DE69231711T2 - Multiple Virus-Resistenz aufweisende transgene Pflanzen und Verfahren zu ihrer Herstellung - Google Patents
Multiple Virus-Resistenz aufweisende transgene Pflanzen und Verfahren zu ihrer HerstellungInfo
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Description
- Diese Erfindung betrifft multiple Virus-Resistenz aufweisende transgene Pflanzen, die eine gentechnisch hergestellte DNA-Sequenz enthalten, welche mindestens ein Polypeptid mit einer 2,5A-Synthetase-Aktivität codiert. Außerdem betrifft diese Erfindung ein Verfahren zur Herstellung der transgenen Pflanzen und der Verwendung der gentechnisch hergestellten DNA-Sequenz.
- Mehrere Methoden zur Konstruktion virusresistenter Pflanzen sind im Stand der Technik beschrieben. Es wurde über die gentechnisch hergestellte Resistenz gegenüber zahlreichen Pflanzenviren berichtet, wobei das Hüllprotein eines jeweiligen Pflanzenvirus in transgenen Pflanzen exprimiert wurde (Beachy et al., Annu. Rev. Phytopathol. 28 (1990), 451-474).
- Auch durch die Expression spezifisch viraler Antisense-RNA in transgenen Pflanzen wurde eine umfangreiche Virus-Resistenz gegenüber mehreren Pflanzenviren gezeigt (Cuozzo et al. Bio/Technology 6 (1988), 549-557; Hemenway et al., EMBO J. 7 (1988), 1273-1280). Die virale Antisense-RNA bewirkt ihre Funktion entweder durch Hybridisierung mit spezifischen viralen DNA- oder RNA-Sequenzen, wodurch weitere Reaktionen, die für die Virusvermehrung wichtig sind, blockiert werden oder durch Ribozymaktivität, die zu einer spezifischen Spaltung viraler RNA nach Hybridisierung mit viraler RNA führt.
- Der wesentliche Nachteil bei den vorstehend erwähnten Methoden zur Konstruktion virusresistenter transgener Pflanzen ist, dass die transgenen Pflanzen nur gegenüber einem Virus oder einer bestimmten Virengruppe resistent sind.
- Der 2,5A-Oligoadenylat-Weg ist Teil des antiviralen Reaktionssystems, das durch Interferone bei Säugerzellen induziert wird (Lengyel, Annu. Rev. Biochem. 51 (1982), 251-282). Man hat wenigstens einige Komponenten des 2,5A-Weges bei Organismen nachgewiesen, die keine Säuger sind, wie Vögel, Reptilien und Amphibien, Insekten, Hefen und sogar Bakterien (Stark et al., Nature 278 (1979), 471-473; Cayley et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 108 (1982), 1243-1250; Laurence et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 81 (1984), 2322-2326).
- Bei Pflanzen wurde ein antiviraler Faktor (AVF), dessen Produktion durch eine Virusinfektion stimuliert wird, teilweise gereinigt, und sein Gen schien zum menschlichen β-Interferon homolog zu sein; Sela et al., in: Plant resistance to Viruses: Ciba Symposium, Nr. 133 (1987), 109-119. Die Behandlung von mit Tabakmosaikvirus (TMV)- infizierten Tabak-Protoplasten mit menschlichem Interferon führte zur Inhibition der TMV-Replikation; Sela, Methods in Enzymology, 119 (1986), 744-752. Außerdem wurde gezeigt, dass 2,5A die TMV-Replikation in Tabakpflanzen inhibieren kann; Devash et al., J. Biol. Chem. 259 (1984), 3482-3486. Man fand auch zur menschlichen 2,5A-Synthetase homologe DNA-Sequenzen in der genomischen DNA des Tabaks; Sela (1987), a.a.O.
- Jedoch wurde bisher im Stand der Technik bei Pflanzen nicht über eine 2,5Aabhängige RNAse berichtet, die Teil des 2,5A-Oligoadenylat-Weges bei Säugern ist. Dies führte zu dem Schluss, dass 2,5A die Virusinfektion bei Pflanzen nicht über eine 2,5Aabhängige Endonuklease inhibiert; Devash et al., Biochemistry 24 (1985), 593-599.
- Außerdem wurde berichtet, dass in transgenen Pflanzen produziertes Interferon die Virusvermehrung nicht inhibiert; De Zoeten et al., Vivology 172 (1989), 213-222.
- Zusammengefasst läßt der Stand der Technik den Schluß nicht zu, dass der 2,5A-Oligoadenylat-Weg als Grundlage zur Konstruktion multipler Virus-Resistenz aufweisender transgener Pflanzen verwendet werden kann.
