FR2658988A1 - Betterave resistante a la rhizomanie. - Google Patents

Abstract

Séquence nucléotidique apte à conférer la résistance à l'infection par le virus des nervures jaunes et nécrotiques de la betterave à sucre (BNYVV) à des cellules exprimant ladite séquence, comprenant un fragment d'acide nucléique dérivé de l'extrémité 5' de l'ARN2 génomique ou subgénomique du BNYVV, ce fragment codant pour au moins une partie des protéines codées par les nucléotides 145 à 3285 de la séquence sauvage de l'ARN2, ledit fragment étant sous le contrôle d'un promoteur permettant l'expression du fragment dans des cellules végétales et étant dans l'orientation sens ou antisens.

Description

BETTERAVE RESISTANTE A LA RHIZONANIE
La presente invention concerne la transformation génétique de la betterave à sucre (Beta vulgaris ssp saccharifera) dans le but de creer des plantes résistantes à la rhizomanie.

Le virus des nervures j aunes et necrotiques de la betterave à sucre (BNYVv) est un virus à composants multiples, constitué de particules virales à symétrie helicoïdale, contenant quatre types de RNA simple brin, de polarite positive (Putz, 1987). Ce virus est disséminé par un champignon du sol, Polymixa betae, qui parasite les cellules superficielles des radicelles de chénopodiacées, dont fait partie la betterave à sucre.

Cette chénopodiacée bisannuelle reste à l'état de rosette la première annee en donnant une racine charnue et sucree, et monte à graine la deuxième année après vernalisation. La persistance de la maladie dans le sol est due aux kystes formés par le champignon (Tamada,
Baba, 1973).

I1 est connu que le virus se développe essentiellement dans la partie racinaire (pivot et racines secondaires). Le symptôme principal de la maladie consiste en une prolifération du chevelu racinaire (d'où le nom de rhizomanie). Mais le nom du virus provient en fait de symptômes plus tardifs visibles dans la partie végétative à savoir : nécroses et jaunissement des nervures dus au fait que le virus se développe surtout au niveau des vaisseaux racinaires, en perturbant ainsi le métabolisme de toute la plante (Salle et al, 1986).

Plusieurs auteurs ont reporté que le virus n'est détecté dans la partie aérienne que très rarement alors qutil est présent en grande quantite au niveau des racines et du pivot (Putz, 1977 ; Ziegler et al, 1985).

D'une manière génerale, le contrôle des maladies virales des végétaux reste problématique. Parmi les méthodes de lutte les plus utilises, on compte aujourd'hui - l'assainissement des plants par culture de méristème mais ce n'est pas envisageable pour des plantes de grande culture comme la betterave à sucre - la lutte chimique contre les vecteurs du virus,
Polymyxa betae dans notre cas ; mais il y a toujours des risques d'infection potentiels - l'introduction de gène de résistance par sélection classique ; mais cela implique l'existence de gènes naturels de resistance chez des espèces voisines de l'espèce concerne ; or chez la betterave, on n'a pu introduire à ce jour que des gènes de tolérance par cette voie, et ce n'est pas suffisant pour empêcher le virus de se développer (Lewellen et al, 1987), - la protection croisée (Broadbent, 1976 ;Fernow, 1967) qui est basee sur l'inoculation d'une souche virale moins agressive qui limite le développement d'une souche virale apparentee plus virulente.

L'avènement du génie génétique végétal a permis à certains auteurs de créer des plantes transgeniques dont le génome comporte à la fois l'information nécessaire à l'expression du virus, mais aussi, celle introduite artificiellement, permettant l'expression d'un facteur limitant la synthèse de ce même virus. C'est ainsi que
Abel et al (1986) ont introduit un gène codant pour la protéine de capside du virus de la mosaïque du tabac (VMT) dans le genome des plantes naturellement sensibles à ce virus. Cette manipulation génétique a provoqué un retard du développement de la maladie chez les plantes transgeniques.D'autres realisations du même type ont été reportées avec d'autres virus - Alfalfa Mosaic Virus, et Tobacco Rattle Virus, sur tabac (Van Dun et al, 1987), - Alfalfa Mosaic Virus sur tabac (Loesch Fries et al, 1987), - Alfalfa Mosaic Virus sur tabac et tomate (Tumer et al, 1987).

Deux équipes ont créé des plantes transgéniques exprimant des gènes codant pour des ARN antisens, complémentaires de 1'ARN codant pour la proteine de capside, et ils montrent que la résistance est beaucoup moins importante que celle conférée par la proteine de capside (Cuozzo et al, 1988 ; Hemenway et al, 1988).

Enfin, d'autres laboratoires ont cree des plantes transgéniques exprimant des gènes codant pour des ARN satellites. Cette strategie a été adoptée par Gerlach et al (1987) pour le virus des tâches annulaires du tabac, et par Harrison et al (1987) pour le virus de la mosaïque du concombre (CMV).

Aucun satellite n'étant connu pour le BNYVV, les inventeurs ont envisagé de faire produire aux cellules végétales transformees soit des ARN antisens, soit des
ARN sens codant pour des protéines virales normales, mutées ou délétees, susceptibles d'inhiber le developpement du virus.

Plus particulièrement, les inventeurs ont transformé des cellules végétales par des séquences codant pour la protéine de capside du BNYVV, ou pour des variantes de celle-ci.

La mise en oeuvre de l'invention a consiste à - construire par les techniques de recombinaison génétique in vitro, des gènes artificiels, potentiels de résistance au virus des nervures jaunes et necrotiques de la betterave à sucre (BNYVV : Beet Necrotic Yellow Vein
Virus) provoquant la rhizomanie, - transférer de façon stable ces gènes de résistance dans des betteraves à sucre.

Le gène codant pour la proteine de capside du BNYW a été localise et séquence (Bouzoubaa et al, 1986).

Cependant, il ne pouvait pas être prévu que l'expression de cette protéine dans des cellules de betterave inhiberait le développement du virus. Le virus étant transmis par le champignon du sol Polvmixa betae, la voie d'infectabilité n'est pas comparable à celle des virus pour lesquels la protéine de capside s'est montre protectrice. D'autre part, la protéine de capside du BNYW est codée par l'extrémité 5'du ARN2, ce qui veut dire que la protéine peut être traduite dans la cellule infectée immédiatement après l'infection. Pour d'autres virus, la protéine de capside est codee par un ARN subgenomique et est donc produite plus tard dans le cycle de l'infection.Pour ces raisons, l'effet protecteur présenté par la protéine de capside pour d'autres virus végétaux ne pouvait pas être attendu chez le BNYVV.

De plus, les inventeurs ont constaté trois phenomènes inattendus : premièrement, il a été observe que des cellules transformées par une même séquence codant pour la proteine de capside de 22 Kd (nucleotides 145 à 708) et au moins une partie de la protéine de 75 Kd qui est composée de la proteine de 22 Kd fusionnée avec la protéine 54 Kd (nucleotides 709 à 2218), donne lieu à l'expression de deux protéines dans la même cellule, c'est-à-dire la proteine de 22 Kd et une proteine chimerique composé de la protéine de 22 Kd additionnee de la partie de la proteine de 75 Kd codée par la séquence transformante. Cette expression est le résultat du phenomène de "readthrough", le codon "stop" à la fin de la protéine de 22 Kd etant parfois supprimé dans la cellule par des tRNA suppresseurs. I1 a été constaté que le taux d'expression de la protéine chimérique de "readthrough" est particulièrement élevé, et pourrait jouer un rôle dans la résistance conferee à la cellule exprimant les deux protèines à la fois.

Deuxiemement, les inventeurs ont observé que dans des plantes transgéniques les proteines exprimées selon l'invention sont exprimées spécifiquement dans les racines, et ce malgré l'utilisation de promoteurs constitutifs. Compte tenu du fait que les cellules cibles du BNYW sont les racines, ce phénomène peut présenter un atout supplémentaire pour la protection de la plante.

Troisièmement, il a été constaté que le promoteur 35S a une efficacité de transcription de 30 à 50 fois plus élevée que le promoteur Nos dans des cellules de betterave.

Les figures 1 à 11, les tableaux 1 à 3 et la photo illustrent des aspects différents de l'invention notamment
Figure 1
a) séquence nucléotidique de l'extrémité 5' du RNA2,
b) organisation génétique de ce RNA d'après
Bouzoubaa et al, (1986)
Figure 2 : construction des vecteurs d'expression pBIOS1 et pBIOS3.

pBIOS1 contient le promoteur (pNos) et le terminateur (Nos 3') du gène de la nopaline synthétase separes par un site de restriction BamHI (B) et encadres par deux sites EcoRI (E).

pBIOS3 est un dérivé de pBIOS1 où le promoteur Nos a été remplace par le promoteur du transcrit 35S (p35S) du
Cauliflower Mosaic Virus (CaMV) isole du plasmide pJEA25 (don de T. Michael).

Abreviations : B, BamHI - E, EcoRI - H, Hind III
Hp, HphI - P, Pst I - S, SmaI - Sst, SstI - X, XhoII - T4
DNA pol, T4 DNA polymérase - K, klenow polymérase - E
Met, EcoRI Méthylase - Ap, Ampicilline - bp, paire de base.

Figure 3 : gènes chimeriques codant pour la protéine de capside du BNYVV et pour la protéine chimerique dérivée.

