DE69931619T2 - Partikel-transformation von sojabohnen mit glyphosat-selektion - Google Patents

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Description

  • Querverweis auf verwandte Anmeldungen: entfällt.
  • Angaben zu bundesstaatlich unterstützter Forschung: entfällt.
  • Hintergrund der Erfindung
  • Die moderne Wissenschaft der Gentechnik oder Biotechnologie hat mehrere nützliche Techniken zur Verbesserung von Kulturpflanzen geliefert. Viele dieser Verbesserungen beruhen auf der gentechnischen Veränderung von Pflanzen, die die Übertragung von Genen unterschiedlicher Herkunft in die vererbbare Keimbahn von Kulturpflanzen beinhaltet, so dass diese Gene dann zur Verwendung in der modernen Landwirtschaft leicht in oder zwischen Elitelinien dieser Pflanzen gezüchtet werden können. Es gibt mehrere Techniken, die für die Einführung von Fremd-Genen in Pflanzen, ein Verfahren, das als Gentechnik bekannt ist, oder zur Pflanzentransformation zur Verfügung stehen. Im Allgemeinen sind die Techniken für die Abgabe der Gene in Pflanzen unabhängig von den übertragenen Genen, und jede Technik, die für eine Pflanzenspezies ausgearbeitet wurde, kann verwendet werden, um jedes besondere interessierende Gen in diese Pflanzen einzuführen. Da die Kultivierungstechniken für verschiedene Pflanzen ganz verschieden sind und da Transformationstechniken im Allgemeinen eine intensive Laborkultivierung von transformiertem Pflanzengewebe erfordern, sind Transformationsverfahren häufig artspezifisch, und die spezifischen Transformationsvorschriften, die bei einer Pflanzenspezies am effizientesten verwendet werden, funktionieren häufig bei anderen Pflanzenspezies nicht gut.
  • Die meisten Pflanzentransformationstechniken beruhen auf der Einführung von Fremd-Genen in einzelne Zellen von Gewebe dieser Pflanzenspezies, das in einer Gewebekultur gehalten wird. Zum Beispiel beruht die häufigste Pflanzentransformationstechnik bei zweikeimblättrigen Pflanzen auf der Fähigkeit des Bakteriums Agrobacterium tumefaciens zur Übertragung eines Teils seiner DNA aus dem Bakterium in das Genom von einzelnen Zellen zweikeimblättriger Pflanzen in Kultur. Typischerweise umfasst die Fremdgenkonstruktion, die in die Pflanzenzelle übergeführt wird, ein interessierendes Gen, das man zusammen mit einem Selektionsmarker, der der transformierten Pflanzenzelle Resistenz gegenüber einem chemischen Selektionsmittel verleiht, in die Keimbahn der Pflanze einführen möchte. Im Falle der Agrobacterium-vermittelten Transformation wird die Transformation häufig mit einer Kalluskultur durchgeführt, einer Form von undifferenzierter Pflanzenzelle, die sich in Gewebekultur vermehrt. Die Transformationsvorschrift erfordert dann typischerweise die Anwendung des Selektionsmittels auf das Pflanzenkallusgewebe, in dem einige transformierte Zellen enthalten sind. Der Zweck des Selektionsmarkers und des Selektionsmittel-Gens besteht darin, die Zellen, die die eingeführte DNA enthalten, von den nicht transformierten Zellen zu trennen, wobei die Trennung durchgeführt wird, indem man alle oder im Wesentlichen alle nichttransformierten Zellen abtötet. Solche Techniken werden verbreitet für die Agrobacterium-vermittelte Transformation einer Vielzahl von zweikeimblättrigen Spezies verwendet.
  • Aus einer Vielzahl von Gründen funktionieren diese Techniken nicht bei allen Pflanzen gut, auch nicht bei allen zweikeimblättrigen Pflanzenspezies. Für die Sojabohne wurde eine frühe Transformationstechnik entwickelt, die zu einer großen Zahl von transgenen Sojapflanzen führt, wobei die Technik auf dem Ansatz der partikelvermittelten Genabgabe beruht. In einem partikelvermittelten Genabgabeverfahren werden kleine Trägerpartikel mit der in die Pflanzenzellen einzufügenden DNA beschichtet, und diese Partikel werden dann physikalisch beschleunigt und in Gewebe der Pflanze befördert. Die Trägerpartikel sind im Vergleich zu den Zellen der Pflanze sehr klein, so dass sie das genetische Material tatsächlich an Zellen der Pflanze abgeben, ohne diese Zellen zu töten.
  • Die partikelvermittelte Genabgabe kann entweder mit Zellen einer Kultur oder mit tatsächlich wachsendem differenziertem Pflanzengewebe durchgeführt werden. Das US-Patent Nr. 5,015,580 beschreibt einige der ersten Bemühungen zur Schaffung von transgenen Sojapflanzen durch die Verwendung von partikelvermittelten Transformationstechniken.
  • Die in dem oben identifizierten Patent entwickelte Technik wurde in dem Verfahren, das im US-Patent Nr. 5,503,998 beschrieben ist und das eine verbesserte Transformationsvorschrift beschreibt, die sowohl für Soja- als auch für andere Pflanzen geeignet ist, weiter verfeinert. Bei diesem Verfahren wird kein Selektionsmittel verwendet. Der Grund dafür, dass bei diesem Verfahren ein Selektionsmarker nicht geeignet war oder verwendet wurde, bestand darin, dass das Verfahren auf der Transformation einer geringen Zahl von Zellen beruhte, die im wachsenden Meristem eines unreifen Embryos einer Sojapflanze enthalten sind. Es war schwierig, bei den damals üblicherweise verwendeten Selektionsmarkern auf ein Niveau der Anwendung eines Selektionsmittels zu gelangen, das es dem wachsenden Meristem erlauben würde, weiterzuwachsen, und sich dennoch als toxisch für die meisten untransformierten Zellen erweisen würde. Daher wurde in Abwesenheit eines Selektionsmarkers ein anderes System für die Sojabohne verwendet, das durch das im US-Patent Nr. 5,503,998 beschriebene Verfahren geschaffen wurde. Dieses Verfahren beruhte stattdessen auf einem leicht nachweisbaren Marker, der als screeningfähiger Marker bezeichnet wurde und der von dem Gen der beta-Glucuronidase oder GUS verkörpert wurde, das leicht durch einen bequemen kolorimetrischen Assay nachgewiesen werden kann. Bei diesem Verfahren wurde eine partikelvermittelte Genabgabe verwendet, um eine fremde genetische Konstruktion in das Meristem eines unreifen Embryos einzuführen, bei dem dann die direkte Erzeugung von Sojaschösslingen induziert wurde. Bei diesem Verfahren entstand eine große Zahl von kleinen Schösslingen, die aus mutmaßlich transformierten unreifen Embryonen erzeugt wurden. Die Mehrzahl der so erzeugten Schösslinge war nicht transgen. Aufgrund der Verfügbarkeit eines leicht nachweisbaren screeningfähigen Markers und der relativen Leichtigkeit, mit der eine große Zahl von Schösslingen auf die Expression des Selektionsmarkergens getestet werden konnte, war es praktisch und tatsächlich ökonomisch, einfach eine große Zahl von Schösslingen zu schaffen und nach dem seltenen Ereignis zu suchen, bei dem ein transformierter Schössling identifiziert wurde. Dieses Verfahren ermöglichte die leichte Schaffung einer großen Zahl von keimbahntransgenen Pflanzen ohne die Verwendung eines Selektionsmarkers.