- Daher liegt das technische Problem der vorliegenden Erfindung darin, eine multiple Virus-Resistenz aufweisende transgene Pflanze bereitzustellen, indem Teile des 2,5A- Oligoadenylat-Weges verwendet werden.
- Das vorstehende technische Problem wird durch die Bereitstellung der in den Ansprüchen charakterisierten Ausführungsformen gelöst.
- Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine multiple Virus-Resistenz aufweisende transgene Pflanze, die eine unter Verwendung gentechnischer Verfahren hergestellte DNA-Sequenz enthält, die mindestens ein Polypeptid mit einer 2,5A-Synthetase- Aktivität codiert, wobei das Polypeptid nach Expression in der Lage ist, eine Endonuklease zu aktivieren, die den Abbau von viraler RNA bewirkt.
- Der Begriff "multiple Virus-Resistenz" bezieht sich auf transgene Pflanzen, die gegenüber einer Vielfalt von Virengruppen, wie Potex-, Carla- und Tobamoviren im wesentlichen resistent sind.
- Der Begriff "genetisch hergestellte DNA-Sequenz" bezieht sich auf eine DNA-Sequenz, die durch gentechnische Methoden, wie rekombinante DNA-Techniken, manipuliert wurde.
- Der Begriff "Polypeptid mit einer 2,5A-Synthetase-Aktivität" bezieht sich auf jedes Polypeptid, das in der Lage ist, 5'-dephosphorylierte oder phosphorylierte 2,5- Oligonukleotide mit drei oder mehr Adenosinresten enzymatisch zu synthetisieren, wie 2,5A3, das ein durch 2',5'-Phosphodiesterbrücken verbundenes und an seinem 5'-Ende dephosphoryliertes Trimer des Adenylats ist.
- Der Begriff "Endonuklease, die den Abbau viraler RNA bewirkt" bezieht sich auf eine heterologe oder homologe Endonuklease, die in der Lage ist, virale RNA durch enzymatische Spaltung abzubauen. Die Endonuklease wird durch ein 2,5A aktiviert, das durch ein Polypeptid mit einer 2,5A-Synthetase-Aktivität synthetisiert wird. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die DNA- Sequenz oder mindestens ein Teil der DNA-Sequenz homolog oder heterolog zur transgenen Pflanze.
- In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die DNA-Sequenz eine chimere DNA-Sequenz.
- In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung codiert die DNA-Sequenz zusätzlich mindestens einen Selektionsmarker und/oder mindestens ein weiteres Polypeptid, wie die Endonuklease.
- In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die das Polypeptid codierende DNA-Sequenz von einem Säugergen, einem Pflanzengen oder einem Mikroorganismengen abgeleitet oder ist ein synthetisches Gen.
- In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die das Polypeptid codierende DNA-Sequenz ein Ratten-2,5A-Synthetase-Gen (siehe Fig. 1).
- In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Endonuklease eine Pflanzen-RNAse L.
- Die Expression des Polypeptids ist unter der Kontrolle eines induzierbaren oder konstitutiven Promotors, der in Pflanzen funktionsfähig ist und eine induzierte und/oder erhöhte Expression des Polypeptids zulässt. Solche Promotoren sind beispielsweise der 35S-Promotor des Blumenkohl-Mosaik-Virus, der Aktin-Promotor aus Reis, der rbc-S- Promotor aus verschiedenen Spezies, der TR2'-Promotor aus Agrobacter, der Promotor des Phaseolingens oder der NOS-Promotor. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Expression des 2,5A-synthetisierenden Polypeptids unter der Kontrolle des 35S-Promotors des Blumenkohl-Mosaik-Virus.
- Die transgene Pflanze ist eine monokotyledone oder eine dikotyledone Pflanze. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die transgene Pflanze Tabak, Reis, Weizen, Gerste, Mais, Tomate, Gurke, Soja, Süßkartoffel, Weintrauben, Raps, Zuckerrübe, Baumwolle, Tee, Sonnenblume, Erdbeere, Rose, Chrysantheme, Paprika oder Kartoffel.
- Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist Vermehrungsmaterial, das von einer multiple Virus-Resistenz aufweisenden transgenen Pflanze stammt.
- Der Begriff "Vermehrungsmaterial" bezieht sich auf intakte Pflanzen oder differenziertes oder undifferenziertes Pflanzengewebe wie Wurzel, Stamm, Blatt, Callus, Protoplast, Suspensionskulturen und Samen.
- Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung einer multiple Virus-Resistenz aufweisenden transgenen Pflanze, das die Einführung einer gentechnisch hergestellten DNA-Sequenz, die mindestens ein Polypeptid mit einer 2,5A-Synthetase-Aktivität codiert, in das genetische Material einer geeigneten Pflanze umfasst. Der Begriff "genetisches Material" bezieht sich auf das Genom im Zellkern einer Pflanzenzelle, dem Genom einer Organelle der Pflanzenzelle oder eine extrachromosomale Form.
