DE69232132T3 - Verfahren zur schöpfung einer transformierten reispflanze - Google Patents

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Description

  • Hintergrund der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der Molekularbiologie der Pflanzen. Insbesondere betrifft sie die Erzeugung transformierter Reispflanzen mittels beschleunigter Teilchen.
  • Hintergrund
  • Reis, Oryza sativa, ist eine wichtige Nutzpflanze, die pro Hektar mehr Kalorien als irgendein anderes Getreide liefert und im Hinblick auf die geerntete Fläche weltweit hinter Weizen auf Platz 2 steht. Es besteht ein großes Interesse an neuen Reis-Sorten, die herkömmlichen Pflanzenzüchtungsverfahren weisen jedoch inhärente Beschränkungen auf. Mehrere Generationen der Inzucht sind für die Erzeugung homozygoter Pflanzen notwendig, so dass Züchtungsprogramme für neue Reis-Sorten mehrere Jahre benötigen. Genetische Merkmale ursprünglicher Reis-Sorten können möglicherweise helfen, die Resistenz des Reis gegen Befall, Erkrankungen und unwirtliche Umgebung zu verbessern, ursprüngliche Reis-Sorten lassen sich jedoch mit gezogenem Reis nicht gut kreuzen.
  • Aufgrund dieser Beschränkungen der herkömmlichen Pflanzenzüchtungsverfahren, wurde Reis genetisch verändert. Luo und Wu, Plant Molec. Biol. Rep. 6 [3]: 165–174 (1988) und Plant Molec. Biol. Rep. 7 [1]: 69–77 (1989) haben ein Verfahren zur Übertragung fremder DNS in frisch bestäubte Reis-Blütenstände beschrieben, die als "Blütenstaubgefäßbahn"-Transformation bezeichnet wurde. Das Blütenstaubgefäßbahn-Verfahren umfasst Schritte, bei denen man die Spitze des Reis-Blütenstandes abschneidet, so dass das Stigma abgeschnitten wird und der Griffel ein hartes Ende aufweist. Ein Tropfen einer DNS- enthaltenden Lösung wird auf das angeschnittene Ende des Blütenstandes platziert und es wird diesem ermöglicht, die Blütenstaubgefäßbahn hinunterzufließen. Samen werden schließlich geerntet und zur Keimung gebracht. Die Transformation über die Blütenstaubgefäßbahn konnte jedoch durch andere nicht wiederholt werden und scheint nicht reproduzierbar.
  • Reis-Protoplasten, die von ihrer Zellwand isolierte Reis-Pflanzenzelle, sind ein bevorzugtes Ziel der genetischen Veränderung. Ein allgemeines Transformationsverfahren besteht darin, Protoplasten mit DNS und Polyethylenglykol (PEG) zu inkubieren und die Protoplasten anschließend in Gegenwart eines Selektionsmittels zu Pflanzen zu ziehen. Uchimiya et al., Mol. Gen. Genet.: 204–207 (1986), beschreiben beispielsweise die PEG-vermittelte Transformation von Reis-Protoplasten, um die Expression des Fremdgens in transformiertem Callus zu erhalten. Weitere Beispiele der PEG-vermittelten Protoplastentransformation können in Hayashimoto et al., Plant Physiol. 93: 857–863 (1990) und Peng et al., Plant Cell Reports 9: 168–172 (1990) gefunden werden.
  • Reis-Protoplasten wurden auch mittels Elektroporation transformiert. Bei den meisten Elektroporationsverfahren werden Reis-Protoplasten mit einer DNS-Lösung vermischt und einem elektrischen Impuls ausgesetzt. Ähnlich zu der PEG-vermittelten Transformation ermöglicht dies den DNS-Molekülen die Zellmembran zu überqueren und in das Zell-Genom zu integrieren. Kürzlich haben Terada und Shimamoto, Mol. Gen. Genet. 2201 389–392 (1990) die Transformation von Reis-Protoplasten mittels Elektroporation beschrieben, wobei eine reife Reispflanze erzeugt wurde, die das Fremdgen expremiert. Tada et al., Theor. Appl. Genet. 80: 475–480 (1990), und Battraw und Hall, Plant Molec. Biol. 15: 527–538 (1990) haben ebenfalls kürzlich die Transformation von Reis mittels Elektroporation beschrieben. Shimamoto et al., Nature 338: 274–276 (1989) haben ein Hygromycin-Resistenzgen mittels Elektroporation in Protoplasten eingebracht und das Fremdgen in den Nachkommenpflanzen nachgewiesen.
  • Reis wurde auch mit einer Kombination aus PEG und Elektroporation transformiert, Yan et al., Plant Cell Reports 7: 421–425 (1988). Die Transformation wurde durch enzymatischen Nachweis in zufällig ausgewählten Kanamycin-resistenten Klonen bestätigt.
  • Die auf PEG oder Elektroporation basierenden Transformationsverfahren sind jedoch ebenfalls beschränkt, da sie auf die Regeneration ganzer transformierter Reispflanzen aus transformierten Protoplasten angewiesen sind. Es gibt jedoch viele Probleme und inhärente Beschränkungen in dem Regenerationsverfahren der Protoplastenkultur. Das derzeitige Protoplasten-Regenerationsverfahren resultiert in einer hohen Frequenz an somaklonaler Variation, Albinismus und Sterilität. Ferner, was von größter Wichtigkeit ist, können nicht alle Reis-Sorten aus Protoplasten regeneriert werden. Reis wird anhand der Sorten in zwei Hauptgruppen eingeteilt, die als Japonica und Indica bezeichnet werden. Japonica- und Indica-Sorten unterscheiden sich aufgrund ihrer geographischen Verteilung und morphologischen und physiologischen Elemente. Japonica- und Indica-Sorten unterscheiden sich ferner in ihrer Fähigkeit zur Gewebekultur und den Regenerationsverfahren. Im Allgemeinen weisen Japonica-Sorten einen hohen Callus-Ertrag und eine hohe Regenerationsfähigkeit auf, wogegen Indica ein sehr geringes Callus-Wachstum und geringes Regenerationspotential aufweist. Indica-Sorten werden jedoch im Allgemeinen kommerziell am meisten bevorzugt.
  • Die mittels der oben genannten Verfahren erzeugten Reispflanzen stammten von der Japonica-Sorte. Luo und Wu Plant Molec. Biol. 7 [1]: 69–77 (1989) nahmen eine Indica-Sorte in ihre Blütenstaubgefäßbahn-Verrsuche auf. Die positiven Transformationsergebnisse, die berichtet wurden, konnten jedoch nicht wiederholt oder bestätigt werden. Datta et al., Biotechnology 8: 736–740 (1990) haben ein PEG-vermitteltes Transformationsverfahren für die Regeneration von Pflanzen aus Protoplasten des Indica-Typs etabliert. Southern-Analyse- und Enzym-Nachweisverfahren haben gezeigt, dass das Fremdgen stabil integriert und an die Nachkommen vererbt wurde. Dieses Verfahren funktioniert jedoch lediglich mit einer spezifischen nicht-kommerziellen Indica-Sorte. Dabei handelt es sich um das einzige beschriebene Verfahren, das bis zum heutigen Tage mit Indica-Reis-Sorten durchgeführt wurde, welches zu transformierten Pflanzen führte. Obwohl im Allgemeinen viel Aufwand für die Entwicklung eines reproduzierbaren Systems zur Regeneration von Indica-Sorten betrieben wurde, konnte ein entsprechendes Verfahren bisher nicht veröffentlicht werden.
