DE69227872T2 - Partikel-auslösende transformation von baumwolle - Google Patents

Description

Gebiet der Erfindung
• Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der Gentechnik im allgemeinen, und insbesondere, die gentechnische Transformation einer bedeutenden Nutzpflanze, der Baumwollpflanze.
Hintergrund der Erfindung
• Eine grundsätzliche Aufgabe der modernen Biotechnologie, soweit diese in der Landwirtschaft Anwendung findet, besteht darin, gentechnische Veränderungen der bedeutenden Nutzpflanzen zur Verfügung zu stellen. Die gentechnische Veränderung von Nutzpflanzen wird erwünscht, um Eigenschaften, die normalerweise nicht in der Nutzpflanze vorliegen, künstlich in das Genom von Elitelinien der Nutzpflanzen einzufügen. Derartige künstliche Eigenschaften, wie beispielsweise Insekten-Resistenz, Herbizid- Resistenz oder künstliche Veränderung in der landwirtschaftlichen Qualität des Produktes der Nutzpflanze werden möglich, sobald rekombinate Gene in die Nutzpflanzen eingeführt werden können.
• Das erste breit anwendbare Verfahren zur gentechnischen Veränderung von Pflanzen basierte auf der natürlichen Fähigkeit des im Boden wachsenden Mikroorganismus Acrrobacterium Tomefaciens. Das Verfahren der Transformation mittels Agrobacterium basiert auf der natürlichen Eigenschaft des Bakteriums ein Teil seiner DNA in eine Pflanzenzelle im Rahmen seiner normalen pathogenen Entwicklung einzufügen. Durch Insertion der fremden Eigenschaft, die in die Pflanze eingefügt werden soll, in das Agrobacterium mittels bestimmter Verfahren, konnte das Agrobacterium dazu verwendet werden, die Gene in die Pflanze zu übertragen. Transformationsverfahren unter Verwendung von Agrobacterium wurden für eine Vielzahl von Pflanzen, meist dicotyledone Pflanzen, entwickelt, diese unterscheiden sich jedoch etwas in der Anwendung von Pflanzensorte zu Sorte.
• Eine Beschränkung des auf Agrobacterium basierenden Übertragungssystems liegt darin, daß diese eine Zellkultur oder Gewebekultur der Pflanzengewebe als Teil des Verfahrens benötigen. Das Agrobacterium überträgt Gene in ein oder mehrere Zellen entweder in einer Suspensionskultur oder in einer Kalluskultur und anschließend müssen die Pflanzen von derart transformierten Zellen in Kultur regeneriert werden. Bei einigen Arten, wie beispielsweise Baumwolle, ist eine Transformation mittels Agrobacterium durch ein Gewebekulturverfahren wie dieses möglich. Es gibt jedoch Beschränkungen bei der Anwendung dieses Verfahrens. Die erste besteht darin, daß einige Pflanzen, wie beispielsweise Baumwolle, extrem langsam in Gewebekultur wachsen. Ein Verfahren zur gentechnischen Veränderung einer Pflanze zur Verwendung von Agrobacterium ist daher ein extrem langwieriges und häufig arbeitsintensives Verfahren. Ferner, können die Verfahren zur Gewebekultur bei vielen Pflanzenarten, darunter wiederum Baumwolle, nicht bei allen Genotypen durchgeführt werden. Nur bestimmte Baumwolle-Sorten können den weit verbreiteten Gewebekulturverfahren unterworfen werden. Die Beschränkungen des Transformationsverfahrens mittels Agrobacterium werden ferner bei Baumwolle deutlich, da die Pflanzen, die wir als Baumwolle bezeichnen, tatsächlich mehr als eine Art umfaßt. Einige Linien der Baumwolle, wie beispielsweise Coker 312 und PD3 sind Linien der Art Gossypium hirsutum, während die Linien Pima (56) und Sea Island (Barbados) Sorten von Gossypium barbardense sind. Obwohl es möglich ist, eine Baumwollpflanze einer Linie, die Gewebekultur adaptierbar ist, unter Verwendung gentechnischer Verfahren zu verändern und anschließend die Gene von dieser Sorte auf andere Baumwoll-Sorten durch herkömmliche Pflanzenzüchtungsverfahren zu übertragen, handelt es sich dabei um ein arbeitsaufwendiges Verfahren, für das mehrere Jahre benötigt werden können. Ein Verfahren zur gentechnischen Veränderung von Baumwolle, das Gewebekulturverfahren umgehen würde und unabhängig vom Genotyp wäre, würde im Hinblick auf die Geschwindigkeit und die Effizienz einen wesentlichen Vorteil darstellen. Ein Verfahren, das für die Übertragung von Genen auf Pflanzen vorgeschlagen wurde, basiert auf einen Transformationsverfahren mittels beschleunigter Gen-Partikel. Der erste Hinweis für die mögliche Eignung dieses Verfahrens war eine Beschreibung, das Gene auf Tungsten-Partikeln beschichtet und in eine Zwiebel-Haut beschleunigt wurden, wobei die Gene transient expremiert wurden, wie in U.S. Patent Nr. 4,945,050 offenbart wird. Bald darauf führten viele Wissenschaftler Versuche zur Transformation von Pflanzen mittels beschleunigter Partikel mit dem Ziel durch, transgene Pflanzen zu erhalten.
• Ein Problem bei der Entwicklung eines Transformationsverfahrens mittels beschleunigter Partikel besteht in der Aufgabe, eine Pflanzen-Transformation der Keimbahn zu erreichen. Als Pflanzentransformation der Keimbahn wird es bezeichnet, wenn die Keimzellen einer Pflanze so transformiert werden, daß die Nachkommen der Pflanze das inserierte Gen erben. Obwohl es leicht möglich ist Partikel mit Genen darauf physikalisch in Pflanzengewebe zu beschleunigen, ist es weit aus schwieriger von diesem Gewebe vollständig transgene Pflanzennachkommen zu gewinnen, welche die transgenen Gene an ihre Nachkommen weiter vererben werden, was als Keimbahntransformationsereignis bezeichnet wird. Dieses Problem wurde durch die Ergebnisse bestätigt, die unter Verwendung der meisten Transformationsverfahren mittels beschleunigter Partikel erhalten wurden, bei denen der Prozentsatz der Zellen, die durch das Partikelbeschleunigungsverfahren stabil transformiert wurden, ein relativ geringer Prozentsatz an Zellen des behandelten Gewebes darstellt. Der Prozentsatz liegt häufig bei weniger als 1% und manchmal um eine oder zwei Größenordnungen weniger als 1%. Bei einem so geringen Prozentsatz an transformierten Zellen kann die Gewinnung der Keimbahntransformanden im Hinblick auf die große Anzahl von Pflanzen und Geweben, die behandelt werden müssen, um wenige Keimbahntransformationsereignisse zu finden, schwer sein.
• Trotz dieser Schwierigkeiten wurde die gentechnische Transformation von Pflanzen durch Transformation von Pflanzen mittels beschleunigter Partikel erzielt. Ein Verfahren zur Durchführung einer solchen Transformation wird in dem Europäischen Patent 301 749 offenbart, welches die Keimbahntransformation von Sojabohnenpflanzen und Pflanzenlinien offenbart. Eines der Verfahren, die in der veröffentlichten Patentanmeldung offenbart werden, basiert auf der Beschleunigung von Partikeln, die mit DNS beladen sind, in die freigelegten embryonalen Achsen der Sojabohnenpflanzen beschleunigt werden. Wenn die so behandelten embryonalen Achsen der Sojabohne anschließend mit einem Medium mit hohen Cytokinin-Gehalt behandelt werden, können Triebe induziert werden, die von den behandelten embryonalen Achsen wachsen. Wenn diese Triebe zu ganzen Sojabohnenpflanzen gezogen werden, kann festgestellt werden, daß ein bedeutender Prozentsatz dieser Pflanzen ein Keimbahntransformationsereignis durchlaufen hat.
• In allen auf gentechnischer Transformation mittels beschleunigter Partikel basierenden Protokollen aus dem Stand der Technik bestand eine Überlegung bei der Entwicklung der Parameter des Partikelbeschleunigungsverfahrens darin, daß der Schaden für die Gewebe auf ein Minimum beschränkt wurde. In dem oben genannten U.S. Patent 4,945,050 wird beispielsweise extra darauf hingewiesen, daß versucht wird, bei der Verwendung kleiner Partikel ein Minimum an Zell-Zerstörung und Läsionen in der Zellmembran zu erzeugen. Bislang wurde es daher für ein Vorteil des Partikelbeschleunigungsverfahrens gehalten, insbesondere sehr kleine Trägerpartikel zu verwenden, um den Schaden für das behandelte Gewebe zu minimieren, sowie die Wachstumsstrukturen des Gewebes des Zielorganismus nicht zu zerstören.
• Die Transformation von Baumwolle mittels Partikelbombardierung wurde von Finer et al. (Plant Cell Reports, 1990, Vol. 8, S. 568 -589) offenbart.
Zusammenfassung der Erfindung
• Die vorliegende Erfindung kann dahingehend zusammen gefaßt werden, daß ein Verfahren zur gentechnischen Veränderung von Baumwollpflanzen und -linien durch Pflanzentransformationen mittels beschleunigter Partikel zur Verfügung gestellt wird, welches vom Genotyp der Baumwolle unabhängig ist und nicht auf einem Gewebe- oder Kallus-Kultur-Schritt des behandelten Baumwollgewebes beruht. Das Verfahren basiert auf der Insertion von mit DNS beladenen Trägerpartikeln in die freigelegten embryonalen Achsen von gekeimten Baumwollsamen. Das behandelte Gewebe wird in einem Medium mit hohen Mengen an Cytokinin kultiviert. Ein wesentlicher Prozentsatz der Triebe die aus dem Verfahren resultieren, können zu vollständig clonalen, transgenen Baumwollpflanzen kultiviert werden, ohne jemals durch einen nicht-organisierten Gewebe-Kultur-Schritt (d. h. Kallus) zu durchlaufen.
• Die vorliegende Erfindung betrifft demgemäß ein Verfahren zur Erzeugung genetisch transformierter Linien von Baumwollpflanzen, bei dem man:
• (a) Baumwollsamen keimen läßt,
• (b) von den keimenden Baumwollsamen embryonische Achsen isoliert,
• (c) die isolierten embryonischen Achsen auf einer Zieloberfläche plaziert,
• (d) Kopien einer fremden genetischen Konstruktion präpariert und die Kopien auf Trägerpartikeln beschichtet, die im Verhältnis zu der Größe der Zellen des Baumwollgewebes klein sind,
• (e) die Trägerpartikel, die die Kopien des fremden genetischen Materials tragen, an der Zieloberfläche, auf der die embryonischen Achsen plaziert sind, derart physikalisch beschleunigt, daß viele Trägerpartikel in das Innere der Zellen der embryonischen Achsen hineingeschossen werden,
• (f) die embryonischen Achsen wie in Stufe (e) auf einem im wesentlichen Hormon-freien Medium und unter Bedingungen kultiviert, so daß aus wenigstens einigen der behandelten embryonischen Achsen Triebe entstehen, ohne die Kalluskultur zu beschädigen, und man
• (g) diese Triebe, die die fremde genetische Konstruktion in ihrem Genom enthalten zu vollständigen, sexuell ausgereiften Baumwollpflanzen kultiviert, die in der Lage sind, das Fremdgen durch sexuelle Vererbung auf ihre Nachfolgepflanzen zu übertragen.
• Gemäß einer besonderen Ausführungsform ist ein Verfahren umfaßt, bei dem man:
• (a) Baumwollsamen keimen läßt,
• (b) von den keimenden Baumwollsamen embryonische Achsen isoliert,
• (c) alle embryonischen Blätter von den embryonischen Achsen entfernt, um die Meristeme der Achsen zu exponieren,
• (d) man die embryonischen Achsen zur Partikelbehandlung vorbehandelt durch Kultivieren der embryonischen Achsen im Dunkeln auf einem Medium mit einem Cytokinin, das aber im wesentlichen Auxin-frei ist,
• (e) man die isolierten embryonischen Achsen auf einer Zieloberfläche plaziert,
• (f) man Kopien einer fremden genetischen Konstruktion herstellt, die ein interessierendes Fremdgen und ein Markergen einschließt,
• (g) man die Kopien der fremden genetischen Konstruktion auf Trägerpartikeln beschichtet, die im Verhältnis zu der Größe der Zellen des Baumwollgewebes klein sind,