- Der Begriff "Einführung" bezieht sich auf eine Methode, die in der Lage ist, die gentechnisch veränderte DNA-Sequenz in das genetische Material einer Pflanzenzelle einzuführen. Bevorzugte Beispiele der Methode sind Agrobacterium-vermittelter Transfer, Pflanzenvirus vermittelter Transfer, Mikroinjektion, Mikroprojektil-Beschuss, Elektroporation, PEG-vermittelte Transformation und Transformation von Pflanzenprotoplasten mit stabilen Vektoren auf Virusbasis.
- In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die DNA- Sequenz in einem Vektor enthalten und unter der Kontrolle eines Promotors, der ihre Expression in der transgenen Pflanze erlaubt.
- In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist der Vektor pHTT2-5A+, der nach den Anforderungen des Budapester Vertrags bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen (DSM) unter der Zugangsnummer DSM 6815 hinterlegt wurde.
- In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird die Einführung mittels Transfektion durchgeführt, wobei das Agrobacterium-System verwendet wird.
- Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung einer genetisch hergestellten DNA-Sequenz, die mindestens ein Polypeptid mit einer 2,5A- Synthetase-Aktivität codiert, zur Herstellung einer multiple Virus-Resistenz aufweisenden transgenen Pflanze.
- Fig. 1: Konstruktion des Plasmids pHTT2-5A+. Das EcoRI-Fragment, das die cDNA des Ratten-2,5A-Synthetase-Gens enthält, wurde aus dem Plasmid pSK2-5A+ herausgespalten, die kohäsiven Enden aufgefüllt, und das erhaltene Fragment wurde in die BamHI-Stelle des Vektors pHTT202 ligiert, wobei BamHI-Linker verwendet wurden. Das führt zum Vektor pHTT2-SA+, der das Ratten-2,SA- Synthetase-Gen unter der Kontrolle des CaMV-35S-Promotors enthält.
- Fig. 2: Northern-Blot-Analyse der Gesamt-RNA aus transgenen, mit einem 2,5A- Synthetase-Gen transformierte Tabakpflanzen. 10 ug Gesamt-RNA pro Spur wurden mit [³²P] markierter 2,5A-Synthetase-cDNA als Sonde versetzt. Die Spuren 1-5 sind transgene Tabaklinien, und Spur 6 ist die Ratten-2,5A- Synthetase-cDNA.
- Fig. 3: Auswirkung unterschiedlich phosphorylierter Formen von 1uM 2,5A-Trimeren (A) und -Tertameren (B) auf TMV-RNA-in vitro-Translation in Weizenkeimextrakten. 0,8 kg TMV-RNA wurden in vitro translatiert, die mit [35S] markierten, aus 5 gl Proben erhaltenen Proteine wurden auf Glasfaser-Filter präzipitiert, und anschließend wurde die eingebaute Radioaktivität gemessen:
- - ohne 2,5A, O - pppAn, - ppAn, - pAn, Δ-An, - ohne RNA.
- Fig. 4: Auswirkung verschiedener 2,5A-Trimere auf die Abbaurate von TMV-RNA in Weizenkeimextrakt. TMV-RNA wurde aus Proben des Weizenkeimextrakts isoliert, die 1 kM 2,5A-Trimere enthielten, einem Northern-Blot unterzogen und mit [32P] markierter TMV-cDNA hybridisiert. Die RNA-Menge wurde anhand von Autoradiogrammen durch einen Laser-Densitometer abgeschätzt: - ohne 2,5 A, O - pppA&sub3;, - A&sub3;,
- Fig. 5: Bindung von 2,5A an Proteine aus Pflanzenzellextrakten. [³²P] markiertes 2,5A wurde covalent an Proteine von Zellextrakten mittels der NaIO&sub4;-Oxidationsmethode quervernetzt und über eine 12%ige SDS-PAAG-Elektrophorese aufgetrennt. Spur 1 ist Kaninchen-Retikulocyten-Lysat (hergestellt nach Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbour Laboratory, Cold Spring Harbour Laboratory Press (1989)), Spur 2 ist Extrakt von Maus-L-Zellen mit unmarkiertem 2,5A, Spur 3 ist Extrakt von Maus-L- Zellen, Spur 4 ist Kaninchen-Retikulocyten-Lysat (Amersham), Spur 5 ist ein Extrakt aus Kartoffelblättern und Spur 6 ist ein Extrakt aus Kartoffelblättern mit unmarkiertem 2,5A.
