EP0998575A1 - Gene chimere codant pour la drosomicine, vecteur le contenant et obtention des plantes transgeniques resistantes aux maladies - Google Patents
Gene chimere codant pour la drosomicine, vecteur le contenant et obtention des plantes transgeniques resistantes aux maladiesInfo
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- EP0998575A1 EP0998575A1 EP98936469A EP98936469A EP0998575A1 EP 0998575 A1 EP0998575 A1 EP 0998575A1 EP 98936469 A EP98936469 A EP 98936469A EP 98936469 A EP98936469 A EP 98936469A EP 0998575 A1 EP0998575 A1 EP 0998575A1
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Definitions
- the subject of the invention is therefore firstly a chimeric gene comprising a nucleic acid fragment coding for a drosomicin as well as heterologous 5 'and 3' regulatory elements capable of functioning in plants and a vector for the transformation of plants containing this chimeric gene. It also comprises a transformed plant cell containing at least one nucleic acid fragment coding for drosomicin and a plant resistant to diseases containing the said cell. Finally, it relates to a process for transforming plants to make them resistant to diseases in which a gene coding for drosomicin is inserted.
- drosomycin of "full length” (total length) as represented by the sequence identifier No. 2 (SEQ ID No. 2).
- the DNA sequence encoding drosomycin comprises the DNA sequence described by bases 21-152 of sequence identifier No. 3 (SEQ ID NO 3), a sequence homologous or complementary to said sequence.
- any corresponding sequence of bacterial origin such as for example the terminator nos of Agrobacterhim tumefaciens, can be used. or of plant origin, such as for example a histone terminator as described in application EP 0 633 317.
- Another series of methods consists in using as a means of transfer into the plant a chimeric gene inserted into a Ti plasmid of Agrobacterhim tumefaciens or Ri of Agrobacterium rhi ⁇ ogenes.
- Oligo 3 5 'GCGCGCGGAT CCTTAGCATC CTTCGCACCA GCACTTCAGA
- This plasmid contains the CaMV 35S promoter which directs the expression of an RNA containing the 5 ′ untranslated sequence of the alfalfa mosaic virus (AMV 5 ′ UTR; Brederode & coll ., 1980), the N-terminal region of the ubql ubql l gene from Arabidopsis thaliana to the ubqit 1 hydrolase cleavage site (ubql 1 N-term; Callis & coll., 1993) which is fused in the same reading frame with the gene for the ⁇ -glucuronidase from E. coli (GUS; Jefferson & coll., 1987). monitoring of the polyadenylation site of the nopaline synthase gene from Agrobaaerium tumefaciens (NOS
- LB have the same meaning as in FIG. 6.
- pRPA-RD-192 Creation of an Agrobacterium tumefaciens vector containing the construction of the gene coding for drosomicin directed towards the cytosol of the cells.
- the DNA fragment containing the drosomicin expression cassette is purified.
- the purified DNA fragment containing the drosomicin expression cassette is linked in pRPA-RD-184, after prior digestion with the same two enzymes.
- An Agrobacterium tumefaciens vector is thus obtained containing the sequence coding for the fusion protein drosomicin-ubiquitin which leads to the expression of drosomicin in the cytosol of plant cells.
- pRPA-RD-193 Creation of an Agrobacterium tumefaciens vector containing the construction of the gene coding for drosomicin directed towards the extracellular matrix.
- Example 2 Tolerance to herbicides in processed tobacco.
- the regeneration of PBD6 tobacco (from SEITA France) from leaf explants is carried out on a Murashige and Skoog (MS) base medium comprising 30 g / l of sucrose as well as 200 ⁇ g / ml of kanamycin.
- the leaf explants are taken from plants cultivated in a greenhouse or in vitro and transformed according to the technique of leaf discs (Horsh & coll., 1985) in three successive stages: the first comprises the induction of shoots on a medium supplemented with 30 g / 1 sucrose containing 0.05 mg / 1 naphthylacetic acid (ANA) and 2 mg / 1 benzylaminopurine (BAP) for 15 days.
- ANA naphthylacetic acid
- BAP benzylaminopurine
- the leaf proteins are first extracted by grinding frozen tissue at -180 ° C. followed by the addition of an extraction buffer (8 M urea, tris HCl pH 6.8 50 raM. 2% SDS. 5% ⁇ -mercaptoethanol. 10% sucrose. 2 mM EDTA and 10 mM dithiothreitol). The total amount of extractable protein is then measured. 100 ⁇ g of extracted proteins are then loaded into SDS-PAGE gel wells (20% acryiamide) for an immunoblot analysis (according to Coligan & coll.).
- Example 4 Resistance to Botrytis cinerea in processed tobacco.
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Abstract
La présente invention a pour objet un gène chimère contenant une séquence d'ADN codant pour la drosomicine, un vecteur contenant le gène chimère, un procédé pour la transformation des plantes et les plantes transformées. La drosomicine produite par les plantes tranformées leur confère une résistance aux maladies, en particulier d'origine fongique.
Description
GENE CHIMERE CODANT POUR LA DROSOMICINE , VECTEUR LE CONTENANT ET OBTENTION DES PLANTES TRANSGENIQUES RESISTANTES AUX MALAD IES
5 La présente invention a pour objet une séquence d'ADN codant pour la drosomicine, un gène chimère la contenant, un vecteur contenant le gène chimère et un procédé pour la transformation des plantes et les plantes transformées résistantes aux maladies.
Il existe aujourd'hui un besoin grandissant de rendre les plantes résistantes 0 contre les maladies notamment fongiques afin de diminuer, voire d'éviter, d'avoir recours à des traitements avec des produits de protection antifongiques, en vue de protéger l'environnement. Un moyen d'augmenter cette résistance aux maladies consiste à transformer les plantes de manière qu'elles produisent des substances à même d'assurer leur défense contre ces maladies. 5 On connaît différentes substances d'origine naturelle, en particulier des peptides. présentant des propriétés bactéricides ou fongicides, notamment contre les champignons responsables des maladies des plantes. Toutefois, le problème consiste à trouver de telles substances qui pourront non seulement être produites par des plantes transformées, mais encore conserver leurs propriétés bactéricides ou fongicides et les 0 conférer aux dites plantes. Au sens de la présente invention, on entend par bactéricide ou fongicide tant les propriétés bactéricides ou fongicides proprement dites que les propriétés bactériostatiques ou fongistatiques.
Les drosomicines sont des peptides produits par les larves et adultes de drosophiles par induction à la suite d'une blessure septique ou de l'injection d'une 5 faible dose de bactéries. Un peptide a déjà été décrit comme présentant certaines propriétés antifongiques et antibactériennes in vitro, notamment dans la demande de brevet français 2 725 992, où le peptide est obtenu par induction sur les drosophiles et purification. Le gène codant pour ce même peptide a également été décrit par Fehlbaum & coll. (1994). La possibilité d'intégrer ce gène à une plante pour lui 0 conférer une résistance aux maladies d'origine fongique ou bactérienne n'a toutefois pas été décrite à ce jour.