  • Man möchte jedoch stets die Effizienz jeder Transformationsvorschrift verbessern. Die Ausarbeitung eines Verfahrens zur Verbesserung der Effizienz des in dem identifizierten US-Patent beschriebenen Verfahrens wäre also vorteilhaft. Eine Methode zur Steigerung der Effizienz würde darin bestehen, einen Selektionsmarker zu finden, der tatsächlich bei dem dort beschriebenen embryonalen Transformationssystem funktioniert.
  • Ein anderer Ansatz zur Transformation einer Sojapflanze beruhte auf der Verwendung des Bakteriums Agrobacterium tumefaciens zur Abgabe von Genen an einzelne Pflanzenzellen. Die US-Patente Nr. 5,416,011 und 5,569,834 beschreiben ein Sojatransformationssystem auf der Basis einer Agrobacteriumvermittelten Genabgabe an Keimblattzellen der Sojapflanze. Dieses System macht sich ein antibiotisches Selektionsmarkersystem zu Nutze, das dazu gebracht wurde, mit diesem Transformationsansatz zu funktionieren.
  • Ein Herbizid, das beträchtliche Aufmerksamkeit als Kandidat zur Verwendung bei der Entwicklung von gentechnisch veränderten Pflanzen erlangt hat, ist N-Phosphonomethylglycin oder Glyphosat. Glyphosat hemmt die 3-Enoylpyruvylshikimat-5-Phosphat-Synthase (EPSP-Synthase), ein Enzym im Shikimasäure-Stoffwechselweg. Der Shikimasäure-Stoffwechselweg ist ein Biosyntheseweg von Pflanzen und Bakterien, bei dem aromatische Aminosäuren, Pflanzenhormone und Vitamine erzeugt werden. Die EPSP-Synthase katalysiert die Umwandlung von Phosphoenolpyruvinsäure (PEP) und 3-Phosphoshikimasäure in 5-Enolpyruvyl-3-phosphoshikimasäure (EPSP).
  • Glyphosat ist ein Herbizid, von dem keine nachteiligen Wirkungen auf die Umwelt bekannt sind und das in der Umwelt auf natürliche Weise abgebaut wird. Glyphosat ist jedoch insofern unspezifisch, als es allgemein eine Hemmung des Wachstums sowohl von Kulturpflanzen als auch Unkräutern bewirkt. Daher kann Glyphosat nicht effektiv als Unkrautbekämpfungsmittel angewendet werden, wenn Glyphosat-intolerante Kulturpflanzen vorhanden sind.
  • Die Einführung von Glyphosat-Resistenz-Markern in Sojapflanzen erlaubt nicht nur eine Verbesserung der Unkrautbekämpfung, sondern erleichterte auch die Entwicklung von gentechnisch veränderten Sojapflanzen mit vorteilhaften Eigenschaften (z.B. höheren Ausbeuten, Schädlingsresistenz, gesteigerter Nährwert und verbesserte Lagereigenschaften). Gegenüber Glyphosat-Herbizid resistente Sojapflanzen finden bereits eine große Akzeptanz auf dem Markt.
  • Glyphosattolerante Pflanzen können erhalten werden, indem man die Pflanzen so verändert, dass sie größere Mengen an EPSP-Synthase produzieren (Shah et al., Science 233: 478–481, 1986). Das US-Patent Nr. 5,633,435, auf das hier ausdrücklich Bezug genommen wird, offenbart EPSP-Synthase-Varianten, die jeweils ein reduziertes Ki für Glyphosat, ein niedriges Km für PEP und eine hohe EPSP-Synthase-Aktivität haben. Es zeigte sich, dass transgene Pflanzen, die ein exprimierbares Gen umfassen, das eine glyphosattolerante EPSP-Synthase codiert, eine erhöhte Toleranz gegenüber glyphosathaltigen Herbiziden aufweisen.
  • Eine weitere Methode, mit der glyphosattolerante Pflanzen erhalten werden können, besteht darin, in Pflanzen ein Gen einzuführen, das ein am Glyphosat-Abbau beteiligtes Protein codiert. Das US-Patent Nr. 5,463,175, auf das hier ausdrücklich Bezug genommen wird, offenbart ein Gen, das Glyphosat-Oxidoreductase (GOX) codiert, ein Enzym, das am Abbau von Glyphosat beteiligt ist. Ebenfalls offenbart sind glyphosattolerante transgene Pflanzen, die ein heterologes Glyphosat-Oxidoreductase-Gen umfassen. Das Enzym Glyphosat-Oxidoreductase katalysiert die Spaltung der C-N-Bindung von Glyphosat unter Bildung von Aminomethylphosphonat (AMPA) und Glyoxylat. Unter aeroben Bedingungen wird Sauerstoff als Substrat bei der Reaktion verwendet. Unter anaeroben Bedingungen dienen andere Elektronenüberträger, wie Phenazinmethosulfat und Ubichinon, als Elektronenakzeptoren. Eine Variante der Glyphosat-Oxidoreductase, die ein zehnmal geringeres Km für Glyphosat als Wildtyp-Glyphosat-Oxidoreductase aufweist, und durch ortsspezifische Mutagenese erzeugte Mutanten dieser Variante wurden ebenfalls offenbart.
  • Damit die Verwendung von agrikulturell nützlichen transgenen Pflanzen, die durch partikelvermittelte Transformation erzeugt werden, ökonomisch machbar ist, muss eine Keimbahntransformation einer Pflanze erhalten werden, so dass die Nachkommen der Pflanze das interessierende Gen ebenfalls tragen. Die Gewinnung von transgenen Pflanzen, die eine transiente Expression eines eingeführten Gens zeigen, ist jetzt zu einem relativ routinemäßigen eindeutigen Verfahren geworden. Die Gewinnung einer keimbahntransformierten Pflanze durch partikelvermittelte Transformationsverfahren, die in der Technik zur Zeit bekannt sind, ist jedoch ein seltenes, wenn auch regelmäßig auftretendes Ereignis.
  • Die US-Patente 5,633,435 und 5,463,175 offenbaren glyphosattolerante Sojapflanzen, die durch Mikropartikel-Injektionstransformation erhalten wurden. Obwohl das Verfahren die Einführung eines Selektionsmarkers in eine Pflanze oder Pflanzenzelle beinhaltet, ist der Transformationsvorgang ein arbeitsintensives Zellkulturverfahren.
  • Das im US-Patent Nr. 5,503,998 offenbarte Verfahren sorgt zwar für eine Reduktion der Menge an Arbeit, die geleistet werden muss, um ein Keimbahn-Transformationsereignis zu identifizieren, doch bleibt die Identifizierung von Keimbahntransformanten ein sehr arbeitsintensives Unternehmen, das eine große Zahl von Schösslingen erfordert, die durchmustert werden müssen. Bei Verwendung dieses Verfahrens beträgt die Transformationseffizienz (ausgedrückt als Prozentsatz der erhaltenen Keimbahntransformanten pro Explantat, das der Partikelbombardierung ausgesetzt wurde) nur etwa 0,05%. Um eine einzige keimbahntransformierte Pflanze zu erhalten, muss man daher ungefähr 2000 Explantate einer Partikelbombardierung unterziehen und etwa 6000–8000 Schösslinge durchmustern, wobei man den gewebezerstörenden GUS-Assay verwendet.