- Fig. 6: Auswirkung des 2,5A-Trimer-"Kerns" auf die Proteinbiosynthese in Tabakprotoplasten. Ein mit [14C] markiertes Protein-Hydrolysat wurde einer Tabakprotoplasten-Kultur zugegeben und die Gesamtradioaktivität der Zellen gemessen:@-ohne 2,5A, O - 1 gMA3.
- Fig. 7: Vermehrung von PVX in transgenen, das 2,5A-Synthetase-Gen enthaltenden Tabakpflanzen. Intakte Pflanzen wurden mit 10 ug/ml PVX infiziert und Blattproben wurden mittels TRFIA analysiert, wobei 21XD2-Antikörper und 21XD2-Europium-Konjugat verwendet wurden. Die Viruskonzentration wurde durch die Zählung der Eu-Fluoreszenz pro Sekunde bestimmt: - SR1 Kontrolle, O - 4N1, - 4N5, + - 4N11, * - 4N12.
- Fi ur 8: Vermehrung von PVS in transgenen, das 2,5A-Synthetase-Gen enthaltenden Tabakpflanzen. Intakte Pflanzen wurden mit 10 ug/ml PVS infiziert und Blattproben wurden mittels ELISA analysiert, wobei S4A4-Antikörper und S4A4- Meerrettich-Peroxidase-Konjugat verwendet wurden. Die Viruskonzentration wird durch die optische Dichte der Farbreaktion bei 450 nm bestimmt: O - SR1 Kontrolle, - transgene Pflanzen mit 2,5A-Synthetase-Gen in "Sense"- Orientierung, - - ELISA-Hintergrund.
- Fig. 9: Vermehrung von PVX in Blattscheiben der transgenen Pflanzen, die das 2,5A- Synthetase-Gen enthalten. Blätter wurden mit 10 ug/ml PVX infiziert, Scheiben mit einem Durchmesser von Bmm ausgestanzt und in sterilem Wasser aufbewahrt. Die Scheiben wurden wie PVX-infizierte, intakte Pflanzen analysiert (siehe Fig. 7): - SR1 Kontrolle, O - 4N10, + - 4N12.
- Fig. 10: Die Viruskonzentration (PVX) von auf dem Feld angebauten, transgenen Kartoffelpflanzen, die das 2,5A-Synthetase-Gen enthalten. Intakte Pflanzen wurden mit Pflanzensaft infiziert, der aus PV-infizierten Tabakpflanzen gesammelt wurde. Blattproben wurden mittels ELISA analysiert, wobei ein Immundiagnostik-Kit für PVX (Boehringer Mannheim) verwendet wurde. Die Viruskonzentration wird durch die optische Dichte der Farbreaktion bei 405 nm bestimmt. Kontr. = Kontrollklon, R101, R102, R104, R106, R107 und R2 = transgene Klone
- Die folgenden Beispiele veranschaulichen die Erfindung. Weitere Erklärungen zu den angewandten molekularbiologischen Methoden können nachgeschlagen werden bei Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", a.a.O.
- Ratten-2,5A-Synthetase-cDNA wurde nach den Versuchsanleitungen von Amersham aus einer Ratten-Hippokampus-cDNA-Genbank in dem Vektor λgt10 isoliert, wobei Mäuse-2,5A-Synthetase-cDNA als Sonde verwendet wurde. cDNA wurde in die EcoRI-Schnittstelle des pBluescript SK+ (Stratagene) Expressionsvektors subkloniert. Das so erhaltene Plasmid wurde pSK2-5A genannt.
- Ratten-2,5A-Synthetase-cDNA wurde zur Transformation von Tabakpflanzen in den Pflanzen-Expressionsvektor pHTT202 subkloniert. cDNA wurde aus pSK2-SA mittels EcoRI herausgespalten, die kohäsiven Enden wurden aufgefüllt, und die cDNA wurde unter Verwendung von synthetischen BamHI-Linkern in den mit Bamlil linearisierten pHTT202-Vektor kloniert (Fig. 1). Das so erhaltene Plasmid pHTT2-5A+ wurde zur Transformation von Agrobacterium-Zellen verwendet.
- Das Plasmid pHTT202 basiert größtenteils auf der Sequenz des Plasmids pBR322. Auf pBR322 basierende Klonierungsvektoren werden normalerweise nicht von einer Wirtszelle zu einem anderen Bakterium mobilisiert, aber sie enthalten die "Mobilisierungsbasis", die bom-Stelle. Wenn die von mob-Genen codierten "Helfer"- Funktionen der Helferplasmide bereitgestellt werden, werden die auf pBR322 basierenden Klonierungsvektoren ebenfalls mobilisiert. Für diesen Zweck wird eine biparentale Konjugation verwendet, die auf dem von Van Haute et al., EMBO J. 2 (1983), 411-417 beschriebenen System basiert.
