JPH07506485A - 真菌応答性キメラ遺伝子 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 応　キメラ′ 本発明は、植物の真菌感染に応答して、真菌感染の部位のまわりの植物の細胞内 で実質的に選択的にＤＮＡフラグメント又は遺伝子の発現を誘発（すなわち刺激 ）することを目的とする、遺伝子導入植物内での真菌応答性プロモータの少なく とも一部分の使用に関する。本発明の真菌応答性プロモータの使用は、植物を感 染性真菌、特に植物病原性真菌に対して耐性を与えるため、真菌感染部位を直接 とり囲む植物の細胞内で選択的に発現される外来性遺伝子又はＤＮＡフラグメン トを制御するために、遺伝子導入植物内で特に価値のあることである。

本発明は又、植物を形質転換する目的で使用でき、しかも次の第１のつまり真菌 応答性キメラ遺伝子に関する。

ａ）真菌感染部位を直接とり囲む植物の細胞内で発現されたとき、１）真菌感染 部位を直接とり囲む植物細胞を殺すか又は少なくとも不利な外乱を与えるか、或 はｉｉ　）真菌感染部位内の単数又は複数の真菌を殺すか、不能状態にするか又 は忌避することのできる産物をコードし； ｂ）本発明の真菌応答性プロモータの少なくとも一部分の制御上本発明はさらに 、第１のキメラ遺伝子、及び任意に第２のつまり回復キメラ遺伝子を含むように 形質転換されたゲノムをもつ植物の細胞にも関する。ここでこの第２のキメラ遺 伝子は、特に真菌感染部位を直接とり囲むもの以外の植物細胞を殺すか又はこれ に著しく不利な外乱を与えることのできる産物を、第１の外来性ＤＮＡがコード する場合に少な（ともこのその他の植物の細胞内で第１の外来性ＤＮＡ又はその コードされた産物を阻害又は失活させることのできる産物をコードする第２の外 来性ＤＮＡを制御する第２のプロモータを含んでいる。

本発明はさらに、ａ）本発明の第１のキメラ遺伝子及び任意に第２のキメラ遺伝 子を用いて、形質転換された本発明の植物細胞から再生される５ｏｌａｎａｃｅ ａｅ　（ナス科）（例えばトマト又はジャガイモ）又はＢｒａｓｓｉｃａｃｅａ ａ　（アブラナ科）（例えばセイヨウアブラナ）といった真菌耐性遺伝子導入植 物、ｂ）再生された遺伝子導入植物及びかかる植物の種子から誘導された真菌耐 性遺伝子導入植物、及びＣ）植物細胞培養物にも関し、これらは全て、基本的に 本発明の形質転換された植物細胞で構成されている。

本発明の植物は、真菌感染部位をとり囲む、好ましくは直接とり囲む植物細胞内 での本発明の第１のキメラ遺伝子の真菌応答性発現、及び、 ａ）その他の植物細胞全てにおける第１のキメラ遺伝子の発現の実質的な、好ま しくは完全な欠如、か又は、ｂ）植物を真菌感染に対して耐性にすることになる 、本発明の第２のキメラ遺伝子の発現による、その他の植物細胞全てにおける第 １のキメラ遺伝子のあらゆる発現の効果の実質的な欠如、及び好ましくはその完 全な欠如、 によって特徴づけられる。

及用Ω貨１ 真菌は、微生物中の非常に古いグループである。有害な真菌は、人間、他の動物 そして特に植物の病害をひき起こす。約ｓ、ｏｏ。

の真菌種が植物の病害をひき起こす可能性があり、全ての植物が、成る種の真菌 による攻撃を受ける。植物病原性真菌の中には数多（の植物種を攻撃しつるもの もあれば、唯１つの植物種しか攻撃しないものもある。

一般に、真菌性の植物病害は２つのタイプに分類できる。すなわち、土壌伝播性 真菌によりひき起こされる病害と空気伝播性真菌によりひき起こされる病害であ る。土壌伝播性真菌は、Ｆｕｓａｒｉｕｍｓｐｐ、によりひき起こされる根及び 茎の腐れ、及び亜匹並旺匣匹ｓｐｐによってひき起こされる根の腐れ、といった 最も広（はびこっている重大な植物病害のいくつかをひき起こす。