  • Was in der Technik benötigt wird, ist ein effizientes Verfahren zur Gewinnung von keimbahntransformierten transgenen Sojapflanzen unter Verwendung von Glyphosat-Selektion.
  • Kurzbeschreibung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein effizientes Verfahren zur Gewinnung von keimbahntransformierten Sojapflanzen unter Verwendung von Glyphosat-Selektion.
  • Es ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Gewinnung von keimbahntransformierten Sojapflanzen bereitzustellen, das effizienter, ökonomischer und leichter einzusetzen ist als vorhandene Verfahren.
  • Kurzbeschreibung der Zeichnungen
  • Entfällt.
  • Ausführliche Beschreibung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft eine Vorschrift für die Transformation der Keimbahn von Elitesojasorten mit Fremdgenen. Das Verfahren ist genotypunabhängig und erreicht ein Effizienzniveau, das zuvor mit partikelvermittelten Transformationstechniken, die für die Sojapflanze geeignet sind, nicht erreicht wurde. Diese Effizienz wird zum Teil durch die Verwendung eines Selektionsmarkersystems erhalten, das auf der Verwendung des Herbizids Glyphosat beruht. Es stellt sich heraus, dass die Glyphosat-Selektion wegen der besonderen Eigenschaften des Herbizids Glyphosat in einer Transformationsvorschrift des hier beschriebenen Typs besonders nützlich ist. Glyphosat wird von der Pflanze im wachsenden Meristem der Pflanze biologisch konzentriert. Die in dieser Anmeldung beschriebene Transformationsvorschrift beruht auf der direkten Transformation von wachsendem Meristemgewebe. Als solche funktioniert die Transformationstechnik in Verbindung mit dem Glyphosat, da beide ihre Wirkungen im Meristembereich der wachsenden Pflanze selbst konzentrieren. Auf diese Weise werden Ausbrüche, d.h. untransformierte Ereignisse, die die Selektion überleben, minimiert, und die Selektion erreicht immer noch eine Toxizität für die meisten der nichttransgenen Gewebe. Die im Transformationsvorgang erreichte Gesamteffizienz ist besser als diejenige, die mit anderen Selektionsmarkern in Sojatransformationssystemen auf der Basis einer differenzierten Gewebetransformation erhalten werden kann.
  • Im Verlauf der hier beschriebenen Arbeit zeigte sich auch, dass Glyphosat eine hormonartige Wirkung auf behandelte Sojaschösslinge verursacht. Im Wesentlichen ist es so, dass Glyphosat allein eine Induktion der Bildung mehrerer Schösslinge in behandelten embryonalen Achsen von Sojapflanzen bewirkt. Diese Beobachtung führte zu der unten beschriebenen hormonfreien Regenerationsvorschrift.
  • Beispiele für eine hocheffiziente Keimbahntransformation von Sojagewebe und die Regeneration von glyphosatresistenten Pflanzen aus den transformierten Zellen mit Hilfe des Verfahrens der vorliegenden Erfindung sind unten im Einzelnen beschrieben. Kurz gesagt, erfordert das Verfahren, dass ein heterologes DNA-Konstrukt bereitgestellt wird, das einen Pflanzenpromotor, eine DNA-Sequenz, die ein Protein, welches Glyphosattoleranz verleiht, codiert, und einen 3'-untranslatierten Transcriptionsterminierungsbereich umfasst. Dann werden relativ kleine Trägerteilchen aus biologisch inertem Material mit Kopien des DNA-Konstrukts beschichtet und in die Zellen des Meristemgewebes einer Sojapflanze beschleunigt. Nach der Transformation des Meristems werden Transformanten auf der Basis der Glyphosattoleranz selektiert. Glyphosattolerantes Gewebe wird unter Bildung von Pflanzen regeneriert. Keimbahntransformanten können gege benenfalls durch Glyphosatselektion der Nachkommen einer aus transformiertem Gewebe regenerierten Pflanze überprüft werden.
  • Es werden heterologe DNA-Konstrukte bereitgestellt, die ein oder mehrere in einer Pflanze exprimierbare Gene codieren, die einer Pflanze, die das DNA-Konstrukt in ihrem Genom umfasst, Glyphosattoleranz verleihen. Die DNA-Konstrukte umfassen einen Pflanzenpromotor, der funktionell mit einer DNA-codierenden Sequenz verbunden ist, die ein Protein codiert, das Glyphosattoleranz verleiht, und ein 3'-Terminierungssignal. Vorzugsweise codiert das DNA-Konstrukt ein zusätzliches interessierendes Gen. Zum Beispiel kann das DNA-Konstrukt ein Gen beinhalten, dessen Expression zu erhöhten Ausbeuten oder einem veränderten Nährstoffgehalt in transformierten Pflanzen führt. In den folgenden Beispielen wurden glyphosattolerante Sojapflanzen, die GUS oder Grünes Fluoreszentes Protein (GFP) exprimieren, aus Gewebe erhalten, das mit DNA-Konstrukten transformiert war, die ein GUS-Gen oder ein GFP-Gen beinhalteten. Diese Gene, die als sreeningfähige Marker dienen können, wurden in einigen der unten beschriebenen Beispiele einfach deshalb verwendet, weil ihre Phänotypen in den transformierten Pflanzen leicht nachgewiesen werden können. Es ist vernünftig zu erwarten, dass die vorliegende Erfindung durch Verwendung von DNA-Konstrukten, die durch Standardtechniken der Molekularbiologie geschaffen wurden, eingesetzt werden kann, um eine Sojapflanze zu erhalten, die praktisch jedes andere Gen exprimieren kann.
  • In einer alternativen Ausführungsform beinhaltet das Verfahren zur Gewinnung von keimbahntransformierten Sojapflanzen die Cotransformation von zwei DNA-Konstrukten, von denen eines einen Glyphosattoleranzmarker und das andere ein interessierendes Gen umfasst.
  • Ein geeignetes DNA-Konstrukt umfasst eine Sequenz, die ein oder mehrere der folgenden Enzyme codiert: eine 5-Enolpyruvyl-3-phosphoshikimisäure-Synthase (EPSP-Synthase), eine Glyphosat-Oxidoreductase (GOX) oder eine Kombination von zwei oder mehr Enzymen, die Glyphosattoleranz verleihen. Die Verwendung anderer Gene, die Glyphosatresistenz verleihen, wird ebenfalls in Betracht gezogen.
  • Ein geeignetes DNA-Konstrukt kann eine DNA-Sequenz haben, die eine Wildtyp-EPSP-Synthase oder eine EPSP-Synthase, die gentechnisch verändert oder einer Mutagenese unterzogen wurde, codiert. Vorzugsweise codiert die DNA-Sequenz eine EPSP-Synthase, die glyphosattolerant ist. "Glyphosattolerante EPSP-Synthase" bedeutet eine EPSP-Synthase mit einem hohen Ki für Glyphosat und einem niedrigen Km für PEP relativ zu diesen Parametern bei einer EPSP-Synthase von einer glyphosatempfindlichen Pflanze oder einem glyphosatempfindlichen Mikroorganismus. In den folgenden Beispielen wurde eine DNA-Sequenz, die eine als CP4 bezeichnete glyphosattolerante EPSP-Synthase codiert, in den DNA-Konstrukten verwendet, und es zeigte sich, dass sie Glyphosattoleranz verleiht, wenn sie allein oder zusammen mit anderen Glyphosattoleranz-Genen eingeführt wird. Das CP4 codierende Gen und das CP4-Enzym sind im Einzelnen im US-Patent 5,633,435 beschrieben, auf das hier ausdrücklich Bezug genommen wird. Es wird erwartet, dass auch jede andere EPSP-Synthase mit einem niedrigen Ki für Glyphosat und einem hohen Km für PEP bei der praktischen Durchführung der vorliegenden Erfindung funktionieren würde.
