盒的IRES上游。

如图所示，所述IRES-kan/nos基因盒作为SacI/XbaI片段被克隆到pzUSE(TGC15)中以形成pzUSEIrK(TGC18)。这显示在滑动图6上。该构建体将eGFP作为与所述α淀粉酶信号序列的融合体表达，定位所述eGFP以从所述细胞中分泌。这使得可视地监视蛋白在所述转化的植物内的运输和聚积成为可能。该载体还表达所述卡那霉素抗性蛋白(由所述IRES内部元件翻译)，并且使得可以在转基因植物中选择。

如图所示，所述IRES-kan/nos基因盒可以作为SacI/XbaI片段被克隆到pzUI(TGC9)中以形成pzUIIrK(TGC19)。这显示在滑动图7上。该构建体表达IFNα-2，它具有用于分泌的信号序列。该载体还表达所述卡那霉素抗性蛋白(由所述IRES内部元件翻译)，并且可以在转基因植物中选择。TGC18和TGC19都以单个的转录子形式表达两个基因，省去了对第二启动子的需求，并且因此缩小了每个载体的总大小。这是重要的，因为缩小转染的构建体的总大小会增加这些元件转移到核中的效率，导致了稳定的整合以及转基因植物的选择。单启动子系统还会降低破坏侧翼基因的表达的风险或者其他可能最终影响转基因表达的情况。

上面列出的质粒可以用其他目标编码序列替代所述α干扰素。如本领域的技术人员知晓的，这些替代可以在所述质粒中的相同位点或者其他位点。

根据本发明的方面，也可以将一种凝血酶原编码序列(SEQ.ID.NO.36)整合进一个质粒载体，如图8中所图示显示的。凝血酶原是凝血酶的前体蛋白。它被活化的因子X(FactorX)在2位切割以释放活化的凝血酶，所述凝血酶是一种凝结蛋白，可以将可溶性的血纤蛋白原转化成不溶的纤维蛋白原带。使用PCR引物(引物序列见表I)扩增所述凝血酶原基因盒(1874碱基对)。利用限制性内切酶BamHI将所述eGFP基因盒从pzUSEIrK(TGC18)载体上释放。随后将所产生的5’突出粘性末端用绿豆核酸酶除去以形成平端。使用小牛肠磷酸酶(CIP)通过在摄氏50度下孵育2个小时进行所述平端的去磷酸化，之后在摄氏15度下与所述凝血酶原基因盒连接过夜。这产生pzUSTIrK(TGC20)(SEQ.ID.NO.42)。对PCR生成的克隆测序以确定不存在任何的DNA突变。

根据本发明的方面，也可以将一种皮离蛋白(Dermcidin)(DCD)编码序列(SEQ.ID.NO.30)整合进一个质粒载体，如图8中所图示显示的。皮离蛋白是一种最近报道的宽光谱抗菌肽，被发现在汗腺中组成型的表达。该蛋白分泌到汗液中，并且被转运到表皮的表面。所述PCR扩增的DCD基因盒具有侧翼的BamHI限制性内切酶的位点(引物序列见表I)。所述BamHI消化的DCD基因盒与原来被eGFP占据的pzUSEIrK(TGC18)的BamHI位点连接，形成pzUSDIrK(TGC21)载体(SEQ.ID.NO.40)。对PCR生成的克隆测序以确定不存在任何的DNA突变。

根据本发明的方面，也可以将一种人生长激素(hGH)编码序列(SEQ.ID.NO.32)整合进一个质粒载体，也如图8中所图示显示的。所述hGH基因盒通过PCR扩增产生，具有侧翼的BamHI限制性内切酶的位点(引物序列见表I)。然后将所述BamHI消化的hGH基因盒与原来被eGFP占据的pzUSEIrK(TGC18)的BamHI位点连接，形成pzUSHIrK(TGC22)载体(SEQ.ID.NO.41)。对PCR生成的克隆测序以确定不存在任何的DNA突变。

根据本发明的方面，也可以将一种人干扰素γ(hIFNg)编码序列整合进一个质粒载体，也如图8中所图示显示的。所述hIFNg基因盒通过PCR扩增产生，具有侧翼的BamHI限制性内切酶的侧位点(引物序列见表I)。然后将所述BamHI消化的hIFNg基因盒与原来被eGFP占据的pzUSEIrK(TGC18)的BamHI位点连接，形成pzUSIfgIrK(TGC23)载体(SEQ.ID.NO.37)。对PCR生成的克隆测序以确定不存在任何的DNA突变。

表I用于产生其他表达基因的引物序列表

信号序列 AA pst bam	TATCTGCAGACCATGGTGAACAAACACTT CTTGTCCCTTTCGGTCCTCATCGTCCTCCT TGGCCTCTCCTCCAACTTGACAGCCGGGG GATCC	SEQ.ID.NO.15
			信号序列 AA ss-pcr	GTGAATTCGGATCCCCCGGCTGTCAA	SEQ.ID.NO.16
IRES sac	ATTGAGCTCAAGCTTCGAATTCTGCAG	SEQ.ID.NO.17
			IRES xho	ATACCTCGAGGTGGCCATATTATCATCGTG TTTTTC	SEQ.ID.NO.18
kan xho	ATACTCGAGACCATGATTGAACAAGATG GATTGCAC	SEQ.ID.NO.19
			Kan xba	ATTTCTAGACCAGAGCCGCCGCCAGCATT GACAGG	SEQ.ID.NO.20
凝血酶原F	AAACCATGGCGCACGTCCGAGGC	SEQ.ID.NO.21
			凝血酶原R	CTACTCTCCAAACTGATCAATGA	SEQ.ID.NO.22
皮离蛋白F	GGGGGATCCACCATGAGGTTCATGACTCT C	SEQ.ID.NO.23
			皮离蛋白R	GGCGGATCCCTATAGTACTGAGTCAAGG	SEQ.ID.NO.24
hhghF	GGGGGATCCACCATGGCTACAGGCTCCC GG	SEQ.ID.NO.25
			hghR	GGCGGATCCCTAGAAGCCACAGCTGCCC	SEQ.ID.NO.26
hifngF	GGGGGATCCACCATGAAATATACAAGTT AT	SEQ.ID.NO.27
			hifngR	TCCGGATCCTTAATAAATAGATTTAGA	SEQ.ID.NO.28

