DE69114275T2

DE69114275T2 - Regenerierung und genetische transformation der zuckerrübe.

Info

Publication number: DE69114275T2
Application number: DE69114275T
Authority: DE
Inventors: Tahar Sophie Ben; Denise Gerentes; Jean Kallerhoff; Pascual Perez; Jo L Perret
Original assignee: BIOCEM
Current assignee: Bayer CropScience NV
Priority date: 1990-03-02
Filing date: 1991-03-01
Publication date: 1996-06-13
Anticipated expiration: 2011-03-02
Also published as: EP0517833A1; ES2079647T5; WO1991013159A2; DK0517833T4; DE69114275D1; EP0517833B2; ATE129745T1; EP0517833B1; DK0517833T3; ES2079647T3; WO1991013159A3

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Transformation von Pflanzenzellen, die der Spezies Beta vulgaris angehören, woran sich gegebenenfalls ein Regenerationsschritt der transformierten Zellen in der ganzen Pflanze anschließt.
Die Erfindung betrifft auch die transformierten Zellen, die transgenen Sprossen, Pflanzen und Samen, die sich nach diesem Verfahren herstellen lassen.
Außerdem betrifft die Erfindung transgene Pflanzen, die der Spezies Beta vulgaris angehören, gegen Infektion durch das Virus der gelben nekrotischen Adern der Zuckerrbe (BNYVV; beet necrotic yellow vein Virus) resistent sind und das Kapsidprotein des BNYVV oder ein Derivat dieses Proteins exprimieren.
Die in der Beschreibung der Erfindung erscheinenden Quellennachweise sind in Form eines Literaturverzeichnisses zusammengestellt.
Bei der Gewinnung von transgenen Pflanzen bedient man sich des Transfers des ausgewählten DNA-Fragments in die Pflanzenzelle, der Selektion der dauerhaft transformierten Zellen und der Regeneration von ganzen Pflanzen aus den selektionierten transformierten Zellen.
Das technische Problem, das sich bei der Ausarbeitung der vorliegenden Erfindung stellte, war das Auffinden einer Methode zur Transformation von Rübenzellen, die eine hohe Transformationsfrequenz aufweist, welche sich erfolgreich mit einer Methode zur Regeneration einer transgenen Pflanze verbinden läßt. Bislang ist eine solche Methode zur Transformation und Regeneration nicht beschrieben, was die Herstellung transgener Rüben mit landwirtschaftlich interessanten Eigenschaften, etwa Resistenz gegen die Wurzelhaarkrankheit, verhindert.
Zur Zeit gibt es zwei Hauptrichtungen bei der Übertragung von DNA in Pflanzenzellen.
Bei der ersten Route handelt es sich um eine physikalischchemische (Elektroporation, Mikroinjektion, Polykationen, Teilchenschleuder). Bei der Rübe werden die dauerhaft transformierten Zellen nach der Elektroporation über ein Gen selektioniert, das für die Resistenz gegen Kanamycin in den Protoplasten codiert (Lindsey et al., 1989).
Dieses Verfahren kann jedoch nie zur Schaffung transgener Rüben führen, da die Regeneration von Pflanzen aus Protoplasten bei dieser Spezies nicht erreicht werden konnte.
Die zweite Route der Übertragung von DNA ist eine biologische Route, bei der als Vektor ein Erdbakterium verwendet wird: Agrobacterium tumefaciens oder rhizogenes.
Für die Transformation von Zellen der Rübe wurden verschiedene Stämme dieser beiden Spezies mit Erfolg verwendet. Diese transformierten Zellen verursachen Tumore mit Agrobacterium tumefaciens (Krens et al., 1988) bzw. Wurzeln mit Agrobacterium rhizogenes (Yacoub et al., 1987). Bei der Rübe ermöglichten diese transformierten Gewebe (Wurzeln und Tumore) bislang nie die Regeneration von Pflanzen. Dies rührt daher, daß diese beiden Phänotypen das Ergebnis der Integration nicht nur des erwünschten DNA-Fragments in das Genom der Zelle sind, sondern auch eines DNA-Fragments des Bakteriums, welches das hormonale Gleichgewicht der Zelle stört (Akiyoshi et al., 1983). Zur Behebung dieser Probleme wurden diese Gene deletiert, unter Bildung neuer Agrobacterium-Stämme, die entwaffnete Stämme genannt werden.
Die Verwendung der entwaffneten Agrobaeterium-Stämme geschieht in Verbindung mit einem selektiven System für die Transformation von Pflanzenzellen. Der Erfolg bei der Gewinnung von Transformanten ist eng mit der Einstellung eines guten selektiven Systems verknüpft. Das auf diesem Gebiet meistverwendete selektive Gen ist das aus dem Transposon Tn5 von Escherichia coli stammende (Rothstein et al., 1981), das für Neomycinphosphotransferase (NPT II) codiert, die Resistenz gegen Kanamycm verleiht (An et al., 1985).
Die meisten der in diesen entwaffneten Stämmen verwendeten Plasmidvektoren enthalten in der übertragbaren DNA neben dem gewünschten Gen das Gen NPT II, unter der Kontrolle pflanzlicher Transkriptionssignale (Bevan, 1984; An, 1986). Das Selektionssystem umfaßt zum einen das Resistenz verleihende Gen und zum andern das selektive Agens (Selektionsmittel). Dies schließt eine Bestimmung der Konzentrationen des selektiven Agens ein, wodurch es ermöglicht wird, die nichttransformierten Zellen zu beseitigen und zugleich die transformierten Zellen wachsen zu lassen. Die einzigen publizierten Arbeiten, die die Selektion von Rübenzellen nach der Transformation multizellulärer Explantate durch Agrobacterium betreffen, befassen sich mit einem anderen selektiven System, namlich Hygromycin Blhygromycin B-phosphotransferase (Harpster et al., 1988).
Die Transformation durch Agrobacterium erfordert zunächst die Auswahl eines Zelltyps oder eines Explantattyps, der den Zweck der Transformation erfüllt. Beispielsweise lassen sich Explantate wie etwa Hypokotyle und Blattstücke (Krens et al., 1988) durch Agrobacterium transformieren.
Die Transformationsfrequenz kann je nach dem Zelltyp, der den Zweck der Transformation erfüllt, variieren, wobei diese Variabilität häufig nicht vorhersagbar ist.
Bei der Herstellung einer transgenen Pflanze schließt sich an die Transformation ein Regenerationsverfahren an.
Die Effizienz der Gewinnung von transgenen Pflanzen ist zum einen abhängig von der Frequenz der Regeneration der Pflanzen aus transformierten Zellen und zum andern von der Transformationsfrequenz der Zellen.
Zum Beispiel ergab die Transformation von Rübenblattstielstücken transformierte, auf Kanamycin selektionierte Kalli. Allerdings war es niemals möglich, Pflanzen aus diesen transformierten, aus den Blattstengeln hervorgegangenen Kalli zu regenerieren, obwohl die Regeneration von somatischen Embryonen und von Sprossen aus diesem Kallus-Typ im nichttransformierten Zustand berichtet ist (Tetu et al., 1987). Dieser Mißerfolg ist nicht überraschend, wenn man die beschriebene geringe Regenerations frequenz berücksichtigt.
Dies verdeutlicht recht gut die schon seit langem bei der Zuckerrübe anzutreffenden Probleme bei der Regeneration von nichttransformierten Pflanzen aus Explantaten (Ritchie et al., 1989). Verschiedene Autoren beschreiben die direkte Regeneration von Adventivsprossen aus Blattstielfragmenten von Pflanzen bei vegetativer Vermehrung (Detrez et al., 1988; Freytag et al., 1988). Obwohl sich dieses Phänomen unter den von den Erfindern angewandten Bedingungen als reproduzierbar erwiesen hat, hat sich die Frequenz als viel zu gering gezeigt, um mit der Transformation in Verbindung gebracht zu werden. Zum andern scheint es, daß die Neubildungen von Zellkomplexen herrühren, die für das Bakterium unzugänglich und gegenüber einem selektiven Agens offenbar wenig empfindlich sind.
Eine andere Technik der Regeneration von nichttransformierten Pflanzen aus Zellen der Zuckerrübe ist die von Saunders et al. (1986) beschriebene. Sie bringt zum ersten die Induktion von brüchigen Kalli ins Spiel, die hormonunabhängig sind und wahrscheinlich aus Epidermiszellen der Blattfläche entstehen, und zum zweiten die Regeneration von Sprossen und somatischen Embryonen aus diesen Kalli. Diese Technik war bei verschiedenen Abarten der Zuckerrübe ohne weiteres reproduzierbar. Ein Vorteil dieses Verfahrens besteht in der Möglichkeit, Zellsuspensionen aus brüchigen Kalli in einfacher Weise zu gewinnen, deren organogenes Potential einige Monate lang aufrechterhalten werden kann.
Die Erfinder haben entdeckt, daß dieses organogene Material, das heißt, die brüchigen Kalli, unter bestimmten Bedingungen für die Transformation durch Agrobacterium tumefaciens verwendet werden kann.
Zudem schien noch vor kurzer Zeit die Transformation von Zellsuspensionen gemäß der anerkannten Lehre, daß der DNA- Transfer durch Agrobacterium in eine pflanzenzelle Zell-Läsionen erfordert, nicht vorstellbar. Allerdings berichteten Autoren über die Transformation von Zellen in Suspension bei Tabak und bei der Karotte (An, 1985; Scott und Draper, 1987). Die Transformation von Zellen in Suspension bei der Rübe wurde bislang nicht beschrieben. Außerdem ist festzustellen, daß die Methoden der Transformation, die sich bei einer Pflanzenspezies erfolgreich anwenden lassen, nicht systematisch auf andere Spezies erweitert werden können. Die Bedingungen der Transformation, die Ausgangsmaterialien und die Kulturmedien sind variable Parameter, die für jede Spezies spezifisch sind.
Was die Transformation und Regeneration von transgenen Rüben mit Resistenz gegen die Wurzelhaarkrankheit anbelangt, so wurde jeglicher Fortschritt durch das Fehlen eines zuverlässigen Herstellungsverfahrens verhindert.
Das Virus der gelben nekrotischen Adern der Zuckerrübe (BNYVV) ist ein Virus mit mehreren Komponenten, das aus viralen Teilchen mit Schraubensymmetrie besteht und vier Typen einsträngiger RNA mit positiver Polarität enthält (Putz, 1987). Dieses Virus wird durch einen Erdpilz, Polymixa betae, verbreitet, der die Oberflächenzellen der Nebenwurzeln der Chenopodiaceae befällt, zu denen auch die Zuckerrübe gehört. Diese zweijährige Chenopodiacea bleibt im ersten Jahr im Zustand der Rosette, wobei sie eine weiche und zuckrige Wurzel bildet, und schießt im zweiten Jahr nach der Vernalisation zum Samen auf. Das Fortdauern der Krankheit im Boden beruht auf Zysten, die durch den Pilz gebildet werden (Tamada, Baba, 1973).
Es ist bekannt, daß sich das Virus im wesentlichen im Wurzelbereich entwickelt (Pfahlwurzel und Sekundärwurzeln). Das Hauptsymptom der Krankheit besteht in der Proliferation von Wurzelhaaren (daher der Name Wurzelhaarkrankheit). Der Name des Virus indessen leitet sich tatsächlich von späteren Symptomen ab, die im vegetativen Teil sichtbar sind, nämlich Nekrosen und Gelbfärbung der Adern aufgrund der Tatsache, daß sich das Virus vor allem in Höhe der Wurzelgefäße entwickelt und so den Metabolismus der ganzen Pflanze stört (Salle et al., 1986).
Mehrere Autoren berichten, daß das Virus im oberirdischen Teil nur sehr selten festzustellen ist, während es in Höhe der Wurzeln und des Wurzelstocks in großer Menge vorhanden ist (Putz, 1977; Ziegler et al., 1985).
Trotz des Einzugs der Pflanzengenetik bleibt die Bekämpfung von Viruskrankheiten bei Pflanzen problematisch.
Abel et al. (1986) führten ein Gen, das für das Kapsidprotein des Tabakmosaikvirus (TMV) codiert, in das Genom von Pflanzen ein, die von Natur aus gegen dieses Virus empfindlich sind. Diese genetische Manipulation bewirkte eine Verlangsamung in der Entwicklung der Krankheit bei den transgenen Pflanzen.
Berichtet wurde über weitere durchgeführte Arbeiten der gleichen Art an anderen Viren:
- Luzernemosaikvirus und Tobacco Rattle Virus auf Tabak (Van Dun et al., 1987);
- Luzernemosaikvirus auf Tabak (Loesch Fries et al., 1987);
- Luzernemosaikvirus auf Tabak und Tomate (Tumer et al., 1987).
Zwei Arbeitskreise erzeugten transgene Pflanzen, die Gene exprimieren, welche für Antisense-RNAs codieren, die komplementär zu der RNA sind, die für das Kapsidprotein codiert, und sie zeigten, daß die Resistenz weit weniger bedeutend ist als die durch das Kapsidprotein verliehene (Cuozzo et al., 1988; Hemenway et al., 1988).
Schließlich erzeugten andere Laboratorien transgene Pflanzen, die Gene exprimieren, welche für Satelliten-RNAs codieren. Diese Strategie wurde von Gerlach et al. (1987) für das Tabakjahresringvirus und von Harrison et al. (1987) für das Gurkenmosaikvirus (CMV) angepaßt.
Da für das BNYVV kein Satellit bekannt ist, erwogen die Erfinder, entweder Antisense-RNAs oder Sinn-RNAs in den transformierten Pflanzenzellen produzieren zu lassen, die für normale Virenproteine codieren, die Mutationen oder Deletionen aufweisen und imstande sind, die Entwicklung des Virus zu hemmen.
Das erfindungsgemäße Transformationsverfahren umfaßt:
- die Transformation von Suspensionen habituierter Zellen, unter Bildung von transformierten Kalli und Zellsuspensionen;
- die Transformation von Suspensionen regenerierter Zellen, unter Bildung von transformierten Kalli, Zellsuspensionen und Pflanzen;
- die Transformation von brüchigen Kalli in Dispersion, unter Bildung von transformierten Kaih, Zellsuspensionen und Pflanzen.
Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Transformation von Pflanzenzellen, die der Spezies Beta vulgaris angehören, dadurch gekennzeichnet, daß dieses umfaßt: das Zusammenbringen einer Dispersion von weißen brüchigen Kalli in einem flüssigen Pflanzenzellenkulturmedium, enthaltend 0 bis etwa 3,0 mg 1&supmin;¹ eines cytokins, oder einer Suspension von weißen brüchigen Kalli in einem flüssigen Pflanzenzellenkulturmedium, enthaltend etwa 0,1 bis etwa 3,0 mg 1&supmin;¹ eines Cytokinins, mit Agrobacterium, enthaltend einen Vektor, der ein in die Pflanzenzellen einzubringendes Gen trägt, gefolgt von gemeinsamem Kultivieren der Pflanzenzellen und Bakterien, um transformierte brüchige Kalli zu ergeben. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung umfaßt das Transformationsverfahren die folgenden sukzessiven Schritte:
I) Induktion von weißen brüchigen Kalli aus Explantat;
II) Dispersion der Kalli in einem flüssigen Pflanzenzellenkulturmedium, enthaltend 0 bis etwa 3,0 mg 1&supmin;¹ eines Cytokinins, oder Gewinnung einer Zellsuspension aus Kalli in einem flüssigen Pflanzenzellenkulturmedium, enthaltend etwa 0,1 bis etwa 3,0 mg 1&supmin;¹ eines Cytokinins;
III) Zusammenbringen der Dispersion oder Suspension mit Agrobacteriumtumefaciens, enthaltend einen Vektor, der ein in die Pflanzenzellen einzubringendes Gen trägt, gefolgt von gemeinsamem Kultivieren der Pflanzenzellen und Bakterien;
IV) Waschen der Pflanzenzellen zur Abtrennung der Bakterien und Selektion der transformierten Zellen auf einem selektiven Medium;
V) Kultivieren der transformierten selektionierten Zellen, um transformierte brüchige Kalli zu erhalten.
Der erste Schritt der Transformation ist die Induktion von weißen brüchigen Kalli aus Rübenexplantaten. Bei den Explantaten, die für diesen Schritt herangezogen werden können, kann es sich beispielsweise um Blattscheiben, Abschnitte von Blattstielen etc. handeln. Vorzugsweise handelt es sich bei den Explantaten um Stücke von jungen Blättern, die einer wenigstens drei Monate alten Pflanze entnommen wurden.
Zum Beispiel werden der Pflanze etwa einen Monat nach dem Keimen der Rübensamen junge Blätter einer Länge von 3 bis 5 cm abgenommen, die einem Desinfektions- und Spülungsschritt unterzogen werden. Anschließend wird jedes Blatt in kleine Stücke von 0,25 cm² bis 1,0 cm² geschnitten. Die Blätter können der Pflanze bis etwa zwei Monate nach den ersten Entnahmen abgenommen werden. Nach dieser Zeit läßt die Regenerationsfähigkeit der Blätter nach. Die Blattscheiben werden anschließend auf einem Pflanzenzellenkulturmedium kultiviert, das 0,1 bis 5,0 mg 1&supmin;¹ Cytokinin enthält. Vorzugsweise ist das Cytokinin in einer Menge von etwa 1,0 mg 1&supmin;¹ vorhanden, und es kann zum Beispiel 6-Benzylaminopurin (BAP), Zeatin oder Kinetin sein. Besonders bevorzugt ist BAP. Bei dem Pflanzenzellenkulturmedium handelt es sich vorzugsweise um das Medium von Murashige und Skoog (1962), das MS-Medium genannt wird. Die Explantate werden 30 Tage lang bei etwa 30ºC im Dunklen kultiviert und anschließend in einer Kulturkammer mit einer Photoperiode von 18/24 h ausgekeimt, zum Beispiel bei etwa 25ºC am Tag und 20ºC nachts.
