DE69931050T3

DE69931050T3 - Brassica-transformation durch teilchenbeschuss

Info

Publication number: DE69931050T3
Application number: DE69931050T
Authority: DE
Inventors: Zhizheng Fort Collins CHEN; Jennifer Carson City CELIO
Original assignee: Cargill Inc
Current assignee: Cargill Inc
Priority date: 1998-02-26
Filing date: 1999-02-25
Publication date: 2011-03-03
Anticipated expiration: 2019-02-26
Also published as: EP1077599B2; AU761649B2; ATE324030T1; CA2321781C; CA2321781A1; WO1999043202A1; JP2002504355A; DE69931050T2; US20030093840A1; US6051756A; EP1077599B1; EP1077599A4; EP1077599A1; DE69931050D1; CN1291860A; JP4550274B2; US6495741B1; AU2789799A; CN100335618C

Description

HINTERGRUND
1. Technisches Gebiet
Die Erfindung betrifft Verfahren und Materialien, die in die Transformation von Brassica durch Partikelbombardierung involviert sind.
2. Hintergrundinformationen
Brassica-Spezies beinhalten eine große Gruppe von landwirtschaftlich wichtigen Nutzpflanzen, die von dem Menschen als Gemüse, Speiseöle und Gewürze genutzt werden. Tatsächlich macht die Brassica-Ölproduktion mehr als 12% der weltweiten Speiseöle aus. Um die Qualität von landwirtschaftlich wichtigen Nutzpflanzen zu verbessern, haben die Züchter traditionell auf konventionelle Züchtungsverfahren vertraut. Durch die gegenwärtigen Fortschritte in der molekularen Pflanzenbiologie und -genetik können die Züchter nun jedoch die Pflanzenqualität durch das Einbringen von fremder DNA verbessern.
Um Pflanzen zu transformieren, sind verschiedene unterschiedliche Verfahren verwendet worden. Ein gewöhnlich verwendetes Verfahren beinhaltet das Bombardieren von Pflanzenzellen mit Mikropartikeln, die mit der interessierenden DNA beschichtet wurden. Tatsächlich wurden Verfahren der Partikelbombardierung in weiten Kreisen verwendet, um Getreide, Sojabohnen, Weizen und Reis zu transformieren. Versuche, um Brassica-Spezies unter Verwendung der Partikelbombardierung zu transformieren, waren jedoch nicht gleichermaßen erfolgreich. In der Tat erforderte die einzige erfolgreiche Transformation von Brassica eine beträchtliche Manipulation von Brassica-Embryos. Folglich vertrauen die Forscher gegenwärtig auf alternative Ansätze, wie beispielsweise Agrobacterium-vermittelte Verfahren, um Brassica zu transformieren.
ZUSAMMENFASSENDE DARSTELLUNG
Die Erfindung beinhaltet die Transformation von Brassica-Spezies durch Partikelbombardierung. Im Speziellen basiert die Erfindung auf dem Auffinden einer schnellen und geeigneten Technik zur Gewebepräparation, die zu Brassica-Zellen führt, die in der Lage sind, kultiviert, durch Partikelbombardierung transformiert und in Pflanzen regeneriert zu werden. Zusätzlich stellt die Erfindung transformierte Zellen sowie regenerierte Pflanzen bereit, die zur Reife heranwachsen und Samen bilden. Solche regenerierten Pflanzen und deren Nachkommenschaft exprimieren stabil das transferierte Nucleinsäuremolekül. Die Einfachheit des hier beschriebenen erfundenen Verfahrens macht die Transformation durch Partikelbombardierung in Brassica nicht nur möglich sondern auch ökonomisch durchführbar.
Die Erfindung stellt ein Verfahren zur Herstellung von transformierten Brassica-Zellen bereit, das die Bombardierung von Zellen, die aus nicht-embryonalem Brassica-Gewebe, wie in Anspruch 1 definiert, präpariert wurden, mit Mikroprojektilen, die mit Nucleinsäure beschichtet sind, und das Identifizieren von Zellen, die mit der Nucleinsäure transformiert sind, beinhaltet. Die Zellen, die mit der Nucleinsäure transformiert sind, können identifiziert werden, indem die bombardierten Zellen auf eine Flotationsvorrichtung platziert werden, die Flotationsvorrichtung mit flüssigem Selektionsmedium in Kontakt gebracht wird, und die Zellen selektiert werden, die überleben. Dieses Verfahren kann ferner das Regenerieren von Brassica-Pflanzen aus den transformierten Zellen involvieren. Die identifizierten Zellen können beispielsweise auf eine Flotationsvorrichtung platziert werden, die mit flüssigem Regenerationsmedium in Kontakt steht. Die aus dem nicht-embryonalen Brassica-Gewebe präparierten Zellen können diploid sein. Ferner kann das nicht-embryonale Brassica-Gewebe aus einem Sämling stammen, z. B. einem 4–6 Tage alten sterilen Sämling. Die Zellen können aus nicht-embryonalem Brassica-Gewebe durch ein Verfahren präpariert werden, das das Schneiden eines Hypocotyls aus einem Sämling in mehrere Scheiben, das Längs-in-Scheiben-Schneiden und das In-Kontakt-Bringen der epidermalen Seite der Längsscheiben mit Induktionsmedium umfasst. Die Zellen können auch aus nicht-embryonalem Brassica-Gewebe durch ein Verfahren präpariert werden, das das Mazerieren des Gewebes zu einem Zellbrei umfasst. Die Zellen können beispielsweise aus nicht-embryonalem Brassica-Gewebe durch ein Verfahren präpariert werden, das das Entfernen des unteren Teils eines Hypocotyls von einem Sämling, das Kombinieren des verbleibenden oberen Teils, der die Triebspitze enthält, der Keimblätter und 10–50% des Hypocotyls mit Induktionsmedium, sowie das Mazerieren der Kombination zu einem Zellbrei aufweist. Zusätzlich kann der Zellbrei mit zellulärer Substanz angereichert werden, die eine Größe von etwa 46–230 μm aufweist. Die Nucleinsäure, die verwendet wurde, um die Brassica-Zellen zu transformieren, kann die Expression eines Polypeptides regulieren oder für ein Polypeptid codieren. Z. B. kann die Nucleinsäure für ein Gegensinn-Molekül codieren, wie beispielsweise ein Ribozym oder ein Gegensinn-Oligonucleotid. Ferner kann das Brassica-Gewebe aus Brassica-Spezies stammen, wie beispielsweise aus Brassica napus, Brassica juncea, Brassica carinata, Brassica nigra, Brassica oleracea und Brassica campestris (auch als ”rapa” bezeichnet).
Das Kultivieren von Brassica-Gewebe auf Selektionsmedium kann zur Identifizierung von Brassica-Gewebe führen, das mit der Nucleinsäure transformiert worden ist. Zusätzlich kann es sich bei diesem flüssigen Medium um Regenerationsmedium handeln. Das Kultivieren von Brassica-Gewebe auf Regenerationsmedium kann zur Regeneration einer Brassica-Pflanze aus Brassica-Gewebe führen.
Sofern nicht anders definiert, haben sämtliche technische und wissenschaftliche Bezeichnungen, die hierin verwendet werden, die gleiche Bedeutung, wie diese üblicherweise von einem Fachmann verstanden wird, an den sich diese Erfindung richtet. Obwohl Verfahren und Materialien, die zu denen ähnlich oder äquivalent sind, die hierin beschrieben werden, zur Durchführung oder zum Testen der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, werden nachfolgend geeignete Verfahren und Materialien beschrieben. Im Falle eines Widerspruches ist die vorliegende Beschreibung einschließlich der Definitionen maßgeblich. Ferner sind die Materialien, Verfahren und Beispiele lediglich illustrativ und nicht einschränkend zu verstehen.
Weitere Merkmale und Vorteile der Erfindung ergeben sich aus der folgenden detaillierten Beschreibung und aus den Ansprüchen.
BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 ist ein Diagramm, das das pIMC38-Konstrukt darstellt, das in den hierin beschriebenen Experimenten verwendet wurde.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG
Die Erfindung stellt Verfahren und Materialien bereit, die die Transformation von Brassica durch Partikelbombardierung betreffen. Im Speziellen stellt die Erfindung Verfahren zur Präparierung von nicht-embryonalem Brassica-Gewebe, wie in Anspruch 1 definiert, bereit, so dass Brassica-Zellen in der Lage sind, kultiviert, durch Partikelbombardierung transformiert und in Pflanzen regeneriert zu werden. Die Erfindung stellt ferner stabil transformierte Brassica-Zellen sowie deren Nachkommen bereit. Transformierte Pflanzen werden hierin auch als transgene Pflanzen bezeichnet.
Gewebepräparation
Eine Zell- oder Gewebepräparation wird als eine Gruppe von Zellen oder Geweben definiert, die auf eine Art und Weise angeordnet sind, die für eine Partikelbombardierung geeignet ist. Um eine erfolgreiche Transformation sicherzustellen, wird mit der Zell- oder Gewebepräparation eine relativ große Anzahl von Zellen, vorzugsweise sich schnell teilende Zellen, bereitgestellt, die an der Oberfläche derart exponiert werden, dass sie Partikel, die mit einer Nucleinsäure beschichtet sind, aufnehmen können. Zusätzlich müssen die aufnehmenden Zellen in der Lage sein, das Wachstum fortzusetzen und Pflanzen zu regenerieren. Eine Vielzahl von nicht-embryonalen Brassica-Zell- oder -Gewebequellen kann dazu verwendet werden, um Zell- oder Gewebepräparationen zu präparieren, die diese Kriterien erfüllen. Beispielsweise können Protoplasten aus Blättern und Hypocotylgewebe, die aus Brassica stammen, als Quellen für Brassica-Zellen verwendet werden. Die Verwendung von nicht-embryonalen Gewebequellen vereinfacht das Transformationsverfahren erheblich. Typischerweise werden Hypocotylgewebe, die aus jungen Sämlingen präpariert werden, die unter sterilen Bedingungen gewachsen sind, verwendet. In diesem Fall kann das Hypocotyl in Längsscheiben geschnitten werden. Alternativ kann ein oberer Teil eines Sämlings zu einem Zellbrei zerkleinert werden. Solch ein oberer Teil kann die beiden Keimblätter, die Triebspitze als auch den oberen Abschnitt des Hypocotyls umfassen.