  • Ein DNA-Konstrukt kann ein Wildtyp-Glyphosat-Oxidoreductase-Gen oder ein Glyphosat-Oxidoreductase-Gen, das gentechnisch verändert oder einer Mutagenese unterzogen wurde, beinhalten. Vorzugsweise weist das Glyphosat-Oxidoreductase-Gen ein niedriges Km für Glyphosat auf.
  • In der Technik sind mehrere Promotoren bekannt, die in Pflanzenzellen funktionieren, einschließlich konstitutiven Promotoren pflanzenpathogenen Ursprungs, wie der Nopalin-Synthase(NOS)- und der Octopin-Synthase(OCS)-Promotor, der Blumenkohlmosaikvirus(CaMV)-19S- und -35S-Promotor und der Figwort-Mosaic-Virus(FMV)-35S-Promotor. Außerdem werden zur Zeit Pflanzenpromotoren identifiziert, die tendenziell entwicklungs- oder gewebespezifisch sind. Um ein DNA-Konstrukt mit einem exprimierbaren Glyphosattoleranz-Gen zu schaffen, kann man jeden geeigneten Promotor verwenden, von dem bekannt ist oder sich herausstellt, dass er in Pflanzenzellen eine Transcription von DNA bewirkt. Um für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet zu sein, sollte der Promotor eine ausreichende Genexpression verursachen können, die zur Synthese einer Menge an EPSP-Synthase oder Glyphosat-Oxidoreductase führt, die bewirkt, dass die Pflanzenzelle oder Pflanze im Wesentlichen tolerant gegenüber Glyphosat wird. Vorzugsweise sollte der eingesetzte Promotor in der Lage sein, die Expression in Meristemgewebe sowie in anderen Geweben zu fördern, da bekannt ist, dass Glyphosat in das Meristemgewebe von Pflanzen transloziert und dort angereichert wird.
  • In den folgenden Beispielen wurden Goldträgerteilchen mit den DNA-Konstrukten beschichtet, wie es im US-Patent Nr. 5,015,580 beschrieben ist, auf das hier ausdrücklich Bezug genommen wird. Es wird erwartet, dass die vorliegende Erfindung auch unter Verwendung anderer Verfahren zur Beschichtung von Trägerteilchen ausgeführt werden könnte und dass auch andere biologisch inerte Materialien mit hoher Dichte außer Gold erfolgreich als DNA-Trägerteilchen eingesetzt werden können.
  • In den folgenden Beispielen wurde exponiertes Meristemgewebe verwendet, um glyphosattolerante Sojapflanzen zu erhalten. Es zeigte sich, dass die Verwendung von Meristemgewebe die Häufigkeit von erhaltenen keimbahntransformierten glyphosatresistenten Pflanzen stark erhöht relativ zu der Häufigkeit, die man bei dem Verfahren der US-Patente Nr. 5,463,175 und 5,633,435 erhält, bei denen intakte Embryos nach dem Verfahren von Christou et al. (Plant Physiol. 87: 671–674, 1988) als Zielgewebe dienten. Glyphosat reichert sich bekanntermaßen im Meristem von Sojapflanzen an. Die Anreicherung von Glyphosat im Meristem kann die drastische Erhöhung der Häufigkeit von Keimbahntransformanten relativ zu den gesamten Transformationsereignissen, die man erhält, wenn Meristemgewebe für die Transformation und Regeneration von glyphosattoleranten Sojapflanzen verwendet wird, erklären. Während die Glyphosatselektion schon früher verwendet wurde, um resistente Pflanzen zu selektieren und individuelle undifferenzierte resistente Zellen (wie in einem Kallus) zu selektieren, gab es keine Erfahrungs grundlage für die Verwendung von Glyphosat zum Selektieren individueller Zellen aus einem differenzierten wachsenden Pflanzenmeristem.
  • Die Selektion auf der Basis der Glyphosatresistenz kann die einzige Basis für die Identifizierung von rekombinanten Pflanzen sein, oder sie kann in Verbindung mit anderen Selektions- oder Screeningverfahren verwendet werden. In den folgenden Beispielen wird die Glyphosatselektion allein oder in Konjunktion mit einem Screening nach GUS-Expression verwendet, um transgene Pflanzen zu identifizieren. Obwohl es im Allgemeinen zu bevorzugen ist, wenn man eine effiziente Selektion mit Hilfe eines einzelnen Markers, wie eines Glyphosattoleranzmarkers, erreichen kann, kann es auch Fälle geben, bei denen es wünschenswert oder notwendig ist, mehr als einen Marken zu verwenden, um Rekombinanten zu identifizieren.
  • "Glyphosattoleranz" bedeutet die Fähigkeit einer mit einem Glyphosattoleranz-Gen transformierten Pflanzenzelle oder Pflanze, auf einem Medium zu wachsen, das Glyphosat in einer ausreichenden Konzentration enthält, um untransformierte Zellen signifikant zu hemmen, während das Wachstum von transformierten Zellen ermöglicht wird. Vorzugsweise ist die Konzentration an Glyphosat ausreichend, um das Wachstum von wenigstens etwa 80% der untransformierten Explantate zu hemmen. Die Konzentration an Glyphosat sollte ausreichend sein, um das Überleben von untransformiertem Gewebe zu verhindern, aber nicht so groß, um die Lebenskraft von transformierten Pflanzen erheblich zu reduzieren. In den folgenden Beispielen wurde eine Glyphosatselektion auf glyphosattolerante Pflanzenzellen bei Glyphosatkonzentrationen im Bereich von etwa 0,01 mM bis 1,0 mM durchgeführt. In einigen Fällen erfolgte die Anfangsselektion bei einer höheren Glyphosatkonzentration, z.B. 0,2 mM Glyphosat, und das Explantat wurde anschließend auf eine niedrigere Glyphosatkonzentration, z.B. 0,075 mM, übertragen. Es zeigte sich, dass Konzentrationen im Bereich von 0,025 mM bis 0,2 mM eine signifikante Hemmung von untransformiertem Gewebe ergaben, ohne die Lebenskraft von regenerierten Transformanten wesentlich zu beeinträchtigen. Es wird jedoch erwartet, dass die Verwendung von Glyphosat bei Konzentrationen, die außerhalb des in den Beispielen verwendeten Bereichs fallen, in der vorliegenden Erfindung ebenfalls nützlich wäre.