这些序列可以包含它们自己的信号序列。与被证明可以在芦荟植物中起作用的α干扰素中的序列类似，在凝血酶原、皮离蛋白(DCD)、人生长激素(hGH)和人干扰素γ(hIFNg)天然信号序列也可以被证明在芦荟植物中发挥功能。无论如何，这些蛋白编码序列可以被克隆到一个包含α淀粉酶信号序列的载体中，如图8的显示的实例。

在开发上述参考构建体的过程中，用于转化的所有载体在含50ug/L的博来霉素的250mlLB中生长，并且使用CsCl方法分离。然后，所述载体被应用于瞬时转染研究中，以确保每种构建体适当表达。使用基因枪进行玉米、土豆和芦荟的转染，并且对eGFP表达进行可视化监视或通过rt-PCR监测IFN或kan的表达。

转化

在生成包含目标基因和整合进载体的功能性的各种功能元件的DNA构建体之后，可以使用多种技术将所述DNA构建体引入到所述芦荟细胞中，所述技术是本领域技术人员通过阅读本公开内容后可以知晓的。通常对这些DNA构建体进行设计以促进稳定转化的芦荟植物10的形成。本领域中已知许多用重组DNA转化植物细胞的方法，所述方法可以被应用到本发明中。用于将包含在载体中的DNA构建体整合进芦荟细胞或组织以形成稳定的芦荟转化体的一些方法可以包括用根癌农杆菌或毛根农杆菌感染、用复制缺陷病毒感染、基因枪转化(biolistictransformation)、原生质体转化、基因转移至花粉中、注射至生殖器官中、注射至未成熟胚中或者类似的方法。现在，两种最常用于植物转化的方法是农杆菌介导的转化和基因枪转化。转化的芦荟细胞或胼胝体组织通常在合适的营养培养基中生长，以筛选转化的细胞。经常地，选择培养基包含一种毒素或其他杀死非转化的细胞的选择因子。培养基的各种改变将会产生包含目标基因的芦荟植物10，这是本领域的技术人员通过阅读本公开内容可以知晓的。

在转化的实施中，任何一次转化实验通常将DNA引入仅少部分的靶植物细胞中。标记基因被应用于为细胞的鉴定提供一个有效的系统，所述被鉴定的细胞是通过将转基因DNA构建体接受和整合进其基因组中以获得稳定的转化。优选的标记基因提供选择性标记，所述标记提供对一种选择剂(例如抗生素或除草剂)的抗性。对于选择性标记来说，被本发明的植物抵抗的任何除草剂都是有用的试剂。潜在的转化的细胞被暴露于所述选择剂。存活的细胞群通常将是整合赋予抗性的基因、并且以足够水平表达以使细胞存活的那些细胞。可以进一步地检测细胞以确定所述外源DNA的稳定整合。通常使用的选择性标记基因包括那些赋予抗生素抗性的基因，所述抗生素例如卡那霉素和巴龙霉素(nptII)、潮霉素B(aphIV)和庆大霉素(aac3和aacC4)；或者赋予除草剂抗性的基因，所述除草剂例如草胺磷(barorpat)和草甘膦(aroA或EPSPS)。这些选择的实例在编号为5,550,318、5,633,435、5,780,708和6,118,047的美国专利中有说明，所有这些专利通过引用的方式纳入本文。也可以使用能够用于可视化鉴定转化体的选择性标记，例如一种表达有色蛋白或荧光蛋白(例如萤光素酶或绿色荧光蛋白(GFP))的基因，或者一种表达β葡萄糖苷酸酶的基因，或者其各种显色底物已知的uidA基因(GUS)。

通常，在一种靶植物系的基因组中随机地引入重组DNA(即在非特异性位点)是有用的。在特定的情况下，靶向重组DNA插入以获得位点特异性的整合可能是有用的，例如替换基因组中存在的基因、使用所述植物基因组中存在的启动子或者在已知会活化基因表达的预定位点插入一段重组多核苷酸。存在几种已知是功能性插入的特异性的重组系统，所述重组系统包括编号为4,959,317的美国专利公开的cre-lox和编号为5,527,695的美国专利公开的FLP-FRT，所述两个专利通过引用的方式纳入本文并且在下文中更详细的叙述。

对于基于根癌农杆菌的植物转化系统，存在于转化构建体上的其他元件将包括T-DNA左侧和右侧序列，以有利于将所述重组体多核苷酸整合进入所述植物基因组中。用农杆菌(根癌农杆菌)侵染，在室温下将芦荟的胼胝体组织与农杆菌的过夜培养物(包含整合有所述DNA构建体的载体)共孵育1个小时。所述农杆菌可以在合适的选择性培养基中生长。所述选择性培养基通常包含链霉素和卡那霉素。所述选择性培养基还可以包含乙酰丁香酮。浓度为50uM-250uM的乙酰丁香酮通常增加单子叶植物侵染性的效率。在所述选择性培养基上生长之后，可以将侵染的芦荟组织转移到培养皿的无选择性培养基中，在摄氏25度下黑暗中维持两(2)天。一种合适的示例性培养基可以是含有乙酰丁香酮的MS培养基。然后可以加入头孢噻肟(cefotaxime)，维持两(2)天以杀死农杆菌。然后为细胞更换含有50mg/L的卡那霉素(用于筛选转化的芦荟细胞)和枝诱导生长因子(0.2mg/LNAA，2mg/LBAP)的培养基，维持四(4)周，16小时光照。然后可以将再生的枝转移至生根培养基中(含0.2mg/LNAA的1/2MS)以生成根(约4-6周后)，之后转移至土壤。

