PT731632E

PT731632E - Transformacao de especies de musa com agrobacterium tumefaciens

Info

Publication number: PT731632E
Application number: PT95905888T
Authority: PT
Inventors: Charles J Arntzen; Gregory D May
Original assignee: Texas A & M Univ Sys
Priority date: 1993-12-09
Filing date: 1994-12-09
Publication date: 2002-03-28
Also published as: EP0731632A1; WO1995015678A1; EP0731632A4; EP1087016A2; EP1087016A3; ATE208131T1; EP0731632B1; AU1433395A; US5792935A; AU693506B2; ES2164759T3; JPH09508786A; CA2177267A1; CA2177267C; DE69429012D1; DE69429012T2

Description

DESCRIÇÃO "TRANSFORMAÇÃO DE ESPÉCIES DE MUSA COM AGROBACTERIUM TUMEFACIENS"

FUNDAMENTO DO INVENTO 1. Campo do invento

Este invento está relacionado com métodos para a transformação de espécies de Musa, tais como bananeira ou pacobeira, usando Agrobacterium tumefaciens. 2. Descrição da Técnica Anterior

As bananeiras e as pacobeiras são ervas gigantes, perenes, pertencentes ao género Musa; os seus frutos são o quarto alimento mais importante no mundo em desenvolvimento. Aproximadamente 10% da produção mundial de banana (cerca de 9 milhões de toneladas em 1990, avaliada em 4 biliões de dólares americanos) entra no mercado de exportação para gerar uma fonte importante de rendimento para as regiões tropicais e subtropicais. Perante o facto de Musa spp. constituir um contributo tão forte para a segurança alimentar e também proporcionar rendimentos de exportação nos países em desenvolvimento, é um paradoxo notável que estas culturas nunca tenham beneficiado do melhoramento tradicional de culturas. A produção em todo o mundo está totalmente dependente de clones não melhorados que foram muitas vezes colhidos da natureza, domesticados e mantidos por propagação clonal. Em termos de culturas importantes para as quais a biotecnologia ofereça a possibilidade de um melhoramento genético dramático, tem existido poucas oportunidades abertas de novas abordagens para Musa spp.

Existe um consenso generalizado de que as bananas comestíveis derivam das duas espécies M. accuminata e M. balbisiana. As bananas comestíveis possuem três níveis diferentes de poliploidia: 2N=22, 3N=33 e 4N=44. Têm sido propagadas vegetativamente durante centenas de anos, com as mutações somáticas a proporcionarem variabilidade. Os triplóides são os cultivares mais numerosos e largamente utilizados (incluindo bananas de sobremesa usadas no mercado de exportação mundial). Os esforços para cruzar Musa usando métodos convencionais estão cheios de obstáculos, incluindo baixa fertilidade, níveis de poliploidia e ausência de variabilidade genética. Uma vez que quase todos os cultivares aceites são plantas propagadas clonalmente, estéreis e sem sementes, os esforços para a reprodução convencional devem começar com material não melhorado, o qual tem sido mal caracterizado relativamente às suas características genéticas. Seria uma grande vantagem se fosse possível fazer melhoramentos genéticos nos cultivares sem sementes, correntemente aceites, que estão em produção como culturas alimentares; este manuscrito descreve um sistema para a transformação genética reprodutível e rápida de Musa que tomará isto possível.

Se bem que a reprodução tradicional tenha sido lenta para Musa spp., a aplicação das ferramentas de cultura de tecidos vegetais tem tido um valor significativo para o melhoramento de culturas. As técnicas de recuperação de embriões, culturas celulares em suspensão e técnicas de culturas celulares relacionadas têm sido usadas em actividades de pesquisa para ultrapassar as limitações na reprodução de culturas, com selecção resultante de variantes genéticas com novos fenótipos. As células vegetais crescidas em culturas -3- h^rb η desorganizadas (calos, células e protoplastos) sofrem alteraçSo genética ubíqua ou variação somaclonal. Se bem que esta variabilidade genética seja útil na criação de novos plasmas germinativos, é uma característica negativa distinta na propagação clonal de cultivares com interesse, para os quais a uniformidade genética é necessária. Isto levou ao desenvolvimento de protocolos de cultura de meristemas que são agora largamente usados, nos países desenvolvidos e em desenvolvimento, para a multiplicação de Musa. Caracteristicamente, estes processos de micropropagação requerem apenas curtos períodos de exposição dos tecidos vegetais a crescimento num estado indiferenciado, e têm um nível muito baixo de variação somaclonal entre a descendência.

No desenvolvimento do sistema de transformação descrito abaixo, tentámos obter um sistema que simulassse os processos de micropropagação de meristemas largamente usados e comercializados. O nosso objectivo é disponibilizar um sistema que seja útil para a modificação genética direccionada de cultivares importantes já existentes, com a menor probabilidade possível de introdução de variabilidade somaclonal imprevisível. É conhecido que estirpes virulentas da bactéria gram negativa do solo Agrobacterium tumefaciens infectam plantas dicotiledóneas e certas plantas monocotiledóneas. O agente indutor de tumores em A. tumefaciens é um plasmídeo que funciona através da transferência de algum do seu DNA para as células da planta hospedeira. Este plasmídeo (o plasmídeo Ti) e a virulência das várias estirpes de A. tumefaciens é determinado em parte pela região vir do plasmídeo Ti, a qual é responsável pela mobilização e transferência de T-DNA. Genes estranhos podem ser mobilizados e introduzidos num hospedeiro susceptível via plasmídeo Ti. O plasmídeo Ti pode ser usado como um vector para a -4-manipulação genética de plantas hospedeiras. Na maior parte dos casos o plasmídeo nativo de A. tumefadens é modificado para criar um plasmídeo desarmado, isto é, que não provoca a formação de tumores ou doença.

Tem sido, de um modo geral, assumido que a gama de hospedeiros de A. tumefadens está limitada às espécies de dicotiledóneas. Tem havido um sucesso limitado na transformação de algumas plantas monocotiledóneas tais como Gramineae (ver Pat. U.S. Nos. 5 187 073 e 5 177 010). Hooykaas-Van Slogteren et al., Nature, 311, 763 (1984), descreveram a produção de pequenas tumefacções, nos locais de feridas infectadas com A. tumefadens, em espécies monocotiledóneas das famílias Liliaceae e Amarylliaceae. Hemalsteens, et al. descreveram [EMBO Journal, 3, 3039 (1984)] que os fragmentos de caules em cultura da monocotiledónea Asparagus officinalis, um membro da família Liliaceae, infectados com A. tumefadens estirpe C58 desenvolveram proliferações tumorais. DeCleene e DeLey em The Botanical Review, 42, 389 (1976) ensinam que as monocotiledóneas das ordens Liliales e Arales são susceptíveis à infecção com A. tumefadens, mas que as monocotiledóneas em geral não são susceptíveis à infecção por A. tumefadens. Tem sido referido [Potrykus, Bio/Technology 8:515 (1990)] que a transformação de monocotiledóneas com Agrobaderium é difícil, devido a estas espécies não apresentarem a resposta de ferida característica das dicotiledóneas (as quais são competentes para a activação da expressão do gene vir na bactéria, transformação e regeneração de tecidos nos quais os genes introduzidos são integrados no cromossoma da célula vegetal). Existe pouca informação disponível para prever o grau em que outras monocotiledóneas podem ser tomadas susceptíveis a Agrobaderium. Chilton [Proc. Natl. Acad. Sei. 90:3119 (1993)] observaram que a química da planta hospedeira é impotante para a delicada sinalização química entre as bactérias e as células vegetais. Esta situação apresenta ainda maior complexidade devido a diferenças na eficiência de -5- agroinfecção entre diferentes plasmídeos vectores Ti. Chilton descreve que existe um grande grau de incerteza na transformação de monocotiledóneas, o que toma impossível prever que Musa possa ser transformada. Devido a esta incerteza, não se pode prever a ocorrência da transferência de genes bacterianos noutras monocotiledóneas não testadas, tais como Musa.