• (h) die Trägerpartikel, die die Kopien des fremden genetischen Materials an der Zieloberfläche, auf der die embryonischen Achsen plaziert sind, derart physikalisch beschleunigt, daß vielen Trägerpartikel in das Innere der Zellen der embryonischen Achsen hineingeschossen werden,
• (i) die embryonischen Achsen wie in Stufe (e) auf einem im wesentlichen Hormon-freien Medium und unter Bedingungen kultiviert, so daß aus wenigstens einigen der behandelten embryonischen Achsen Triebe entstehen, ohne die Kalluskultur zu beschädigen, und man
• (j) man die Triebe daraufhin screent, ob sie das Markergen exprimieren, und man
• (k) diese Triebe, die die fremde genetische Konstruktion in ihrem Genom enthalten, zu vollständigen, sexuell ausgereiften Baumwollpflanzen kultiviert, die in der Lage sind, das Fremdgen durch sexuelle Vererbung auf ihre Nachfolgepflanzen zu übertragen.
• Alternativ dazu ist ein Verfahren umfaßt, bei dem man
• (a) Baumwollsamen keimen läßt,
• (b) von den keimenden Baumwollsamen embryonische Achsen isoliert,
• (c) man die isolierten embryonischen Achsen auf einer Zieloberfläche plaziert,
• (d) man die Kopien der fremden genetischen Konstruktion auf Trägerpartikeln beschichtet, die im Verhältnis zu der Größe der Zellen des Baumwollgewebes klein sind,
• (e) man die Trägerpartikel, die die Kopien des fremden genetischen Materials tragen, an der Zieloberfläche derart physikalisch beschleunigt, daß viele der Trägerpartikel in das Innere der Zellen in den embryonischen Achsen hineintreten,
• (f) man die embryonischen Achsen auf einem Medium, das im wesentlichen Hormon-frei ist, derart kultiviert, daß Triebe mit Blättern aus den behandelten embryonischen Achsen hervortreten, ohne die Kalluskultur zu beschädigen,
• (g) man ein Blatt von der Pflanze abschneidet und einen Abschnitt des Blattes daraufhin untersucht, ob es das Markergen exprimiert,
• (h) die Triebe, bei denen die Untersuchung ergab, daß sie das Markergen in der Mittelrippe des Blattabschnitts exprimieren, zu einer sexuell ausgereiften Pflanze kultiviert,
• (i) man den Blütenstaub der Pflanzen daraufhin untersucht, ob er das Markergen exprimiert, um festzustellen, ob die Transformation ein Keimbahn-Ereignis beinhaltet, und man
• (j) von denjenigen Pflanzen, die ein Keimbahn-Ereignis beinhalten, die Nachkommen der Pflanzen wiedergewinnt, die die fremde genetische Konstruktion enthalten.
• Die Erfindung stellt ferner ein Verfahren zur Erzeugung von genetisch transformiertem Gewebe einer Pflanze zur Verfügung, bei dem man
• (a) embryonische Achsen aus Samen einer Pflanze herausschneidet,
• (b) die embryonischen Achsen auf einer Zieloberfläche plaziert,
• (c) Kopien einer fremden genetischen Konstruktion herstellt,
• (d) man Kopien der fremden genetischen Konstruktion auf Trägerpartikeln beschichtet, wobei die Trägerpartikeln eine Mischung aus Goldkügelchen einer Größe zwischen 1 und 3 um und mikrokristallinen Goldpartikeln ist,
• (e) man die Trägerpartikel, die die Kopien des fremden genetischen Materials tragen, an der Zieloberfläche, auf der die embryonischen Achsen plaziert sind, derart physikalisch beschleunigt, daß viele Trägerpartikel in das Innere der Zellen der embryonischen Achsen hineintreten, und man
• (f) aus den embryonischen Achsen Triebe erzeugt, von denen ein Teil mit der fremden genetischen Konstruktion transformiert ist.
• Weitere Aufgaben, Vorteile und Merkmale der vorliegenden Erfindung werden aus der nachfolgenden Beschreibung deutlich, wenn diese im Zusammenhang mit den begleitenden Zeichnungen genommen wird.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
• Fig. 1 zeigt eine schematische Explosionsdarstellung eines Partikelbeschleunigungsgerätes, das für das Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann.
• Fig. 2 ist eine planare Aufsichtsdarstellung des Geräts aus Fig. 1.
• Fig. 3 ist eine Darstellung des Plasmids pTVBT41100, das in den nachfolgenden Beispielen verwendet wurde.
• Fig. 4 ist eine Darstellung des Plasmits pCMC2114, das in den nachfolgenden Beispielen verwendet wurde.
Beschreibung der bevorzugten Ausführungsform
• Mit den Verfahren der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur gentechischen Veränderung von Baumwollpflanzen beschrieben, welches unmittelbar und wiederholbar zu transgenen Baumwollpflanzen und -linien führt, ohne daß eine Gewebekultur des Baumwollgewebes notwendig ist. Das Verfahren ist darauf ausgerichtet, die Anzahl der Keimbahnztransformationsereignisse zu maximieren, so daß das Transformationsverfahren in einem vernünftigen und praktischen Umfang durchgeführt werden kann, wobei immer noch eine große Anzahl an unabhängig voneinander transformierten Baumwollpflanzen und -linien entsteht. Im Gegensatz zu den vorbekannten Baumwoll-Transformationsverfahren wurde festgestellt, daß das vorliegende Protokoll in einer Vielzahl von Baumwollinien aus verschiedenen Arten von Baumwolle effektiv ist. Während andere Verfahren auf Pflanzen beruhen, die aus Gewebekultur erzeugt wurden, welche seltene oder unmoderne Linien benötigen, die besonders gut zur Gewebekultur geeignet sind, konnte gezeigt werden, daß das vorliegende Verfahren in den derzeitigen Elitebaumwoll-Linien effektiv ist.
• Diese Vorgehensweise basiert grundsätzlich auf einem Verfahren, bei dem man Trägerpartikel antreibt, die das Fremdgen in die Baumwoll-Embryonen tragen, welche von keimendem Baumwoll-Samen gewonnen wurden. Die Embryonen werden für das Partikelbeschleunigungsverfahren durch Behandlung mit einem Cytokinin, jedoch ohne Auxin, konditioniert. Die Embryonen werden einem Beschuß mit beschleunigten Partikeln ausgesetzt, welcher in größerem Umfang schädigend für das Gewebe ist, als der in bekannten Protokollen verwendete. Die resultierenden verwundeten Baumwoll-Embryonen können anschließend ausplattiert und in Kultur gezogen werden und erzeugen spontan Triebe, welche sich zu vollständigen, sexuell reifen Pflanzen entwickeln. Es hat den Anschein, als ob der Prozentsatz an transformierten Pflanzen, die so gewonnen wurden, sich vorteilhaft mit anderen Transformationsverfahren in anderen Pflanzen-Systemen vergleichen läßt.
• Das unten beschriebene Verfahren basiert auf der Verwendung von zerkleinerten Baumwoll-Embryonen, die von keimendem Samen gewonnen wurden. Im allgemeinen können Standard-Baumwoll-Samen einer Oberflächen-Sterilisierung unterzogen und anschließend unter Bedingungen für eine Keimung gehalten werden. Die keimenden Samen werden anschließend isoliert und von den soeben keimenden Samen, wird die Baumwoll-Samen-Achse entfernt und ausplattiert. Die Stufe der Keimung des Embryos kann von Bedeutung sein. Es wurde herausgefunden, daß die Verwendung von Samen, die bis zu dem Punkt gekeimt waren, bei dem 1 bis 4 mm der Radicula exponiert ist, sehr gute Ergebnisse hervorbrachte. Dabei wurde festgestellt, daß diese keimenden Achsen besonders zur Transformation und direkten Kultur zu Pflanzen geeignet sind, ohne einen Verlust der Gewebedifferenzierung und ohne die Notwendigkeit einer Kallus-Kultur des Baumwollgewebes. Die Embryonen werden anschließend zerkleinert, um das Meristem für den Beschuß zu exponieren. Dies wird unter dem Mikroskop durchgeführt und umfaßt die Entfernung des embryonalen Blattes oder der Blätter, welche das Meristem verhüllen. Diese Schritte werden durchgeführt, um das Meristem unmittelbar dem Partikel-Beschuß-Verfah ren auszusetzen.
• Die so erhaltenen Explantate werden für den Beschuß durch Kultur im Dunklen in einem Kulturmedium, welches Cytokinin aber kein Auxin enthält, vorbehandelt. Es wird davon ausgegangen, daß diese Vorbehandlung für die Transformationseffizienz hilfreich ist und die Anzahl der Keimbahn-Transformationsereignisse erhöht. Die Vorbehandlungskultur sollte von wenigen Stunden bis zu wenigen Tagen reichen und für Baumwolle ein Cytokinin aber kein Auxin enthalten. Die Kultur sollte im wesentlichen in Abwesenheit von Licht erfolgen, d. h. entweder im Dunkeln oder in gedämpftem Licht. Aus nicht vollständig bekannten Gründen scheint dieses Vorbehandlungsprotokoll das Ergebnis des Verfahrens zu verbessern.
• Grundsätzlich wurde in den aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren zur Einführung fremden genetischen Materials in Zellen im allgemeinen und in Pflanzen insbesondere wurde Wert auf eine Minimierung der Schäden für die Zelle gelegt. Man ist davon ausgegangen, daß das behandelte Gewebe so irreparabel geschädigt würde, daß es schwierig wäre, transformiertes Gewebe aus dem ursprünglich behandelten Gewebe zu gewinnen, wenn eine Vielzahl von Zellen zerstört oder getötet wurden. In den Partikel-Transformationsverfahren der Vergangenheit wurden daher Anstrengungen unternommen, um den Schaden für die Gewebe zu minimieren. Diese Vorgehensweise minimiert jedoch auch die Anzahl der transformierten Zellen, die erhalten werden, indem sichergestellt wird, daß nur eine kleine Teilmenge der behandelten Zellen tatsächlich mit den Trägerpartikel injiziert bekommen, welcher das fremde genetische Material trägt. Da die Frequenz, mit der die Zielzellen DNS von dem Trägerpartikel aufnehmen, gering ist, wenn man nur einem Prozentsatz der behandelten Zellen die Trägerpartikel injiziert, wird sogar nur ein geringerer Prozentsatz der Zellen tatsächlich transformiert. Das Problem besteht daher darin, die sehr seltenen Transformationsereignisse, die bei einem solchen Verfahren vorkommen, zu lokalisieren.
• Das vorliegende Verfahren ist im Gegensatz dazu darauf ausgerichtet, die Anzahl der Zellen, in die ein Trägerpartikel tatsächlich injiziert wird, zu maximieren. Dieses Vorgehen trägt das Risiko, daß eine Vielzahl der Zellen gegenteilige Auswirkungen durch das Verfahren erleiden. Tatsächlich werden viele, wenn nicht die meisten, der Zellen, die mit diesem Verfahren behandelt werden, tödlich verwundet. Es ist davon auszugehen, daß das Verfahren die Mehrzahl der Zellen in dem embryonalen Meristem tötet, wobei in den überlebenden Achsen eine Anzahl an lebenden Zellen verbleibt, die fast nicht in der Lage ist, das Wachstum eines neuen Triebs zu stützen. Trotzdem stellt das Verfahren sicher, daß eine ausreichende Anzahl an Zellen, die einen Trägerpartikel in sich tragen, das Verfahren überleben, so daß die Frequenz, mit der Transformationsereignisse erreicht werden, gesteigert wird, so daß das Gesamtverfahren praktisch anwendbar ist. Da die Aufgabe des Verfahrens darin besteht, eine vollständig transgene Pflanze zu gewinnen, die in der Lage ist, das aufgenommene Gen an ihre Nachkommen zu vererben, hat es keine Auswirkungen, wenn eine Vielzahl der behandelten Zellen sterben, solange wie eine ausreichende Anzahl von Zellen behandelt werden kann, die zu transgenen Pflanzen führt. Weil das eigentliche Verfahren des Abschießens der Trägerpartikel auf Pflanzengewebe relativ ökonomisch und einfach durchzuführen ist, wird es sehr praktisch, eine Vielzahl von Pflanzen-Geweben einem Transformationsverfahren mit beschleunigten Partikeln zu unterwerfen. Unter Verwendung des hierin beschriebenen Verfahrens können transgene Pflanzen aller Zuchtlinien der Baumwolle in ausreichend hoher Frequenz gewonnen werden, so daß das Gesamtverfahren sehr praktisch ist und transgene Pflanzen routinemäßig und regelmäßig in wesentlicher Anzahl gewonnen werden können.