Vier bis zehn Wochen nach Kultivierungsbeginn erscheinen ringsum auf oder unter den Blattexplantaten weiße brüchige Kalli.
Der folgende Schritt des Transformationsverfahrens ist die Herstellung einer Zellsuspension aus den Kalli oder einer Dispersion der Kalli in einem flüssigen Kulturmedium. Diese Suspension oder Dispersion wird später für die Transformation verwendet.
Die Zellsuspension wird erhalten durch Kultivieren der Kalli 4 bis 6 Wochen nach ihrem Erscheinen in einem flussigen Kulturmedium, das mit 0,1 bis 3,0 mg 1&supmin;¹ eines cytokinins, beispielsweise BAP, versetzt ist. Dieser Kultivierungsschritt dauert 2 bis 3 Wochen und wird unter Rühren durchgeführt. Vorteilhafterweise handelt es sich bei dem Kulturmedium um das MS-Medium. Ein besonders bevorzugtes Medium ist das mit 1 mg 1&supmin;¹ BAP versetzte MS-Medium. Dieses Medium soll im folgenden als MSB1 bezeichnet werden. Seine Zusammensetzung ist in Tabelle 2 angegeben (siehe Beispiel 9).
Die Zellsuspension stellt sich in 2 oder 3 Wochen ein. Danach wird jede Suspension alle drei Wochen durch Filtration der Suspensionen über drei übereinandergelegte Siebe umgesetzt, woraus sich drei Fraktionen ergeben (zum Beispiel > 1 mm, > 500 µm, > 100 µm). Ein Teil jeder Fraktion wird in dem flüssigen Medium, beispielsweise dem MSB1-Medium, wieder in Suspension gebracht, und diese neuen Suspensionen werden gerührt. Die Beobachtung der verschiedenen Suspensionen ermöglicht, das Vorhandensein zweier Zelltypen zu unterscheiden, insbesondere:
- den habituierten Typ (A): feine grüne Suspension, mit schnellem Wachstum, regeneriert punktuell glasartige Formationen, die sich schwer entwickeln;
- den knötchenförmigen Typ (C): Suspension kompakter gelblicher Aggregate, mit langsamerem Wachstum, regeneriert häufiger als erstere, die kompakten embryonalen Strukturen entwickeln sich recht gut. Dieser Typ ist auch bekannt unter dem Namen "regenerierender Typ".
Alternativ wird die Herstellung einer Dispersion der Kalli durch Dispergieren der nach 2 bis 6 Wochen auf den Explantaten erschienenen Kalli in einem flüssigen Kulturmedium durchgeführt, das 0 bis 3,0 mg 1&supmin;¹ cytokinin enthält, zum Beispiel das MSB1-Medium. Die beiden Zelltypen, habituiert und knötchenförmig, sind auch in den Dispersionen zu beobachten. Die Kalli in Dispersion können zum Zweck der Trennung der beiden Zelltypen, d.h., knötchenförmig und habituiert, vor der Transformation untersucht werden. Eine visuelle Prüfung der Kalli ermöglicht die Erkennung der beiden Typen, die dann mit einer Pinzette aus dem Medium genommen und wieder dispergiert werden. Die Zellsuspensionen, die aus Dispersionen weißer brüchiger knötchenförmiger Kalli sorgfältig hergestellt werden, haben sich als ideales Material für die Optimierung der Transformationseffizienz erwiesen.
Ein jeder der beiden Zelltypen kann der Transformation unterzogen werden, aber vorzuziehen ist die Transformation des knötchenförmigen Typs, wenn die Transformation der Pflanze später erwünscht ist.
Die Zellsuspension oder die Dispersion der Kalli wird anschließend mit dem Bakterium Agrobacterium tumefadens zusammengebracht.
Das Transformationsprotokoll ist das gleiche wie das bei den Zellsuspensionen oder den Dispersionen durchgeführte. Eine Probe der Bakterien in frischem Medium wird der Suspension oder der Dispersion der Rübenzellen zugegeben. Die Cokultur der Pflanzenzellen und der Bakterien wird im Dunklen für etwa drei Tage in einer Kulturkammer durchgeführt.
Das bei der Transformation verwendete Agrobacterium enthält einen Vektor, der ein in die Rübenzellen einzubringendes Gen trägt. Die von den Erfindern verwendeten Stämme enthalten binäre Vektoren, die das Nutzgen tragen. Bei den drei in der hier beschriebenen Arbeit verwendeten entwaffneten Agrobacterium tumefaciens-Stämmen handelt es sich um LBA 4404 (Hoekema et al., 1983), EHA 101 (Hood et al., 1986) und C58'3 (Dale et al., 1989). Selbstverständlich wird das Nutzgen der Kontrolle geeigneter Regulationssignale unterworfen, beispielsweise eines Promotors, der dessen Expression in der Pflanzenzelle und gegebenenfalls in der regenerierten transgenen Pflanze gestattet. Der Promotor kann so ausgewählt sein, daß er die spezifische Expression des Gens in einem bestimmten Teil der Pflanze zuläßt oder in einem bestimmten Stadium ihrer Entwicklung. Alternativ kann ein konstitutiver Promotor verwendet werden, der zu einer ubiquitären Expression des eingebrachten Gens führt.
Als Gene seien diejenigen Gene erwähnt, die für landwirtschaftlich interessante Eigenschaften codieren, zum Beispiel Resistenz gegen Herbizide, gegen Insekten und gegen Viren, oder auch Gene, die männliche Sterilität induzieren. Resistenz gegen Herbizide kann beispielsweise durch den Gentyp verliehen werden, der von De Block et al. (1987) und von Bedbrook et al. (1988) beschrieben ist. Ein Gen, das Resistenz gegen Insekten zu verleihen vermag, ist das Gen des kristallinen Proteins von B. thiuringiensis (Perlak et al. (1990); Vaeck et al. (1987); Fischoff D. et al. (1987)). Männliche Sterilität kann durch ein Gen induziert werden, das für eine Ribonudease codiert, etwa das von Mariani et al. (1990) beschriebene. Die Resistenz gegen Viren kann bisweilen durch das Gen induziert werden, das für das Kapsidprotein des fraglichen Virus codiert. Zum Beispiel kann die Resistenz gegen das Virus BWYV durch das von Gilen et al. (1990) beschriebene Gen verliehen werden. Zudem kann der Schutz gegen das für die Wurzelhaarkrankheit verantwortliche BNYVV ebenfalls durch den gleichen Gentyp induziert werden. Gemäß dem Verfahren der Erfindung kann das für dieses Kapsidprotein codierende Gen in Rübenzellen eingebracht werden und verleiht somit Resistenz gegen die Wurzelhaarkrankheit. Die in diesen Beispielen beschriebenen Vektoren können zur Einführung dieser Gene verwendet werden.
Der Vektor trägt auch ein Gen, das für ein Protein codiert, welches die Selektion der Transformanten ermöglicht, zum Beispiel Neomycinphosphotransferase (NPT II), die Resistenz gegen Kanamycin verleiht. Des weiteren kann ein Reportergen in den Vektor eingebracht werden, das ermöglicht, den transformierten Charakter des Pflanzengewebes zu bestätigen. Ein Beispiel für ein solches Reportergen ist das uid A-Gen von E. coli, das für das Enzym β-Glucuronidase codiert. Die Bestimmung der enzymatischen Wirkung dieses Proteins gestaltet sich bei chromogenen oder fluoreszierenden Substraten einfach.
Nach der Cokultur der Rübenzellen und der Bakterien wird ein Waschschritt mit einem Bakteriostatikum vorgenommen, um die Bakterien zu beseitigen. Als Bakteriostatikum kann Cefotaxim verwendet werden. Das Waschen kann in zwei Schritten durchgeführt werden, zum Beispiel ein erstes Mal mit dem MSB1- Medium, enthaltend 600 mg 1&supmin;¹ Cefotaxim, dann ein zweites Mal mit MSBL-Medium, enthaltend 300 mg 1&supmin;¹ Cefotaxim.
Anschließend wird mit Hilfe des Gens, das für die Resistenz gegen das selektive Agens codiert, die Selektion der transformierten Zellen durchgeführt. Die gewaschenen Zellen werden dann fünfzehn Tage lang auf einem Medium kultiviert, welches das selektive Agens, zum Beispiel Kanamycin, und das Bakteriostatikum enthält. Anschließend werden die Pflanzenzellen auffrisches Medium umgesetzt.
Drei bis acht Wochen nach dem gemeinsamen Kultivieren erscheinen weiße Kalli. Diese transformierten Kalli stellen die beiden Zelltypen knötchenförmig und habituiert dar.
Die wichtigste physikalische Eigenschaft der so erhaltenen transformierten Kalli ist, daß sie sich in Flüssigkeit durch relativ schonendes Rühren dispergieren lassen und dann darin eine Größe von 3 bis 5 mm aufweisen. Überraschenderweise bewahren diese transformierten Kalli die weiße, brüchige und regenerierende Beschaffenheit, die sie vor der Transformation besaßen und erweisen sich somit als geeignetes Material für die Regeneration von transgenen Pflanzen. Es ist festzuhalten, daß die mit Explantaten anstelle von Kalli durchgeführte Transformation (Harpster et al., 1988) sehr kompakte transformierte Kalli ergibt, die nicht die Eigenschaft brüchig aufweisen und nicht regenerierend sind.
Sobald sie sich ausreichend entwickelt haben, werden die erfindungsgemäßen transformierten Kalli auf ein MSB1-Medium mit Cefotaxim und gegebenenfalls Kanamycin umgesetzt.
Überraschenderweise wurde festgestellt, daß einen Monat nach dem Klonieren der transformierten Kalli Kanamycin und Cefotaxim im Medium weggelassen werden können, ohne daß sich Bakterien entwickeln. Dies kann beim Regenerationsschritt vorteilhaft sein, da die Zellen nicht mehr mit den Antibiotika in Kontakt sind.
Nach Gewinnung der transformierten brüchigen Kalli kann die Regeneration der transgenen Pflanze eingeleitet werden, wobei mit der Regeneration transgener Sprossen und/oder Embryonen begonnen wird.
Das Verfahren zur Regeneration von transgenen Sprossen und/oder Embryonen gemäß der Erfindung ist gekennzeichnet durch die Gewinnung von transformierten brüchigen Kalli nach dem vorstehend beschriebenen Verfahren, gefolgt von Umsetzen der transformierten brüchigen Kalli auf ein Kulturmedium, zum Beispiel das MS-Medium, enthaltend 0 bis 3,0 mg 1&supmin;¹ eines Cytokinins und gegebenenfalls ein Bakteriostatikum und ein selektives Agens. Als Cytokinine seien Zeatin, Kinetin oder BAP erwähnt, zum Beispiel in einer Konzentration von 1 mg 1&supmin;¹. BAP ist besonders bevorzugt.
Nach einer Verzögerungszeit, die von einer Woche bis zu mehreren Monaten variiert, werden Sprossen und/oder Embryonen auf bestimmten Kalli regeneriert.
Ausgehend von diesen transgenen Sprossen und/oder Embryonen ist es erfindungsgemäß möglich, Pflanzen durch Umsetzen der Sprossen und/oder Embryonen auf ein Kulturmedium wie etwa das MS-Medium, enthaltend ein Cytokinin in geringer Konzentration, beispielsweise zwischen 0,05 und 0,15 mg 1&supmin;¹, vorzugsweise 0,1 mmg 1&supmin;¹, zu regenerieren. Bei diesem Schritt wird BAP bevorzugt. Die regenerierten Strukturen beginnen dann Blätter zu entwickeln, und sie werden in Töpfen oder Schalen in die vegetative Vermehrung zurückgeführt. Die am weitesten entwickelten Sprossen werden dann auf ein Medium für die Einwurzelung gesetzt, etwa das MS-Medium, das Naphthalinessigsäure enthält, beispielsweise 1 mg 1&supmin;¹. Die Wurzeln erscheinen 2 bis 6 Wochen danach. Die Pflanzen können dann im Gewächshaus akklimatisiert werden.
Die Erfindung betrifft auch die Herstellung von Samen aus transgenen Pflanzen durch Vernalisation dieser transgenen Pflanzen und Abernten der Samen nach der Blüte.
Die Erfindung betrifft auch die transformierten brüchigen Kalli, die transformierten Sprossen und/oder Embryonen, die transgenen Pflanzen sowie die transgenen Samen dieser Pflanzen, die sich nach den vorstehend beschriebenen Verfahren herstellen lassen.
Die Erfindung betrifft auch Samen von transgenen Pflanzen, die transgene Samen enthalten.
Ebenso betrifft die vorliegende Erfindung die genetische Transformation und die Regeneration von Zuckerrüben (Beta vulgaris Ssp. sacchanfera) mit dem Ziel, Pflanzen zu erzeugen, die gegen die Wurzelhaarkrankheit resistent sind.
Insbesondere haben die Erfinder Pflanzenzellen mit Hilfe von Sequenzen transformiert, die für das BNYVV-Kapsidprotein oder für dessen Varianten codieren.
Die Durchführung dieses Aspekts der Erfindung besteht in:
- dem Aufbau artifizieller Gene mit Resistenzpotential gegen das Virus der gelben nekrotischen Adern der Zuckerrübe (BNYVV: beet necrotic yellow vein virus) mit Hilfe von genetischen in vitro-Rekombinationstechniken;
- der stabilen Übertragung dieser Resistenzgene in Zuckerrüben.
Das für das BNYVV-Kapsidprotein codierende Gen wurde lokalisiert und sequenziert (Bouzoubaa et al., 1986). Es war jedoch nicht vorauszusehen, daß die Expression dieses Proteins in den Zellen der Rübe die Entwicklung des Virus hemmen würde. Bei diesem Virus, das durch den Erdpilz Polymixabetae übertragen wird, ist der Infektionsweg nicht vergleichbar mit dem derjenigen Viren, gegen die sich das BNYVV-Kapsidprotein als schützend erwiesen hat. Andererseits wird das BNYVV-Kapsidprotein durch das 5'-Ende der RNA2 codiert, das heißt, daß das Protein unmittelbar nach der Infektion in der infizierten Zelle translatiert werden kann. Bei anderen Viren wird das Kapsidprotein durch eine subgenomische RNA codiert, wird also später im Infektionszyklus produziert. Aus diesen Gründen war die durch das Kapsidprotein anderer Pflanzenviren dargebotene Schutzwirkung beim BNYVV nicht vorherzusehen.
Weiterhin stellten die Erfinder mehrere unerwartete Phänomene fest:
Erstens wurde beobachtet, daß Zellen, die durch die gleiche Sequenz transformiert sind, die für das 22 Kd-Kapsidprotein (Nudeotide 145 bis 708) und wenigstens einen Teil des 75 Kd- Proteins codiert, das zusammengesetzt ist aus dem 22 Kd-Protein, kondensiert mit dem 54 Kd-Protein (Nudeotide 709 bis 2218), zur Expression zweier Proteine in der gleichen Zelle führen, das heißt, dem 22 Kd-Protein und einem chimären Protein, das zusammengesetzt ist aus dem 22 Kd-Protein plus dem Teil des 75 Kd-Proteins, das durch die transformante Sequenz codiert wurde. Diese Expression ist das Ergebnis des "Readthrough"-Phänomens, wobei das Stopcodon am Ende des 22 Kd Proteins durch Suppressor-tRNAs bisweilen in der Zelle unterdrückt wird. Es wurde festgestellt, daß die Expressionsrate des chimären Readthrough-Proteins besonders hoch ist und eine Rolle bei der Resistenz spielen könnte, die der Zelle verliehen wird, welche die beiden Proteine gleichzeitig exprimiert.
Zweitens beobachteten die Erfinder, daß die erfindungsgemäßen exprimierten Proteine in der transgenen Pflanze speziell in den Wurzeln exprimiert werden, und dies trotz Verwendung von konstitutiven Promotoren.
Dieses Phänomen ist völlig unerwartet und bietet mehrere Vorteile für die Pflanze. Zunächst werden die Zellen, die das Ziel des BNYVV sind, spezifisch geschützt. Zudem bedeutet das Fehlen der Expression des Kapsidproteins und seiner Derivate in den oberirdischen Teilen der Pflanze - dem Teil, der nicht durch das BNYVV infiziert werden kann - eine wichtige Energieeinsparung für die Pflanze. Außerdem ist die Expression in den Wurzeln unter Ausschluß jeglicher Expression in anderen Pflanzenteilen ein Phänomen, das bei Verwendung eines Promotors, der "spezifisch" für die Wurzeln ist, nicht erzielt worden wäre. Dieser Promotortyp führt tatsächlich zu stärkerer Expression in den Wurzeln und einer schwachen Expression in den übrigen Pflanzenteilen. Versuche, die von den Erfindern unter Verwendung eines Markergens (GUS) durchgeführt wurden, haben belegt, daß die spezifische Expression nicht auf schlechtes Funktionieren des Promotors zurückgeht, da das Produkt der Expression des GUS-Gens in allen Teilen der Pflanze exprimiert wird, wenn sie unter der Kontrolle ebendieser Promotoren steht. Die spezifische Expression könnte das Ergebnis der Instabilität des Proteins in den oberirdischen Teilen der Pflanze oder einer schlechten Translation sein. Diese Experimente zeigen, daß der Promotor keine Rolle bei der spezifischen Expression zu spielen scheint.
Festgestellt wurde auch, daß der Promotor 35S in Rübenzellen eine 30- bis 50mal höhere Transkriptionseffizienz aufweist als der NOS-Promotor.
Die Erfindung betrifft transgene Pflanzen, welche produzieren:
- das Kapsidprotein des BNYVV;
- modifizierte Kapsidproteine wie nachstehend definiert (zusätzliche Aminosäuren, ausgetauschte Aminosäuren deletierte Aminosäuren), die die Schutzwirkung gegenüber BNYVV beibehalten;
- Sinn-RNAs und Antisense-RNAs unterschiedlicher Größen, die gegen unterschiedliche Regionen der RNA2 des BNWV gerichtet sind.