De um modo geral tem sido aceite que as espécies de Musa não são susceptíveis à transformação por A. tumefaciens. De facto, trabalhos anteriores demonstram que A. tumefaciens não pode ser usado para transformar Musa. [Biotech. and Devei. Monitro., 14:14-16 (1993)].

Grimsley et al., em EP 0267159 A descrevem um método para a inserção de DNA virai, o qual facultativamente pode conter DNA a transportar, em plantas. O método envolve a infecção de plantas, de preferência plantas da família das Graminiae, tais como milho, arroz, trigo e cevada, com Agrobacterium tumefaciens a qual contem DNA virai clonado capaz de transformar plantas da família Gramineae. A patente ‘159 estabelece que o método descrito pode ser aplicado a várias monocotiledóneas incluindo Musa. No entanto, não são descritos nem DNA específico para a transformação de Musa, nem métodos ou exemplos específicos para a transformação de Musa, um género que se sabe ser particularmente difícil de transformar. Consultar Chilton, Proc. Natl. Acad. Sei. 90:3119 (1993).

Bidney em EP0486233 A2 descreve o bombardeamento de micropartículas para criar microferidas no tecido vegetal de monocotiledóneas tais como milho, sorgo, triticale, cevada, aveia, centeio, trigo, cebola e arroz, para proporcionar um ambiente que conduza, particularmente, à infecção por Agrobacteria. Se bem que Bidney estabeleça que o método de microbombardeamento melhore a infecção de várias monocotiledóneas, não -6- C—J-i existe descrição da transformação de Musa. De facto, Bidney descreve que a utilização com êxito, e de forma reprodutível, da inoculação de Agrobacterium para transformar monocotiledóneas, é específica de fenótipo tanto relativamente às plantas como a Agrobacterium.

Existe a necessidade de desenvolver um método para efectuar a transformação genética eficaz de Musa. A capacidade para inserir genes estranhos nestas populares plantas tropicais será de grande importância, uma vez que permitirá fazer tentativas de criar resistência a doenças e pragas e fenótipos de frutos alterados via engenharia genética.

Estas e outras vantagens do presente invento serão aparentes a partir da descrição detalhada que se segue.

SUMÁRIO DO INVENTO

Constitui um objectivo do presente invento proporcionar métodos para a transformação de plantas de Musa.

Assim, o presente invento proporciona um método para a transformação de uma planta de Musa, o referido método compreendendo os passos a), b) e c) da reivindicação 1. O presente invento também proporciona um método para a transformação de plantas de Musa, em que pelo menos um T-DNA manipulado geneticamente compreende ainda pelo menos um segundo gene seleccionado do grupo consistindo nos genes que codificam resistência a agentes de selecção, genes que codificam pelo menos uma marca detectável e suas combinações. -7- O presente invento também proporciona um método para a transformação de plantas de Musa, em que pelo menos um T-DNA manipulado geneticamente compreende ainda pelo menos um gene que codifica a resistência a agentes de selecção, e em que o método compreende ainda a regeneração do tecido vegetal de Musa, transformado na presença de pelo menos um agente de selecção, que responda ao gene que codifica a resistência ao agente de selecção, de forma a seleccionar o tecido resistente transformado com o T-DNA manipulado geneticamente.

Também é proporcionado um método para a transformação das plantas de Musa com pelo menos um produto farmacêutico, seleccionado do grupo consistindo no antigénio de superfície da hepatite B, proteína da cápside do vírus de Norwalk, insulina, interleucinas, hormona de crescimento, eritropoietina, G-CSF, GM-CSF, hPG-CSF, Factor VIII, Factor IX, tPA, insulina e suas combinações. Também são proporcionadas plantas transformadas com pelo menos um fármaco.

Também é proporcionado um método para a transformação de plantas de Musa com pelo menos um gene que altere características fenotípicas do fruto da planta. Também são proporcionadas plantas transformadas que possuem frutos tendo uma característica fenotípica alterada. É igualmente proporcionado um método para a transformação de plantas de Musa de forma a conferir às plantas resistência a herbicidas e/ou doença.

Também é proporcionado um método para a transformação de uma planta de Musa, em que a planta de Musa transformada é crescida durante tempo suficiente para identificar a presença de características quiméricas, produção de -8- Mb tecido não quimérico através da divisão da planta de Musa transformada em segmentos, os quais têm pelo menos um meristema que pode regenerar uma planta intacta e que possuiem células que estão uniformemente transformadas para produzir tecido não quimérico, e crescimento do tecido não quimérico numa planta não quimérica.

Estes e outros objectos e vantagens são descritos na Descrição Detalhada que se segue.

BREVE DESCRICÃO DOS DESENHOS A Figura 1 descreve os ensaios para NPT-II de pontos transferidos para membranas de plantas individuais em regeneração, após transformação genética mediada por Agrobacterium. Cada um dos alvéolos (ponto) contem um extracto de tecido foliar de uma planta individual. As filas A, B e C contêm todas extractos de transformantes putativos de bananeira, recuperados após selecção em sulfato de canamicina a 100 mg/1. A fila D contem extractos de plantas de bananeira não transformadas testemunhas. As amostras E-l e E-2 são plantas de tabaco não transformadas e transformadas, apresentadas para comparação. A variabilidade na intensidade da reacção entre os diferentes regenerantes putativos é atribuída à inserção cromossómica ao acaso do T-DNA nos cromossomas da bananeira, com concomitante variabilidade dos níveis de expressão de NPT-II. A Figura 2 descreve a actividade de β-glucuronidase (GUS) em extractos de tecido foliar de plantas individuais derivadas da transformação, mediada por Agrobacterium, de tecidos meristemáticos de bananeira. As plantas individuais foram identificadas por números. A actividade de GUS é medida fluorimetricamente como a taxa de conversão molar do substrato [4-metil-umbeliferil-p-Dglucurónido (MUG)] para produzir [4-metil-umbeliferona (4- Ν -9- UM)] pela enzima β-glucuronidase. Esta actividade é expressa como. moles de produto produzido por minuto por mg de proteína total contida na mistura de ensaio. A Figura 3 descreve uma autorradiograma de uma transferência