• Von den Anmeldern wurde zusätzlich festgestellt, daß bei Baumwolle die geschädigten Baumwoll-Explantate in einem Lebenszustand verbleiben und diese Explantate wachsende, lebende Baumwoll-Triebe in brauchbarer Frequenz hervorbringen. Obwohl der Grund, aus dem sich die Triebe entwickeln, nicht vollständig aufgeklärt ist, kann ein Verfahren beteiligt sein, das eine Antwort auf die Wunden im Gewebe der Baumwolle nach dem zerstörenden Partikel-Beschuß hervorruft. Was auch immer der Grund für dieses Phänomen ist, Triebe entwickeln sich und können schnell zu ganzen, sexuell reifen Baumwollpflanzen gezogen werden. Während die Triebe auf ein Medium, das Cytokinin enthält, unmittelbar nach dem Beschuß ausplattiert werden, ist eine Hormon- Behandlung danach nicht notwendig, um die Entwicklung des Triebes zu begünstigen. Durch ein geeignetes, frühes Screening der Baumwoll-Triebe, die aus den Explantaten hervorgehen, die einem Beschuß ausgesetzt wurden, kann die Anzahl an Pflanzen, die bis zur Reife kultiviert werden müssen, auf solche begrenzt werden, die wahrscheinlich Keimbahn-Transformationsereignisse hervorbringen werden.
• Dieses Verfahren basiert auf der Transformation von Pflanzenzellen mittels Partikel im allgemeinen und der Zellen von Baumwolle insbesondere. Das Konzept besteht darin, daß genetisches Material, entweder DNS oder RNS, auf kleine Trägerpartikel geschichtet wird. Die Trägerpartikel werden anschließend physikalisch manipuliert, so daß sie auf die Zellen des Baumwoll-Gewebes geschleudert werden. Die Trägerpartikel werden mit einiger Frequenz innerhalb des Cytosols der Baumwollpflanzenzellen landen. Durch ein nicht vollständig verstandenes Verfahren verläßt das genetische Material mit einiger Frequenz die Trägerpartikel und wird in die DNS der Wirts-Baumwollzellen integriert. Aus diesen Zellen müssen Pflanzen entweder durch Regeneration oder durch normale Kultur der Pflanzenzellen gewonnen werden. Bei diesem Weg, entweder bei der zellulären oder bei der Pflanzen- Stufe, muß eine Kombination von Screening und Selektion angewendet werden, um die transformierten von den nicht-transformierten Pflanzen zu trennen. In den meisten Pflanzen-Transformationsereignissen, die durch Partikel hervorgerufen wurden, wird die Mehrzahl der gewonnenen Pflanzen kein Transformationsereignis aufweisen. Daher ist es notwendig, ein Verfahren zur Verfügung zu stellen, mittels dessen ausreichende Anzahlen von Pflanzen regelmäßig erzeugt werden kann, so daß die relativ seltenen transgenen Ereignisse schnell und einfach isoliert werden können. Es ist ein wünschenswerter Aspekt eines solchen Verfahrens, daß der Prozentsatz der so gewonnen transgenen Pflanzen der höchste ist, da die Gesamteffizienz des Verfahrens deutlich gesteigert wird, wenn weniger Gewebe-Fläche zu Beginn produziert werden muß, um die gewünschte Anzahl an unabhängigen Transformationsereignissen als Ergebnis des Verfahrens zu erzeugen.
• Es gibt mehrere Faktoren, die bei der Erzeugung eines Keimbahn- Transformationsereignisses berücksichtigt werden müssen. Das genetische Konstrukt, sei es DNS oder RNS, muß so konstruiert werden, daß eine vernünftige Expression in Pflanzengewebe möglich ist. Die in dem Verfahren verwendete Vorrichtung muß von einem Typ sein, der in der Lage ist, die Träger-Partikel mit dem darauf beschichteten genetischen Material in Pflanzenzellen so zu übermitteln, daß eine geeignete Anzahl an Zellen transformiert werden kann. Es gibt viele Ausführungsformen von mechanischen Systemen, von denen erwartet wird, daß sie biologisch inerte, kleine Träger-Partikel in Pflanzenzellen beschleunigen. Geeignete Mechanismen umfassen ballistische, explosive Beschleunigung der Partikel, zentrifugale Beschleunigung der Partikel, elektrostatische Beschleunigung der Partikel oder andere, analoge Systeme, die in der Lage sind, einen ausreichenden Impuls und ausreichende Geschwindigkeit auf kleine, inerte Partikel zu übertragen. Ein Mechanismus, der im erfindungsgemäßen Verfahren verwendet wurde, basiert auf der Beschleunigung der Partikel durch ein Funken-Entladungsgerät mit einstellbarer elektrischer Spannung, das dazu geeignet ist, ein gerades Trägerblatt auf eine Zieloberfläche zu beschleunigen. Da dieses Gerät für die vorliegende Erfindung besonders geeignet ist, wird es im folgenden mit Verweis auf die beigefügten Zeichnungen Fig. 1 und 2 näher beschrieben. Das Partikelbeschleunigungsgerät im allgemeinen wird mit 10 in Fig. 1 bezeichnet. Das Gerät besteht aus einer Funken-Entladungskammer 12, in die zwei Elektroden 14 eingefügt sind, die durch eine Entfernung von etwa 1 bis 2 mm im Abstand voneinander gehalten werden. Die Funken-Entladungskammer 12 besteht aus einem horizontal verlängerten Rechteck mit zwei Öffnungen, 16 und 18, wobei das nach oben stehende Ende verlängert ist. Die Öffnung 16 wird durch eine Zugangsplatte 20 bedeckt. Die Öffnung 18, die auf der im Hinblick auf die Elektrode 14 entgegengesetzten Seite des Rechtecks der Funken-Entladungskammer positioniert ist, ist letzten Endes dazu vorgesehen, durch ein Trägerblatt 22 bedeckt zu werden. Die Elektroden 14 werden mit einer geeigneten, einstellbaren Quelle für elektrischen Spannungsentladung (nicht gezeigt) verbunden. Eine geeignete Quelle für eine elektrische Spannungsentladung umfaßt einen Kondensator in der Größenordnung von 1 bis 2 Mikrofarrad und die Menge der Spannung der Ladung, die in den Kondensator eingeführt wird, sollte einstellbar sein. Eine derartige einstellbare Spannung kann jederzeit in einem derartigen Kondensator durch die Verwendung eines Autotransformators eingefügt werden, welcher zwischen einem Bereich von vielleicht 1 und 50 000 Volt einstellbar sein kann. Es ist bevorzugt, daß eine geeignete elektrische Hochspannungs-Schaltung zur Verfügung gestellt wird, so daß der Kondensator durch die Elektroden 14 sicher entladen werden kann, ohne den menschlichen Nutzer des Systems zu schädigen.
• Ein Trägerblatt 22 ist dazu vorgesehen, auf die Öffnung 18 der Funken-Entladungskammer 12 plaziert zu werden. Das Trägerblatt 22 besteht aus einem geraden Blatt aus relativ steifem Material, das in der Lage ist, kleine, inerte Träger-Partikel auf die Zieloberfläche zu tragen. Es wurde festgestellt, daß das Trägerblatt 22 vorzugsweise ein kleines Blatt eines aluminisierten, mit Saran beschichten Mylar ist. Saran-beschichtetes Mylar ist besonders leicht und weist eine hohe Zugfestigkeit auf. Es ist ferner vorgesehen, daß andere leichte, jedoch relativ stark planare Materialien, die etwas Flexibilität aufweisen, ebenfalls als Trägerblatt 22 verwendet werden können. Die Funktion des Trägerblattes 22 besteht darin, eine nach außen gerichtete offene Kraft, die durch die Elektroden erzeugt wird, in eine breit verstreute vertikale Kraft umzuwandeln, welche in der Lage ist, eine große Anzahl an Trägerpartikeln parallel und mit gleicher Kraft zu beschleunigen. Es wird sofort deutlich, daß andere Arten von Kraft als ein elektrisches Feld verwendet werden können, um das Trägerblatt 22 nach oben zu treiben. Die am meisten bevorzugte Voraussetzung besteht darin, daß die Kraft eine einstellbare ist, so daß die Kraft der Bewegung des Trägerblattes 22 zum Zeitpunkt des Aufpralls unmittelbar eingestellt werden kann.
• Wiederum unter Bezugnahme auf die Vorrichtung der Fig. 1 und 2, oberhalb der Öffnung 18 und der Entladungskammer 12, in einer Position von etwa 15 mm oberhalb, befindet sich ein Rückhalteschirm 24. Oberhalb des Rückhalteschirms 24 in einer Entfernung irgendwo zwischen 5 und 25 mm wird die Zieloberfläche 26 plaziert. Die Zieloberfläche 26 kann eine beliebige, geeignete Kulturoberfläche sein, auf die das zu transformierende Material einfach plaziert werden kann. Es wurde festgestellt, daß umgedrehte Petrischale am einfachsten für die Transformation von Pflanzengewebe verwendet werden konnten. Unter Verwendung eines halbfesten oder festen auf Agar basierenden Mediums in dem Boden der Petrischale ist es möglich, Gewebe auf den Agar zu plazieren, wo diese einfach zurückgehalten werden. Anschließend wird die Petrischale über die Vorrichtung der Fig. 1 und 2 plaziert, wobei die Petrischale selbst als Zieloberfläche dienen kann, während das Pflanzengewebe auf dem darin befindlichen Agar verbleibt.
• Kopien von geeignetem genetischen Material, DNS oder RNS, werden getrennt voneinander erzeugt. Diese Materialien können durch im Stand der Technik für die Veränderung von DNS bekannte Verfahren erzeugt werden, die dem Durchschnittsfachmann gut bekannt sind, und viele Kopien der genetischen Konstrukte können einfach hergestellt werden. Die genetischen Konstrukte müssen anschließend auf kleine Trägerpartikel aus einem beständigen, dichten, biologisch-inertem Material geschichtet werden. Gold ist ein ziemlich übliches und vorteilhaftes Material zur Verwendung als Trägerpartikel. Die Trägerpartikel müssen von extrem kleiner Größe sein, typischerweise im Bereich von 1 bis 3 Micron, so daß sie im Verhältnis zu der Größe der Zielzellen des Transformationsverfahrens sehr klein sind. Es wird insbesondere bevorzugt, daß mikrokristalline Goldpartikel als Trägerpartikel zur Durchführung der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Eine geeignete Quelle für mikrokristalline Goldpartikel ist ein Produkt, welches von der Engelhart Corporation in East Brunswick, New Jersey, als "gold powder A1570" bezeichnet wird. Dieses Produkt besteht aus amorphen Goldpartikeln mit einer großen Oberfläche und amorpher Form und Größe. Es wurde insbesondere festgestellt, daß mikrokristalline Trägerpartikel mit unregelmäßiger Größe grundsätzlich eine Transformationseffizienz erreichen, die höher ist als die, welche mit sphärischen Goldpartikeln erzielt wird, wobei die Gründe dafür weitgehend unverstanden sind. In wenigstens einem Satz der Experimente wurde eine Mischung von mikrokristallinem Goldpulver und Goldkugeln in einer Größe von 1 bis 3 Micron ebenfalls mit sehr gutem Erfolg verwendet.
• Das genetische Material, das in die Zellen inseriert werden soll, wird anschließend auf die Trägerpartikel geschichtet. Dies kann einfacherweise durchgeführt werden, indem Lösungen mit DNS oder RNS auf die Trägerpartikel selbst präzipitiert werden. Geeignete Stabilisatoren, wie beispielsweise die in den folgenden Beispielen offenbarte, auf Spermidin basierende Zusammensetzung, können zu der Mischung zugegeben werden, um die Lebensdauer des genetischen Materials auf den Trägerpartikeln zu verlängern. Die Trägerpartikel mit dem genetischen Konstrukt darauf werden anschließend auf die Oberfläche des Trägerblattes 22 geschichtet. Die Beschichtung wird so durchgeführt, daß ein relativ gleichmäßiges Muster an Trägerpartikeln über die gesamte Oberfläche des Trägerblattes 22 erreicht wird. In dem vorliegenden Verfahren haben die Anmelder die Trägerpartikel auf das Trägerblatt mit einer Beschichtungsrate im Bereich von 0,0125 bis 0,050 mg an beschichteten Trägerpartikel pro Quadratzentime ter der Trägerplatte beschichtet. Die Trägerplatte 22 wird anschließend auf die richtige Öffnung auf der Oberfläche der Entladungskammer 12 plaziert, wobei es sich um die Öffnung 18 handelt. Die Zieloberfläche 26, welche das lebende Pflanzenmaterial darauf umfaßt, wird dann in eine Position oberhalb des Rückhalteschirms 24 gebracht. Ein kleiner Tropfen Wasser, vorzugsweise in einer Größe von etwa 10 Microliter, wird dann in der Kammer, die die Enden zwischen den beiden Elektroden 14 verbindet, plaziert. Die Zugangsabdeckung 20 wird in eine Position oberhalb der Funken-Entladungskammer 12 gebracht.
