JPH07504820A - 複数ウイルス耐性を示すトランスジェニック植物およびその生産方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 複数ウィルス耐性を示すトランスジェニック植物およびその生産方法本発明は、 ２．５Ａシンテターゼ活性を有する少な（とも１つのポリペプチドをコードする 遺伝子工学により作成したＤＮＡ配列を含有する、複数ウィルス耐性を示すトラ ンスジェニック植物に関する。さらに、本発明は、該トランスジェニック植物の 生産方法および遺伝子工学により作成した該ＤＮＡ配列の使用に関する。

ウィルス耐性植物を作成するいくつかの方法が、技術水準において記載されてい る。トランスジェニック植物において各植物ウィルスのコート蛋白を発現させる ことによる、多数の植物ウィルスに対する遺伝子工学により作成した耐性が報告 されている（ビーチイ（Ｂｅａｃｈｙ）ら、アヌ・レブ・フィトパソル（Ａｎｎ ｕ、　Ｒｅｖ。

Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌ、　）、２８　（１９９０）、４５１−４７４）。

また、トランスジェニック植物において特異的ウィルス・アンチセンスＲＮＡを 発現させることによる、いくつかの植物ウィルスに対する実質的ウィルス耐性が 示されている（クオッッｔ　（Ｃｕｏｚｚｏ）ら、バイオ／テクノロジー（Ｂｉ ｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）６　（１９８８）　、５４９−５５７　；ヘーメン ウエイ（Ｈｅｍｅｎｗａｙ）ら、ＥＭＢＯＪ、７（１９８８Ｌ　１２７３−１２ ８０）。該ウィルス・アンチセンスＲＮＡは、特異的なウィルスＤＮＡもしくは ＲＮＡ配列にノゾブリダイズし、かくして、さらに当該ウィルスの増殖に重要な 反応をブロックするか、あるいは当該ウィルスＲＮＡに対するハイブリダイゼー ションに際してウィルスＲＮＡの特異的切断を起こすリボザイム活性によって、 その機能を呈する。ウィルス耐性トランスジェニック植物を作成する前記方法の 主要な欠点は、該トランスジェニック植物がただひとつのウィルスまたは特定群 のウィルスに対して耐性であるにすぎないということである。

２．５Ａオリゴアデニル酸経路は、哺乳動物細胞においてインターフェロンによ って誘導される抗ウイルス反応系の一部である（レンゲウェル（Ｌｅｎｇｙｅｌ ）ら、アヌ・レブ・バイオケム（Ａｎｎｕ、　Ｒｅｖ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、）、 ５１　（１９８２）　、２５１−２８２）。該２．５Ａ経路の少なくともいくつ かの構成成分が、鳥類、爬虫類および両生類、昆虫、酵母およびバクテリアのご とく哺乳動物以外の生物で検出されている（シュタルク（Ｓｔａｒｋ）ら、ネイ チ＋　−（Ｎａｔｕｒｅ）２７８　（１９７９）、４７１−４７３；カイレイ（ Ｃａｙｌｅｙ）ら、バイオケミカル・アンド・バイオフィンカル・リサーチ・コ ミューニケー／ヨンズ（Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏ ｏｎ、）１０８　（１９８２）、１２４３−１２５０＋ｏ−レンス（Ｌａｕｒｅ ｎｃｅ）ら、プロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイ エンシズ（Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、）ＵＳＡ、８１　（１９８４）、２３２２−２ ３２６）。

植物においては、その産生がウィルス感染によって刺激される抗ウイルス因子（ ＡＶＦ）が不完全ながら精製され、その遺伝子はヒト・β−インターフェロンに 相同であるらしい（セラ（Ｓｅｌａ）ら、ウィルスに対する植物の耐性（Ｐｌａ ｎｔｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ　ｔｏ　Ｖｉｒｕｓｅｓ）　：チバ（Ｃｉｂａ）ソン ボンウムＮｏ、１３３　（１９８７）、１０９−１１９）。タバコモザイクウィ ルス（ＴＭＶ）が感染したタバコ・プロトプラストをヒト・インターフェロンで 処理すると、ＴＭＶ−複製が抑制される（セラ（Ｓｅｌａ）、メソッズ・インー エンサイモロノー（ｉｌｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）、１１９ 　（１９８６）　、７４４−７５２）。さらに、２．５Ａはタバコ植物において ＴＭＦ複製を抑制し得ることが示されている（デバシュ（Ｄｅｖａｓｈ）ら、ジ ャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ 、）、２５９（１９８４）　、３４８２−３４８６）。また、ヒト・２．５Ａン ンテターゼに相同なりＮＡ配列もタバコのゲノミックＤＮＡで見い出されている （セラ（Ｓｅｌａ）（１９８７）、前掲）。

しかしながら、哺乳動物における２、５Ａオリゴアデニル酸経路の一部である２ 、５Ａ依存性ＲＮアーゼは、技術水準において、植物ではいまだ報告されていな い。これから、２．５Ａは２，５Ａ依存性エンドヌクレアーゼを介して植物にお いてウィルス感染を抑制しないと結論される（デバンユ（Ｄｅｖａｓｈ）、バイ オケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）２４　（１９８５）　、５９３　 ５９９）。

さらに、トランスジェニック植物で産生されたインターフェロンはウィルス増殖 を抑制しないことが報告されている（ドウ・セオテン（Ｄｅ　Ｚｅｏｔｅｎ）ら 、パイロロジー（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）１７２　（１９８９）　、２１３−２２２ ）。