Ein Zellbrei ist eine beliebige flüssige Suspension von unlöslichem Zellmaterial, das lebende Zellen enthält. Ein Mixer kann dazu verwendet werden, um Brassica-Gewebe zu einem Zellbrei zu zerkleinern. Zusätzlich kann ein Zellbrei in Gruppen, basierend auf der Größe des unlöslichen Zellmaterials, unterteilt werden. Beispielsweise kann ein Zellbrei durch eine Reihe von Maschen unterteilt werden, so dass unlösliches Zellmaterial einer bestimmten Größe angereichert wird. Ein Zellbrei mit einer beliebigen Größe kann zur Partikelbombardierung verwendet werden, vorausgesetzt, der Zellbrei enthält lebende Zellen. Beispielsweise kann ein Zellbrei mit Zellmaterial von etwa 35 μm bis etwa 500 μm Größe oder etwa 46 μm bis etwa 230 μm Größe angereichert sein und für die Partikelbombardierung verwendet werden.
Die Brassica-Gewebepräparationen können diploide oder haploide Zellen enthalten. Werden diploide Zellen verwendet, versteht es sich, dass die resultierenden transformierten Zellen sehr wahrscheinlich an jeder Integrationsstelle heterozygot sein werden. Mit anderen Worten, es ist äußerst unwahrscheinlich, dass sich eine Kopie der eingebrachten Nucleinsäure in beiden Chromosomen an der gleichen Stelle integriert. Bei der Verwendung von haploiden Zellen können die resultierenden transformierten Zellen jedoch mit Colchicin behandelt werden, um die Chromosomenverdopplung zu induzieren. Deshalb werden die resultierenden Zellen höchstwahrscheinlich an jeder Integrationsstelle homozygot sein. Alternativ können aus den resultierenden, transformierten, haploiden Zellen haploide Pflanzen regeneriert werden. Diese haploiden Pflanzen können dann wiederum mit anderen Pflanzen gekreuzt werden, um Pflanzen zu produzieren, die an bestimmten Integrationsstellen entweder heterozygot oder homozygot sind. Ferner werden Zellen, die eine eingebrachte Nucleinsäuresequenz in ihr Genom integrieren, als stabil transformierte Zellen bezeichnet. Stabil transformierte Zellen behalten typischerweise die eingebrachte Nucleinsäuresequenz bei jeder Zellteilung. Zellen, die eingebrachte Nucleinsäuresequenzen enthalten, die nicht in das Genom integriert sind, werden als transient transformierte Zellen bezeichnet. Transient transformierte Zellen verlieren typischerweise mit jeder Zellteilung einen Teil der eingebrachten Nucleinsäuresequenz. Folglich können die transformierten Zellen entweder transient und/oder stabil transformiert sein.
Eine nicht-embryonale Brassica-Gewebepräparation kann vor der Bombardierung auf Induktionsmedium kultiviert werden, z. B. einem festen Induktionsmedium. Typischerweise wird ein festes Medium aus flüssigem Medium durch Zugabe von Agar hergestellt. Das Induktionsmedium enthält typischerweise Murashige und Skoog(MS)-Medium, sowie relativ höhere Konzentrationen von Auxin, z. B. 2,4-Dichlorophenoxyessigsäure (2,4-D), und relativ niedrigere Konzentrationen von Cytokinin, z. B. Kinetin. Beispielsweise können 1 mg/l von 2,4-D und 0,3 mg/l Kinetin zu dem MS-Medium hinzugegeben und verwendet werden. Zusätzlich wird die Gewebepräparation auf dem Induktionsmedium üblicherweise für 1–3 Tage vor der Bombardierung kultiviert.
Für die Zwecke dieser Erfindung können feste und/oder flüssige Gewebekulturtechniken verwendet werden. Beispielsweise kann das Induktions-, Selektions- und Regenerationsmedium entweder in fester oder in flüssiger Form vorliegen.
Bei der Verwendung von festem Medium kann das Brassica-Gewebe direkt auf das Medium platziert werden, oder es kann auf einen Filterstreifen platziert werden, der dann mit dem Medium in Kontakt gebracht wird. Bei der Verwendung von flüssigem Medium kann das Brassica-Gewebe auf eine Flotationsvorrichtung platziert werden, die mit dem flüssigen Medium in Kontakt steht. Bei einer Flotationsvorrichtung handelt es sich typischerweise um eine poröse Membran, die an anderer Stelle beschrieben ist ( US-Patent Nr. 5,324,657 ). Beispiele für Flotationsvorrichtungen, Verfahren zur Verwendung von Flotationsvorrichtungen und Zusatzgeräte, die in Flüssigkulturtechniken zusätzlich verwendet werden, können unmittelbar von Anbietern wie beispielsweise Life Technologies (Rockville, MD) und Osmotek Ltd. (Kiryat Weizmann Rehovot 76120, Israel) erhalten werden. Typischerweise wird schneller wachsendes Gewebe auf Flüssigmedium kultiviert. Beispielsweise kann flüssiges Selektionsmedium und flüssiges Regenerationsmedium zur Kultivierung von Brassica juncea-Gewebe verwendet werden.
Nucleinsäuremoleküle
Es können entweder zirkuläre oder lineare Nucleinsäuremoleküle verwendet werden, um die Partikel zu beschichten, die dann wiederum dazu verwendet werden, um Brassica zu transformieren. Ferner kann es sich bei diesen Nucleinsäuremolekülen um RNA oder DNA, einschließlich cDNA, genomische DNA und synthetische (z. B. chemisch synthetisierte) DNA handeln, die doppelsträngig oder einzelsträngig sein kann. Bei einer einzelsträngigen Nucleinsäure kann es sich um den Sinnstrang oder den Gegensinnstrang handeln. Im Rahmen der Erfindung werden auch Fragmente dieser Moleküle in Erwägung gezogen und können beispielsweise durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR) hergestellt werden oder durch die Behandlung mit einer oder mehreren Restriktionsendonucleasen gewonnen werden. RNA-Moleküle können beispielsweise durch Transkription in vitro hergestellt werden.
Die Nucleinsäuremoleküle der Erfindung codieren typischerweise für ein Polypeptid oder regulieren die Expression eines Polypeptides. Beispielsweise kann eine cDNA verwendet werden, die für ein Enzym oder ein Gegensinn-Molekül codiert, das die Herstellung eines Enzyms verhindert. Der Begriff ”Gegensinn-Molekül” umfasst ein beliebiges Nucleinsäuremolekül, das Sequenzen enthält, die komplementär zu dem Codierungsstrang des natürlicherweise vorkommenden Polypeptides sind. Ein Gegensinn-Molekül kann ferner flankierende Sequenzen beinhalten, z. B. regulatorische Sequenzen oder Introns. Folglich werden im Rahmen der Erfindung als Gegensinn-Moleküle enzymatische Nucleinsäuremoleküle, die spezifisch auf RNA ausgerichtet sind und diese unter Verwendung von komplementären Gegensinn-sequenzen, wie beispielsweise Ribozymen oder Gegensinn-Oligonucleotiden, spalten, in Erwägung gezogen. Diese Ribozyme können jede allgemeine Struktur aufweisen, einschließlich, ohne Einschränkung, Haarnadel-, Hammerkopf- oder Axtkopfstrukturen, vorausgesetzt, dass das Molekül RNA spaltet.
Im Allgemeinen liegt ein Nucleinsäuremolekül der Erfindung in der Form eines Plasmides vor und enthält Sequenzen, die für ein Polypeptid codieren, sowie die Expression des Polypeptides fördern, wenn dies in einer Brassica-Zelle vorhanden ist. Die Sequenzen, die die Polypeptidexpression fördern, sind typischerweise regulatorische Sequenzen, die die Sequenzen flankieren, die für das Polypeptid codieren. Bei einem Polypeptid kann es sich um jedes beliebige synthetisch hergestellte oder biologisch gewonnene Polypeptid handeln. Ferner kann das Polypeptid natürlicherweise in Brassica vorkommen oder heterolog zu Brassica sein. Folglich werden im Rahmen der Erfindung Brassica-Polypeptide, Pflanzen-Polypeptide, Nicht-Pflanzen-Polypeptide, modifizierte Polypeptide, synthetische Polypeptide und Teile von Polypeptiden in Erwägung gezogen.
Die Zusammensetzung der und Verfahren zur Konstruktion von Nucleinsäuremoleküle(n) zur erfolgreichen Transformation von Pflanzen sind einem Fachman wohlbekannt. So ist beispielsweise die Verwendung von geeigneten Nucleinsäurekomponenten, wie beispielsweise Promotoren, Polyadenylierungssequenzen, selektierbare Markersequenzen, Reportersequenzen, Enhancer, Introns und dergleichen als Referenzen, die die spezifischen Zusammensetzungen der Komponenten ausmachen, an anderer Stelle beschrieben (Weising et al., Ann. Rev. Genetics 22: 421-478 (1988)). Ferner sind geeignete Verfahren zur Konstruktion an anderer Stelle beschrieben (Sambrook J., et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)). Es ist wichtig, festzuhalten, dass die gleichen oder ähnliche Zusammensetzungen und Verfahren hierin verwendet werden können, um Nucleinsäuremoleküle herzustellen, die nützlich sind, um Brassica zu transformieren, da die spezifische Zusammensetzung des Nucleinsäuremoleküls, das dazu verwendet wird, um Brassica zu transformieren, für die vorliegende Erfindung nicht entscheidend ist, und die Erfindung ist nicht abhängig von der Zusammensetzung des verwendeten, spezifischen, transformierenden Nucleinsäuremoleküls.