  • Reis wurde ferner mittels Agrobacterium-Infektion transformiert, wobei Reisembryonen verwendet wurden. Das zunächst breit angewandte genetische Pflanzen-Transformationsverfahren basiert auf der natürlichen Fähigkeit des im Boden wachsenden Mikroorganismus Agrobacterium tumefaciens, einen Teil seiner DNS in eine Pflanzenzelle als Teil seines üblichen pathogenen Kreislaufs einzufügen. Sofern ein Fremdgen auf eine bestimmte Art in die Bakterien eingeführt wird, kann das Agrobacterium dazu verwendet werden, das Fremdgen in eine Pflanze zu übertragen. Agrobacterium-Transformationsverfahren wurden für eine Vielzahl von Pflanzen entwickelt, von denen die meisten Dicotyledone waren, die Nützlichkeit des Verfahrens unterscheidet sich jedoch von Pflanzenart zu Pflanzenart. Auf Agrobacterium-basierende Trans formationsverfahren sind beschränkt, da sie Zell- oder Gewebekultur und Pflanzen-Regenerationsverfahren benötigen. Die Pflanzenzüchtungen variieren in ihrer Verwendbarkeit für Gewebekultur und Regenerationsverfahren. Monocotyledone Pflanzen, wie Reis, sind besonders schlechte Kandidaten für eine Agrobacterium-vermittelte Transformation. Die Agrobacterium-vermittelte Transformation von Reis-Gewebe wurde jedoch von Raineri et al., Biotechnology 8: 33–80 (1990) beschrieben und durch DNS-Hybridisierungsnachweise bestätigt. Die behandelten Embryonen bildeten tumorigenes Callus-Gewebe. Es wurden keine Pflanzen beschrieben, und es hat den Eindruck, dass es nicht möglich war, Pflanzen aus diesen Geweben zu regenerieren.
  • Ein neues Transformationsverfahren ist darauf gerichtet transformierte Pflanzen durch Beschuss von Pflanzenzellen oder Geweben mittels beschleunigter Teilchen transformierte Pflanzen zu erzeugen, welche das genetische Material tragen. Erste Hinweise auf die Verwendbarkeit dieses Verfahrens bestanden in einer Beschreibung, nach der DNS-Konstrukte auf Wolfram-Teilchen geschichtet und in die Haut einer Zwiebel beschleunigt wurden, worin die Gene transient expremiert wurden. US-Patent 4,945,050 . Ein Problem bei der Entwicklung des Transformationsverfahrens mittels beschleunigter Teilchen besteht in der Schwierigkeit eine Pflanze mit Keimbahntransformation zu erhalten. Der Begriff "Keimbahntransformation" bezeichnet Keim-Zellen der Pflanze, die so transformiert wurden, dass die Nachkommen der Pflanze das fremde Nukleinsäure-Konstrukt, das durch die Teilchen in das Pflanzengewebe der vorherigen Generation insertiert wurde, durch Vererbung erhalten. Genetische Transformation von Pflanzen wurde durch das Verfahren des Teilchen-Beschuss erzielt. US-Patent 5,015,580 offenbart die Keimbahn-Transformation von Sojabohnen-Pflanzen und -pflanzenzüchtungen. Eines der in dieser veröffentlichten Patentanmeldung offenbarten Verfahren besteht darin, mit DNS beschichtete Teilchen auf ausgeschnittene embryonale Achsen der Sojabohnenpflanzen zu beschleunigen. Wenn die beschossenen embryonalen Achsen der Sojabohne mit einem Medium mit hohem Zytokinanteil behandelt werden, werden Triebe aus den behandelten embryonalen Achsen induziert. Wenn die Triebe zu ganzen Sojabohnen-Pflanzen gezogen werden, wird ein signifikanter Prozentsatz der Pflanzen Keimbahn-Transformation aufweisen. Ähnlich zu dem Teilchen-Beschuss wurde die Transformation von Reis mittels eines Luftgewehr-Gerätes erzielt. Oard et al., Plant Physiol. 92: 334–339 (1990) beschreibt die transiente Genexpression nach Beschuss von embryogenem Reis-Callus. Bei den Bemühungen um eine Teilchenvermittelte Transformation ist es jedoch weit einfacher eine transiente Aktivität in Callus als Pflanzen mit Keimbahn-Transformation zu erhalten.
  • Der Stand der Technik im Bereich molekularer Pflanzenbiologie benötigt ein effizientes Verfahren zur Erzeugung einer transformierten Indica-Reispflanze. Dieses Verfahren würde bestenfalls nicht von Protoplasten-Kultur und Regeneration abhängen, sollte unabhängig vom Genotyp sein und Pflanzen mit Keimbahn-Transformation, die transgene Nachkommen erzeugen, schnell zur Verfügung stellen. Sofern dasselbe Verfahren auch für Japonica-Sorten anwendbar wäre, wäre dies am meisten zu bevorzugen.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft sowohl ein Verfahren zur Erzeugung transformierter Reispflanzen als auch transformierte Indica-Reispflanzen. Das Verfahren geht aus von der Erzeugung von Kopien eines Nukleinsäure-Konstruktes. Diese Kopien werden auf biologisch inerte Träger-Teilchen geschichtet. In der vorliegenden Erfindung werden die Nukleinsäure-beschichteten Träger-Teilchen physisch auf unreife Reisembryonen beschleunigt. Die beschossenen Embryonen werden in Kultur gezogen, um Triebe zu erzeugen, und der Prozentsatz der transformierten, wiedergewonnenen Triebe wird angereichert, indem die Triebe einem Selektionsmittel ausgesetzt werden. Diese Triebe werden zu ganzen, sexuell reifen Pflanzen gezogen. Die Gegenwart des Nukleinsäure-Konstruktes wird entweder in den Trieben oder den sexuell reifen Pflanzen verifiziert. Zusätzlich wird die Vererbbarkeit des Nukleinsäure-Konstruktes verifiziert.
  • Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, eine transformierte Indica-Reispflanze zu erzeugen.
  • Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, eine Indica-Reispflanze zu erzeugen, die transformierte Nachkommen hat.
  • Ein Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht darin, dass es erfolgreich auf alle Reis-Sorten angewendet werden kann.
  • Ein weiterer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht darin, dass es nicht von einer Protoplasten-Kultur oder embryogenen Suspensions-Kultur abhängt, deren Regenerationsschritte in starker Umfang vom Genotyp abhängen.
  • Weitere Aufgaben, Vorteile und Merkmale der vorliegenden Erfindung werden durch die folgende Beschreibung im Zusammenhang mit den beigefügten Zeichnungen klar.
  • Beschreibung der Figuren
  • 1 ist eine schematische Explosionsdarstellung eines Teilchenbeschleunigungsgerätses, das für die vorliegende Erfindung verwendet werden kann.
  • 2 ist eine Aufsicht auf das Gerät der 1.
  • 3 ist eine Darstellung des Plasmids pCMC2114, das in dem Beispiel verwendet wurde.
  • Beschreibung der bevorzugten Ausführungsform
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Erzeugung transformierter Reispflanzen. Der allgemeine Weg bestand darin, Meristem-Gewebe zu beschießen, um eine Keimbahn-Transformation zu erzielen. Meristem-Gewebe sind Gewebe, in denen sich die Pflanzenzellen teilen. Gräser und verwandte Monocotyledone, wie Reis, weisen meristematisches Gewebe in der Nähe der Knoten auf, die Blattansatzbereiche darstellen. Reis-Embryonen weisen ebenfalls meristematische Zellen auf.