  • Andere Faktoren, die die Effizienz des Identifizierens einer Transformante, die ein Resistenz-Gen exprimiert, beeinflussen können, sind die zeitliche Abstimmung und die Dauer der Einwirkung des Selektionsmittels. Daher wurde die Wirkung einer Variation dieser Parameter ebenfalls untersucht, und die Ergebnisse sind im Folgenden zusammengefasst. Unter Verwendung des Verfahrens der vorliegenden Erfindung werden mit einem Glyphosattoleranz-Gen transformierte Explantate unmittelbar nach der Partikelbombardierung und/oder mehrere Tage nach der Bombardierung auf einem glyphosathaltigen Medium eingepflanzt, ohne die Transformationseffizienz oder die Zahl der Ausbrüche zu beeinflussen. Der hier verwendete Ausdruck "Ausbrüche" bezieht sich auf untransformierte Explantate, die auf der Grundlage der Glyphosatselektion allein nicht von transformierten Explantaten zu unterscheiden sind. Nach einer Zeit der Selektion nach der Bombardierung kann es vorteilhaft sein, auch wenn es nicht notwendig zu sein scheint, diese Glyphosatselektion zu entfernen, um die Belastung der wachsenden Pflanzenschösslinge zu senken. Es hat sich herausgestellt, dass eine Wegnahme der Selektion während der Schösslings-Verlängerungsphase und danach die Gesamteffizienz des Verfahrens nicht beeinträchtigt.
  • Man kann sich die Gesamtvorschrift der Pflanzentransformation als aus mehreren Phasen bestehend vorstellen, jeweils mit einzigartigen Anforderungen an die Medien, und beispielhafte Medien sind im Folgenden beschrieben. Es gibt eine Konditionierungsphase vor der Bombardierung, die tatsächliche Partikelabgabebehandlung, die Kultur nach der Bombardierung, bei der die Schösslingsbildung induziert wird, die Schösslingsverlängerung und dann die Wurzelbildung und Härtung der Pflanzen. Es hat sich gezeigt, dass es ausreicht, während der Kultur nach der Bombardierung nur die Glyphosatselektion während einer begrenzten Zeit anzuwenden, um die Gesamteffizienz des Transformationsvorgangs drastisch zu erhöhen. Die Anwendung der Glyphosatselektion in anderen Phasen ist nicht so effektiv für die Erhöhung der Effizienz.
  • Die Transformationseffizienz, wie sie hier verwendet wird, wird berechnet, indem man den Prozentsatz der Keimbahntransformanten als Funktion der Zahl der Explantate, die einer Partikelbombardierung unterzogen wurden, bestimmt.
  • Die hier beschriebenen Verfahren beruhen auf einer direkten Schösslingsinduktion aus behandelten embryonalen Sojameristemen. Während der Ausdruck "Regeneration" hier verwendet wird, um die Neuschaffung einer ganzen Pflanze aus solchen behandelten Meristemen zu beschreiben, ist der Regenerationsvorgang in diesem Kontext viel weniger schwierig und weniger mühsam als die Regeneration von ganzen Pflanzen aus undifferenziertem Pflanzengewebe, wie Kallusgewebe oder Protoplasten. Durch Induzieren der direkten Schösslingsbildung aus den behandelten embryonalen Meristemen werden direkt und schnell differenzierte wachsende Schösslinge erzeugt, die leicht auf vielen verschiedenen Medien zu ganzen Sojapflanzen wachsen. Die Methode, um zu erreichen, dass dieses Verfahren funktioniert, besteht in der direkten Induktion von differenzierten Schösslingen aus dem behandelten embryonalen Meristem. Im Verlaufe dieser Untersuchung wurde herausgefunden, dass Glyphosat bei diesem Vorgang eine überraschende Rolle spielt.
  • Um eine Bildung multipler unabhängiger Schösslinge aus behandelten Sojameristemen zu erreichen, war es früher Praxis, Hormonbehandlungen, insbesondere unter Verwendung von BAP, auf das behandelte Gewebe anzuwenden. Es hat sich hier gezeigt, dass Glyphosat selbst eine Bildung multipler unabhängiger Schösslinge induziert, so dass das Hormon nicht notwendig ist. Wie im folgenden Beispiel 2 beschrieben ist, ermöglicht das Weglassen des BAP und die Verwendung von Glyphosat allein sowohl für die Selektion als auch für die Schösslingsinduktion ein Verfahren, das tatsächlich effizienter ist als ein Verfahren auf der Basis von hormoninduzierter Schösslingsbildung. Wiederum ist dies ein Hinweis auf die einzigartige Wechselwirkung zwischen diesem Molekül und dem wachsenden Sojameristem, die bei anderen Mitteln nicht vorkommt.
  • In den folgenden Beispielen wurden die Sojaexplantate entweder einem oder zwei Teilchenbombardierungen ausgesetzt, wobei ein vierstündiges Intervall zwischen den beiden Bombardierungen lag. Es wird vernünftigerweise erwartet, dass die vorliegende Erfindung auch mit Variationen der Zahl oder Häufigkeit von Bombardierungen durchgeführt werden kann. Ein Transformationsverfahren, bei dem eine einzige Bombardierung oder mehr als zwei Bombardierungen eingesetzt werden, könnte gleichermaßen geeignet sein. Die vorliegende Erfindung soll auch ein Verfahren umfassen, bei dem Explantate multiplen Bombardierungen ausgesetzt werden, die durch einen Zeitraum voneinander getrennt sind, der länger oder weniger lang als vier Stunden dauert.
  • Die transformierten Explantate, die Glyphosattoleranz-Aktivität exprimieren, werden zu ganzen Pflanzen regeneriert. Die Wahl der Methode für den Regenerationsschritt ist für die vorliegende Erfindung nicht entscheidend. Für die Regeneration von Sojapflanzen kann jedes beliebige Verfahren eingesetzt werden. Die bei der Entwicklung dieses Verfahrens eingesetzten Mediumzubereitungen sind in den Beispielen offenbart. Es wird erwartet, dass auch andere Medien, die für die Regeneration von Pflanzen geeignet sind, bei der praktischen Durchführung der vorliegenden Erfindung effektiv wären.
  • Die folgenden nichteinschränkenden Beispiele sollen rein illustrativ sein.
  • Beispiel 1
  • Verfahren und Materialien Medienherstellung
  • Medien, die bei der Entwicklung von glyphosatresistenten Sojapflanzen eingesetzt werden, wurden mit Hilfe von Standardverfahren hergestellt, die dem Fachmann bekannt sind. Medienzubereitungen sind in den zitierten Literaturstellen oder in der Medientabelle (Tabelle 4) zu finden.
  • Herstellung von Meristem für die Transformation durch Partikelbombardierung
  • Embryonale Achsen wurden aus Samen herausgeschnitten, die über Nacht bei 20 °C in Dunkeln in flüssigem Bohnenkeimmedium (BGM) keimen gelassen wurden. Die Zusammensetzung des BGM wird im Anhang angegeben. Das primäre Blattgewebe wurde sorgfältig entfernt, so dass der Meristembereich freigelegt wurde. Explantate wurden auf OR-Medium senkrecht zur Oberfläche ausgestrichen, wobei die Meristeme vom Medium weg orientiert waren, und die Explantate wurden über Nacht bei 15 °C im Dunkeln inkubiert. OR-Medium ist MS-Medium gemäß der Modifikation von Barwale et al. (Planta 167: 473–481, 1986) plus 3 mg/l BAP, 200 mg/l Carbenicillin, 62,5 mg/l Cefotaxim und 60 mg/l Benomyl.