- E.coli, enthaltend das Plasmid pHTT2-SA+ (ampR, spc/strR) wurde auf L-Platten mit dem E.coli-Helferstamm GJ23 konjugiert, der das let-artige Plasmid R64drd11 (tetR, strR) für die notwendigen tra-Funktionen und ein zweites Helferplasmid pGJ28 (kant neoR) enthält, welches die mob-Funktionen in trans bereitstellt, um die Transmission der pBR-basierenden mob bom+-Plasmide zu komplementieren.
- Die Zellen mit Helferplasmiden wurden auf L-Platten selektiert, die Ampicillin, Tetracyclin und Kanamycin enthielten. Diese Zellen wurden in L-Medium mit dem Agrobacterium tumefaciens Stamm C58C1 cokultiviert, der das Ti-Plasmid pGV2260 (rifR cbR) enthält, bei dem die in der Pflanzenzelle für die Tumorgenese verantwortlichen Gene durch pBR322-Sequenzen ersetzt wurden. Konjugierte Agrobacterium Zellen wurden auf Platten selektiert, die Rifampicin, Spektinomycin und Streptomycin enthielten. Da auf pBR322 basierende Vektoren in Agrobacterium nicht replizieren können, können nur Agrobacterien, bei denen eine Rekombination zwischen der pBR322-Sequenz von PGV2260 und pHTT202 zu Bildung eines cointegrierten Moleküls geführt hat, auf Selektionsplatten wachsen. Zur Bestätigung, dass die T-DNA der rekombinanten Plasmide das 2,5A-Synthetase-Gen enthält, wurde Gesamt-DNA aus so erhaltenen Agrobacterien isoliert (Dhaese et al., Nucl. Acids Res. 7, (1979), 1837-1849) und mittels Southern-Blot analysiert.
- Transgene Nicotiana tabacum-SR1-Pflanzen wurden über den Agrobacteriumvermittelten Transfer erhalten (Zambryski, Annu. Rev. Genet. 22 (1988), 1-30). Die Methode basiert auf dem Phänomen, dass Agrobacterium ein Fragment seines Ti- Plasmids nach Kontakt mit verwundeten Pflanzenzellen in ein Pflanzengenom stabil transferieren kann. Das Segment, das als "T-DNA" bezeichnet wird, wird durch seine konservierten Grenzsequenzen definiert. Die genetische Information zwischen den Grenzsequenzen kann ersetzt werden, ohne die Effizienz des T-DNA-Transfers zu beeinträchtigen.
- Die Transformation von Tabakpflanzen mit dem 2,5A-Synthetase-Gen wurde nach Horsch et. al., Science 227 (198δ), 1229-1231 durchgeführt. N. tabacum-SR1-Blätter von Pflanzen, die auf MS/2-Medium (Murashige und Skoog, Phys. Plant 18 (1962), 473-497) unter sterilen Bedingungen bei 24ºC mit 16stündiger Belichtungszeit wuchsen, wurden umgedreht in K3-400 mM Saccharose-Medium gesetzt (Nagy und Maliga, Z. Pflanzenphysiol. 78 (1976), 453-455) und in 0,5-1 cm² Stücke geschnitten, so dass alle Ecken abgeschnitten wurden. Agrobacterium mit cointegrierter T-DNA, das in M9- Minimalmedium (Sambrook et al., "Molecular Cloning A Laboratory Manual" (1989), a.a.O.) gezogen wurde, wurde K3-400 mM Saccharose-Medium zugesetzt, und die Schalen wurden unter denselben Bedingungen wie die Pflanzen drei Tage lang aufbewahrt. Die Blattscheiben wurden gewaschen und umgedreht auf festes LS-Medium (Linsmaier und Skoog, Phys. Plant. (1965), 100-127) transferiert, das Claforan zur Abtötung von Agrobacterien enthielt, Benzylaminopurin (BAP) zur Induktion der Sprosse aus den Blattscheiben und Kanamycin zur Selektion der transformierten Zellen, da das in die T-DNA von pGV2260 cointegrierte Segment des Plasmids pHTT2-5A+ ebenfalls das nos-npt2-Gen enthielt, das den transformierten Zellen eine Kanamycin-Resistenz verleiht. Nachdem die Sprosse erschienen, wurden sie abgeschnitten und auf einem ähnlichen Medium ohne BAP zum Wurzeln gebracht. Vollständig bewurzelte Pflanzen wurden auf MS/2 = Medium unter den vorstehend beschriebenen Bedingungen aufbewahrt.
- Um zu verifizieren, dass die Pflanzen echte Transformanten waren, wurde Gesamt- DNA und -RNA aus Blattgewebe nach Dellaporta et al., Plant Mol. Biol. Rep. 1 (1983), 19-21 bzw. Verwoerd et al., Nucl. Acids Res. 17 (1989), 2362, isoliert. Southern- und Northern-Blot-Analysen wurden nach der Versuchsbeschreibung von Amersham durchgeführt, wobei mit [³²P] markierte 2,5A-Synthetase-cDNA als Sonde verwendet wurde (Fig. 2).