Insbesondere betrifft dieser Aspekt der Erfindung eine transgene Pflanze, die der Spezies Beta vulgaris angehört und gegen Infektion durch das Virus der gelben nekrotischen Adern der Zuckerrübe (BNYVV) resistent ist, wobei die Pflanze durch ein Nucleinsäure-Fragment stabil transformiert ist, dessen Expressionsprodukt imstande ist, diese Resistenz zu verleihen, wobei dieses Fragment abgeleitet ist vom 5'-Ende der genomischen oder subgenomischen RNA2 des BNYVV oder von der entsprechenden cDNA, wobei dieses Fragment für wenigstens einen Teil der Proteine codiert, die durch die Nudeotide 145 bis 3285 der RNA2-Wildtypsequenz codiert werden, und unter der Kontrolle eines Promotors steht, der die Expression des Fragments in den Pflanzenzellen ermöglicht, und die Orientierung Sinn oder Antisense aufweist.
Im Zusammenhang mit der Erfindung bezeichnet "vom 5'-Ende der RNA2 des BNYVV abgeleitetes" Fragment die entsprechende cDNA oder eine Variante, die mit dieser unter nicht stringenten Bedingungen hybridisieren kann, wobei deren Expressionsprodukt wenigstens 80% Homologie aufweist. Wichtig ist, daß die Varianten die Eigenschaft aufweisen, die Infektion durch das BNYVV in den exprimierenden Zellen hemmen zu können. Unter "hemmen" ist eine signifikante Minderung oder Verzögerung im Auftreten der Infektionssymptome und Vermehrung des Virus zu verstehen. Unter optimalen Bedingungen werden die Symptome und die Vermehrung des Virus vollkommen beseitigt.
Als Beispiel für ein bevorzugtes Nucleotidsäure-Fragment sei ein Fragment des 5'-Endes der genomischen RNA2 des BNYVV oder der entsprechenden cDNA erwähnt, das für wenigstens einen Teil des Proteins codiert, das durch die Nudeotide 145 bis 2218 der RNA2 codiert wird, oder für eine Variante dieses Proteins, die eine Homologie von wenigstens 80% aufweist und Insertion, Substitution oder Deletion von Aminosäure(n) umfaßt und die Resistenz gegen die Wurzelhaarkrankheit in den sie exprimierenden Zellen verleiht.
Ein weiteres Beispiel für eine transgene Pflanze gemäß dieses Aspekts der Erfindung ist eine solche, in der das Fragment für das Protein codiert, das durch die Nudeotide 145 bis 708 codiert wird, und außerdem für einen Teil des Proteins, das durch die Nudeotide 709 bis 2218 der RNA2 des BNYVV codiert wird. Erfindungsgemäß kann eine solche transgene Pflanze ein Fragment umfassen, welches für das Protein codiert, das durch die Nudeotide 145 bis 871 der RNA2 des BNYVV codiert wird, wobei dieses Fragment zum Beispiel aus den Nudeotiden 91 bis 871 der RNA2 des BNYVV zusammengesetzt sein kann.
Das transformierende Fragment kann auch für wenigstens einen Teil einer Variante des Proteins codieren, das durch die Nudeotide 145 bis 2218 codiert wird, wobei sich die Variante von der Wildtypsequenz durch das Vorhandensein der Sequenz Glu-Asp-Leu-Pro unterscheidet, die die Aminosäuren His-Ala ersetzt, die durch die Nudeotide 253 bis 258 der Wildtypsequenz codiert werden. Unter Wildtypsequenz ist die von Bouzoubaa et al. (1986) veröffentlichte RNA2-Sequenz zu verstehen, insbesondere die in Figur 2 dieser Veröffentlichung. Diese Abbildung gibt die Nucleotidsequenz sowie die Aminosäuresequenz an. Die Numerierung der in dieser Anmeldung verwendeten Basen ist die gleiche wie die von Bouzoubaa et al. verwendete.
Als Beispiel für die Teile dieses Variantentyps sei ein Fragment erwähnt, das zusammengesetzt ist aus den Nudeotiden 91 bis 871 der Wildtypsequenz, wobei die Nudeotide 253 bis 258 der Wildtypsequenz durch jene ersetzt sind, die für Glu-Asp- Leu-Pro codieren. Der Teil der Variante kann auch jenem entsprechen, der durch die Nudeotide 145 bis 255 in der Wildtypsequenz codiert wird, wobei die Nudeotide 253 bis 255 der Wildtypsequenz durch jene ersetzt sind, die für Glu codieren.
Ein weiteres Beispiel für eine transgene Pflanze gemäß diesem Aspekt der Erfindung ist eine solche, worin das Fragment für wenigstens einen Teil einer Variante des Proteins codiert, das durch die Nudeotide 145 bis 2218 codiert wird, wobei sich die Variante von der Wildtypsequenz durch das Vorhandensein der Sequenz Arg-Ser-Ser-Gly anstelle der Aminosäuren unterscheidet, die durch die Nudeotide 637 bis 651 der Wildtypsequenz codiert werden, wobei die Sequenz Arg-Ser-Ser-Gly das Carboxyl-terminale Ende des Proteins bildet.
Insbesondere exprimieren die transgenen Pflanzen gemäß den Aspekten der Erfindung Nucleinsäure-Fragmente, bestehend aus den Nudeotiden 91 bis 871 der RNA2 des BNYVV oder der entsprechenden cDNA-Sequenz, worin die Nudeotide 253 bis 258 gegebenenfalls durch GAA GAT CTT CCT ersetzt sind, oder worin die Sequenz GA AGA TCT TC in Position 638 unmittelbar nach C in Position 637 inseriert ist, oder auch die Fragmente BglII dieser Sequenzen.
Gemäß einer anderen Ausführungsform der Erfindung kann das transformierende Fragment aus den Nudeotiden 2078 bis 2774 der subgenomischen RNA2 des BNYVV bestehen. Das so exprimierte Protein entspricht dem NH&sub2;-terminalen Ende des 42 Kd-Proteins des BNYVV.
Beispiele für besonders bevorzugte transformante Nucleinsäure-Fragmente und die durch diese Fragmente codierten Proteine sind in Tabelle 1 (siehe Beispiel 6) wiedergegeben.
Von den besonders bevorzugten Sequenzen sei die Sequenz aufeinanderfolgender Basen erwähnt, die für wenigstens einen Teil des 22 Kd-Kapsidproteins (codiert durch die Nudeotide 145 bis 708) und außerdem für einen Teil des 75 Kd-Proteins (codiert durch die Nudeotide 709 bis 2218) codiert. Ein Beispiel für eine solche Sequenz ist die aus den Nudeotiden 91 bis 871 der RNA2 zusammengesetzte. Dieser das 22 Kd-Stopcodon enthaltende Sequenztyp führt zum Phänomen des "Readthrough", und die Zelle exprimiert somit zwei Proteine gleichzeitig.
Die Erfindung betrifft auch die durch die Expression dieser Sequenzen erzeugten Proteine, insbesondere das 29 Kd-Protein, das aus der Expression der Nudeotide 91 bis 871 der RNA2 resultiert und zur gleichen Zeit wie das 22 Kd-Kapsidprotein exprimiert wird.
Bei den Promotoren, die in den transgenen, gegen die Wurzelhaarkrankheit resistenten Pflanzen verwendet werden können, handelt es sich um all diejenigen, welche die Expression der Sequenz ermöglichen, die die Resistenz in der Pflanze verleiht. Besonders bevorzugt sind die Promotoren 35S und NOS, bei denen es sich um den Promotor des großen Transkripts 35S des Blumenkohlmosaikvirus bzw. den Promotor des Nopalinsynthasegens handelt. Die Verwendung dieser konstitutiven Promotoren, insbesondere p35S, führt überraschenderweise zur spezifischen Expression des schützenden Proteins in den Wurzeln.
Weitere Transkriptionssignale zur Verwendung mit dem Promotor sind Terminatoren, zum Beispiel Nos.
Die transgenen Samen der gegen die Wurzelhaarkrankheit resistenten transgenen Pflanzen gehören ebenfalls zu diesem Aspekt der Erfindung.
Die bei der erfindungsgemäßen Transformation der Pflanzen verwendeten Sequenzen können als Nudeinsonde in Kombination mit Hilfsmitteln verwendet werden, die den Nachweis der Hybridisierung ermöglichen, um die Gegenwart der Sequenzen in den transformierten Zellen festzustellen. Dies kann von Nutzen sein, um den transformierten Zustand der Zellen zu verifizieren.
Dieser Aspekt der Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung transgener Pflanzen, die der Spezies Beta vulgaris angehören und gegen Infektion durch das BNYVV resistent sind, wobei die Pflanze speziell in den Wurzeln ein Protein exprimiert, das diese Resistenz zu verleihen vermag; dieses Verfahren umfaßt die Transformation von Zellen, die von Beta vulgaris stammen, mit Fragmenten wie vorstehend beschrieben durch den Zwischenwirt Agrobacterium tumefadens, wobei die Transkription des Fragments der Kontrolle eines konstitutiven Promotors wie etwa p35S oder pnos unterliegt, gefolgt von der Regeneration einer transgenen Pflanze aus transformierten Zellen.
Die verschiedenen Aspekte der Erfindung seien anhand der folgenden, nicht einschränkenden Beispiele erläutert. Insbesondere erläutern diese Beispiele:
- die Produktion von Fragmenten mit genetischer Information, modifiziert durch das Virus BNYVV oder nicht, durch die Pflanze;
- die Expression dieser Fragmente einer DNA viralen Ursprungs unter konstitutiven Promotoren (35S, NOS);
- die Verifizierung dieser Expression durch den Nachweis der entsprechenden MRNAs in den habituierten und transformierten Zellsuspensionen;
- die Bestätigung, daß in der gleichen Zelle zwei Proteine unterschiedlicher Größe, codiert durch das gleiche Gen, produziert werden:
* das BNYVV-Kapsidprotein mit 22 Kd (188 Aminosäuren),
* das vom Kapsidprotein abgeleitete chimäre Protein mit 29 Kd (252 Aminosäuren);
- die Verwendung dreier entwaffneter Agrobacterium tumefaciens- Stämme für die Transformation von Zellsuspensionen und brüchigen Kalli der Rübe;
- die Gewinnung von Suspensionen transformanter Zellen, induziert ausgehend von auf Kanamycin selektionierten Kalli nach Transformation von Suspensionen habituierter Zellen;
- die Verwendung dieser Suspensionen transformierter Zellen als Modell für die Prüfung der Expression des ganzen DNA- Fragments unter Kontrolle geeigneter Promotoren;
- die Verwendung dieser Zellsuspensionen für die Prüfung der Hemmung der viralen Vermehrung durch ein gegebenes Gen;
- die Hemmung der Vermehrung des BNYVV in Protoplasten, die aus Suspensionen transformierter Zellen stammen und die beiden Proteine mit 22 Kd und 29 Kd produzieren, wobei die Protoplasten als Modell für die Prüfung der Infizierbarkeit der Zelle dienen und die Zellen nicht direkt durch die Viren infiziert werden können;
- die Transformation frischer brüchiger organogener Kalli;
- Gewinnung von transformierten organogenen, auf Kanamycin selektionierten Kalli nach Transformation der frischen brüchigen organogenen Kalli;
- die Möglichkeit der sehr frühzeitigen, gleichzeitigen Beseitigung des selektiven Agens (Kanamycin) und des Bakteriostatikums (Cefotaxim) aus dem Kulturmedium der Kalli;
- die Entwicklung von Sprossen oder Embryonen zu transformierten eingewurzelten Pflanzen, aus den transformierten Kalli;
- die Expression der transferierten Gene in der Pflanze;
- der Nachweis, daß die Proteine mit 22 und 29 Kd speziell in den Wurzeln der transformierten Rüben produziert werden;
- das Fehlen der Produktion der Proteine mit 22 und 29 Kd im oberirdischen Teil der transformierten Pflanzen;
- die Produktion transgener Samen aus primären Transformanten;
- der Nachweis, daß die aus den transgenen Samen hervorgegangenen Keimlinge gegen die wurzelhaarkrankheit resistent sind.
Die Figuren 1 bis 11 und die Tabellen 1 bis 3 erläutern verschiedene Aspekte der Erfindung, insbesondere:
Figur 1: Genetische Struktur der RNA2 des BNYVV nach Bouzoubaa et al. (1986).
Figur 2: Herstellung der Expressionsvektoren pBIOS1 und pBIOS3.
pBIOS1 enthält den Promotor (pNOS) und den Terminator (NOS 3') des Gens der Nopalinsynthase, getrennt durch eine Restriktionsschnittstelle BamHI (B) und flankiert von zwei EcoRI-Stellen (E).
pBIOS3 ist ein Derivat von pBIOS1, worin der Promotor Nos ersetzt wurde durch den Promotor des Transkripts 35S (p35S) des Blumenkohlmosaikvirus (Cauliflower Mosaic Virus: CAMV), isoliert vom Plasmid pJEA25 (überlassen von T. Michael). Abkürzungen: B = BamHI; E = EcoRI; H = HindIII; Hp = HphI; P = PstI; S = SmaI; Sst = SstI; X = XhoII; T4 DNA Pol = T4-DNA- Polymerase; K = Klenow-Polymerase; EMet EcoRI-Methylase; Ap = Ampicillin; bp = Basenpaare.
Figur 3: Chimäre Gene, die für das BNYVV-Kapsidprotein und für das abgeleitete chimäre Protein codieren.
Ausgehend vom Plasmid pBC2, enthaltend die DNA-Kopie des 5'-Endes der RNA2, isolierten wir ein Fragment DraI-BglI mit 780 bp (Position 91 bis 871). Dieses Fragment wurde mit T4- DNA-Polymerase behandelt, und die BamHI-Linker wurden zugesetzt, wodurch dessen Klonierung an der BamHI-Stelle der Expressionsvektoren pBIOS1 und pB1053 ermöglicht wurde. Die beiden erhaltenen Plasmide pBIOL-1B und pBIO3-1B weisen das DNA-Fragment in der Sinn-Orientierung auf.
Abkürzungen: B = BamHI; D = DraI; E = EcoRI; P = PstI; Sst = SstI; T4 DNA Pol = T4-DNA-Polymerase; CAP = theoretischer Start des Transkripts; A&spplus; = Signal der Polyadenylierung; ATG = Startcodon; TGA, TAA = Stopcodons.
Figur 4: Herstellung von pBIO1-2B und pBIO1-5B.
Figur 5: Herstellung der Transfervektoren.
Die verschiedenen funktionellen genetischen Gebilde, abgeleitet von pBIOS1 und pBIOS3, werden in den binären Vektor pGA492 inseriert. Die Derivate von pBIOS1 werden an die EcoRI-Stelle kloniert, und es werden nur diejenigen Konstrukte zurückgehalten, die in einem zum Neomycinphosphotransferase-Gen (npt) identischen Transkriptionssinn orientiert sind, während die pBIOS3-Derivate zwischen die Ssti-Stelle und die EcoRI-Stelle inseriert werden und sich zwangsläufig in der richtigen Orientierung befinden. Es wurden so 32 von pGA492 abgeleitete Plasmide erhalten.
Abkürzungen: E = EcoRI; Sst = SstI; npt = Neomycinphosphotransferase; cat = Chloramphenicolacetyltransferase; BR und BL = rechte und linke T-DNA-Bordersequenzen; tet = Tetracyclin-Resistenz; Kb = Kilobasen.
Figur 6: Der binäre Vektor pGA-β-3-1B.
Legende: 35S = Promotor 35S des Blumenkohlmosaikvirus; 5'NOS = Promotor des Nopalinsynthase-Gens; NOS = Terminator des Nopalinsynthase-Gens; NPT Neomycinphosphotransferase-Gen; UID A = Gen der β-Glucuronidase von E. coli; BR und BL = rechte und linke T-DNA-Bordersequenzen von pTiT37; amp. = Gen der Resistenz gegen Ampicillin; tet. = Gen der Resistenz gegen Tetracyclin; kana. = Gen der Resistenz gegen Kanamycin; E = EcoRI; H HindIII; S = SstI; = Ursprung der Replikation von RK2.
Figur 7: Western-Blot-Analyse der Suspensionen von Zellen, die durch den binären Vektor pGA-β-3-1B transformiert sind. Legende: CP = Kapsidprotein; WT = nichttransformierte Suspension; 20 ng und 2 ng = Rekonstruktion mit den angegebenen BNYVV-Mengen; β-Glu = β-Glucuronidase; MW = Angabe des Molekulargewichts.
Eingerahmt ist die Struktur des chimären Gens wiedergegeben, das für das Kapsidprotein codiert.
p35S = Promotor des Blumenkohlmosaikvirus; Nos = Terminator des Nopalinsynthase-Gens; tag = Stopcodon des BNYVV: Readthrough; tag = das im Terminator sitzende Stopcodon; atg = Start codon.
Figur 8: Infektion von Protoplasten der Rübe durch das BNYVV F13 ( , ) und S2 ( ) mit Hilfe der PEG-Methode. ( ) stellt die Ergebnisse dar, die mit inaktiviertem Virus erhalten werden.
Figur 9: Infektion von Protoplasten der Rübe durch Elektroporation in Gegenwart ( ) und in Abwesenheit ( ) von 5 mM CaCl&sub2;. Die entsprechenden offenen Symbole stellen den Prozentanteil an lebensfähigen Protoplasten in Gegenwart (V) und in Abwesenheit ( ) von 5 mM CaCl&sub2; dar.
Figur 10: Densitometrische Kurven der Analysen von RNA-Extrakten von infizierten Protoplasten, isoliert aus Linien, die das BNYVV-Kapsidprotein exprimieren (----) oder dieses nicht exprimieren ( ).
Figur 11: Western-Blot-Analyse von Proteinextrakten aus 3 transgenen Rüben mit Hilfe zweier Sera: einem Anti-BNYVV- Serum und einem Anti-β-glucuronidase-Serum.
Abkürzungen: L Blattfläche; P = Blattstiel; R = Wurzel; Te = Kontrolle; 5 = Suspension transformierter Zellen; 2 ng = 2 ng an gereinigtem BNYVV; 14-3, 22-1 und 68-1 bezieht sich auf drei verschiedene transgene Rüben.
Tabelle 1: Die 16 Gene mit Resistenzpotential gegen BNYVV mit ihren theoretischen Produkten.
Anm.: Die Zahlen in Klammern geben die Position der Restriktionsschnittstellen gemäß der BNWV-Sequenz an; Δ stellt den zugesetzten BglII-Linker dar. Die Größe des Transkripts entspricht dem Teil des komplementären Messengers des BNYVV.
Tabelle 2: Verschiedene Kulturmedien, die beim erfindungsgemäßen Transformations- und Regenerationsverfahren verwendet wurden.
Tabelle 3: BNYVV-Infektion von Protoplasten, die von transformierten und nichttransformierten Zellen stammen. 1 10&sup6; Protoplasten wurden mit 5 µg BNYVV (F13 oder 52) geimpft, außer bei Versuch 4, wo das Impfmaterial aus 30 µg BNYVV bestand. Die Zahlen stellen den Prozentanteil an fluoreszierenden Protoplasten dar, die 30 h nach dem Impfen erfaßt wurden. CP&spplus; und CP&supmin; sind transformierte Zellinien, die das BNYVV-Kapsidprotein exprimieren bzw. nicht exprimieren.