  • Bei Verfahren zur Teilchen-vermittelten genetischen Transformation wird festgestellt, dass lediglich ein geringer Prozentsatz der behandelten Zellen transformiert wurde. Ein schwieriger Teil des Verfahrens besteht demgemäß in der Identifizierung oder Selektion auf transformierte Zellen oder Pflanzen. Dieses Problem hat einige Forscher dazu gebracht, mit einzelnen Zell-Systemen, wie Protoplasten oder Suspensionskulturen zu arbeiten, ausgehend von der Theorie, dass alle regenerierten Pflanzen von einzelnen Zellen abstammen und chimäre Pflanzen somit vermieden werden können. Die Verwendung entsprechender Ein-Zell-Systeme weist jedoch schwere Nachteile auf, so dass lediglich bestimmte Reis-Genotypen von entsprechenden Kulturen regeneriert werden können.
  • Ein weiterer Ansatz besteht darin, mit DNS-beladene Träger-Teilchen auf differenziertes Gewebe zu beschleunigen, und dies ist der hierin verwendete Ansatz. Dieser Ansatz ist nicht auf Ein-Zell-Kulturen angewiesen und daher unabhängig vom Genotyp anwendbar. Ein theoretischer Rückschlag bei der Durchführung dieses Verfahrens besteht darin, dass chimäre Ereignisse überwiegen könnten, wodurch es schwer wird, irgendein Keimbahn-Transformationsereignis zu identifizieren. Überraschenderweise wurde jedoch festgestellt, dass klonale, Keimbahntransformierte Triebe in einer praktischen Frequenz durch den Beschuss von meristematischem Reis-Gewebe erhalten werden können.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung werden unreife Reisembryonen als Zielgewebe verwendet. Die Embryonen werden mit Nukleinsäure-beschichteten Teilchen beschossen, zur Bildung embryonaler oder organogener Calli induziert und transformierte Pflanzen werden aus den Calli regeneriert. Unter den Pflanzen, die durch Embryogenese erzeugt wurden, werden klonale Keimbahn-transformierte Pflanzen in brauchbarer Frequenz gefunden. Die beschossenen Embryonen werden in Kultur gezogen, um Triebe zu erzeugen, und der Prozentsatz der erhaltenen, transformierten Triebe wird erhöht, indem die Triebe einem Selektionsmittel ausgesetzt werden. Diese Triebe werden zu ganzen, sexuell reifen Pflanzen regeneriert. Die Gegenwart eines Nukleinsäure-Konstruktes kann entweder in den Trieben oder den sexuell reifen Pflanzen nachgewiesen wurden. Ferner wird die Vererbbarkeit des Nukleinsäure-Konstruktes verifiziert.
  • A. Erzeugung der Reis-Embryonen
  • Um die vorliegende Erfindung durchzuführen, werden unreife Reis-Embryonen isoliert. Reis-Samen werden aus dem Panicle einer reifen Reispflanze isoliert und sterilisiert. Das Reis-Embryo, welches aus dem Scutellum (dem Keimblatt) und der Trieb/Wurzelachse zusammengesetzt ist, wird aus dem Samenmantel durch Entfernung des Endosperms ausgeschnitten. Vorzugsweise werden unreife Embryonen ausgeschnitten. Als "unreif" werden Embryonen mit einer Länge von etwa 0,5 mm bis 1,5 mm und etwa 10–18 Tage nach Anthesis bezeichnet. Reife Embryonen können auch in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden, es ist jedoch schwieriger, diese Embryonen in Kultur zu ziehen. Sehr unreife Embryonen können verwendet werden, aber es kann schwierig sein, die Größe dieser Embryonen zu verändern, die Embryonen können durch den Beschuss stärker beschädigt werden, und es hat sich gezeigt, dass kleinere Embryonen eine schlechtere Transformationseffizienz in transienten Expressionsversuchen aufwiesen.
  • Nach der Isolierung werden die Reis-Embryonen für die Transformation vorbehandelt. Als "Vorbehandlung" wird das Ablegen des isolierten Gewebes unmittelbar vor der Transformation auf ein für die embryonale Kultur geeignetes Mediums bezeichnet. Aus derzeit unklaren Gründen erscheint die Vorbehandlung die Effizienz des Transformationsverfahrens zu erhöhen, wodurch eine größere Anzahl an Transformierten erzeugt werden, als man ohne dieses Verfahren erhalten würde. Ein geeignetes Kulturmedium für Indica-Sorten ist das CC-Medium, welches durch Potrykus et al., Theor. Appl. Gent. 54: 209–14 (1979) definiert wurde und in Tabelle 1 zusammengefasst ist. Dieses Medium enthält Salze, Zucker und ein Auxin, 2,4-D. Typischerweise supplementiert man das CC-Medium mit weiterem 2,4-D und Casein-Hydrolysat. Ein für Japonica-Sorten geeignetes Medium ist das MS-Medium, welches 0,5 mg/l 2,4-D enthält. MS-Medium wird in Murashige und Skoog definiert, Physiol. Plant, 15: 473–497, 1962).
  • Üblicherweise verbleiben die isolierten Embryonen auf dem Medium für die Vorbehandlung für 24–48 Stunden bei 25°C im Dunklen. Die embryonalen Achsen sollten das Medium berühren und das Scutellum sollte exponiert sein. Nach der Vorbehandlung werden die Embryonen mit Nukleinsäurebeschichteten Teilchen, wie nachfolgend beschrieben, beschossen. Obwohl diese Vorbehandlung bevorzugt ist, ist sie keine absolute Voraussetzung für eine erfolgreiche Transformation, das die Vorbehandlung auf einem bestimmten Medium durchgeführt wird.
  • Im Allgemeinen erscheint es vorteilhaft, das Gewebe-Explantat 24–48 Stunden vor dem Teilchen-Beschuss zu isolieren. Obwohl die Auswahl eines bestimmten Mediums nicht kritisch erscheint, erzielen isolierte und gealterte (24–48 Stunden) Embryonen eine wesentliche Steigerung bei der Aktivität der transienten Expression der insertierten Gene gegenüber frisch beschossenen. Tabelle 1.
    CC-Medien
    KNO3 1212.0 mg/l
    NH4NO3 640,0 mg/l
    CaCl·2H2O 588,0 mg/l
    MgSO4·7H2O 247,0 mg/l
    KH2PO4 136,0 mg/l
    FeSO4·7H2O 27,8 mg/l
    Na2EDTA 37,3 mg/l
    H3BO3 3,1 mg/l
    MnSO4·4H2O 11,15 mg/l
    ZnSO4·7H2O 5,76 mg/l
    KI 0,83 mg/l
    Na2MoO4·2H2O 0,24 mg/l
    CuSO4·5H2O 0,025 mg/l
    CoSO4·7H2O 0,028 mg/l
    Nikotinsäure 6,0 mg/l
    Thiamin-HCl 8,5 mg/l
    Pyridoxin-HCl 1,0 mg/l
    Glycin 2,0 mg/l
    m-Inositol 90,0 mg/l
    Kokosnußwasser* 100,0 mg/l
    Sucrose 20,0 g/l
    Mannitol 36,43 g/l
    pH(KOH) 5,8 g/l
    2,4-D 2,0 mg/l
    Filter sterilisiert
    • * Gibco Nr. 570–5180, nicht-verdünnt.