  • Herstellung von Folien für die Partikelbombardierung
  • Ein Bead-Präparat zur Beschichtung der Strahlfolien wurde wie folgt hergestellt. 5 μl DNA (1 mg/ml) wurden zu 100 μl 0,1 M Spermidin gegeben. Die Spermidin/DNA-Lösung wurde in ein Gefäß, das 10 mg 0,71-μm-Beads enthielt, übergeführt und mit dem Wirbelmischer vollständig gemischt. Unter ständigem Rühren mit dem Wirbelmischer wurden 100 μl 10%iges CaCl2 hinzugetropft. Das Gemisch wurde 10 Minuten lang stehen gelassen, und während dieser Zeit erfolgte eine Fällung. Der Überstand wurde entfernt, und der DNA/Gold-Niederschlag wurde in 20 ml 100%igem Ethanol resuspendiert. Ein 320-μl-Aliquot des Bead-Präparats wurde verwendet, um jede Strahlfolie zu beschichten. Die Beads wurden ungefähr 30 Sekunden lang sich absetzen gelassen, das Ethanol wurde entfernt, und die Folien wurden trocknen gelassen.
  • Transformation und Regeneration von Explantaten
  • Explantate wurden auf Target-Medium (8% niedrigviskose Carboxymethylcellulose, 2% mittelviskose Carboxymethylcellulose, 0,4% gewaschener Agar) übertragen, wobei die Meristeme nach oben zeigten. Die Explantate wurden zweimal bombardiert, wobei ein Intervall von vier Stunden zwischen den Bombardierun gen lag und ein Instrument mit elektrischer Entladung für die partikelvermittelte Genabgabe verwendet wurde. Nach der Partikelbombardierung wurden die Explantate auf OR-Medium übertragen und entweder: 1) auf einem glyphosathaltigen Medium gehalten, 2) für drei oder vier Tage auf glyphosatfreies Medium übertragen und dann auf glyphosathaltiges Medium übertragen oder 3) unmittelbar nach der Bombardierung 14 Tage lang Glyphosat ausgesetzt. Die Explantate wurden 2 oder 4 Tage lang bei 23 °C im Dunkeln inkubiert. Dann wurden die Explantate auf MSR-Medium (modifiziertes OR-Medium ohne NAA-Hormon plus 0,4 mg/l BAP und 0,04 mg/l IBA), das 0 bis 0,2 mM Glyphosat enthielt, übertragen und 7 Tage lang bei 28 °C ins Dunkle gestellt. Die Kulturen wurden an Licht gewöhnt, indem man die Kulturen zwei Tage lang bei 28 °C unter ein Schattenaggregat stellte und dann für zwei Tage in volles Licht (16 h Licht/8 h Dunkelheit) überführte.
  • Nachdem die Explantate vollständig grün waren, wurden sie in Holzpflanzenmedium (WPM) (McCown & Lloyd, Proc. International Plant Propagation Soc., 30: 421, 1981) mit Zusatz von 0,04 mg/l BAP, 200 mg/l Carbenicillin, 60 mg/l Benomyl und 0 bis 0,2 mM Glyphosat übertragen. Die Explantate wurden typischerweise nach zwei Wochen auf frisches glyphosathaltiges WPM übertragen, bis die Ernte vollständig war.
  • Die verlängerten Schösslinge waren fünf bis sechs Wochen nach der Bombardierung fertig für die Ernte. Es wurden nur diejenigen Schösslinge geerntet, die verlängerte Stängel (Länge ungefähr 1 inch), volle dreizählige Blätter und eine aktive Wachstumsspitze aufwiesen. Die geernteten Schösslinge wurden auf Bohnenwurzelmedium (BRM; siehe Medientabelle), das 0 bis 0,025 mM Glyphosat enthielt, übertragen. Die Ernten wurden wöchentlich fortgesetzt, bis drei bis vier Ernten erfolgt waren.
  • Gelegentlich traten untransformierte Schösslinge in Explantaten auf, die nach der Transformation mehr als zwei Monate lang gehalten wurden oder auf Medium inkubiert wurden, in dem das Glyphosat abgebaut war. Es wurde herausgefunden, dass untransformierte Schösslinge phänotypisch auf der Basis der langen, schmalen dreizähligen Blätter, der kurzen Internodien und des für untransformierte Schösslinge typischen baumartigen Erscheinungsbilds von transformierten Schösslingen unterschieden werden konnten. Untransformierte Schösslinge wurden verworfen. Die nicht verworfenen Explantate wurden auf frisches glyphosathaltiges WPM übertragen.
  • Die Wurzelbildung erfolgte typischerweise ungefähr eine bis vier Wochen nach der Übertragung auf BRM. Nachdem sich das Wurzelsystem entwickelt hatte, wurden die Pflanzen auf Erde übertragen. Die Pflanzen wurden mehrere Tage lang in einem Treibhaus in einer Nebelbank gehalten. Nachdem die Pflanzen ausgehärtet waren, wurden sie in Standard-Treibhausbedingungen übergeführt. Nachdem eine Pflanze drei bis fünf dreizählige Blätter entwickelt hatte, konnte sie auf die Anwesenheit des Selektionsmarkers oder des interessierenden Gens getestet werden.
  • Plasmidkonstruktion
  • Plasmide wurden unter Verwendung von Standardtechniken der Molekularbiologie konstruiert, die dem Fachmann bekannt sind. Die Expressionscassetten, die in jedem in den Beispielen eingesetzten Konstrukt enthalten sind, sind in Tabelle 1 zusammengefasst, wobei zuerst der Promotor und dann das Gen angegeben ist. Das CP4-Gen, das bei der Konstruktion der in Tabelle 1 aufgeführten Plasmide verwendet wird, ist das CP4syn-Gen, ein synthetisches Gen, das für CP4-EPSP-Synthase codiert. Das Gen wurde im US-Patent Nr. 5,633,435 offenbart, auf das hier ausdrücklich Bezug genommen wird. Das bei der Konstruktion dieser Plasmide eingesetzte GOX-Gen war das GOXsyn-Gen, ein synthetisches Glyphosat-Oxidase-Gen, das im US-Patent Nr. 5,463,175 offenbart ist, auf das hier ausdrücklich Bezug genommen wird.
  • Tabelle 1
    Figure 00190001
  • Screening nach dem GUS-Gen in transformierten Sojapflanzen
  • Mutmaßliche glyphosattolerante Schösslinge wurden auf die Expression von GUS durchmustert, wobei man den gewebezerstörenden GUS-Assay verwendete, wie es im US-Patent Nr. 5,503,998 beschrieben ist. Die Samen aus einer glyphosattoleranten R0-Pflanze konnten bewertet werden, um Keimbahn-Transformationsereignisse zu identifizieren, indem man einen geschälten Samenschnitt (einschließlich eines Teils des Keimblatts) Indigoglucuronid (5-Brom-4-chlor-3-indolylglucuronid) aussetzt und die Bildung einer blauen Farbe sichtbar macht. Der Samen, von dem ein Schnitt angefertigt wird, kann auskeimen und sich zu einer Pflanze entwickeln. Auf diese Weise können Samen, die zu R1-keimbahntransformierten Pflanzen führen, leicht identifiziert werden.
  • Screening nach dem GFP-Gen in transformierten Sojapflanzen
  • Die Expression des GFP-Gens wurde in Blattgewebe und/oder geschälten Samenschnitten unter Verwendung eines Fluoreszenzmikroskops nach dem Verfahren von Pang et al. (Plant Physiol. 112: 893–900, 1996) bestimmt.