Nucleinsäuremoleküle, die besonders nützlich sind, um Brassica zu transformieren, beinhalten DNA-Moleküle, die ein für die resultierende transformierende Brassica-Pflanze vorteilhaftes Merkmal liefern oder verstärken. Die DNA kann beispielsweise für Polypeptide oder Gegensinn-Moleküle codieren, die erhöhte Nährwerte, höhere Ernten, Schädlingsresistenz, Krankheitsresistenz und dergleichen fördern. Spezifische Beispiele umfassen, ohne Einschränkung, eine heterologe Fettsäuredesaturase oder Fettsäureelongase, die die Fettsäurezusammensetzung beeinflussen, ein Bt-Endotoxin-Gen oder einen Proteaseinhibitor, welche Insekten Resistenz verleihen; ein bakterielles ESPS-Synthase-Gen, das Resistenz gegenüber dem Herbizid Glyphosat verleiht; und ein Chitinase- oder Glucan-endo-1,3-B-glucosidase-Gen, das Fungizideigenschaften verleiht. Ferner kann das Nucleinsäuremolekül in Brassica eingebracht werden, um als ein genetisches Werkzeug zu wirken, um Mutanten zu generieren, und/oder die Identifizierung, genetische Markierung oder die Isolierung von Segmenten von Brassica-DNA zu unterstützen. Zusätzliche Nucleinsäuremoleküle, die ein vorteilhaftes Merkmal bereitstellen, oder als genetisches Werkzeug nützlich sind, sind einem Fachmann allgemein bekannt und werden im Rahmen der Erfindung in Erwägung gezogen.
Das Nucleinsäuremolekül, das in Brassica eingebracht wird, kann ferner Nucleinsäuresequenzen enthalten, die für einen selektierbaren Marker, einen Reporter oder für beides codieren. Die Expression dieser Sequenzen in Brassica kann die Identifizierung und Selektion von Zellen erleichtern, die stabil, transient oder auf beide Art und Weisen transformiert sind. Alternativ kann der selektierbare Marker von einem separaten Nucleinsäuremolekül getragen werden, das unter Verwendung eines Cotransformationsverfahrens eingebracht wird. Die Sequenzen, die für diese selektierbaren Marker und Reporter codieren, können von geeigneten regulatorischen Sequenzen flankiert sein, die die Expression in Brassica fördern. Nützliche selektierbare Marker sind im Stand der Technik wohlbekannt und umfassen z. B. Antibiotika- und Herbizid-Resistenz-Gene. Spezifische Beispiele solcher Gene sind an anderer Stelle offenbart (Weising et al., Ann. Rev. Genetics 22: 421-478 (1988)). Ein typisches selektierbares Marker-Gen ist das Aminoglycosid-Phosphotransferase-Gen des Transposons Tn5 (AphII), das für ein Polypeptid codiert, das Resistenz gegenüber den Antibiotika Kanamycin, Neomycin und G418 (Geneticin) verleiht. Weitere selektierbare Marker, die im Stand der Technik bekannt sind, beinhalten die Codierungs-sequenz der Hygromycin-B-Phosphotransferase (HPT), die aus E. coli gewonnen werden kann, sowie jene Gene, die für Polypeptide codieren, die Resistenz oder Toleranz gegenüber Glyphosat, Methotrexat, Phosphinotricin, Imidazolinone, Sulfonylurea, Bromoxynil, Dalapon und dergleichen verleihen. Die Expression von selektierbaren Marker-Genen, die Herbizidresistenz oder -toleranz in den transformierten Brassica-Pflanzen verleihen, ist kommerziell nützlich.
Reporter-Gene, die für leicht nachweisbare Markerpolypeptide codieren, sind im Stand der Technik wohlbekannt. Im Allgemeinen handelt es sich bei einem Reporter-Gen um ein Gen, das im Empfängerorganismus oder -gewebe nicht vorhanden ist oder exprimiert wird, und das für ein Polypeptid codiert, dessen Expression durch eine leicht detektierbare Eigenschaft manifestiert wird, z. B. eine phänotypische Veränderung oder enzymatische Aktivität. Beispiele für solche Reporter werden an anderer Stelle gegeben (Weising et al., Ann. Rev. Genetics 22: 421-478 (1988)). Typische Reporter umfassen das Grün-Fluoreszenz-Protein(GFP)-Gen aus der biolumineszenten Qualle Aequorea victoria, Varianten von GFP, das Chloramphenicolacetyltransferase-Gen aus Tn9 von E. coli, das Betaglucuronidase-Gen aus dem uidA-Locus von E. coli und Luciferase-Gene aus dem Glühwürmchen Photinus pyralis. Vektoren, die Nucleinsäuresequenzen von GFP und GFP-Varianten enthalten, sind kommerziell von Clontech Laborstories, Inc. (Palo Alto, CA) erhältlich. Die Anwendungshinweise für GFP (Living Colors^TM; PT2040-1; Clontech Laboratories, Inc.) beschreiben sowohl GFP als auch GFP-Varianten.
Die regulatorischen Sequenzen, die hierin nützlich sind, beinhalten konstitutive, induzierbare, gewebe- oder organspezifische, oder entwicklungsstadiumspezfische Promotoren, die in Pflanzenzellen funktionieren. Geeignete Promotoren sind an anderer Stelle offenbart (Weising et al., Ann. Rev. Genetics 22: 421-478 (1988)). Anschließend folgt eine partielle repräsentative Liste von Promotoren, die für eine Verwendung hierin geeignet sind: regulatorische Sequenzen aus der T-DNA von Agrobacterium tumefaciens, einschließlich Mannopinsynthase, Nopalinsynthase und Octopinsynthase; Alkoholdehydrogenasepromotor aus Getreide; lichtinduzierbare Promotoren, wie beispielsweise das Gen für die kleine Untereinheit der Ribulosebiphosphatcarboxylase aus einer Vielzahl von Spezies; der Promotor für das Gen für das Hauptchlorophyll a/b-Bindeprotein; 35S- und 19S-Promotoren des Blumenkohlmosaikvirus; entwicklungsabhängig regulierte Promotoren, wie beispielsweise Oleosin-, Cruciferin-, Napin- und Phaseolinpromotoren; des Weiteren synthetische oder andere natürliche Promotoren, die entweder induzierbar oder konstitutiv sind, einschließlich jene Promotoren, die die organspezifische Expression oder die Expression in (einem) spezifischen Entwicklungsstadium/stadien der Pflanze ausüben.
Besonders bevorzugte Promotoren sind jene, die die saatgutspezfische Expression ermöglichen. Solche Promotoren sind nützlich, da Saatgut die Hauptquelle für pflanzliche Öle ist, und da die saatgutspezifische Expression mögliche potentielle schädliche Auswirkungen in Nicht-Saatgut-Geweben verhindert. Beispiele für saatgutspezifische Promotoren umfassen, ohne Einschränkung, Promotoren von Saatgutspeicherproteinen, die in vielen Pflanzen bis zu 90% des gesamten Saatgutproteins ausmachen können. Die Saatgutspeicherproteine werden genau reguliert und werden nahezu ausschließlich in Saatgut in höheren Geweben und auf stadiumspezifische Art und Weise exprimiert (Higgins et al., Ann. Rev. Plant Physiol. 35: 191-221 (1984)). Ferner können verschiedene Saatgutspeicherproteine zu verschiedenen Stadien der Saatgutentwicklung exprimiert werden.
Die Expression von saatgutspezifischen Genen wurde in großem Detail untersucht (siehe Übersichtsartikel von Goldberg et al., Cell 56: 149-160 (1989)). Es gibt gegenwärtig vielzählige Beispiele für eine saatgutspezifische Expression von Saatgutspeicherprotein-Genen in transgenen zweikeimblättrigen Pflanzen.
Weitere Beispiele für saatgutspezifische Promotoren betreffen Gene, die während der frühen Embryogenese und Ölbiosynthese exprimiert werden. Beispielsweise können native regulatorische Sequenzen, einschließlich der nativen Promotoren, von Fettsäuredesaturase-Genen nach deren Isolation durch den Fachmann verwendet werden. Heterologe Promotoren aus anderen Genen, die in die Saatgutöl-Biosynthese involviert sind, wie beispielsweise jene der Isocitratlyase und Malatsynthase von Brassica napus (Comai et al., Plant Cell 1: 293-300 (1989)), Delta-9-Desaturase aus Safflower (Thompson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 2578-2582 (1991)), und Castor (Shanklin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 2510-2514 (1991)), Acylträgerprotein (ACP) aus Arabidopsis (Post-Beittenmiller et al., Nucl. Acids Res. (1989) 17: 1777), Brassica napus (Safford et al., Eur. J. Biochem. 174: 287-295 (1988)), und Brassica campestris (Rose et al., Nucl. Acids Res. 15: 7197 (1987)), β-Ketoacyl-ACP-Synthetase aus der Gerste (Siggaard-Andersen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 4114-4118 (1991)), und Oleosin aus Zea mays (Lee et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 6181-6185 (1991)), Sojabohne (Genbank-Zugriffsnummer: X60773) und Brassica napus (Lee et al., Plant Physiol. 96: 1395-1397 (1991)), sind von Nutzen.
Ein Nucleinsäuremolekül kann ferner weitere Elemente enthalten, wie beispielsweise Introns, Enhancer, Polyadenylierungssequenzen und dergleichen. Solche Elemente können gegebenenfalls für die Funktion des Nucleinsäuremoleküls nützlich sein, obgleich sie eine bessere Expression oder Funktionsweise des Nucleinsäuremoleküls durch das Beeinflussen der Transkription, Stabilität der mRNA oder dergleichen ermöglichen. Solche Elemente können in das Nucleinsäuremolekül eingebracht werden, sofern gewünscht, um die optimale Leistungsfähigkeit der transformierenden Nucleinsäure in der Pflanzen zu erreichen. Eine ausreichende Expression kann für einen selektierbaren Marker, so dass dieser zufriedenstellend funktioniert, häufig jedoch ohne ein Intron erreicht werden.