Beispiel 1: Extraktion der viralen RNA

Die Vermehrung des BNYVV erfolgt auf Chenopodlum quinoa nach manueller Impfung, und die Extraktion erfolgt ausgehend von Blättern mit achttägigem Virusbefall nach der Technik von Putz (1977). Die so erhaltene Virus-Suspension wird auf 100 mM NaCl eingestellt, dann zweimal mit Phenol extrahiert, wonach die wäßrige Phase zweimal mit Ether gewaschen wird. Die viralen RNAs werden durch Zugabe von zwei Volumina destilliertem Ethanol gefällt und bei -20ºC aufbewahrt. Anzahl und Größe der RNAs wurde von Richards et al. (1985) berichtet.

Beispiel 2: Herstellung der cDNA der RNA2

Richards et al. zeigten 1985, daß die RNA2 ein wirksamer Messenger für die Synthese des Kapsidproteins ist. Eine zu einem Teil der RNA2 komplementäre DNA wurde mit Hilfe der Methode von Van der Werf et al. (1981) synthetisiert und an die Pstl-Stelle des Plasmids pBR322 kloniert (Bolivar et al., 1977). Das resultierende Plasmid pBC2 enthält eine DNA-Kopie, entsprechend den 2938 Basen des 5'-Endes der RNA2 (Richards et al., 1985).

Beispiel 3: Bestimmung der Sequenz des 5'-Endes der RNA2

Mit Hilfe der Technik von Maxam und Gilbert (1980) und der von Sanger (1977) wurde die Sequenz des Klons pBC2 bestimmt. Die detaillierte Sequenz ist in der Veröffentlichung von Bouzoubaa et al. (1986) mit der schematisierten genetischen Struktur der RNA2 dargestellt. Die Untersuchung dieser Sequenz bestätigte das Vorhandensein des Kapsidproteins in Höhe des ersten, an 5' befindlichen Cistrons, wobei das ATG-Startcodon 144 Nudeotide vom 5'-Ende gelegen ist. Dieses Protein mit einem Molekulargewicht von 22 Kd trägt 188 Codons und endet mit einem Codon Amber UAG. Die aus der Sequenz abgeleitete Aminosäure-Zusammensetzung ist identisch mit der des BNYVV-Kapsidproteins, die von C. Putz (1977) bestimmt wurde. Unmittelbar auf das Stopcodon (UAG) folgt eine offene Phase, die ein Codierungsvermögen entsprechend einem Polypeptid von 54 Kd aufweist. Mit Hilfe der Suppression des UAG-Codons läßt sich somit ein offenes Leseraster erhalten, das ein Protein mit 75 Kd codieren kann. Diese Daten stehen in Einklang mit den von Ziegler et al. (1985) erhaltenen Ergebnissen, die zeigen, daß die RNA2 ein wirksamer Messenger für die Synthese der beiden Proteine ist, die durch Anti-BNYVV-Serum präzipitiert werden und deren Synthese in Gegenwart eines tRNA-Suppressors verstärkt wird. All diese Resultate werden in der Veröffentlichung von Bouzoubaa et al. (1986) erörtert; es wird auch festgestellt, daß sich ein drittes Leseraster, das in vitro für ein Protein codieren kann, aus einer subgenomischen RNA der RNA2 entwickelt, die aufgeklärt wurde und die sich umhüllen läßt.

Beispiel 4: Herstellung der Expressionsvektoren

In erster Linie wurden die Transkriptionssignale des Nopalinsynthase-Gens des Bakteriums Agrobacterium tumefaciens T 37 eingesetzt. Ausgehend von dem von Bevan (1983) hergestellten Plasmid pNosneoΔ 18, dessen Struktur in Figur 2 dargestellt ist, enthält dieses die Sequenz des Klonierungsvektors pUC9 (Vierra et al., 1982) mit einem Fragment EcoRI-BamHI mit 260 bp und einem Fragment HindIII-XHOII (BamHI-BglI) mit 310 bp. Diese beiden Fragmente, die aus dem tumorbildenden Plasmid pTiT37 von Agrobacteriumtumefaciens T 37 stammen, enthalten das Signal der Polyadenylierung bzw. den Promotor des Nopalinsynthase-Gens. Diese beiden Transkriptions signale flankieren ein Fragment BglII-BamHI mit 1000 bp, welches das für die Aminoglycosidphosphotransferase II codierende Gen enthält; ausgehend von diesem Plasmid wurde das Fragment mit 1000 bp durch schonenden Abdau mit dem Restriktionsenzym XhoII entfernt, und die Moleküle mit einer Größe von etwa 3300 bp wurden nach Wanderung auf Agarose-Gel gewonnen. Nach Ligation und Transformation in E.coli HB101 (Bolivar et al., 1979) wurden Ampicillin-resistente Transformanten selektioniert. Die meisten dieser Techniken sind beschrieben in "Molecular doning. A Laboratory Manual" (Maniatis et al., 1982). Durch Kartieren mit Hilfe eines Restriktionsenzyms erhielten die Erfinder das Plasmid pNosΔneo, das ein Fragment EcoRI-BamHI mit 260 bp und ein Fragment BamHI-HindIII mit 310 bp besitzt. Aus Gründen der Zweckmäßigkeit bei der Verwendung dieses Plasmids ersetzten die Erfinder die Restriktionsschnittstelle HindIII durch eine EcoRI-Stelle (Einzelheiten nicht angegeben) und erhielten so den Expressionsvektor pBIOS1 (Figur 2).
Im Umfang der Erfindung wurde ein weiterer Expressionsvektor hergestellt. Er besitzt die gleiche Struktur wie pBIOS1, wobei das gleiche Fragment das Signal der Polyadenylierung umfaßt, aber das Promotor-Fragment verändert ist. Tatsächlich wurde das Fragment PstI-BamHI, umfassend den Promotor des Nopalinsynthase-Gens, durch ein EcoRI-BamHI-Fragment mit 400 bp ersetzt, das den Promotor des großen Transkripts 35S des Blumenkohlmosaikvirus (CaMV) enthält. Dieses Fragment wurde aus dem Plasmid pUC35S erhalten, das aus der Klonierung eines Fragments BamHI-HphI an der Smai-Stelle des Klonierungsvektors pUC13 stammt (Messing, 1983). Ausgangspunkt des Fragments BamHI-HphI war das von T. Michael hergestellte Plasmid pJEA25, der ein DdeI-Fragment herausnahm, das sich von Position 7069 bis Position 7569 des von Franck et al. (1980) beschriebenen CaMV-Isolats BJ1 erstreckt. Nachdem er die Enden dieses Fragments mit Hilfe von BamHI-Linkern modifiziert hatte, klonierte T. Michael dieses an die BamHI-Stelle des Plasmids pAT513 (Twigg et al., 1980). In Figur 2 sind die verschiedenen Stufen der Herstellung des Expressionsvektors pBIOS3 schematisiert dargestellt.
Bei den beiden Expressionsvektoren pBIOS1 und pBIOS3 liegt die Restriktionsschnittstelle BamHI zwischen den beiden DNA- Fragmenten, die zum einen den Promotor und zum anderen das Polyadenylierungssignal enthalten; dieser Umstand ist ideal für die Insertion jeglicher Fremd-DNA, die zum Substrat für die Transkription werden soll.