利用基因枪转化，直接用所述载体构建体轰击芦荟细胞或胼胝体组织。基因枪转化的各种实施方案和方面在编号为5,015,580(大豆)、5,550,318(玉米)、5,538,880(玉米)、5,914,451(大豆)、6,160,208(玉米)、6,399,861(玉米)和6,153,812(小麦)的美国专利中公开，并且农杆菌介导的转化在编号为5,159,135(棉花)、5,824,877(大豆)、5,591,616(玉米)和6,384,301(大豆)的美国专利中描述，所有这些专利通过引用的方式纳入本文。此外，可以使用各种基因枪转化的装置，例如Bio-Rad，Inc的BiolisticPDS-1000/He粒子传递系统。在这种方法中，所述载体和关联的DNA构建体可以被绑定在金或其他颗粒上，并且被直接射进所述芦荟细胞。所述被轰击的芦荟细胞在黑暗中无选择性地生长4天，之后被转移到选择性的培养基。同样，所述选择性培养基可以包含50mg/L的卡那霉素。通常在8-12周内开始形成转化体，并且可以将其转移到长枝和生根培养基继续维持8-12周。一旦开始形成根，可以将小植物转移至土壤。

也可以使用各种其他技术实现转化。这些技术包括使用复制妥协的病毒载体系统(replicationcompromisedviralvectorsystem)的病毒感染、电穿孔(特别是对胼胝体细胞或生长在液体培养中的原生质体)，以及PEG或脂质介导的原生质体转移。然后可以按照与基因枪转化的步骤相同的基本步骤进行转化体的选择。

一旦被引入所述芦荟胼胝体组织中，构建体可以被整合进入所述植物的遗传物质中，如图3中一般性显示的。在其他方面，所述构建体可以被稳定地整合到所述芦荟植物10的遗传物质外的细胞中。根据所述构建体，如果没有某种形式的转录诱导中，目标蛋白可以表达也可以不表达。在一方面，构建体一旦被引入芦荟细胞，就可以指导蛋白的合成或者指导运输至所述芦荟10的特定组织。典型地，这在目标蛋白中包含靶向信号序列的时候发生。

位点特异性的整合(Cre-Lox)

在一方面，本发明可以利用位点特异性的整合或切出引入芦荟植物中的DNA构建体。位点特异性的整合或切出的一个优点是它可以被用来克服传统的转化技术涉及到的问题，其中转化构建体通常以多拷贝的形式随机地整合进一个宿主基因组中。如果所述外源DNA插入到一个必需基因中，这种将所要引入的DNA随机插入所述宿主细胞的基因组中可能是致死的。另外，一个转基因的表达可能被“位置效应”影响，所述位置效应是由周围基因组DNA引起。此外，因为与植物处理多转基因拷贝相关的困难，所述困难包括基因沉默、重组和不可预料的遗传，所以通常需要控制插入到所述转基因的芦荟植物10基因组中的DNA构建体的拷贝数量，并且经常仅需要插入单拷贝的所述DNA构建体。

通过同源重组可以在植物中完成转基因或部分的转基因的位点特异性的整合或切出(例如见编号为5,527,695的美国专利，所述专利的全文通过引用的方式明确地纳入本文)。同源重组是任何具有相似核苷酸序列的DNA序列对之间的反应，其中所述两个序列相互作用(重组)以形成新的重组DNA片段。随着所述共享的核苷酸DNA序列长度的增加同源重组的频率增加，并且线性化的质粒分子的同源重组的频率比环形质粒分子高。在两个不完全相同的DNA序列之间可以出现同源重组，但是随着两个序列间差异的增加所述重组频率会降低。

通过将目标DNA分子和与所述宿主细胞的内源序列有同源性的序列连接，通过同源重组可以定向引入的DNA序列。一旦所述DNA进入所述芦荟细胞，所述的两个同源序列可以相互作用，以在所述同源的基因组DNA序列所处位置插入所述引入的DNA序列。因此，对所述引入的DNA上包含的同源序列的选择将决定所述引入的DNA通过同源重组整合的位点。例如，如果目标DNA序列和与一个宿主芦荟细胞的单拷贝基因同源的DNA序列连接，那么目标DNA序列将通过同源重组仅插入到单个特异性位点。然而，如果目标DNA序列和与所述宿主真核细胞的多拷贝基因同源的DNA序列连接，那么目标DNA序列可以通过同源重组在每个所述基因拷贝存在的特异性位点进行插入。

通过涉及单互惠重组(导致插入全长的引入DNA)或者通过双互惠重组(导致仅仅插入位于所述两个重组事件之间的DNA)的同源重组反应，可以在所述宿主基因组中插入DNA。例如，如果希望将一个外源基因插入到一个选定基因所处的基因组位点中，所述引入的DNA应该包含与所述选定的基因同源的序列。然后单个的重组事件会导致所述整个的引入DNA序列被插入到所选定的基因中。或者，通过将目标DNA序列(所述意欲插入到所述基因组中的序列)的每一端侧接与所选定的基因同源的DNA序列，可以实现双重组事件。涉及每个所述同源侧翼区的同源重组事件将导致所述外源DNA的插入。因此，仅仅那些位于共享基因组同源性的两个区域之间的DNA序列可以被整合进入所述基因组中。