- Studien über die Auswirkung verschiedener 2,5-Oligoadenylat-Formen durch in vitro Translation des Tabak Mosaik Virus (TMV) in Weizenkeimextrakten (wheat germ extract; WGE) zeigen, dass nicht phosphorylierte Tri- und Tetramere von 2,5A in WGE die TMV-RNA-Translation wirksam inhibieren können (Fig. 3). Die Abbauraten von TMV-RNA während der in vitro-Translation in Gegenwart und Abwesenheit der 2,5A wurden analysiert, indem Proben aus dem Translationsgemisch entnommen wurden und RNA isoliert wurde, wie von Toots et al., Mol. Biol. (USSR) 22 (1988), 1473-1481 beschrieben. Nach der Elektrophorese in AgarosefFormamidgel und einem Northern-Blot wurde die RNA-Konzentration in den Proben durch Scannen der Autoradiogramme der mit [³²P] markierten Filter mit einem Laser-Densitometer abgeschätzt. Die Zugabe des 2,5A-Trimer-"Kerns" führte zu einem schnellen Abbau von TMV-RNA, während die Abbaurate von TMV-RNA bei Kontrollexperimenten mit oder ohne triphosphoryliertem 2,5A viel niedriger war (Fig. 4). Daraus ergibt sich die Schlussfolgerung, dass der inhibitorische Effekt des 2,5A "Kerns" auf die in vitro-Translation in zelifreien Pflanzenextrakten durch den schnellen Abbau der Substrat-RNA verursacht wird.
- Zur Identifizierung von 2,5A-bindenden Proteinen in Pflanzenextrakten vurde 2,5A mit [³²P]pCp ligiert, wie von Knight et al., Methods in Enzymology 79 (1981), 216-227 beschrieben. Mit [³²P] markiertes 2,5A wurde covalent mit Proteinen von Zellextrakten der Kartoffel mittels der NaIO&sub4;-Oxidationsmethode nach Wreschner et al., Eur. J. Biochem. 124 (1982), 261-268 quervernetzt. Die Bindungsspezifität wurde mittels Kompetition überprüft, bei der unmarkiertes 2,5A im Überschuss zu den Reaktionsgemischen gegeben wurde. Die Reaktionsgemische wurden mittels einer 12%igen SDS- Polyacrylamid-Gel-elektrophorese (SDS-PAGE) aufgetrennt.
- Bei den Extrakten aus Kartoffelblättern wurde ein 70 kD Protein identifiziert, das spezifisch an markiertes 2,5A band (Fig. 5). Die Bindungsspezifität wurde durch die Kompetition gezeigt, bei der unmarkiertes 2,5A das [³²P]-2,5A in Kartoffelextrakten vollständig verdrängte (Fig. 5).
- Da die 2,5A-induzierte Inhibition der in vitro-Translation in WGE durch einen schnellen Abbau der TMV-RNA verursacht wurde, ist das 70 kD 2,5A-bindende Protein aus dem Pflanzenextrakt eine 2,5A-aktivierte Pflanzen-Endoribonuklease.
- Es wurde ebenfalls die Auswirkung von 2,5A auf die Proteinbiosynthese in N. tabacum SR1-Protoplasten untersucht. Protoplasten wurden nach Honkanen et al., "Biotechnology in tropical crop improvement: proceedings of the international biotechnology workshop", (1988) aus dem Blattmesophyll von unter sterilen Bedingungen gezogenen Pflanzen erhalten und in K3-400 mM Saccharose-Medium aufbewahrt. Nach Zugabe eines mit [¹&sup4;C] markierten Aminosäure-Hydrolysats wurden Proben aus dem Protoplastengemisch gesammelt, um die Konzentration der de novo synthetisierten Proteine zu analysieren. Die Proteine wurden mit Trichloressigsäure präzipitiert und die eingebaute Radioaktivität wurde gemessen. 2,5A inhibierte wirksam die Proteinbiosynthese in Tabakprotoplasten (Fig. 6), was wiederum zeigt, dass 2,5A als Inhibitor der Proteinbiosynthese in Pflanzensystemen in vivo fungiert.
- Nach der Identifizierung einer 2,5A abhängigen RNAse-Aktivität bei der Kartoffel und im Tabak kann man daraus schließen, dass es einen metabolischen Weg bei Pflanzen gibt, der teilweise dem IFN-induzierten metabolischen Weg der Säuger ähnelt, welcher eine virale Resistenz bewirkt.