Southern de DNA genómico da testemunha negativa (não transformada), testemunha positiva (plantas de tabaco transgénicas portadoras de NTP-II) e plantas de bananeira transformadas por Agrobacterium, as quais foram regeneradas em 100 mg/1 de canamicina. Dez microgramas de cada DNA genómico foram digeridos com EcoRI e foram aplicados em pistas separadas. Estes DNAs foram hibridados contra um fragmento PstI de 1,0 Kb de NPT-II. O DNA das plantas (bananeira transgénica e planta do tabaco transgénica) que apresentaram actividade de NPT-II (pistas 1 a 7 e pista 9), demonstraram hibridação com o fragmento NPT-II. A planta de bananeira não transformada (testemunha negativa) (pista 8) não apresentou hibridação detectável. A Figura 4 descreve um autorradiogama de uma transferência

Southern de DNA genómico da testemunha positiva (DNA genómico de Agrobacterium), testemunha negativa (plantas de bananeira não transformadas) e plantas de bananeira transformadas por Agrobacterium que foram regeneradas em 100 mg/1 de canamicina. Um micrograma do DNA de Agrobacterium e 10 pg de DNAs das plantas foram digeridos com EcoRI e foram aplicados em pistas separadas. Estes DNAs foram hibridados contra um fragmento BamHI/BagllI contendo vir B. O DNA de Agrobacterium apresentou hibridação com o fragmento vir B (pista 1). Nem a planta de bananeira não transformada (testemunha negativa) (pista 2), nem as plantas de bananeira transgénicas (pistas 3-5) apresentaram hibridação detectável. -10-

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DESCRICÃO DETALHADA DO INVENTO O método do presente invento destina-se à obtenção de espécies de Musa transformadas estáveis. O termo Musa inclui bananeiras e pacobeiras. Os tecidos de Musa adequados para a transformação incluem tecido meristemático, como seja por exemplo meristema apical e meristema adventício, e tecido de cormo da bananeira em crescimento ou culturas de rebentos de pacobeira. O tecido adequado também deverá ser capaz de regenerar pelo menos uma planta intacta. O tecido meristemático lateral ou axial poderá ser igualmente adequado. O método envolve ferimento de tecido meristemático (para facilitar a infecção por Agrobacteríum íumefaciens) por técnicas tais como, por exemplo, dissecção (e.g., bissecção longitudinal), corte, perfuração e/ou bombardeamento com micropartícuias. A eficácia do ferimento pode ser aumentada por bombardeamento do tecido dissectado com micropartí cuias. O bombardeamento com micropartículas pode ser realizado por qualquer técnica conhecida dos familiarizados com a matéria. Tais técnicas incluem, mas não estão limitadas a bombardeamento com micropartículas de tungsténio ou de ouro. Prevê-se que o ferimento não só proporcione tecido exposto, que é competente para a transformação por Agrobacteríum íumefaciens, como também estimule a produção de compostos que induzem a virulência da bactéria.

Após ferimento, o tecido meristemático pode ser incubado durante um período de incubação adequado, como seja cerca de um a oito, de preferência cerca de duas a cerca de seis e mais preferencialmente cerca de quatro dias a uma temperatura de incubação e regime de iluminação adequados. As temperaturas de incubação adequadas são entre cerca de 25°C e cerca de 29°C, de preferência entre cerca de 26°C e cerca de 28°C, e mais preferencialmente a cerca de 27°C. Os regimes de iluminação adequados são cerca de 14 horas a cerca de 18 horas, e - 11 - c «Ά de preferência cerca de 15 horas a cerca de 17 horas, e mais preferencialmcntc cerca de 16 horas. Numa realização alternativa o tecido ferido é sujeito ao tratamento com A. tumefaciens sem incubação prévia. O método envolve a aplicação, no tecido ferido, de pelo menos uma A. tumefaciens competente para transformação para transformar a planta. A selecção da estirpe apropriada de A. tumefaciens pode ser feita pelos familiarizados com a matéria. Uma estirpe adequada é aquela que pode transferir eficazmente o gene com interesse. Estirpes adequadas de A. tumefaciens incluem, mas não estão limitadas às estirpes LBA4404, C58 e A281, portadoras de um plasmídeo que provoca a expressão génica em Musa. A A. tumefaciens possui pelo menos um plasmídeo Ti, compreendendo pelo menos um T-DNA manipulado geneticamente. A. tumefaciens pode ser aplicada por qualquer técnica conhecida dos familiarizados com a matéria, como seja , por exemplo, a aplicação manual com a ponta dos dedos, fricção, injecção e/ou por cocultura. A aplicação de A. tumefaciens será por um período de tempo adequado. Um tempo de incubação adequado é cerca de 15 a 60 minutos, de preferência entre cerca de 20 e cerca de 45 minutos, e mais preferencialmente cerca de 30 minutos. O T-DNA manipulado geneticamente pode ser portador de um ou mais genes para transformar a planta. Estes podem ser, por exemplo, pelo menos um primeiro gene que codifica pelo menos uma proteína não nativa para a planta de Musa, pelo menos uma proteína nativa para a planta de Musa, pelo menos um gene que altera a expressão génica na planta de Musa e suas combinações. O T-DNA geneticamente manipulado pode também compreender pelo menos um segundo gene que codifica a resistência a um agente de selecção, pelo menos um gene que codifica pelo menos uma marca detectável e suas combinações. -12-

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Numa realizaçao preferida do presente invento, tecidos meristc-

máticos podem ser tratados com pelo menos um composto que induz a virulência de A. tumefadens. Compostos adequados incluem, mas não estão limitados a acetossiringona, ou outros extractos de plantas, para a indução da virulência de A. tumefadens. Outros aditivos podem ser aplicados para aumentar o êxito da infecção, incluindo, mas não estando limitados a opinas tais como octapina, nopalina e leucinopina. O tratamento com tais compostos indutores de virulência pode ser realizado por cocultura do tecido em meio contendo tais compostos. Os tecidos são incubados a uma temperatura de incubação adequada, como descrito atrás, durante um período de tempo adequado, como descrito atrás. Numa realização alternativa, a cocultura não é realizada na presença de um composto indutor de virulência. Numa realização, o tecido transformado é plantado e deixado a crescer. Numa realização alternativa preferida, o tecido transformado é incubado em condições que permitem a selecção usando técnicas bem conhecidas dos familiarizados com a matéria. Por exemplo, o tecido pode ser incubado num meio de regeneração selectivo. A selecção pode ser feita usando pelo menos um gene de resistência a antibióticos. Pode ser empregue a inserção da sequência de pelo menos um gene de resistência a antibióticos como seja, mas não estando limitado a canamicina, cloranfenicol, neomicina, carbenicilina, higromicina e sutis combinações. Igualmente, pode ser inserido pelo menos um gene codificador da resistência a herbicidas. Estes incluem herbicidas tais como, mas não estando limitados a fosfinotricina, glifosato e pelo menos uma das sulfonilureias e suas combinações. O meio de regeneração selectivo será constituído por pelo menos um ingrediente selectivo adequado, como sejam antibióticos adequados para selecção de transformantes resistentes a antibióticos, ou pelo menos um herbicida, para os transformantes resistentes a herbicidas. A escolha de um ou mais agentes selectivos dependerá dos genes de resistência transferidos para a planta. -13- /<(ί