  • B. Herstellung der Nukleinsäure-beschichteten Teilchen
  • Mehrere Kopien eines Nukleinsäure-Konstruktes, entweder RNS oder DNS, werden durch bekannte molekularbiologische Verfahren erzeugt. Als "Nukleinsäure-Konstrukte" wird jedes RNS- oder DNS-Molekül bezeichnet, das in der Lage ist, innerhalb einer Reiszelle eine Funktion auszuüben. Ein geeignetes Nukleinsäure-Konstrukt kann aus einem isolierten oder konstruiertem Gen mit begleitenden regulatorischen Signalen bestehen oder kann eine Population an RNS- oder DNS-Molekülen sein. Die Nukleinsäure kann aus Reis oder irgendeiner anderen Art abstammen.
  • Um für das Teilchen-vermittelte Transformationsverfahren nützlich zu sein, muss das Nukleinsäure-Konstrukt in der Lage sein, eine nützliche Funktion in den Zellen des pflanzlichen Ziel-Gewebes auszuführen. Das transformierende genetische Konstrukt wird normalerweise ein chimäres Konstrukt in dem Sinne sein, dass sein genetisches Material von mehr als einer Art von Organismus abstammt. Das genetische Konstrukt kann ein solches sein, welches in der Lage ist, ein Genprodukt in dem Zielgewebe zu expremieren. Entsprechende Genprodukte werden typischerweise ein Fremd-Protein sein, können jedoch auch andere Genprodukte, wie ein Antisense-RNS-Konstrukt sein, welches die Aufgabe hat, ein endogenes Pflanzensystem zu inhibieren.
  • Fremde genetische Konstrukte werden oft in einer Expressionskassette in Vektoren für Pflanzenzellen eingebaut, von denen viele im Stand der Technik bekannt sind. Typischerweise umfasst ein entsprechendes Vektorsystem für die Expression in Pflanzen die kodierende Sequenz für das gewählte Fremdgen und geeignete regulatorische Sequenzen. Die geeigneten regulatorischen Sequenzen können eine Promotor-Sequenz, welche in der Lage ist, die Transkription zu initiieren, und einen translationalen Terminator umfassen. Einige Promotoren und Transkriptions-Terminatoren, von denen bekannt war, dass sie in anderen Pflanzen wirksam sind, sind auch in Reis wirksam. Ein translationaler oder transkriptionaler Enhancer kann zwischen dem Promotor und dem kodierenden Bereich der genetischen Sequenz eingebaut sein.
  • Das transformierende Nukleinsäure-Konstrukt kann ein Marker-Gen umfassen, welches eine Selektion oder ein Screening der behandelten Pflanzengewebe ermöglicht. Selektierbare Marker werden für die Transformation von Pflanzen im Allgemeinen bevorzugt, sind jedoch nicht für alle Pflanzenarten verfügbar. Ein selektierbarer Marker konditioniert für ein Merkmal in den transformierten Pflanzenzellen, auf dessen Gegenwart durch Umsetzen der Pflanzenzellen mit einem Selektionsmittel selektiert werden kann. Geeignete selektierbare Marker können Antibiotika- oder Herbizid-Resistenzgene sein, die, wenn sie in einige Zellen einer Pflanze in Gewebekultur insertiert sind, diese besonderen Zellen mit der Fähigkeit ausstatten, der Gegenwart eines Antibiotikums oder Herbizids standzuhalten.
  • Ein weiterer Typ von Markergen ist der, welcher mittels histochemischer oder biochemischer Nachweisverfahren gescreent werden kann, obwohl nicht für das Gen selbst selektiert werden kann. Ein geeignetes Markergen, das sich bei der Transformation von Pflanzen als nützlich erwiesen hat, ist das GUS-Gen. Jefferson et al., EMBO J., 6: 3901–3907 (1987), beschreiben ein allgemeines Verfahren für einen GUS-Nachweis. Das GUS-Gen kodiert für ein Enzym, das die Spaltung von 5-Bromo-4-chloro-3-indolylglucuronid katalysiert, ein Substrat, welches nach Spaltung eine blaue Farbe aufweist. Die Verwendung eines GUS-Gens ermöglicht daher durch histochemische Analyse der Pflanzengewebe ein praktisches Verfahren zum Nachweis der Expression der eingefügten DNS in den Pflanzengeweben. In einem typischen Transformationsverfahren können die Gene, die in der Pflanze expremiert werden sollen, in Tandem-Orientierung mit dem GUS-Gen verknüpft werden. Das Tandem-Konstrukt wird in die Pflanzengewebe transformiert und die so erhältlichen Pflanzengewebe können auf die Expression des GUS-Enzyms hin analysiert werden.
  • In unseren Versuchen wurde das in 3 beschriebene Plasmid pCMC2114 verwendet. Dieses Plasmid enthält das für GUS kodierende Gen und das Bar-Gen. Das Bar-Gen kodiert für eine Resistenz gegen bestimmte Herbizide, wie beispielsweise Bialaphos, und ermöglicht die Verwendung eines Selektionsmitteles, da transformierte Pflanzen in Gegenwart des Herbizids wachsen können.
  • Das Transformationsverfahren benötigt Trägerteilchen aus beständigem, dichtem, biologisch-inertem Material. Die Trägerteilchen weisen eine extrem geringe Größe auf, liegen typischerweise im Bereich von 1 bis 3 Mikrons, so dass sie im Vergleich zu der Größe der Reis-Ziel-Zelle klein sind. Die Erfinder und ihre Mitarbeiter haben zwei physische Formen von Gold-Träger-Teilchen verwendet. Eine Form besteht aus kleinen sphärischen Gold-Teilchen, die in einem nominellen Größenbereich (in Mikrons) vertrieben werden und typischerweise ±50% in der Größe zwischen jedem Batch variieren. Die andere Form besteht aus mikrokristallinem Gold oder Gold-Puder, indem das Metall bei mikroskopischer Betrachtung als Flakes oder flache Kristalle irregulärer Größe erscheint und das in der Größe stark variiert. Vorzugsweise werden mikrokristalline Gold-Teilchen als Trägerteilchen verwendet. Eine bevorzugte Quelle der mikrokristallinen Gold-Teilchen ist das "Gold-Puder A1570" der Engelhart Corporation, East Brunswick, New Jersey. Es wurde festgestellt, dass mikrokristalline Träger-Teilchen irregulärer Größe eine höhere Transformationseffizienz als sphärische Gold-Teilchen erzielen.
  • Das genetische Material, das in die Zellen insertiert wird, wird auf die Träger-Teilchen geschichtet. Dies kann durchgeführt werden, indem Lösungen mit DNS oder RNS auf den Träger-Teilchen selbst präzipitiert werden. Geeignete Stabilisatoren können zu der Mischung gegeben werden, welche die Langlebigkeit des genetischen Materials auf den Träger-Teilchen verbessern.