On a maintenant trouvé que les gènes des drosomicines pouvaient être insérés dans les plantes pour leur conférer des propriétés de résistance aux maladies fongiques
et aux maladies d'origine bactérienne, apportant une solution particulièrement avantageuse au problème énoncé ci-dessus.
L'invention a donc d'abord pour objet un gène chimère comprenant un fragment d'acide nucléique codant pour une drosomicine ainsi que des éléments de régulation en position 5' et 3' hétérologues pouvant fonctionner dans les plantes et un vecteur pour la transformation des plantes contenant ce gène chimère. Elle comprend aussi une cellule végétale transformée contenant au moins un fragment d'acide nucléique codant pour la drosomicine et une plante résistante aux maladies contenant la dite cellule. Elle concerne enfin un procédé de transformation des plantes pour les rendre résistantes aux maladies dans lequel on insère un gène codant pour la drosomicine.
Par drosomicine, on entend selon l'invention tout peptide pouvant être isolé des larves et adultes de drosophiles par induction à la suite d'une blessure septique ou de l'injection d'une faible dose de bactéries, ces peptides comprenant au moins 44 acides aminés et 8 résidus cystéine formant entre eux des ponts disulfure.
De manière avantageuse, la drosomicine comprend essentiellement la séquence peptidique de formule (I) ci-dessous :
Xaa-Cys-Xab-Cys-Xac-Cys-Xad-Cys-Xae-Cys-Xaf-Cys-Xag-Cys-Xah-Cys
(I) dans laquelle
Xaa représente un reste peptidique comprenant au moins 1 acide aminé.
Xab représente un reste peptidique de 8 acides aminés.
Xac représente un reste peptidique de 7 acides aminés,
Xad représente unreste peptidique de 3 acides aminés, Xae représente un reste peptidique de 9 acides aminés,
Xaf représente un reste peptidique de 5 acides aminés,
Xag représente unreste peptidique d'un acide aminé, et
Xah représente un reste peptidique de 2 acides aminés.
De manière avantageuse, Xab et/ou Xad et/ou Xac comprenent au moins un acide aminé basique. Plus avantageusement. Xab comprend au moins 2 acides aminés basiques, de préférence 2 et/ou Xad et/ou Xaf comprenent au moins 1 acide aminé basique, de préférence 1. Par acide aminé basique, on enbtend selon l'invention les acides aminés choisis parmi la lysine, l'arginine ou l'homoarginine.
De manière préférentielle.
Xaa représente la séquence peptidique Xaa'-Asp- dans laquelle Xaa' représente NH2 ou un reste peptidique comprenant au moins 1 acide aminé, rt/ou
Xab représente la séquence peptidique -Leu-Xab'-Pro- dans laquelle Xab' représente un reste peptidique de 6 acides aminés, et/ou
Xac représente la séquence peptidique -Ala-Xac'-Thr- dans laquelle Xac' représente un reste peptidique de5 acides aminés, et/ou
Xad représente la séquence peptidique -Arg-Xad'-Val, dans laquelle Xad' représente un reste peptidique d'un acide aminé, et/ou Xae représente la séquence peptidique -Lys-Xae'-His- dans laquelle Xae' représente un reste peptidique de 7 acides aminés, et/ou
Xaf représente la séquence peptidique -Ser-Xaf-Lys- dans laquelle Xaf représente un reste peptidique de 3 acides aminés, et/ou
Xag représente Trp. et/ou Xah représente le reste peptidique Glu-Gly. De manière plus préférentielle,
Xab' représente la séquence peptidique Ser-Gly-Arg-Tyr-Lys-Gly, et/ou
Xac' représente la séquence peptidique Val-Trp-Asp-Asn-Glu, et/ou
Xad' représente Arg, et/ou Xae' représente la séquence peptidique Glu-Glu-Gly-Arg-Ser-Ser-Gly, et/ou
Xaf représente la séquence peptidique Pro-Ser-Leu.
Selon un mode plus préférentiel de réalisation de l'invention, la drosomicine est la séquence peptidique représentée par l'identificateur de séquence n° 4 (SEQ ID
No 4) et les séquences peptidiques homologues. Par séquence peptidiques homologues, on entend toute séquence équivalente comprenant au moins 65 % d'homologie avec la séquence représentée par l'identificateur de séquence n° 4, étant entendu que les 8 résidus cystéine et le nombre d'acides aminés les séparant restent identiques certains acides aminés étant remplacés par des acides aminés différents mais équivalents sur des sites n'induisant pas de modification substantielle de l'activité antifongique ou antibactérienne de la dite séquence homologue. De préférence, les séquences homologues comprennent au moins 75 % d'homologie, plus préférentiellement au moins 85 % d'homologie. encore plus préférentiellement 90 % d'homologie.
Le résidu NH2 terminal peut présenter une modification post-traductionnelle. par exemple une acétylation, de même que le résidu C-terminal peut présenter une modification post-traductionnelle, par exemple une amidation.
Par séquence peptidique comprenant essentiellement la séquence peptidique de formule générale (I), on entend non seulement les séquences définies ci-dessus, mais également de telles séquences comprenant à l'une ou l'autre de leurs extrémités, ou les deux, des résidus peptidiques, notamment nécessaires à leur expression et ciblage dans les cellules végétales ou dans les plantes.
Il s'agit notamment de la drosomicine « full length » (longueur totale) représentée par l'identificateur de séquence n°2 (SEQ ID No 2).
Il s'agit en particulier d'un peptide de fusion « peptide-drosomicine » ou « drosomicine-peptide », avantageusement « peptide-drosomicine ». dont la coupure par les systèmes enzymatiques des cellules végétales permet la libération de la drosomicine. définie ci-dessus. Le peptide fusionné à la drosomicine peut être un peptide signal ou un peptide de transit qui permet de contrôler et d'orienter la production de la drosomicine de manière spécifique dans une partie de la cellule végétale ou de la plante, comme par exemple le cytoplasme, la membrane cellulaire, ou dans le cas des plantes dans un type particulier de compartiments cellulaires ou de tissus ou dans la matrice extracellulaire.
Selon un mode de réalisation, le peptide de transit peut être un signal d'adressage chloroplastique ou mitochondrial. lequel est ensuite clivé dans les chloroplastes ou les mitochondries.
Selon un autre mode de réalisation de l'invention, le peptide signal peut être un signal N-terminal ou « prépeptide », éventuellement en association avec un signal responsable de la rétention de la protéine dans le réticulum endoplasmique, ou un peptide d'adressage vacuolaire ou « propeptide ». Le réticulum endoplasmique est le lieu où sont pris en charge par la « machinerie cellulaire » des opérations de maturation de la protéine produite, comme par exemple le clivage du peptide signal.