空気伝播性真菌は、風によって長距離に分散されうろことから、特に広域にわた って生育する作物に対して破壊的な損失をひき起こす可能性がある。このような 病原体のいくつかがさまざまな作物に広範な伝染病をひき起こしてきた。空気伝 播性真菌によりひき起こされる重大な病害は、小麦の黒サビ病（Ｐｕｃｃｉｎｉ ａ　ｒａｍｎｉｓ）　、トウモロコシの黒穂病（Ｕｓｔｉｌａ　ｏ　ｍａ　ｄｉ ｓ）及びジャガイモ及びトマトの疫病（Ｐｈ　ｔｏ　ｈｔｈｏｒａ　１ｎｆｅｓ ｔａｎｓ）である。

これらの真菌性病害の大部分は、克服し難（、農場主及び栽培者は、衛生上の措 置、耐性のある栽培品種、及び有効な殺菌剤といった実践方法の組合せをこのよ うな病害に対して使用しなければならない。植物病原性真菌の化学的制御のため に、年間何億ドルもの費用が費やされている。その結果、今日では、植物病原性 真菌を制御するための新しくさらに有効で安全な手段が真に必要とされている。

植物が真菌性病害に対し防衛メカニズムを有していることがわかっている。植物 は、真菌の攻撃を認識した場合、真菌感染部位を直接とり囲むその細胞内にいく つかの反応を誘発することにより応答することが可能である。最初の感染により 抵抗メカニズムが活性化され、かくして侵入する真菌病原体の蔓延を制限する（ Ｗａｒｄ　ｅｔａｌ、　１９９１）。この抵抗メカニズムには、過敏性応答とし て知られている局所的な細胞の死滅、フィトアレキシンの蓄積及び木質化が含ま れる（Ｄｅ　Ｗｉｔ、　１９８７）　、真菌感染の蔓延を制限するのに非常に効 果的でありうるこれらの応答の特異性は、宿主及び病原体の遺伝的構成によって 左右される。

栽培品種／品種特異的な宿主／病原体の相互作用を制御する遺伝的構成要素の特 徴づけが、現在の分子植物病理学研究の１つの目的である。防衛関連遺伝子の転 写活性化は、植物が潜在的病原体との接触に対処できるようにする複雑な防衛シ ステムの一部を成している（Ｃｏｌｌｉｎｇｅ及び５ｌｕｓａｒｅｎｋｏ、　１ ９８７；　Ｈａｈｌｂｒｏｃｋ及び５ｃｈｅｅｌ。

１９８９；Ｂｏｗｌｅｓ、　１９９０）。防衛関連遺伝子の発現を調節するシス 作用性要素の同定は、シグナル形質導入鎖が、植物宿主による病原体の最初の認 識をその防衛反応誘発と結びつけるプロセスを解明する目的で探求されてきた（ Ｌａｍｂ　ｅｔ　ａｌ、　１９８９）。その他のいくつかの宿主／病原体システ ムについて発見されたように（Ｖａｎ　Ｌｏａｎ。

１９８５；　Ｈａｈｌｂｒｏｃｋ及び５ｃｈｅｅ１．１９８９）　、疫病の病因 である真菌堕へ匹肛匡皿」可社印匹によるジャガイモの感染は、フェニルプロパ ノイド代謝の酵素及びＰＲ−タンパク質をコードする遺伝子の転写活性化を導＜ 　（Ｆｒｉｔｚｅ＋＋＋ｅｉｅｒ　ｅｔ　ａｌ、　１９８７；　Ｋｏｍｂｒｉｎ ｋ　ｅｔ　ａｌ。

１９８８；　Ｔａｙｌｏｒ　ｅｔ　ａｌ、　１９９０）　、これらの遺伝子の転 写は、異なる匹■肛肛匠皿」バ朋印朋種属と異なるジャガイモ栽培品種の共存性 及び非共存性相互作用において、類似の動態で誘発される。大型二二■ユ遺伝子 系統群（１つの１倍体ゲノムにつき１０〜１５個のきわめて類似したコピーを伴 う）の−員であるＬＬ旦上ニュというジャガイモ内の「病因関連」　（又はｒＰ ＲＪ）−タンパク質遺伝子の１つのヌクレオチド及び推測されたアミノ酸配列は 、大豆中のＨＳＰ２６熱ショックタンパク質をコードする相応する遺伝子配列に 対し、著しい類似性を示している（Ｔａｙｌｏｒ　ｅｔ　ａｌ、　１９９０）　 ＊　１ｎｓｉｔｕハイブリツド形成実験は、真菌進入部位のまわりにｐｒｐ１転 写体が蓄積することを示したが、ジャガイモの防衛方法におけるこのタンパク質 の機能についてはまだ明らかになっていない。相同の大豆ＨＳＰ２６タンパク質 は、いくつかの特徴的な構造的特性に欠け、広範なストレス条件下で異常に高い 相対的濃度で現われるが（Ｃｚａｒｒｅｃｋａ　ｅｔ　ａｌ、　１９８４；　Ｖ ｉｅｒｌｉｎｇ、　１９９１）、同様に細胞代謝における既知の役目を全（有し ていない、植物の低分子量熱シヨツクタンパク質の一部の中の唯一のメンバーで ある。！！コしよ：」、遺伝子によりコードされたタンパク質とその他の５ｏｌ ａｎａｃｅｏｕｓ種からのいくつかの既知のＰＲ−タンパク質の間には、いかな る配列類似性も発見されていない（Ｔａｙｌｏｒ　ｅｔ　ａｌ、　１９９０）。