Um festzustellen, ob eine bestimmte Kombination von Nucleinsäurekomponenten wie gewünscht funktioniert, können Brassica-Empfängerzellen stabil oder transient durch Partikelbombardierung mit einem Nucleinsäuremolekülkonstrukt transformiert werden, das sowohl die bestimmte Kombination als auch einen Reporter enthält. Zu einer geeigneten Zeit nach der Transformation kann ein Assay zur Expression des Reporters durchgeführt werden. Beispielsweise führt ein Assay zur Identifizierung der transienten Expression des Genes für die Betaglucuronidase (GUS) aus E. coli (Jefferson et al., EMBO J. 6: 3901-3907 (1987)). In diesem Fall beträgt eine geeignete Zeit für die Durchführung des Versuches etwa 1–3 Tage nach der Bombardierung. Die Verwendung des Transientassays ist insbesondere wichtig, wenn ein Nucleinsäuremolekül verwendet wird, das Komponenten enthält, für die zuvor nicht gezeigt oder bestätigt wurde, dass diese mit den gewünschten Brassica-Empfängerzellen kompatibel sind.
Partikelbombardierung
Die hierin beschriebenen Nucleinsäuremoleküle werden in die nicht-embryonalen Brassica-Gewebepräparationen unter Verwendung eines Partikelbombardierungsverfahrens eingebracht. Allgemeine Beschreibungen von geeigneten Partikelbombardierungsvorrichtungen und Partikelbombardierungsverfahren werden an anderer Stelle gegeben (Sanford et al., J. Part. Sci. Technol. 5: 27-37 (1987)); Heiser W., ”Optimization of Biolistic^® transformation using the helium-driven PDS-1000/He system” in US/EG Bulletin 1688, BIO-RAD; und Dunder et al., ”Comparison of performance characteristics of different biolistic^® devices” in US/EG Bulletin 1689, BIO-RAD). Kurz gesagt, führt das Partikelbombardierungsverfahren, das auch als ein biolistisches Verfahren bezeichnet wird, ein gewünschtes Nucleinsäuremolekül unter Verwendung sehr kleiner Partikel einer Zelle zu, wobei die Partikel aus einem biologisch inerten Material bestehen und mit einem Nucleinsäuremolekül beschichtet wurden. Wenn die inerten Partikel mit dem Nucleinsäuremolekül beschichtet werden und auf eine geeignete Geschwindigkeit beschleunigt werden, dringt eines oder mehrere der Partikel in eine oder mehrere der Zellen ein, wobei das Nucleinsäuremolekül von dem Partikel freigesetzt und in der Zelle exprimiert wird. Während einige der Zellen durch das Bombardierungsverfahren tödlich beschädigt werden, überleben andere. Einige der Empfängerzellen, die überleben, behalten das eingebrachte Nucleinsäuremolekül und exprimieren es.
Die Partikel, die als Mikroprojektile bezeichnet werden, weisen im Allgemeinen ein Material mit einer hohen Dichte auf, wie beispielsweise Wolfram oder Gold. Sie sind mit dem interessierenden Nucleinsäuremolekül beschichtet. Beschichtungsverfahren sind an anderer Stelle im Detail beschrieben (Stanford et al., Methods Enzymol. 217: 483-509 (1993) und Heiser W., ”Optimization of Biolistic^® transformation using the helium-driven PDS-1000/He system” in US/EG Bulletin 1689, BIO-RAD). Die Mikroprojektile werden dann auf die Oberfläche eines Makroprojektils platziert, das dazu dient, die Antriebskraft von einer geeigneten Energiequelle auf die Mikroprojektile zu übertragen. Nachdem das Makroprojektil und die Mikroprojektile auf die passende Geschwindigkeit beschleunigt wurden, treten diese mit einer Blockierungsvorrichtung in Kontakt, die verhindert, dass das Makroprojektil seine Vorwärtsbewegung fortführt, ermöglicht es jedoch den Mikroprojektilen, die mit den Nucleinsäuremolekülen beschichtet sind, fortzuschreiten und in die Empfänger-Brassica-Zellen einzuschlagen. Geeignete Vorrichtungen können eine Vielzahl von Antriebskräften verwenden, wie beispielsweise einen Hochdruckheliumtank, Schießpulver und Schockwellen aus einer elektrischen Bogenentladung (Sanford et al., J. Part. Sci. Technol. 5: 27-37 (1987)) und Sanford et al., Technique 3: 3-16 (1988)).
Ein Protokoll zur Verwendung einer Schießpulvervorrichtung wird von Klein T et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 85: 4305-4309 (1988) und Bio/Technology 6: 599-563 (1988)) bereitgestellt und beinhaltet zwei Hauptschritte. Zuerst werden Wolfram-Mikroprojektile beschichtet, wenn diese mit dem Nucleinsäuremolekül, Calciumchlorid und der freien Base von Spermidin in einer speziellen Reihenfolge in einer wässrigen Lösung gemischt werden. Die Konzentrationen der verschiedenen Komponenten können variiert werden. Es kann beispielsweise jede beliebige Konzentration des Nucleinsäuremoleküls verwendet werden, vorausgesetzt, dass die Empfänger-Brassica-Zellen das transferierte Nucleinsäuremolekül exprimieren. Zweitens, während der eigentlichen Bombardierung wird sowohl die Entfernung zwischen den Empfängerzellen und dem Ende des Laufs als auch das Vakuum in der Probenkammer eingestellt. Diese Einstellungen sind an anderer Stelle beschrieben (Klein et al., Bio/Technology 6: 599-563 (1988)) und können variiert werden.
Ein Protokoll zur Verwendung einer Vorrichtung mit einem Tank von Hochdruckhelium (Biolistic^® PDS-1000/He Particle Delivery System) wird von dem Hersteller (BIO-RAD, Hercules, CA) bereitgestellt. Die spezifischen Bedingungen, wie beispielsweise die Konzentration des Nucleinsäuremoleküls, das zur Beschichtung der Mikroprojektile verwendet wird, der Heliumdruck, der zur Beschleunigung der Mikroprojektile verwendet wird, und die Entfernung der Stoppwand von der Probe, können variiert werden. Typischerweise wird das Empfängergewebe etwa 6 bis 9 cm unterhalb des Trägers mit der Stoppplatte positioniert.
Die spezifischen Brassica-Gewebepräparationen, die hierin beschrieben werden, können auf eine Petrischale oder eine andere Oberfläche platziert und auf im Wesentlichen jede beliebige Art und Weise angeordnet werden, wobei klar ist, dass (i) der Bereich in dem Zentrum der Schale die höchste Konzentration von Nucleinsäuremolekül-beschichteten Partikeln aufnimmt, und das Gewebe, das dort angeordnet ist, während der Bombardierung geschädigt werden kann, und (ii) die Anzahl von Partikeln, die eine Zelle erreichen, abnimmt, so wie der Abstand der Zelle von dem Zentrum des Einschlagsbereiches zunimmt, so dass die Zellen, die vom Zentrum der Schale weit entfernt sind, möglicherweise nicht bombardiert und transformiert werden. Das Biolistic^® PDS-1000/He Particle Delivery System (BIO-RAD, Hercules, CA) kann eine gleichmäßigere Verteilung von Mikroprojektilen auf die Empfängerzellen liefern. Ein Maschenschild, vorzugsweise aus Metall, kann wahlweise auf die Schale gelegt werden, um ein Spritzen oder ein Herausschleudern des Gewebes zu verhindern. Das Gewebe kann einmal oder mehrmals mit den Nucleinsäuremolekül-beschichteten Partikeln bombardiert werden. Ferner können die Zellen mit Partikeln bombardiert werden, die mit einem einzigen Typ von Nucleinsäuremolekül oder mit mehreren verschiedenen Nucleinsäuremolekülen beschichtet sind. Gleichermaßen kann eine Gewebepräparation mit einer Ansammlung von Partikeln bombardiert werden, wobei die Ansammlung verschiedene Sets enthält, die jeweils mit einem unterschiedlichen Nucleinsäuremolekül beschichtet sind.
Identifizierung von transformierten Brassica
Nachdem die Brassica-Gewebepräparation mit den beschichteten Partikeln bombardiert wurde, und das Nucleinsäuremolekül einige der Zellen penetriert hat, ist es erforderlich, Zellen zu identifizieren, die sowohl das Nucleinsäuremolekül enthalten, als auch eine ausreichende regenerative Kapazität beibehalten haben. Es können viele Ansätze dazu verwendet werden, um transformierte Pflanzenzellen zu identifizieren, die einem Fachmann bekannt sind. Kurz gesagt, zwei allgemeine Ansätze, die als nützlich empfunden werden, werden beschrieben. Erstens, transformierte Brassica-Zellen oder aus diesen regenerierte Pflanzen können auf das Vorhandensein des Nucleinsäuremoleküls durch verschiedene Standardverfahren gescreent werden, einschließlich, ohne Einschränkung, Versuche zu der Expression eines Reporters, der in dem Nucleinsäuremolekül enthalten ist, und Bewertungen der phänotypischen Auswirkungen, welche durch die Expression des Nucleinsäuremoleküls verursacht werden, sofern zutreffend. Zweitens, eine selektierbare Markersequenz kann zusammen mit oder als Teil des Nucleinsäuremoleküls übertragen werden. In diesem Fall können die Zellen durch die Verwendung eines selektiven Agens identifiziert werden, um die Expression des selektierbaren Markers zu detektieren.
Die Selektionsbedingungen müssen derart gewählt werden, dass ein Wachstum und die Akkumulation der transformierten Zellen ermöglicht wird, während gleichzeitig das Wachstum der nicht-transformierten Zellen inhibiert wird. Diese Situation kann durch die Tatsache verkompliziert werden, dass die Vitalität von individuellen Zellen in einer Population häufig hochgradig von der Vitalität der benachbarten Zellen abhängt. Ferner dürfen die Selektionsbedingungen nicht so streng sein, dass die Pflanzenregenerationsfähigkeit der transformierten Zellen und die Fertilität der resultierenden Pflanze beeinträchtigt werden. Folglich sollten die Auswirkungen des Selektionsagens auf die Zellvitalität und -morphologie bewertet werden. Dies kann vorausgehend durch das experimentelle Produzieren einer Wachstumsinhibitionskurve für ein bestimmtes selektives Agens und Gewebe bewerkstelligt werden, wodurch der Konzentrationsbereich ermittelt wird, der das Wachstum nicht inhibiert.