Os regenerados de Musa emergentes podem ser transferidos para meio de regeneração contendo antibióticos e/ou herbicidas para permitir a selecção de plântulas transgénicas. Os meios de regeneração são aqueles meios conhecidos dos familiarizados com a matéria que proporcionam condições favoráveis à regeneração de plântulas. Meios de regeneração adequados incluem, mas não estão limitados a meio SM, como descrito em Novak, F.J., et al., Bio/Technology 7, 154 (Fevereiro, 1989), aqui incluído como referência. Os regenerados emergentes são deixados a incubar durante tempo suficiente no meio de regeneração. Um tempo suficiente é aquele que permite a formação de plântulas. O crescimento de regenerados de Musa pode então ser transferido para um meio de enraizamento. Os meios de enraizamento são aqueles meios conhecidos dos familiarizados com a matéria que proporcionam condições favoráveis à indução da formação de raízes. Meios de enraizamento adequados incluem, mas não estão limitados a meio SH, como descrito por Novak, F.J., et al., supra, aqui incluído como referência. Os regenerados em crescimento são incubados durante tempo suficiente em meio de enraizamento. Um tempo suficiente é aquele que permite a formação de raízes.

Numa realização preferida, regenerados de Musa são testados quanto à presença de um ou mais genes ou seus produtos adicionados, usando métodos bioquímicos convencionais.

Existem pelo menos três vantagens principais do método desenvolvido para transformação de Musa spp. Primeiro é a sua aplicabilidade a todos os cultivares de bananeira e de pacobeira. Ainda, o método permite a introdução de genes em bananeira ou em pacobeira sem passar por uma fase celular que pode induzir variação somaclonal. Ainda, o processo total da introdução do gene até à regeneração de plantas é curto (menos de aproximadamente dois meses). O método do presente invento pode ser usado para transformar a planta de Musa com um ou mais genes. Conforme aqui é usado “Genes” inclui, mas não está limitado a sequências de nucleótidos naturais ou sequências de nucleótidos sintéticas. “Sequência de nucleótidos” como aqui é usado refere-se a uma cadeia de ácidos nucleicos naturais ou modificados conforme normalmente reconhecido pelos familiarizados com a matéria.

Para melhorar a capacidade de identificar transformantes, pode-se pretender empregar uma marca genética seleccionável ou detectável, para além do gene expressável com interesse. Tais genes podem codificar uma marca seleccionável ou detectável, dependendo se a marca confere uma característica que se pode seleccionar por meios químicos, i.e. através da utilização de um agente selectivo como seja um herbicida, antibiótico ou similares, ou se é simplesmente uma característica que se pode identificar através da observação ou. . testando (e.g., a característica do locus R). São conhecidos muitos exemplos de genes de marcas adequadas e podem ser empregues na realização do presente invento.

Possíveis marcas seleccionáveis para usar em relação ao presente invento incluem, mas não estão limitadas ao gene NPT-II que codifica a resistência à canamicina e que pode ser seleccionada usando canamicina, G418, etc.; um gene bar que codifica resistência a bialafos, um mutante do gene da sintetase de EPSP que codifica resistência ao glifosato; etc. Exemplos de marcas detectáveis incluem um gene da beta-glucuronidase (GUS), cloranfenicol-acetil-transferase (CAT) ou um locus R, que codifica um produto que regula a produção de pigmentos antocianinas (cor vermelha) nas células hospedeiras. -15- M- h^rh ι»«-»ι ·ί f

Estão também incluídos nos termos gene “seleccionável” ou “marca detectável” os genes que codificam uma marca secretável, cuja secreção pode ser detectada como um meio de identificação ou selecção das células hospedeiras transformadas. Exemplos incluem marcas que são capazes de secretar um ou mais antigénios que podem ser identificados por interacção com anticorpos, ou uma ou mais enzimas, que podem ser detectadas cataliticamente. A escolha de um ou mais genes particulares a serem introduzidos na planta muitas vezes dependerá da finalidade da transformação. Os genes codificadores dos polipeptídeos não nativos para Musa, genes codificadores de polipeptídeos nativos para Musa, genes que alteram a expressão génica e suas combinações, podem ser assim aplicados a Musa. Os genes que alteram a expressão génica incluem, mas não estão limitados a um ou mais genes que codifiquem pelo menos uma ribozima, genes que codifiquem nucleótidos complementares de sequências codificadoras e genes que operam negativamente em trans, tal como descrito na Patente U.S. N° 5 231 020. O método pode ser usado para transformar plantas com genes que codificam polipeptídeos não nativos para a planta de Musa. Tal como aqui é usado, “polipeptídeo” refere-se a polipeptídeo ou proteína. Este inclui a produção de proteínas importantes ou outros produtos para utilização comercial, como seja lipase, melanina, pigmentos, anticorpos, hormonas, fármacos tais como, por exemplo, interleucinas, EPO, G-CSF, GM-CSF, hPG-CSF, M-CSF, Factor VIII, Factor IX, tPA, hGH, receptores, insulina, vacinas, antibióticose similares. Vacinas úteis incluem, mas não estão limitadas ao antigénio de superfície da hepatite B e proteína da cápside do vírus de Norwalk. Os genes podem também codificar proteínas de fusão. As sequências codificadoras de proteínas que podem ser usadas são conhecidas ou podem ser obtidas por técnicas de sequenciação convencionais. Como alternativa, o método pode ser usado para produzir uma

-16- enzima que é capaz de converter um produto naLural uum produto único. Isto inclui, por exemplo, a produção de metabolitos secundários úteis como fármacos. Como alternativa, o método pode ser usado para alterar o metabolismo celular conduzindo à alteração do sabor dos frutos ou à alteração da pigmentação da planta ou outras características fenotípicas da planta. Tais características incluem, mas não estão limitadas a características, características relacionadas com o ambiente ou com pressão, características relacionadas com doença e características de maturação. Estas incluem, por exemplo, genes responsáveis pela síntese ou metabolismo de peptídeos proteínas, ácidos gordos, lípidos, cêras, óleos, amidos, açúcares, sabores, odores, fragrâncias, toxinas, pigmentos carotenóides, hormonas, polímeros da parede celular, moléculas reguladores de genes, flavonóides, proteínas de armazenamento, ácidos fenólicos, cumarinas, alcaloides, quinonas, linhinas, glucosinolatos, taninos, aminas alifáticas, celuloses, polissacáridos, glicoproteínas e glicolípidos.

Por exemplo, uma alteração na produção de ácidos gordos ou lípidos pode ser manipulada (e a composição em ácidos gordos, por exemplo de uma planta produtora de óleos, assim alterada) através do bloqueio da elongação de uma cadeia específica ou de uma enzima de dessaturação. Igualmente, a síntese de amido pode ser alterada e os açúcares alterados (e o teor de açúcares de, e.g., uma planta edível assim alterado). De forma semelhante, pode ser manipulada a produção de moléculas voláteis que conferem fragrância.