要約すると、先行技術は、該２．５Ａオリゴアデニル酸経路が、複数ウィルス耐 性を示すトランスジェニック植物を構築するための基礎として使用できるという 結論を許容していない。

かくして、本発明の技術上の問題点は、該２．５Ａオリゴアデニル酸経路の一部 を用いて、複数ウィルス耐性を示すトランスジェニック植物を提供することであ る。

前記技術上の問題点に対する解決は、請求の範囲でその特徴が述べられる具体例 を提供することによって達成される。

本発明の１の目的は、２，５Ａンンテターゼ活性を有する少な（とも１つのポリ ペプチドをコードする遺伝子工学により作成されたＤＮＡ配列を含有し、ここに 、該ポリペプチドは、発現に際し、ウィルスＲＮＡの分解を引き起こすエンドヌ クレアーゼを活性化できるという複数ウィルス耐性を示すトランスジェニック植 物に関する。

「複数ウィルス耐性」なる語は、ポテックスー、カーラーおよびトバモウィルス のごとき種々のウィルス群に対して実質的に耐性であるトランスジェニック植物 をいう。

「遺伝子工学により作成されたＤＮＡ配列」なる語は、組換えＤＮＡ法のごとき 遺伝子工学法によって操作されたＤＮＡ配列をいう。

「２．５シンテターゼ活性を有するポリペプチド」なる語は、２′、５−ホスホ ジエステル結合によって結合されたアデニレートのトリマーであって、その５゜ −末端が脱リン酸化された２、５Ａ３のごとき、３ｇまたはそれを超えるアデノ メン残基をもつ５′　−説リン酸化もしくはリン酸化された２、５−オリゴヌク レオチドを酵素的に合成できるいずれのポリペプチドをもいう。

「ウィルスＲＮＡの分解を引き起こすエンドヌクレアーゼ」とは、酵素的切断に よってウィルスＲＮＡを分解できる同種または異種エンドヌクレアーゼをいう。

該エンドヌクレアーゼは、２，５Ａンンテターゼ活性を有するポリペプチドによ って合成された２、５Ａによって活性化される。

本発明の好ましい具体例において、該ＤＮＡ配列または該ＤＮＡ配列の少な（と も一部は該トランスジェニック植物に対して同種または異種である。

本発明のさらなる具体例において、該ＤＮＡ配列はキメラＤＮＡ配列である。

本発明のさらなる好ましい具体例において、該ＤＮＡ配列は、さらに、少なくと も１つの選択可能マーカーおよび／または該エンドヌクレアーゼのごとき少な（ とも１つのさらなるポリペプチドをコードする。

本発明の好ましい具体例において、該ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列は、 哺乳動物遺伝子、植物遺伝子または微生物遺伝子に由来するものであるが、ある いは合成遺伝子である。

本発明の特に好ましい具体例において、該ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列 は、ラット・２．５Ａシンテターゼ遺伝子である（第１図参照）。

本発明の好ましい具体例において、該エンドヌクレアーゼは植物ＲＮアーゼしで ある。

該ポリペプチドの発現は、植物で機能し、該ポリペプチドの発現を誘導および／ または増大できる誘導性または構成的プロモーターの制御下にある。かがるプロ モーターの例は、カリフラワーモザイクウィルスの３５Ｓプロモーター、コメ・ アクチンプロモーター、異なる種からのｒｂｃ　Ｓプロモーター、アブロバフタ −（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒ）　Ｔ　Ｒ２’　プロモーター、ファゼオリン遺伝子 プロモーターまたはＮＯＳプロモーターである。本発明の好ましい具体例におい て、２．５Ａ合成ポリペプチドの発現は、カリフラワーモザイクウィルスの３５ Ｓプロモーターの制御下にある。

トランスジェニック植物は単子葉植物または双子葉植物である。本発明の好まし い具体例において、該植物はタバコ、コメ、小麦、大麦、トウモロコシ、トマト 、キュウリ、大豆、サツマイモ、ブドウ、ナタネ、テンサイ、綿、茶、ヒマワリ 、イチゴ、バラ、サクランボ、トウガラシまたはジャガイモである。

本発明のさらなる目的は、複数ウィルス耐性を示すトランスジェニック植物に由 来する増殖材を提供することにある。「増殖材」なる語は、根、茎、葉、カルス 、プロトプラスト懸濁培養および種子のごとき完全な植物体または分化もしくは 未分化植物組織をいう。

本発明のさらなる目的は、２，５Ａシンテターゼ活性を有する少なくとも１つの ポリペプチドをコードする遺伝子工学により作成されたＤＮＡ配列を適当な植物 体の遺伝物質に導入することよりなる、複数ウィルス耐性を示すトランスジェニ ック植物の生産方法を提供することにある。

「遺伝物質」なる語は、植物細胞の核ゲノム、植物細胞のオルガネラのゲノムま たは染色体外形態をいう。

「導入する」なる語は、該遺伝子工学により作成された該ＤＮＡ配列を、植物細 胞の該遺伝物質に導入できる方法をいう。該方法の好ましい例は、アグロバクテ リウム媒介移入、植物ウィルス媒介移入、マイクロインジェクション、マイクロ ブロンエフタイル衝撃（ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ　ｂｏｍｂａｒｄｍｅ ｎｔ）、エレクトロポレーション、ＰＥＧ−媒介形質転換およびウィルスをベー スとする安定なベクターでの植物プロトプラストの形質転換である。