A partir du plasmide pBC2 contenant 1'ADN copie de l'extrémité 5' du RNA2, nous avons isole un fragment
DraI-Bgl I de 780 bp (position 91 à 871). Ce fragment a été traité par la T4 DNA polymérise et des linkers BamHI ont été rajoutes permettant son clonage au site BamHI des vecteurs d'expression pBIOS1 et pBIOS3. Les deux plasmides pBIOî-îB et pBIO3-lB obtenus ont le fragment d'ADN en orientation sens.

Abréviation : B, BamHI - D, Dra I - E, EcoRI - P,
PstI - Sst, Sst 1 - T4 DNA Pol, T4 DNA Polymérase - CAP, départ théorique du transcrit - A+, signal de polyadenylation - ATG, codon de départ - TGA, TAA, codons stop.

Figure 4 : construction de pBIO1-2B et pBIO1-5B.

Figure 5 : construction des vecteurs de transfert.

Les differentes entités génétiques fonctionnelles dérivées de pBIOS1 et de pBIOS3 sont insérées dans le vecteur binaire pGA492. Les dérivés de pBIOS1 sont clonés au site EcoRI et seuls sont retenus les construits orientés dans le sens de transcription identique au gène de la néomycine phophotransférase (npt), alors que les dérivés de pBIOS3 sont insérés entre le site SstI et le site EcoRI, et se trouvent obligatoirement dans la bonne orientation. 32 plasmides dérives de pGA492 ont donc été obtenus.

Abreviations : E, EcoRI - Sst, SstI - npt, néomycine phosphotransférase - cat, chloroamphénicol acétyltransferase - BR et BL, bordures droite et gauche du T-DNA - Tet, tetracycline résistance - Kb, kilobase.

Figure 6 : vecteur binaire pGA-p -3-1B.

Légende : 35S, promoteur 35S du Cauliflower Mosaic
Virus - 5'Nos, promoteur du gène de la nopaline synthase - Nos, terminateur du gène de la nopaline synthase. NPT, gène de la néomycine phosphotransférase -UID A, gène de la -glucuronidase d'E. coli - BR et BL, bordures droite et gauche du T-DNA de pTiT 37 - amp, gène de résistance à l'ampicilline - tet., gène de résistance à la tetracycline - Kana., gène de resistance à la kanamycine - E, EcoRI - H, Hind III - S, Sst I - ,origine de replication du RK2.

Figure 7 : analyse par Western blot des suspensions cellulaires transformees par le vecteur binaire pGA -3-1B.

Légende : CP, protéine de capside - WT, suspension non transformée - 20 ng et 2 ng, reconstructions avec les quantités indiquées de BNYVV -p -Glu, -glucuronidase
MW, marqueur de poids moléculaire.

En encadré, la structure du gène chimérique codant pour la protéine de capside est représenté. p35S, promoteur du Cauliflower Mosaic Virus - Nos, terminateur du gène de la nopaline synthase ; tag, codon de terminaison du BNYVV : readthrough - tag, codon de terminaison situé dans le terminateur - atg, codon d'initiation.

Figure 8 : infection de protoplastes de betterave par du BNYW F13 (Cl, O) et S2 (v) par la méthode au PEG.

( & représente les résultats obtenus avec du virus inactivé.

Figure 9 : infection de protoplastes de betterave par électroporation en présence (v) et en absence (v) de CaC12 5 mM. Les symboles ouverts correspondants représentent le pourcentage de protoplastes viables en présence (V) et en absence (t2) de CaC12 5 mM.

Figure 10 : profils densitometriques d'analyses de
RNA extraits de protoplastes infectes isoles de lignees exprimant (----) ou n'exprimant pas (-) la proteine de capside du BNYVV.

Figure 11 : analyse par Western blot d'extraits protéiques de 3 betteraves transgéniques à l'aide de deux sérums : un sérum anti-BNY W et un serum anti-p glucuronidase.

Abréviations : L, limbe ; P, pétiole ; R, racine
Te, témoin ; S, suspension cellulaire transformees ; 2ng, 2ng de BNYW purifie ; 14-3, 22-1 et 68-1 réfèrent à 3 betteraves transgéniques différentes.

Tableau 1 : les 16 gènes de resistance potentiels avec leurs produits théoriques.

N.B. : les chiffres entre parenthèses réfèrent la position des sites de restrictions selon la séquence du
BNYW ; A représente le linker BglII additionné. La taille des transcripts correspond à la partie du messager complémentaire du BNYVV.

Tableau 2 : infection par le BNYW de protoplastes issus de cellules transformees et non transformees. 1 x 106 protoplastes ont été inocules avec 5 yg de BNYVV (F13 ou S2) sauf pour l'expérience 4 où l'inoculum consistait de 30 Ag de BNYW les chiffres représentent le pourcentage de protoplastes fluorescents détectés 30 h après l'inoculation. CP+ et CP- sont des lignées cellulaires transformees exprimant et n'exprimant pas la protéine capsidaire du BNYVV.

Tableau 3 : milieux de culture.

Photo : betteraves transgeniques après 4 mois d'acclimatation en serre.

L'invention concerne des plantes transgéniques produisant
- la proteine de capside du BNYVV,
- des protéines de capside modifiées définies cidessous (acides aminés supplementaires, acides aminés permutés, acides aminés deletés), qui conservent l'effet protecteur vis-à-vis du BNYW
- des ARN sens et des ARN antisens de differentes tailles et dirigés contre différentes régions de 1'ARN2 du BNYW.

Plus particulièrement, l'invention concerne une séquence nucleotidique apte à conferer la resistance à l'infection par le virus des nervures jaunes et nécrotiques de la betterave à sucre (BNYW) à des cellules exprimant ladite séquence, comprenant un fragment d'acide nucleique dérive de l'extrémité 5' du
ARN2 génomique ou subgénomique du BNYVV, ce fragment codant pour au moins une partie des protéines codées par les nucléotides 145 à 3285 du ARN2, ledit fragment etant sous le contrôle d'un promoteur permettant l'expression du fragment dans des cellules végétales et étant dans l'orientation sens ou antisens.

Comme exemple de cette séquence, on citera une séquence nucleotidique comprenant un fragment de l'extrémité 5' de 1'ARN2 génomique du BNYVV ou du cDNA correspondant, ledit fragment codant pour au moins une partie de la protéine codée par les nucléotides 145 à 2218 du ARN2 ou pour une variante de cette protéine comportant l'insertion, la substitution ou la délétion d'acide(s) aminé(s) et qui confère une résistance à la rhizomanie aux cellulels l'exprimant.

Un autre exemple de ce type de sequence est celle dans laquelle ledit fragment code pour la proteine codée par les nucléotides 145 à 708 et, en outre, pour une partie de la protéine codée par les nucléotides 709 à 2218 du ARN2 du BNYVV.

Un autre exemple de ce type de sequence est celle dans laquelle ledit fragment code pour au moins une partie d'une variante de la protéine codee par les nucléotides 145 à 2218, ladite variante se distinguant de la séquence sauvage par la presence de la séquence Glu
Asp Leu Pro qui remplace les acides aminés His ALa codés par les nucléotides 253 à 258 de la séquence sauvage. Par séquence sauvage, il faut comprendre la séquence de l'ARN2 publiée par Bouzoubaa et al (1986) reprise sur la
Fig. la, et qui indique la séquence nucleotidique ainsi que la séquence d'acides aminés.

Encore un exemple de ce type de sequence est celle dans laquelle ledit fragment code pour au moins une partie d'une variante de la protéine codée par les nucléotides 145 à 2218, ladite variante se distinguant de la séquence sauvage par la présence de la séquence Arg
Ser Ser Gly au lieu des acides aminés codés par les nucléotides 637 à 651 de la séquence sauvage, la séquence
Arg Ser Ser Gly formant le carboxy-terminal de la protéine.

L'invention vise également des fragments d'acide nucleique consistant en les nucléotides 91 à 871 du ARN2 du BNYW ou de la séquence cADN correspondante, dans lequel les nucléotides 253 à 258 sont éventuellement remplaces par GAA GAT CTT CCT, ou dans lequel la séquence
GA AGA TCT TC a été insérée à la position 638, immédiatement après le C en position 637, ou encore les fragments BglII de ces séquences. L'invention concerne aussi des fragments consistant en les nucléotides 2078 à 2774 du ARN2 subgénomique du BNYW.

Des exemples de fragments d'acide nucléique particulièrement préferes et les proteines codees par ces fragments sont illustrés dans le tableau 1.

Parmi ces séquences particulièrement préférées, on citera la séquence de bases consecutives codant pour au moins une partie de la protéine de capside de 22 Kd (codée par les nucléotides 145 à 708) et, en outre, pour une partie de la protéine de 75 Kd (codee par les nucléotides 709 à 2218). Un exemple d'une telle séquence est celle composée des nucléotides 91 à 871 du ARN2. Ce type de sequence incluant le codon stop du 22 Kd donne lieu au phénomène de "readthrough" et la cellule exprime ainsi deux protéines à la fois.

L'invention concerne egalement les protéines produites par l'expression de ces séquences, et en particulier la protéine de 29 Kd résultant de l'expression des nucléotides 91 à 871 du ARN2, qui est exprimée en même temps que la proteine de capside de 22 Kd.

Les promoteurs qui peuvent être utilisés dans le cadre de l'invention sont tous ceux qui permettent l'expression de la séquence de l'invention dans la cellule vegétale. Les promoteurs 35S et Nos qui sont, respectivement le promoteur du grand transcrit 35S du virus de la mosaïque du choux-fleur et le promoteur du gène de la noptaline synthase. D'autres signaux de transcription à utiliser avec le promoteur sont des terminateurs, par exemple Nos.