Numa realização alternativa, o método é usado para a transformação de plantas para adicionar algumas características à planta importantes em termos agronómicos. Tais características incluem, mas não estão limitadas a resistência a herbicidas, aumento de rendimentos, resistência a insectos e a doenças, aspecto físico, teor em alimentos e composição, etc. Por exemplo, pode-se pretender incorporar um ou mais genes codificadores de resistência a herbicidas. São bons exemplos os genes bar e da sintetase de EPSP tolerante a glifosato. Um potencial gene de resistência a insectos que pode ser introduzido inclui o gene da toxina do cristal de Bacillus thuringiensis, que pode proporcionar resistência a pragas tais como lepidópteros ou coleópteros.

Os genes codificadores de proteínas caracterizadas como tendo potencial actividade insecticida, tais como o inibidor da tripsina da ervilheira (CpTI); podem encontrar utilização como repelente de lagartas da raiz; genes codificadores de avermectina podem ser particularmente úteis como repelentes das lagartas da raiz de cereais.

Nalguns casos, a planta de Musa transformada será quimérica. “Quimérica” refere-se a uma planta tendo tecido de constituição genética diversa, ou um indivíduo composto por uma mistura de células geneticamente diferentes. As plantas quiméricas podem, por exemplo, ser o resultado da inserção de pelo menos um gene que codifica pelo menos um polipeptídeo não nativo para a planta de Musa, pelo menos um gene que codifica pelo menos um polipeptídeo nativo para a planta de Musa, pelo menos um gene que codifica a expressão génica alterada de pelo menos um gene nativo de Musa, e suas combinações, numa região do genoma da planta que conduza à expressão génica diminuída, incompleta ou alterada apenas numa parte das células que estão contidas na planta transgénica resultante. Ainda, as plantas quiméricas podem resultar da transformação de uma única célula de um meristema em que o referido meristema (composto por células transformadas e não transformadas) regenera uma planta “quimérica” transformada. As plantas quiméricas podem ser identificadas por técnicas conhecidas dos familiarizados com a matéria. Estes incluem, mas não estão limitados a análises enzimáticas do produto do gene estranho, análises de hibridação Southern e Northern das diferentes linhagens celulares dentro da mesma planta transformada. Nalguns casos, as plantas -18- h*.yfr c quiméricas podem ser identificadas por observação visual das características da planta. Por exemplo, as secções seleccionadas da planta podem ter crescimento retardado ou diminuído.

Nalguns destes casos, conhecidos dos familiarizados com a matéria, será desejável desenvolver uma planta de Musa que não possua estas características quiméricas. A geração de uma planta transformada não quimérica a partir de uma planta quimérica transformada pode ser efectuada através do crescimento de uma planta de Musa transformada, durante um tempo suficiente para identficar a presença de características quiméricas, e produção de tecido não quimérico através da divisão da referida planta de Musa quimérica transformada em segmentos que possuam pelo menos um meristema, que pode regenerar uma planta intacta e que possui células que não estão uniformemente transformadas, para produzir tecido não quimérico e crescimento do referido tecido não quimérico numa planta não quimérica. “Tempo suficiente” como aqui é usado é um tempo conhecido dos familiarizados com a matéria, e inclui, mas não está limitado de cerca de dois dias a cerca de 45 dias, de preferência cerca de 10 dias a cerca de 30 dias, e mais preferencialmente cerca de 14 dias a cerca de 21 dias. “Divisão” como aqui é usado refere-se a corte físico, por exemplo com uma faca, bisturi ou micrótomo.

Os exemplos que se seguem ilustram os ensinamentos do presente invento e não se destinam a limitar o seu âmbito.

Exemplo 1

Este exemplo descreve a transformação de bananeira usando Agrobacterium tumefaciens. Neomicina fosfotranferase-II (NPT-II) e beta-glucuronidase (GUS) foram expressos em bananeiras.

As plântulas de cultura de tecidos do clone comercial Cavendish “Grand Nain” (AAA) foram micropropagados como culturas de rebentos apicais. As culturas em suspensão derivadas de calos pró-embriogénicos foram geradas e mantidas como descrito por Novak, F.J., et ai, Bio/Technology, 7, 154-159 (1989), aqui incluído como referência.

Os meristemas apicais (2-5 mm de tamanho) foram removidos das culturas de rebentos apicais in vitro, para obter a cúpula meristemática com 2-4 primórdios foliares e uma quantidade limitada de tecido de cormo subjacente; estes foram então bissectados longitudinalmente. Como alternativa, os tecidos de cormo removidos (os quais contêm numerosos botões adventícios) sem o meristema apical foram cortados em fatias de 2-3 mm de espessura. O plasmídeo pBI141 continha o gene GUS sob o controlo do promotor da actina do arroz 1 (Actl) e o gene NPT-II sob o controlo do promotor NOS. Este vector binário foi construído por inserção do fragmento Xhol/Xba 1 de pActl F em pBIlOO digerido com Xbal/Hindlll. O plasmídeo pB3G continha os genes bar e GUS sob o controlo do promotor 35S do vírus do mosaico da couve-flor.

Bissecções longitudinais do meristema apical ou tecidos de botões adventícios de culturas de rebentos de bananeira em crescimento foram bombardeados com micropartículas nuas, usando um aparelho projectado por medida, a uma distância de 10 cm. O bombardeamento com micropartículas nuas antes da incubação dos tecidos com Agrobacterium aumentou ainda mais a percentagem de plântulas que cresceram em meio selectivo. Estes tecidos passaram por um período de recuperação de três dias. Após recuperação, as porções de botões meristemáticos ou adventícios foram cocultivados durante 30 -20-minutos com uma cultura diluída, crescida durante a noite, de Agrobacterium estirpe LBA4404, portadora de pBI141, na presença de acetossiringona (AS) 100 μΜ. Após inoculação, os tecidos vegetais foram transferidos para meio de regeneração não selectivo S27 como descrito por Novak, F.J., et al., Bio/Technology, 7, 154-159 (1989), aqui incluído como referência, contendo AS 100 μΜ, e foram incubados no escuro a 27°C durante quatro dias. Os tecidos de botões meristemáticos e adventícios foram então transferidos para meio de regeneração selectivo contendo 100 mg por litro de sulfato de canamicina e 500 mg por litro de carbenicilina. Os rebentos de regeneração foram transferidos para meio de enraizamento como descrito por Novak, supra, contendo 100 mg/1 de sulfato de canamicina e 500 mg/1 de carbenicilina. As plântulas formadoras de raízes em meio selectivo foram testadas relativamente à actividade de NPT-II.

Foram realizadas experiências preliminares usando meristemas apicais bissectados ou tecidos de cormo, os quais foram incubados com Agrobacterium na presença ou ausência de acetossiringona (AS) Encontrou-se que AS aumentou o número de plântulas em regeneração resistentes a agentes selectivos, indicando que AS aumentou a transformação genética de células de bananeira mediada por Agrobacterium.