本発明の好ましい具体例において、該ＤＮＡ配列は、該トランスジェニック植物 においてその発現を可能とするプロモーターの制御下にあるベクターに含有され ている。

本発明の特に好ましい具体例において、該ベクターは、ブダペスト条約の要件ニ 従い、ＤＳＭ６８１５の受託番号の下で、「トイチェ・ザムルング・フィール・ ミクロオルガニスメン（ＤＳＭ）Ｊに寄託されているｐＨＴＴ２−５Ａ＋である 。

本発明のさらなる好ましい具体例において、該導入は、アグロバクテリウム系を 用い、トランスフェクションによって行う。

本発明のさらなる目的は、２，５Ａンンテターゼ活性を有する少なくとも１つの ポリペプチドをコードする遺伝子工学により作成されたＤＮＡ配列の、複数ウィ ルス耐性を示すトランスジェニック植物の生産のための使用である。

１１１Ｄ　＋プラスミドｐＨＴＴ２−５Ａ＋の構築。ラット・２．５Ａシンテタ ーゼ遺伝子ｃＤＮＡを含有するＥｃｏＲＩ断片をプラスミドｐＳＫ２−５Ａ’か ら切り出し、粘着末端を満たし、得られた断片をＢａｍＨＩリンカ−を用いてベ クターｐＨＴＴ２０２のＢａｍＨ］部位に結んだ。この結果、ＣａＭＶ３５Ｓプ ロモーターの制御下にあるラット・２，５Ａシンテターゼ遺伝子を含有するベク ターｐＨＴＴ２−５Ａ＋が得られる。

＊２１Ｄ：２，５Ａンンテターゼ遺伝子で形質転換したトランスジェニック・タ バコ植物からの全ＲＮＡのノーザンプロット分析。レーン当たり合計１０μｇＲ ＮＡを［０−ｐ］標識２．５ＡシンテターゼｃＤＮＡでプローブした。レーン１ −５は、トランスジェニックタバコ系であり、レーン６はラット・２，５Ａシン テターゼｃＤＮＡである。

ｊ＊３［ｉ＞　：小麦胚芽エキスにおけるＴＭＶ　ＲＮＡのｉｎ　ｖｉｔｒｏ翻 訳に対する１ｇＭ２．５Ａトリマー（Ａ）およびテトラマー（Ｂ）の異なってリ ン酸化された形態の影響。ＴＭＶ−ＲＮＡ　Ｏ，８ｇｇをｉｎ　ｖｉｔｒｏで翻 訳し、試料５μｍから得られた［”Ｓ］標識蛋白をガラス繊維フィルター上に沈 澱させ、次いで、取り込まれた放射能を測定した。・−２，５Ａ　無し、０−ｐ ｐｐＡ−１■−ｐｐＡ、、ロー　ｐＡ、、△−Ａ５、ム一　ＲＮＡ無し。

！１星：小麦胚芽エキスにおけるＴＭＶ　ＲＮＡ分解速度に対する異なる２゜５ Ａ）リマーの影響。１ｇＭ２．５Ａトリマーを含有する小麦胚芽エキスの試料か らＴＭＶ−ＲＮＡを単離し、ノーザンプロットに付し、　［”Ｐｌ標識ＴＭＶ− ｃＤＮＡとでハイブリダイズさせた。ＲＮＡの量をレーザーデンントメーターに よってオートラジオグラフィーから評価した：肩−２，５Ａ無し、０−ｐｐｐＡ ３、・−Ａ、。

！互奥：植物細胞エキス蛋白への２．５Ａの結合。［３２Ｐ］標識２，５Ａを、 Ｎａ１Ｏ＜−酸化法によって、細胞抽出物の蛋白に共有結合架橋させ、１２％５ ＤＳ−ＰＡＡＧｉｔ気泳動で分離した。レーン１は（サムプルツク（Ｓａｍｂｒ ｏｏｋ）らの「モレキュラー・クローニングニア・ラボラトリ−・マニュアル（ ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：＾Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ） Ｊ　、コールド・スプリング＋ハーバ−・ラボラトリ−・プレス（Ｃｏｌｄ　Ｓ ｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ）　（１９８９ ）に従って調製した）ウサギ・網状赤血球溶解物であり、レーン２は未標識２゜ ５Ａを有するマウスＬ−細胞抽出物であり、レーン３はマウスＬ−細胞抽出物で あり、レーン４はウサギ・網状赤血球溶解物（アメルスハム（＾ｍｅｒｓｈａａ ＋））であり、レーン５はジャガイモ葉抽出物であって、レーン６は未標識２． ５Ａを有するジャガイモ葉抽出物である。

第６図：タバコ・プロトプラストにおける蛋白合成に対する２、５Ａトリマー「 コア」の影響。［＋４０］標識蛋白加水分解物をタバコ・プロトプラスト培養に 添加し、細胞の合計放射能を測定した二・−２，５Ａ無し、Ｏ−１μＭ　Ａ、。