• Zu diesem Zeitpunkt wird das gesamte Gerät von einer Vakuumkammer umschlossen und ein Vakuum im Bereich von etwa 500 mm Quecksilber wird angelegt. Während das Vakum angelegt wird, wird eine Quelle von Helium in die Vakuumkammer eingelassen, die somit die verbleibende Atmosphäre innerhalb der Kammer durch Helium ersetzt. Demnach enthält die Vakuumkammer in sich ein relatives Vakuum im Vergleich zur Atmosphäre und die Luft innerhalb des Vakuums ist unproportional durch Helium ersetzt. Die geringere Dichte des Heliums kombiniert mit dem geringeren Gewicht unterstützt die Verringerung des Strömungswiderstandes auf sowohl das Trägerblatt 22 und auf die Trägerpartikel selbst.
• Zu diesem Zeitpunkt kann das Transformationsverfahren mittels beschleunigter Partikel initiiert werden. Dies wird durch elektrische Entladung der Spannung von den Kondensatoren zu den Elektroden 14 erreicht. Die Spannungen, die in dem vorliegenden Verfahren verwendet werden, liegen üblicherweise in dem Bereich von 10 bis 25 kV und der Bereich von 16 bis 22 kV wird derzeit bevorzugt. Die Spannungsentladung wird vorzugsweise durch die Verwendung einer geeigneten elektrischen Schaltung, wie oben beschrieben, herbeigeführt. Die Kraft der elektrischen Entladung löst einen Funken aus, der den Abstand zwischen den Elektroden 14 überspringt, wodurch der kleine Tropfen Wasser, der zuvor zwischen diese plaziert wurde, unmittelbar verdampft. Die Kraft der Verdampfung dieses Wassers erzeugt eine heftige atmosphäri sche Schockwelle in der Luft, die sich innerhalb der Funken- Entladungskammer 12 befindet. Die Schockwelle strahlt von den Elektroden in alle Richtungen nach außen. Die strahlende Schockwelle erfaßt das Trägerblatt 22, welches mit großer Geschwindigkeit nach oben beschleunigt wird. Das sich nach oben bewegende Trägerblatt 22 beschleunigt mit großer Kraft nach oben, bis es den Rückhalteschirm 24 kontaktiert. Zu diesem Zeitpunkt unterstützt die Verdrängung der in der Kammer verbleibenden Atmosphäre mit Helium die Bewegung des Trägerblattes 22, da Helium einen geringeren Strömungswiderstand auf den Flug des Trägerblattes sowie auf die Trägerpartikel selbst ausübt. An dem Rückhalteschirm 24 trifft das Trägerblatt 22 den Rückhalteschirm 24 und wird darauf vollständig zurückgehalten. Die Trägerpartikel, die zuvor mit genetischem Material beschichtet wurden, fliegen im Gegensatz dazu von dem Trägerblatt und bewegen sich frei vorwärts in Richtung des Zielgewebes. Die kleinen Trägerpartikel treffen dann auf dem lebenden Gewebe der Zieloberfläche ein und schreiten in die Zellen des darauf befindlichen Gewebes fort.
• Durch eine Darstellung der Vorrichtung des vorliegenden Verfahrens wird sofort deutlich, daß der tatsächliche Impuls und die Geschwindigkeit der Trägerpartikel, wenn sie die Oberfläche des Zielgewebes treffen, einstellbar ist, indem die Spannung der ursprünglichen elektrischen Entladung, welche den Elektroden 14 appliziert wird, einstellbar ist. Durch Veränderung der Menge der elektrischen Entladung, die über die Elektroden 14 appliziert wird, kann daher die Geschwindigkeit, mittels derer die Partikel auf dem Ziel eintreffen, eingestellt werden, und somit kann auch die Tiefe der Penetration der Trägerpartikel in das Gewebe des Zielgewebes kontinuierlich über den Bereich der Einstellbarkeit, welcher durch die elektrische Spannung bereitgestellt wird, die über die Elektroden 14 appliziert wird, eingestellt werden. Der tatsächlich kritische physikalische Schritt ist die Beschleunigung des Trägerblattes 22 in Richtung der Zieloberfläche. Durch Lagerung der Trägerpartikel auf dem Trägerblatt 22 und die Beschleunigung des Trägerblattes 22 in Rich tung des Ziels wird sicher gestellt, daß eine breite horizontale Schicht an Trägerpartikeln sich in Richtung des Zielgewebes bewegt. Auf diese Art kann eine relativ große Anzahl an Transformationsereignissen zu gleicher Zeit erzielt werden, da eine relativ breite horizontale Schicht eines Gebiets auf der Zieloberfläche 26 von einer Reihe der Trägerpartikel getroffen wird, die sich mit ähnlicher Geschwindigkeit bewegen. Weitere mechanische Mittel könnten verwendet werden, andere als Funken-Entladung, um eine Kraft auf das Trägerblatt 22 zur Verfügung zu stellen, soweit diese in geeigneter Weise einstellbar wären.
• Um für das Partikel-Transformationsverfahren geeignet zu sein, muß das transformierende exogene genetische Konstrukt in der Lage sein, eine nützliche Funktion in den Zellen des pflanzlichen Zielgewebes auszuüben. Das transformierende genetische Konstrukt, sei es DNS oder RNS, wird normalerweise ein chimäres Konstrukt in dem Sinne sein, daß sein genetisches Material von mehr als einer Art von Organismus entstammt. Das genetische Konstrukt würde ein solches sein, das in der Lage ist, in dem Zielgewebe ein nützliches Genprodukt zu exprimieren. Solche Genprodukte bestehen typischerweise aus einem Fremdprotein, von dem eine Expression in den Zellen des Pflanzengewebes gewünscht wird, könnten jedoch auch andere Genprodukte, wie beispielsweise ein Antisense-RNS-Konstrukt sein, das ein endogenes Pflanzensystem inhibieren soll. Typische fremde genetische Konstrukte sollen die Expression von Protein in Pflanzenzellen bewirken und werden häufig in geeigneter Weise in Vektoren eingefügt, die als Expressionskassetten für Pflanzenzellen verwendet werden, von denen dem Fachmann viele bekannt sind. Typischerweise umfaßt ein solches pflanzliches Expressionsvektorsystem neben der kodierenden Sequenz für das gewünschte, exogene oder fremde Gen, geeignete flankierende regulatorische Sequenzen, die für die Expression des Fremdgens in der Pflanzenzelle geeignet sind. Die geeigneten flankierenden regulatorischen Sequenzen würden eine Promotor-Sequenz umfassen, die in der Lage ist, die Transkription zu initiieren und einen Translations-Terminator, um die Translation eines RNS-Messengers zu beenden, wenn eine Proteinsynthese gewünscht wird. Ferner konnte bereits gezeigt werden, daß typische Promotoren und Transkriptionsterminatoren, die in anderen Pflanzengeweben aktiv sind, auch in Baumwolle aktiv sind. Es mag zudem wünschenswert sein, zwischen den Promotor und den kodierenden Bereich der genetischen Sequenz ein Translations- oder Transkriptions-Enhancer aufzunehmen, um die Effizienz des eingefügten genetischen Materials in den transgenen Pflanzen zu verstärken.
• Es ist bevorzugt, daß das transformierende genetische Konstrukt ein Marker-Gen enthält, welches in der Lage ist, eine Selektion oder ein Screening des behandelten Pflanzengewebes durchzuführen. Selektierbare Marker werden für pflanzliche Transformationsereignisse grundsätzlich bevorzugt, sind jedoch nicht für alle Pflanzenarten verfügbar. Ein selektierbarer Marker ist ein solcher, der in den transformierten Pflanzenzellen ein Merkmal konditioniert, das durch Umsetzen des Pflanzengewebes mit einem Selektionsmittel ausgewählt werden kann. Geeignete selektierbare Marker wären Antibiotika-Resistenzgene oder Herbizid-Resistenzgene, welche, wenn sie in einige Zellen der Pflanzen in Kultur aufgenommen würden, diese besonderen Zellen mit der Fähigkeit ausstatten, ein Einwirkenlassen des Antibiotikums oder des Herbizids auszuhalten, welches alle nicht-transformierten Zellen in der Kultur töten würde. Eine weitere Form des Markergens ist eine solche, die in einfacher Weise durch histochemische oder biochemische Nachweisverfahren gesichtet werden kann, obwohl auf das Gen selbst nicht selektiert werden kann. In diesem Fall ist es am meisten bevorzugt, daß das Gen für ein phänotypisches Merkmal kodiert, welches in einfacher Weise in transgenen Pflanzen beobachtet werden kann. Ein geeignetes Markergen, von dem festgestellt wurde, daß es für derartige Pflanzen-Transformationsversuche geeignet ist, ist das Gus-Gen, das von Jefferson et al., EMBO J., 6: 3901-3907 (1987) beschrieben wurde. Das Gus- Gen kodiert für das Enzym β-Glucuronidase, welches in Pflanzenzellen exprimiert werden kann, und die Expression des Gus-Gens kann bei Pflanzengewebe in einem Gewebe-zerstörenden Nachweisverfahren auf seine Gegenwart hin überprüft werden. Das Gus-Gen wird ein geeignetes Substrat, Indigoglucuronid oder 5-Bromo-4- chloro-3-indulylglucuronid in einem in situ Nachweisverfahren in Pflanzengewebe in eine blaue Farbe umwandeln. Die Verwendung des Gus-Gens stellt daher ein geeignetes kolorimetrisches Nachweisverfahren für die Expression der in Pflanzengewebe eingefügten DNS durch phenotypische Analyse des Pflanzengewebes zur Verfügung. In einem typischen Transformationsverfahren würde das gewünschte Gen, das in der Pflanze exprimiert werden soll, in einem einzigen genetischen Konstrukt auf einem einzigen DNS- Strang hintereinander mit dem Gus-Gen gekoppelt. Anschließend würde das hintereinander verknüpfte genetische Konstrukt in Pflanzengewebe transformiert und die resultierenden Pflanzengewebe würden auf die Expression des Gus-Enzyms in dem Pflanzenzielgewebe analysiert, um transgenes Gewebe in dem behandelten Gewebe zu identifizieren.
• Im Fall der nachfolgend beschriebenen Beispiele wurde kein selektierbarer Marker verwendet. Anstelle davon wurde der Gus- Gen-Marker als Screening-Marker verwendet. Da die Anmelder transgene Triebe in relativ hoher Frequenz (etwa 1%) erzeugen, wird eine Selektion für eine effiziente und ökonomische Durchführung des Verfahrens nicht benötigt. Die Verwendung eines selektierbaren Markers würde zur Effizienz des Systems beitragen, wenn einer zur Verfügung stünde.
• Im vorliegenden Verfahren, das in Baumwolle durchgeführt wurde, entstehen aus den behandelten embryonalen Achsen, welche das Beschuß-Protokoll überleben, einzelne Triebe. In einem Transformationsverfahren für Sojabohnen, das von einem dieser Erfinder und von anderen durchgeführt wird, wurde festgestellt, daß mehrere Triebe aus embryonalen Achsen hervorgehen, die dem Beschuß-Protokoll unterworfen wurden, und es konnte gezeigt werden, daß einige der Triebe klonale Transformanden sind, was darauf hindeutet, daß die Triebe aus einer einzigen Zelle ent standen sind. Bei Baumwolle scheint das Phänomen, das für die Erzielung von Keimbahn-Transformationserfolgen verantwortlich ist, ein anderes zu sein. Ein einzelner Trieb entstand aus jeder behandelten embryonalen Achse der Baumwolle, und der Trieb ist typischischerweise chimär oder lediglich teilweise transformiert. Der transformierte Teil der Baumwollpflanze kann jedoch durch Analyse der Blätter der wachsenden Pflanze auf die Aktivität des Marker-Gens (Gus) und durch selektives Beschneiden der wachsenden Pflanze, um das Wachstum des exprimierenden Teils der Pflanze zu bevorzugen, angereichert werden. Bei Baumwolle konnte gezeigt werden, daß dieses Verfahren erfolgreich zur Erzeugung von Pflanzen mit einem ausreichend transformierten Charakter führt, so daß Keimbahn-Transformationen ermöglicht werden. Der Keimbahn-Charakter der transformierten RO-Pflanze (erste transgene Pflanze) kann durch Screening der Pollen, die diese verbreitet, auf Gus hin bestimmt werden. Das Gus-Screening funktioniert nicht nur effektiv mit Baumwollpollen, sondern das Aufspaltungsmuster des transgenen Gens kann durch die relative Anzahl der exprimierenden und nicht-exprimierenden Pollenkörner bestimmt werden. Bei einer einzigen Insertion des Fremdgens wird die Mendel'sche Vererbungslehre voraussagen, daß 50% der Pollenkörner die transgene Gen-Insertion tragen. Die Bestätigung der Keimbar-Natur der Transformation wird durch Expression des Gens in den Nachkommen-Pflanzen (R1) gestützt, welche das inserierte Gen an ihre Nachkommen über die normalen Muster der genetischen Vererbung weitergeben.