L'invention concerne en outre des cellules de betterave (Beta vulqaris) resistantes à la rhizomanie transformées d'une manière stable par les séquences nucléotidiques de l'invention, dans des conditions qui permettent l'expression de ladite sequence pendant au moins une partie de la vie de la cellule.

L'invention vise également des bourgeons et/ou embryons et des plantes transgéniques de l'espèce Beta vulqaris, résistantes à la rhizomanie et exprimant dans au moins une partie de leurs tissus, et pendant au moins une partie de leur vie, les séquences nucleotidiques de l'invention. Les graines de telles plantes sont également visees par l'invention.

Les sequences de l'invention peuvent également être utilisées comme sonde nucléique, éventuellement en combinaison avec des moyens permettant une detection, pour détecter par exemple la présence des séquences dans des cellules transformées.

La presente invention concernant la création de betteraves sucrières génétiquement transformées et pouvant resister au BNYW et donc à la rhizomanie, met en jeu
- la production de fragments de message génétique modifie ou non du virus, par la plante,
- l'expression de ces fragments d'ADN d'origine virale sous des promoteurs constitutifs (35S ; Nos),
- la vérification de cette expression par la mise en évidence des ARN messagers correspondants dans des suspensions cellulaires habituées et transformées,
- la confirmation de la production dans la même cellule de deux protéines de tailles différentes codes par le même gène
* la protéine de capside du BNYVV de 22 Kd (188, acides aminés)
* la protéine chimérique dérivée de la protéine de capside, de 29 Kd (252 acides aminés),
- l'utilisation des trois souches désarmées d'Agrobacterium tumefaciens pour la transformation de suspensions cellulaires et de cals friables de betterave,
- l'obtention de suspensions cellulaires transformantes, induites à partir de cals sélectionnés sur kanamycine apres transformation de suspens ions cellulaires habitués,
- l'utilisation de ces suspensions cellulaires transformées comme modèle pour tester l'expression de tout fragment d'ADN placé sous le contrôle de promoteurs appropries,
- l'utilisation de ces suspensions cellulaires pour tester l'inhibition de la multiplication virale par un gene donné,
- l'inhibition de la multiplication du BNYVV dans des protoplastes issus de suspens ions cellulaires transformées et produisant les deux proteines de 22 Kd et 29 Kd, des protoplastes servant comme modèle pour tester l'infectabilité de la cellule, les cellules ne pouvant pas être infectées directement par les virus,
- la transformation de jeunes cals friables organogènes,
- l'obtention de cals transformés organogènes sélectionnes sur kanamycine après transformation de jeunes cals friables organogènes,
- la possibilite de supprimer très tôt à la fois l'agent selectif (kanamycine) et l'agent bacteriostatique (céfotaxime) du milieu de culture des cals,
- le développement des bourgeons ou embryons initiés à partir des cals transformes, en plantes transformées enracinées,
- l'expression dans la plante des gènes transférés,
- la mise en evidence de la production des protéines 22 et 29 Kd spécifiquement dans les racines de betteraves transformees,
- l'absence de la production de proteines 22 et 29
Kd dans la partie aerienne des plantes transformées,
- la production de graines transgéniques à partir de transformants primaires,
- la mise en évidence de la résistance à la rhizomanie des plantules issues des graines transgeniques.

EXEMPLE 1 : EXTRACTION DE L'ARN VIRAL
La multiplication du virus se fait sur Chenopodium quinoa après inoculation manuelle, et l'extraction se fait à partir de feuilles viroses de huit jours selon la technique de Putz (1977). La suspension virale ainsi obtenue est ajustée à 100 mM NaCl puis soumise à deux extractions au phénol suivies de deux lavages à l'éther de la phase aqueuse. Les RNA viraux sont precipités par addition de deux volumes d'éthanol distillé et conservés à -20 C. Le nombre et la taille des RNA a été rapporté par Richards et al (1985).

EXEMPLE 2 : FABRICATION DU cDNA DU RNA 2
Richards et al ont montre en 1985 que le RNA 2 était un messager efficace pour la synthèse de la protéine capsidaire. Un ADN complémentaire d'une partie du RNA 2 a été synthétisé par la méthode de Van der Werf et al (1981) et clone au site Pst 1 du plasmide pBR322 (Bolivar et al, 1977). Le plasmide résultant pBC2 contient un ADN copie correspondant aux 2938 bases de l'extrémité 5' du
RNA 2 (Richards et al, 1985).

EXEMPLE 3 : DETERMINATION DE LA SEQUENCE DE L'EXTREMITE 5'DU RNA 2
Grâce à la technique de Maxam et Gilbert (1980), et à celle de Sanger (1977), la séquence du clone pBC2 a été déterminée. Sur la figure 1, la séquence detaillee est presentée avec, au-dessous, l'organisation genetique du
RNA2 schématisée. L'examen de cette séquence a confirmé la présence de la protéine de capside au niveau du ler cistron situé en 5', le codon ATG de départ étant placé à 144 nucléotides de l'extrémité 5'. Cette protéine d'un poids moléculaire de 22 Kd comporte 188 codons et se termine par un codon ambre UAG. La composition en acides aminés déduite de la séquence est identique à celle de la protéine capsidaire du BNYW déterminée par C. Putz (1977).Le codon stop (UAG) est immédiatement suivi d'une phase ouverte ayant une capacité codante correspondant à un polypeptide de 54 Kd. Par la suppression du codon UAG, on peut donc obtenir une phase de lecture ouverte capable de coder pour une protéine de 75 Kd. Ces données sont en accord avec les résultats obtenus par Ziegler et al (1985) montrant que le RNA2 est un messager efficace pour la synthèse de deux protéines immunoprécipitées par du sérum anti BNYVV et dont la synthèse est augmentee en présence d'un t.RNA suppresseur. Tous ces resultats sont discutés dans la publication de Bouzoubaa et al (1986), il est aussi précisé qu'une 3ème phase de lecture capable de coder in vitro pour une proteine se fait à partir d'un
ARN subgenomique du RNA2 qui a été mis en évidence et qui peut être encapsidé.

EXEMPLE 4 : CONSTRUCTION DES VECTEURS D'EXPRESSION
Premièrement les signaux de transcription du gène de la nopaline synthase de la bacterie Aqrobacterium tumafaciens T 37 ont été utilises. A partir du plasmide pNopnéoa 18 construit par Bevan (1983) dont la structure est présentée dans la figure 2, celui-ci contient la séquence du vecteur de clonage pUC9 (Vierra et al, 1982) avec un fragment EcoRI-BamHI de 260 bp et un fragment
HindIII-XhoII (BamHI-BglI) de 310 bp. Ces deux fragments qui proviennent du plasmide tumorigène pTiT37 d'Aqrobacterium tumafaciens T 37 contiennent respectivement le signal de polyadénylation et le promoteur du gène de la nopaline synthase.Ces deux signaux de transcription encadrent un fragment BglII-Bam
HI de 1000 bp qui contient le gène codant pour l'aminoglycoside phosphotransferase II ; à partir de ce plasmide, le fragment de 1000 bp a été enleve par digestion ménagee avec l'enzyme de restriction XhoII, et les molécules de taille de 3300 bp environ sont récuperees après migration sur gel d'agarose. Après ligation et transformation dans E. coli HB101 (Bolivar et al, 1979) des transformants résistants à l'ampicilline ont été selectionnes. La majorité de ces techniques sont décrites dans "Molecular Cloning. A laboratory manual" (Maniatis et al, 1982).Grâce à la cartographie à l'aide d'enzyme de restriction, les inventeurs ont retenu le plasmide pNosENeo, qui possédait un fragment EcoRI-BamHI de 260 bp et un fragment BamHI-HindIII de 310 bp. Pour des commodités d'utilisation de ce plasmide, les inventeurs ont remplacé le site de restriction Hind III par un site EcoRI (détails non presentés) et ainsi ils ont obtenu le vecteur d'expression pBIOS1 (figure 2).

Un autre vecteur d'expression a été construit dans le cadre de l'invention. I1 a la même structure que pBIOS1, le même fragment comportant le signal de polyadenylation, mais le fragment promoteur a été changé.

En effet, le fragment PstI-BamHI comportant le promoteur du gène de la nopaline synthase a été remplace par un fragment EcoRI-BamHI de 400 bp contenant le promoteur du grand transcrit 35S du virus de la mosaïque du choufleur (Ca.M.V.). Ce fragment a été obtenu à partir du plasmide pUC35S qui dérivait du clonage d'un fragment BamHI-HphI au site Sma I du vecteur de clonage pUC13 (Messing, 1983). La source du fragment BamHI-HphI etait le plasmide pJEA25 construit par T. Michael qui avait prélevé un fragment Dde I s'étendant de la position 7069 à la position 7569 du CaMV isolat BJ1 décrit par Franck et al (1980). Après avoir modifié les extrémités de ce fragment grâce à des linkers BamHI, T. Michael l'avait cloné au site BamHI du plasmide pAT153 (Twigg et al, 1980).Sur la figure 2, les differentes étapes de la construction du vecteur d'expression pBIOS3 sont schématisées.

Pour les deux vecteurs d'expression pBIOS1 et pBIOS3, le site de restriction BamHI est présent entre les deux fragments d'ADN contenant le promoteur pour l'un et pour l'autre le signal de polyadénylation ; cette situation est idéale pour l'insertion de tout DNA étranger qui sera un substrat pour la transcription.