  • Screening nach CP4 unter Verwendung von ELISA
  • Die Anwesenheit des CP4-Gens in glyphosattoleranten Pflanzen wurde durch ELISA bestätigt. Der Assay ist ein indirekter enzymverknüpfter Immunosorbent- Antikörper-Sandwich-Assay, der die Mengen des in Pflanzengewebeextrakten vorhandenen CP4-Proteins nachweist. Die Mengen von CP4 in Pflanzenproben wurden mit einem gereinigten Referenzstandard von CP4 verglichen. Kurz gesagt, 96-Napf-Polystyrolplatten wurden mit gereinigtem Kaninchen-Anti-CP4 beschichtet. Pflanzengewebeextrakt und CP4-Referenzstandards wurden zu geeigneten antikörperbeschichteten Näpfen gegeben. Dann wurden die Platten 30 Minuten lang bei 37 °C inkubiert und gewaschen. Mit Meerrettich-Peroxidase konjugierte Anti-CP4-Antikörper wurden zu den Platten gegeben, 30 Minuten lang bei 37 °C inkubiert, und ungebundene Anti-CP4-Antikörper wurden durch Waschen entfernt. Um die Anwesenheit eines Antikörper-Sandwichs sichtbar zu machen, wurde TMB-Substrat zu jedem Napf gegeben, und der Napf wurde auf die Entwicklung einer blauen Farbe untersucht. Die Wirkung von Peroxidase auf TMB-Substrat führt zur Bildung eines löslichen blauen Produkts. Die Peroxidase-Reaktion wird mit 1 M Phosphorsäure unterbrochen, was bewirkt, dass das Produkt gelb wird. Die Menge des in einem Napf vorhandenen CP4 hängt direkt mit der Intensität der Farbe in diesem Napf zusammen.
  • Ergebnisse
  • Transformationseffizienz unter Verwendung von Glyphosatselektion
  • Die Transformationseffizienzen für jeden Versuch wurden bestimmt, indem man den Prozentsatz an R1-keimbahntransformierten Familien berechnete, der pro der Partikelbombardierung ausgesetztem Explantat erhalten wurde. Die unter Verwendung dieses Verfahrens erhaltenen Transformationseffizienzen lagen im Bereich von 0,89 bis 5,21% (Tabelle 2).
  • Wirkung des Plasmidkonstrukts auf die Transformationseffizienz
  • Verschiedene Plasmidkonstrukte wurden unter Verwendung der Partikelbombardierung in Sojaexplantate eingeführt. Alle Plasmidkonstrukte enthielten das CP4-Gen unter der Kontrolle des FMV-Promotors (Tabelle 1). Das pMON17204-Konstrukt enthielt auch die FMV-GOX-Expressionscassette. Die unter Verwen dung von Glyphosatselektion erhaltenen Transformationseffizienzen variierten nicht signifikant mit dem eingesetzten Konstrukt (Tabelle 2).
  • Tabelle 2
    Figure 00210001
  • Wirkung von Zeit und Dauer der Glyphosateinwirkung auf Transformationseffizienz und Ausbrüche
  • Die zeitliche Abstimmung der Glyphosateinwirkung von Sojaexplantaten nach der Partikelbombardierung beeinflusste die Transformationseffizienz nicht signifikant. Wenn die zeitliche Abstimmung der Glyphosateinwirkung die Transformationseffizienz beeinflussen sollte, hätten einige erwartet, dass eine Verzögerung der Einwirkung die Transformationseffizienz erhöht. Es wurde jedoch kein solcher Effekt beobachtet; folglich liegt kein Vorteil darin, die Glyphosateinwirkung zu verzögern. Die bisher gesammelten Daten weisen darauf hin, dass eine sofortige Einwirkung von Glyphosat die Zahl der "Ausbrüche" zu reduzieren scheint (Tabelle 3). Daher werden die transformierten Explantate bei der praktischen Durchführung der vorliegenden Erfindung unmittelbar nach der Partikelbombardierung auf glyphosathaltiges Medium übertragen.
  • Häufigkeit von Keimbahntransformanten bei Verwendung von Cotransformation
  • Es zeigte sich, dass Keimbahntransformanten mit hoher Häufigkeit (etwa 0,8% Transformationseffizienz) erhalten werden können, wenn man eine Cotransformation eines DNA-Konstrukts, das ein interessierendes Gen enthält, und eines DNA-Konstrukts, das einen exprimierbaren Glyphosatmarker enthält, verwendet (Tabelle 3). Ein heterologes GUS-Gen, das unter die Kontrolle eines Ubiquitin-Promotors (Ubi-GUS) gestellt wurde, wurde in etwa 80% der glyphosattoleranten Pflanzen gefunden, die durch Cotransformation eines Konstrukts, das das Ubi-GUS-Gen enthält, und eines Plasmids, das FMV-CP4 enthält, erhalten wurden.
  • Figure 00230001
  • Beispiel 2
  • Verfahren und Materialien
  • Die Medien, Verfahren und Materialien wurden wie oben in Beispiel 1 verwendet, wenn es im Folgenden nicht anders angegeben ist.
  • Herstellung von Folien für die Partikelbombardierung
  • Goldteilchen (Beads) mit einer Größe von ungefähr 1 μm wurden verwendet. Nach der Zugabe von CaCl2, der Fällung und der Entfernung des Überstands wurde der Niederschlag in 10 ml 95%igem Ethanol resuspendiert. Die DNA-beschichteten Partikel wurden in einer Dichte von 0,1 mg/cm2 auf die Trägerfolien aufgetragen.
  • Transformation und Regeneration
  • Nachdem die embryonalen Achsen herausgeschnitten worden waren und ausgekeimt hatten, wie es in Beispiel 1 beschrieben ist, wurden die Explantate auf WPM ausgestrichen und über Nacht bei 15 °C aufbewahrt.
  • Tabelle 4
    Figure 00250001
  • Die Explantate wurden auf Zielplatten in Anordnungen von 16 Explantaten angeordnet und einem einzelnen partikelvermittelten Genabgabeereignis (Blast) ausgesetzt.
  • Die Explantate wurden danach in Anwesenheit von Glyphosat, aber in Abwesenheit der Phytohormone BAP oder IBA kultiviert. Das Medium, das sowohl nach der Bombardierung als auch während des Keimens verwendet wurde, war WPM, das 0,075 mM Glyphosat enthielt, aber ohne BAP. Das verwendete Wurzelmedium war wie in Beispiel 1, ergänzt mit 0,500 mM Tryptophan, Tyrosin und Phenylalanin.
  • Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 zusammengefasst.
  • Ergebnisse
  • Diese Vorschrift wurde in acht Parallelansätzen im Produktionsmaßstab unter Verwendung des Plasmids pWRG4750 verwendet. Sie wurden zuerst auf der Basis des visuellen Phänotyps durchmustert. Untransformierte Schösslinge erschienen kränklich und zeigten deutlich weniger Lebenskraft. Die Zahlen in der Spalte "in Bezug auf visuellen Phänotyp positive Schösslinge" waren Zahlen von Schösslingen, die aus behandelten Geweben hervorgingen, die gesund und glyphosatresistent zu sein schienen.
  • Die Effizienz bei der Ernte der Schösslinge ist einfach die Zahl der phänotypisch positiven Schösslinge, dividiert durch die Zahl der behandelten Explantate. Die mittlere Effizienz in diesem Stadium betrug 22%.