Transformantes putativos de bananeira foram testados quanto à presença de actividade de NPT-II de acordo com um protocolo modificado como descrito por Peng, J. Wen, et al., PlantMol. Biol. Rep., 11(1), 38-47, (1993), aqui incluído como referência. Na modificação, o tecido foliar das plântulas em enraizamento em meio selectivo foram isoladas e imediatamente congeladas em N2 líquido. Os extractos proteicos foram preparados por homogeneização de amostras em trituradores de tecidos Kontes, descartáveis, na presença de tampão de extracção (tampão Na fosfato 50 mM, pH 7,0, β-mercaptoetanol 10 mM, EDTA 10 mM, 0,2% de Triton-X100). As amostras foram centrifugadas durante quatro minutos a 4°C e 50 μΐ de cada exlraclo foi adicionado a tubos de microcentrífuga separados. Os restantes processos do ensaio foram realizados como descrito por Peng, et al.

As plantas nas quais as actividades de NPT-II foram detectadas foram ainda analisadas quanto à presença de actividade enzimática GUS de acordo com métodos convencionais como descrito por Jefferson, R.A., Plant Mol. Biol. Rep., 5,387-405 (1987), aqui incluído como referência. O DNA genómico foi isolado a partir de folhas de plântulas que apresentaram actividade de NPT-II de acordo com um protocolo CTAB como descrito por Feinberg, A. P. e Vogelstein, B., Anal. Biochem., 132, 6-13 (1983), aqui incluído como referência. As amostras de DNA (10 pg) foram digeridas com as enzimas de restrição adequadas e foram sujeitas a electroforese através de um gel de 0,7% de agarose e tranferidas para uma membrana de nylon Zeta Probe™ (BioRad, Richmon, CA) de acordo com as recomendações do fornecedor. As sondas marcadas radioactivamente ao acaso foram geradas a partir do fragmento GUS EcoRV/SstIde 1,0 Kb. As membranas foram hibridadas e lavadas como recomendado pelo fornecedor. Os resultados foram visualizados por autorradiografia usando técnicas convencionais.

As experiências de transformação tipicamente envolvem 50 plântulas de bananeira, micropropagadas a partir das quais 100 meristemas apicais bissectado,s e 20 a 40 pedaços de cormo foram obtidos. Após cocultura com Agrobacterium, todos os passos de regeneração de plântulas incluíram sulfato de canamicina como agente selectivo (100 mg/1). Setenta por cento ods pedaços de meristema apical formaram rebentos no meio de micropropagação; 50% destes deram crescimento de raízes vigorosos no meio de regeneração de raízes selectivo. Quarenta por cento das fatias de cormo formaram rebentos no meio de micropropagação selectivo e destes, 40% formaram raízes no meio selectivo de regeneração de raízes. As plântulas que formaram raízes neste meio selectivo foram testadas relativamente à actividade enzimática de NPT-II (Figura 1). Aproximadamente 66% das plantas seleccionadas demonstraram níveis de actividade enzimática facilmente detectáveis.

Plântulas de bananeira transgénicas putativas, seleccionadas com base no crescimento de raízes em meio contendo canamicina e níveis elevados de actividade de NPT-II, foram ainda avaliadas relativamente à actividade enzimáticade GUS (Figura 2). O tecido foliar de testemunhas não transformadas demonstrou níveis baixos de actividade de fundo GUS (valor médio de 20 picomoles de 4-metil-umbeliferona/min/mg de proteína. Os transformantes individuais expressaram uma gama de actividades de GUS, desde níveis perto dos das testemunhas não transformadas até cerca de 1000 picomoles de 4-metil-umbeliferona/min/mg de proteína.

Os DNAs genómicos das plantas testemunha e transgénicas putativas foram isolados e analisados relativamente à presença do gene NPT-II (Figura 3). Dez microgramas de DNA genómico de cada uma das amostras foi digerido com a enzima de restrição indicada e foram hibridados com o fragmento ΝΡΤ-Π de 1,0 Kb. Cada um dos regenerados testados, que previamente tinham demonstrado actividade de NPT-II, continha as sequências que hibridaram com o fragmento NPT-II.

Para determinar se as hibridações do fragmento NPT-II nas amostras testadas foram devidas à presença de Agrobacterium residual contaminante, os DNAs genómicos das amostras atrás referidas foram hibridadas com o gene de virulência bacteriana vir B. Não se detectou hibridação de vir B nas amostras de plantas regeneradas, enquanto que uma pista da testemunha positiva contendo DNA genómico de Agrobacterium deu um sinal facilmente detectável (Figura 4).

Exemplo 2

Neste Exemplo, o tecido meristemático foi tratado como descrito no Exemplo 1, com a excepção de o tecido ter sido transformado com uma A. tumefaciens portadora de um plasmídeo tendo o gene codificador do antigénio de superfície da hepatite B (HbsAG) em vez de GUS. A construcção do vector Ti codificador de HbsAG (pHBlOl) foi anteriormente descrita [Mason, et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89, 11745-11749 (1992)] e a sequência do gene HbsAG usado na construcção foi publicada [Pasek, et al., Nature, 575-579 (1979)]. As células de Agrobacterium estirpe LB4404 foram transformadas pelo método directo [Na, et al., Methods Enzymol. 153, 292-305 (1987)], aqui incluído como referência, com os plasmídeos preparados a partir de clones de E. coli e a estrutura dos plasmídeos foi verificada por digestão com enzimas de restrição. Os tecidos meristemáticos foram transformados, como descrito no Exemplo 1, por Agrobacterium com o plasmídeo pHBlOl (codificador de HbsAG). As plântulas foram selectivamente regeneradas em 100 mg/1 de canamicina. Estes transformantes putativos criaram raízes em meio contendo 100 mg/1 do agente selectivo, enquanto as testemunhas não transformadas morreram nestas condições.

Extraiu-se proteína a partir de tecidos foliares por homogenização com um homogenizador de vidro triturado Tem-Broek (limpidez, 0,15 mm) em 5 volumes de tampão contendo fosfato de potássio 20 mM (pH 7,0), NaCl 0,15M, ascorbato de sódio 20 mM, 0,1% de triton X-100 e fluoreto de fenilmetilsulfonilo 0,5 mM a 4°C. O homogenato foi centrifugado a 1 000 xg durante 5 min, e o

«L n -24- ( «Ά sobrenadante foi centrifugado a 27 OOOxg durante 15 min. O sobrenadanle de 27 000 xg foi centrifugado a 100 000 xg durante 1 h e o sedimento foi ressuspenso em tampão de extracção. A proteína nas diferentes fracções foi medida por ensaio de ligação do corante Coomassie (Bio-Rad). HbsAG foi testado com o estojo de monoclonal Auszyme (Abbott, North Chicago, IL), usando a testemunha positiva (HbsAG derivada de soro humano) como padrão. A testemunha positiva foi diluída para dar níveis de HbsAg de 0,09-1,8 ng por ensaio, e a absorvância a 492 nm após aparecimento da cor deu uma relação linear nesta gama.

As plântulas regeneradas em meios de selecção foram testadas quanto à presença de HbsAG. O material antigénico positivo foi detectado em plantas de Musa transformadas com pHBlOl.