EXEMPLE 5 : INSERTION DE FRAGMENTS cDNA DU BNYVV AU
SITE BAMHI DES VECTEURS D'EXPRESSION
Le plasmide pBC2 a été digere par les enzymes de restriction BglI et DraI et ensuite l'extrémité sortante du site BglI a été supprimee par l'utilisation de la DNA polymérase du bactériophage T4. Ce fragment a été purifié par élution à partir d'un gel d'agarose, après separation électrophoretique. Des linkers BamHI ont été additionnés aux extrémités de ce fragment, et après une digestion avec un grand excès de l'enzyme de restriction BamHI ; ce fragment de 780 bp a été incubé avec les vecteurs pBIOS1 et pBIOS3 ouvert au site BamHI. Après ligation, le melange a servi à transformer E. coli HB101. Après un tri effectué sur les clones resistants à l'ampicilline, 4 plasmides ont été retenus.Les plasmide appelés pBIO1-lB et pBIO3-lB qui ont le fragment cDNA contenant la séquence codante de la protéine de capside sous le contrôle du promoteur Nos pour le premier et pour l'autre sous le contrôle du 35S (figure 3).

Ces plasmides peuvent diriger la fabrication de RNA messagers qui une fois traduits produiront à la fois la protéine de capside du BNYVV et une protéine chimérique de 29 Kd provenant de la suppression du codon stop (phénomène de readthrough). Cette proteine de 252 acides aminés est composée comme suit
- les 188 acides amines de la protéine de capside,
- 53 acides aminés de la protéine de 75Kd allant de la position 189 à 241 inclus,
- de 11 acides amines codés par la séquence du terminateur de la nopaline synthase qui sont respectivement : thréonine, glycine, serine, proline, isoleucine, leucine, glutamine, thréonine, phénylalanine, glycine, glutamine. Deux autres plasmides ont ete obtenus, ces plasmides appelés pBIO1-lA et pBIO3-lA ont le fragment cDNA du BNYVV en orientation inverse sous le contrôle des deux promoteurs.Ces plasmides pourront diriger la fabrication de RNA messagers dits antisens, qui seront des messagers complémentaires de la partie 5' du RNA2.

EXEMPLE 6 : CONSTRUCTION D'UNE FAMILLE DE GENES
PERMETTANT LA FABRICATION DE PROTEINES DE CAPSIDE DU
BNYVV MODIFIEES ET DE RNA ANTISENS DE TAILLE VARIABLE
Deux plasmides dérives de pBIOl-lB, le plasmide pBIO1-2B et le plasmide pBIO1-5B ont été construits. Les différentes étapes de la construction de ces plasmides sont présentées dans la figure 4. Brièvement pour la construction de pBIO1-2B, le plasmide pBIO1-lB a été ouvert au site SphI (position 256 du RNA2) les bouts "collants" ont été enlevés par l'utilisation de la DNA polymérase du bactériophage T4 (délétion de 4 bp) et des linkers BglII de 10 bp ont été ligases aux extrémités franches ainsi produites. Après une digestion exhaustive avec BglII, le plasmide est religasé.Après transformation dans E. coli, le plasmide pBIO1-2B a été obtenu ; celui-ci ne contient plus de site SphI et à cette position on trouve maintenant un site BglII. Cette manipulation a permis deux choses : premièrement, l'obtention d'un site de restriction utile pour d'autres constructions (extrémités compatibles avec celles produites par BamHI) et deuxièmement, l'obtention d'une séquence codante modifiee qui code pour une proteine de capside possédant deux acides aminés supplémentaires et dont deux acides aminés sont changes. Le plasmide pBI01-5B a été obtenu par le même type de manipulation mais dans son cas c'est le site Smal de pBIO1-lB (position 637 du RNA2) qui a été modifié par des linkers
BglII. Ce plasmide code pour une protéine de capside raccourcie de 19 acides amines et dont les 4 derniers sont modifiés.

En utilisant les sites BglII et Bam HI de ces deux ;plasmides, les inventeurs ont pu isoler et cloner dans les deux vecteurs d'expression pBIOS1 et pBIOS3 differents morceaux de cDNA recouvrant l'extrémité 3' ou l'extrémité 5' de la protéine de capside et ceci sur des longueurs variables. Une famille de gènes susceptibles de rendre résistante au BNYVV une cellule ou une plante fabriquant le produit d'un ou plusieurs de ces gènes a ainsi été obtenue. Tous ces différents fragments de cDNA sont présentés dans le tableau 1 avec les produits attendus (transcrit et protéine) ; la lettre B référant une orientation sens et A une orientation antisens.

TABLEAU 1

<tb> :ODE <SEP> FRAGMENT <SEP> cDNA <SEP> TRANSCRIPT <SEP> PROTEINE
<tb> <SEP> 780 <SEP> bp
<tb> <SEP> B <SEP> II <SEP> ARN <SEP> bon <SEP> sens <SEP> protéine <SEP> de
<tb> <SEP> (188 <SEP> acides <SEP> ami
<tb> <SEP> nes) <SEP> et <SEP> protéine
<tb> <SEP> chimérique <SEP> déri
<tb> <SEP> vée <SEP> 29 <SEP> Kd <SEP> (252
<tb> <SEP> Aa)
<tb> B <SEP> ~~~~~~~~~~~~~ <SEP> B <SEP> } <SEP> ARNARN <SEP> bon <SEP> sens <SEP> Protéine <SEP> de
<tb> <SEP> (256) <SEP> 780 <SEP> bp <SEP> capside <SEP> mutee
<tb> <SEP> (190 <SEP> Aa)
<tb> <SEP> B <SEP> B <SEP> 4 <SEP> ARN <SEP> bon <SEP> sens <SEP> 36 <SEP> Aa <SEP> NH2 <SEP> terminal
<tb> <SEP> 3' <SEP> 165 <SEP> bp <SEP> de <SEP> la <SEP> proteine
<tb> <SEP> de <SEP> capside
<tb> 4 <SEP> B <SEP> X <SEP> | <SEP> ARN <SEP> bon <SEP> sens
<tb> <SEP> 5' <SEP> 615 <SEP> bp
<tb> 5B <SEP> ARN <SEP> bon <SEP> sens <SEP> Proteine <SEP> de
<tb> <SEP> (637) <SEP> 780 <SEP> bp <SEP> capside <SEP> tronquée
<tb> <SEP> (169 <SEP> Aa)
<tb> <SEP> B <SEP> B <SEP> ≈<SEP> L~ <SEP> ARN <SEP> bon <SEP> sens <SEP> 164 <SEP> Aa <SEP> NH2 <SEP> terminal
<tb> <SEP> 5' <SEP> 546 <SEP> bp <SEP> de <SEP> la <SEP> proteine <SEP> de
<tb> <SEP> capside
<tb> B <SEP> B <SEP> k <SEP> ARN <SEP> bon <SEP> sens
<tb> <SEP> 3' <SEP> 234 <SEP> bp
<tb> 700 <SEP> bp
<tb> 8 <SEP> B <SEP> < <SEP> ARN <SEP> bon <SEP> sens <SEP> 215 <SEP> Aa <SEP> NH2 <SEP> terminal
<tb> <SEP> (2078) <SEP> (2774)700 <SEP> bp <SEP> de <SEP> la <SEP> protéine <SEP> de
<tb> <SEP> 42 <SEP> Kd
<tb>

<tb> CODE <SEP> FRAGMENT <SEP> cDNA <SEP> TRANSCRIPT <SEP> PROTEINE
<tb> 1 <SEP> A <SEP> ~~~~~~~~~~~~~ <SEP> * <SEP> ARNARN <SEP> anti-sens
<tb> <SEP> (8701) <SEP> (91) <SEP> 780 <SEP> bp
<tb> 2As' <SEP> ARN <SEP> anti-sens
<tb> <SEP> 780 <SEP> bp
<tb> 3A <SEP> ARN <SEP> anti-sens
<tb> <SEP> 5' <SEP> 165 <SEP> bp
<tb> 4 <SEP> A <SEP> s <SEP> ARN <SEP> anti-sens
<tb> <SEP> 3' <SEP> 3' <SEP> 615 <SEP> bp
<tb> 5A <SEP> ARN <SEP> anti-sens
<tb> <SEP> 780 <SEP> bp
<tb> 6 <SEP> A <SEP> + <SEP> ARN <SEP> anti-sens
<tb> <SEP> 5' <SEP> 546 <SEP> bp
<tb> 7 <SEP> A <SEP> ARN <SEP> anti-sens
<tb> <SEP> 3' <SEP> 234 <SEP> bp
<tb> 8 <SEP> A <SEP> ~~~~~~~~~~~~~ <SEP> ~ <SEP> ARNARN <SEP> anti-sens
<tb> <SEP> (2774) <SEP> (2078 <SEP> 700 <SEP> bp
<tb>
N.B. : les chiffres entre parenthèses repèrent la position des sites de restrictions selon la séquence du BNYVV ; V représente le linker BglII additionné. La taille des transcripts correspond à la partie du messager complementaire du BNYVV.

Sur ce tableau, il est aussi presente un fragment de cDNA s'étendant de la position 2078 à 2774 ; il s'agit d'un fragment Sau 3A du RNA2 correspondant à l'extrémité 5'du RNA subgénomique codant pour la protéine de 42 Kd (figure lb). Les inventeurs ont clone ce fragment dans les vecteurs d'expression pBIOSl et pBIOS3 et ceci dans les deux orientations (8B et 8A).