Les peptides de transit peuvent être soit simples, soit doubles, et dans ce cas éventuellement séparés par une séquence intermédiaire, c'est à dire comprenant, dans le sens de la transcription, une séquence codant pour un peptide de transit d'un gène végétal codant pour une enzyme à localisation plastidiale, une partie de séquence de la partie mature N-terminale d'un gène végétal codant pour une enzyme à localisation plastidiale. puis une séquence codant pour un second peptide de transit d'un gène végétal codant pour
une enzyme à localisation plastidiale, tels que décrit dans la demande EP 0 508 909
Comme peptide de transit utile selon l'invention, on peut citer en particulier le peptide signal du gène PR-lα du tabac (WO 95/19443), ou encore l'ubiquitine représentée fusionnée à la drosomicine par l'identificateur de séquence n° 6. Le peptide de fusion « ubiquitine-drosomicine » et sa séquence codante sont également partie de la présente invention, en particulier décrits par l'identificateur de séquence n° 5.
La présente invention concerne donc un gène chimère comprenant une séquence codante pour la drosomicine ainsi que des éléments de régulation en position 5' et 3' hétérologues pouvant fonctionner dans les plantes, la séquence codante comprenant au moins une séquence d'ADN codant pour la drosomicine telle que définie ci-dessus.
La séquence d'ADN peut être obtenue selon les méthodes standards d'isolation et de purification à partir des drosophiles. ou encore par synthèse selon les techniques usuelles d'hybridations successives d'oligonucléotides synthétiques. Ces techniques sont notamment décrites par Ausubel ei al.
Selon un mode de réalisation de l'invention, la séquence d'ADN codant pour la drosomicine comprend la séquence d'ADN décrite par les bases 21 à 152 de l'identificateur de séquence n° 3 (SEQ ID NO 3), une séquence homologue ou complémentaire de ladite séquence.
Selon un autre mode de réalisation de l'invention, la séquence d'ADN codant pour la drosomicine « full length » comprend la séquence d'ADN décrite par les bases 101 à 310 de l'identificateur de séquence n° 1 (SEQ ID No 1 ), une séquence homologue ou complémentaire de ladite séquence. Selon un autre mode de réalisation de l'invention, la séquence d'ADN codant pour le peptide de fusion « peptide-héliomicine » comprend la séquence d'ADN décrite par les bases 15 à 221 de l'identificateur de séquence n°5 (SEQ ID NO 5), une séquence homologue ou une séquence complémentaire des dites séquences.
Par « homologue ». on entend selon l'invention toute séquence d'ADN présentant une ou plusieurs modifications de séquence par rapport à la séquence nucléotidique décrite par les identificateurs de séquences n° 1, 3 ou 5 et codant pour la drosomicine. la drosomicine « full length » ou le peptide de fusion « peptide-drosomicine ». Ces modifications peuvent être obtenues selon les techniques usuelles de mutation, ou encore
en choisissant les oligonucléotides synthétiques employés dans la préparation de ladite séquence par hybridation. Au regard des multiples combinaisons d'acides nucléiques pouvant conduire à l'expression d'un même acide aminé, les différences entre la séquence de référence décrite par les identificateurs de séquences n° 1. 3 ou 5 et l'homologue correspondant peuvent être importantes, d'autant plus qu'il s'agit de fragments d'ADN de faible taille réalisables par synthèse chimique. De manière avantageuse, le degré d'homologie sera d'au moins 70 % par rapport à la séquence de référence, de préférence d'au moins 80 %, plus préférentiellement d'au moins 90 %. Ces modifications sont généralement neutres, c'est à dire qu'elles n'affectent pas la séquence primaire de la drosomicine ou du peptide de fusion résultants.
Par "cellule végétale", on entend selon l'invention toute cellule issue d'une plante et pouvant constituer des tissus indifférenciés tels que des cals, des tissus différenciés tels que des embryons, des parties de plantes, des plantes ou des semences.
On entend par "plante" selon l'invention, tout organisme multicellulaire différencié capable de photosynthèse, en particulier monocotvlédones ou dicotylédones, plus particulièrement des plantes de culture destinées ou non à l'alimentation animale ou humaine, comme le maïs, le blé. le colza, le soja, le riz. la canne à sucre, la betterave, le tabac, le coton, etc.
Les éléments de régulation nécessaires à l'expression de la séquence d'ADN codant pour la drosomicine sont bien connus de l'homme du métier en fonction de la plante. Ils comprennent notamment des séquences promotrices, des activateurs de transcription, des séquences terminatrices, y compris des codons start et stop. Les moyens et méthodes pour identifier et sélectionner les éléments de régulation sont bien connus de l'homme du métier.Comme séquence de régulation promotrice dans les plantes, on peut utiliser toute séquence promotrice d'un gène s'exprimant naturellement dans les plantes en particulier un promoteur d'origine bactérienne, virale ou végétale tel que. par exemple, celui d'un gène de la petite sous-unité de ribulose-biscarboxylase/oxygénase (RuBisCO) ou d'un gène de virus de plante tel que, par exemple, celui de la mosaïque du choux fleur (CAMV 19S ou 35S), ou un promoteur inductible par les pathogènes comme le PR-la du tabac, tout promoteur convenable connu pouvant être utilisé. De préférence on a recours à une séquence de régulation promotrice qui favorise la surexpression de la séquence codante de manière constitutive ou induite par l'attaque d'un pathogène, tel que par exemple, celle comprenant au moins un promoteur d'histone tel que décrit dans la
demande EP 0 507 698.
Selon l'invention, on peut également utiliser, en association avec la séquence de régulation promotrice, d'autres séquences de régulation, qui sont situées entre le promoteur et la séquence codante, telles que des activateurs de transcription ("enhancer"). comme par exemple l'activateur de translation du virus de la mosaïque du tabac (TMV) décrit dans la demande WO 87/07644, ou du virus etch du tabac (TEV) décrit par Carrington & Freed.
Comme séquence de régulation terminatrice ou de polyadénylation, on peut utiliser toute séquence correspondante d'origine bactérienne, comme par exemple le terminateur nos d'Agrobacterhim tumefaciens. ou encore d'origine végétale, comme par exemple un terminateur d'histone tel que décrit dans la demande EP 0 633 317.
La présente invention concerne également un vecteur d'intégration pour la transformation des plantes contenant au moins un gène chimère tel que défini ci- dessus.
L'invention a encore pour objet un procédé de transformation des cellules végétales par intégration d'au moins un gène chimère tel que défini ci-dessus. transformation qui peut être obtenue par tout moyen connu approprié, amplement décrit dans la littérature spécialisée et notamment les demandes citées dans la présente demande.
Une série de méthodes consiste à bombarder des cellules ou des protoplastes avec des particules auxquelles sont accrochées les séquences d'ADN.