Exemplo 3

Este é um exemplo profético. O tecido mristemático foi transformado com um A. tumefaciens portadora de um plasmídeo tendo o gene codificador de fosfinotricina acetiltransferase e GUS. O gene bar codifica fosfinotricina acetiltransferase (PAT); o qual quando introduzido em plantas transgénicas confere resistência ao herbicida Basta. A sequência do gene bar usado na construção do plasmídeo Ti codificador de PAT foi recentemente publicado [White, et al., Nuc. Acids Res. 64, 675-678 (1990)]. Um plasmídeo (pDEllO) contendo o gene bar sob o controlo do promotor do vírus do mosaico da couve-flor (CaMV) e o terminador da nopalina sintetase (NOS) foi usado na obtenção de um plasmídeo Ti (pIBT-115), contendo as sequências que codificam PAT. O fragmento EcoRIlHindIII contendo o promotor de CaMV, sequências codificadoras de PAT e o terminador NOS foi

V V <~x 25- retirado do pDEl 10 após digestão com EcoRI/HindIII. Este fragmento foi tratado com o fragmento Klenow da DNA polimerase na presença de excesso de dNTPs para produzir um fragmento de extremos cerses. PBI21 (CLONETECH Laboratories, Paio Alto, CA), contendo o gene GUS sob o controlo do promotor de CaMV, foi linearizado por digestão com a enzima de restrição PstI. Após digestão, o extremo saliente 3’-OH resultante foi removido do plasmídeo por tratamento com DNA polimerase de T4 na presença de excesso de dNTPs a 12°C. Colectivamente, estes tratamentos resultaram num plasmídeo linear (pBI121) tendo extremos cerses. Ainda, este tratamento resulta na libertação da maioria do gene NPT-II e no terminador NOS que existe como um fragmento PstI/PstI do pBI121. O fragmento CaMV-PAT-NOS EcoRI/HindIII foi ligado ao pBI121 sem NPT-II para dar pIBT-115. Células de Agrobacterium estirpe LBA4404 foram transformadas pelo método directo [An, et al., Methods Enzymol 153, 292-305 (1987)] com os plasmídeos preparados a partir de clones de E. coli, e a estrutura dos plasmídeos foi verificada por digestão de restrição. Os tecidos meristemáticos foram transformados por Agrobacterium com o plasmídeo pIBT115 (codificador dos genes bar e GUS) como descrito no Exemplo 1, com a excepção de fosfinotricina substituir a canamicina como agente selectivo. As plântulas foram selectivamente regeneradas em 0,5 mg/1 de fosfinotricina. Estes tranformantes putativos podem ser enraizados em meios contendo 0,5 mg/1 de herbicida, enquanto que as testemunhas não transformadas morrem nestas condições. Algumas das plantas foram subsequentemente cultivadas em solo e testadas quanto à resistência ao herbicida, por aplicação directa do produto químico no verticilo da folha, quando as plantas cresceram até cerca de 10 cm de altura. Nas testemunhas não transformadas foi evidente a destruição grave com as folhas acastanhadas, enquanto que os transformantes putativos não apresentaram sintomas visíveis. Também se observou que a aplicação do herbicida às plantas testemunha causa inibição do crescimento do meristema apical com concomitante proliferação das plantas filhas (“rebentos”); estes efeitos não foram observados nos transformantes putativos. Uma vez que pEBT115 codifica o gene GUS, também realizámos experiências de coloração histoquímica nestas plantas para avaliar a presença de GUS. Observou-se uma coloração intensa em todas as plantas resistentes ao herbicida, comparado com a ausência de coloração em testemunhas não transformadas nas mesmas condições de ensaio histoquímico.

Exemplo 4 A transformação de meristemas, realizada como no Exemplo 1, pode resultar em plantas quiméricas. Ou seja, apenas uma célula num conjunto de células deverá receber o DNA de NPTII, mas a actividade enzimática resultante deverá resultar na degradação da canamicina que protegerá as células envolventes, permitindo assim a regeneração de uma planta que conterá células transformadas e não transformadas. Para criar condições para eliminar quaisquer possíveis células não transformadas e derivados de células, podem ser usados dois níveis adicionais de pressão selectiva - regime de criação de raízes na presença do agente de selecção, seguido de um ou mais ciclos adicionais de regeneração de rebentos que forçam a formação da nova planta a partir de apenas um pequeno agregado de células.

Para estas experiências, ápices de rebentos de 3x5 mm e fatias de cormo de 2-3 mm de espessura foram removidas das plantas transformantes putativas com raízes, recuperadas em 100 mg/1 de canamicina, após cocultura com Agrobacterium. Estas foram transferidas para meio de formação de rebentos que também continha o mesmo nível de canamicina. Para comparação, os meristemas testemunha não transformados ou fatias de cormo foram transferidas para uma gama de concentrações de canamicina, até 100 mg/1 inclusive. Os efeitos de inibição nas plantas testemunha incluíram retardamento do crescimento e amarelecimenlo das folhas; a 100 mg/1, o crescimento das raízes foi totalmente inibido. Uma porção dos transformantes putativos mostrou crescimento vigoroso das raízes neste nível de inibidor. Numa exeriência típica, cerca de 40% dos tecidos que formaram raízes em canamicina formaram raízes fortes. Estes dados indicam que os restantes 60% eram quiméricos e não continham tecidos meristemáticos que dessem origem a raízes resistentes ao antibiótico. Naguns casos, após exposição prolongada dos tranformantes putativos à selecção com canamicina em meio de enraizamento (mais de 4 semanas), a morte da maior parte do tecido meristemático foi observada em amostras individuais, com um estabelecimento subsequente de novos rebentos e desenvolvimento de raízes surgindo a partir de apenas uma pequena porção dos tecidos anteriormente verdes. Interpretámos este fenómeno como sendo a morte dos tecidos não transformados, acoplado ao crescimento de uma nova plântula surgindo de tecido meristemático, derivado de uma linha celular progenitora original que resultou de um caso de transformação mediada por Agrobacterium.

Foi importante determinar se as plântulas que regeneraram e . enraizaram em 100 mg/1 de canamicina apresentavam evidência de actividade enzimática correspondendo à degradação do antibiótico. Analisámos múltiplos transformantes individuais obtidos após transformação mediada por

Agrobacterium compBI141, a qual inclui o gene NPTII.

As plântulas que formaram raízes em meio selectivo foram testadas relativamente à actividade enzimática de NPT (Peng et al., supra). Aproximadamente 66% dos transformantes putativos que formaram raízes em meios selectivos demonstraram níveis facilmente detectáveis de actividade enzimática.

As plantas individuais foram seleccionadas com base nestes ensaios NPT para posterior propagação; as plantas que tinham demonstrado níveis elevados de actividade enzimática foram sujeitas a posterior cultura de meristema. Esta envolveu dissecção de cada transformante putativo num pequeno meristema apical e fatias de cormo; estes tecidos foram então transferidos para meio de formação de rebentos contendo 100 mg/1 de canamicina. Rebentos verdes com crescimento forte foram subsequentemente seleccionados, dissectados em pequenos meristemas apicais (3x5 mm) e fatias de cormo, e deixados desenvolver para dar origem a novos rebentos, os quais foram subsequentemente forçados a enraizar em 100 mg/1 de canamicina. A partir das 50 plantas originais que foram usadas para iniciar uma experiência típica, obteve-se aproximadamente cinco transformantes putativos de crescimento forte após este segundo ciclo de selecção de raízes. Estes foram então analisados individualmente, por análise enzimática e Southern, e, em todos os casos, o tecido do meristema apical foi sempre preservado e micropropagado para originar múltiplos derivados clonalmente propagados.