虽然引入的DNA序列可以通过同源重组被定向插入到特异性基因组位点，但是在高等真核生物中，与随机插入事件相比，同源重组是相对少的事件。在芦荟细胞中，外源DNA分子在所述芦荟植物的基因组中发现同源序列，并且以大约0.5-4.2×10^-4的频率重组。因此，包含通过同源重组整合的引入DNA序列的任何转化的细胞将也可能包含许多拷贝的随机整合引入的DNA序列。避免这些随机插入的一种方法是使用一种位点特异性重组酶系统。通常，一种位点特异性重组酶系统由三个元件组成：两对DNA序列(所述位点特异性重组序列)和一种特异性酶(所述位点特异性重组酶)。所述位点特异性重组酶将仅催化两个位点特异性重组序列之间的重组反应。

根据本发明，可以使用大量的不同的位点特异性重组酶系统，包括但不限于噬菌体P1的Cre/lox系统(编号为5,658,772的美国专利，所述专利的全文通过引用的方式明确地纳入本文)、酵母的FLP/FRT系统(GolicandLindquist，1989)、噬菌体Mu的Gin重组酶(MaeserandKahmann，1991)、E.coli的Pin重组酶(Enomotoetal.，1983)和pSRl质粒的R/RS系统(Arakietal.，1992)。所述噬菌体P1Cre/lox和酵母FLP/FRT系统组成用于转基因的位点特异性整合或切出的两种特别有用的系统。在这些系统中，一种重组酶(Cre或FLP)将特异性地与其各自的位点特异性重组序列(分别是lox或FRT)相互作用，以反转或切出所述间隔序列。这两个系统的序列相对比较短(lox为34bp并且FRT为47bp)，并且因此方便与转化载体联合使用。

图8显示了使用Flp/Frt和Cre/Loxp重组酶系统的一种具体的示例性方案。在一个这样的系统中，来自噬菌体和酵母的位点特异性重组酶可以被用作在试管中和在活体器官中操作DNA的工具。重组酶/重组位点的组合可以包括Cre-Lox、FLP-FRT和R-RS，其中Cre、FLP和R是重组酶，并且Lox、FRT和RS是重组位点。为了使用这个系统，可以产生一种包含用于重组的特异性位点的转基因植物。通过转染一种载体、表达一种选择性标记并且设计包含串联排列的Frt和Lox位点，产生一种亲代的转基因的芦荟植物10。所述Frt和Lox位点都由三个元件组成，在每个长度都是十三个(13)核苷酸的两个(2)反向重复之间的长度为八个(8)核苷酸的间隔序利。所述反向重复序列作为所述特异性重组酶的DNA结合结构域，而所述间隔元件是可变的，但是对于同源重组是必须的。通过改变LoxP或者FRT位点处的间隔元件，可以产生用于重组的多个不同位点。通过改变Frt和Lox位点，可以形成一个允许多位点定向整合的系统(如在图8中列出的)。该系统可以具有许多优点。生成所述的初始的亲代植物之后，使内源基因的破坏最小。通过位点特异性重组酶的表达可以提高所述转化的效率。使用串联排列的lox和frt位点使得可以选择性的除去选择的标记而保留目标基因。并且一旦形成一株亲代植物，细胞的增殖和再生能力会得到提高。然而，所述亲代植物是第一步，并且按照标准的转化方法(基因枪或农杆菌)形成。通过一种包含LoxP和Frt位点以及目标基因和一种选择性标记的载体与一种表达所述Cre重组酶的载体共转染，形成后续的转基因植物。Cre重组酶的表达诱导所述载体的LoxP位点和所述亲本植物的同源重组。通过表达选择性标记选择转化体，并且诱导所述转化体再生。用表达Flp重组酶的后续转化可以除去所述选择性标记并且使得可以随后整合到其他Loxp位点中。

产生存活的植物

在芦荟细胞或芦荟组织转化之后，所述转化的芦荟细胞或芦荟组织可以生长成小植物。可以在再生培养基中培养在所述选择剂暴露中存活的芦荟细胞或者在筛选实验中得分为正的芦荟细胞，并且使它们发育成转基因的芦荟植物10。可以将由转化的芦荟细胞再生的发育中的芦荟小植物转移到植物生长基质并硬化，例如在一个大约85％的相对湿度、600ppmCO₂和25-250微爱因斯坦(microeinstein)m^-2S^-1的光照的环境控制箱中，然后转移至一个温室或生长室中成熟。依赖于所述初始组织，在转化体被鉴定后，所述转化的芦荟植物10再生大约6周至10个月。通常可以测试所述再生的转化芦荟植物10或其子代种子或植物的所述重组DNA的表达。

从转化的未分化的胼胝体组织或分生组织再生的转基因芦荟植物10主要涉及生长因子生长素和激动素的处理。所述第一步是启动枝的生长。枝诱导培养基通常包含低浓度的生长素(0.2mg/LNAA)和相对高浓度的细胞分裂素(2mg/LBAP)。降低糖浓度至2％的蔗糖(影响渗透压)也可有助于植物的再生。在生枝培养基上的细胞被置于25℃的培养箱中，以12小时的白昼循环。在开始形成的枝达到约2cm的长度后将其从所述原始胼胝体上切除，并且置于生根培养基中。也可以将这些根维持在生枝培养基中以促进其他枝的发育。生根培养基促进根的发育，并且通常包含1/2的MS培养基和相对低浓度的生长素(0.2mg/LNAA)。在根开始发育之后(1-2cm)，将所述小植物转移至土壤众并且逐渐减少所述相对湿度使之适应环境。一旦产生转基因的芦荟植物10之后，可以通过种子、克隆繁殖的方法或其他的方法繁殖所述转基因的芦荟植物10，所述其他方法是本领域的技术人员通过阅读本公开内容后可以知晓的。