第７図：２．５Ａシンテターゼ遺伝子を含有するトランスジェニック・り／くコ 植物におけるＰＶＸの増殖。完全植物体を１０μｇ／ｍｌ　ＰＶＸで感染さ上葉 試料を、２１ＸＤ２抗体および２１ＸＤ２ユ一ロピウム複合体を用いてＴＲＦＩ Ａによって分析した。ウィルス濃度は１秒当たりのＥｕ蛍光の計数によって測定 した：・−ＳＲＩ対照、Ｏ−４Ｎ１、ロー　４Ｎ５、＋−４Ｎ１１、植物におけ るＰＶＳの増殖。完全な植物体を１０μｇ／ｍｌ　ＰＶＳで感染させ、葉試料を 、５４Ａ４抗体および５４Ａ４ホ一スラデイツンユペルオキシダーゼ複合体を用 いてエライヤ法によって分析する。ウィルス濃度は４５０ｎｍにおける発色反応 の光学密度によって測定した：ｏ−ＳＲＩ対照、ロー　「センス」方向に２．５ Ａシンテターゼ遺伝子を有するトランスジェニック植物、−一エライザ法バック グラウンド。

第９図：２．５Ａノンテターゼ遺伝子を含有するトランスジェニック植物の葉デ ィスクにおけるＰｖｘの増殖。葉を１０μｇ／ｍｌ　ＰＶＸで感染させ、８ｍｍ 直径のディスクをパンチにて得て、滅菌水中に保った。該ディスクをＰＶｘを感 染させた完全な植物体として分析した（第７図参照）　・−ＳＲＩ対照、Ｏ−４ Ｎ１０、十−４Ｎ１２゜ 第１０図：２．５Ａジンテターセ遺伝子を含有するフィールドで成長させたトラ ンスジェニック・ジャガイモ植物におけるウィルス濃度（ＰＶＸ）。完全な植物 体を、ＰＶＸ感染タバコ植物体から収集した樹液流動体で感染させた。葉試料を 、ＰＶＸについての免疫診断キット（ベーリンガー・マン／　％　イム（Ｂｏｅ ｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ））を用い、エライヤ法によって分析する。４ ０５ｎｍにおける発色反応の光学密度によってウィルス濃度を測定した。対照＝ 対照クロー゛／、Ｒ１０１、Ｒ１０２、Ｒ１０４、Ｒ１０６、Ｒ１０７、Ｒ２− トランスジェニック・クロー以下の実施例は本発明を説明する。適用される分子 生物学的方法のさらなる説明は、サムプルツク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）らの「モレ キュラー・クローニングニア・ラボラトリ−・マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ 　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ）Ｊ　、前掲、に 見い出される。

マウス・２，５ＡンンテターゼｃＤＮＡをプローブとして用い、アメルスハム（ ＾ｍｅｒｓｈａｍ）プロトコルに準じ、ラット・２．５ＡンンテターゼｃＤＮＡ をベクターλｇｔｌＯ中のラット海馬ｃＤＮＡライブラリーから単離した。ｐＢ １ｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ＋　（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））発現 ベクターのＥｃｏＲ１部位にｃＤＮＡをサブクローンした。得られたプラスミド をｐＳＫ２−５Ａと命名した。

タバコ植物の形質転換については、ラット・２．５ＡシンテターゼｃＤＮＡを植 物発現ベクターｐＨＴＴ２０２にサブクローンした。ｃＤＮＡをＥｃｏＲＩによ ってｐＳＫ２−５Ａから切り出し、粘着末端を満たし、該ｃＤＮＡを、合成りａ ｍＨＩリンカ−を用いて、ＢａｍＨＩて直線化したｐＨＴＴ２０２にクローンし た（第１図）。得られたプラスミドｐＨＴＴ２−５Ａ＋を用いてアグロバクテリ ウム細胞を形質転換した。

Ｂ　プラスミドｐＨＴＴ２−５Ａ＋でのアグロバクテリウムの形質転換プラスミ ドｐＨＴＴ２０２は多くをプラスミドｐＢＲ３２２配列をベースとするものであ る。ｐＢＲ３２２をベースとするクローニングベクターは、通常、宿主細胞から もう１つのバクテリウムへ移動しないが、「移動化のベース」となるｂｏｍ部位 を含有する。ヘルパープラスミドのｍｏｂ遺伝子によってコードされる「ヘルパ ー」機能が与えられると、該ｐＢＲ３２２をベースとするクローニングベクター もまた移動可能となる。この目的には、ファン・ノ１ウテ（Ｖａｎ　Ｈａｕｔｅ ）ら、ＥＭＢＯＪ、、２　（１９８３）、４１１−４１７）によって記載されて いる系に基づ（二親性交配（ｂｉｐａｒｅｎｔａｌ　ｍａｔｉｎｇ）を用いる。

プラスミドｐＨＴＴ２−５Ａ＋　（ａｍｐ’、ｓｐｃ／ｓ　ｔ　ｒ”）を含有す るイー・コリ（Ｅ、Ｃｏ１１）を、必要なｔｒａ機能のためのＩａ−型プラスミ ドＲ６４ｄｒｄ１１Ｄｅｔ’、ｓｔｒ’）、およびｐＢＲをベースとするｍｏｂ 　ｂｏｍ”プラスミドの伝達を補足するｉｎ　ｔｒａｎｓのｍｏｂ機能を提供す る第２のヘルパープラスミドｐＧＪ２８（ｋａｎ’、ｎｅＯ１＋）を含有するイ ー・コリ・ヘルパー株ＧＪ２３とでＬ−プレート上で接合させた。