  • Ein typisches Verfahren zur Beschichtung von Gold-Kügelchen mit Nukleinsäure-Konstrukten wird wie folgt durchgeführt:
    10 mg amorphes, kristallines Gold wird auf den Boden eines 1,5 ml Eppendorf Mikrofugenröhrchens abgemessen. Man sollte dabei Vorsicht walten lassen, um sicherzustellen, dass Gold nicht auf die Seiten des Röhrchens gelangt, da hierdurch die Resuspension des Goldes wegen dem geringen Volumen, das in dem Verfahren verwendet wird, erschweren würde. 100 ìl eines Puffers werden zugegeben und das Röhrchen wird vorsichtig geschüttelt, wobei der Puffer aus 150 mM NaCl, 10 mM Tris-CHl, pH 8,0, besteht. 20,0 ìg der Plasmid-DNS werden zu dem Mikrofugenröhrchen gegeben und das Röhrchen wird vorsichtig für 5–10 Sekunden geschüttelt. 100 ìl an 0,1 M Spermidin-Lösung (freie Base) werden zu dem Mikrofugenröhrchen gegeben und das Röhrchen wird geschüttelt. 100 ìl einer 25% PEG-Lösung (MW 1300–1600) werden zugegeben und das Röhrchen wird gründlich geschüttelt. Während die DNS/Träger-Teilchen/PEG-Mischung geschüttelt wird, werden 100 ìl an 2,5 M CaCl2 Tropfen für Tropfen zu dem Röhrchen gegeben. Das Schütteln wird beendet und das Röhrchen wird bei Raumtemperatur für 10 Minuten inkubiert. Zu diesem Zeitpunkt ist die Nukleinsäure aus der Lösung und auf das Gold ausgefällt.
  • Die Mischung aus DNS und Träger-Teilchen wird kurz in einer Mikrofuge zentrifugiert. Der gereinigte Überstand wird vollständig entfernt. Das Präzipitat, bestehend aus DNS und Träger-Teilchen, wird in 10 ml 100 Ethanol resuspendiert. Die resuspendierte DNS und Träger-Teilchen-Mischung wird 2 oder 3 Mal für 1 Sekunde in einem Wasserbad-Ultraschall-Gerät Ultraschall-behandelt. Diese Zusammensetzung kann für einige Zeit gelagert werden. Die resultierende Lösung wird anschließend auf ein 18 × 18 mm Trägerblatt in einer Menges von 163 ìl pro Trägerblatt oder einer errechneten Rate von 0,05 mg/cm2 des Trägerblattes geschichtet. Zusammengefasst werden Gold-Teilchen mit DNS in einer Menge von etwa 2 mg DNS/1 mg Teilchen beschichtet und die Teilchen werden in einer Konzentration von 0,5–1,0 mg Teilchen/1 ml Ethanol resuspendiert.
  • C. Beschuss in Kultur gezogener Embryonen
  • Die Vorrichtung, die für die vorliegende Erfindung verwendet wird, muss in der Lage sein, die mit Nukleinsäurebeschichteten Teilchen in einer solchen Art in Pflanzen-Zellen einzubringen, dass ein geeignete Anzahl an Zellen transformiert werden kann. Die Träger-Teilchen landen innerhalb der Reiszellen in einer Frequenz und, aufgrund eines wenig verstandenen Verfahrens, das genetische Material verlässt die Träger-Teilchen und integriert in die DNS der Reis-Wirtszellen. Viele Arten mechanischer Systeme können Träger-Teilchen in Pflanzenzellen beschleunigen. Geeignete Verfahren umfassen ballistische, explosive Beschleunigung der Teilchen, zentrifugale Beschleunigung der Teilchen, elektrostatische Beschleunigung der Teilchen oder analoge Systeme, die in der Lage sind Impuls und Geschwindigkeit auf kleine Teilchen zu übertragen.
  • Der in dem Beispiel verwendete Mechanismus basiert auf einer Beschleunigung der Teilchen mittels eines einstellbaren, elektrischen Spannungs-Funkenentladungsgerätes, welches in der Lage ist ein planares Trägerblatt auf eine Zieloberfläche hin zu beschleunigen. Dieses Gerät wird nachfolgend unter Verweis auf die 1 und 2 näher beschrieben.
  • Das Teilchenbeschleunigungsgerät wird allgemein als 10 in 1 bezeichnet. Das Gerät besteht aus einer Funkenentladungskammer 12, in die zwei Elektroden 14 in einem Abstand von etwa 1 bis 2 mm eingefügt sind. Die Funkenentladungskammer 12 ist ein horizontal ausgedehntes Rechteck, das zwei Öffnungen aufweist, 16 und 18, die sich zu dem oberen Ende hin fortsetzen. Die Öffnung 16 wird durch eine Abdeckplate 20 abgedeckt. Die Öffnung 18, die sich auf der Seite der Funkenentladungskammer des Rechtecks befindet, die gegenüber der Elektrode 14 liegt, ist dazu vorgesehen, durch ein Trägerblatt 22 abgedeckt zu werden.
  • Elektroden 14 werden durch eine geeignete Quelle elektrischer Spannungsentladung (nicht gezeigt) verbunden. Eine geeignete Quelle elektrischer Spannungsentladung umfasst einen Kondensator im Bereich von 1 bis 2 Mikrofarad. Die Spannung der Ladung, die durch den Kondensator zugeführt wird, sollte einstellbar sein. Eine einstellbare Spannung kann in einfacher Weise in einen entsprechenden Kondensator über die Verwendung eines Autotransformators erzielt werden, welcher in einem Bereich von 1 bis 50 000 Volt einstellbar sein kann. Vorzugsweise wird eine elektrische Hochspannungsschaltung vorgesehen, so dass der Kondensator sicher über die Elektroden 14 entladen werden kann, ohne dem Anwender zu schaden.
  • Ein Trägerblatt 22 wird auf die Öffnung 18 der Funkenentladungskammer 12 gelegt. Das Trägerblatt 22 ist ein planares Blatt aus relativ steifem Material, das in der Lage ist, kleine, inerte Träger-Teilchen auf seiner Oberfläche zu einer Zieloberfläche zu transportieren. Vorzugsweise besteht Trägerblatt 22 aus einem kleinen Blatt eines aluminisierten, mit Saran beschichteten Mylar. Wir gehen jedoch davon aus, dass andere, relativ steife, planare Materialien ebenfalls als Trägerblatt 22 verwendet werden können. Die Funktion des Trägerblattes besteht darin, die nach außen gerichtete Kraft, welche durch die Elektroden erzeugt wird, in eine breit verteilte horizontale Kraft umzuwandeln, die in der Lage ist, eine große Anzahl der Träger-Teilchen parallel mit einer gleichen Kraft zu beschleunigen. Andere Arten an Kraft als elektrische Entladung können verwendet werden, um das Trägerblatt 22 nach oben zu beschleunigen. Die Kraft sollte jedoch einstellbar sein, so dass die Kraft der Bewegung des Trägerblattes 22 eingestellt werden kann.
  • Unter Bezugnahme auf das Gerät der 1 und 2, befindet sich ein Rückhalteschirm 24 etwa 15 mm oberhalb der Öffnung 18 und der Entladungskammer 12. Eine Zieloberfläche 26 wird oberhalb des Rückhalteschirms 24 in einer Entfernung zwischen 5 und 25 mm platziert. Die Zieloberfläche 26 ist irgendeine geeignete Kulturoberfläche, auf die das zu transformierende Reis-Gewebe ohne weiteres platziert werden kann. Wir haben festgestellt, dass ein umgedrehte Petrischale für die Transformation der Pflanzengewebe verwendet werden kann. Unter Verwendung eines auf Agar basierenden festen Mediums im Boden der Petrischale ist es möglich Reis-Gewebe auf den Agar zu platzieren, so dass sie darauf zurückgehalten werden. Die Petrischale selbst kann als Zieloberfläche dienen, während sie Reis-Gewebe auf dem Agar zurückhält.