シス作用性要素のレベルにおいて今日までに分析されてきた病原体防衛に関連す るタンパク質をコードする大部分の植物遺伝子は、同様に、機械的損傷、光及び ／又は高濃度の重金属といったい（つかのその他のストレス刺激によっても活性 化される（Ｏｓｈｉｍａ　ｅｔａｌ、、　１９９０；　Ｓｃｈｍｉｄ　ｅｔ　ａ ｌ、　１９９０；　５ｔｅｒＩｌｅｒ　ｅｔ　ａｌ、　１９９０；　Ｄｏｕｇｌ ａｓｅｔ　ａｌ、　１９９１；　Ｊｏｏｓ及びＨａｈｌｂｒｏｃｋ、　１９９２ ；　Ｂｅｃｋｅｒ−Ａｎｄｒｅ　ｅｔ　ａｌ。

１９９１）　。

■肌五！豹 本発明に従うと、 １）好ましくはＬ二エユブロモー夕の全部又はプロモータ有効部分、特に且二旦 １ニュブロモー夕の全部又はプロモータ有効部分、特定的には配列表内に記され たＳＥＱ　ＩＤ番号１のヌクレオチド１と６９６の間のｍニュブロモータフラグ メントのプロモータ有効部分、さらに特定的には配列表内に記載したＳＥＱ　Ｉ Ｄ番号ｌのヌクレオチド２９５と５６７の間のプロモータフラグメントを含み、 真菌特にＰｈ　ｔｏ　ｈｔｈｏｒａ　（例えばＰ、　１ｎｆｅｓｔａｎｓ）又は 四閃並匹虱匹（例えばＣ１ａｄｏｓ　ｏｒｉｕｍ　ｆｕｌｖｕｍ）といった植物 病原性真菌による植物の感染の部位をとり囲む、好ましくはこれを直接とり囲む 植物の細胞内で、実質的に選択的に、好ましくは選択的に外来性ＤＮＡの転写に 向けることのできる真菌応答性プロモータ；２）真菌感染部位をとり囲む、好ま しくはこれを直接とり囲む植物の細胞内で産生又は過剰産生された時点で、（ａ ）この真菌を殺すか、不能状態にするか又は忌避する、或は（ｂ）この真菌感染 部位をとり囲む、好ましくはこれを直接とり囲む植物細胞を殺すか又は少なくと もその代謝、機能及び／又は発達を著しく妨害して、その真菌のそれ以上の蔓延 を制限する、第１のＲＮＡ及び／又はタンパク質又はポリペプチドをコードする 第１の外来性ＤＮＡ、及び３）真菌感染部位をとり囲む、好ましくはこれを直接 とり囲む植物の細胞内で、実質的に選択的に、好ましくは選択的に第１の外来性 ＤＮＡを発現するための適当な３′転写終結シグナル（すなわち３′末端）、 という作動的に連鎖されたＤＮＡ配列を含む、第１のつまり真菌応答性キメラ遺 伝子が提供される。