ヘルパープラスミドを持つ細胞を、アンピンリン、テトラサイクリンおよびカナ マイシンを含有するし一プレート上で選択した。これらの細胞を、Ｔｉ−プラス ミドｐＧＶ２２６０　（ｒ　ｉ　ｆ”、ｃｂＲ）を含有するアグロバクテリウム ・チュメファノエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ ）株Ｃ５８Ｃ１と共にＬ−グロス中で共培養したが、ここに、植物細胞において 腫瘍化の原因となる遺伝子はｐＢＲ３２２配列によってすでに置き換えられてい る。複合化アグロバクテリウム（＾ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｕ）細胞を、リファ ンピノン、スペクチノマインンおよびストレプトマイシンを含有するプレート上 で選択した。ｐＢＲ３２２をベースとするベクターは、アグロバクテリウムで複 製できず、ｐＧＶ２２６０およびｐＨＴＴ２０２のｐＢＲ３２２−配列の間での 組換えが統合化分子の形成を導いたアゲロバクチリアのみが選択的プレートで増 殖できる。組換えプラスミドのＴ−ＤＮＡが２．５Ａンンテターゼ遺伝子を含有 することを確認するために、得られたアゲロバクチリアの全ＤＮＡを単離しくデ ーゼ（Ｄｈａｅｓｅ）ら、ヌクレイツク・アシズ・リサーチズ（Ｎｕｃｌ　＾ｃ ｉｄｓ、　Ｒｅｓ、）、７、（１９７９）、１８３７−１８４９）、サザーンブ ロツティング法によって分析した。

実施例２ ２．５−Ａンンテターゼ遺伝子によるタバコ植物の形質転換トランスジェニック ・ニコチアナ・タバカム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ　ｔａα＋ｃｕｍ）　Ｓ　Ｒ１植 物はアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）を介する移入により得 られた（ツアムブリスキー（Ｚａｍｂｒｙｓｋｉ）、アニュ・レブ・ゼ不ソト（ ＾ｎｎｕ、　Ｒｅｖ、　Ｇｅｎｅｔ、　）、第２２巻、（１９８８年）、第１頁 〜第３０頁）。この方法はアグロバクテリウムが傷ついた植物細胞に接触した際 にそのＴビブラスミトのセグメントを植物ゲノム中に安定に移入する現象に基づ いている。”Ｔ−ＤＮＡ”と呼ばれるこのセグメントはその保存された境界配列 により範囲が定まる。境界配列間の遺伝情報はＴ−ＤＮＡの移入の効率に影響す ることなく置換することができる。

タバコ植物の２．５−Ａシンテターセ遺伝子による形質転換は、ホルシュ（Ｈａ ｒｓｈ）らの、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、第２２７巻、（１９８５年）、 第１２２９頁〜第１２３１頁に準じて行った。ＭＳ／２培地上仏ラシゲとスクー グ（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ　ａｎｄ　Ｓｋｏｏｇ）　、フイズ・プラント（Ｐｈｙ ｓ、　Ｐｌａｎｔ）　、第１８巻・（１９６２年）、第４７３頁〜第４９７頁） で無菌状態、２４℃において１６時間−の明期て成育した植物から得られたエヌ 、タバカムＳＲＩの葉を、Ｒ３−４００ｍＭショ糖培地（ナノ−とマリガ、ゼッ ト（Ｎａｇｙ　ａｎｄ　Ｍａｌｉｇａ、Ｚ）、フランツエンフインオロギー（Ｐ ｆｌａｎｚｅｎｐｈｙｚｉｏｌ、　）　、第７８巻、（１９７６年）、第４５３ 頁〜第４５５頁）中上王道に置き、全ての角が切られるように０．５ないし１ｃ ｍ２の断片に切った。Ｍ９最小培地（サムプルツク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）らのご モレキュラー・クローニング、ア・ラボラトリ−’？　ニュアル”（”Ｍｏ１ｅ ｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、　Ａ　ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ”、前 掲））上に増殖させたコインテグレート（ｃｏｉｎｔｅｇｒａｔｅ）Ｔ−ＤＮＡ を持つアグロバクテリウムをに３−４００ｍＭショ糖培地に添加し、皿を３日間 植物に対するのと同じ条件においた。葉の円盤（ディスク）を洗浄し、アグロバ クテリウムを殺すためにクラホランを、また葉の円盤からの新芽を誘導するため にベンジルアミノプリン（ＢＡＰ）を、そしてｐＧＶ２２６０中のＴ−ＤＮＡ中 でコインテグレートされるプラスミドｐＨＴＴ２−５Ａ＋断片もまたトランスジ ェニック細胞にカナマイシン耐性を付与するｎｏｓ−ｎｐｔ２遺伝子を含むので 、形質転換した細胞を選択するためにカナマイシンを含む固体ＬＳ培地（リンス 、イア−とスクーグ（Ｌｉｎｓｍａｉｅｒ　ａｎｄ　Ｓｋｏｏｇ）　、フィズ・ プラント（ＰｈｙｓＰｌａｎｔ、　）、（１９６５年）、第１００頁〜第１２７ 頁）に上下逆さまにして移した。