  • Die Gesamteffizienz des Verfahrens hängt selbstverständlich von einer Überprüfung der Genexpression ab. Die Schösslinge aus den Verfahren 2215 und 2216 wurden auf Genexpression (GUS) durchmustert. Aus den beiden Experimenten waren 87% (257) bzw. 89% (101) der phänotypisch positiven Schösslinge auch GUS-positiv. Wenn man annimmt, dass diese Ergebnisse typisch sind, betrüge die Gesamteffizienz des Verfahrens bis zu transgenen Pflanzen dann 20%, eine hocheffiziente Rate. Tabelle 5 Bohnenkeimmedium (BGM 2,5%)
    Figure 00260001
    verteilt auf 1-Liter-Mediumflaschen, autoklaviert
    Zusätze vor Verwendung: pro 1 l
    Cefotaxim (50 mg/ml) 2,5 ml
    "ANTILIFE"-Fungizid-Stammlösung 3 ml
  • BT-Stammlösung für Bohnenkeimmedium
  • Jede Stammlösung einzeln herstellen und aufbewahren. Jede Chemikalie in der angegebenen Reihenfolge gründlich auflösen, bevor man die nächste hinzufügt.
  • Das Volumen jeder Stammlösung entsprechend einstellen. Bei 4 °C lagern.
    BT-Stammlösung 1 (1 Liter)
    KNO3 50,5 g
    NH4NO3 24,0 g
    MgSO4·7H2O 49,3 g
    KH2PO4 2,7 g
    BT-Stammlösung 2 (1 Liter)
    CaCl2·7H2O 17,6 g
    BT-Stammlösung 3 (1 Liter)
    H3BO3 0,62 g
    MnSO4·H2O 1,69 g
    ZnSO4·7H2O 0,86 g
    KI 0,083 g
    NaMoO4·2H2O 0,072 g
    CaSO4·5H2O 0,25 ml Stammlösung mit 1,0 mg/ml
    CoCl4·6H2O 0,25 ml Stammlösung mit 1,0 mg/ml
    BT-Stammlösung 4 (1 Liter)
    Na2EDTA 1,116 g
    FeSO4·7H2O 0,834 g
    BT-Stammlösung 5 (500 ml), in Metallfolie-umhülltem Behälter aufbewahren
    Thiamin-HCl 0,67 g
    Nicotinsäure 0,25 g
    Pyridoxin-HCl 0,41 g
    Bohnenwurzelmedium (BRM)
    Figure 00280001
    Zusätze nach dem Autoklavieren:
    SBRM/TSG-Hormonstammlösung 20,0 ml
    Sojagewebekulturhormon-Vormischungen
    Figure 00280002
    Figure 00290001
    Vitaminstammlösung für Sojawurzelmedium (1 Liter)
    Glycin 1,0 g
    Nicotinsäure 0,25 g
    Pyridoxin-HCl 0,25 g
    Thiamin-HCl 0,05 g
  • Jeweils nur einen Bestandteil auf einmal auflösen, auf Volumen bringen, in Metallfolie-abgedeckter Flasche nicht länger als einen Monat im Kühlschrank aufbewahren.
    3 × Neben-MS-Salze-Stammlösung (1 Liter)
    H3BO3 1,86 g
    MnSO4·H2O 5,07 g
    ZnSO4·7H2O 2,58 g
    KI 0,249 g
    NaMoO4·2H2O 7,5 μl
    CoSO4·5H2O Stammlösung (1,0 mg/ml) 7,5 μl
    CoCl4·6H2O Stammlösung (1,0 mg/ml) 7,5 μl
  • Jeweils nur eine Chemikalie auf einmal auflösen, Volumen einstellen, im Kühlschrank aufbewahren.
  • ANTILIFE-Fungizid-Stammlösung (100 ml)
    BRAVO (75% WP) 1,0 g
    Benomyl (50% OF) 1,0 g
    Captan (50% WP) 1,0 g
  • Steriles destilliertes Wasser bis 100 ml hinzufügen.
  • Vor der Verwendung gut schütteln.
  • Nicht länger als eine Woche bei 4 °C im Dunkeln aufbewahren.

Claims (13)

  1. Effizientes Verfahren zur Gewinnung von keimbahntransformierten Sojapflanzen mit Hilfe von Glyphosatselektion, das die folgenden Schritte umfasst: (a) Bereitstellen eines heterologen DNA-Konstrukts, umfassend einen in Pflanzen geeigneten Promotor, der funktionell mit einer DNA-codierenden Sequenz verbunden ist, wobei die codierende Sequenz ein Protein codiert, das einer Pflanzenzelle, in der die Sequenz exprimiert wird, Glyphosattoleranz verleihen kann, und eine 3'-Terminierungssequenz; (b) Beschichten von Trägerteilchen aus biologisch inertem Material mit Kopien des DNA-Konstrukts, wobei die Trägerteilchen im Vergleich zu einer Sojabohnenzelle klein sind; (c) Beschleunigen der beschichteten Teilchen in das Meristemgewebe eines Sojaembryos; (d) Induzieren einer Schösslingsbildung aus dem behandelten Meristemgewebe durch Kultivieren des behandelten Meristemgewebes auf Postbombardierungskulturgewebe, das Glyphosat umfasst; (e) Kultivieren der Schösslinge auf einem geeigneten Austreibmedium, das Glyphosat in einer ausreichenden Konzentration enthält, um das Wachstum von untransformierten Sojabohnenzellen erheblich zu hemmen, so dass glyphosatresistente Sojaschösslinge entstehen; (f) Regenerieren der Schösslinge von Schritt (e) zu genetisch transformierten Sojapflanzen mit einer im Vergleich zu Wildtyp-Sojapflanzen erhöhten Toleranz gegenüber Glyphosat-Herbizid.
  2. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei in dem in Schritt (f) verwendeten Medium kein Glyphosat vorhanden ist.
  3. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das DNA-Konstrukt zusätzlich ein interessierendes Gen umfasst.
  4. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das Induzieren der Schösslingsbildung in Schritt (d) weiterhin die Zugabe eines Hormons umfasst.
  5. Verfahren gemäß Anspruch 4, wobei es sich bei dem Hormon um BAP handelt.
  6. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das Induzieren der direkten Schösslingsbildung in Schritt (d) durch die Anwendung von Glyphosat ohne die Verwendung eines anderen Pflanzenhormons erreicht wird.
  7. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das DNA-Konstrukt ein EPSP-Synthase-Gen umfasst.
  8. Verfahren gemäß Anspruch 7, wobei es sich bei dem EPSP-Synthase-Gen um CP4 handelt.
  9. Verfahren gemäß Anspruch 7, wobei das DNA-Konstrukt weiterhin ein Gen umfasst, das ein Enzym codiert, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Glyphosat-Oxidoreductase besteht.
  10. Verfahren gemäß Anspruch 1, das weiterhin den Schritt der Bewertung des morphologischen Erscheinungsbilds der Schösslinge als Maß für die Glyphosattoleranz und das Verwerfen derjenigen Schösslinge mit einem abnormen morphologischen Erscheinungsbild vor Schritt (f) umfasst.
  11. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die in Schritt (e) verwendete Glyphosatkonzentration zwischen 0,01 und 1,0 mM Glyphosat im Kulturmedium beträgt.
  12. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Zahl der gewonnenen transgenen Schösslinge als Prozentsatz der Zahl der behandelten Meristeme wenigstens 1% beträgt.
  13. Verfahren gemäß Anspruch 12, wobei die Zahl der gewonnenen transgenen Schösslinge als Prozentsatz der Zahl der behandelten Meristeme wenigstens 20% beträgt.
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