从植物或植物细胞提取并纯化蛋白

通过载体引入到植物细胞或植物中的所述结构的蛋白或酶可以存在于所述芦荟植物10的各种组织中，所述组织包括根、块茎、叶、种子、花、树液或植物部分和发育阶段的结合。在一方面，目标一种或多种蛋白可以富集在所述叶的中央部分的凝胶基质中。在另一方面，当从所述芦荟叶12中提取之后，一种或多种目标蛋白可以是生物活性的并且可以提供某种程度的药用效果。在另一方面，一种或多种目标蛋白与在所述凝胶基质中存在的至少一种自身的芦荟蛋白、碳水化合物和/或其他化合物协同地作用，以便为患者提供所需的治疗。可以从总生物量或个别的组织提取蛋白。从植物细胞提取蛋白的方法可以包括物理的和化学的方法。从叶中或树液中提取蛋白的方法可以涉及到过滤、超速离心、化学萃取和亲和层析。

在一方面，目标蛋白可能积聚在所述转化的芦荟植物10的叶的凝胶中。这个区域主要是水，大约99％，并且没有有害的蛋白酶。所述凝胶的提取是本领域的技术人员可以理解的已知技术。一些蛋白，特别是化妆品用的蛋白，可以直接被用于补充所述芦荟凝胶，并且绝不需要从所述凝胶中将其单独地分离出来。

实施例

分离植物细胞的方法

在第一个实例中，用于直接应用或用于胼胝体的初始化的枝分生组织分离自所述芦荟的茎，所述芦荟是芦荟(Aloeveta)(库拉索芦荟)、开普芦荟(Aloeferox)或木立芦荟(Aloearborescence)。去除叶部分，并且沿所述芦荟叶的纵轴方向从侧面将茎切开。用吐温20(0.05％)和次氯酸盐(5％)的混合液将组织灭菌10分钟，之后用乙醇浸泡30秒钟，用3x的无菌水冲洗。然后将切片暴露表面侧向放置在含琼脂(0.8-1％)的MS培养基的平皿中，所述MS培养基包含各种浓度的所述生长因子、生长素和细胞分裂素，以及2-3％的蔗糖。根据所需的过程，改变生长条件。无枝发育的胼胝体培养通常是通过在没有BAP或含有低浓度的BAP(0.2mg/L)的NAA(2-5mg/L)中培养这些切片开始。未分化的细胞开始沿被切割的茎的区域生长，并且可以在不同的皿上传代和维持。通过将这种片段置于生枝培养基上可以直接开始枝诱导，所述生枝培养基是包含0.2mg/LNAA(或IAA0.2mg/L)和2mg/LBAP的MS培养基。NAA和IAA二者都可以作为生长素的来源，并且有效果的生长素和细胞分裂素都有一个浓度范围。来自未成熟胚的胼胝体细胞可以从市售的种子发育而来。所述种子首先被灭菌(乙醇30秒，5％次氯酸盐加0.05％的吐温20中15分钟，并在无菌水中清洗3次)。然后将灭菌的种子置于水中，4摄氏度下过夜。通过除去种皮分离未成熟胚。在所述三角形的种子的一个角切开一个小口，并且将胚挤出。然后将它置于MS培养基上，所述培养基仅包含生长素(NAA2-5mg/L)以诱导胼胝体，或者包含生长素和细胞分裂素(NAA0.2mg/L，BAP2mg/L)以诱导胼胝体和枝增殖。糖浓度通常是2-3％。

在去叶的年轻芦荟植物10的底部剪下的1-2厘米的片段，由所述片段可以发育成来自所述枝顶端分生组织的胼胝体细胞。所述片段经过表面灭菌，重新放置于含1％琼脂的MS培养基中，所述培养基含生长素和细胞分裂素(2mg/LNAA、0.2mg/LBAP)。

在1-2周内开始胼胝体细胞的诱导。然后可以从这些培养物中分离细胞，并且将所述细胞用作转化的起始材料。

DNA构建体

i.pBI121泛素干扰素载体(pBI-UI)。

所述pBI121农杆菌二元载体被用作产生pBI-UI的骨架。使用包含5’PstI和3’SacI/XhoI限制性位点的基因特异性引物从人293个细胞中扩增具有信号序列的人干扰素α-2基因。所述587bp的干扰素PCR产物被克隆到pZErO中并测序。通过扩增来自所述载体pUBI-GFP的区域并克隆进5’HindIII和3’PstI限制性位点中，来自玉米的1962bp的泛素(Ubi)启动子元件也被克隆进pZErO。然后，使用HindIII/PstI(pZErOUI)将所述Ubi片段亚克隆进入所述pZero干扰素载体。然后使用HindIII/PstI将所述完整的Ubi干扰素盒亚克隆到pBI121中，并且去除所述CaMV35S启动子和GUS基因形成pBIUI。该载体保留了农杆菌介导的感染和转化必需的右侧和左侧T-元件边缘区域，并且转化和表达受Nos启动子控制的卡那霉素抗性基因(NPTII)。

ii.pZErO泛素干扰素IRES卡那霉素。(pZUIIK)