- Zur Untersuchung der Vermehrung verschiedener Viren in transgenen Pflanzen, welche die 2,5A-Synthetäse exprimieren, wurden unterschiedliche Infektionsexperimente durchgeführt. Pflanzen, die auf MS/2-Medium wuchsen, wurden zwei Wochen vor der Infektion ins Erdreich überführt. Zur Infektion wurden 2-3 untere Blätter mit Carborundum behandelt, 10 ug/ml Virus wurden manuell auf die Blattoberfläche inokuliert und das Carborundrum wurde nach 30 Minuten mit sterilem Wasser abgewaschen. Die Pflanzen wurden einen Monat lang bei 16-stündigen Belichtungszeiten aufbewahrt. Proben wurden gesammelt, indem jeden fünften Tag eines der kleinen oberen Blätter entnommen und in flüssigem Stickstoff eingefroren wurde.
- Die Blattproben wurden in einem Mörser homogenisiert, wobei 1 ml Immungssay- Puffer pro Gramm Blattmaterial zugegeben wurde. Zum Nachweis des Kartoffelvirus X (PVX), wurden die monoklonalen Antikörper 21XD2 und die zeitaufgelöste Fluoroimmungssay-Technik (time-resolved fluoroimmunoassay, TRFIA) verwendet, wie von Sober et al., J. gen. Virol. 69 (1988), 1799-1807 bzw. Sinijärv et al., J. gen. Virol. 69 (1988), 991-998 beschrieben. Die PVS-Konzentration wurde mittels DAS-ELISA bestimmt, wobei monoklonale S4A4-Antikörper verwendet wurden (Sinijärv et al., 1988, a.a.O.).
- Einen Monat nach der Infektion mit 10 ug/ml PVX, enthielten alle transgenen Pflanzen nachweisbare PVX-Spiegel, aber die Viruskonzentration war viel niedriger als bei Kontrollpflanzen (Fig. 7). Außerdem begann die nachweisbare Vermehrung des PVX bei diesen Pflanzen 1-2 Wochen später als bei den Kontrollpflanzen.
- Einen Monat nach der Infektion mit 10 ug/ml PVS zeigten alle transgenen Tabaklinien eine vollkommene Resistenz gegenüber der PVS-Infektion und enthielten kaum nachweisbare PVS-Spiegel (Fig. 8).
- Es wurden auch Infektionen der Blattscheiben mit PVX und zusätzlich mit TMV vorgenommen. Blätter transgener Tabakpflanzen wurden, wie vorstehend beschrieben, infiziert. Scheiben mit einem Durchmesser von 8 mm wurden aus den Blättern gestanzt und umgekehrt in sterilem Wasser bei 24ºC bis zu 5 Tage lang bei 16-stündigen Belichtungszeiten aufbewahrt. Die Scheiben wurden in flüssigem Stickstoff eingefroren und homogenisiert. Die Infektion mit 10 ug/mi PVX ergab ähnliche Ergebnisse wie jene mit intakten Pflanzen. Blattscheiben einiger transgener Tabaklinien enthielten weniger Virus, und die nachweisbare Vermehrung der Kartoffelviren erfolgt viel früher als bei intakten Pflanzen. Die Konzentration von TMV in Blattscheiben 5 Tage nach der Infektion zeigte eine deutliche Inhibition der Virusvermehrung bezogen auf die Kontrollpflanzen.
- Zum Nachweis der Konzentration von 2,5A in transgenen, 2,5A-Synthetase exprimierenden Tabakpflanzen, wurden Blattextrakte aus virusinfizierten und nicht infizierten Planzen hergestellt. Eine Kompetition von unmarkiertem 2,5A aus Pflanzenextrakten mit 2,5A-[³²P]pCp wurde durchgeführt. Extrakt von Maus-L-Zellen wurde als Quelle für 2,5A-bindende Endoribonuklease L (RNAse L) verwendet. Das Gemisch aus markiertem 2,5A, L-Zellextrakt und Blattextrakt wurde 90 Minuten lang auf Eis inkubiert. Proteine aus dem Gemisch wurden auf Nitrozellulose-Filtern präzipitiert, und die Radioaktivität der Filter und des Filtrats wurde gemessen. Das Gemisch ohne Pflanzenextrakt wurde als Positivkontrolle verwendet. Das Gemisch, bei dem 107 M unmarkiertes 2,5A-Trimer das markierte 2,5A vollständig verdrängt hat, wurde als Negativkontrolle verwendet.