Wenn ein selektierbarer Marker verwendet wird, kann das bombardierte Brassica-Gewebe entweder von der Bombardierung auf einem nicht-selektiven Medium regeneriert werden oder direkt in das Medium gegeben werden, das das Selektions-Agens enthält.
Selektionsverfahren beinhalten typischerweise die Exposition des bombardierten Gewebes an ein toxisches Agens. Das Gewebe kann sequentiellen Veränderungen der Konzentration des Agens oder auch verschiedenen Selektionsrunden unterzogen werden. Die speziellen Konzentrationen und Zykluslängen variieren typischerweise in Abhängigkeit von den Agenzien, die im Speziellen verwendet werden. Ferner kann das Selektionsverfahren die Verwendung einer anfänglichen Selektionsrunde mit einer relativ niedrigen Konzentration des toxischen Agens, und dann (eine) weitere Runde(n) bei (einer) höheren Konzentration(en) beinhalten. Dadurch wird ermöglicht, dass das selektive Agens seinen toxischen Effekt langsam über einen längeren Zeitraum ausübt. Anfänglich kann die Konzentration des Agens derart sein, dass etwa ein 5–40%-iger Level der Wachstumsinhibition erfolgt, wie dies über eine Wachstumsinhibitionskurve bestimmt wird. Das Ziel ist es, den transformierten Zellen ein Wachstum und Teilungsaktivität zu ermöglichen, wobei vorzugsweise die untransformierten Zellen inhibiert werden, allerdings nicht zu einem solchen Ausmaß, dass das Wachstum der transformierten Zellen verhindert wird. Nachdem wenige individuelle transformierte Zellen ausreichend gewachsen sind, kann das Gewebe in Medium überführt werden, das eine höhere Konzentration des toxischen Agens enthält, um im Wesentlichen sämtliche untransformierten Zellen abzutöten. Das Überführen in höhere Konzentrationen reduziert ferner die Möglichkeit, dass sich nicht-transformierte Zellen an das Agens gewöhnen. Bei einer höheren Konzentration kann es sich um eine solche Konzentration handeln, die etwa 30 bis 100% Wachstum inhibiert. Die Länge des ersten Selektionszyklus kann zwischen etwa 1 bis 4 Wochen liegen, typischerweise etwa 2 Wochen betragen. Spätere Selektionszyklen können zwischen etwa 1 bis etwa 12 Wochen, typischerweise zwischen etwa 2 bis etwa 10 Wochen liegen. Vermeintliche Brassica-Transformanten können im Allgemeinen vor einem Hintergrund von nicht-proliferierenden Zellen als proliferierende Gewebe oder Zellen identifiziert werden. Das bombardierte Brassica-Gewebe kann ferner auf nicht-selektiven Medien zu verschiedenen Zeiten während des gesamten Selektionsverfahrens kultiviert werden.
Nachdem ein Sektor als ein vermeintlich transformierter Sektor identifiziert wurde, kann die Transformation durch eine phänotypische und/oder genotypische Analyse bestätigt werden. Wenn ein Selektionsagens verwendet wird, umfasst die phänotypische Analyse beispielsweise die Messung einer jeglichen Zunahme des Frischgewichtes der vermeintlichen Transformante im Vergleich zu einer Kontrolle bei verschiedenen Spiegeln des selektiven Agens. Weitere Analysen, die verwendet werden können, hängen von der Funktion des transformierten Nucleinsäuremoleküls ab. Wenn beispielsweise durch das Nucleinsäuremolekül ein Enzym oder ein anderes Polypeptid codiert wird, können enzymatische oder immunologische Assays durchgeführt werden, die für das spezielle Enzym spezifisch sind. Spezifische Bioassay- und chemische Assaytechniken, die für die Detektion der Expression der transformierten Nucleinsäuremoleküle geeignet sind, sind im Stand der Technik wohlbekannt und werden hier nicht wiederholt. Das Vorhandensein der Nucleinsäure selbst kann durch übliche Verfahren bestätigt werden, d. h. Southern blot, Northern blot oder PCR-Analyse oder dergleichen.
Regeneration von Brassica-Pflanzen
Transformierte Brassica-Zellen können in Pflanzen regeneriert, und die Fertilität der resultierenden Pflanzen kann bestimmt werden. Kurz gesagt, Zellen, die positiv auf die Transformation getestet wurden, werden auf Medium platziert, das die Gewebedifferenzierung und Pflanzenregeneration fördert. Ein Beispiel für ein Regenerationsmedium beinhaltet, ohne Einschränkung, MS-Medium, das relativ geringere Konzentrationen von Auxin enthält, z. B. Indol-3-Essigsäure (IAA), und relativ höhere Konzentrationen von Cytokinin, z. B. Zeatin. Der spezifische Regenerationsprozess kann in Übereinstimmung mit Standardverfahren durchgeführt werden, die im Stand der Technik wohlbekannt sind. Typischerweise haben diese Verfahren eine Reduzierung des Spiegels von Auxin zur Folge. Das Regenerationsmedium kann ferner das gleiche Selektionsagens enthalten, das in dem Selektionsmedium verwendet wurde. Die regenerierten Pflanzen können in einem Wachstumsraum oder Gewächshaus bis zur Reife wachsen gelassen werden, und geeignete Geschlechtskreuzungen und Selbstungen werden durchgeführt.
Es ist wichtig, festzuhalten, dass die Pflanzenregeneration, sofern wichtig für die vorliegende Erfindung, auf jede beliebige konventionelle Art und Weise durchgeführt werden kann. Wenn beispielsweise ein selektierbarer Marker in die Zellen eingebracht wurde, kann dann ein Selektionsagens zu dem Regenerationsmedium gegeben werden, um weiter zu bestätigen, dass die regenerierten Pflänzchen transformiert sind. Da die Regenerationstechniken wohlbekannt und für die vorliegende Erfindung nicht entscheidend sind, kann jede beliebige Technik verwendet werden, die die Regeneration bewerkstelligt und fertile Pflanzen liefert.
Analyse der Nachkommen
Die Pflanzen, die von den transformierten Brassica regeneriert werden, werden als R₀-Generation oder R₀-Pflanzen bezeichnet. Die Saatgüter, die durch verschiedene sexuelle Kreuzungen der R₀-Generationspflanzen produziert werden, werden als R₁-Nachkommen oder R₁-Generationen bezeichnet. Wenn die R₁-Saatgüter keimen, werden die resultierenden Pflanzen auch als die R₁-Generation bezeichnet.
Die R₁-Generation sollte analysiert werden, um die erfolgreiche Übertragung und Vererbung des transformierten Nucleinsäuremoleküls zu bestätigen. Die Analyse kann unter Verwendung von beliebigen Verfahren durchgeführt werden, die hierin beschrieben sind, um Transformanten zu identifizieren, wobei zu berücksichtigen ist, dass ein beliebiger Teil der Pflanze verwendet werden kann. Ferner kann jede R₁- oder spätere (z. B. R₂, R₃, R₄ etc.) Pflanze als auch F₁- oder spätere (z. B. F₂, F₃, F₄ etc.) Pflanze analysiert werden.
Aus dem Vorstehenden ergibt sich, dass der Begriff ”Nachkomme” Abkömmlinge einer bestimmten Zelle, Zelllinie, Pflanze oder Pflanzenlinie, z. B. Saatgüter, die von einer Pflanzen entwickelt wurden, und Pflanzen, die von solchen Saatgütern gewonnen wurden, beinhaltet. Nachkommen einer solchen Pflanze beinhalten Saatgüter, die aus R₀, R₁, R₂ und Pflanzen nachfolgender Generationen gewonnen wurden, Saatgüter, die aus F₁, F₂, F₃ und nachfolgenden Generationen von Pflanzen gewonnen wurden, oder Saatgüter, die von BC₁, BC₂, BC₃ oder Pflanzen aus nachfolgenden Generationen gewonnen wurden. Folglich beinhalten geselbstelte Nachkommen nicht nur die R₁-Nachkommen der anfänglichen Selbstbestäubung, sondern auch R₂, R₃ und nachfolgende Generationen.
Züchtung der transgenen Brassica
Im Allgemeinen ist der kommerzielle Wert der transformierten Brassica-Pflanzen, die hierin produziert werden, am größten, wenn das Nucleinsäuremolekül in viele verschiedene Sorten eingebracht werden kann. Ein Landwirt baut typischerweise verschiedene Sorten basierend auf Unterschieden in der Reife, Standfestigkeit und anderen landwirtschaftlichen Merkmalen an. Ferner muss der Landwirt eine Sorte basierend auf der geographischen Örtlichkeit auswählen, da Sorten, die an eine spezielle Wachstumsumgebung angepasst sind, im Allgemeinen wegen Unterschieden in solchen Merkmalen, wie Reife, Krankheits- und Insektenresistenz, nicht an andere angepasst sind. Insofern kann es vorteilhaft sein, wenn das Nucleinsäuremolekül in eine größere Anzahl von parentalen Brassica-Linien eingebracht wird, so dass viele Sorten produziert werden können, die das gewünschte Nucleinsäuremolekül enthalten. Dies kann auf konventionelle Art und Weise mit Hilfe von Zuchtprogrammen erfolgen, in denen ein Konversionsvorgang (Rückkreuzung) durchgeführt wird, indem die anfängliche tansgene, fertile Pflanze mit normalen Eliteinzuchtlinien gekreuzt wird, und dann die Nachkommen mit den normalen Eltern rückgekreuzt werden. Die Nachkommen aus dieser Kreuzung spalten sich derart auf, dass einige Pflanzen das Nucleinsäuremolekül tragen werden, andere hingegen nicht. Die Pflanzen, die das Nucleinsäuremolekül tragen, werden dann erneut mit den normalen Pflanzen gekreuzt, was in Nachkommen resultiert, die sich noch einmal aufspalten. Dieses Kreuzen wird wiederholt, bis das ursprüngliche normale Elternteil zu einer gentechnisch hergestellten Linie konvertiert wurde, die das Nucleinsäuremolekül enthält und ferner alle anderen wichtigen Eigenschaften besitzt, die ursprünglich in dem Elternteil gefunden wurden. Ein separates Rückkreuzungsprogramm kann für jede Elitelinie verwendet werden, die in eine gentechnisch hergestellte Elitelinie konvertiert werden soll. Es kann für beide Elternteile notwendig sein, dass diese für das Nucleinsäuremolekül homozygot sind. Die Brassica-Züchtung und die Techniken und Fähigkeiten, die erforderlich sind, um Gene von einer Linie oder einer Art zu einer anderen zu transferieren, sind dem Fachmann wohlbekannt.