该载体的产生是通过将所述Ubi启动子克隆进所述pZErO克隆载体。在该片段的之后克隆一个盒，所述盒包含人干扰素α-2、IRES(内部核糖体进入序列)和卡那霉素抗性基因。该单元被表达为单个的转录物，但被翻译成两种不同的蛋白(由IRES提供的第二翻译起始位点导致)。这使得所述选择性标记和干扰素都在所述Ubi启动子的控制下表达。

iii.使用Cre和Flp重组酶的双质粒系统。

首先产生一个亲代植物，所述植物可表达具有用于定向整合的cre和flp位点的选择性标记。引入具有目标基因的载体的另一次转染被靶向所述cre位点。然后使用flp去除不需要的遗传物质。将DNA构建体导入分离的植物细胞

i.农杆菌介导的基因转移

用所述pBIUI载体电穿孔农杆菌菌株LB4404(Invitrogen，Carlsbad，CA)，并且在含50ug/ml的卡那霉素和100ug/ml链霉素的LB琼脂平板上筛选阳性克隆。摄氏30度下，使单克隆在含250uM的乙酰丁香酮的LB培养基中过夜生长。感染的发生是通过将植物片段或胼胝体浸入所述过夜的培养物中，在无菌滤纸上干燥印迹，并且在摄氏25度于黑暗中放置于包含250uM的乙酰丁香酮的MS琼脂平板上。感染两天之后，将组织转移到包含200uM的头孢噻肟(cefotaxime)的MS琼脂平板上以杀死农杆菌。然后将所述组织转移到含50mg/L的卡那霉素、0.2mg/L的NAA和2mg/L的BAP的MS琼脂平板上以筛选转化体，并且诱导枝再生。所述组织在12小时光照和摄氏25度下生长。使不定枝生长到大约2cm的长度，然后将其剪下并且移植到生根培养基上继续筛选。检测表达目标基因的小植物的表达水平，并且将其转移到土壤中。

ii.基因枪基因转移

用包含所述DNA构建体的载体包被金颗粒(0.6-1um)。所述金颗粒在70％的乙醇中搅拌并浸泡清洗15分钟，之后在无菌水中清洗3次。然后将所述金颗粒重新悬浮于50％的丙三醇中至60mg/ml的浓度。为了在所述清洗的颗粒上包被载体DNA，将3mg的颗粒加入1.5ml的微量离心管中。在所述微量离心管中加入5ul浓度为1ug/ul的DNA、50ul2.5MCaCl₂和20ul0.1M亚精胺，并且搅拌2-3分钟。使之沉降、离心1-2秒并弃去液体。加入140ul70％的乙醇，离心并弃去液体。加入140ul100％的乙醇，离心并弃去液体。在沉淀中加入48ul100％的乙醇并轻轻地再悬浮。将所述基因枪装置(PDS1000/He，Bio-RadLaboratories，Inc.，Hercules，CA)用70％的乙醇灭菌。使用巨携带子支撑物(macrocarrierholder)和停止屏(推荐设置)之间的最小间隙距离装配所述基因枪装置。用移液管将包被的金颗粒(8ul)滴入所述巨携带子中央。根据所述靶组织(6cm组织，9cm胼胝体)设定所述靶距离，破圆盘(rupturedisk)为600-1100psi。

在第一实例中，在轰击后细胞被置于包含2mg/LNAA的无选择性MS琼脂平板上，在摄氏25度下的黑暗中培养1周。然后将细胞转移到含用于选择的50mg/L的卡那霉素的MS琼脂平板上继续4-5周，所述琼脂平板含生长素(2mg/LNAA)和细胞分裂素(0.2mg/L，6-苄氨基嘌呤)。所述细胞在摄氏25度下以12小时的光照生长。

在第二实例中，在一个MS的平板(4g/LMS盐、1mg/L(1000X)MS维生素储液、2mg/LNAA、100mg/L肌醇、2.76g/L脯氨酸、30g/L蔗糖、100mg/L酪蛋白水解产物、36.4g/L山梨糖醇、36.4g/L甘露醇、2.5g/L固化剂(gelrite)，pH5.8)上进行微粒轰击。在轰击后，所述轰击的胼胝体留在MSOSM上1个小时，然后转移到MS初始培养基中(4g/LMS盐、1mg/L(1000X)MS维生素储液、2mg/LNAA、100mg/L肌醇、2g/L脯氨酸、30g/L蔗糖、100mg/L酪蛋白水解产物、2.5g/L固化剂(gelrite)，pH5.8)。在MS上7-10天之后，所述轰击的胼胝体被转移到含50mg/L的卡那霉素的MSS选择培养基中(4g/LMS盐、1mg/L(1000X)MS维生素储液、2mg/LNAA、100mg/L肌醇、30g/L蔗糖、2.5g/L固化剂(gelrite)，pH5.8)用于筛选转化的细胞。在3周后，单胼胝体碎片被转移到新鲜MSS培养基中。在轰击的6-8周内，由选定的胼胝体碎片产生卡那霉素抗性克隆。

iii.原生质体

原生质体是没有其外细胞壁的植物细胞。产生这些细胞的优点是提高转染的效率，并且可以将这样的细胞融合形成一种体细胞杂种。体细胞杂种可以将来自不同植物的基因混合，有可能获得完全新的细胞。

使用根据本发明的原生质体的技术可以包括在液体培养中生长所述细胞(对数生长期中的2-3天)。然后离心所述细胞(1000x重力，5分钟)。所述细胞被重新悬浮于含纤维素酶、浸解酶和果胶酶的溶液中。在摄氏25度黑暗中振荡过夜。离心(600x重力，5分钟)并除去上清液。在培养基中重新悬浮所述原生质体，并且多次离心以除去微量的酶。所述原生质体不能被存储或者用于增殖，并且必须被尽快用于转染或体细胞融合。