Une autre série de méthodes consiste à utiliser comme moyen de transfert dans la plante un gène chimère inséré dans un plasmide Ti d'Agrobacterhim tumefaciens ou Ri d'Agrobacterium rhi∑ogenes.
D'autres méthodes peuvent être utilisées telles que la micro-injection ou l'électroporation.
L'homme du métier fera le choix de la méthode appropriée en fonction de la nature de la plante, notamment de son caractère monocotylédone ou dicotylédone.
Pour les procédés de transformation des cellules végétales et de régénération des plantes, on citera notamment les brevets et demandes de brevet suivants: US 4.459,355, US 4.536.475, US 5,464,763. US 5.177,010. US 5,187,073, EP 267,159. EP 604 662, EP 672 752. US 4.945,050, US 5.036.006, US 5.100,792. US 5,371,014. US 5.478,744, US 5,179,022. US 5,565.346, US 5,484.956. US 5.508.468, US 5,538,877, US 5.554.798, US 5,489.520. US 5.510,318. US 5.204,253, US 5.405.765. EP 442 174. EP 486 233, EP 486
234. EP 539 563. EP 674 725, WO 91/02071 et WO 95/06128.
La présente invention a encore pour objet les cellules végétales, de plantes monocotvlédones ou dicotylédones, notamment de cultures, transformées et contenant dans leur génome une quantité efficace d'un gène comprenant une séquence codante pour la drosomicine définie ci-dessus.
La présente invention a encore pour objet les plantes contenant des cellules transformées, en particulier les plantes régénérées à partir des cellules transformées. La régénération est obtenue par tout procédé approprié qui dépende de la nature de l'espèce, comme par exemple décrit dans les brevets et demandes ci-dessus. La présente invention a également pour objet les plantes transformées issues de la culture et/ou du croisement des plantes régénérées ci-dessus, ainsi que les graines des plantes transformées.
Les plantes ainsi transformées sont résistantes à certaines maladies, en particulier à certaines maladies fongiques. De ce fait, la séquence d'ADN codant pour la drosomicine peut être intégré avec pour objectif principal la réalisation de plantes résistantes aux dites maladies, la drosomicine étant efficace contre des maladies fongiques telles que celles causées par Botrytis, en particulier Botrytis cinerea (mycélium ou spores), Cercospora, en particulier Cercospora beticola. Seploria, en particulier Septoria tritici, ou Fitsarium, en particulier Fusarium citlmorum (mycélium ou spores) ou Fusarium graminearum.
Le gène chimère pourra comprendre également et de manière avantageuse au moins un marqueur de sélection, tel qu'un ou plusieurs gènes de tolérance aux herbicides.
La séquence d'ADN codant pour la drosomicine peut également être intégrée comme marqueur de sélection lors de la transformation de plantes avec d'autres séquences codant pour d'autres peptides ou protéines d'intérêt, comme par exemple des gènes de tolérance aux herbicides.
De tels gènes de tolérance aux herbicides sont bien connus de l'homme du métier et notamment décrits dans les demandes de brevet EP 115 673, WO 87/04181. EP 337 899. WO 96/38567 ou WO 97/04103. Bien entendu, les cellules et plantes transformées selon l'invention peuvent comprendre outre la séquence codant pour la drosomicine, d'autres séquences hétérologues codant pour des protéines d'intérêt comme d'autres peptides complémentaires susceptibles de conférer à la plante des résistances à d'autres maladies d'origine bactérienne ou
fongique, et/ou d'autres séquences codant pour des protéines de tolérance aux herbicides et/ou d'autres séquences codant pour des protéines de résistance aux insectes, comme les protéines Bt notamment.
Les autres séquences peuvent être intégrées au moyen du même vecteur comprenant un gène chimère, lequel comprend une première séquence codant pour la drosomicine et au moins une autre séquence codant pour un autre peptide ou protéine d'intérêt.
Elles peuvent également être intégrées au moyen d'un autre vecteur comprenant au moins la dite autre séquence, selon les techniques usuelles définies ci-dessus. Les plantes selon l'invention peuvent encore être obtenues par croisement de parents, l'un portant le gène selon l'invention codant pour la drosomicine, l'autre portant un gène codant pour au moins un autre peptide ou protéine d'intérêt.
La présente invention concerne enfin un procédé de culture des plantes transformées selon l'invention, le procédé consistant à planter les graines des dites plantes transformées dans une surface d'un champ approprié pour la culture des dites plantes, à appliquer sur la dite surface du dit champ une composition agrochimique, sans affecter de manière substantielle les dites graines ou les dites plantes transformées, puis à récolter les plantes cultivées lorsqu'elles arrivent à la maturité souhaitée et éventuellement à séparer les graines des plantes récoltées. Par composition agrochimique, on entend selon l'invention toute composition agrochimique comprenant au moins un produit actif ayant l'une des activités suivantes, herbicide, fongicide, bactéricide, virucide ou insecticide.
Selon un mode préférentiel de réalisation du procédé de culture selon l'invention, la composition agrochimique comprend au moins un produit actif ayant au moins une activité fongicide et/ou bactéricide, plus préférentiellement présentant une activité complémentaire de celle de la drosomicine produite par les plantes transformées selon l'invention.
Par produit présentant une activité complémentaire de celle de la drosomicine, on entend selon l'invention un produit présentant un spectre d'activité complémentaire, c'est à dire un produit qui sera actif contre des attaques de contaminants (champignons, bactéries ou virus) insensibles à la drosomicine, ou encore un produit dont le spectre d'activité recouvre celui de la drosomicine, totalement ou en partie, et dont la dose d'application sera diminuée de manière substantielle du fait de la présence de la
drosomicine produite par la plante transformée.
Les exemples ci-après permettent d'illustrer l'invention, la préparation du gène chimère, du vecteur d'intégration, des plantes transformées et leur résistance à différentes maladies d'origine fongique. Les figures 1 à 7 en annexe décrivent les structures schématiques de certains plasmides préparés pour la construction des gènes chimères. Dans ces figures, les différents sites de restriction sont marqués en italiques.
Exemple 1: Construction des gènes chimères
Toutes les techniques employées ci-après sont des techniques standard de laboratoire. Les protocoles détaillés de ces techniques sont notamment décrits dans Ausubel & coll. pRPA-RD-180:
On insère un clone entier de l'ADNc codant pour la drosomicine décrit par Fehlbaum & coll (SEQ. ID N° 1) dans le plasmide pCR-1000 (INVITROGEN) comme fragment EcoRI-HindIII. pRPA-RD-182: Création d'une région codant pour la drosomicine dite "longueur totale" (correspondant au peptide pre-pro) en éliminant la région non transcrite en 5' et en supprimant le premier codon ATG.