Beispiel 5: Insertion der cDNA-Fragmente des BNYVV an der BamHI-Stelle der Expressionsvektoren

Das Plasmid pBC2 wurde mit Hilfe der Restriktionsenzyme BglI und DraI abgedaut, und anschließend wurde das an der BglI- Stelle gebildete Ende durch Verwendung der DNA-Polymerase des Bakteriophagen T4 supprimiert. Das Fragment wurde durch Elution aus einem Agarose-Gel nach elektrophoretischer Trennung gereinigt. BamHI-Linker wurden an den Enden dieses Fragments angesetzt, und nach Verdau mit einem großen Überschuß an Restriktionsenzym BamHI wurde das Fragment mit 780 bp mit den an der BamHI-Stelle geöffneten Vektoren pBIOS1 und pBIOS3 inkubiert. Nach Ligation diente diese Mischung zur Transformation von E. coli HBIO1. Nach Aussortieren der Ampicillinresistenten Klone wurden vier Plasmide erhalten. Die pBIO1-1B und pBIOS3-1B genannten Plasmide besitzen das cDNA-Fragment, das die Sequenz enthält, die das Kapsidprotein zum einen unter der Kontrolle des Promotors Nos und zum anderen unter der Kontrolle von 35S codiert (Figur 3).
Diese Plasmide können die Produktion von Messenger-RNAs steuern, die, sobald sie translatiert sind, gleichzeitig das BNYVV-Kapsidprotein und ein chimäres Protein mit 29 Kd erzeugen, das aus der Suppression des Stopcodons herrührt (Phänomen des Readthrough). Dieses Protein mit 252 Aminosäuren ist wie folgt zusammengesetzt:
- 188 Aminosäuren des Kapsidproteins;
- 53 Aminosäuren des Proteins mit 75 Kd, das von Position 189 bis einschließlich 241 reicht;
- 11 Aminosäuren, die durch die Terminationssequenz der Nopalinsynthase codiert werden, nämlich: Threonin, Glycm, Serin, Prolin, Isoleucin, Leucin, Glutamin, Threonin, Phenylalanin, Glycin, Glutamin.
Es wurden zwei weitere Plasmide erhalten; diese pBIO1-1A und pBIOS3-1A genannten Plasmide besitzen das cDNA-Fragment des BNYVV in umgekehrter Orientierung unter der Kontrolle zweier Promotoren. Diese Plasmide können die Produktion sogenannter Antisense-Messenger-RNAs steuern, bei denen es sich um komplementäre Messenger des 5'-Teils der RNA2 handelt.

Beispiel 6: Herstellung einer Klasse von Genen, die die Produktion von modifizierten BNYVV-Kapsidproteinen und Antisense-RNA unterschiedlicher Größe ermöglichen

Es wurden zwei von pBIO1-1B abgeleitete Plasmide hergestellt, das Plasmid pBIO1-2B und das Plasmid pBIO1-5B. Die verschiedenen Stufen der Herstellung dieser Plasmide sind in Figur 4 dargestellt. Kurz umrissen wurde für die Herstellung von pBIO1-2B das Plasmid pBIO1-1B an der SphI-Stelle (Position 256 der RNA2) geöffnet, die "kohäsiven" Enden wurden durch Verwendung der DNA-Polymerase des Bakteriophagen T4 (Deletion von 4 bp) beseitigt, und es wurden BglII-Linker mit 10 bp an die so erzeugten offenen Enden ligasiert. Nach erschöpfendem Abdau mit BglII wurde das Plasmid religasiert. Nach Transformation in E. coli wurde das Plasmid pBIO1-2B erhalten; dieses enthält nicht mehr die SphI-Stelle, und an dieser Position findet sich jetzt eine BglII-Stelle. Diese Manipulation ermöglicht zweierlei: erstens die Gewinnung einer Restriktionsschnittstelle, die für andere Herstellungen nutzbar ist (die Enden sind kompatibel zu denen mit BamHI erzeugten), und zweitens die Gewinnung einer modifizierten codierenden Sequenz, die für ein Kapsidprotein codiert, das zwei zusätzliche Aminosäuren besitzt und bei dem zwei Aminosäuren verändert sind. Das Plasmid pBIO1-5B wurde durch eine Manipulation gleicher Art erhalten, aber in diesem Falle ist es die SmaI- Stelle von pBIO1-1B (Position 637 der RNA2), die durch die Linker BglII modifiziert wurde. Dieses Plasmid codiert für ein um 19 Aminosäuren verkürztes Kapsidprotein, bei dem die vier letzten modifiziert sind.
Durch Verwendung der BglII- und BamHI-Stellen dieser beiden Plasmide konnten die Erfinder verschiedene cDNA-Stücke, die das 3'-Ende oder das 5'-Ende des Kapsidproteins ergeben, isolieren und in die beiden Expressionsvektoren pBIOS1 und pBIOS3 einklonieren, und zwar mit verschiedenen Längen. Auf diese Weise wurde eine Klasse von Genen erhalten, die einer Zelle oder einer Pflanze, die das Produkt eines oder mehrerer dieser Gene erzeugt, gegen BNYVV Resistenz verleihen können. All diese verschiedenen cDNA-Fragmente sind in Tabelle 1 mit den erwarteten Produkten (Transkript und Protein) dargestellt, wobei sich der Buchstabe B auf eine Sinn-Orientierung und A auf eine Antisense-Orientierung bezieht. TABELLE 1 Code cDNA-Fragment Transkript Protein RNA mit korrektem Sinn Kapsidprotein mit 22 Kd (188 Aminosäuren) und abgeleitetes chimäres Protein 29 KD Mutiertes Kapsidprotein Terminus des Kapsidproteins Abgeschnittenes Kapsidprotein Code cDNA-Fragment Transkript Protein Antisense
Anm.: Die Zahlen in Klammern kennzeichnen die Position der Restriktionsschnittstellen gemäß der Sequenz des BNYVV; Δ stellt den zugesetzten Linker BglII dar. Die Größe der Transkripte entspricht dem Teil des komplementären Messengers des BNYVV.
In der Tabelle ist auch ein Fragment dargestellt, das sich von Position 2078 bis 2774 erstreckt; es handelt sich um ein Fragment Sau 3A der RNA2, das dem 5'-Ende der subgenomischen RNA entspricht, die für das Protein mit 42 Kd codiert (Figur 1). Die Erfinder klonierten dieses Fragment in die Expressionsvektoren pBIOS1 und pBIOS3, und zwar in beiden Orientierungen (8B und 8A).

Beispiel 7: Einführung der Gene in einen binären Vektor

Der gewählte binäre Vektor pGA492 wurde von G. An (1986) hergestellt. Dieses Plasmid hat eine Größe von 12 kb, und seine Genkarte ist in Figur 5 dargestellt. Dieses Plasmid besitzt:
- zwei DNA-Fragmente, die die T-DNA des tumorbildenden Plasmids pTiT37 enthalten; diese Sequenzen legen den transferierten Teil fest und sind für den Transfer unentbehrlich;
- ein chimäres Gen, das die codierende Sequenz des Neomycinphosphotransferase-Gens des Transposons Tn5 (Rothstein et al., 1981) enthält, welches an ein Fragment kondensiert wird, das den Promotor des Nopalinsynthase- Gens und die ersten Codons der codierenden Sequenz ebendieses Gens enthält. Das chimäre Gen wird durch das Polyadenylierungs signal des Nopalinsynthase-Gens terminiert. Dieses Gen verleiht Pflanzenzellen, die dieses enthalten, die Fähigkeit, sich in Gegenwart von Kanamycin zu vermehren, das normalerweise ein toxisches Antibiotikum für diese ist;
- mehrere unverwechselbare Restriktionsschnittstellen, die die Klonierung der in vitro hergestellten Gene ermöglichen;
- einen Replikationsursprung mit großem Wirtsspektrum, der in E. coli und in Agrobacteriumtumefaciens funktioniert;
- einen Transfer-Ori und die mob-Gene, die für den Transfer durch bakterielle Konjugation erforderlich sind;
- ein Resistenzgen gegen Tetracyclin, das die Selektion von transkonjugierten Bakterien ermöglicht;
- ein Resistenzgen gegen Tetracyclin, das die Selektion von transkonjugativen Bakterien ermöglicht.
In Figur 5 stellen die Erfinder beispielhaft die Einführung von zwei Genen dar, den Genen, die von pBIO1-1B und pBIO3-1B getragen werden. Alle cDNA-Fragmente unter der Kontrolle des Promotors Nos (pBIOS1-Derivate) werden nach Isolierung der jeweiligen Gene mit EcoRI an die EcoRI-Stelle von pGA492 kloniert. Es werden nur diejenigen Klone zurückbehalten, welche die Gene im gleichen Transkriptionssinn aufweisen wie das Gen, das Resistenz gegen Kanamycin verleiht. Bei den Genen, die den Promotor 35S des CaMV enthalten (pBIOS3-Derivate) erfolgt die Klonierung zwischen der Ssti- und der EcoRI-Stelle von pGA492 nach Abdau der verschiedenen Plasmide durch diese beiden Enzyme. Es wurden 32 Vektoren erhalten, wovon zwei in Figur 5 dargestellt sind, pGA-1-1B und pGA-3-1B.

Beispiel 8: Einführung eines Reportergens in den binären Vektor pGA-3-1B

Die Bestätigung der transformierten Eigenschaften eines Pflanzengewebes erfolgt in vielen Fällen durch Nachweis der durch die transferierten Gene codierten Proteine. Im Falle des binären Vektors pGA-3-1B konnten die Erfinder mit Hilfe immunologischer Techniken das BNYVV-Kapsidprotein bestimmen und durch eine enzymatische Bestimmung die Aktivität der Neomycinphosphotransferase erfassen, die die Resistenz gegen Kanamycin verleiht. Allerdings sind die Bestimmungen langwierig und schwierig und erfordern eine beträchtliche Menge an pflanzlichem Material.
In 1987 verwendeten Jefferson et al. das Gen uid A von E. coli, das für das Enzym β-Glucuronidase (GUS E.C.3.2.2.31) codiert, als Reportergen. Unter der Kontrolle pflanzlicher Transkriptionssignale (Promotor 35S des CaMV und Terminator Nos) exprimiert sich dieses Gen in den Pflanzenzellen sehr gut, und das Enzym erweist sich als sehr stabil. Für die Bestimmung der enzymatischen Aktivität dieses Proteins stehen mehrere Methoden zur Verfügung, da es verschiedene Substrattypen gibt, insbesondere Substrate, die chromogene Produkte ergeben, und Substrate, die fluoreszierende Produkte ergeben. Es können quantitative Bestimmungen (Intensität der Fluoreszenz) und qualitative Bestimmungen mit Hilfe der Histochemie (Auftreten eines blau-indigofarbenen Präzipitats) mit wenig pflanzlichem Material in einfacher Weise durchgeführt werden. Um bei den Transformationsexperimenten aus diesem Reportersystem Nutzen zu ziehen, haben die Erfinder den binären Vektor pGA-β-3-1B hergestellt. Die genetische Struktur dieses Plasmids ist in Figur 6 dargestellt. Das Gen, das die Vermehrung des BNYVV hemmen kann, wird flankiert von dem Gen, das Resistenz gegen Kanamycin verleiht, sowie von dem Gen, das für β-Glucuronidase codiert. Zur Durchführung dieser Herstellung inserierten die Erfinder das an seiner EcoRI- Stelle offene Plasmid pPI221 (Jefferson, 1987) an die EcoRI- Stelle des binären Vektors pGA-3-1B. Der resultierende binäre Vektor pGA-β-3-1B (mit einer Größe von 19 kb) wurde durch triparentale Konjugation gemäß der von Ditta et al. (1980) beschriebenen Technik in die entwaffneten Agrobacterium-Stämme (LBA 4404, EHA 101, C58'3) übertragen.