Verwendungen von transgenen Brassica-Pflanzen
Transgene Pflanzen, die wie hierin beschrieben produziert werden, sind für eine Vielzahl von kommerziellen und Forschungszwecken nützlich. Transgene Pflanzen können zur Verwendung in der traditionellen Landwirtschaft hergestellt werden, um Merkmale zu besitzen, die für den Züchter von Nutzen sind (z. B. landwirtschaftliche Merkmale, wie beispielsweise Schädlingsresistenz oder Ertragserhöhung), die vorteilhaft für den Konsumenten des Produktes sind, das aus der Pflanze gewonnen wird (z. B. erhöhter Nährwert in der Nahrung für den Menschen oder in dem Tierfutter), oder die von Vorteil für den Verarbeiter von Nahrungsmitteln (z. B. verbesserte Verarbeitungsmerkmale) sind. Chemische Bestandteile, wie beispielsweise Öle und Stärken von Brassica, können zu Nahrungsmittel- oder industriellen Zwecken extrahiert werden, und transgene Pflanzen können hergestellt werden, um die Spiegel solcher Komponenten zu erhöhen oder zu modifizieren. Die Pflanzen können ferner zur Produktion von Saatgut für eine Vielzahl von Zwecken verwendet werden.
Transgene Pflanzen können ferner in der gewerblichen Herstellung von Polypeptiden oder anderen Molekülen verwendet werden, die von dem darin enthaltenen Nucleinsäuremolekül codiert werden, wobei das exprimierte interessierende Molekül aus den Pflanzenteilen, Saatgütern und dergleichen extrahiert oder gereinigt wird. Ferner können Zellen oder Gewebe aus transgenen Pflanzen kultiviert, in vitro wachsen gelassen oder fermentiert werden, um die gewünschten Moleküle herzustellen, oder anderen Zwecken dienen, wie beispielsweise der Forschung.
Die transgenen Pflanzen können ferner in gewerblichen Zuchtprogrammen verwendet werden, oder können gekreuzt oder mit Pflanzen von verwandten Nutzpflanzen-Spezies gekreuzt oder gezüchtet werden. Verbessernde Eigenschaften, die von dem Nucleinsäuremolekül codiert werden, können von einer Brassica-Spezies auf eine andere Brassica-Spezies übertragen werden, beispielsweise durch die Fusion von Protoplasten.
Transgene Pflanzen können auf vielfältige Art und Weise in der Forschung oder der Züchtung verwendet werden, einschließlich zur Bildung von neuen mutierten Pflanzen durch Insertionsmuttergenese, um vorteilhafte Mutanten zu identifizieren, die später durch traditionelle Mutation und Selektion hergestellt werden könnten. Die Verfahren der Erfindung können auch dazu verwendet werden, um Pflanzen herzustellen, die einzigartige ”Signatursequenzen” oder andere Markersequenzen aufweisen, die dazu verwendet werden können, um proprietäre Linen oder Arten zu identifizieren.
Die Erfindung wird in den folgenden Beispielen weiter beschrieben, die die Reichweite der in den Ansprüchen beschriebenen Erfindung nicht einschränken.
BEISPIELE
Transformierte Brassica-Pflanzen wurden durch Partikelbombardierung unter Verwendung von spezifischen Gewebepräparationsverfahren hergestellt.
Beispiel 1 – Brassica-Transformation durch Verwendung eines Gewebescheibenpräparationsverfahrens
Sterilisierte Saatgüter der Brassica napus-Sorte Westar wurden auf MS-Medium mit Agar und 30 mM CaCl₂ bis zur Keimung im Dunkeln für 5–6 Tage wachsen gelassen. Die Sämlinge hatten in diesem Stadium eine Höhe von 3–6 cm mit Sprossspitzen. Der Vorteil der Verwendung von sterilen Sämlingen als eine Gewebequelle ist, dass minimale Ausstattung, Zeit und Aufwand erforderlich sind, um die Spendermaterialien aufrechtzuerhalten. Die Hypocotylen dieser Sämlinge wurden geerntet und in Stücke von 2–3 cm Länge geschnitten. Jedes Hypocotyl-Stück wurde der Länge nach in zwei Hälften geschnitten und dann auf Induktionsmedium platziert, wobei die epidermale Seite in Kontakt mit dem Medium gebracht wurde, d. h. die frisch geschnittene Oberfläche zeigte im Allgemeinen nach oben. Bei dem Induktionsmedium handelte es sich um MS-Medium mit 0,5 bis 1,0 mg/l 2,4-Dichlorophenoxyessigsäure (2,4-D) und 0,2 bis 0,3 mg/l Kinetin. Die Längsschnitte wurden eng zueinander mit etwa 20 Stücken pro Schale angeordnet. Nachdem diese für 1–2 Tage auf Induktionsmedium kultiviert wurden, wurden die Längsschnitte mit Nucleinsäure-beschichteten Goldpartikeln bombardiert.
Das Nucleinsäuremolekül, das dazu verwendet wurde, um Partikel für die Bombardierung und Transformation der nicht-embryonalen Brassica-Zellen zu beschichten, war pIMC38 (1). Dieses Konstrukt enthält zwei Gene: das Neomycin-Phosphotransferase(NPTII)-Gen und das Beta-Glucuronidase(GUS)-Gen. Beide Gene werden von einem CaMV-35S-Promotor reguliert und mit einem Nopalin-Synthase(NOS)-Gen-Terminator terminiert. Die 35S-NPTII-NOS- und 35S-GUS-NOS-Einheiten sind in entgegengesetzten Richtungen angeordnet. Das NPTII-Gen dient als ein Selektionsmarker, der bei korrekter Expression den transferierten Zellen in Kultur eine Resistenz gegenüber Kanamycin verleiht, und die transformierten Saatgüter resistent gegenüber Geneticin während des Keimens macht.
Die Vorrichtung, die dazu verwendet wurde, um nicht-embryonale Brassica-Zell- oder Gewebepräparationen zu bombardieren, war ein Biolistic^® PDS-1000/He System (Dupont). Das Verfahren für die Partikelbombardierung folgt dem BioRad: US/EG Bulletin 1688 und 1689. Die spezifischen Metallpartikel, die verwendet wurden, waren 0,6 μ oder 1,0 μ Goldpartikel.
Nach der Bombardierung wurden die Längsschnitte für 3 Tage in Induktionsmedium kultiviert. Die Kulturen wurden dann in Selektionsmedium überführt. Das Selektionsmedium war das gleiche wie das Induktionsmedium, außer dass das Selektionsagens Kanamycin mit einer Endkonzentration von 25 mg/l hinzugegeben wurde. Nach 2–3 Wochen wurden die Kulturen in Regenerationsmedium überführt, das 2 mg/l Zeatin, 0,1 mg/l IAA und 25 mg/l Kanamycin enthielt. Diese Zellen wurden etwa jeweils zwei Wochen später auf dem Regenerationsmedium subkultiviert, bis grüne Sprosse erschienen.
Eine der regenerierten Pflanzen wurde selektiert (als ”Peter” bezeichnet) und auf das Vorhandensein von NPTII-Nucleinsäure analysiert. im Speziellen wurde Blattgewebe von ”Peter” gesammelt, und die DNA wurde aus diesen Zellen extrahiert und durch PCR unter Verwendung von NPTII-spezifischen Primern analysiert. Diese Analyse ergab, dass die Zellen von ”Peter” NPTII-Nucleinsäure enthielten (Tabelle I).
Regenerierte Pflanzen wurden in einem Gewächshaus bis zur Geschlechtsreife wachsen gelassen. Eine kontrollierte Bestäubung wurde zwischen ”Peter” und einer nicht-transgenen kommerziellen B. napus-Art Quantum durchgeführt. ”Peter” wurde ebenfalls selbstbestäubt.
R₁-Saatgüter von ”Peter” wurden gewonnen, und F₁-Saatguter wurden von der Quantum-x-”Peter”-Kreuzung gewonnen und auf Geneticin-Resistenz getestet. Sterilisierte Saatgüter wurden in Testmedium platziert, das 1,2 g/l Bacto-Agar und 50 mg/l oder 100 mg/l Geneticin (Gibco-LifeSciences, II811-023) enthielt. Die Saatgüter wurden in das Medium in ungefähr 0,1 bis 0,4 cm in die Tiefe gedrückt, danach wurde der Keimungsstatus wöchentlich gemessen, und der Endwert wurde nach drei Wochen aufgezeichnet. Die folgenden Beschreibungen wurden verwendet, um den Keimungsstatus der Saatgüter einzustufen. Typischerweise wachsen die nicht-transgenen Saatgüter, wenn diese in 50 mg/l Geneticin Testmedium wachsen gelassen wurden, bis zu einer Höhe von 1,5 cm, und weisen Keimblätter auf, die grün sind und gelb- bis braungefärbte Ränder aufweisen, wobei die Wurzeln nicht länger sind als 0,5 cm. Ferner wachsen nicht-transgene Saatgüter nicht in lebensfähige Sämlinge aus, nachdem diese für zwei Wochen in dem 50 mg/l Geneticin-enthaltenden Testmedium verblieben waren. Folglich wurden Saatgüter, die in Sämlinge mit grünen Keimblättern und einer Höhe von größer als 2 cm und Wurzeln von länger als 1 cm in 50 mg/l Geneticin-enthaltendem Testmedium auskeimen, als NPTII-positiv definiert. Ferner wurden Saatgüter, die in 50 mg/l enthaltendem Geneticin-Testmedium genauso schnell und normal keimen wie nicht-transgene Saatgüter, die in Geneticinfreiem Medium wuchsen, mit ”++” gekennzeichnet. Tabelle I. Analyse der regenerierten Pflanze ”Peter”, geselbstelte Nachkommen (R₁ und R₂), und gekreuzte Nachkommen (F₁ und F₂)