同様に、本発明に従うと、本発明に従った第１のキメラ遺伝子を内含するべく、 及び任意に・・・特に真菌応答性プロモータが、真菌感染部位を直接とり囲む植 物細胞内で、単に実質的に選択的に第１の外来性ＤＮＡの転写に向けるとき、特 定的には第１の外来性ＤＮＡが上述のタイプｂ）のものであるとき・・・好まし くは同じ遺伝子座内で第２のつまり回復キメラ遺伝子を内含するべく、核ゲノム が形質転換される植物の細胞において、この第２のキメラ遺伝子が、１）少な（ とも真菌感染部位をとり囲むもの、好ましくはこれを直接とり囲むもの以外の植 物の細胞内で外来性ＤＮＡの転写に向けることのできる、比較的弱い構成プロモ ータ（例えばユ旦互プロモータ）といったような第２のプロモータ；２）植物の 少なくとも前記その他の細胞の中で産生又は過剰産生された時点で、植物の少な くともこのその他の細胞の中で第１の外来性ＤＮＡ又は第１のＲＮＡ或いはタン パク質又はポリペプチドを阻害又は失活させることのできる、第２のＲＮＡ及び ／又はタンパク質又はポリペプチドをコードする第２の外来性ＤＮＡ、及び３） 植物の少なくとも前記その他の細胞の中で、第２の外来性ＤＮＡを発現するため の適当な３′転写終結シグナル、といった作動的に連鎖されたＤＮＡ配列を含ん でいる、植物細胞が提供される。

さらに本発明に従うと、各々基本的に本発明の形質転換された植物細胞で構成さ れている、本発明の形質転換された植物細胞から再生された真菌耐性植物、それ から誘導された真菌耐性植物及びその種子、ならびに植物細胞培養物、が提供さ れる。

さらに又本発明に従うと、本発明の第１のキメラ遺伝子、及び任意に第２のキメ ラ遺伝子を用いて植物の核ゲノムを形質転換する段階を含む単数又は複数の真菌 、特にＰｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ　（例えばＬｉｎｆｅｓｔａｎｓ　）及び叶ｍ １匹匹亘匹（例えばＣ１ａｄｏｓ　ｏｒｉｕｍ　ｆｕｌｖｕｍ）といった植物病 原性真菌に対する耐性を植物に付与するための方法も提供される。

及肛立用釈皇韮朋 本明細書全体を通して、以下の定義づけが適用される。すなわち、 「真菌感染植物」というのは、少な（とも１つの真菌種、特に植物病原性真菌、 例えば皿■匹肛匡皿ｓｐｐ、　ａ旦江凹ｓｐｐ。

Ｆｕｓａｒｉｕｍ　ｓｐｐ、　５ｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ　ｓｐｐ、　Ｐｕｃｃｉ ｎｉａ　ｓｐｐ、　７ｓｐｐ、Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ　ｓｐｐ、　Ｆ（ｅｌｍｉ ｎｔｈｏｓ　ｏｒｉｕｍ　ｓｐｐ、、　Ｐ　ｒｅｎｏ　ｅｒｉｚａｃｒｕｃｉｆ ｅｒｏｒｕｍ、Ｐｅｒｏｎｏｓ　ｏｒａ　ａｒａｓｉｔｉｃａ、Ｐｌａｓｍｏｄ ｉｏ　ｈｏｒａｂｒａｓｓｉｃａｅ、Ｐｓｅｕｄｏｃｅｒｃｏｓ　ｏｒｅｌｌａ 　ｃａ　５ｅｌｌａ、社旦堕二堕ｓｐｐ。

Ｐ　ｒｅｎｏ　ｈｏｒａ　ｓ　、　匡■圏Ｌｓｐｐ、　旺二ム旦ｓｐｐ、　ａｎ ｄ　ｋＬ旦糖ｓｐｐ、による感染を受けた植物のことを意味する。　「真菌応答 性プロモータ」というのは、植物内でＤＮＡ配列（例えば遺伝子）の転写を制御 する上でのその作用が、１）真菌、特に植物病原性真菌による植物の感染により 影響される・・・すなわち誘発され（つまり刺激され）・・・；２）真菌感染部 位のまわりの植物細胞内、好ましくは真菌感染部位を直接とり囲む植物細胞内で 実質的に選択的に、好ましくは排他的に発生するような、プロモータのことであ る。「真菌応答性プロモータ」という語はさらに、真菌感染部位をとり囲む、好 ましくはこれを直接とり囲む植物の細胞内で、実質的に選択的に、好ましくは排 他的に本発明の第１の外来性ＤＮＡの転写に向ける上で、少なくとも同様に有効 であり、好ましくははるかに有効である真菌応答性プロモータの部分（以下「プ ロモータ有効部分」と呼ぶ）をも包含している。本発明の好ましい真菌応答性プ ロモータは、二二旦ユ遺伝子特に２匡」とＬ：」２遺伝子のプロモータ、特定的 にはヌクレオチド１と６９６の間の５ＥＱＩＤ番号１内のユニＬ上ニュブロモー タのフラグメントのプロモータ有効部分である。ＳＥＱ　ＩＤ番号ｌのヌクレオ チドｌと６９６の間のＬ二ニュー１プロモータの好ましいプロモータ有効部分は 、ＳＥＱ　ＩＤ番号１のヌクレオチド２９５と６９６の間にある部分、例えば５ ＥＱＩＤ番号１のヌクレオチド２９５と５６７の間にある部分である。二二二± 二エブロモー夕のこのようなプロモータ有効部分は、真菌感染部位を直接とり囲 む植物細胞内のより優れた発現選択性、及び／又は真菌感染に応答して真菌感染 部位を直接とり囲む植物細胞内の第１の外来性ＤＮＡの発現レベルの強化を提供 することができると考えられている。実際に、ＳＥＱ　ＩＤ番号ｌのヌクレオチ ド位置２９５と５６７の間のＬＬ！±二１プロモータは、より優れた選択性と発 現レベルの強化を提供するものであることがわかっている。