Beispiel 9: Gewinnung regeneranter brüchiger Kalli aus Blättern

In einem Gewächshaus wurden Rübensamen in Humuserde eingesät. Diese Samen stammten von der amerikanischen Sorte "REL 1".
Etwa einen Monat nach der Keiinung im Gewächshaus wurden die ersten Versuche zur Induktion von Kalli gemäß der von Saunders et al. (1986) beschriebenen Methode durchgeführt:
- einer jeden Pflanze werden junge, 3 bis 5 cm lange Blätter abgenommen;
- diese werden wie folgt desinfiziert: fünf Minuten lang Reiniger der Marke Domestos 15%, drei Spülungen mit sterilem Wasser, Trocknung auf sterilem Filterpapier;
- ein jedes Blatt wird anschließend in Stücke von etwa 0,25 cm² geschnitten;
- die so erhaltenen Explantate werden in Petri-Schalen auf MSB1-Medium (Tabelle 2) kultiviert;
- die Schalen werden, nachdem sie mit einer Kunststoff- Folie der Marke Scello-frais luftdicht verschlossen wurden, 30 Tage lang bei 30ºC im Dunklen belassen;
- dann werden sie in Kulturkammern überführt; LID 18/8, 25ºC/20ºC.
Vier bis zehn Wochen nach Kulturbeginn erscheinen auf oder unter den Blattexplantaten weiße brüchige Kalli.
Eine bis acht Wochen nach dem Erscheinen der Kalli beginnt die Regeneration der Sprossen und/oder Embryonen aus diesen Kalli. TABELLE 2: KULTURMEDIEN MS: Auf einen Liter: 4,4 g dehydratisiertes Medium nach Murashige und Skoog, von SIGMA, Ref. M6899; Vitamine: 1 mg Calciumpantothenat 0,01 mg Biotin 1 mg Nicotinsäure 1 mg Pyridoxin HCL 10 mg Thiamin HCL 30 g Saccharose pH: 5,8 Festmedium: 8 g Agar-Agar MSB1: MS + 1 mg/1 BAP MSBO, 1: MS + 0,1 mg/1 BAP MS für Einwurzelung: MS + 1 mg/l Naphthalinessigsäure Ausbreitung der Zellen: MSB1 + C MSB + 300 mg/l Cefotaxim MSB1 + CK MSB + 300 mg/l Cefotaxim + 200 mg/1 Kanamycin Auf 1 Liter: 10 g Bactotrypton 5 g Hefeextrakt 10 g NaCl

Beispiel 10: Gewinnung von Zellsuspensionen aus induzierten Kalli

Vier bis sechs Wochen nach ihrem Erscheinen werden die Kalli abgenommen (wobei alle gegliederten Strukturen vermieden werden) und in 250 ml-Erlenmeyern, die mit einer durch zwei Gummibänder am Hals gehaltenen Cellophanfolie verschlossen sind, in 100 ml flüssigem MSB1-Medium kultiviert. Die Erlenmeyer werden mit etwa 200 U/min in der Kulturkammer gerührt.
Die Zellsuspension stellt sich in 2 oder 3 Wochen ein. Eine jede Suspension wird etwa alle 3 Wochen wie folgt umgesetzt:
- nach 3 Wochen Kultivieren wird der Inhalt eines jeden Erlenmeyers über eine Reihe von drei übereinandergestapelten Sieben (deren Maschenweiten 1 mm, 500 µm und 100 µm betragen) filtriert. Ein Teil einer jeden Fraktion (> 1 mm, > 500 µm, > 100 µm) wird in 250 ml-Erlenmeyern in frischem MSB1-Medium wieder in Suspension gebracht. Diese neuen Suspensionen werden wiederum mit 200 U/min gerührt. Die Beobachtung der verschiedenen Zellsuspensionen, die sich aus den verschiedenen Genotypen einstellen, gestattet die Unterscheidung zweier Zelltypen:
* der habituierte Typ (A): feine grüne Suspension, mit schnellem Wachstum, regeneriert punktuell glasartige Formationen, die sich schwer entwickeln;
* der knötchenförmige Typ (C): Suspension kompakter gelblicher Aggregate, mit langsamerem Wachstum, regeneriert häufiger als erstere, die kompakten embryonalen Strukturen entwickeln sich recht gut.

Beispiel 11: Transformation von Zeilsuspensionen und jungen Kalli

Zellsuspension

Die Transformation wird mit Zellsuspensionen nach dreiwöchigem Kultivieren ohne Umsetzen durchgeführt.
In einem sterilen und graduierten Kunststoffrohr wird ein Teil der Suspension in einer Weise aufgefangen, daß 5 ml abgesetzte Zellen in 10 ml Medium vorliegen. Es werden 10 ml frisches MSB1-Medium zugesetzt. Die so erhaltene neue Suspension wird auf vier Petri-Schalen zu je 5 ml pro Schale verteilt.
Bei den geprüften Agrobacteriuni tumefaciens-Stämmen handelt es sich um LBA 4404, EHA 101, C58'3. Ein jeder dieser Stämme enthält binäre Vektoren, welche die hergestellten Gene tragen (Beispiele 5 und 6) und insbesondere den Vektor pGA-β-3-1B (Beispiel 8).
Die Bakterienstämme werden bei -20ºC in 15% Glycerin aufbewahrt. Von jedem Stamm werden 50 µl entnommen und in 2 ml LB- Medium + Rifampicin + Tetracyclin kultiviert. Die Kulturen werden zwei Tage lang mit 200 U/min bei 30ºC gerührt. Ein jeder Stamm wird in frisches Medium umgesetzt und unter den vorstehend beschriebenen Bedingungen eine Nacht lang kultiviert.
Sobald die Bakterien in dieser Weise bereitgestellt sind, wird die Infektion der Pflanzenzellen vorgenommen:
- 50 µl eines jeden eine Nacht lang gewachsenen Stammes werden entnommen und einer der Petri-Schalen zugesetzt, die die vorstehend beschriebenen Rübenzellen enthalten;
- die Cokultivierung der Rübenzellen und der Bakterien geht drei Tage lang in einer Kulturkammer im Dunklen vor sich;
- nach diesen drei Tagen werden die Pflanzenzellen zur Beseitigung der Bakterien gewaschen, ein erstes Mal mit MSB1 + 600 mg/l Cefotaxim (Bakteriostatikum, welches das Wachstum von Agrobacterium hemmt), dann ein zweites Mal mit MSBL-Medium + 300 mg/l Cefotaxim;
- die so gewaschenen Zellen werden in Petri-Schalen auf einem Blatt sterilen Whatman-Papier kultiviert, das auf einem MSB1-Medium + CK (Tabelle 2) liegt (Kanamycin ist das selektive Agens, das nur die Entwicklung der transformierten Zellen gestattet). Die Schalen werden mit Scello-frais luftdicht verschlossen und in die Kulturkammer gestellt. Nach 15 Tagen werden die die Pflanzenzellen tragenden Filter auffrisches MSB1-Medium + Cefotaxim + Kanamycin umgesetzt;
- 3 bis 8 Wochen nach dem Cokultivieren erscheinen weiße Kalli auf einer Schicht abgestorbener Zellen.
Sobald sie sich genügend entwickelt haben, werden diese Kalli auf ein Medium MSB1 + CK oder MSB1 + C umgesetzt; der größte Teil der Kalli wächst auf beiden Medien. Eine histochemische Prüfung (Jefferson, 1987) zum Nachweis der Aktivität des durch das Gen der β-Glucuronidase codierten Proteins in den Zellen dieser Kalli ermöglichte die Bewertung, daß etwa 80% der Menge der Kalli bei dieser Prüfung positiv sind. Dies bestätigt somit den transgenen Charakter des größten Teils der erhaltenen Kalli.
Die Durchführung der Kultivierung dieser Kalli ohne selektives Agens (Kanamycin) scheint die Expression des GUS-Gens nicht zu verändern. Außerdem können die Kalli nach einmonatigem Kultivieren auf dem Medium mit Cefotaxim von diesem Antibiotikum abgetrennt werden, ohne daß sich die Bakterien auf dem Medium entwickeln.
Einen Monat nach der Klonierung der Kalli kann also auf die Zugabe der beiden Antibiotika zum Kulturmedium ohne sichtbaren Nachteil verzichtet werden. Dies kann ein Plus für die Regeneration bedeuten.

Dispersion von neu induzierten Kalli

Anstatt Zellsuspensionen zu transformieren, die seit mehreren Monaten induziert waren (und theoretisch ihr Regenerationspotential verloren haben) wurden junge, aus Blattexplantaten (Saunders et al., 1986) frisch induzierte Kalli transformiert. Das organogene Potential dieser transformierten Kalli konnte auf diese Weise untersucht werden.
Um dies zu prüfen, wurden Kalli abgenommen, die nach 2 bis 6 Wochen auf Blättern im Gewächshaus gerade erschienen waren. Diese Kalli wurden in sterilen Kunststoffröhren in flüssigem MSB1-Medium dispergiert, und es wurde das gleiche Transformationsprotokoll wie bei den Zellsuspensionen angewandt. Auf diese Weise wurden die transformierten Kalli selektioniert.

Beispiel 12: Exdression der Gene, die die Entwicklung des BNYVV in den Zellen der Rübe hemmen können

Die Erfinder transformierten Suspensionen habituierter Rübenzellen mit all den hergestellten Genen, die in den Beispielen 5 und 6 angegeben sind. Für jedes dieser Gene wurden mehrere Suspensionen transformierter Zellen angesetzt und in Gegenwart von 200 mg/l Kanamycin kultiviert. Ausgehend von 10 g transformierten Zellen, die der Wirkung von Cellulasen und Pektinasen unterworfen wurden, wurden die Gesamt-RNAs bzw. die gesamten löslichen Proteine isoliert.
Zur Extraktion der RNAs hat sich die von Ausubel et al. (1987) beschriebene Technik, bei der Guanidinisothiocyanat verwendet wird, bei diesen Zellen mit zersetzten Wänden als die wirksamste erwiesen. Die Gesamt-RNAs wurden durch Northern-Blot gemäß Maniatis et al. (1982) analysiert. Für die Hybridisierung der Gesamt-RNAs, die eine vom Gen des Kapsidproteins abgeleitete MRNA enthalten, verwendeten die Erfinder als Sonde das BamHI-Fragment mit 780 Basenpaaren des Plasmids pBIO-3B. Für diejenigen, die eine mRNA exprimieren, die von dem für das Protein mit 42 Kd codierende Gen abgeleitet ist, wurde das Fragment EcoRI mit 1330 Basenpaaren des Plasmids pBIO-3-8B als Sonde verwendet. Die radioaktive Markierung dieser beiden Sonden mit Hilfe von ATP (³²P) wurde mit Hilfe der "Oligonudeotide Primed Synthesis" (Ausubel et al., 1987) genannten Technik durchgeführt.
Die erhaltenen Ergebnisse ermöglichten es den Erfindern, die Gegenwart aller erwarteten mRNAs nachzuweisen, wodurch die Funktionalität der hergestellten chimären Gene belegt wird. Diese Messenger weisen eine Größe auf, die der in Tabelle 1 angegebenen, um etwa 200 Nudeotide erhöhten entspricht. Die am 3'-Ende der mRNA befindlichen zusätzlichen Nudeotide gehen zurück auf den vom Terminator Nos transkribierten Teil bis zum Polyadenylierungssignal und am Poly-A-Ende. Auch wurde beobachtet, daß der Promotor Nos in Rübenzellen eine Transkriptionseffizienz aufweist, die 30- bis 50mal geringer ist als die des Promotors 35S. Diese Ergebnisse sind vergleichbar mit denen, die von Sanders et al. (1987) beim Tabak und bei der Tomate erhalten wurden.
Obwohl die Transkription aller Gene nachgewiesen wurde, war es notwendig, zu sehen, ob die Translation und die Produktion des Kapsidproteins sowie des chimären Proteins mit 29 Kd im Falle des binären Vektors pGA-β-3-1B erzielt wurde. Hierfür wurde mit den löslichen Proteinen, die aus den verschiedenen Suspensionen transformierter Zellen extrahiert wurden (Extraktionspuffer: 9 M Harnstoff, 7,5% β-Mercaptoethanol, 4,5% SDS; pH 6,8) ein Western-Blot durchgeführt (Ausubel et al., 1987). Die Ergebnisse sind in Figur 7 dargestellt; der obere Teil des Filters wurde mit polyklonalen Anti-β-glucuronidase- Antikörpern und der untere Teil mit polyklonalen Anti-BNYVV- Antikörpern entwickelt. Die β-Glucuronidase ist in den meisten transformierten Suspensionen vorhanden (immunreaktive Bande bei 68 Kd). Zehn Suspensionen von elf getesteten zeigen eine immunreaktive Bande, die mit dem BNYVV-Kapsidprotein wandert, sowie eine Bande mit einem Molekulargewicht von etwa 29 Kd. Die Expression dieser beiden Proteine liegt in der Größenordnung von 0,005 bis 0,01% der gesamten löslichen Proteine; diese Menge bestätigt die gute Translationseffizienz des hergestellten Messengers. Es ist festzustellen, daß die Menge an 29 Kd bei den meisten Transformanten besonders hoch ist und höher sein kann als die des Kapsidproteins. Der Grad an Readthrough bei den Suspensionen habituierter Zellen scheint höher zu sein als derjenige, der in den Rübenwurzeln für die RNA2 (Ziegler et al., 1985) und bei den transgenen Rüben beobachtet wird (Beispiel 15).

Beispiel 13: Invitro-Resistenzprüfung

Isolierung und Reinigung von Rübenprotoplasten

Fünf Tage nach dem Umsetzen werden 2 ml abgesetzte Zellsuspension in 20 ml Caylase-Enzymen digeriert. Die Zusammensetzung der Enzymmischung ist wie folgt: 0,25% 345 5; 0,25% T; 0,08% M&sub2;L gelöst in 0,7 M Mannit, enthaltend 0,08 mM NaH&sub2;PO&sub4;, 0,03 mM MES und 0,68 mM CaCl&sub2;. Der osmotische Druck wird auf 760 mosmol/kg und der pH auf 5,8 eingestellt. Nach 16 bis 18 h leichten Schüttelns (30 Schwingungen pro Minute) im Dunklen bei 24ºC wird die Suspension über Siebe mit 100 bzw. 50 µm filtriert. Das Filtrat wird einem gleichen Volumen einer isoosmotischen 470 mM KCl-Lösung zugesetzt, und die Protoplasten werden im Lauf von 5 Minuten mit 50 g sedimentiert. Der Rückstand wird wieder mit 570 mM isoosmotischer Saccharose aufgenommen und 15 Minuten lang mit 50 g sedimentiert. Der Ring aus Protoplasten wird herausgenommen, einer zweiten Zentrifugation mit Saccharose unterzogen und nach dem Sedimentieren zweimal mit 760 mOsmol/kg Mannit gewaschen. Die Lebensfähigkeit der Protoplasten wird quantitativ bestimmt durch Anfärben mit Fluoresceindiacetat (Widholm, 1972). Man vergewissert sich der Vollständigkeit des Verdaus durch das Ausbleiben des Anfärbens der Wandungen mit Calcofluor.
Die Anwendung von isoosmotischen Gradienten sowie differentiellen Dichten gestattet die Gewinnung von Protoplastenpräparaten in sehr hohen Ausbeuten von 5 10&sup6; Protoplasten pro ml abgesetzter und völlig von Zellbruchstücken befreiter Zellen. Im Durchschnitt sind 90% der Protoplasten lebensfähig.

Kultivierung von Protoplasten. die aus nichttransformierten und transformierten Zellen isoliert wurden

Das Protoplasten-Kulturmedium ist ein Medium aus Makro- und Mikroelementen von Murashige und Skoog (1962), wobei das NH&sub4;NO&sub3; auf die Hälfte abgesenkt ist und wobei versetzt wird mit:
1 gil Casein-Hydrolysat
30 gil Saccharose
7,7 mg/l Glycin
1,3 mg/l Nicotinsäure
0,25 ng/l Pyridoxin
0,25 ng/l Thiamin HCl
400 mg/l Glutamin
25 mg/l Glucosamin
1 mg/l 6-Benzylaminopurin
1 mg/l Indolylessigsäure
Der osmotische Druck wird mit Mannit auf 760 mOsmol/kg und der pH auf 5,8 eingestellt. Das Kulturmedium wird durch Filtration sterilisiert.
Aus Suspensionen transformierter und nichttransformierter Zellen wurden Protoplasten isoliert. Diese wurden in Gegenwart und Abwesenheit von 200 mg/l Kanamycin in obigem Medium kultiviert, um den Grad der Ausbreitung zu berechnen. Die Ergebnisse zeigen, daß die aus nichttransformierten Zellen isolierten Protoplasten auf einem 200 mg/l Kanamycin enthaltenden selektiven Medium nicht überleben. Dies steht in Einklang mit dem Fehlen von Ausreißern bei den Transformationsversuchen. Bei den aus transformierten Zellen hervorgegangenen Protoplasten wurde in Gegenwart und Abwesenheit von Kanamycin kein signifikanter Unterschied beim Grad der Ausbreitung gefunden. Dies bestätigt somit das Fehlen nichttransformierter Zellen innerhalb der transformierten Linien. Bei den nachstehend beschriebenen Vergleichsversuchen werden Protoplasten, die von 4 Arten von Zellinien abstammen (β7 und β14, die 22 Kd und 29 Kd exprimieren, nichttransformierte WT, sowie durch den binären Vektor pGA492 transformierte βD), ohne Selektionsdruck kultiviert.