EXEMPLE 7 : INTRODUCTION DES GENES DANS UN
VECTEUR BINAIRE
Le vecteur binaire pGA492 choisi a ete construit par
G. An (1986).Ce plasmide a une taille de 12 kb, sa carte génétique est présentée dans la figure 5. Ce plasmide possède :
- deux fragments d'ADN contenant les séquences du
T-DNA du plasmide tumorigène pTiT37, ces sequences delimitent la partie transférée et sont indispensables au transfert,
- un gène chimerique contenant la séquence codante du gène de la neomycine phosphotransférase du transposon
Tn5 (Rothstein et al, 1981) qui est fusionné à un fragment contenant le promoteur du gène de la nopaline synthase et les premiers codons de la séquence codante de ce même gène.Ce gène chimerique est termine par le signal de polyadenylation du gène de la nopaline synthase. Ce gène confère aux cellules végetales le contenant la capacité de se multiplier en presence de kanamycine, qui est normalement un antibiotique toxique pour celles-ci,
- plusieurs sites uniques de restriction permettant le clonage de gènes construits in vitro,
- une origine de réplication à large spectre d'hôte fonctionnant dans E. coli et dans Aqrobacterium tumefaciens,
- une origine de transfert et les gènes mob nécessaires pour le transfert par conjugaison bactérienne,
- un gène de resistance à la tétracycline qui permet la sélection de bactéries transconjugantes.

Sur la figure 5, les inventeurs ont exemplifié l'introduction de deux gènes, les gènes portes par pBIO1-lB et par pBIO3-lB. Tous les fragments de cDNA sous le contrôle du promoteur Nos (pBIOS1 dérivés) sont clones au site EcoRI de pGA 492 après isolement des gènes respectifs avec EcoRI. Seuls les clones presentant les gènes dans le même sens de transcription que celui du gène conferant la resistance à la kanamycine sont retenus.Pour les gènes contenant le promoteur 358 du
CaMV (pBIOS3 derives) le clonage s'effectue entre les sites Sst I et EcoRI de pGA 492 après digestion des diferents plasmides par ces deux mêmes enzymes. 32 vecteurs de tranfert ont été obtenus, deux de ceux-ci sont presentés dans la figure 5, pGA-1-lB et pGA-3-lB.

EXEMPLE 8 : INTRODUCTION D'UN GENE REPORTEUR DANS LE
VECTEUR BINAIRE pBA-3-lB
La confirmation du caractère transformé d'un tissu végétal s'effectue dans de nombreux cas par la mise en evidence des proteines codes par les gènes transférés.

Dans le cas du vecteur binaire pGA-3-lB, les inventeurs ont pu doser par des techniques immunologiques la proteine de capside du BNYVV et par un dosage enzymatique l'activité de la néomycine phosphotransferase qui confère la résistance à la kanamycine. Cependant, ces dosages sont longs et délicats et ils necessitent une importante quantité de matériel vegétal.

En 1987, Jefferson et al, utilisent le gène uid A d'E.

coli codant pour l'enzyme 8-glucuronidase (GUS
E.C.3.2.2.31) comme gène reporteur. Ce gène sous le contrôle de signaux de transcription végétaux (promoteur 35S du CaMV et terminateur Nos) s'exprime très bien dans les cellules végétales et l'enzyme se révèle très stable.

Plusieurs méthodes de dosage de l'activité enzymatique de cette protéine sont disponibles car il existe différents types de substrats ; en particulier des substrats donnant des produits chromogènes et des substrats donnant des produits fluorescents. On peut effectuer de façon simple et avec peu de matériel végétal des dosages quantitatifs (intensite de la fluorescence) et des dosages qualitatifs par histochimie (apparition d'un precipité bleu-indigo).

Pour bénéficier de ce système reporteur dans les expériences de transformation, les inventeurs ont construit le vecteur binaire pGA-ss-3-lB. La structure genique de ce plasmide est présentée dans la figure 6. Le gène pouvant inhiber la multiplication du BNYW est encadre par le gène conférant la résistance à la kanamycine et par le gène codant pour la B-glucuronidase.

Pour réaliser cette construction, les inventeurs ont inséré au site EcoRI du vecteur binaire pGA-3-lB, le plasmide pBI221 (Jefferson, 1987) ouvert à sont site
EcoRI. Le vecteur binaire pGA-B-3-1B resultant (d'une taille de 19 kb) a été transféré dans les souches d'Aqrobacterium désarmées (LBA 4404, EHA 101, C58'3) par conjugaison triparentale selon la technique décrite par
Ditta et al (1980).

EXEMPLE 9 : OBTENTION DE CALS FRIABLES REGENERANTS A
PARTIR DE FEUILLES
Des graines de betterave sont semees dans du terreau en serre.

Environ un mois après la germination en serre, les premières expériences d'induction de cals selon la méthode decrite par Saunders et al (1986) ont été faites
- de jeunes feuilles de 3 à 5 cm de long sont prélevees de chaque plante,
- elles sont desinfectees comme suit
Domestos 15 % pendant 5 minutes
3 rinçages à l'eau stérile
séchage sur papier filtre stérile
- chaque feuille est ensuite découpée en fragments de 0.25 cm2 environ,
- les explants ainsi obtenus sont mis en culture sur du milieu MSB1 (annexe 1) en boites de Petri,
- les boîtes après avoir été scellées avec du scello-frais sont placees à 30"C à l'obscurité pendant 30 jours,
- puis elles sont sorties en chambre de culture
L:D 18:8, 25"C:20"C.

De 4 à 10 semaines après la mise en culture, des cals blancs friables apparaissent autour, sur ou sous les explants foliaires.

De 1 à 8 semaines après l'apparition de cals des bourgeons et/ou embryons commencent à régénérer de ces cals.

TABLEAU 3 : MILIEU DE CULTURE MS
Pour 1 litre
4.4 g de milieu de Murashige et Skoog
déshydratés de chez SIGMA réf. M6899.

Vitamines
1 mg panthotenate de calcium
0,01 mg biotine
1 mg acide nicotinique
1 mg pyridoxine HCl
10 mg thiamine HCl 30 g saccharose pH : 5.8
Milieu solide : 8 g agar-agar
MSB1
MS + 1 mg/l BAP
MSBo.l
MS + 0.1 mg/l BAP
MS enracinement
MS + 1 mg/l ANA
Etalement des cellules
MSB1 + C = MSB + 300 mg/l céfotaxime
MSB1 + CK = MSB + 300 mg/l céfotaxime
+ 200 mg/l kanamycine LB
Pour 1 litre
10 g bactotryptone
5 g yeast extract
10 g NaCl
EtENPLE 10 :OBTENTION DE SUSPENSIONS
CELLULAIRES A PARTIR DES CALS INDUITS
De 4 à 6 semaines après leur apparition, les cals sont prélevés (en évitant toute structure organisée) et mis en culture dans 100 ml de milieu
NSB1 liquide, dans les erlenmeyers de 250 ml fermés avec une feuille de cellophane maintenue au col par deux élastiques. Les erlenmeyers sont agités à 200
RPM environ dans la chambre de culture.

La suspension cellulaire s'établit en 2 ou 3 semaines. Chaque suspension est repiquée toutes les 3 semaines environ comme suit
- le contenu de chaque erlenmeyer après 3 semaines de culture est filtré sur une serie de trois tamis empilés (dont les mailles sont de 1 mm, 500 ym et 100 m). Une partie de chaque fraction ( > 1 mm, > 500pm, > 100 ?m) est remise en suspension dans 100 ml de milieu NSBl frais en erlenmeyers de 250 nil. Ces nouvelles suspensions sont à nouveau agitées à 200
RPM.L'observation des differentes suspensions cellulaires établies à partir des différents génotypes ont permis de distinguer deux types cellulaires
* type habitué (A) : suspension fine, verte à croissance rapide, régénère ponctuellement des formations vitrifiées se développant difficilement,
* type noduleux (C) : suspension d'agregats compacts jaunâtres, à croissance plus lente, régénère plus fréquemment que la première, des structures embryonnaires compactes se développant assez bien.

EXEMPLE 11 : TRANSFORMATION DE SUSPENSIONS
CELLULAIRES ET DE JEUNES CALS
Suspension cellulaires
La transformation est faite sur des suspens ions cellulaires après 3 semaines de culture, sans repiquage.

Dans un tube plastique, stérile et gradue, on recueille une partie de la suspens ion de manière à avoir 5 ml de cellules tassées dans 10 ml de milieu. 10 ml milieu MSB1 frais sont rajoutés. La nouvelle suspension ainsi obtenue est distribuee dans quatre boîtes de pétri à raison de 5 ml par boite.

Les souches d'Aqrobacterium tumefaciens testées sont
LBA 4404, EHA 101, C58'3. Chacune de ces souches contient des vecteurs binaires portant les gènes construits (exemples 5 et 6) et plus particulièrement le vecteur pGA-B-3-1B (exemple 8).

Les souches bactériennes sont conserves à -20 C dans 15 % de glycérol. 50 pl de chaque souche sont prélevés et mis en culture dans 2 ml de milieu LB + rifampicine + tetracycline. Les cultures sont agitees à 200 RPM à 30"C pendant 2 jours. Chaque souche est repiquée dans du milieu frais et cultivée dans les conditions décrites plus haut pendant une nuit.