新芽が見られた後、これを切りＢＡＰを含まない同様の培地に根付かせた。十分 に根付いた植物を前述した条件下でＭＳ／２培地上に放置した。

植物が本当に形質転換体であることを確かめるために、葉組織からの全ＤＮＡお よびＲ，ＮＡを、各々、デラボルタ（Ｄｅｌｌａｐｏｒｔａ）らの、プラント・ モレキュラー・バイオロジー・リポータ−（Ｐｌａｎｔ　Ｍｏｌ、　Ｂｉｏｌ、 　Ｒｅｐ、　）、第１巻、（１９８３年）、第１９頁〜第２１頁およびバーボー ド（Ｖｅｒｖｏｅｒｄ）らの、ヌクレイツク・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌ、 ＾ｃｉｄｓ　Ｒｅｓ、　）、第１７巻、（１９８９年）、第２３６２頁に準じて 単離した。サザーンおよびノーザンブロッティング分析を、［３２ｐ］でラベル した２、５−ＡシンテターゼｃＤＮＡをプローブとして用い、アマジャム（Ａｍ ｅｒｓｈａｍ）のプロトコルに準じて行った（第２図）。

コムギ胚芽抽出物（ＷＧＥ）中でのタバコ・モザイクウィルス（ＴＭＶ）インビ トロ翻訳による異なる２、５オリゴアデニル酸形の影響の研究により、２，５Ａ のリン酸化されていないトリーおよびテトラマーはＷＧＥ中でのタバコ・モザイ クウィルスＲＮＡ翻訳を効率的に阻害し得ることが示される（第３図）。２．５ Ａの存在および不存在下でのインビトロ翻訳中のタバコ・モザイクウィルスＲＮ Ａの分解速度は、トーク（Ｔｏｏｔｓ）ら、モレキュラー・バイオロジー（ニー ニスニスアール・イン・イングリッシュ・トランスレーション（Ｍｏ１．　Ｂｉ ｏｌ、　（ＵＳＳＲｉｎ　ＥｎｇｌｉｓｈＴｒａｎｓｌａｔｉｏｎ））、第２２ 巻、（１９８８年）、第１４７３頁〜第１４８１頁に述べられているように翻訳 混合物から試料を採取し、ＲＮＡを単離することにより分析した。アガロース／ ホルムアミドゲル中での電気泳動およびノーザンブロツティングの後、試料中の ＲＮＡの濃度を、レーザーデンシトメーターを用い［３２ｐ］でラベルしたフィ ルターのオートラノオグラムをスキャンすることにより推定した。

２．５Ａトリマー°コア“の添加によりタバコ・モザイクウィルスＲＮＡの急速 な分解が引き起こされた一方で、タバコ・モザイクウィルスＲＮＡの分解速度は 三リン酸化２，５Ａの存在下および非存在下における対照実験におけるそれより も大変低かった（第４図）。結論として、植物無細胞抽出液中でのインビトロ翻 訳に対する２、５Ａ”コア“の阻害効果は基質ＲＮＡの急速な分解により引き起 こされる。

植物抽出物中における２、５Ａ結合タンパクを同定するために、ナイト（Ｋｎｉ ｇｈｔ）らによる、メソッズ・インーｘンサイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ 　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）、第７９巻、（１９８１年）、第２１６頁〜第２２７ 頁に述べられているように２，５Ａを［３２Ｐ］ｐＣｐに連結した。［３２ｐ］ でラベルした２、５Ａはレシュナー（ｌｒｅｓｃｈｎｅｒ）らによる、ヨーロピ アン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅ ｍ、　）、第１２４巻、（１９８２年）、第２６１頁〜第２６８頁に準じてＮａ ＩＯ４酸化法によりジャガイモ細胞抽出物のタンパクと共有的に架橋させた。結 合の特異性はラベルされていない２．５Ａを反応混合物に過剰に添加した状態で の競合アッセイにおいて制御した。反応混合物を１２％５ＤＳ−ポリアクリルア ミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により分離した。

ラベルした２、５Ａに特異的に結合したジャガイモ抽出物中で７０ｋＤのタンパ クが同定された（第５図）。結合の特異性は、ジャガイモ抽出物中でラベルされ ていない２．５Ａが完全に［３２Ｐ］２゜５Ａで置換された状態での競合アッセ イに示された（第５図）。

コムギ胚芽抽出物中でのインビトロ翻訳の２，５Ａで誘導される阻害はタバコ・ モザイクウィルスＲＮＡの急速な分解により引き起こされるので、植物抽出物か らの７０ｋＤ２．５Ａ−結合タンパクは２，５Ａで活性化される植物のエンドリ ボヌクレアーゼである。

エヌ　タバカムＳＲＩプロトプラスト中でのタンパク合成に対する２、５Ａの影 響もまた試験された。プロトプラストは無菌条件下で生長した植物の葉のメソフ ィルから、ホンカネン（Ｂｏｎｋａｎｅｎ）らの、”熱帯穀物改良におけるバイ オテクノロジー−国際バイオテクノロジーワークンヨツブにおける進歩“（”Ｂ ｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｉｎ　ｔｒｏｐｉｃａｌ　ｃｒｏｐ　ｉｍｐｒｏｖｅ ｍｅｎｔ：ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａ ｌｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　ｗｏｒｋｓｈｏｐ”）、（１９８８年）に準じ て得られ、Ｋ３−４００ｍＭシタ糖培地に維持された。［＋４（：］でラベルし たアミノ酸加水分解物の添加後、デノボ合成されたタンパクの濃度を分析するた めに試料をプロトプラスト混合物から集めた。タンパクをトリクロロ酢酸で沈澱 させ、取り込まれた放射能を測定した。