产生包含DNA构建体的存活的植物

在第一个实例中，利用其细胞毒素(例如卡那霉素)的抗性筛选成功的转化体。稳定转染的细胞必须表达所述抗性标记和目标基因，例如编码干扰素的基因，以及能够再生成完整的植物。将50mg/L的卡那霉素加到所述MS琼脂平板以启动筛选。所述筛选过程部分地依赖于所述细胞复制的速度，但是可以在6-10周间发生。在这个时间中，通过在所述MS琼脂平板中加入0.2mg/LNAA和2mg/LBAP诱导转化的组织的再生，并且用12小时/光照循环促进枝的发育(继续使用选择压力)。当不定枝开始发育的时候，在大约2cm长时可以对它们进行基因表达的检测。随后将表达目标基因产物的枝(利用RT-PCR、Western印迹和生物检验测定)转移到MS琼脂平板上以诱导根形成(1/2MS加0.2mg/LNAA)。

在第二个实例中，转基因胼胝体的再生的实现是通过将大约15个小碎片(约4mm)转移到含有经过滤灭菌的卡那霉素(50mg/L)的再生培养基I中(4.3g/LMS盐、1ml/L(1000X)MS维生素储液、100mg/L肌醇、60g/L蔗糖、3g/L固化剂(gelrite)，pH5.8)，并且在摄氏25度下黑暗中孵育2-3周。在光照下将成熟的体细胞胚转移至在含有经过滤灭菌的卡那霉素(50mg/L)的再生培养基II中(4.3g/LMS盐、1ml/L(1000X)MS维生素储液、100mg/L肌醇、30g/L蔗糖、3g/L固化剂(gelrite)，pH5.8)以进行萌发。

Claims (21)

1.一种在植物中生产一种对所述植物外源的蛋白的方法，所述方法包含：

提供包含一种DNA构建体的转基因植物，所述DNA构建体包含一个启动子、一个编码所述外源蛋白的序列、一个终止序列和一个编码一种分泌信号肽的易位序列，其中所述启动子是SEQIDNO:44编码的来自玉米的泛素启动子，所述易位序列是SEQIDNO:29编码的来自水稻(Oryzasativa)的α淀粉酶分泌序列，并且所述外源蛋白是由SEQIDNO:33编码的α-2干扰素；

增殖所述植物以便表达来自所述DNA构建体的外源蛋白；和

从所述植物提取所述蛋白；

其中所述植物是芦荟；所述DNA构建体包含一种分泌信号肽，使得至少部分的所述外源的蛋白被易位到所述芦荟叶的凝胶中；并且提取存在于所述叶凝胶中的外源蛋白。

2.根据权利要求1的方法，其中所述分泌信号肽是一种包括在所述外源蛋白中的天然的或合成的结构域，所述分泌信号肽靶向所述外源蛋白的分泌。

3.根据权利要求1的方法，其中在所述蛋白从所述芦荟细胞中易位出来的时候，所述分泌信号肽被从所述外源蛋白上切除。

4.根据权利要求1的方法，其中在所述蛋白从所述芦荟细胞中易位出来的时候，所述分泌信号肽保留在所述外源蛋白上。

5.一种转基因芦荟植物的凝胶，包含：

由一种DNA构建体表达的一种外源蛋白，所述DNA构建体具有一个启动子、一个编码所述外源蛋白的序列、一个终止序列和一个编码一种分泌信号肽的易位序列，并且至少部分的所述外源蛋白是从所述转基因芦荟植物的芦荟细胞被易位到芦荟叶的凝胶中，

其中所述启动子是SEQIDNO:44编码的来自玉米的泛素启动子，所述易位序列是SEQIDNO:29编码的来自水稻(Oryzasativa)的α淀粉酶分泌序列，并且所述外源蛋白是由SEQIDNO:33编码的α-2干扰素。

6.一种治疗组合物，所述组合物包含：

包含一种或多种天然的和治疗性芦荟蛋白或碳水化合物的芦荟叶凝胶；和

一种有生物活性的且对芦荟外源的蛋白，所述蛋白由重组的DNA构建体表达，所述构建体包含：一个启动子、一个编码所述外源蛋白的序列、一个终止序列和一个编码一种分泌信号肽的易位序列，其中至少部分的所述外源蛋白从芦荟细胞被易位到所述芦荟叶的凝胶中；

其中所述启动子是SEQIDNO:44编码的来自玉米的泛素启动子，所述易位序列是SEQIDNO:29编码的来自水稻(Oryzasativa)的α淀粉酶分泌序列，并且所述外源蛋白是由SEQIDNO:33编码的α-2干扰素。

7.一种用于产生生物活性蛋白的方法，所述方法包含：

提供一种DNA构建体，所述DNA构建体含有一个启动子、一个编码所述外源蛋白的序列、一个终止序列和一个编码一种分泌信号肽的易位序列，其中所述启动子是SEQIDNO:44编码的来自玉米的泛素启动子，所述易位序列是SEQIDNO:29编码的来自水稻(Oryzasativa)的α淀粉酶分泌序列，并且所述外源蛋白是由SEQIDNO:33编码的α-2干扰素；

把所述DNA构建体克隆到芦荟植物的基因组中；

繁殖所述包含所述DNA构建体的芦荟植物；

由所述DNA构建体表达所述外源蛋白，其中至少部分的所述外源蛋白从所述芦荟植物的芦荟细胞被易位到芦荟叶的凝胶中；和

提取由所述DNA构建体表达的所述外源蛋白。

8.根据权利要求7的方法，其中所述方法还包含诱导编码所述外源蛋白的基因的转录的步骤。

9.根据权利要求7的方法，其中所述提取所述外源蛋白的步骤包含从所述芦荟叶提取凝胶。

10.根据权利要求7的方法，其中在所述蛋白从所述芦荟细胞中易位出来的时候，所述分泌信号肽被从所述外源蛋白上切除。

11.根据权利要求7的方法，其中在所述蛋白从所述芦荟细胞中易位出来的时候，所述分泌信号肽保留在所述外源蛋白上。

12.一种用于产生生物活性蛋白的方法，所述方法包含：

提供一种DNA构建体，所述DNA构建体含有一个启动子、一个编码所述外源蛋白的序列、一个终止序列和一个编码一种分泌信号肽的易位序列，其中所述启动子是SEQIDNO:44编码的来自玉米的泛素启动子，所述易位序列是SEQIDNO:29编码的来自水稻(Oryzasativa)的α淀粉酶分泌序列，并且所述外源蛋白是由SEQIDNO:33编码的α-2干扰素；