Quand les bactéries sont ainsi prêtes, l'infection des cellules végétales est faite
- 50 pl de chaque souche poussée une nuit sont prélevés et ajoutés à une des boîtes de Pétri contenant les cellules de betteraves decrites plus haut
- la coculture des cellules de betterave et des bactéries se fait à l'obscurité pendant 3 jours en chambre de culture
Après ces 3 jours, des cellules végétales sont lavées pour éliminer la bactérie, une première fois avec du MSB1 + 600 mg/l de céfotaxime (bactériostatique inhibant la croissance d'Aqrobacterium), puis une deuxième fois dans du milieu MSB1 + 300 mg de céfotaxime
- les cellules ainsi lavees sont mises en culture sur un disque de papier Whatman stérile déposé sur du milieu MSB1 + CK (tableau 3), en boîtes de Pétri (la kanamycine est l'agent sélectif permettant aux seules cellules transformees de se developper). Les boites sont scellées avec du scello-frais et mises en chambre de culture. 15 jours apres, les filtres portant les cellules vegetales sont repiqués sur du milieu frais MSB1 + céfotaxime + kanamycine
- 3 à 8 semaines apres la coculture, des cals blancs apparaissent sur un lit de cellules mortes.

Quand ils sont suffisamment développés, ces cals sont repiqués soit sur milieu MSB1 + CK ou MSB1 + C ; la plupart des cals poussent sur les deux milieux. Un test histochimique (Jefferson, 1987) pour déceler l'activité de la protéine codée par le gène de la p-glucuronidase dans les cellules de ces cals, a permis d'évaluer à environ 80 % le taux de cals positifs pour ce test. Ceci confirme donc le caractère transgénique de la plupart des cals obtenus.

Le fait de cultiver ces cals sans l'agent sélectif (kanamycine) ne semble pas modifier l'expression du gène
GUS. De plus, après un mois de culture sur milieu avec céfotaxime, les cals peuvent être sevres de cet antibiotique sans que la bactérie se developpe sur le milieu.

Donc, un mois après le clonage des cals, on peut se passer d'ajouter les deux antibiotiques dans le milieu de culture, sans inconvénient apparent. Ceci peut représenter un atout pour la régénération.

Cals nouvellement induits
Les inventeurs ont pensé que le potentiel organogène des cals transformés serait mieux préservé si, au lieu de transformer des suspensions cellulaires induites depuis plusieurs mois (et ayant hypothétiquement perdu de leur potentiel de regeneration), de jeunes cals fraîchement induits d'explants foliaires (Saunders et al, 1986) étaient transformés.

Pour tester cela, des cals juste apparus depuis 2 à 6 semaines sur feuilles de serre ont été preleves. Ces cals ont été dispersés dans un milieu MSB1 liquide en tubes plastiques steriles, et le même protocole de transformation que pour les suspens ions cellulaires a été appliqué. Des cals transformés ont ainsi été sélectionnés par cette voie.

EXEMPLE 12 : EXPRESSION DES GENES POUVANT INHIBER LE
DEVELOPPEMENT DU BNYVV DANS DES CELLULES DE BETTERAVE
Les inventeurs ont transformé des suspens ions cellulaires habituées de betteraves avec tous les gènes construits presentés dans les exemples 5 et 6. Pour chacun de ces gènes plusieurs suspensions cellulaires transformees ont été initiées et cultivées en présence de kanamycine 200 mg/l. A partir de 10 g de cellules transformées soumises à l'action de cellulases et de pectinases, soit les ARN totaux, soit les protéines solubles totales ont été isolés.

Pour l'extraction des ARNs la technique utilisant l'isothyocyanate de guanidium décrite par Ausubel et al (1987) s'est révélée la plus efficace sur ces cellules aux parois digerées. Les ARN totaux ont été analysés par
Northern blot selon Maniatis et al (1982). Pour l'hybridation des ARN totaux contenant un ARN message dérivé du gène de la protéine de capside, les inventeurs ont utilise comme sonde le fragment BamHI de 780 paires de bases du plasmide pBIO-3B. Pour ceux exprimant un ARN messager dérive du gène codant pour la protéine de 42 Kd, le fragment EcoRI de 1330 paires de bases du plasmide pBIO-3-8B a été utilisé comme sonde.Le marquage radioactif de ces 2 sondes grâce à de l'ATP (P32) s'est fait par la technique dite de l"'Oligonucleotide Primed
Synthesis" (Ausubel et al, 1987).

Les résultats obtenus ont permis aux inventeurs de verifier la présence de tous les ARN messagers attendus, ce qui montrait la fonctionnalité des gènes chimériques construits. Ces messagers ont une taille correspondante à celle indiquée dans le tableau 1 majorée de 200 nucléotides environ. Ces nucléotides supplémentaires situés à l'extrémité 3' du mRNA sont dus à la partie transcrite du terminateur Nos jusqu'au signal de polyadénylation et à la queue de poly-A. Il a aussi été observé que le promoteur Nos a une efficacité de transcription de 30 à 50 fois plus faible que le promoteur 35S dans des cellules de betteraves. Ces résultats sont comparables à ceux obtenus sur le tabac et la tomate par Sanders et al (1987).

Bien que la transcription de tous les gènes ait ete vérifiée, il était nécessaire de voir si nous avions traduction et production de la protéine de capside et de la protéine chimérique de 29 Kd dans le cas du vecteur binaire pGA-ss-3-lB. Pour cela il a été réalise un western blot (Ausubel et al, 1987)) sur des protéines solubles extraites à partir de différentes suspens ions cellulaires transformées (tampon d'extraction : urée, 9M ; p- mercaptoéthanol, 7,5 %, SDS, 4,5 % ; pH : 6,8).Les résultats sont presentes dans la figure 7 ; la partie supérieure du filtre a été revelée avec des anticorps polyclonaux anti ss-glucuronidase et la partie inférieure par des anticorps polyclonaux anti-BNY W. La ss- glucuronidase est présente dans la majorité des suspens ions transformees (bande immunoréagissante 68 Kd).

Dix suspensions sur les 11 testées présentent une bande immunoréactive commigrant avec la protéine de capside du BNYW ainsi qu'une bande d'un poids moléculaire d'environ 29 Kd. L'expression de ces deux protéines est de l'ordre de 0,005 à 0;01 % des protéines solubles totales ; cette quantité atteste de la bonne efficace de traduction du messager produit. Il est à noter que la quantité de 29 Kd est particulièrement élevee dans la majorité des transformants et peut être supérieure à celui de la protéine de capside. Le taux de readthrough dans les suspensions cellulaires habituées à l'air d'être supérieur à celui observé dans des racines de betteraves pour le RNA2 (Ziegler et al, 1985) et sur des betteraves transgéniques (exemple 15).

EXEMPLE 13 : TEST DE RESISTANCE IN VITRO
Isolement et purification de protoplastes de betterave
Cinq jours après le repiquage, 2 ml de suspension cellulaire tassée sont digérés dans 20 ml d'enzymes caylase. La composition du cocktail enzymatique est la suivante : 0.25 %, 345 S ; 0.25 % T ; 0.08 % M2L dissout dans du mannitol 0.7 M contenant 0.08 mM NaH2PO4, 0.03 mM
MES et 0.68 mM CaCL2. La pression osmotique est ajustee à 760 mOsmole/Kg et à pH 5,8. après 16 à 18H00 de douce agitation (30 oscillations par minute) à l'obscurité et à 24"C, la suspension est filtrée sur tamis de 100 et 50 Sm respectivement.Le filtrat est additionné d'un volume égal d'une solution iso-osmotique de KCl à 470 mM et les protoplastes sont sédimentés à 50 g pendant 5 minutes. Le culot est repris dans du saccharose isoosmotique à 570 mM et centrifugé à 50 g pendant 15 minutes. L'anneau de protoplastes est prélevé, soumis à une deuxième centrifugation dans du saccharose, qui, sedimenté, est lavé deux fois dans du mannitol à 760 mOsmoles/Kg. La viabilite des protoplastes est quantifiee par coloration au diacetate de fluorescéine (Widholm, 1972). On s'assure que la digestion est complète par l'absence de coloration de paroi du calcofluor.

L'utilisation de gradients iso-osmotiques mais de densités différentielles a permis d'obtenir des préparations de protoplastes à très hauts rendements 5 x 106 protoplastes par ml de cellules tassées et complètement débarrassés de débris cellulaires. En moyenne, 90 % des protoplastes sont viables.

Culture des protoplastes isolés de cellules non transformées et transformées
Le milieu de culture des protoplastes est un milieu de macro et micro éléments de Murashige et Skoog (1962) ou le NH4NO3 est diminué de moitié et additionné de
zig/1 hydrolysat de caséine
30 g/l saccharose
7,7 mg/l glycine
1,3 mg/l d'acide nicotinique
0,25 ng/l pyridoxine
0,25 n/l Thiamin-HCI
400 mg/l glutamine
25 mg/l glucosamine
1 mg/l 6 benzyl amino purine
1 mg/l acide indole acetique.

La pression osmotique est ajustée à 760 mOsmole/kg avec du mannitol et le pH à 5,8. Le milieu de culture est stérilisé par filtration.

Des protoplastes ont été isolés à partir de suspensions cellulaires transformees et non transformées.

Ils ont été mis en culture dans le milieu ci-dessus en présence et en absence de kanamycine à 200 mg/l afin de calculer l'efficacité d'étalement. Les résultats montrent que les protoplastes isolés à partir de cellules non transformées ne survivent pas sur milieu sélectif contenant 200 mg/l de kanamycine. Ceci est en accord avec l'absence d'échappement dans les expériences de transformation. Aucune différence significative n'a été trouvée entre les efficacités d'étalement de protoplastes issus de cellules transformees en présence et absence de kanamycine. Ceci confirme donc l'absence de cellules non transformées au sein des lignées transformees. Lors d'expériences comparatives qui seront décrites ci-dessous, les protoplastes issus de 4 types de lignées cellulaires (ss7 et B14 exprimant la 22 Kd et la 29 Kd, WT, non transformées et ss D transformée par le vecteur binaire pGA492) seront mis en culture en absence de pression de sélection.