  • Die DNS-beschichteten Teilchen werden auf die Oberfläche des Trägerblattes 22 gelegt. Die Ablage wird so durchgeführt, dass eine relativ gleichmäßige Verteilung der Träger-Teilchen auf der gesamten Oberfläche des Trägerblattes 22 erzielt wird. Vorzugsweise werden die Träger-Teilchen auf das Trägerblatt in einer Ladungsmenge von 0,025 bis 0,050 mg beschichteter Träger-Teilchen pro Quadratzentimeter Trägerblatt platziert. Das Trägerblatt 22 wird auf die Öffnung 18 gelegt. Die Zieloberfläche 26 mit dem Reis-Gewebe darauf wird oberhalb des Rückhalteschirms 24 platziert. Ein kleiner Tropfen Wasser, vorzugsweise 10 ìl, wird in die Kammer gegeben, die sich zwischen den Enden der beiden Elektroden befindet. Die Zugangsplatte wird in ihre Position auf die Oberfläche der Funkenentladungskammer 12 gelegt.
  • Zu diesem Zeitpunkt wird das gesamte Gerät in eine Vakuumkammer eingeschlossen und ein Vakuum im Bereich von etwa 500 mm Quecksilber wird gezogen. Während das Vakuum erstellt wird, wird eine Menge Helium in die Vakuumkammer geblasen. Die Vakuumkammer enthält daher ein relatives Vakuum im Verhältnis zur Atmosphäre und die Atmosphäre innerhalb der Kammer enthält Helium. Die geringere Dichte des Heliums, in Verbindung mit dem verringerten Druck, verringert den Sog sowohl auf die Trägerplatte 22 als auch die Träger-Teilchen. Zu der Zeit, zu der die Zugangsplatte 20 und die Trägerplatte 22 auf die Entladungskammer 12 gelegt werden, bevor das Vakuum gezogen wird, verbleibt innerhalb der Entladungskammer 12 ein höherer Druck an reiner Luft, der noch nicht durch Helium ersetzt wird.
  • Das Transformationsverfahren mittels beschleunigter Teilchen wird zu diesem Zeitpunkt in Gang gesetzt. Die Spannung aus dem Kondensator wird elektrisch auf die Elektroden 14 entladen. Die Spannung in dem vorliegenden Verfahren lagen in dem Bereich von 10–25 kV. Der Bereich von 10–16 kV ist bevorzugt. Die Spannung wird durch die Verwendung einer geeigneten elektrischen Schaltung, wie oben beschrieben, entladen. Die Spannung der elektrischen Entladung initiiert einen Funken, welcher über die Lücke zwischen den Elektroden 14 überspringt und den kleinen Tropfen Wasser, der zwischen die Elektroden platziert wurde, verdampfen lässt. Die Kraft der Verdampfung erzeugt eine starke atmosphärische Schockwelle innerhalb der Funkenentladungskammer 12. Die Schockwelle richtet sich von den Elektroden in alle Richtungen ausgehend radial nach außen. Aufgrund der nicht-veränderbaren Seiten der Kammer richten sich die Folgen der radialen Schockwelle im Inneren der Entladungskammer 12 auf das Trägerblatt 22, welches mit großer Geschwindigkeit nach oben beschleunigt wird. Das sich nach oben bewegende Trägerblatt 22 beschleunigt mit großer Kraft nach oben, bis es den Rückhalteschirm 24 erreicht. Der Austausch der verbleibenden Atmosphäre in der Kammer durch Helium hilft der Bewegung des Trägerblattes 22, da Helium einen geringeren Sog auf den Flug des Trägerblattes und die Träger-Teilchen selbst ausübt. Bei dem Rückhalteschirm 24 trifft das Trägerblatt 22 den Rückhalteschirm 24 und wird zurückgehalten. Im Gegensatz dazu fliegen die Nukleinsäurebeschichteten Teilchen von dem Trägerblatt und bewegen sich frei auf die Reis-Gewebe. Die kleinen Träger-Teilchen treffen anschließend das Reis-Gewebe auf der Zieloberfläche und gelangen in die Zellen des Gewebes.
  • D. Regeneration der Reispflanzen
  • Aus dem beschossenen embryonalen Gewebe müssen Pflanzen erzeugt werden. Entweder auf der zellulären oder der Pflanzen-Stufe, müssen die Pflanzen gescreent oder selektiert werden, um die transformierten Gewebe und Pflanzen von den nicht-transformierten Gewebe und Pflanzen zu trennen, da in den meisten Teilchen-vermittelten Pflanzen-Transformationsereignissen die nicht-transformierten Pflanzen die Mehrzahl der gewonnenen Pflanzen darstellt. In den erfindungsgemäßen Verfahren werden Selektionsverfahren verwendet, beispielsweise können Embryonen, die mit pCMC2114 beschossen wurden, in Gegenwart des Herbizids Bialaphos gezogen werden, um transformierte Pflanzen aus nicht-transformierten Pflanzen auszuwählen. Um die Selektion durchzuführen wird entweder eine kontinuierliche Umsetzung mit dem Selektionsmittel oder eine pulsierte Gabe des Mittels verwendet. Um zu bestimmen, ob die Pflanze eine Keimbahn-Transformation aufweist, müssen die Nachkommen der Pflanze auf Gegenwart des insertierten Fremdgens oder der Gene hin analysiert werden. Das Selektionsverfahren hat sich nicht als völlig ausreichend erwiesen, da eine wesentliche Anzahl an nicht-transformierten erhalten wurde. Die Verwendung der Selektion ist jedoch nützlich, da sie den Pool der möglicherweise transformierten Pflanzen vergrößert, die so gescreent werden müssen, dass ein größerer Prozentsatz ausgewählter Pflanzen im Verhältnis zu dem Prozentsatz gewonnener nicht-selektierter Pflanzen transformiert ist.
  • 1. Regeneration der Indica-Embryonen
  • Zunächst muss Callus aus den transformierten Zellen induziert werden. Callus-Induktionsverfahren sind im Bereich der Pflanzenbiologie allgemein verbreitet. Beispielsweise haben Hartke und Lorz, J. Genet. & Breeding 43: 205–214 (1989) somatische Embryogenese und Pflanzenregeneration verschiedener Indica-Genotypen beschrieben. Ein MS-Medium mit 2,4-D kann auch verwendet werden, gibt jedoch offenbar nicht optimale Ergebnisse. Beschossene Embryonen werden auf ein Medium übertragen, das Callus-Wachstum fördert. Ein geeignetes Mediums ist das CC-Medium, das mit 1 g/l Casein-Hydrolysat und 2 mg/l 2,4-D supplementiert wurde. Geeignete Wachstumsbedingungen sind 25°C im Dunklen. Nach etwa 4 Wochen wird Callus gebildet.
  • Triebe müssen in dem transformierten Callus induziert werden. Ein geeignetes Medium für die Induktion von Trieben ist das CC-Medium, welches 0,05 mg/l Zeatin und 1 mg/l IAA enthält. (Diese Kombination wird als "CCIZ1" bezeichnet.) Geeignete Wachstumsbedingungen bestehen aus 16 Stunden Photoperiode bei 26°C. Triebe erscheinen typischerweise nach 10 bis 20 Tagen. Die Triebe werden anschließend zur Subkultur auf CCIZ1 aufgetrennt. Diese Triebe oder irgendein anderes beschossenes oder transformiertes Gewebe können auf die Gegenwart des Fremdgens hin analysiert werden. Die Wurzelbildung in den Trieben wird durch ein geeignetes Medium induziert, wie beispielsweise 1/2 MS-Medium mit 20 g/l Sucrose und 0,5 mg/l IBA, und entwickeln sich zu reifen Reispflanzen. Reife Pflanzen werden auf die Gegenwart des Fremdgens hin analysiert.