Podem ser feitas muitas outras variações e modificações nas técnicas aqui descritas, pelos familiarizados com esta tecnologia, sem se afastarem do conceito do presente invento. Assim, deverá ser claramente compreendido que a descrição anterior é apenas ilustrativa e não se destina a limitar o âmbito do invento.

Lisboa, 12 de Dezembro de 2001 Ál lu< ^ ^

ALBERTO CANELAS Agente Oficial da Propriedade Industrial RUA VICTOR CORDON, 14 1200 LISBOA

Claims

REIVINDICAÇÕES 1. Um método para a transformação de uma planta de Musa, em que o referido método compreende: a) ferimento prévio do tecido meristemático de uma planta de Musa antes do bombardeamento da referida planta com micropartículas; b) ferimento do tecido meristemático, previamente ferido, por bombardeamento com micropartículas para gerar um tecido ferido da planta de Musa e para facilitar o acesso de Agrobacterium íumefaciens às células vegetais de Musa competentes para a transformação e regeneração; e c) aplicação ao referido tecido vegetal ferido de Musa de pelo menos uma Agrobacterium íumefaciens competente para a transformação para transformar a referida planta de Musa, em que a referida Agrobacterium íumefaciens competente para a transformção possui pelo menos um plasmídeo Ti e pelo menos um gene de virulência, em que o referido plasmídeo Ti compreende pelo menos um T-DNA manipulado geneticamente para efectuar a transformação da referida planta de Musa.
2. O método de acordo com a reivindicação 1, em que pelo menos um T-DNA manipulado geneticamente, compreende pelo menos um primeiro gene seleccionado do grupo consistindo nos genes que codificam pelo menos um polipeptídeo não nativo para a planta de Musa, genes que codificam pelo menos um polipeptídeo nativo para a planta de Musa, genes que alteram a expressão pelo menos um gene nativo para Musa e suas combinações.
3. 0 método de acordo com a reivindicação 2, em que pelo menos um T-DNA manipulado geneticamente compreende ainda pelo menos um segundo gene seleccionado a partir do grupo consistindo em genes que codificam -2- «-1 a resistência a um agente de selecção, genes que codificam pelo menos uma marca detectável, e suas combinações.
4. O método de acordo com a reivindicação 2, em que o T-DNA geneticamente manipulado compreende ainda pelo menos um gene que codifica a resistência a um agente de selecção e em que o método compreende ainda a regeneração do tecido transformado da planta de Musa, na presença de pelo menos um agente de selecção que responde a pelo menos um gene que codifica a resistência ao agente de selecção, de forma a seleccionar o tecido resistente transformado com pelo menos um T-DNA geneticamente manipulado.
5. O método de acordo com a reivindicação 1, em que a planta de Musa é seleccionada do grupo constituído por bananeira e pacobeira.
6. O método de acordo com a reivindicação 1, em que o tecido meristemático é seleccionado do grupo constituído por meristema apical, meristema adventício e suas combinações.
7. O método de acordo com a reivindicação 1, em que o ferimento prévio é por dissecção.
8. O método de acordo com a reivindicação 1, compreendendo ainda a cocultura do tecido ferido da planta de Musa com Agrobacterium íumefaciens e pelo menos um composto para a indução de pelo menos um gene de virulência de Agrobacterium íumefaciens.
9. O método de acordo com a reivindicação 8, em que pelo menos um composto para a indução de pelo menos um gene de virulência de Agrobacterium íumefaciens é acetossiringona.
10. O método de acordo com a reivindicação 2, em que pelo menos um primeiro gene, que codifica pelo menos um polipeptídeo não nativo para a planta de Musa, codifica a resistência a pelo menos um herbicida.
11. O método de acordo com a reivindicação 10, em que pelo menos um herbicida é seleccionado do grupo consistindo em fosfinotricina, glifosato, sulfonilureias e suas combinações.
12. O método de acordo com a reivindicação 2, em que pelo menos um primeiro gene, que codifica pelo menos um polipeptídeo não nativo para a planta de Musa, codifica pelo menos um fármaco.
13. O método de acordo com a reivindicação 12, em que o fármaco é seleccionado do grupo constituído por antigénio de superfície da hepatite B, proteína da cápside do vírus de Norwalk, insulina, interleucinas, hormona de crescimento, eritropoietina, G-CSF, GM-CSF, hPG-CSF, Factor VIII, Factor IX, tPA, insulina e suas combinações.
14. O método de acordo com a reivindicação 3, em que o segundo gene, que codifica pelo menos uma marca detectável, é seleccionado do grupo consistindo em GUS, CAT e suas combinações.
15. O método de acordo com a reivindicação 3, em que pelo menos um segundo gene, que codifica a resistência ao agente de selecção, codifica resistência a antibióticos.
16. O método de acordo com a reivindicação 15, em que o segundo gene que codifica a resistência a antibióticos codifica resistência a pelo -4- Aí h^-rh menos um antibiótico seleccionado do grupo consistindo em canamicina, higromicina e suas combinações.
17. O método de acordo com a reivindicação 3, em que o segundo gene, que codifica a resistência ao agente de selecção, codifica a resistência a herbicida.
18. O método de acordo com a reivindicação 17, em que o segundo gene, que codifica a resistência a herbicidas, codifica a resistência a pelo menos um herbicida seleccionado do grupo consistindo em fosfinotricina, glifosato, sulfonilureias e suas combinações.
19. O método de acordo com a reivindicação 1, em que o T-DNA geneticamente manipulado codifica pelo menos uma enzima industrial.
20. O método de acordo com a reivindicação 1, em que o T-DNA geneticamente manipulado codifica pelo menos uma proteína de fusão.
21. O método de acordo com a reivindicação 1, em que o T-DNA geneticamente manipulado codifica pelo menos uma proteína que interage com pelo menos um composto na planta de Musa para produzir um metabolito secundário do referido composto.
22. O método de acordo com a reivindicação 1, em que o T-DNA geneticamente manipulado codifica pelo menos uma proteína que altera pelo menos uma característica fenotípica do fruto da planta de Musa.
23. O método de acordo com a reivindicação 22, em que a característica fenotípica é seleccionada do grupo consistindo em textura, sabor, pigmentação e suas combinações.
24. O método de acordo com a reivindicação 22 em que a característica fenotípica afecta a maturação do fruto da planta de Musa.
25. Um método de acordo com a reivindicação 1, compreendendo ainda: a) crescimento da referida planta de Musa transformada durante um tempo suficiente para identificar a presença de características quiméricas; b) produção de tecido não quimérico através da divisão da referida planta transformada de Musa em segmentos que tenham pelo menos um meristema, o qual pode regenerar uma planta intacta e possui células que estão uniformemente transformadas para produzir tecido não quimérico; e c) crescimento do referido tecido não quimérico para originar uma planta não quimérica. Lisboa, 12 de Dezembro de 2001

ALBERTO CANELAS Agente Oficial da Propriedade Industrial RUA VICTOR CORDON, 14 1200 LISBOA