Le plasmide pRPA-RD-180 est digéré avec les enzymes de restriction Seal et EcoRI. et le grand fragment d'ADN est purifié. Un oligonucléotide synthétique double brins de séquence Oligo 1 suivante est ensuite lié à la séquence d'ADN purifiée dérivée de pRPA-RD-180:
Oligo 1: 5 ' AATTCCCGAAGACGACATGCAGATCAAGT 3 ' GGGCTTCTGCTGTACGTCTAGTTCA
pRPA-RD-183; Création d'une séquence codant pour la drosomicine mature qui ne comprend pas la région non transcrite en 3'. Les deux oligonucléotides synthétiques complémentaires de séquences Oligo 2 et Oligo 3 ci-après sont hybrides à 65°C pendant 5 minutes puis par diminution lente de la température à 30°C pendant 30'.
Oligo 2: 5 ' GAGAGATCCC CCGCGGTGGT GACTGCCTGT CCGGAAGATA CAAGGGTCCC TGTGCCGTCT GGGACAACGA GACCTGTCGT CGTGTGTGCA AGGAGGAGGG 3 '
Oligo 3: 5' GCGCGCGGAT CCTTAGCATC CTTCGCACCA GCACTTCAGA
CTGGGGCTGC AGTGGCCACT GGAGCGTCCC TCCTCCTTGC ACACACGACG 3 '
Après hybridation entre l'Oligo 2 et l'Oligo 3, l'ADN resté simple brin sert de matrice au fragment klenow de la polymérase 1 de E. coli (dans les conditions standard préconisées par le fabriquant (New England Biolabs)) pour la création de l'oligonucléotide double brin. Cet oligonucléotide double brin est ensuite digéré par les enzymes de restriction SacII et EcoRI et clones dans le plasmide pBS II SK(-) (Stratagene) digéré par les même enzymes de restriction. On obtient alors un clone comprenant la région codant pour la drosomicine mature située entre les sites de restriction SacII et BamHI (SEQ ID 3). pRPA-RD-186: Elimination de la région 3' non transcrite de la région codant pour la drosomicine longueur totale de pRPA-RD-182.
Le plasmide pRPA-RD-182 est digéré avec les enzymes de restriction BspEI et Kpn . et le grand fragment d'ADN est purifié. Le plasmide pRPA-RD-183 est ensuite digéré avec les enzymes de restriction BspEI et Kpnl, et le petit fragment d'ADN est purifié. Ces deux fragments purifiés sont ensuites liés de manière à obtenir un plasmide contenant la région codant pour le peptide pre-pro de la drosomicine dont le premier codon ATG et les deux régions non codantes en 5' et 3' ont été supprimées (SEQ ID 5). pRPA-RD-187; Création d'un vecteur d'expression dans les plantes comprenant la séquence codant pour la forme mature de la drosomicine.
Le plasmide pUGUS(l lδ), dérivé du pUC-19, a été obtenu auprès du Dr. Richard Vierstra de l'Université du Wisconsin (plasmide non décrit). Ce plasmide dont la structure schématique est représentée sur la figure 1, contient le promoteur CaMV 35S qui dirige l'expression d'un ARN contenant la séquence non traduite en 5' du virus de la mosaïque alfalfa (AMV 5' UTR; Brederode & coll., 1980), la région N-terminale du gène de l'ubiquitine ubql l d'Arabidopsis thaliana jusqu'au site de clivage de l'ubiquitine hydrolase (ubql 1 N-term; Callis & coll., 1993) laquelle est fusionnée dans
le même cadre de lecture avec le gène de la β-glucuronidase de E. coli (GUS; Jefferson & coll., 1987). suivi du site de polyadenylation du gène de la nopaline synthase d'Agrobaaerium tumefaciens (NOS polyA; Bevan & coll.. 1983).
Le plasmide pUGUS(118) est digéré avec les enzymes de restriction SacII et BamHI et le grand fragment d'ADN est purifié. Le plasmide pRPA-RD-183 est digéré avec les enzymes de restriction SacII et BamHI et le petit fragment d'ADN contenant la région codante pour la forme mature de la drosomicine est ensuite purifié. Les deux fragments d'ADN purifiés sont liés ensemble dans une cassette d'expression dans les plantes qui synthétisent une protéine de fusion ubiquitine-drosomicine dans le cytoplasme des cellules végétales. La structure schématique de cette cassette d'expression est représentée sur la figure 2. Sous l'action de l'ubiquitine hydrolase sur cette protéine de fusion, la drosomicine mature est libérée dans le cytoplasme des cellules de la plante. pRPA-RD-188: Création d'un vecteur d'expression dans les plantes comprenant la longueur totale de la séquence codant pour la drosomicine (pre-pro).
Le plasmide pRTL-2 GUS. dérivé du plasmide pUC-19. a été obtenu auprès du Dr. Jim Carrington (Texas A&M University. non décrit). Ce plasmide dont la structure schématique est représentée sur la figure 3, contient le promoteur CaMV 35S dupliqué isolé du virus de la mosaïque du choux fleur (Promoteur CaMV 2x35S; Odell & coll.. 1985) qui dirige l'expression d'un ARN contenant séquence non traduite en 5' du virus etch du tabac (TEV 5' UTR: Carrington & Freed. 1990), le gène de la β-glucuronidase de E. coli (GUS Jefferson & coll.. 1987) suivi du site de polyadenylation de l'ARN 35S de CaMV (CaMV polyA; Odell & coll.. 1985).
Le plasmide pRTL-2 GUS est digéré avec les enzymes de restriction Ncol et BamHI et le grand fragment d'ADN est purifié. Le plasmide pRPA-RD-186 est digéré avec les enzymes de restriction BbsII et BamHI et le petit fragment d'ADN contenant la région codant pour la drosomicine pre-pro est purifié. Les deux fragments d'ADN purifiés sont ensuite liés ensemble dans une cassette d'expression dans les plantes qui synthétisent une protéine de drosomicine pre-pro. La structure schématique de cette cassette d'expression est représentée sur la figure 4. « pre-pro-drosomicine «représente la région codante pour la drosomicine de pRPA-RD-186. La drosomicine est transportée vers la matrice extra-cellulaire de la plante par l'action d'un peptide signal (pre-pro).
pRPA-RD-195: Création d'un plasmide contenant un site de clonage multiple modifié.
Le plasmide pRPA-RD-195 est un plasmide dérivé du pUC-19 qui contient un site de clonage multiple modifié. Les oligonucléotides synthétiques complémentaires Oligo 4 et Oligo 5 ci-après, sont hybrides et rendus double brin selon la procédure décrite pour pRPA-RD-183.