Pflanzen-Generation PCR (NPTII) Saatgutkeimung auf Geniticin-enthaltendem Medium

R₀ Positiv N/A

R₁ nicht getestet ++

F₁ nicht getestet +

R₂ Positiv ++

F₂ nicht getestet ++

++ = normale Vitalität, normale Morphologie des Pflänzchens; + = moderate Vitalität, normale Morphologie des Pflänzchens; N/A = entfällt; F₁ = Quantum x Peter; Quantum ist eine nicht-transgene kommerzielle B. Napus-Art.

Einige R₁-Saatgüter aus der regenerierten Pflanze ”Peter” (R₀) keimten normal, wenn diese auf Geniticin-enthaltendem Medium wuchsen, was die Transformation von Brassica anzeigt (Tabelle I). Einige R₁-Sämlinge, die die Geneticin-Selektion überlebten, wurden in Erde überführt, selbstbestäubt, und die R₂-Saatgüter wurden gewonnen. Die meisten dieser R₂-Saatgüter keimten und wuschen auf Geniticin-enthaltendem Medium normal und kräftig. F₁ (Quantum × Peter)-Saatgüter keimten auf Geneticin-enthaltendem Medium normal, jedoch nicht so kräftig, wie die Geneticin-resistenten R₁- oder R₂-Saatgüter. Folglich scheinen die Kopienzahl der NPTII-Nucleinsäure und die heterozygote Natur der integrierten NPTII-Nucleinsäure den Spiegel der NPTII-Expression zu beeinflussen. Einige F₁-Sämlinge, die die Geneticin-Selektion überlebten, wurden in Erde überführt, selbstbestäubt, und von Quantum × Peter wurden F₂-Saatgüter gewonnen und getestet. Etwa die Hälfte dieser F₂-Saatgüter keimten auf Geneticin-enthaltendem Medium normal und kräftig. Eine NPTII-spezifische PCR-Analyse an R₂-Pflanzen ergab ein positives Signal, wodurch bestätigt wurde, dass die NPTII-Nucleinsäure in ”Peter” integriert war. Eine GUS-Färbung war jedoch in allen Generationen von ”Peter” negativ.
Beispiel 2 – Brassica-Transformation unter Verwendung eines Präparationsverfahrens zur Gewebeverkleinerung
Vier bis sechs Tage alte sterile Sämlinge der Brassica napus-Sorte Westar wurden geerntet, und der untere Teil der Hypocotylen, die Samenhülle und die Wurzeln wurden verworfen. Der verbleibende obere Teil des Sämlings enthielt 10%–50% des Hypocotyls, zwei Keimblätter und die Sprossspitze. Dieser obere Teil wurde mit flüssigem Induktionsmedium zu einem Zellbrei unter Verwendung eines Mixers zerkleinert. Im Speziellen wurde der obere Teil von etwa 200 Sämlingen mit 30 ml Induktionsmedium gemischt. Diese Mischung wurde in einem Mischer bei Raumtemperatur mazeriert (Blender Model 33BL79, Warning Products Division, Dynamics Corporation of America). Der resultierende Brei wurde über eine Reihe von Maschen in Gruppen sortiert, die verschiedene Bereiche von Gewebegrößen aufwiesen. Die Gruppe mit einer Gewebegröße von 46–230 μm wurde gesammelt und bei hoher Dichte auf 12 Filtermembranen (4 cm Durchmesser) kultiviert, die auf einem festen Induktionsmedium platziert wurden. Nach 3 Tagen der Kultivierung wurden die Filme, die zerkleinertes Gewebe enthielten, mit Nucleinsäuremolekül-beschichteten Goldpartikeln bombardiert, wie in Beispiel 1 beschrieben, und für weitere 3 Tage auf Induktionsmedium kultiviert. Die Kulturen wurden dann für 2–3 Wochen in Selektionsmedium überführt, gefolgt von einer Kultivierung auf Regenerationsmedium, bis sich Schösslinge regeneriert hatten.
Regenerierte Pflanzen wurden auf das Vorhandensein von NPTII-Nucleinsäure analysiert, wie beschrieben in Beispiel 1. Ferner wurden Teile solcher Pflanzen auf GUS-Expression analysiert. Kurz, Zellen, die GUS exprimieren, erscheinen nach einem GUS-Färbeversuch blau. Der verwendete GUS-Färbeversuch wurde im Detail von Anne-Marie Stopm in Sean R. Gallagher (ed.), GUS Protocols: Using the GUS Gene as a Reporter of Gene Expression, Seiten 103-113, Academic Press, San Diego, California, 1992, beschrieben. Einige der regenerierten Schösslinge und Blätter zeigten eine starke blaue Färbung nach der GUS-Färbung, was die Expression der transferierten fremden GUS-Nucleinsäuresequenzen anzeigte.

Die regenerierten Pflanzen wurden in Erde überführt und bis zur Reife wachsen gelassen. Zehn R₁-Saatgüter wurden auf Geneticin-Resistenz durch den Saatgutkeimtest, der in Beispiel 1 beschrieben ist, getestet. Sechs Saatgüter zeigten keine Keimung. Zwei der vier verbleibenden Saatgüter waren Geneticin-resistent, und die resultierenden Pflänzchen zeigten unter solchen Bedingungen moderate Vitalität (Tabelle II). Ferner keimten 17 R₁-Saatgüter in Abwesenheit von Geneticin, und ein Blattstück eines jeden Sämlings wurde auf GUS gefärbt, wie oben beschrieben. Elf Saatgüter hiervon zeigten eine starke blaue Färbung (Tabelle II). Die GUS-Färbung und NPTII-spezifische PCR-Analyse mit R₂-Pflanzen ergab positive Signale. Zusammengenommen zeigen diese Ergebnisse, dass sowohl das NPTII-Gen als auch das GUS-Gen in das Genom integriert wurden und erfolgreich auf die Nachkommen übertragen wurden. Tabelle 2. Analyse der regenerierten Pflanzen, die unter Verwendung des Verkleinerungsverfahrens hergestellt wurden.