  • Die Vererbbarkeit des Fremdgens wird anschließend verifiziert.
  • 2. Regeneration der Japonica-Embryonen durch Embryogenese
  • Die Regeneration der Japonica-Embryonen ist sehr ähnlich zu der der Indica-Embryonen. Generell wird jedoch das MS-Medium gegenüber dem CC-Medium für Japonica bevorzugt. Nach dem Beschuss werden die Japonica-Embryonen auf MS-Medium, das 0,5 mg/l 2,4-D enthält, platziert, um Callus-Wachstum zu induzieren. Nach etwa 2 Wochen werden die Calli auf ein Triebförderndes Medium überführt, wie beispielsweise MS-Medium, das 50 g/l Sucrose, 2 mg/l Kinetin, 1 mg/l NAA, 0,8% gewaschenen Agar und 300 mg/l Casein-Hydrolysat enthält. (Diese Kombination wird als "MS+" bezeichnet.) Geeignete Wachstumsbedingungen bestehen aus 16 Stunden Photoperiode bei 26°C. Triebe entwickeln sich nach 7 bis 14 Tagen und werden auf ein Medium zur Förderung des weiteren Wachstums übertragen, wie beispielsweise MS-Medium, das 1 mg/l IAA und 1 mg/l Zeatin enthält. Einzelne Triebe werden auf ein Wurzelinduierendes Medium gelegt, wie beispielsweise 1/2 MS-Medium mit 20 g/l Sucrose und 0,5 mg/l IBA, um reife Pflanzen zu erhalten. Wie bei Indica können transformierte Gewebe oder reife Pflanzen auf das Fremdgen hin untersucht werden. Die Vererbbarkeit des Fremdgens wird anschließend verifiziert.
  • Unabhängig von der Sorte, Japonica, Indica oder gemischt, kann die Regeneration der Pflanzen am einfachsten mittels Embroygenese durchgeführt werden, kann aber organogene Triebe umfassen. Embryogenese bezeichnet das Verfahren, mittels dessen sich ein somatischer Embryo durch ein Entwicklungsmuster ähnlich der zygotischen Embryogenese in ganzen Pflanzen entwickelt. Embryogene Triebe überwiegen in den oben beschriebenen Regenerationsverfahren. Die embryogenen Triebe werden als Nachkommen einer einzelnen Primordia betrachtet, da sie klonal und nicht-chimär sind. Organogene Verfahren umfassen die Entwicklung von Organstrukturen (d. h. Triebe oder Wurzeln) aus differenzierten Gewebestrukturen und werden üblicherweise chimäre Pflanzen erzeugen. Überraschenderweise überwiegt die embryogene Regeneration in diesen Callus-Kulturen und klonal transformierte Embryonen können in relativ hoher Frequenz erzeugt werden.
  • BEISPIELE
  • A. Transformation der Reis-Embryonen unter Verwendung des Japonica-Verfahrens
  • Samen wurden aus im Gewächshaus gezogenen Gulfmont-Reis, einer populären Sorte in den USA, geerntet. Während der Durchführung dieses Experiments war man davon ausgegangen, das Gulfmont eine reine Japonica-Sorte ist. Später verfügbare detaillierte Abstammungsinformation wies darauf hin, dass dies nicht der Fall ist, und Gulfmont sowohl Indica- als auch Japonica-Abstammung umfassen könnte. Die unreifen Samen wurden durch Einweichen in Bleichungsmittel für 5 Minuten sterilisiert und anschließend in einer SDW (steriles destilliertes Wasser) und CCB (Carbencillin, 400 mg/l, Cefotaxim, 100 mg/l und Benomyl, 50 mg/l) extensiv gespült. Die Hochblätter, die die Samen umgeben wurden mikroskopisch entfernt und die Samen nochmals auf eine Mischung aus SDW und CCB gelegt. Die unreifen Samen wurden nochmals in 50% Bleichungsmittel für 1 Minute sterilisiert und 4 Mal mit einer Mischung aus SDW und CCB gespült.
  • Die unreifen Embryonen wurden aus den sterilisierten Samen ausgeschnitten. Diese Embryonen wiesen eine Größe zwischen 0,5 und 1,5 mm auf. Die ausgeschnitten Embryonen wurden mit dem Scutellum nach oben auf CC-Medium, das zusätzlich 2,0 mg/1,4-D und 1 g/l Casein-Hydrolysat enthielt, gelegt und bei 25°C 24 Stunden im Dunkeln belassen.
  • Nach 24 Stunden der Vorbehandlung wurden die Embryonen mit Träger-Teilchen, die mit dem Plasmid pCMC2114 (3) beschichtet waren, beschossen. In diesem Beispiel wurden etwa 100 Embryonen bei 10–16 kV beschossen. Zwei Tage nach dem Beschuss wurden die Explantate auf MS-Medium gelegt, zu dem 2,4-D in eine Konzentration von 0,5 mg/l und Bialaphos in einer Konzentration von 10 mg/l gegeben worden war. Die Bialaphos-Selektion wurde während der gesamten Kultur auf MS+-Medium aufrechterhalten. Anschließend verblieben die Embryonen für 2 Wochen auf einem Callus-Induktionsmedium.
  • Nach Induktion des Callus wurden die Calli auf MS+-Medium überführt und mittels einer 16 stündigen Photoperiode bei 26°C gezogen. Aus dem Callus entwickelten sich Triebe. Während sich die Triebe entwickelten, wurden sie zur weiteren Kultur aus MS-Medium, das zusätzlich 1 mg/l IAA und 1 mg/l Zeatin enthielt, entfernt. Die Wurzelbildung einzelner Triebe wurde auf 1/2 MS-Medium induziert, das 20 g/l Sucrose und 0,5 mg/l IBA enthielt.
  • Von 100 Explantaten wurden 18 Triebe gewonnen. Drei Triebe zeigten eine teilweise positive Reaktion, als sie einem GUS-histochemischen Nachweisverfahren unterworfen wurden. Ein Trieb, der einem destruktiven Nachweisverfahren unterworfen wurde, war vollständig blau. Ein weiterer Trieb zeigte eine positive Reaktion in einer Polymerasekettenreaktion, PCR, schien jedoch keine Keimbahn-Transformanion aufzuweisen. Ein weiterer Trieb, der einen positiven PCR-Nachweis für einen kleinen Teil des Triebes erzeugt hatte, wurde in das Gewächshaus überführt und auf ein Reis-Mix gepflanzt (gleiche Mengen Sand, Torf, Perlstein und Boden). Diese Pflanze ist inzwischen eine reife Pflanze und hat Nachkommen. Es wurde festgestellt, dass die Pflanze selbst (R0) sowohl das GUS- als auch BAR-Gen in allen Blättern der Pflanze expremiert. Southern-Blot-Analyse der Pflanze bestätigte die Gegenwart der DNS für beide Gene. Solche Ergebnisse weisen darauf hin, dass diese Pflanze eine Keimbahn-Transformation aufweist. Es wurde festgestellt, dass die Nachkommen der Pflanze die Produkte der durch pCMC2114 kodierten Gene expremieren. Die Aufteilung der Transgenen in der ersten Nachkommengeneration (R1) wies das erwartete Verhältnis von 3:1 auf.