把所述DNA构建体克隆到芦荟植物的基因组中；

繁殖所述包含所述DNA构建体的芦荟植物；和

由所述DNA构建体表达所述外源蛋白，其中至少部分的所述外源蛋白从所述芦荟植物的芦荟细胞被易位到芦荟叶的凝胶中。

13.根据权利要求12的方法，进一步包含从所述芦荟植物的芦荟叶提取凝胶。

14.一种用于产生生物活性蛋白的方法，所述方法包含：

从转基因芦荟植物的芦荟叶提取凝胶；

其中所述转基因芦荟植物包含重组DNA构建体，所述DNA构建体包含：一个启动子、一个编码所述外源蛋白的序列、一个终止序列和一个编码一种分泌信号肽的易位序列，其中所述启动子是SEQIDNO:44编码的来自玉米的泛素启动子，所述易位序列是SEQIDNO:29编码的来自水稻(Oryzasativa)的α淀粉酶分泌序列，并且所述外源蛋白是由SEQIDNO:33编码的α-2干扰素；并且

由所述DNA构建体表达所述外源蛋白，其中至少部分的所述外源蛋白从所述转基因芦荟植物的芦荟细胞被易位到芦荟叶的凝胶中。

15.一种产生转基因的芦荟植物的方法，所述方法包含：

在一种营养培养基中培养来自芦荟种子的芦荟细胞的未分化的胼胝体，所述营养培养基为包含0.2mg/lNAA、2mg/lBAP和2-3％蔗糖的MS培养基；

在所述胼胝体中引入一种重组DNA构建体，所述DNA构建体含有一个启动子、一个编码所述外源蛋白的序列、一个终止序列和一个编码一种分泌信号肽的易位序列，其中所述启动子是由SEQIDNO:44编码的来自玉米的泛素启动子，所述外源蛋白是由SEQIDNO:33编码的α-2干扰素，并且所述分泌信号肽是SEQIDNO:29；

在生枝和选择培养基中生长所述胼胝体，所述选择培养基包含链霉素或卡那霉素或乙酰丁香酮，所述生枝培养基是包含0.2mg/lNAA和2mg/lBAP的MS培养基或包含0.2mg/lIAA和2mg/lBAP的MS培养基；使所述在生枝和选择培养基中再生的枝在一种生根培养基中生长，所述生根培养基包含1/2的MS培养基和0.2mg/l的NAA；和

一旦开始形成根，就将所述小植物转移至土壤中。

16.根据权利要求15的方法，其中用所述重组DNA构建体直接地轰击所述胼胝体组织。

17.根据权利要求15的方法，进一步包含如下步骤：培养所述植物，使得可以表达来自所述DNA构建体的所述外源蛋白，其中至少部分的所述外源蛋白被易位到芦荟叶的凝胶中；并且提取包含所述外源蛋白的叶凝胶。

18.根据权利要求1的方法，其中所述分泌信号肽是所述外源蛋白的一个天然结构域。

19.根据权利要求1的方法，其中所述分泌信号肽是所述干扰素的一个天然结构域。

20.根据权利要求1的方法，其中所述分泌信号肽是一个与编码所述外源哺乳动物蛋白的序列相连接的植物分泌序列。

21.一种在植物中生产一种蛋白的方法，所述方法包含：

提供包含一种重组DNA构建体的转基因植物，所述重组DNA构建体包含一个启动子、一个编码所述外源蛋白的序列、一个终止序列和一个编码一种分泌信号肽的易位序列，其中所述启动子是SEQIDNO:44编码的来自玉米的泛素启动子，所述易位序列是SEQIDNO:29编码的来自水稻(Oryzasativa)的α淀粉酶分泌序列，并且所述外源蛋白是由SEQIDNO:33编码的α-2干扰素；

栽培所述植物以便表达来自所述DNA构建体的外源蛋白；和

从所述植物提取所述蛋白；

其中：

(a)所述植物是芦荟；

(b)通过下述方法产生所述转基因植物，所述方法包含：从芦荟种子获得芦荟胚细胞；在培养基中生长所述芦荟细胞以在一种营养培养基中形成胼胝体，所述营养培养基为包含0.2mg/lNAA、2mg/lBAP和2-3％蔗糖的MS培养基；用重组DNA构建体转化所述胼胝体；在生枝和选择培养基中生长所述胼胝体时筛选包含所述重组DNA构建体的转化的芦荟细胞，所述选择培养基包含链霉素或卡那霉素或乙酰丁香酮，所述生枝培养基是包含0.2mg/lNAA和2mg/lBAP的MS培养基或包含0.2mg/lIAA和2mg/lBAP的MS培养基；使在所述生枝和选择培养基中再生的枝在一种生根培养基中生长，所述生根培养基包含1/2的MS培养基和0.2mg/l的NAA；并且一旦开始形成根，就将所述小植物转移至土壤中；

(c)所述DNA构建体包含一种分泌信号肽，使得至少部分的所述外源的蛋白被易位到所述芦荟叶的凝胶中；并且

(d)提取存在于所述叶凝胶中的外源蛋白。