- Die Ergebnisse zeigen, dass nicht infizierte, transgene, 2,5A-Synthetase exprimierende Pflanzen, eine geringe (wenn überhaupt) nachweisbare Menge 2,5A enthielten, ähnlich wie bei den Kontrollpflanzen und den transgenen Pflanzen, die das 2,5A-Synthetase- Gen in Antisense-Orientierung tragen (Tabelle 1). Das liegt daran, dass die 2,5A- Synthetase als inaktives Enzym exprimiert wird, welches durch dsRNA aktiviert werden kann. Wenn transgene, 2,5A-Synthetase exprimierende Pflanzen mit PVX infiziert wurden, wurde das 2,5A nachweisbar und seine intrazellulären Konzentrationen waren sogar höher als bei den Kontrollgemischen. Solch ein Anstieg des 2,5A wurde in den SR1-Kontrollpflanzen nicht nachgewiesen. Der Anstieg von 2,5A bei transgenen Pflanzen führt zur Inhibition der PVX-, PVS- und TMV = Vermehrung. Tabelle 1 Kompetitiver Test zur Bindung von Radioaktivität zur Bestimmung der 2,5-Oligoadenylat-Konzentration bei transgenen, 2.5A-Synthetase enthaltenden Pflanzen vor und nach der Infektion mit PVX
- Die Schlussfolgerung daraus ist, dass doppelsträngige, replizierende PVX-RNA-Intermediate die inaktive 2,5A-Synthetase aktivieren können, was zu einer Synthese von intrazellulärem 2,5A führt.
- Intakte, das 2,5A-Synthetase-Gen enthaltende Kartoffelpflanzen, wurden mit Planzensaft infiziert, der aus PVX-infizierten und auf dem Feld gewachsenen Tabakpflanzen gesammelt wurde.
- Blattproben wurden fünf Wochen nach der Infektion mittels ELISA analysiert, wobei ein Immundiagnostik-Kit für PVX (Boehringer Mannheim) verwendet wurde. Die Viruskonzentration wurde durch die optische Dichte der Farbbildung bei 405 nm bestimmt (siehe Fig. 10).
- Die Konzentration von PVX in das 2,5A-Synthetase-Gen enthaltenden Pflanzen war im Vergleich zu den Kontrollpflanzen drastisch reduziert.
Claims (13)
1. Multiple Virus-Resistenz aufweisende transgene Pflanze, die eine unter
Verwendung gentechnischer Verfahren hergestellte DNA-Sequenz enthält, die
mindestens ein Polypeptid mit einer 2,5A-Synthetaseaktivität codiert, wobei
das Polypeptid nach Expression in der Lage ist, eine Endonuclease zu
aktivieren, die den Abbau von viraler RNA bewirkt.
2. Transgene Pflanze gemäß Anspruch 1, wobei die DNA-Sequenz eine
heterologe DNA-Sequenz ist.
3. Transgene Pflanze gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei die DNA-Sequenz eine
chimäre DNA-Sequenz ist.
4. Transgene Pflanze gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die codierende
Sequenz des Polypeptids von einem Säugergen, einem Pflanzengen oder
einem Mikroorganismengen abgeleitet ist oder ein synthetisches Gen ist.
5. Transgene Pflanze gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die codierende
Sequenz des Polypeptids ein Ratten-2,5A-Synthetasegen ist.
6. Transgene Pflanze gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Expression
des Polypeptids unter der Kontrolle eines induzierbaren oder konstitutiven
Promotors steht.
7. Transgene Pflanze gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, die Tabak, Reis,
Weizen, Gerste, Mais, Tomate, Gurke, Soja, Süßkartoffel, Weintraube, Raps,
Zuckerrübe, Baumwolle, Tee, Sonnenblume, Erdbeere, Rose, Chrysantheme,
Paprika oder Kartoffel ist.
8. Transgene Vermehrungsmaterial abgeleitet von einer transgenen Pflanze
gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7.
9. Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze gemäß einem der
Ansprüche 1 bis 7, umfassend die Einführung einer unter Verwendung
gentechnischer Verfahren hergestellten DNA-Sequenz, die mindestens ein
Polypeptid mit 2,5A-Synthetaseaktivität codiert, in das genetische Material
einer geeigneten Pflanze.
10. Verfahren gemäß Anspruch 9, wobei die DNA-Sequenz in einem Vektor
enthalten ist unter der Kontrolle eines Promotors, der ihre Expression in der
transgenen Pflanze erlaubt.
11. Verfahren gemäß Anspruch 10, wobei der Vektor pHTT2-5A+ (DSM Nr. 6815)
ist.
12. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 9 bis 11, wobei die Einführung durch
Transfektion mittels dem Agrobacterium-System durchgeführt wird.
13. Verwendung einer unter Verwendung gentechnischer Verfahren hergestellten
DNA-Sequenz, die mindestens ein Polypeptid mit einer 2,5A-
Synthetaseaktivität codiert, zur Herstellung einer transgenen Pflanze gemäß
einem der Ansprüche 1 bis 7.
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