  • Mehrere hundert R1 Nachkommen dieser Pflanze konnten bis jetzt zur Reife gezogen werden. Southern-Blot-Analysen bestätigten die stabile Integration und Vererbbarkeit der insertierten DNS. Die Pflanzen zeigen sich auch als sehr resistent gegenüber einer Applikation eines Glutamin-Synthaseinhibitor-Herbizids. Die Applikation des Herbizids BASTA (Markenname für Bialaphos) in einer Menge von 500 ppm bei einer Applikation auf das Blatt schädigte die Pflanzen nicht sichtbar, die kontinuierlich wuchsen und Wuchskraft behielten. In destruktiven Nachweisverfahren (für GUS) konnten transformierte, klonale Embryonen in einer Frequenz zwischen 10% und 50% der erhaltenen Embryonen mit oder ohne Selektion erzielt werden.
  • B. Transformation der Indica-Reis-Embryonen
  • Das Verfahren zur Transformation des Indica-Reis, das hier durchgeführt wurde, ist sehr ähnlich zu dem des Japonica-Reis. Die beschossenen Indica-Embryonen wurden in Kultur auf einem Medium gezogen, das für deren Wachstum besser geeignet ist.
  • Die Samen wurden aus den Panicle von im Gewächshaus gezogenen IR54 Reis, einer Indica-Sorte, geerntet. Die unreifen Samen wurden durch Eintauchen in 50% Bleichungsmittel für 5 Minuten sterilisiert und ausführlich in einer Mischung aus SDW und CCB gespült. Die den Samen umgebenden Hochblätter wurden mikroskopisch entfernt und der Samen wurde auf eine Mischung aus SDW und CCB gelegt. Der unreife Samen wurde nochmals in 50% Gleichungsmittel für 1 Minute sterilisiert und 4 Mal in SDW und CCB gespült.
  • Unreife Embryonen in einer Größe von 0,5 mm bis 1,5 mm wurden aus dem Samenmantel ausgeschnitten und zur Transformation auf CC-Medium (Tabelle 1) vorbehandelt, das mit 1 g/l Casein-Hydrolysat und 2 mg/l 2,4-D supplementiert wurde. Die Embryonen wurden bei 25°C ins Dunkle gelegt. Nach 24 Stunden auf diesem Medium wurden die Embryonen mit Nukleinsäurebeschichteten Träger-Teilchen beschossen, wie oben beschrieben. In diesem Beispiel wurden etwa 100 Embryonen bei 10 kV mit Teilchen beschossen, die mit dem Plasmid pCMC1515 beschichtet waren. Das Plasmid pCMC1515 ist ähnlich zu pCMC2114, wobei es anstelle der kodierenden Sequenz des Bar-Gens eine kodierende Sequenz für Hygromycin-Resistenz aufweist.
  • Nach dem Beschuss wurden die Embryonen auf CC-Medium mit 1 g/l Casein-Hydrolysat und 2 mg/l 2,4-D gelegt und verblieben bei 25°C für 4 Wochen im Dunkeln. Zwei Tage nach dem Beschuss wurde eine Hygromycin-Selektion für 2 Wochen durchgeführt. Nach 4 Wochen wurden die Calli auf CC-Medium, das 0,05 mg/l Zeatin und 1 mg/l IAA enthielt, bei einer 16 stündigen Photoperiode bei 26°C überführt. Die Triebe erschienen und wurden zur Subkultur auf CCIZ1 aufgetrennt. Getrennte Wurzelbildung wurde bei den Trieben auf 1/2 MS-Medium mit 20 g/l Sucrose und 0,5 mg/l IBA induziert.
  • Wir haben eine große Vielzahl an Trieben auf GUS-Aktivität mittels des histochemischen Standard-Nachweisverfahrens untersucht. Pflanzen mit Nicht-Keimbahn-Transformation wurden in der Regel gewonnen. Eine Pflanze mit Keimbahn-Transformation wurde ferner identifiziert, die sowohl für das Transgene im PCR-Nachweis positiv ist, als auch in allen ihren Geweben GUS deutlich expremiert.
  • C. Selektion der Transformierten
  • In dem Verfahren zur Erzeugung von Japonica- und Indica-Embryonen, das oben beschrieben wurde, erscheint die Selektion und/oder Anreicherung möglicherweise Transformierter mittels Herbizid oder Antibiotika-Stress funktional. Mehrere Callus-Kulturen wurden zur Induktion der Embryonen auf Medium überführt, zu dem Bialaphos in einer Konzentration von 10 mg/l gegeben worden war. In wiederholten Versuchen, die durch ein endgültiges Nachweisverfahren (für GUS) beendet wurden, erzeugten die Calli eine große Vielzahl an Trieben, von denen nachgewiesen werden konnte, dass sie klonal transformiert worden waren. Obwohl die Selektion nicht vollständig ist, scheint die Anreicherung der erhaltenen Trieb-Population daher die Selektion zu rechtfertigen.

Claims (8)

  1. Verfahren zur Erzeugung einer transformierten Reispflanze, umfassend Schritte, bei denen man: (a) Kopien eines Nukleinsäurekonstruktes erzeugt; (b) biologisch inerte Trägerpartikel mit Kopien des Nukleinsäurekonstruktes beschichtet; (c) ein unreifes Reis-Embryo isoliert; (d) das in Kultur gezogene Embryo auf eine Zieloberfläche platziert; (e) das in Kultur gezogene Embryo mit den mit Nukleinsäurebeschichteten Trägerpartikeln beschießt, wobei die Partikel physisch so auf die Zieloberfläche beschleunigt werden, dass einige Partikel in mindestens einigen der Zellen des Embryos landen; (f) das beschossene Embryo in Kultur zieht, so dass Triebe aus dem beschossenen Embryo entstehen, und den Prozentsatz der Triebe, die transformiert wurden, anreichert, indem die Triebe einem Selektionsmittel ausgesetzt werden; (g) die in Schritt (f) gebildeten Triebe zu ganzen, sexuell reifen Pflanzen zieht; (h) die Gegenwart des Nukleinsäurekonstruktes in den in Schritt (f) gebildeten Trieben oder in den in Schritt (g) gebildeten Pflanzen verifiziert; und (i) die Vererbbarkeit des Nukleinsäurekonstruktes verifiziert.
  2. Verfahren gemäß Anspruch 1, indem die Embryos vor Schritt (e) vorbehandelt werden.
  3. Verfahren gemäß Anspruch 1, bei dem die Vorbehandlung die Kultur der Embryos in Gegenwart eines Auxins umfasst.
  4. Verfahren gemäß Anspruch 1, bei dem die Länge des isolierten Embryos etwa 0,5 bis 1,5 mm beträgt.
  5. Verfahren gemäß Anspruch 1, bei dem die isolierten Embryonen von der Sorte Indica abstammen.
  6. Verfahren gemäß Anspruch 1, bei dem die isolierten Embryonen von der Sorte Japonica abstammen.
  7. Verfahren gemäß Anspruch 1, bei dem Schritt (f) die Induktion einer embroynalen Callus-Kultur und die Kultur der Embryonen von embryonalem Callus in Triebe umfasst.
  8. Verfahren gemäß Anspruch 1, bei dem das Selektionsmittel das Herbizid Bialaphos ist.
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