Infection de protoplastes de betterave par le BNYVV
L'optimisation de la technique d'infection s'est effectuée sur des protoplastes issus de cellules non transformées. Les inventeurs se sont inspirés de la technique d'infection par le polyéthylène glycol décrit par Samac et al (1983) et de celle par électroporation décrite par Watts et al (1987). Afin d'obtenir des taux élevés d'infectivitê, il était impératif d'utiliser des préparations de protoplastes dépourvues de débris, ayant des taux de viabilité supérieurs à 90 % ainsi que des preparations de virus âgées de moins de deux semaines.

La fréquence d'infection a été déterminee par immunofluorescence par une technique indirecte décrite par Maule et al (1980). Les protoplastes infectés ont une fluorescence vert clair caractéristique, dispersee dans le cytoplasme ; les protoplastes non infectés sont marron terne. La figure 8 présente les résultats de 4 expériences d'infection de protoplastes de betterave par la technique au polyéthylène glycol. Il a été constaté qu'après 24 heures de culture environ 60% des protoplastes sont infectés. Ce pourcentage n'évolue pas de façon significative pour des durées de culture supérieures à 24 h. L'infection s'est donc réalisée de façon quasi-synchrone.Cette figure nous montre aussi que du virus inactivé par congelations et décongelations répétées ne se réplique pas dans les protoplastes de betterave. Dans toutes les experimentations effectuees, en moyenne 50 % des protoplastes sont infectés.

Les inventeurs ont réussi à introduire des particules virales du BNYVV en utilisant des impulsions electriques (technique d'glectroporation). Les inventeurs se sont inspirés de la technique decrite par Watts et al (1987) et ont utilisé un électroporateur à décharge de capacites (Guerche et al, 1987).

L'optimisation de la technique s'est faite en faisant varier la durée d'impulsion délivrée par des condensateurs de différentes capacites et la résistivité du milieu d'électroporation. C'est ainsi que les inventeurs ont vu que deux impulsions de 100 ms délivrées à 15 secs d'intervalle par des condensateurs de capacite 63 AF chargés à 220 V à 1 x 106 protoplastes remis dans du mannitol contenant du CaCl2 à 5 mM en présence de 5 g de BNYVV permettaient d'avoir un taux de 55 % de protoplastes infectés. L'omission du CaCl2 résulte en une diminution de l'infectivite d'un facteur 3, bien que la viabilité des protoplastes soit augmentée d'un facteur 2. Ceci est illustré sur la figure 9.

Infection de protoplastes de betteraves issus de cellules transformées et non transformées
Afin de determiner si la protéine capsidaire du
BNYVV et la proteine dérivée produite dans les cellules de betterave pouvait inhiber la multiplication du virus, les inventeurs ont inocule des protoplastes issus de cellules exprimant ou n'exprimant pas ces protéines par le virus. Les expériences ont été réalisées par les techniques au
PEG et par l'electroporation. L'infection a été visualisée par immunofluorescence des cellules 30 heures après culture. Il n'a pas été décele de bruit de fond en immunofluorescence dans les cellules transformees et exprimant la protéine capsidaire avant inoculation.

TABLEAU 2 : infection par le BNYVV de protoplastes issus de cellules transformees et non transformees.

Source protoplastes
Non Transformé Protection
transforme CP+ CP (%)
Expérience Pll ss ,814
1 30 1 97
2 68 10 85
3 70 4 94
4 27 1 96
5 35 5 86
6 25 2 92
7 37 10 36 73
8 12 48 75
1 x 106 protoplastes ont été inoculés avec 5 g de BNYW (F13 ou S2) sauf pour l'expérience 4 où l'inoculum consistait de 30 pg de BNYVV les chiffres representent le pourcentage de protoplastes fluorescents détectes 30 h après l'inoculation. CP+ et CP- sont des lignées cellulaires transformees exprimant et n'exprimant pas la protéine capsidaire du BNYVV.

Le tableau 2 résume les resultats obtenus avec deux lignées cellulaires (ss7 et p14) exprimant fortement deux protéines, et la lignee cellulaire transformée (ssD) et la lignée cellulaire non transformée WT. Dans tous les cas, le pourcentage de protoplastes infectés isolés de cellules transformées ss7 et p14 est significativement plus faible que celui des protoplastes de cellules non transformées. Les expériences 7 et 8 prouvent bien que la protection est bien due à la présence des protéines 22 Kd et 29
Kd, car le taux d'infection de protoplastes issus des cellules de la lignée ssD est comparable à celle des cellules non transformées.Donc le processus de transformation en lui-même ne confère pas de protection à l'infection par le virus. L'expression de proteines étrangères, autres que celles du BNYW ne confère pas non plus la protection à l'infection par ce même virus. La protection n'est pas abolie lorsque l'on augmente la concentration du virus présente dans l'inoculum. Les profils densitométriques (figure 10) des RNA totaux (isoles de protoplastes p14 et WT infectés) et hybridés avec une sonde cDNA total contre les 4 RNA de BNYW montrent que ceux-là ne se repliquent pas dans les protoplastes exprimant la proteine capsidaire du virus.

La protection a aussi été observee lorsque l'inoculation a été effectuée par électroporation indiquant que la protection est indépendante de la méthode utilisée pour l'inoculation.

Ces résultats démontrent pour la première fois que des protoplastes de betterave exprimant la protéine capsidaire virale du BNYVV et la protéine chimérique dérivée sont protégés contre l'infection par ce même virus.

EXEMPLE 14 : REGENERATION DE PLANTES A PARTIR DE
CALS TRANFORMES
Après un premier passage d'un mois sur M.SBl + C ou MSBl + CK, les cals tranformés sont repiqués tous les mois sur MSB1. Après des délais plus ou moins longs, variant d'une semaine à plusieurs mois, des bourgeons et/ou embryons régénèrent sur certains de ces cals.

Il a été observé qu'après transformation les cals ont le même phenotype que la suspens ion de depart.

C'est-à-dire que le type noduleux ou habitué se retrouve après la transformation. En outre, il semble que ce soit les cals tranformés de type noduleux qui aient la plus grande aptitude à la régénération. Ils permettent la régénération de plusieurs structures se développant assez bien et vite en plante, alors que les structures obtenues sur les cals habitués transformés sont très rares, longues et très difficiles à se développer en plante.

Les structures régénérées sont très hétérogènes morphologiquement. Elles sont repiquées, après avoir été coupées à la base au scalpel, sur le milieu MSB0.1 en boîtes de Petri.

Quand les bourgeons commencent à développer plusieurs feuilles, ils sont remis en multiplication végétative en pots ou boites. Les bourgeons les plus développés sont alors mis en enracinement sur MS + ANA 1 mg/l(ANA . acide naphtalene-acetic). Les racines apparaissent de 2 à 6 semaines après.

Dès que les racines sont suffisamment développées, les plantes sont acclimatées en serre dans du terreau universel. Au bout de 3 mois, les plantes sont bien developpees (voir photo) et ont perdu la plupart des variations phénotypiques dues à la culture in vitro.

EXEMPLE 15 : EXPRESSION DE LA PROTEINE DE CAPSIDE ET
DE LA PROTEINE CHIMERIQUE DERIVEE DANS LES BETTERAVES
TRANSGENIQUES
Bien que sachant les betteraves transgéniques, grâce aux tests de détection du gène codant pour la p- glucuronidase, il n'etait pas certain que le gène intéressant, à savoir celui codant pour les protéines de capside du BNYVV, était bien exprimé dans ces plantes.

Pour le savoir, il faut detecter ces protéines dans les tissus de betterave transformées. Pour détecter les protéines dans les transformants, il a été fait appel à la technique de Western blot (Ausubel et al, 1987).

Celle-ci consiste à faire migrer les protéines solubles extraites de broyat de tissus des transformants, sur gel de polyacrylamide en conditions dénaturantes (Laemmli, 1970). Les protéines ainsi separées sont tranférees par electrotransfert sur une membrane de nitrocellulose.

Cette membrane est ensuite hybridée avec des anticorps polyclonaux de lapins dirigés contre le BNYVV. La révélation se fait par addition d'anticorps anti-lapin conjugés à la phosphatase alcaline, qui utilise des substrats chromogènes. La figure 2 montre le type de resultats obtenus. Les extraits de betterave transgéniques contenant le gène codant pour les protéines de capside montrent une bande immunoreactive migrant au même niveau que la proteine de capside du virus. Cette bande n'est pas presente dans les extraits de plante non transformees.De plus, dans les extraits de plantes transformees, on detecte une bande à 29 Kd correspondant à la protéine chimerique dérivée de la 22 Kd par addition de 64 acides aminés, due au "readthrough" (exemple 5).

Ces deux protéines de 22 et 29 Kd n'ont pu être detectees que dans des extraits de racines de transformants et pas dans les feuilles.

Le BNYVV se transmet et se développe au niveau des racines, il est donc avantageux que les protéines susceptibles d'inhiber le virus soient présentes dans ces organes.