２．５Ａはタバコプロトプラスト中のタンパク合成を効率的に阻害しく第６図） 、インビボの植物の系におけるタンパク合成の阻害剤としての２，５Ａの働きを も示唆する。

ジャガイモとタバコにおいて２．５Ａ依存性ＲＮアーゼ活性が同定されたことよ り、植物において、ウィルス耐性を引き起こす哺乳動物のインターフェロンによ り誘導される代謝経路と部分的に類似した代謝経路があることが結論付けられる 。

２．５Ａンンテターゼを発現しているトランスジェニック植物における異なるウ ィルスの増殖を試験するために、様々な感染実験を行なった。ＭＳ／２培地上に 生長している植物を感染前２週間土壌に移した。感染のために、２ないし３枚の 低いところの葉をカーボランダムで処理し、１０μｇ／ｍｌのウィルスを手で葉 の表面に接種して、カーボランダムを３０分後に滅菌水で洗い流した。植物を１ か月間１６時間の明期のもとに置いた。試料を、小さい最上部の葉の一枚を５日 毎に集め、液体窒素中で凍結させることによって収集した。

葉の試料に、葉の１ｇ当たり１ｍｌのイムノアッセイ緩衝液を添加し、乳鉢中で ホモヶナイズした。ジャガイモ・ウィルスＸ（ＰＶＸ）の検出のために、ソーバ ー（Ｓｏｂｅｒ）らの、ジャーナル・オブ・ゼネラル・バイオロジー（Ｊ、　ｇ ｅｎ、　■１ｒｏｌ、　）、第６９巻、（１９８８年）、第１７９９頁〜第１８ ０７頁およびジニエルブ（Ｓｉｎｉｊａｒｖ）らの、ツヤ−ナル・オブ・ゼネラ ル・バイオロジー（Ｊ、　ｇｅｎ、　Ｖｉｒｏｌ、　）、第６９巻、（１９８８ 年）、第９９１頁〜第９９８頁に記載されているごと（、モノクローナル抗体２ １ＸＤ２および時間分解蛍光イムノアッセイ（ＴＲＦｒＡ）の技術をそれぞれ使 用した。ＰｖＳの濃度はモノクロ−ナル５４Ａ４抗体を用いてジアルデヒドデン ブンーエライザ法（ＤＡＳ−ＥＬＩＳＡ）により測定した（Ｓｉｎｉ　ｊａｒｖ ）ら、１９８８年、前掲）。

１０μｇ／ｍｌのジャガイモ・ウィルスＸによる１か月の感染後、全てのトラン スジェニック植物は検出可能なレベルのジャガイモ・ウィルスＸを含んでいたが 、ウィルスの濃度は対照の植物におけるそれよりもずっと低かった（第７図）。

更に、これらの植物において、ジャガイモ・ウィルスＸの検出できる増殖は対照 の植物におけるそれよりも工ないし２週間遅く始まった。

１０μｇ／ｍ＋のジャガイモ・ウィルスＳによる１か月の感染後、全てのトラン スジェニックジャガイモの系は、ジャガイモ・ウィルスＳによる感染に対しトー タルで耐性を示し、どのような検出可能なレベルのジャガイモ・ウィルスＳもほ とんど含まなかった（第８図）。

葉の円盤のジャガイモ・ウィルスＸによる感染と、付加的にタバコ・モザイクウ ィルスによる感染を行った。トランスジェニック・タバコの葉を前述したように 感染させた。直径８ｍｍの円盤を葉からバンチして切り取り、滅菌水中２４℃で １．６時間の明朗のもと５日間上下逆さまに置いた。円盤を液体窒素中で凍結さ せ、ホモゲナイズしｔ：。１０μｇ／ｍｌのジャガイモ・ウィルスＸによる感染 も、無傷の植物に対し同様の結果を与えた。幾つかのトランスジェニック・タバ コの系の葉の円盤はウィルスをより少なく含み、ジャガイモ・ウィルスＸの検出 できる増殖は無傷の植物のそれより大変早（始まった。感染後５日における葉の 円盤中でのタバコ・モザイクウィルスの濃度により、対照の植物と比較してウィ ルスの増殖の明らかな阻害が示された。

２．５Ａンンテターゼを発現しているトランスジェニック・タバコＳＲ１植物中 の２．５Ａａ度を検出するために、ウィルスの感染したあるいは感染していない 葉の抽出物を調製した。２．５Ａ［”Ｐ］ｐＣｐを用いて植物抽出物からのラベ ルしていない２，５Ａの競合アッセイを行った。マウスのし細胞抽出物を２．５ Ａ−結合エンドリボヌクレアーゼＬ（ＲＮａｓｅ　Ｌ）の供給源として用いた。

ラヘ゛ルされた２、５Ａ、Ｌ細胞抽出物および葉の抽出物を水上９０分インキュ ベートした。混合物からのタンパクをニトロセルロースフィルター上に沈澱させ 、フィルターおよび＃液の放射能をカウントした。植物抽出物を含まない混合物 を陽性の対照として使用し、１０”Ｍのラベルされていない２．５Ａトリマーが 完全に、ラベルされた２、５Ａに置き換えられた混合物を陰性の対照として用い た。