• In den folgenden Beispielen werden zwei verschiedene Plasmidvektoren verwendet. Ein Vektor wird als pTVBT41100 bezeichnet und in Fig. 3 dargestellt. Der Vektor enthält ein Gen, das für NPT-II kodiert, welche Resistenz gegen Kanamycin verleiht, eine Expressionskassette für das Gus-Gen, 2 Antibiotika-Resistenz- Marker, die für bakterielle Wirtszellen geeignet sind (Ampicillinresistenz, Ampr, und Sulfadiazen, Sur) und eine Expressionskassette für das Insekten-spezifische Toxin von Bacillus thuringiensis (B.t.). Die B.t.-Expressionskassette umfaßt eine 5'nicht-translatierte Leadersequenz des Alfalfa-Mosaikvirus (AMV), den 35S Promotor des Blumenkohl-Mosaikvirus ("cauliflower mosaic virus", CaMV35S) und eine synthetische kodierende Sequenz, die von der bevorzugten Codon-Nutzung von Pflanzen abgeleitet wurden, welche für die Amino-terminalen 55% des Lepidopteran-spezifischen B.t.-Toxins von dem B.t.-Stamm Kurstaki kodiert. Das Plasmid pCMC2114, dargestellt in Fig. 4, enthält zwei gegensätzlich orientierte Genkonstrukte, von denen eines ein Gus-Genkonstrukt mit einem CaMV35S-Promotor, einem AMV 5'-Leader- und dem Nopalinsyntase-Ppolyadenylierungsbereich ist und das andere ein Bar-Gen von Streptomycis hygroscopius mit dem CaMV35S-Promotor, einem AMV 5'-Leader- und dem Sojabohnen-SSU- Terminator-Bereich ist. Das Bar-Gen kodiert für das Enzym Phosphinotrycin-Acetyltransferase, welches Resistenz gegen Herbizide mit Glutaminsyntase-Inhibitor verleiht. Das Plasmid pCMC2114 ist erhältlich von ATCC, Zugriffsnummer 67.936. Das Gus-Gen kann in einfacher Weise aus Kopien von pCMC2114 durch Verdau von Kopien des Plasmides mit Hind III und Sal I isoliert werden, wobei die Gus-Genkassette zwischen den Stellen für diese beiden Restriktionsenzyme lokalisiert ist. Es sollte jedoch klar sein, daß keines der Plasmide für die Ausführung der vorliegenden Erfindung notwendig ist, sondern diese nur Beispiele darstellen. Obwohl das Gus-Gen ein einfacher und nützlicher Marker für das Screening ist, sind andere Screening-Verfahren, darunter molekulare Screening-Verfahren, wie beispielsweise die Polymerasekettenreaktion (PCR) für das gewünschte, inserierte Gen ebenfalls möglich.
Beispiel 1 Oberflächen-Sterilisierung
• Das Verfahren geht von kommerziell erhältlichem Baumwollsamen aus. Samen der Pima Baumwolle (Sorte S6) wurden verwendet. Das Verfahren beginnt mit einem Sieb-Becher-System, das autoklaviert werden kann. Dabei handelt es sich um einen Becher, in dessen Boden dutzende von Löcher gebohrt wurden, welcher in einen nicht-durchbohrten Glasbecher eingesetzt werden kann. Es ist ferner nützlich, einen dritten sterilen Becher zum Spülen der Samen zu verwenden, so daß der Sieb-Becher in dem sterilen Becher verbleiben kann, während das Waschwasser verworfen wird.
• Der Sieb-Becher wurde mit Baumwollsamen gefüllt. Der Becher, in dem der Sieb-Becher eingesetzt wurde, wurde anschließend mit 95% Ethanol gefüllt, bis die Samen bedeckt waren. Die Samen wurden anschließend trockengelegt. Nachfolgend wurden die Samen dreimal mit destilliertem Wasser gespült, wonach sie erneut trockengelegt wurden. Alternativ dazu, wurden einige der Samen ohne Vorbehandlung mit Bleichmittel bedeckt. Zu diesem Zeitpunkt wurden die Samen einer Mischung aus 50% Chlorox-Bleichmittel ausgesetzt, so daß die Samen bedeckt wurden, und die Samen wurden in der Bleichmittellösung für drei Minuten belassen. Das Bleichmittel wurde anschließend abgetropft und die Samen wurden fünfmal mit destilliertem Wasser gespült.
• Die Baumwollsamen mit sterilisierter Oberfläche wurden anschließend in einen sterilen Glasbecher plaziert, zu dem ein Baumwoll- Antibiotika-Sterilisationsmedium gegeben wurde, bestehend aus sterilem, destilliertem Wasser, wozu Carbenicillin in einer Konzentration von 200 mg pro Liter, Cifotaxime in einer Konzentration von 125 mg pro Liter und je 30 mg von Bravo WP, Benlate 50 DF und Captan 50 WP pro Liter zugegeben wurde. Im Verhältnis zum Volumen der Samen wurde doppelt soviel des Baumwoll-Antibiotika- Sterilisationsmedium zugegeben. Die Samen wurden in dem Sterilisationsmedium für 3-4 Stunden im Dunkeln bei Raumtemperatur inkubiert. Das Verfahren wurde um 8 : 00 Uhr vormittags angefangen; die Samen wurden bis etwa zum Mittag inkubiert.
• Anschließend wurden die Samen mit einer Pipette trockengelegt, mit sterilem, destilliertem Wasser gespült und der Becher mit frischem Baumwoll-Antibiotika-Sterilisationsmedium gefüllt, woran sich weitere drei Stunden Inkubation anschlossen.
• Die Samen wurden daraufhin trockengelegt und die Samen wurden auf die Oberfläche eines 0,8% Wasser-Agar plus ccb ausplattiert, eine Mischung aus Antibiotika und Fungiziden, Carbenicillin (200 mg/l), Cefotaxime (50 mg/l) und Benomyl (60 mg/l). Alle nicht keimenden Samen und die Reste der Samenschalen wurden entfernt. Die Samen waren ziemlich gedrängt auf der Agarplatte, verblieben jedoch in einer einzigen Schicht. Die Samen wurden daraufhin über Nacht bei 15ºC im Dunkeln inkubiert, um zu keimen. Wenn die Keimung wie gewünscht erfolgte, konnte die Samenkeimung durch Kühlung bei 4ºC für bis zu drei Tage nach dem Keimungsverfahren unterbunden werden. Alternativ dazu, wurden die immer noch mit dem Baumwoll-Antibiotika-Sterilisationsmedium bedeckten Samen bei 28ºC über Nacht inkubiert, anschließend trockengelegt und insgesamt in einen 15ºC Inkubator zur unmittelbaren Verwendung überführt.
Samenzerkleinerung
• Nach der Keimung der Samen oder der Entnahme der gekeimten Samen aus der Lagerung wurden Samen ausgewählt, die gerade mit der Keimung begonnen hatten. Zu weit gekeimte und nicht-gekeimte Samen wurden verworfen. Das geeignete Stadium der Keimung wurde definiert als voll aufgesogener Samen, bei dem 1-4 mm der Radicula exponiert wird. Unter sterilen Bedingungen wurde die Samenachse aus dem Samen entfernt. Dies wurde durch manuelle Eingriffe mit behandschuten Händen durchgeführt, um die Samenachse sowohl von den Kotelydonen als auch den Samenschalen zu entfernen. Mit Übung konnte das Verfahren relativ einfach durchgeführt werden. Die Fähigkeit, die Samenschalenachse von dem Samen abspringen zu lassen, ohne die Samenachse zu schädigen oder eine der Kotelydonen auf der Samenachse zu belassen, kann leicht entwickelt werden.
• Die freigelegte Samenachse wurde anschließend in 3-4 Spülungen mit sterilem destilliertem Wasser gewaschen. Das gewaschene aber nicht zerkleinerte explantierte Gewebe wurde entweder unmittel bar zerkleinert oder durch Plattieren auf Standard ORccb Medium gelagert, welches mit frischem Benzylaminopurin oder BRP, jedoch ohne NAA, hergestellt wurde. Dieses Medium entspricht dem von Barwhale et al., Planta, 167, S. 473-481 (1986), beschriebenen, jedoch ohne das NAA-Hormon. Das explantierte Gewebe wurde auf die Agaroberfläche ausplattiert, indem es auf die Seite gelegt wurde. Die freigelegten embryonalen Samenachsen, die auf das Agarmedium plattiert wurden, wurden bei 4ºC im Dunkeln für bis zu drei Tage inkubiert.
Freilegen des Meristems
• Die gewaschenen, explantierten Samenachsen waren jetzt bereit für die Mikro-Zerkleinerung, um die Meristeme der Samenachsen freizulegen. Diese Zerkleinerung wurde unter sterilem, destilliertem Wasser und mit sterilen Geräten durchgeführt. Die Zerkleinerung besteht aus der Entfernung des embryonalen Blattes oder der Blätter, wenn mehr als eins vorhanden war, die das Meristem auf jeder der freigelegten Samenachsen verhühlt. Das vollständig zerlegte explantierte Gewebe wurde in eine weitere Petrischale überführt, die steriles, destilliertes Wasser enthielt.
Hormon-Behandlung vor dem Beschuß
• Nachdem alle Zerkleinerungsschritte abgeschlossen waren, wurde das Explantat nochmals für 3-5 Spülungen mit sterilem, destilliertem Wasser gewaschen. Nach der letzten Spülung wurde das überschüssige Wasser mit einer Pipette entfernt. Die behandelten Explantate wurden danach wieder seitlich auf die Oberfläche des Standard OR ccb Mediums gelegt, welches wiederum mit frischem BRP jedoch ohne NAA hergestellt wurde. Die Explantate wurden über Nacht, maximal 24 Stunden, bei 15ºC im Dunkeln inkubiert. Die behandelten, ausgeschnittenen embryonalen Achsen mit exponierten Meristemen sind jetzt fertig für den Transformationsbeschuß mit beschleunigten Partikel.
Genetisches Material und Herstellung der Trägerpartikel
• 10 mg eines amorphen, kristallinen Goldpulvers oder einer gleichen Mischung aus 1-3 Mikron Goldkügelchen und kristallinen Goldpulver wurden in den Boden eines 1,5 Milliliter Eppendorf- Mikrozentrifugenröhrchens abgewogen. Dies wurde vorsichtig durchgeführt, um sicherzustellen, daß das Gold nicht auf die Seiten des Röhrchens spritzt, weil dadurch das Resuspendieren des Goldes aufgrund des kleinen Volumens, das in dem Herstellungsverfahren verwendet wird, schwierig geworden wäre. Zu diesem Mikrozentrifugenröhrchen wurden 100 Mikroliter an 0,1M Spermidim (freie Base) gegeben und das Mikrozentrifugenröhrchen wurde gut geschüttelt. Zu dem Mikrozentrifugenröhrchen wurden 1 -10,0 Mikrogramm an doppelsträngiger DNS des fremden, genetischen Materials gegeben und das Röhrchen wurde anschließend vorsichtig aber vollständig geschüttelt. Die verwendete DNA bestand aus pAMVBT41100. Während die DNS/Trägerpartikelmischung vorsichtig geschüttelt wurde, wurden 100 Mikroliter 2,5MCaCl&sub2; zu dem Röhrchen gegeben. Das Schütteln wurde daraufhin eingestellt und die Ausfällung wurde für 10 Min. bei Raumtemperatur durchgeführt. Zu diesem Zeitpunkt kann die Zusammensetzung für einige Zeit gelagert werden. Kurz vor der Verwendung wurde der Mischung aus DNS und Trägerpartikel einer kurzen Drehung in einer Mikrozentrifuge unterworfen. Der gereinigte Überstand wurde vollständig entfernt und das Präzipitat, bestehend aus der DNS und den Trägerpartikeln, wurde in 20 Milliliter 100% Ethanol resuspendiert. Die resuspendierte DNA und Trägerpartikel-Mischung wurde in einem Wasserbad-Ultraschallgerät für 2-3 kurze Bestrahlungen von einer Sekunde mit Ultraschall behandelt. Die resultierende Suspension wurde anschließend in einer Menge von 320 Mikroliter pro Trägerblatt oder einer berechneten Menge von 0,05 mg pro Quadratzentimeter des Trägerblattes auf das Trägerblatt 22 beladen. Nachdem das Gold sich abgesetzt hatte, wurde das überstehende Ethanol abgelassen und das Blatt getrocknet. Die Zusammensetzung aus DNS und Trägerkügelchen wurden täglich frisch erstellt.