EXEMPLE 16 : OBTENTION DE GRAINES DE BETTERAVES
TRANSGENIQUES
Après 2 à 3 mois d'acclimatation en serre des plantes transgéniques, il a été constaté qu'elles étaient phénotypiquement conformes à la plante mère. A ce stade les plantes possèdent de 10 à 15 feuilles très bien développées, et sont toujours à l'état de rosette. Pour savoir si les plantes obtenues sont tout à fait normales et notamment fertiles, et si le gène introduit est transmis à la descendance, les plantes ont été vernalisées pour induire la montée à graine. Les transformants primaires sont donc placés entre 2 et 7"C à l'obscurité pendant 3 mois, puis en champs en période de jour long. Un mois à un mois et demi après la mise en champ, la hampe florale commence à monter.

La floraison a lieu trois mois environ après la sortie de vernalisation, et les fruits sont mûrs deux mois après.

Quand les glomérules sont bien secs, ils sont récoltés et nettoyés. Les graines sont ainsi prêtes à être semées.

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Claims (32)

REVENDICATIONS

1. Séquence nucleotidique apte à conferer la résistance à l'infection par le virus des nervures jaunes et nécrotiques de la betterave à sucre (BNYW) à des cellules exprimant ladite séquence, comprenant un fragment d'acide nucléique dérive de l'extrémité 5' de 1 'ARN2 génomique ou subgênomique du BNYW, ce fragment codant pour au moins une partie des protéines codées par les nucléotides 145 à 3285 de la séquence sauvage de 1'ARN2, ledit fragment étant sous le contrôle d'un promoteur permettant l'expression du fragment dans des cellules vegetales et étant dans l'orientation sens ou antisens.

2. Séquence nucléotidique selon la revendication 1 comprenant un fragment de l'extrémité 5' de 1'ARN2 génomique du BNYW ou du cDNA correspondant, ledit fragment codant pour au moins une partie de la protéine codée par les nucléotides 145 à 2218 de 1'ARN2 ou pour une variante de cette proteine comportant l'insertion, la substitution ou la délétion d'acide(s) aminé(s).

3. Séquence nucléotidique selon la revendication 2 dans laquelle ledit fragment code pour la proteine codée par les nucléotides 145 à 708 et, en outre, pour une partie de la proteine codée par les nucléotides 709 à 2218 du

ARN2 du BNYW.

4. Séquence nucléotidique selon la revendication 3 dans laquelle ledit fragment code pour la proteine codée par les nucléotides 145 à 871 de 1'ARN2 du BNYW.

5. Séquence nucleotidique selon la revendication 4 dans laquelle ledit fragment est compose par les nucléotides 91 à 871 de 1'ARN2 du BNYVV.

6. Séquence nucléotidique selon la revendication 2 dans laquelle ledit fragment code pour au moins une partie d'une variante de la protéine codee par les nucléotides 145 à 2218, ladite variante se distinguant de la séquence sauvage par la presence de la sequence Glu Asp Leu Pro qui remplace les acides aminés His ALa codés par les nucléotides 253 à 258 de la séquence sauvage.

7. Séquence nucléotidique selon la revendication 6 dans laquelle ledit fragment code pour une partie de la variante et est composé par les nucléotides 91 à 871 de la séquence sauvage, les nucléotides 253 à 258 de la séquence sauvage étant remplacés par ceux codant pour Glu

Asp Leu Pro.

8. Séquence nucléotidique selon la revendication 6 dans laquelle ledit fragment code pour une partie de la variante, ladite partie correspondant à celle codee par les nucléotides 145 à 255 dans la séquence sauvage, les nucléotides 253 à 255 de la séquence sauvage étant remplacés par ceux codant pour Glu.

9. Séquence nucléotidique selon la revendication 6 dans laquelle ledit fragment code pour une partie de la variante, ladite partie correspondant à celle codée par les nucléotides 256 à 871 dans la séquence sauvage, les nucléotides 256 à 258 de la séquence sauvage étant remplacés par ceux codant pour Asp Leu Pro.

10. Séquence nucléotidique selon la revendication 2 dans laquelle ledit fragment code pour au moins une partie d'une variante de la protéine codée par les nucléotides 145 à 2218, ladite variante se distinguant de la séquence sauvage par la présence de la séquence Arg Ser Ser Gly au lieu des acides aminés codés par les nucléotides 637 à 651 de la séquence sauvage, la séquence Arg Ser Ser Gly formant le carboxy-terminal de la protéine.

11. Séquence nucléotidique selon la revendication 10 dans laquelle ledit fragment code pour une partie de la variante et est composé par les nucléotides 91 à 871 de la séquence sauvage, les nucléotides 637 à 654 de la séquence sauvage étant remplacés par ceux codant pour Arg

Ser Ser Gly stop.

12. Séquence nucléotidique selon la revendication 11 dans laquelle ledit fragment code pour une partie de la variante, ladite partie correspondant à celle codée par les nucléotides 144 à 640 de la séquence sauvage.

13. Séquence nucléotidique selon la revendication 11 dans laquelle ledit fragment code pour une partie de la variante et est composé par les nucléotides 641 à 871 de la séquence sauvage, les nucléotides 641 et 642 de la séquence sauvage étant remplacés par GA et les nucléotides 643 à 654 étant remplaces par ceux codant pour Ser Ser Gly Stop.

14. Séquence nucléotidique selon la revendication 1 comprenant un fragment de l'extrémité 5' du ARN2 subgenomique du BNYW, ou du cADN correspondant, ledit fragment codant pour au moins une partie de la protéine codée par les nucléotides 2133 à 3285 du ARN2, ou pour une variante de cette protéine comportant l'insertion, la substitution ou la déletion d'acide(s) aminé(s).

15. Séquence nucléotidique selon la revendication 14 dans laquelle ledit fragment code pour la protéine codée par les nucléotides 2133 à 2774 de 1'ARN2 du BNYVV.

16. Séquence nucléotidique selon la revendication 15 dans laquelle ledit fragment est composé par les nucléotides 2078 à 2774 de 1'ARN2 du BNYW.

17. Fragment d'acide nucléique consistant en les nucléotides 91 à 871 de 1'ARN2 du BNYW ou de la séquence cADN correspondante, dans lequel les nucléotides 253 à 258 sont éventuellement remplaces par GAA GAT CTT CCT, ou dans lequel les nucléotides GA AGA TCT TCG GGA TAA, ont été insérés à la position 638 immediatement après le C en position 637, ou encore les fragments BglII de ces séquences.

18. Fragment d'acide nucleique consistant en les nucléotides 2078 à 2774 du subgénomique de 1'ARN2 du

BNYVV.

19. Protéines codées par les sequences nucléotidiques ou les fragments d'acide nucleique selon les revendications 2 et 18 et conférant la résistance à la rhizomanie à une cellule exprimant ladite protéine.

20. Protéine selon la revendication 19 ayant un poids moléculaire de 29 Kd et résultant de l'expression du fragment d'acide nucléique consistant en les nucléotides 91 à 871 de 1'ARN2 du BNYW ou de la séquence cADN correspondante, et les 11 acides aminés codés par la sequence du terminateur de la nopaline synthase.

21. Vecteur d'expression contenant la sequence selon l'une quelconque des revendications 1 à 16 ou le fragment d'acide nucléique selon la revendication 17 ou 18.

22. Vecteur d'expression selon la revendication 21 dans lequel la sequence est sous le contrôle du promoteur 35S ou Nos.

23. Vecteur d'expression selon la revendication 21 ou 22 qui est un vecteur binaire contenant en outre des séquences du T-DNA d'un plasmide Ti et, éventuellement, un gène reporteur et un gène de sélection.

24. Vecteur d'expression selon la revendication 23 qui est le pGA-p -3-1B illustré dans la figure 6.

25. Cellule de plante appartenant à l'espèce Beta vulqaris et résistante à la rhizomanie, ladite cellule étant transformée d'une manière stable par la sequence d'acide nucléique selon l'une quelconque des revendications 1 à 16 ou par le fragment d'acide nucléique selon la revendication 17 ou 18, dans des conditions permettant l'expression de ladite séquence ou dudit fragment pendant au moins une partie de la vie de la cellule.

26. Cellule selon la revendication 25 exprimant à la fois la proteine de capside de 22 Kd et la proteine de 29 Kd selon la revendication 20.

27. Plante transgénique appartenant à l'espèce Beta vulqaris et résistante à la rhizomanie, ladite plante transgénique étant transformée d'une manière stable par la séquence d'acide nucleique selon l'une quelconque des revendications 1 à 16, ou par le fragment d'acide nucleique selon la revendication 17 ou 18 dans des conditions permettant l'expression de ladite sequence ou dudit fragment pendant au moins une partie de la vie de la plante, dans au moins une partie des tissus de la plante.

28. Plante transgénique selon la revendication 26, ladite plante exprimant ladite séquence ou ledit fragment uniquement dans les racines.

29. Graines de plantes transgéniques selon la revendication 27 ou 28.

30. Sonde nucléique consistant en le fragment d'acide nucléique selon la revendication 17, éventuellement associé avec un moyen permettant sa détection.

31. Protoplaste dérive d'une cellule de plante appartenant à l'espèce Beta vulqaris selon la revendication 25.

32. Bourgeon ou embryon appartenant à l'espèce Beta vulqaris et resistante à la rhizomanie, ledit bourgeon ou embryon étant transformé d'une manière stable par la séquence d'acide nucléique selon l'une quelconque des revendications 1 à 16 ou par le fragment d'acide nucléique selon la revendication 17 ou 18, dans des conditions permettant l'expression de ladite séquence ou dudit fragment dans le bourgeon ou l'embryon.