Oligo 4: 5 ' AGGGCCCCCT AGGGTTTAAA CGGCCAGTCA GGCCGAATTC GAGCTCGGTA CCCGGGGATC CTCTAGAGTC GACCTGCAGG CATGC 3'
Oligo 5: 5 ' CCCTGAACCA GGCTCGAGGG CGCGCCTTAA TTAAAAGCTT GCATGCCTGC AGGTCGACTC TAGAGG 3 '
L'oligonucléotide double brin obtenu est ensuite lié dans pUC-19 qui a été préalablement digéré avec les enzymes de restriction EcoRI et HindIII et rendu bouts francs en employant le fragment klenow de l'ADN polymérase 1 de E. coli. On obtient un vecteur contenant de multiples sites de clonage pour faciliter l'introduction des cassettes d'expression dans un plasmide vecteur d'Agrobacterium tumefaciens. La structure schématique de ce site de clonage multiple est représentée sur la figure 5. pRPA-RD-190: Introduction de la cassette d'expression de la drosomicine de pRPA-RD-187 dans pRPA-RD-195.
Le plasmide pRPA-RD-187 est digéré avec les enzymes de restriction Kpnl et Sali, et le fragment d'ADN contenant la cassette d'expression de la drosomicine est purifié. Le fragment purifié est ensuite lié dans pRPA-RD-195 qui a été préalablement digéré avec les même enzymes de restriction.
pRPA-RD-191: Introduction de la cassette d'expression de la drosomicine de pRPA-RD-188 dans pRPA-RD-195.
Le plasmide pRPA-RD-188 est digéré avec l'enzyme de restriction HindIII et déphosphorylé avec de la phosphatase intestinale de veau. Le fragment d'ADN contenant la cassette d'expression de la drosomicine est purifié. Le fragment purifié est ensuite lié dans pRPA-RP-195 qui a été préalablement digéré avec l'enzyme de
restriction HindIII. nRPA-RD-174: Plasmide dérivé de pRPA-BL-150A (EP 0 508 909) contenant le gène de tolérance au bromoxynil de pRPA-BL-237 (EP 0 508 909).
Le gène de tolérance au bromoxynil est isolé de pRPA-BL-237 par une amplification génique par PCR. Le fragment obtenu est à bouts francs et est clone dans le site EcoRI de pRPA-BL-150A qui a été rendu bouts francs par l'action de la polymérase klenow dans des conditions standard. On obtient un vecteur d'Agrobacterium tumefaciens qui contient le gène de tolérance au bromoxynil à proximité de sa bordure droite, un gène de tolérance à la kanamycine à proximité de sa bordure gauche et le site de clonage multiple de pUC-19 entre ces deux gènes.
La structure schématique de pRPA-RD-174 est représentée sur la figure 6. Sur cette figure, "nos" représente le site de polyadenylation de la nopaline synthase d'Agrobacterium tumefaciens (Bevan & coll., 1983), "NOS pro" représente le promoteur de la nopaline synthase d'Agrobacterium tumefaciens (Bevan & coll., 1983). "NPT II" représente le gène de la néomycine phosphotransphérase du transposon Tn5 de E. coli (Rothstein & coll., 1981), "35S pro" représente le promoteur 35S isolé du virus de la mosaïque du choux fleur (Odell & coll., 1985), "BRX" représente le gène de la nitrilase isolé de K. ozaenae (Stalker & coll., 1988), "RB" et "LB" représentent respectivement les bordures droite et gauche de la séquence d'un plasmide Ti d'Agrobacterium tumefaciens. pRPA-RD-184: Addition d'un nouveau site de restriction, unique, dans pRPA- R -174.
Les oligonucléotides synthétiques complémentaires Oligo 6 et Oligo 7 ci-après, sont hybrides et rendus double brin selon la procédure décrite pour pRPA-RD-183. Oligo 6: 5 ' CGGGCCAGTC AGGCCACACT TAATTAAGTT TAAACGCGGC
CCCGGCGCGC CTAGGTGTGT GCTCGAGGGC CCAACCTCAG TACCTGGTTC AGG 3 ' Oligo 7 : 5 ' CCGGCCTGAA CCAGGTACTG AGGTTGGGCC CTCGAGCACA CACCTAGGCG CGCCGGGGCC GCGTTTAAAC TTAATTAAGT GTGGCCTGAC TGG 3 '
L'oligonucléotide double brin hybride (95 paires de bases) est purifié après séparation sur un gel d'agarose (3 % Nusieve, FMC). Le plasmide pRPA-RD-174 est digéré avec l'enzyme de restriction Xmal. et le grand fragment d'ADN est purifié. Les
deux fragments d'ADN obtenus sont ensuite liés.
On obtient un plasmide dérivé de pRPA-RD-174 comprenant d'autres sites de restriction entre le gène de tolérance au bromoxynil et le gène de la kanamycine marqueur de sélection. La strucure schématique du plasmide pRPA-RD-184 est représentée sur la figure 7 où les termes "nos", "NPT II", "NOS pro", "35S pro", "BRX gène", "RB" et
"LB" ont la même signification que pour la figure 6. pRPA-RD-192: Création d'un vecteur d'Agrobacterium tumefaciens contenant la construction du gène codant pour la drosomicine dirigée vers le cytosol des cellules.
Le plasmide pRPA-RD-190 est digéré avec les enzymes de restriction Apal et
Ascl. et le fragment d'ADN contenant la cassette d'expression de la drosomicine est purifié. Le fragment d'ADN purifié contenant la cassette d'expression de la drosomicine est lié dans pRPA-RD-184, après digestion préalable avec les même deux enzymes. On obtient ainsi un vecteur d'Agrobacterium tumefaciens contenant la séquence codant pour la protéine de fusion drosomicine-ubiquitine qui conduit à l'expression de la drosomicine dans le cytosol des cellules de la plante. pRPA-RD-193; Création d'un vecteur d'Agrobacterium tumefaciens contenant la construction du gène codant pour la drosomicine dirigée vers la matrice extracellulaire.
On reprend le mode opératoire décrit ci-dessus avec le plasmide pRPA-RD-191 et les enzymes de restriction Pmel et Ascl, remplaçant le plasmide pRPA-RD-190 et les enzymes de restriction Apal et Ascl. On obtient ainsi un vecteur d'Agrobacterium tumefaciens contenant la séquence codant pour la protéine pre-pro de la drosomicine qui conduit à l'expression de la drosomicine dans la matrice extracellulaire de la plante.
Exemple 2: Tolérance aux herbicides des tabacs transformés.
2.1- Transformation
Les vecteurs pRPA-RD-192 and pRPA-RD-193 sont introduit dans la souche d'Agrobacterium tumefaciens EHAIOI (Hood & coll.. 1987) porteuse du cosmide pTVK291 (Komari & coll., 1986). La technique de transformation est basée sur la procédure de Horsh & coll. (1985).