Beschuß
• Zu diesem Zeitpunkt des Verfahrens wurden die Trägerblätter auf die Vorrichtung der Fig. 1 und 2 für das Beschießen plaziert. Die Baumwoll-Explantate wurden auf 12% Xantan-Gummi-Platten ausplattiert. Unter Verwendung der oben beschriebenen normalen Keimungs- und Hormonbehandlung vor dem Beschuß wurde festgestellt, daß typischerweise 25 Explantate auf jede der Zieloberflächen innerhalb des Beschußgebietes angebracht werden konnten.
• Die Parameter, die für den Transformationsbeschuß mittels der Partikel selbst verwendet wurden, umfassen eine relativ hohe elektrische Spannungsentladung durch das Gewehr, typischerweise im Bereich von 15-25 Kilovolt. Als Standardspannung wurde 18 kV verwendet. Die Spannung wurde so eingestellt, daß ein Ausmaß an Impuls auf die behandelten Achsen erreicht wurde, so daß die Überlebensrate der Meristeme zwischen 40 und 80% betrug. Mit anderen Worten, die Kraft des Beschusses wurde auf einen Wert eingestellt, bei dem durch das Verfahren wenigstens einige Meristeme nicht-lebensfähig wurden. Die Beschuß-Versuche wurden bei 350 mm Quecksilber durchgeführt, wobei Helium in einer Menge von 1,5 l pro Minute bei atmosphärischem Gehalt und etwa 5,0 l pro Minute unter Vakuum eingeführt wurde.
• Jedes der Zielgewebe wurde zweifach während des selben Tages beschossen, einmal am Morgen und einmal am Nachmittag, wobei die Explantate zwischen dem sukzessiven Beschuß in einer feuchten Kammer bei etwa 28ºC im Dunkeln mit geringer Sauerstoffkonzentration (8%) gelagert wurden. Die Zielgewebe wurden unmittelbar nach dem Beschuß im Dunkeln belassen.
Nach-Beschuß-Protokoll
• Die Explantate wurden nunmehr von der Zieloberfläche entfernt und in normaler Orientierung auf OR ccb Medium ausplattiert, welches mit frischem BAP aber ohne NAA hergestellt wurde. Es wurde darauf geachtet, daß die Explantate nicht zuviel Licht ausgesetzt wurden. Vorsicht wurde darauf gelegt, daß das Meristem nicht in Kontakt mit dem Medium kam, und es wurden keine nassen Platten verwendet. Die frischen Explantate wurden ausplattiert und bei 28º im Dunklen bei geringer Sauerstoffkonzentration für zwei volle Tage inkubiert.
• Einen Tag nach dem Beschuß wurde eine vorläufige Bestimmung der transienten Enzym-Aktivität an dem resultierenden Gewebe durchgeführt. Das Nachweisverfahren wurde zu diesem Zeitpunkt durchgeführt, um die Qualität des Verfahrens zur Herstellung der Kügelchen zu überprüfen und ferner um die Anzahl der Transformationsereignisse in dem Meristem zu bestimmen, wobei eine grobe Näherung derselben durch Überprüfung der transienten Aktivität in den Explantaten zu diesem Zeitpunkt durchgeführt werden kann. Obwohl durch die schweren Schäden von dem Beschußverfahren geschädigt, 20-60% der Meristeme wurden soweit beschädigt, daß sie nie Triebe produzierten, werden dieselben beschädigten Meristeme in dem Nachweisverfahren ausgezeichnete Transientengenaktivität insbesondere des Gus-Gens und der Verwendung dieses Verfahrens aufweisen. Die Gewebe können daher in dieser Stufe auf den Prozentsatz der Gus-Aktivität hin untersucht werden, obwohl die Triebe auf den diesem Verfahren unterworfenen Meristemen noch nicht sichtbar sind.
• Nach der initialen Nach-Beschuß-Inkubation auf dem oben beschriebenen Medium wurden die Baumwoll-Explantate auf ein auf Dextrose basierendes holziges Pflanzenmedium ("woody plant medium", WPM) übertragen, ohne BRP, mit Carbenicillin und Benomyl, in Behälter für Pflanzen und wiederum unter wenig Licht. Die Mischung des WPM Mediums basiert auf McCown and Lloyd, Proc. International Plant Propagation Suc., 30: 421 (1981) und wurde wie folgt hergestellt: NH&sub4;NO&sub3; (400 mg/l), Ca(NO&sub3;)&sub2; · 4 HOH (556 mg/l), K&sub2;SO&sub4; (900 mg/l), CaCl&sub2; · 2 HOH (96 mg/l), KH&sub2;PO&sub4; (170 mg/l), H&sub3;BO&sub3; (6,2 mg/l), Na&sub2;MoO&sub4; · 2 HOH (0,25 mg/l), MgSO&sub4; · 7 HOH (370 mg/l), MnSO&sub4; · HOH (16,9 mg/l), ZnSO&sub4; · 7 HOH (8,6 mg/l), CuSO&sub4; · 5 HOH (0,025 mg/l), FeSO&sub4; · 7 HOH (27,8 mg/l), Na&sub2; · EDTA (37,3 mg/l), Thiamin · HCl (1,0 mg/l), Nikotinsäure (0,5 mg/l), Pyridoxin · HCL (0,5 mg/l), Glyzin (2,0 mg/l), Myoinositol (100 mg/l), Dextrose (20 g/l), Agar (3,0 g/l), Gelrite (1,1 g/l), Kalziumgluconat (1,29 g/l), Carbenicillin (200 mg/l) und Benomyl (60 mg/1). Die Gewebe wurden bei 28ºC im Dunklen mit normalem Sauerstoffgehalt für 5-7 Tage inkubiert.
• Nach der obigen Kultur im Dunklen wurden die Pflanzen-Behälter in einen schattigen Bereich bewegt. Die Explantate wurden für zwei volle Tage im Schatten belassen, um sich an die graduelle Bestrahlung mit Licht zu gewöhnen.
• Anschließend wurden die Pflanzen-Behälter, die dasselbe Medium enthielten, zur vollen Bestrahlung mit Licht überführt, so daß die Trieb-Entwicklung in den kultivierten Geweben induziert wird.
Identifizierung der Transformationsereignisse
• Die Pflanzen-Behälter wurden in eine Kulturkammer überführt und für 16 Stunden Lichtphasen bei 28ºC exponiert. Eine Anzahl der in Kultur gezogenen Exlantate würden daraufhin fortschreiten und Triebverlängerung und Entwicklung aus dem plattierten Gewebe zeigen. Es wurde daher notwendig, die wachsenden Triebe zu bewerten, um das Ausmaß der Keimbahn-Transformationsereignisse zu bestimmen, welches durch dieses Verfahren erzielt wurde. Das Nachweisverfahren wurde zu dem Zeitpunkt durchgeführt, beidem die Triebe jeweils ihre ersten Blätter entwickelt hatten. Daraufhin wurde das äußerste Drittel bis zur Hälfte jedes Blattes vollständig über das Blatt durch die Mittelrippe abgeschnitten. Die Blätter wurden daraufhin auf Gus-Aktivität hin untersucht, um Gus-positive, expremierende Pflanzen zu identifizieren.
• Zu diesem Zeitpunkt wurde die Qualität des Ereignisses in Abhän gigkeit des Ausmaß der Gus-Aktivität in dem Blatt bestimmt. Einige der Blätter zeigten lediglich eine ungerade oder unregelmäßige Gus-Expression, was auf chimäre Pflanzen hindeutet. Aufgrund der unten dargestellten Ergebnisse und aufgrund von Erfahrung mit anderen Pflanzensystemen wurde festgestellt und verifiziert, daß bei chimären Pflanzen eine Transformation des vaskulären Systems, wie beispielsweise von der Mittelrippe dargestellt, sehr gut mit dem Auftreten eines Keimbahn-Transformationsereignisses korreliert. Einige der Blätter schienen vollständig blau zu sein, was auf möglicherweise klonal transgene Pflanzen hindeutet. Sofern die Pflanze als ein Keimbahn-Ereignis gekennzeichnet wurde, wurde die Pflanze auf Bedingungen zur Induktion des Wurzelwachstums übertragen und im Gewächshaus gezogen. Bei chimären Pflanzen wurde die Pflanze bis unmittelbar oberhalb des transformierten Blattes beschnitten, um die Hilfs- Knospe dazu zu bringen, von dem transformierten Bereich der Pflanze nach erneuter Testung zu wachsen.
• Bei Pflanzen, die in dem Nachweisverfahren negativ waren, wurden die Blätter entfernt und die Pflanzen gezogen, bis sich neu gebildete Blätter erzeugt wurden. Die Nachweisverfahren wurden nochmals durchgeführt. Dieses Verfahren wurde dreimal wiederholt, bevor eine abschließend negative Bestimmung für die Pflanze durchgeführt wurde.
• In dem oben beschriebenen Versuch wurden 590 Triebe von Pima Baumwolle gewonnen. Von diesen Trieben wurden 6 Triebe ermittelt, die eine wesentliche Gus-Aktivität in der Pflanze aufweisen. Kein Umsetzen der transformierten Triebe wurde benötigt und die Wurzelverlängerung und Entwicklung verlief normal. Von den 590 Trieben wurden 6 möglicherweise transgene Pflanzen gewonnen.
• Die Pflanze, die am weitesten gewachsen ist, wurde als vollständig klonale Transformation verifiziert und ist in der Lage das inserierte Gen über Mendel'sche Vererbung an ihre Nachkommen weiterzugeben. Die Pflanze ist vollständig klonal, wobei eine Gus-Aktivität in allen ihren Blättern und in allen Bereichen der Pflanze gezeigt wird. Die Pollen der Pflanze wurden auf Gus- Aktivität hin untersucht, wobei gezeigt werden konnte, daß etwa die Hälfte der Pollenkörner der Pflanze das Gus in einer Menge expremiert, die bei normaler Verteilung der Gene in der Keimbahn erwartet werden würde. Selbstbestäubung der klonalen R-0 Pflanze erzeugte pflanzliche Nachkommen, die das in der transgenen Elternpflanze inserierte, vererbte Gen enthalten und expremieren. Die Aufteilung des inserierten Gens für die Nachkommenpflanzen entsprach etwa 3 : 1 oder dem, was von einem heterozygoten Allel erwartet werden würde. Eine Mendel'sche Vererbung des Gens konnte dementsprechend bestätigt werden und eine Keimbahn-Transformation der Pima Baumwolle wurde daher bestätigt. Zusätzlich zeigten zwei weitere Pflanzen ein Transformationsereignis, das bisher das Abwerfen von expremierenden Pollen in einer Verteilung von etwa 1 : 1 umfaßt.
• Das gesamte, oben beschriebene Verfahren, von dem ersten ausplattieren der Samen bis zur Gewinnung der Ursprungsgeneration transgener Pflanzen, d. h. R-0, benötigt etwa 3 bis 5 Wochen. Basierend auf den ersten oben dargestellten Ergebnissen, wird davon ausgegangen, daß etwa eine klonale transgene Pflanze aus etwa 100 bis 500 Meristemen hervorgehen wird, die dem Beschuß- Verfahren ausgesetzt wurden. Von den Trieben, die durch dieses Verfahren erzeugt werden, wird festgestellt werden, daß etwa 0,1 -1% ein Keimbahn-Transformationsereignis durchlaufen hat.
Beispiel 2
• Das obige Protokoll wird derzeit mit Gewebe der Baumwoll-Sorten Delta und Pine 50, einer Hochland-Baumwolle, und Sea Island, der Sorte Barbados, wiederholt. Dabei wird das Plasmite pCMcC 2114 verwendet. Triebe wurden gewonnen, dem initialen Nachweisverfahren unterworfen und werden in Kultur gezogen, um Pflanzen zu erhalten. Bis heute weisen die Nachweisverfahren an abgeschnittenen Blättern auf ein Ausmaß an Transformationereignissen hin, daß mit den obigen Ergebnissen für Pima übereinstimmt. Zusätzlich, zeigten die Nachweisverfahren Transformationsereignisse, die in einer Transformation der vaskulären Gewebe resultierte, welche mit Keimbahn-Transformationsereignissen assoziiert sind.
• Auf diese Art wird es nunmehr durchführbar und praktisch, transgene Baumwollpflanzen einer breiten Anzahl von Genotypen und Sorten zu erhalten. Während die oben beschriebenen Verfahren die Verwendung eines Gewebekulturgerätes, wie Petrischalen und Pflanzenwachstumsmedien, umfassen, wird keine Gewebekultur in dem Sinne benötigt, daß kein undifferenziertes Baumwollgewebe in irgendeiner Stufe der Verfahrens verwendet wird. Da Baumwolle ein bekanntermaßen langsam wachsendes System in undifferenzierter Pflanzenkultur ist, liegt in der Tatsache, daß kein undifferenziertes Gewebe durch das vorliegende Verfahren erzeugt wird, ein einzigartiger Vorteil dieses Verfahrens, welcher die unmittelbare und bequeme und schnelle Erzeugung einer großen Vielzahl von transgenen Baumwollpflanzen mit einem Minimum an Problemen und Ausgaben ermöglicht.