これらの結果により、２，５Ａンンテターゼを発現している、非感染トランスジ ェニック植物は、対照植物および２．５Ａンンテターゼ遺伝子をアンチセンスの 向きに持つトランスジェニック植物のそれと同様の２．５Ａの低い（もしあると しても）検出可能量ををすることが示される（第１表）。これは、２，５Ａンン テターゼが二本鎖ＲＮＡにより活性化され得る不活性な酵素として発現している からである。２，５Ａシンテターゼを発現しているトランスジェニック植物をジ ャガイモ・ウィルスＸに感染させた場合、２．５Ａは検出可能となり、その細胞 内濃度は対照の混合物中のそれよりもさらに高かった。そのような２，５Ａの増 加はＳ　Ｒ，１対照植物においては検出されなかった。トランスジェニック植物 中の２．５への増加の結果、ジャガイモ・ウィルスＸの増殖、ジャガイモ・ウィ ルスＳの増殖、およびタバコ・モザイクウィルスの増殖が阻害される。

第１表 結論として、ジャガイモ・ウィルスＸ　ＲＮＡの二本鎖複製中間体は、不活性な ２，５Ａシンテターセを活性化することができ、この活性化の結果、細胞内２． ５Ａが合成される。

２．５Ａシンテターゼ遺伝子を含む無傷のタバコ植物を、ジャガイモ・ウィルス Ｘに感染したタバコ植物から集めた樹液により感染させ、野外で成育させた。

葉の試料は感染′ｄｋ５週間目週間子ガイモ・ウィルスＸのための免疫診断キッ ト（ベーリンガー・マンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｒ＋ｈｅｉｍ） ）を用いて、エライザ法により分析した。ウィルス濃度は４０５ｎｍにおいて発 色の吸光度により測定した（第１０図参照）。

２．５Ａシンテターゼ遺伝子を含む植物中のジャガイモ・ウィルスＸの濃度は対 照の植物と比べ猛烈に低下した。

Ｆｉｇ、１ Ｆ工Ｇ、２ σ ロー ｉｇ−４ ０．５　１．Ｏｉ、５　２．０ 時間（時間） Ｆｉｇ、６ ｓｄり　°ロヨ Ｘ某飾妥４〉４工 ｓｄフ　°ｎヨ 、ａ、−−−、，５，、−、、ＰＣＴ／ＥＰ　９２１０２２１７フロントページ の続き （７２）発明者　トウルヴ工、エルッキエストニア、ニー・ニー００２６、タリ ン、アカデミアク旙 （７２）発明者　テーリ、チーム フィンランド、０２１８０ニスポー、ポルッティティエ１３べ一番

Claims (13)

【特許請求の範囲】
1. １．２．５Ａシンテターゼ活性を有する少なくとも１つのポリペプチドをコード する遺伝子工学により作成されたＤＮＡを含有し、該ポリペプチドは、発現に際 し、ウイルスＲＮＡの分解を引き起こすエンドヌクレアーゼを活性化できること を特徴とする複数ウイルス耐性を示すトランスジエニツク植物。
2. ２．該ＤＮＡ配列が異種ＤＮＡ配列である請求の範囲第１項記載のトランスジエ ニツク植物。
3. ３．該ＤＮＡ配列がキメラＤＮＡ配列である請求の範囲第１項または第２項記載 のトランスジエニック植物。
4. ４．該ポリペプチドの暗号配列が哺乳動物遺伝子、植物遺伝子または微生物遺伝 子に由来するか、あるいは合成遺伝子である請求の範囲第１項ないし第３項いず れか１項に記載のトランスジエニツク植物。
5. ５．該ポリペプチドの暗号配列がラット・２，５Ａシンテターゼ遺伝子である請 求の範囲第１項ないし第４項いずれか１項に記載のトランスジエニツク植物。
6. ６．該ポリペプチドの発現が、誘導的もしくは構成的プロモーターの制御下にあ る請求の範囲第１項ないし第５項いずれか１項に記載のトランスジエニツク植物 。
7. ７．タバコ、コメ、小麦、大麦、トウモロコシ、トマト、キユウリ、大豆、サツ マイモ、ブドウ、ナタネ、テンサイ、綿、茶、ヒマワリ、イチゴ、バラ、サクラ ンボ、トウガラシまたはジャガイモである請求の範囲第１項ないし第６項いずれ か１項に記載のトランスジエニツク植物。
8. ８．請求の範囲第１項ないし第７項いずれか１項に記載のトランスジエニツク植 物に由来する増殖材。
9. ９．２．５Ａシンテターゼ活性を有する少なくとも１つのポリペプチドをコード する遺伝子工学により作成されたＤＮＡ配列を、適当な植物の遺伝物質に導入す ることを特徴とする請求の範囲第１項ないし第７項いずれか１項に記載のトラン スジェニツク植物の生産方法。
10. １０．該ＤＮＡ配列が、該トランスジエニツク植物におけるその発現を可能とす るプロモーターの制御下にあるベクターに含有されている請求の範囲第９項記載 の生産方法。
11. １１．該ベクターがｐＨＴＴ２−５Ａ＋（ＤＳＭＮｏ．６８１５）である請求の 範囲第１０項記載の生産方法。
12. １２．該導入が、アグロバクテリウム系を用いてトランスフエクシヨンによつて 行われる請求の範囲第９項ないし第１１項いずれか１項に記載の生産方法。
13. １３．２．５Ａシンテターゼ活性を有する少なくとも１つのポリペプチドをコー ドする遺伝子工学により作成されたＤＮＡ配列の、請求の範囲第１項ないし第７ 項いずれか１項に記載のトランスジエーニツク植物を生産するための使用。