Infektion von Rübenprotoplasten durch BNYVV

Die Optimierung der Infektionstechnik wurde mit Protoplasten durchgeführt, die von nichttransformierten Zellen abstammen. Als Vorbild diente den Erfindern die Infektionstechnik mit Hilfe von Polyethylenglycol, beschrieben von Samac et al. (1983), und diejenige mit Hilfe der Elektroporation, beschrieben von Watts et al. (1987). Zur Erzielung höherer Infektionsraten war es notwendig, bruchstückfreie Protoplastenpräparate zu verwenden, die eine Lebensfähigkeitsrate von mehr als 90% aufweisen, sowie Viruspräparate, die wenigstens zwei Wochen alt sind.
Die Infektionshäufigkeit wurde durch Immunfluoreszenz mit Hilfe einer indirekten, von Maul et al. (1980) beschriebenen Technik bestimmt. Die infizierten Protoplasten weisen eine charakteristische, im Cytoplasma dispergierte hellgrüne Fluoreszenz auf; die nichtinfizierten Protoplasten sind von matter Kastanienfarbe. In Figur 8 sind die Ergebnisse von vier Infektionsversuchen an Rübenprotoplasten mit Hilfe der Polyethylenglycol-Technik dargestellt. Es wurde festgestellt, daß nach 24stündigem Kultivieren etwa 60% der Protoplasten infiziert sind. Bei Kultivierungszeiten von mehr als 24 Stunden erhöht sich dieser Prozentsatz nicht signifikant. Somit geht die Infektion in einer quasi-synchronen Art und Weise vor sich. Diese Abbildung zeigt auch, daß sich das durch wiederholtes Gefrieren und Auftauen inaktivierte Virus in den Rübenprotoplasten nicht repliziert. Bei allen durchgeführten Versuchen wurden im Durchschnitt 50% der Protoplasten infiziert.
Den Erfindern gelang die Einführung viraler Teilchen des BNYVV unter Anwendung elektrischer Impulse (Technik der Elektroporation). Als Vorbild diente den Erfindern die von Watts et al. (1987) beschriebene Technik, wobei sie sich eines Elektroporators mit kapazitiver Entladung (Guerche et al., 1987) bedienten.
Die Optimierung dieser Technik geht so vor sich, daß die Dauer der von Kondensatoren mit unterschiedlichen Kapazitäten gelieferten Impulse und der spezifische Widerstand des Elektroporationsmediums variiert werden. Auf diese Weise erkannten die Erfinder, daß zwei Impulse von 100 ms, die in einem Abstand von 15 5 durch Kondensatoren mit einer Kapazität von 63 µF, geladen bei 220 V, auf 1 10&sup6; Protoplasten abgegeben werden, die wieder eingebracht wurden in Mannit enthaltend 5 mM CaCl&sub2;, in Gegenwart von 5 µg BNYVV einen Prozentanteil von 55% infizierter Protoplasten ermöglichen. Durch Weglassen des CaCl&sub2; ergibt sich eine Verringerung der Infektiosität um den Faktor 3, wenn auch die Lebensfähigkeit der Protoplasten sich um den Faktor 2 erhöht. Dies ist in Figur 9 dargestellt.

Infektion von Rübenprotoplasten, die von transformierten und nichttransformierten Zellen abstammen

Um festzustellen, ob das BNYVV-Kapsidprotein (22 Kd) und das in den Zellen der Rübe produzierte abgeleitete Protein (29 Kd) die Vermehrung des Virus zu hemmen vermögen, impften die Erfinder Protoplasten, die aus Zellen stammen, welche diese Proteine exprimieren oder nicht exprimieren, mit dem Virus. Die Versuche wurden mit Hilfe der PEG- und der Elektroporationstechnik durchgeführt. Die Infektion wurde 30 Stunden nach dem Kultivieren durch Immunfluoreszenz der Zellen sichtbar gemacht. Das Hintergrundrauschen bei der Immunfluoreszenz an den transformierten Zellen, die das Kapsidprotein exprimieren, wurde vor der Impfung nicht erfaßt. TABELLE 3: Infektion von Protoplasten, die aus transformierten und nichttransformierten Zellen stammen, mit dem BNYVV. Herkunft der Protoplasten Nichttransformiert Transformiert Schutz Versuch
1 10&sup6; Protoplasten wurden mit 5 µg BNYVV (F13 oder S2) geimpft, außer bei Versuch 4, wo das Impfmaterial aus 30 µg BNYVV bestand. Die Zahlen geben den Prozentanteil an fluoreszierenden, 30 h nach der Impfung erfaßten Protoplasten wieder. CP&spplus; und CP&supmin; sind transformierte Zellinien, die das BNYVV-Kapsidprotein exprimieren bzw. nicht exprimieren.
In Tabelle 3 sind die Ergebnisse zusammengefaßt, die mit zwei Zellinien (β7 und β14), die zwei Proteine stark exprimieren, und der transformierten Zellinie (βD) sowie der nichttransformierten Zellinie WT erhalten wurden. In allen Fällen ist der Prozentanteil an infizierten Protoplasten, die aus den transformierten Zellen β7 und β14 isoliert wurden, signifikant geringer als derjenige der Protoplasten aus nichttransformierten Zellen. Die Versuche 7 und 8 sind ein guter Beweis dafür, daß der Schutz tatsächlich auf die Gegenwart der Proteine mit 22 Kd und 29 Kd zurückgeht, da die Infektionsrate der Protoplasten, die aus den Zellen der Linie βD stammen, mit derjenigen der nichttransformierten Zellen vergleichbar ist. Somit verleiht der Prozeß der Transformation an sich keinen Schutz gegen die Infektion durch das Virus. Die Expression von Fremdproteinen, anderen als denen des BNYVV, verleiht ebenfalls keinen Schutz gegen die Infektion durch dieses Virus. Der Schutz wird nicht aufgehoben, wenn die Konzentration des Virus im Impfmaterial erhöht wird. Die densitometrischen Profile (Figur 10) der Gesamt-RNAs (isoliert aus den infizierten Protoplasten β14 und WT), die hybridisiert sind mit einer Gesamt-cDNA-Sonde, gegen die vier RNAs des BNYVV zeigen, daß sich diese in den Protoplasten, die das Virus-Kapsidprotein exprimieren, nicht replizieren. Schutz wird auch beobachtet, wenn die Impfung mit Hilfe der Elektroporation durchgeführt wird, was darauf hinweist, daß der Schutz unabhängig von der zur Impfung angewandten Methode ist.
Diese Ergebnisse belegen zum ersten Mal, daß Rübenprotoplasten, die das virale Kapsidprotein des BNYVV und das abgeleite chimäre Protein exprimieren, vor Infektion mit ebendiesem Virus geschützt sind.

Beispiel 14: Regeneration von Pflanzen aus transformierten Kalli

Nach einem ersten einmonatigen Durchgang auf MSB1 + C oder MSB1 + CK werden die transformierten Kalli alle Monate auf MSB1 umgesetzt. Nach mehr oder weniger langem Verzug, der von einer Woche bis mehrere Monate schwankt, regenerierten Sprossen und/oder Embryonen auf bestimmten Kalli.
Es wurde beobachtet, daß die Kalli nach der Transformation den gleichen Phänotyp aufweisen wie die Ausgangssuspension. Das heißt, der knötchenförmige und der habituierte Typ finden sich nach der Transformation wieder. Außerdem scheint es, daß es die transformierten Kalli des knötchenförmigen Typs sind, die die größte Neigung zur Regeneration aufweisen. Sie ermöglichen die Regeneration verschiedener Strukturen, die sich recht gut und schnell in der Pflanze entwickeln, während die auf den habituierten transformierten Kalli erhaltenen Strukturen sehr spärlich und langsam sind und sich sehr schwer in der Pflanze entwickeln.
Die regenerierten Strukturen sind morphologisch sehr heterogen. Sie werden, nachdem sie mit einem Skalpell an der Basis abgeschnitten wurden, auf das Medium MSB0,1 in petri-Schalen umgesetzt.
Sobald die Sprossen mit der Entwicklung mehrerer Blätter beginnen, werden sie in Töpfen oder Schalen wieder zur vegetativen Regeneration belassen. Die am weitesten entwickelten Sprossen werden dann auf MS + 1 mg/l ANA (ANA: Naphthalinessigsäure> eingewurzelt. Die Wurzeln erscheinen nach 2 bis 6 Wochen.
Sobald die Wurzeln genügend entwickelt sind, werden die Pflanzen im Gewächshaus in Universalhumuserde akklimatisiert. Nach drei Monaten sind die Pflanzen gut entwickelt (siehe Photo) und haben die meisten der auf das Kultivieren in vitro beruhenden phänotypischen Veränderungen verloren.

Beispiel 15: Expression des Kapsidproteins und des abgeleiteten chimären Proteins in den transpenen Rüben

Zwar waren die transgenen Rüben dank der Prüfungen zum Nachweis des Gens, das für β-Glucuronidase codiert, bekannt, doch war es nicht sicher, ob das Nutzgen, nämlich dasjenige, das für die Kapsidproteine des BNYVV codiert, in diesen Pflanzen gut exprimiert war. Um dies in Erfahrung zu bringen, war es notwendig, diese Proteine im Gewebe der transformierten Rüben nachzuweisen. Zum Nachweis der Proteine in den Transformanten wurde die Western-Blot-Technik (Ausubel et al., 1987) herangezogen. Diese besteht darin, daß man lösliche Proteine, die aus zerkleinertem Gewebe der Transformanten extrahiert wurden, auf Polyacrylamid-Gel unter denaturierenden Bedingungen wandern läßt (Laemmli, 1970). Die so getrennten Proteine werden durch Elektrotransfer auf eine Nitrocellulose-Membran überführt. Die Membran wird anschließend mit polyklonalen Kaninchen-Antikörpern hybridisiert, die gegen das BNYVV gerichtet sind. Die Entwicklung erfolgt durch Zugabe von Antikaninchen-Antikörpern, die mit alkalischer Phosphatase konjugiert sind, welche chromogene Substrate verwertet. Figur 11 zeigt die Art der erhaltenen Ergebnisse. Die Extrakte der transgenen Rüben, die das für die Kapsidproteine codierende Gen enthalten, zeigen eine immunreaktive Bande, die auf gleicher Höhe wandert wie das Kapsidprotein des Virus. Diese Bande ist in den Extrakten nichttransformierter Pflanzen nicht vorhanden. Zudem ist in den Extrakten der transformierten Pflanzen eine Bande mit 29 Kd nachzuweisen, die dem chimären Protein entspricht, das von dem mit 22 Kd abgeleitet ist durch Addition von 64 Aminosäuren, die auf das "Readthrough" (Beispiel 5) zurückgeht. Diese beiden Proteine mit 22 und 29 Kd konnten nur in den Wurzelextrakten der Transformanten aber nicht in den Blättern nachgewiesen werden.
Figur 11 veranschaulicht die ungeachtet der Verwendung eines konstitutiven Promotors spezifische Expression der Proteine mit 22 Kd und 29 Kd in den Wurzeln der transgenen Rüben. Die Funktionalität des Promotors in den oberirdischen Teilen der Pflanze wird durch Expression des Markergens GUS in allen Geweben bestätigt.
Das BNYVV überträgt und entwickelt sich in Höhe der Wurzeln, so daß es vorteilhaft ist, wenn die Proteine, die das Virus zu hemmen vermögen, in diesen Organen vorhanden sind.

Beispiel 16: Gewinnung von transgenen Rübensamen

Nach 2 bis 3monatigem Akklimatisieren der transgenen Pflanzen im Gewächshaus war festzustellen, daß sie phänotypisch mit der Mutterpflanze übereinstimmen. In diesem Stadium besitzen die Pflanzen 10 bis 15 sehr gut entwickelte Blätter und befinden sich stets im Zustand der Rosette. Um herauszufinden, ob die gewonnenen Pflanzen völlig normal und insbesondere fruchtbar sind und ob das eingeführte Gen an die Nachkommenschaft vererbt wird, wurden die Pflanzen vernalisiert, um das Aufschießen zum Samen einzuleiten. Die primären Transformanten werden also 3 Monate lang zwischen 2 und 7ºC ins Dunkle gestellt und dann während der Zeit der langen Tage aufs Feld gebracht. Einen Monat bis eineinhalb Monate nach dem Ausbringen aufs Feld beginnen die Blütenstiele zu schießen.
Die Blüte findet etwa drei Monate nach Abschluß der Vernalisation statt, und zwei Monate danach sind die Früchte reif.
Sobald die Blütenstände gut trocken sind, werden sie abgeerntet und gewaschen. Die Samen sind somit fertig zum Säen.

Beispiel 17: Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens auf verschiedene Arten von Beta vulgaris

Die in den Beispielen 9 bis 14 beschriebenen Methoden der Transformation und Regeneration wurden auf Zellsuspensionen und auf Dispersionen von weißen brüchigen Kalli angewandt, die aus Pflanzen stammen, welche von einer "Elite"-Sorte herrühren (Elternabart kommerzieller Hybride).
Es wurden transgene Pflanzen erhalten, die das BNYVV-Kapsidprotein exprimieren. Die Expression erfolgt spezifisch in den Wurzeln. Die Sorte "Elite" weist eine genetische Umgebung auf, die sich von anderen transformierten Arten unterscheidet; die spezifische Expression scheint in der Spezies Beta vulgaris erhalten zu bleiben.
Die Reproduzierbarkeit dieser Techniken wurde nachgewiesen durch Anwenden der erfindungsgemäßen Transformations- und Regenerationsverfahren auf andere Abarten sowie an anderen geographischen Orten durch ein anderes Experimentatoren-Team. In jedem Fall wurden transgene Pflanzen erhalten.

Beispiel 18: Selbstbefruchtung und Kreuzung transgener Pflanzen mit Resistenz aegen die Wurzelhaarkrankheit

Transgene Samen wurden sowohl bei der Selbstbefruchtung der transformierten Pflanzen als auch bei der Kreuzung der gleichen Pflanzen mit drei anderen männlichen sterilen Rübenlinien erhalten (einer männlichen sterilen einkeimigen genetischen Linie, einer männlichen sterilen mehrkeimigen genetischen Linie und einer männlichen sterilen cytoplasmatischen Linie).
Die spezifische Expression des Kapsidproteins und die des 29 Kd-Proteins in den Wurzeln aller aus der Selbstbefruchtung und Kreuzung stammenden transgenen Pflanzen wurde erreicht.
Diese Ergebnisse belegen, daß diese spezifische Expression in einer genetischen Umgebung, die sich von der der primären Transformanten unterscheidet, beibehalten wird.