Claims (22)

1. Verfahren zur Erzeugung genetisch transformierter Linien von Baumwollpflanzen, bei dem man

(a) Baumwollsamen keimen läßt,

(b) von den keimenden Baumwollsamen embryonische Achsen isoliert,

(c) die isolierten embryonischen Achsen auf einer Zieloberfläche plaziert,

(d) Kopien einer fremden genetischen Konstruktion präpariert und die Kopien auf Trägerpartikeln beschichtet, die im Verhältnis zu der Größe der Zellen des Baumwollgewebes klein sind,

(e) die Trägerpartikel, die die Kopien des fremden genetischen Materials tragen, an der Zieloberfläche, auf der die embryonischen Achsen plaziert sind, derart physikalisch beschleunigt, daß viele Trägerpartikel in das Innere der Zellen der embryonischen Achsen hineingeschossen werden,

(f) die embryonischen Achsen wie in Stufe (e) auf einem im wesentlichen Hormon-freien Medium und unter Bedingungen kultiviert, so daß aus wenigstens einigen der behandelten embryonischen Achsen Triebe entstehen, ohne die Kalluskultur zu beschädigen, und man

(g) diese Triebe, die die fremde genetische Konstruktion in ihrem Genom enthalten zu vollständigen, sexuell ausgereiften Baumwollpflanzen kultiviert, die in der Lage sind, das Fremdgen durch sexuelle Vererbung auf ihre Nachfolgepflanzen zu übertragen.

2. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem man in Stufe (a) den Samen keimen läßt, bis 1 bis 4 mm der Wurzel hervorgetreten sind.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, bei dem man die embryonischen Achsen, nachdem man sie von den Samen isoliert hat, zerlegt, um alle embryonischen Blätter zu entfernen, die die Meristeme bedecken.

4. Verfahren nach Anspruch 1, 2 oder 3, bei dem man die embryonischen Achsen nach Stufe (b) durch Kultivieren im wesentlichen unter Ausschluß von Licht in einem Medium vorbehandelt, das ein Cytokinin, aber kein Auxin enthält.

5. Verfahren nach einem irgendeinem der vorangegangenen Ansprüche, bei dem man nach Stufe (e) die embryonischen Achsen im wesentlichen unter Ausschluß von Licht für eine kurze Zeit auf einem Medium inkubiert, das ein Cytokinin, aber kein Auxin enthält.

6. Verfahren nach irgendeinem der vorangegangenen Ansprüche, bei dem in Stufe (d) die Kopien der fremden genetischen Konstruktion sowohl ein interessierendes Fremdgen als auch ein Markergen einschließt und bei dem man die Triebe aus Stufe (f) daraufhin screent, ob sie das Markergen exprimieren, um Triebe zu identifizieren, die die fremde genetische Konstruktion tragen.

7. Verfahren nach Anspruch 6, bei dem das Markergen das Gus-Gen ist.

8. Verfahren nach irgendeinem der vorangegangenen Ansprüche, bei dem man in Stufe (e) den physikalischen Beschleunigungs schritt mit ausreichender Kraft und Intensität durchführt, so daß zwischen 20 und 60% der embryonischen Achsen derart beschädigt werden, daß sie in Stufe (f) niemals Triebe hervorrufen.

9. Verfahren nach irgendeinem der vorangegangenen Ansprüche, bei dem man in Stufe (e) den physikalischen Beschleunigungsschritt mit ausreichender Kraft und Intensität durchführt, so daß die Mehrzahl an Zellen in den embryonischen Meristemen getötet werden.

10. Verfahren nach irgendeinem der vorangegangenen Ansprüche, bei dem man Stufe (e) durchführt, indem man die beschichteten Trägerpartikel auf einem ebenen Trägerblatt plaziert, man das Trägerblatt an der Trägeroberfläche mit einer Schockwelle einstellbarer Kraft beschleunigt und man das Trägerblatt derart zurückhält, daß die Trägerpartikel auf die Zieloberfläche zuwandern können.

11. Verfahren nach Anspruch 10, bei dem man die Schockwelle einstellbarer Kraft durch eine elektrische Funkenentladung erzeugt und die Kraft dadurch einstellbar ist, daß man die elektrische Spannung der Entladung einstellt.

12. Verfahren nach irgendeinem der vorangegangenen Ansprüche, bei dem der Baumwollsamen einer Sorte entstammt, die aus der Gruppe bestehend aus Pima-, Avala- und Upland-Baumwollsorten ausgewählt ist.

13. Verfahren zur Erzeugung genetisch transformierter Linien von Baumwollpflanzen, bei dem man

(a) Baumwollsamen keimen läßt,

(b) von den keimenden Baumwollsamen embryonische Achsen isoliert,

(c) alle embryonischen Blätter von den embryonischen Achsen entfernt, um die Meristeme der Achsen zu exponieren,

(d) man die embryonischen Achsen zur Partikelbehandlung vorbehandelt durch Kultivieren der embryonischen Achsen im Dunkeln auf einem Medium mit einem Cytokinin, das aber im wesentlichen Auxin-frei ist,

(e) man die isolierten embryonischen Achsen auf einer Zieloberfläche plaziert,

(f) man Kopien einer fremden genetischen Konstruktion herstellt, die ein interessierendes Fremdgen und ein Markergen einschließt,

(g) man die Kopien der fremden genetischen Konstruktion auf Trägerpartikeln beschichtet, die im Verhältnis zu der Größe der Zellen des Baumwollgewebes klein sind,

(h) die Trägerpartikel, die die Kopien des fremden genetischen Materials an der Zieloberfläche, auf der die embryonischen Achsen plaziert sind, derart physikalisch beschleunigt, daß vielen Trägerpartikel in das Innere der Zellen der embryonischen Achsen hineingeschossen werden,

(i) die embryonischen Achsen wie in Stufe (e) auf einem im wesentlichen Hormon-freien Medium und unter Bedingungen kultiviert, so daß aus wenigstens einigen der behandelten embryonischen Achsen Triebe entstehen, ohne die Kalluskultur zu beschädigen, und man

(j) man die Triebe daraufhin screent, ob sie das Markergen exprimieren, und man

(k) diese Triebe, die die fremde genetische Konstruktion in ihrem Genom enthalten, zu vollständigen, sexuell ausgereiften Baumwollpflanzen kultiviert, die in der Lage sind, das Fremdgen durch sexuelle Vererbung auf ihre Nachfolgepflanzen zu übertragen.

14. Verfahren nach Anspruch 13, bei dem das Markergen das Gus- Gen ist.

15. Verfahren nach Anspruch 13 oder 14, bei dem man in Stufe (h) den physikalischen Beschleunigungsschritt mit ausreichender Kraft und Intensität durchführt, so daß zwischen 20 und 60% der embryonischen Achsen derart zerstört werden, daß sie in Stufe (f) niemals Triebe hervorrufen.

16. Verfahren nach Anspruch 13, 14 oder 15, bei dem man in Stufe (h) den physikalischen Beschleunigungsschritt mit ausreichender Kraft und Intensität durchführt, so daß die Mehrzahl an Zellen in den Meristemen einer jeden Achse getötet werden.

17. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 13 bis 16, bei dem man Stufe (h) durchführt, indem man die beschichteten Trägerpartikel auf einem ebenen Trägerblatt plaziert, man das Trägerblatt an der Trägeroberfläche mit einer Schockwelle einstellbarer Kraft beschleunigt und man das Trägerblatt derart zurückhält, daß die Trägerpartikel auf die Zieloberfläche zuwandern können.

18. Verfahren nach Anspruch 17, bei dem man die Schockwelle einstellbarer Kraft durch eine elektrische Funkenentladung erzeugt und die Kraft dadurch einstellbar ist, daß man die elektrische Spannung der Entladung einstellt.

19. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 13 bis 18, bei dem der Baumwollsamen einer Sorte entstammt, die aus der Gruppe bestehend aus Pima-, Avala- und Upland-Baumwollsorten ausgewählt ist.

20. Verfahren zur Erzeugung genetisch transformierter Baumwollpflanzen-Linien, bei dem man

(a) Baumwollsamen keimen läßt,

(b) von den keimenden Baumwollsamen embryonische Achsen isoliert,

(c) man die isolierten embryonischen Achsen auf einer Zieloberfläche plaziert,

(d) man die Kopien der fremden genetischen Konstruktion auf Trägerpartikeln beschichtet, die im Verhältnis zu der Größe der Zellen des Baumwollgewebes klein sind,

(e) man die Trägerpartikel, die die Kopien des fremden genetischen Materials tragen, an der Zieloberfläche derart physikalisch beschleunigt, daß viele der Trägerpartikel in das Innere der Zellen in den embryonischen Achsen hineintreten,

(f) man die embryonischen Achsen auf einem Medium, das im wesentlichen Hormon-frei ist, derart kultiviert, daß Triebe mit Blättern aus den behandelten embryonischen Achsen hervortreten, ohne die Kalluskultur zu beschädigen,

(g) man ein Blatt von der Pflanze abschneidet und einen Abschnitt des Blattes daraufhin untersucht, ob es das Markergen exprimiert,

(h) die Triebe, bei denen die Untersuchung ergab, daß sie das Markergen in der Mittelrippe des Blattabschnitts exprimieren, zu einer sexuell ausgereiften Pflanze kultiviert,

(i) man den Blütenstaub der Pflanzen daraufhin untersucht, ob er das Markergen exprimiert, um festzustellen, ob die Transformation ein Keimbahn-Ereignis beinhaltet, und man

(j) von denjenigen Pflanzen, die ein Keimbahn-Ereignis beinhalten, die Nachkommen der Pflanzen wiedergewinnt, die die fremde genetische Konstruktion enthalten.

21. Verfahren nach Anspruch 20, bei dem das Markergen das Gus- Gen ist.

22. Verfahren zur Erzeugung von genetisch transformiertem Gewebe einer Pflanze, bei dem man

(a) embryonische Achsen aus Samen einer Pflanze herausschneidet,

(b) die embryonischen Achsen auf einer Zieloberfläche plaziert,

(c) Kopien einer fremden genetischen Konstruktion herstellt,

(d) man Kopien der fremden genetischen Konstruktion auf Trägerpartikeln beschichtet, wobei die Trägerpartikeln eine Mischung aus Goldkügelchen einer Größe zwischen 1 und 3 um und mikrokristallinen Goldpartikeln ist,

(e) man die Trägerpartikel, die die Kopien des fremden genetischen Materials tragen, an der Zieloberfläche, auf der die embryonischen Achsen plaziert sind, derart physikalisch beschleunigt, daß viele Trägerpartikel in das Innere der Zellen der embryonischen Achsen hineintreten, und man

(f) aus den embryonischen Achsen Triebe erzeugt, von denen ein Teil mit der fremden genetischen Konstruktion transformiert ist.