2.2- Régénération
La régénération du tabac PBD6 (provenance SEITA France) à partir d'expiants foliaires est réalisée sur un milieu de base Murashige et Skoog (MS) comprenant 30 g/1 de saccharose ainsi que 200 μg/ml de kanamycine. Les explants foliaires sont prélevés sur des plantes cultivées en serre ou in vitro et transformées selon la technique des disques foliaires (Horsh & coll., 1985) en trois étapes successives: la première comprend l'induction des pousses sur un milieu additionné de 30 g/1 de saccharose contenant 0.05 mg/1 d'acide naphtylacétique (ANA) et 2 mg/1 de benzylaminopurine (BAP) pendant 15 jours. Les pousses formées au cours de cette étape sont ensuite développées pendant 10 jours par culture sur un milieu MS additionné de 30 g/ 1 de saccharose mais ne contenant pas d'hormone. Puis on prélève des pousses développées et on les cultive sur un milieu d'enracinement MS à teneur moitié en sels, vitamines et sucre et ne contenant pas d'hormone. Au bout d'environ 15 jours, les pousses enracinées sont passées en terre. 2.3- Tolérance au bromoxynil
Vingt plantes transformées ont été régénérées et passées en serre pour chaque construction pRPA-RD- 192 et pRPA-RD- 193. Ces plantes ont été traitées en serre au stade 5 feuilles avec une suspension aqueuse de Pardner correspondant à 0,2 kg de matière active bromoxynil par hectare. Toutes les plantes montrant une tolérance complète au bromoxynil sont employées dans les expérimentations suivantes pour tester les effets de l'expression de la drosomicine sur la tolérance des plantes transformées aux agressions fongiques.
Exemple 3: Détection de la drosomicine dans les tabacs transformés Une analyse immunoblot (telle que décrites par Coligan & coll.) est employée pour détecter la drosomicine produite par les tabacs transformés, en employant un anticorps de lapin dirigé contre la drosomicine synthétique fixée sur une protéine porteuse KLH, avec la drosomicine synthétique comme antigène.
Les protéines de feuilles sont extraites d'abord par broyage des tissus congelés à -180°C. suivi par l'addition d'un tampon d'extraction (urée 8 M, tris HCl pH 6.8 50 raM. SDS 2 %. β-mercaptoéthanol 5 %. saccharose 10 %. EDTA 2 mM et dithiothreitol 10 mM). La quantité totale de protéines extractables est ensuite mesurée. 100 μg de protéines extraites sont ensuite chargées dans des puits de gel SDS-PAGE
(20 % acryiamide) pour une analyse immunoblot (selon Coligan & coll.).
Pour les plantes transformées avec le plasmide pRPA-RD-193 (drosomicine pre-pro), on a trouvé jusqu'à 160 ng de drosomicine pour 100 μg du total de protéines extraites des feuilles. Pour les plantes transformées avec le plasmide pRPA-RD-192 (drosomicine mature), on a trouvé jusqu'à 50 ng de drosomicine pour 100 μg du total de protéines extraites des feuilles.
La drosomicine synthétisée et isolée dans les plantes transformées avec les plasmides pRPA-RD-192 et pRPA-RD-193 co-migre avec la drosomicine isolée des drosophiles. Ce résultat montrent que chacune des drosomicines dirigée soit vers le cytoplasme (pRPA-RD-192) soit vers la matrice extracellulaire (pRPA-RD-193) conduisent à une drosomicine mature. En outre, le système de gel employé dans cet analyse (20 % acryiamide) aurait permis de détecter aisément de la drosomicine qui n'aurait pas été transformée puisque les deux constructions (ubiquitine-drosomicine et drosomicine pre-pro) font approximativement 10 kD, contre 5 kD pour la drosomicine mature.
Exemple 4: Résistance au Botrytis cinerea des tabacs transformés.
15/20 plantes issues des plantes obtenues à l'exemple 2.3. sont cultivées en serre dans des pots de repiquage de 7 cm de côté dans les conditions suivantes:
- température: 16° C durant la nuit: 19° C durant le jour:
- photopériode: 14 h de nuit; 10 h de jour, - hygrométrie: 90-1400
Deux feuilles par plantes sont innoculées avec 6 disques de 6 mm de diamètre par feuille, chaque disque étant constitué d'une suspension de Botrytis cinerea (100 000 spores/ml). L'évolution de l'infection est observée 7 jours après l'innoculation en mesurant l'augmentation du diamètre de chaque disque.
Pour l'essentiel des plantes transformées par le plasmide pRPA-RD-192
(protéine mature dans le cytoplasme) ou par le plasmide pRPA-RD-193 (drosomicine extra-cellulaire), on observe une absence d'augmentation des diamètres des disques. ou une augmentation très minime, ce qui indique une forte résistance aux infections causées par Botritis cinerea.
Exemple 5: Résistance à Cltalara elegans des tabacs transformés.
On reprend le mode opératoire précédent avec les conditions opératoires suivantes:
- température: 18° C durant la nuit; 22° C durant le jour: - photopériode: 14 h de nuit; 10 h de jour.
L'innoculation est effectuée 18 jours après le semis par apport dans chaque pot de 1 ml d'une suspension d'endoconidies à 1 000 000 conidies/ml. La lecture des résultats de l'infection est effectuée 21 jours après l'innoculation en observant les racines des plantules préalablement nettoyées à l'eau. L'évolution de la maladie est appréciée par une échelle de notation de 0 à 11, 0 correspodant à une absence d'infection. Pour les plantes transformées par le plasmide pRPA-RD-192 (protéine mature dans le cytoplasme) et celles transformées par le plasmide pRPA-RD-193 (drosomicine extra-cellulaire), la notation moyenne est de 4. ce qui correspond à une forte résistance à Chalara elegans.
Les résultats obtenus in vivo dans les exemples 4 et 5 montrent que la transformation par le gène chimère selon l'invention confère à la plante transformée de nouvelles propriétés de résistance aux champignons, activité est liée à la conservation des propriétés antifongiques de la drosomicine produite par les plantes transformées selon l'invention.
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Claims
1. Gène chimère comprenant une séquence codante ainsi que des éléments de régulation en position 5' et 3' hétérologues pouvant fonctionner dans une plante, caractérisé en ce que la séquence codante comprend au moins une séquence d'ADN codant pour la drosomicine.
2. Gène chimère selon la revendication 1. caractérisée en ce que la drosomicine comprend essentiellement la séquence peptidique de formule (I) ci- dessous : Xaa-Cys-Xab-Cys-Xac-Cys-Xad-Cys-Xae-Cys-Xaf-Cys-Xag-Cys-Xah-Cys
(I) dans laquelle
Xaa représente un reste peptidique comprenant au moins 1 acide aminé,
Xab représente un reste peptidique de 8 acides aminés, Xac représente un reste peptidique de 7 acides aminés,
Xad représente unreste peptidique de 3 acides aminés.
Xae représente un reste peptidique de 9 acides aminés,
Xaf représente un reste peptidique de 5 acides aminés,
Xag représente unreste peptidique d'un acide aminé, et Xah représente un reste peptidique de 2 acides aminés.
3. Gène chimère selon la revendication 2, caractérisé en ce que Xab et/ou Xad et/ou Xac comprenent au moins un acide aminé basique.