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Claims

1. Verfahren zur Transformation von Pflanzenzellen, die der Spezies Beta vulgaris angehören, dadurch gekennzeichnet, daß dieses umfaßt: das Zusammenbringen einer Dispersion von weißen brüchigen Kalli in einem flüssigen Pflanzenzellenkulturmedium, enthaltend 0 bis etwa 3,0 mg 1&supmin;¹ eines Cytokins, oder einer Suspension von weißen brüchigen Kalli in einem flüssigen pflanzenzellenkulturmedium, enthaltend etwa 0,1 bis etwa 3,0 mg 1&supmin;¹ eines Cytokinins, mit Agrobacterium, enthaltend einen Vektor, der ein in die Pflanzenzellen einzubringendes Gen trägt, gefolgt von gemeinsamem Kultivieren der Pflanzenzellen und Bakterien, um transformierte brüchige Kalli zu ergeben.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es die folgenden sukzessiven Schritte umfaßt:

I) Induktion von weißen brüchigen Kalli aus Explantat;

II) Dispersion der Kalli in einem flüssigen Pflanzenzellenkulturmedium, enthaltend 0 bis etwa 3,0 mg 1&supmin;¹ eines Cytokinins, oder Gewinnung einer Zellsuspension aus Kalli in einem flüssigen Pflanzenzellenkulturmedium, enthaltend etwa 0,1 bis etwa 3,0 mg 1&supmin;¹ eines Cytokinins;

III) Zusammenbringen der Zelldispersion oder Suspension mit Agrobacterium tumefaciens, enthaltend einen Vektor, der ein in die Pflanzenzellen einzubringendes Gen trägt, gefolgt von gemeinsamem Kultivieren der Pflanzenzellen und Bakterien;

IV) Waschen der Pflanzenzellen zur Abtrennung der Bakterien und Selektion der transformierten Zellen auf einem selektiven Medium;

V) Kultivieren der transformierten selektionierten Zellen, um transformierte brüchige Kalli zu erhalten.

3. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die weißen brüchigen Kalli aus jungen Blättern induziert werden, die beispielsweise eine Länge von 3 bis 5 cm aufweisen und einer wenigstens drei Monate alten Pflanze entnommen wurden.

4. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Dispersion der Kalli in einem Pflanzenzellenkulturmedium durchgeführt wird, das 6-Benzylaminopurin (BAP) enthält, insbesondere etwa 1 mg 1&supmin;¹ BAP.

5. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellsuspension erhalten wird durch zwei- bis dreiwöchiges Kultivieren von 4 bis 6 Wochen alten weißen brüchigen Kalli in dem mit Cytokinin versetzten Medium, wobei das Medium während dieses Zeitraums gerührt wird, gefolgt von Umsetzen der so erhaltenen Suspension auffrisches Kulturmedium, wobei sich zwei Zelltypen ergeben, vor allem der habituierte Typ und der knötchenförmige Typ.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Kulturmedium mit 6-Benzylaminopurin (BAP) versetzt ist, insbesondere etwa 1 mg 1&supmin;¹ BAP.

7. Verfahren nach irgendeinem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Pflanzenzellenkulturmedium um das Medium von Murashige und Skoog (1962) handelt, das MS-Medium genannt wird.

8. Verfahren nach irgendeinem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das gemeinsame Kultivieren von Pflanzenzellen und Bakterien über drei Tage im Dunklen auf einem Pflanzenzellenkulturmedium wie etwa dem MS- Medium durchgeführt wird, das gegebenenfalls mit einem Cytokinin versetzt ist, beispielsweise etwa 1 mg 1&supmin;¹ BAP.

9. Verfahren nach irgendeinem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Abtrennung der Bakterien durch Waschen der Pflanzenzellen mit einem Pflanzenzellenkulturmedium vorgenommen wird, das ein Bakteriostatikum enthält, welches das Wachstum von Agrobacterium hemmt, zum Beispiel Cefotaxim.

10. Verfahren nach irgendeinem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Selektion der transformierten Zellen auf einem Kanamycin enthaltenden Medium durchgeführt wird.

11. Verfahren nach irgendeinem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Kultivierung der transformierten selektionierten Zellen auf einem festen Kulturmedium durchgeführt wird, etwa festem MS-Medium, das versetzt ist mit einem Cytokinin, einem Bakteriostatikum und einem selektiven Agens.

12. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß das in die pflanzenzellen einzubringende Gen ausgewählt ist aus einem Gen, das landwirtschaftlich oder industriell interessante Eigenschaften verleiht, zum Beispiel ein Gen für die Resistenz gegenüber Virusinfektionen, etwa ein Gen, das für das Kapsidprotein des Virus BWYV oder des Virus BNYVV codiert, ein Gen, das Resistenz gegenüber Herbiziden oder Insektiziden verleiht, oder ein Gen, dessen Expression männliche Sterilität verleiht.

13. Verfahren zur Regeneration von der Spezies Beta vulgaris angehörenden transgenen Sprossen und/oder Embryonen aus Explantaten, dadurch gekennzeichnet, daß es die folgenden sukzessiven Schritte umfaßt:

I) Gewinnung von transformierten brüchigen Kalli nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 12;

II) Umsetzen der transformierten Kalli auf ein Medium, enthaltend 0 bis etwa 3 mg 1&supmin;¹ eines Cytokinins und gegebenenfalls ein Bakteriostatikum und ein selektives Agens, bis zum Auftreten von transgenen Sprossen und/oder Embryonen.

14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Kulturmedium um das MS-Medium handelt, versetzt mit etwa 1 mg 1&supmin;¹ BAP und gegebenenfalls etwa 300 mg 1&supmin;¹ Cefotaxim und 200 mg 1&supmin;¹ Kanamycin.

15. Verfahren zur Regeneration von transgenen Pflanzen, die der Spezies Beta vulgaris angehören, dadurch gekennzeichnet, daß es die folgenden sukzessiven Schritte umfaßt:

I) Regeneration von transgenen Sprossen und/oder Embryonen gemäß dem Verfahren nach Anspruch 13;

II) Umsetzen der transgenen Sprossen und/oder Embryonen auf ein Kulturmedium wie etwa das MS-Medium, das mit etwa 0,1 mg 1&supmin;¹ eines Cytokinins, beispielsweise BAP, versetzt ist;

III) Rückführung der regenerierten Strukturen in die vegetative Vermehrung, gefolgt von Einwurzelung auf einem Kulturmedium wie etwa dem Mg-Medium, das Naphthalinessigsäure enthält, beispielsweise etwa 1 mg 1&supmin;¹.

16. Verfahren zur Herstellung von Samen transgener Pflanzen, die der Spezies Beta vulgaris angehören, dadurch gekennzeichnet, daß es die folgenden sukzessiven Schritte umfaßt:

I) Regeneration von transgenen Pflanzen gemäß dem Verfahren nach Anspruch 15;

II) Vernalisation der transgenen Pflanzen und Gewinnung der Samen nach der Blüte.

17. Transformierte brüchige Kalli, die der Spezies Betavulgaris angehören und nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 12 hergestellt werden können.

18. Transgene Sprossen und/oder Embryonen, die der Spezies Beta vulgaris angehören und nach einem der Ansprüche 13 und 14 hergestellt werden können.

19. Transgene Pflanzen, die der Spezies Betavulgaris angehören und nach dem Verfahren von Anspruch 15 hergestellt werden können.

20. Transgene Samen von transgenen Pflanzen, die der Spezies Beta vulgaris angehören und nach dem Verfahren von Anspruch 16 hergestellt werden können.

21. Transgene Pflanze, die der Spezies Betavulgaris angehört und gegenüber Infektion durch das Virus der gelben nekrotischen Adern der Zuckerrübe (BNYVV) resistent ist, wobei die Pflanze in stabiler Weise durch ein Nudeinsäure- Fragment transformiert ist, dessen Expressionsprodukt imstande ist, diese Resistenz zu verleihen, wobei dieses Fragment abgeleitet ist vom 5'-Ende genomischer oder subgenomischer RNA2 des BNYVV oder von der entsprechenden cDNA, wobei dieses Fragment für wenigstens einen Teil der Proteine codiert, die durch die Nudeotide 145 bis 3285 der RNA2-Wildtypsequenz codiert werden, und unter der Kontrolle eines Promotors steht, der die Expression des Fragments in den Pflanzenzellen ermöglicht, und die Orientierung Sinn oder Antisense aufweist.

22. Transgene Pflanze nach Anspruch 21, wobei das Fragment für wenigstens einen Teil des Proteins codiert, das durch die Nudeotide 145 bis 2218 der RNA2 codiert wird, oder für eine Variante dieses Proteins, die eine Homologie von wenigstens 80% aufweist und Insertion, Substitution oder Deletion von Aminosäure(n) umfaßt.

23. Transgene Pflanze nach Anspruch 22, wobei das Fragment für das Protein codiert, das durch die Nudeotide 145 bis 708 codiert wird, und außerdem für einen Teil des Proteins, das durch die Nudeotide 709 bis 2218 der RNA2 des BNYVV codiert wird.

24. Transgene Pflanze nach Anspruch 23, wobei das Fragment für das Protein codiert, das durch die Nudeotide 145 bis 871 der RNA2 des BNYVV codiert wird.

25. Transgene Pflanze nach Anspruch 24, wobei das Fragment aus den Nudeotiden 91 bis 871 der RNA2 des BNYVV zusammengesetzt ist.

26. Transgene Pflanze nach Anspruch 22, wobei das Fragment für wenigstens einen Teil einer Variante des Proteins codiert, das durch die Nudeotide 145 bis 2218 codiert wird, wobei sich die Variante von der Wildtypsequenz durch das Vorhandensein der Sequenz Glu-Asp-Leu-Pro unterscheidet, die die Aminosäuren His-Ala ersetzt, die durch die Nudeotide 253 bis 258 der Wildtypsequenz codiert werden.

27. Transgene Pflanze nach Anspruch 26, wobei das Fragment für einen Teil der Variante codiert und zusammengesetzt ist aus den Nudeotiden 91 bis 871 der Wildtypsequenz, wobei die Nudeotide 253 bis 258 der Wildtypsequenz durch jene ersetzt sind, die für Glu-Asp-Leu-Pro codieren.

28. Transgene Pflanze nach Anspruch 26, wobei das Fragment für einen Teil der Variante codiert, wobei dieser Teil jenem entspricht, der durch die Nudeotide 145 bis 255 in der Wildtypsequenz codiert wird, und wobei die Nudeotide 253 bis 255 der Wildtypsequenz durch jene ersetzt sind, die für Glu codieren.

29. Transgene Pflanze nach Anspruch 26, wobei das Fragment für einen Teil der Variante codiert, wobei dieser Teil jenem entspricht, der durch die Nudeotide 256 bis 871 in der Wildtypsequenz codiert wird, und wobei die Nudeotide 256 bis 258 der Wildtypsequenz durch jene ersetzt sind, die für Asp-Leu-Pro codieren.

30. Transgene Pflanze nach Anspruch 22, wobei das Fragment für wenigstens einen Teil einer Variante des Proteins codiert, das durch die Nudeotide 145 bis 2218 codiert wird, wobei sich die Variante von der Wildtypsequenz durch das Vorhandensein der Sequenz Arg-Ser-Ser-Gly anstelle der Aminosäuren unterscheidet, die durch die Nudeotide 637 bis 651 der Wildtypsequenz codiert werden, und wobei die Sequenz Arg-Ser-Ser-Gly das Carboxyl-terminale Ende des Proteins bildet.

31. Transgene Pflanze nach Anspruch 30, wobei das Fragment für einen Teil der Variante codiert und zusammengesetzt ist aus den Nudeotiden 91 bis 871 der Wildtypsequenz, wobei die Nudeotide 637 bis 654 der Wildtypsequenz durch jene ersetzt sind, die für Arg-Ser-Ser-Gly-Stop codieren.

32. Transgene Pflanze nach Anspruch 31, wobei das Fragment für einen Teil der Variante codiert, wobei dieser Teil jenem entspricht, der durch die Nudeotide 144 bis 640 der Wildtypsequenz codiert wird.

33. Transgene Pflanze nach Anspruch 31, wobei das Fragment für einen Teil der Variante codiert und zusammengesetzt ist aus den Nudeotiden 641 bis 871 der Wildtypsequenz, wobei die Nudeotide 641 und 642 der Wildtypsequenz durch GA und die Nudeotide 643 bis 654 durch jene ersetzt sind, die für Ser-Ser-Gly-Stop codieren.

34. Transgene Pflanze nach Anspruch 21, enthaltend ein Fragment des 5'-Endes der subgenomischen RNA2 des BNYVV oder der entsprechenden cDNA, wobei das Fragment für wenigstens einen Teil des Proteins codiert, das durch die Nudeotide 2133 bis 3285 der RNA2 codiert wird, oder für eine Variante dieses Proteins, die eine Homologie von wenigstens 80% aufweist und Insertion, Substitution oder Deletion von Aminosäure(n) umfaßt.

35. Transgene Pflanze nach Anspruch 34, wobei das Fragment für das Protein codiert, das durch die Nudeotide 2133 bis 2774 der RNA2 des BNYVV codiert wird.

36. Transgene Pflanze nach Anspruch 35, wobei das Fragment aus den Nudeotiden 2078 bis 2774 der RNA2 des BNYVV zusammengesetzt ist.

37. Transgene Pflanze nach irgendeinem der Ansprüche 21 bis 36, dadurch gekennzeichnet, daß diese das Resistenz verleihende und durch das Fragment codierte Protein ausschließlich in den Wurzeln exprimiert.

38. Transgene Pflanze nach Anspruch 37, dadurch gekennzeichnet, daß der die Expression des Proteins kontrollierende Promotor ein konstitutiver Promotor ist, beispielsweise pNOS oder p35S.

39. Transgene Pflanze nach Anspruch 37, die sich gemäß dem Verfahren nach Anspruch 15 erhalten läßt.

40. Transgene Samen von transgenen Pflanzen nach irgendeinem der Ansprüche 21 bis 39.

41. Samen von transgenen Pflanzen nach irgendeinem der Ansprüche 19 oder 21 bis 39, die transgene Samen nach Anspruch 40 enthalten.

42. Verfahren zur Herstellung transgener Pflanzen, die der Spezies Beta vulgaris angehören und gegen BNYVV-Infektion resistent sind, wobei die Pflanze speziell in den Wurzeln ein Protein exprimiert, das diese Resistenz zu verleihen vermag, wobei das Verfahren umfaßt: die Transformation, nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 12, von Zellen, die aus Beta vulgaris stammen, mit einem der in irgendeinem der Ansprüche 21 bis 36 beschriebenen Nucleinsäure-Fragmente durch den Vermittler Agrobacterium tumefadens, wobei die Transkription des Fragments der Kontrolle eines konstitutiven Promotors wie etwa p35S oder pNOS unterliegt, gefolgt von der Regeneration einer transgenen Pflanze aus den transformierten Zellen.