Pflanzen-Generation	GUS-Färbung	Keimung auf Geniticin-enthaltendem Medium	NPTII-spezifische PCR
R₀	positiv	N/A	nicht getestet
R₁	positiv	+	nicht getestet
R₂	positiv	nicht getestet	positiv

+ = moderate Vitalität, normale Morphologie des Pflänzchens; N/A = entfällt

Beispiel 3 – Transformation von Brassica juncea
Die Brassica juncea-Linie DZJ-01 ist eine proprietäre Linie, die Gewebekultur- und Regenerationseigenschaften aufweist, die vergleichbar sind mit jenen von anderen Brassica juncea-Linien. Die Linie DZJ-01 wurde unter Verwendung des in Beispiel 2 beschriebenen Verfahrens zur Präparation von zerkleinertem Gewebe erfolgreich transformiert. Da DZJ-01-Gewebe in Kultur schneller wachst als Brassica napus-Gewebe, wurden einige Kultivierungsbedingungen modifiziert. Im Speziellen wurde DZJ-01-Gewebe präpariert und bombardiert, wie beschrieben in Beispiel 2. Nach der Bombardierung wurde das Gewebe auf festem Induktionsmedium für sechs Tage wachsen gelassen. Die Kulturen wurden dann auf ein Flotationsfloßsystem überführt und für acht Tage in flüssigem Selektionsmedium kultiviert, wobei zu diesem Zeitpunkt das Medium gegen flüssiges Regenerationsmedium ausgetauscht wurde. Diese beiden flüssigen Medien hatten die gleiche Zusammensetzung wie die entsprechenden Medien in Beispiel 2, außer, dass kein Agar verwendet wurde. Das Flotationsfloßsystem umfasste ein LifeRaft-Membran-Floß (Life Technologies, Cat. No. 10518-017), eine LifeRaft-Flotationseinheit (Life Technologies Cat. No. 10521-011) und ein Magenta-Gefäß mit LifeGuard Membrane Vented Lid (Life Technologies Cat. No. 10678-019), und wurde verwendet, wie von dem Hersteller beschrieben.
Das Regenerationsmedium wurde jede Woche erneuert, bis sich grüne Sprossspitzen entwickelten. Nachdem sich die Schösslinge gebildet hatten, wurden sie auf festes Regenerationsmedium überführt und dann auf festes hormonfreies MS-Medium überführt.
Eine der regenerierten Pflanzen (als ”J. J.” bezeichnet) zeigte eine starke blaue Färbung in dem oben beschriebenen GUS-Färbeversuch. Ferner zeigte die PCR-Analyse unter Verwendung von GUS-spezifischen Primern starke positive Signale, was anzeigte, dass die GUS-spezifischen Sequenzen vorhanden waren (Tabelle III). Zusammengefasst zeigen diese Ergebnisse, dass die eingebrachte DNA in das Genom der R₀-Pflanze integriert wurde. Zum Zeitpunkt der Geschlechtsreife wurde ”J. J.” selbstbestäubt, und die R₁-Saatgüter wurden gewonnen. Um die Integration zu bestätigen, wurden R₁-Saatgüter keimen gelassen, und die resultierenden Pflänzchen wurden auf GUS-Expression getestet. Einige der R₁-Sämlinge zeigten nach der GUS-Färbung eine starke blaue Färbung, was die Integration des GUS-Genes in das Brassica juncea-Genom anzeigte. Ferner ergab die GUS-Färbung und die NPTII-spezifische PCR-Analyse mit R₂-Pflanzen positive Signale, was zusätzlich die Integration der GUS- und NPTII-Gene in das Brassica juncea-Genom bestätigte. Tabelle III. Analyse der regenerierten Brassica juncea-Pflanzen.

Pflanzen-Generation GUS-Färbung PCR (GUS) PCR (NPTII)

R₀ positiv positiv nicht getestet

R₁ positiv nicht getestet nicht getestet

R₂ positiv nicht getestet positiv
ANDERE AUSFÜHRUNGSBEISPIELE
Obwohl die Erfindung im Zusammenhang mit der detaillierten Beschreibung hiervon beschrieben wurde, gilt als vereinbart, dass die vorstehende Beschreibung dazu vorgesehen ist, um zu illustrieren, und nicht um die Reichweite der Erfindung zu beschränken, die durch den Umfang der beigefügten Ansprüche definiert wird. Weitere Aspekte, Vorteile und Modifikationen liegen im Umfang der folgenden Ansprüche.

Claims

Verfahren zur Herstellung von transformierten Brassica-Zellen, wobei das Verfahren die folgenden Schritte aufweist: (a) Bombardieren von Zellen, die aus nicht-embryonalem Brassica-Gewebe präpariert wurden, mit Mikroprojektilen, die mit Nucleinsäure beschichtet sind, um eine Präparation von bombardierten Zellen zu bilden, wobei die bombardierten Zellen wie folgt präpariert werden: (i) aus Protoplasten der Blätter; oder (ii) durch Schneiden eines Hypocotyls von einem Sämling in im Wesentlichen diagonaler Ausrichtung, um zumindest ein Hypocotylstück zu bilden, Schneiden von Scheiben aus dem zumindest einen Hypocotylstück in Längsrichtung, und In-Kontakt-Bringen von zumindest einem der Längsschnitte mit einem Induktionsmedium; oder (iii) durch Mazerieren des Gewebes in einen Zellbrei; und (b) Identifizieren von Zellen der bombardierten Präparation, die stabil mit der Nucleinsäure transformiert wurden, wobei die identifizierten Zellen die transformierten Brassica-Zellen sind.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Zellen, die aus dem nicht-embryonalen Brassica-Gewebe präpariert werden, diploid sind.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das nicht-embryonale Brassica-Gewebe aus einem Brassica-Sämling stammt.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei der Sämling ein 4 bis 6 Tage alter steriler Sämling ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Zellen, die bombardiert werden, aus nicht-embryonalem Brassica-Gewebe durch Mazerieren des oberen Teils eines Sämlings in Induktionsmedium präpariert werden, um einen Zellbrei zu bilden, wobei der obere Teil die Triebspitze, die Keimblätter und 10% bis 50% des Hypocotyls aufweist.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei der Zellbrei mit zellulärer Substanz angereichert ist, die eine Größe von etwa 46 μm bis 230 μm aufweist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die Nucleinsäure für ein Polypeptid codiert, oder die Expression eines Polypeptids reguliert.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die Nucleinsäure ein Gegensinn-Molekül aufweist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die Nucleinsäure ein Ribozym aufweist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die Nucleinsäure ein Gegensinn-Oligonucleotid aufweist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei das Brassica-Gewebe aus einer Brassica-Spezies stammt, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Brassica napus, Brassica juncea, Brassica carinata, Brassica nigra, Brassica oleracea und Brassica campestris.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Identifizierung Folgendes umfasst, nämlich das Kultivieren der bombardierten Zellen auf einer Flotationsvorrichtung in Kontakt mit einem flüssigen Selektionsmedium, und Selektieren derjenigen Zellen, die in Gegenwart des Selektionsmediums überleben.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die Nucleinsäure einen selektierbaren Marker aufweist, wobei der selektierbare Marker eine Herbizidresistenz verleiht.
Verfahren nach Anspruch 13, wobei das Herbizid ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Glyphosat, Phosphinothricin, einem Imidazolinon, einem Sulfonylharnstoff, Bromoxynil und Dalapon.
Verfahren nach Anspruch 14, wobei die Nucleinsäure für eine bakterielle ESPS-Synthase codiert.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die Nucleinsäure für ein Enzym codiert, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: einer Fettsäuredesaturase, einer Fettsäureelongase, einer Chitinase und einer Glucanendo-1,3-9-glucosidase.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Zellen, die aus einem nicht-embryonalen Brassica-Gewebe präpariert werden, haploid sind.
Verfahren nach Anspruch 17, das ferner den Schritt der Induzierung der Chromosomenverdopplung in den identifizierten Zellen unter Verwendung von Colchicin den identifizierten Zellen umfasst.
Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, das ferner den Schritt des Regenerierens einer Brassica-Pflanze aus den identifizierten Zellen umfasst, wobei die regenerierte Brassica-Pflanze mit der Nucleinsäure stabil transformiert ist, so dass eine transgene Brassica-Pflanze produziert wird.
Verfahren nach Anspruch 19, das ferner den Schritt umfasst: (a) Rückkreuzen der transgenen Brassica-Pflanze mit Pflanzen einer normalen Elite-Brassica-Inzuchtlinie, wodurch eine BC₁-Pflanze produziert wird.
Verfahren nach Anspruch 20, das ferner den Schritt umfasst: (b) Rückkreuzen der BC₁-Pflanze mit Pflanzen der normalen Elite-Brassica-Inzuchtlinie, wodurch eine BC₂-Pflanze produziert wird.
Verfahren nach Anspruch 21, das ferner den Schritt umfasst: (c) Rückkreuzen der BC₂-Pflanze mit Pflanzen der normalen Elite-Brassica-Inzuchtlinie, wodurch eine BC₃-Pflanze produziert wird.
Verfahren nach Anspruch 19, das ferner den Schritt umfasst: (a) Kreuzen der transgenen Brassica-Pflanze mit Pflanzen einer Brassica-Linie, wobei F₁-Nachkommen-Pflanzen produziert werden.
Verfahren nach Anspruch 23, das ferner das Zulassen einer Selbstbestäubung der F₁-Pflanzen umfasst, wodurch F₂-Nachkommen-Pflanzen produziert werden.
Verfahren nach Anspruch 19, wobei die Regeneration das Kultivieren der identifizierten Zellen auf einer Flotationsvorrichtung in Kontakt mit flüssigem Regenerationsmedium umfasst.