4. Gène chimère selon la revdication 3, caractérisé en ce que Xab comprend au moins 2 acides aminés basiques, de préférence 2 et/ou Xad et/ou Xaf comprenent au moins 1 acide aminé basique, de préférence 1.
5. Gène chimère selon l'une des revendications 2 ou 3, caractérisé en ce que
Xaa représente la séquence peptidique Xaa'-Asp- dans laquelle Xaa' représente NH2 ou un reste peptidique comprenant au moins 1 acide aminé, rt/ou Xab représente la séquence peptidique -Leu-Xab'-Pro- dans laquelle Xab' représente un reste peptidique de 6 acides aminés, et/ou
Xac représente la séquence peptidique -Ala-Xac'-Thr- dans laquelle Xac' représente un reste peptidique de5 acides aminés, et/ou
HUME DE REMPLACEMENT (REGLE 26)
Xad représente la séquence peptidique -Arg-Xad'-Val, dans laquelle Xad' représente un reste peptidique d'un acide aminé, et/ou
Xae représente la séquence peptidique -Lys-Xae'-His- dans laquelle Xae' représente un reste peptidique de 7 acides aminés, et/ou Xaf représente la séquence peptidique -Ser-Xaf -Lys- dans laquelle Xaf représente un reste peptidique de 3 acides aminés, et/ou
Xag représente Trp, et/ou
Xah représente le reste peptidique Glu-Gly.
6. Gène chimère selon la revendication 5, caractérisé en ce que Xab' représente la séquence peptidique Ser-Gly-Arg-Tyr-Lys-Gly, et ou
Xac' représente la séquence peptidique Val-Trp-Asp-Asn-Glu, et/ou
Xad' représente Arg, et/ou
Xae' représente la séquence peptidique Glu-Glu-Gly-Arg-Ser-Ser-Gly, et/ou
Xaf représente la séquence peptidique Pro-Ser-Leu.
7. Gène chimère selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que la drosomicine est la séquence peptidique représentée par l'identificateur de séquence n° 4 (SEQ ID No 4) et les séquences peptidiques homologues.
8. Gène chimère selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que la drosomicine est un peptide de fusion « peptide-drosomicine », dont la coupure par les systèmes enzymatiques des cellules végétales permet la libération de la drosomicine, définie dans les revendications 1 à 7.
9. Gène chimère selon la revendication 8, caractérisé en ce que le peptide de fusion « peptide-drosomicine » est représenté par l'identificateur de séquence n° 6 (SEQ ID No 6).
10. Peptide de fusion « peptide-drosomicine », caractérisé en ce que la drosomicine est définie selon les revendications 1 à 7.
11. Peptide de fusion selon la revendication 10. caractérisé en ce que le peptide est être un peptide signal ou un peptide de transit.
12. Peptide de fusion selon la revendication 1 1. caractérisé en ce que le peptide signal est choisi parmi le peptide signal du gène PR-l du tabac, ou l'ubiquitine.
13. Gène chimère selon l'une des revendications 1 à 12, caractérisé en ce qu'il comprend en outre au moins un gène de tolérance aux herbicides.
14. Gène chimère selon l'une des revendications 1 à 14, caractérisé en ce
qu'il comprend en outre au moins une séquence codante pour un autre peptide susceptible de conférer à la plante des résistances à d'autres maladies d'origine bactérienne ou fongique.
15. Gène chimère selon l'une des revendications 1 à 14, caractérisé en ce que les éléments de régulations comprennent les séquences promotrices, les activateurs de transcription, les peptides de transit et ou les séquences terminatrices.
16. Gène chimère selon l'une des revendications 1 à 14, caractérisé en ce que la séquence de régulation promotrice est choisie parmi les séquences promotrices d'origine bactérienne, virale ou végétale.
17. Gène chimère selon la revendication 16, caractérisé en ce que la séquence de régulation promotrice est choisie parmi le promoteur du gène de la petite sous-unité de ribulose-bisphosphate carboxylase/oxygénase (RuBisCO) ou celui de la mosaïque du choux fleur (CAMV 19S ou 35S).
18. Gène chimère selon la revendication 16, caractérisé en ce que la séquence de régulation promotrice comprend au moins un promoteur choisi parmi les promoteurs d'histone ou d'actine.
19. Vecteur pour la transformation des plantes caractérisé en ce qu'il contient au moins un gène chimère selon l'une des revendications 1 à 18.
20. Cellule végétale transformée contenant au moins un ADN tel que défini dans l'une des revendications 1 à 18.
21. Plante résistante aux maladies, caractérisée en ce qu'elle comprend une cellule transformée selon la revendication 20.
22. Plante selon la revendication 21, caractérisée en ce qu'elle est obtenue par régénération à partir d'une cellule transformée selon la revendication 20.
23. Plante transformée résistante aux maladies, caractérisée en ce qu'elle est issue de la culture et/ou du croisement des plantes selon l'une des revendications 21 ou 22.
24. Graines de plantes transformées selon l'une des revendications 21 à 23.
25. Procédé de transformation des plantes pour les rendre résistantes aux maladies, caractérisé en ce qu'on insère un gène chimère selon l'une des revendications l à 18.
26. Procédé de transformation des plantes pour les rendre résistantes aux maladies fongiques, caractérisé en ce qu'on insère un gène chimère selon l'une des revendications 1 à 18.
27. Procédé selon l'une des revendications 25 ou 26, caractérisé en ce que le transfert est effectué avec Agrobacterium tumefaciens ou Agrobacterium rhizogenes.
28. Procédé selon l'une des revendications 25 ou 26, caractérisé en ce que le transfert est effectué par apport par bombardement à l'aide de particules chargées de l'ADN.
29. Procédé selon l'une des revendications 25 à 28, caractérisé en ce que l'on insère également au moins un gène de tolérance aux herbicides.
30. Procédé selon l'une des revendications 25 à 29, caractérisé en ce que l'on insère également au moins une séquence codante pour un autre peptide susceptible de conférer à la plante des résistances à d'autres maladies d'origine bactérienne ou fongique.
31 Procédé de culture des plantes transformées selon l'une des revendications 21 à 24, caractérisé en ce qu'il consiste à planter les graines des dites plantes transformées dans une surface d'un champ approprié pour la culture des dites plantes, à appliquer sur la dite surface du dit champ une composition agrochimique, sans affecter de manière substantielle les dites graines ou les dites plantes transformées, puis à récolter les plantes cultivées lorsqu'elles arrivent à la maturité souhaitée et éventuellement à séparer les graines des plantes récoltées.
32. Procédé de culture selon la revendication 31, caractérisé en ce que la composition agrochimique comprend au moins un produit actif ayant au moins une activité fongicide et/ou bactéricide.
33. Procédé de culture selon la revendication 24, caractérisé en ce que le produit actif présente une activité complémentaire de celle de la drosomicine.
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