「人工的過敏性細胞死滅」というのは、形質転換を受ける植物に対して本発明の 第１のキメラ遺伝子により付与され、しかも真菌病原体感染部位における植物細 胞の壊死が関与し、かくして真菌のそれ以上の蔓延を制限する植物防衛メカニズ ムのことである。このメカニズムは、共存性のない植物／病原体相互作用におい て発生する自然の過敏性壊死と類似している。

「相同な」というのは、それぞれ類似した、好ましくは基本的に同じアミノ酸又 はヌクレオチド配列を有し、かくして実質的に同じ、好ましくは基本的に同じ、 構造的及び／又は機能的特性を有するタンパク質又は核酸のことである。

本発明の第１の又は第２の外来性ＤＮＡといったＤＮＡ配列に関して「外来性」 という語は、このようなりＮＡが、それが由来した植物、細菌、動物、真菌、ウ ィルスなどの細胞内に天然に見出される状態と比べて、本発明に従ってこのよう なりＮＡで形質転換された植物細胞内で、同じゲノミック環境内にない（例えば 、同じプロモータ及び／又は３′末端に作動的に連鎖されていない）ということ を意味する。

本発明に従うと、本発明の真菌応答性プロモータの制御下にあり、このプロモー タに対してその上流（すなわち５′）末端で融合され、かつその下流（すなわち ３′）末端でポリアデニル化シグナルを含む適当な転写終端（又は調節）シグナ ルに融合されている、少なくとも１つの第１の外来性ＤＮＡを含む本発明の第１ のキメラ遺伝子をその核ゲノム内に安定した形で挿入させるため、既知の要領で 植物細胞を形質転換することにより植物の単細胞から真菌耐性植物を産生ずるこ とができる。好ましくは、第１のキメラ遺伝子の中では、ＴＡＴＡボックス及び 第２のプロモータ（例えば３５Ｓプロモータ）として使用できる構成植物発現可 能プロモータの１つといったようなエンハンサ−などのその他の従来のプロモー タ要素と組合わせて、真菌応答性プロモータのプロモータ有効部分のみが用いら れる。かくして、第１のＲＮＡ及び／又はタンパク質又はポリペプチドは、真菌 感染部位のまわり、好ましくはそれを直接とり囲んでいる植物細胞内で少なくと も優越して、好ましくは実質的に排他的に、特に排他的に産生又は過剰産生され ることになる。

任意には、植物細胞ゲノムは、少なくとも真菌感染部位をとり囲む細胞以外で、 第１の外来性ＤＮＡが発現される植物の細胞内で、好ましくは真菌感染部位を直 接とり囲む細胞以外で、第１の外来性ＤＮＡが発現される植物細胞内で、実質的 に選択的に、第２の外来性ＤＮＡの発現を誘導することのできる第２のプロモー タの制御下にあり、このプロモータに対しその５′末端で融合され、その３′末 端でポリアデニル化シグナルを含む適当な転写終端シグナルに融合されている、 少なくとも１つの第２の外来性ＤＮＡを含む第２のキメラ遺伝子を用いて安定し た形で形質転換されつる。第２のキメラ遺伝子は、形質転換された植物細胞から 再生された植物の子孫内への第１及び第２のキメラ遺伝子の両方の同時分離を高 い確実性で保証するべく、第１のキメラ遺伝子と同じ遺伝子座の中にある。しか しながらい（つかのケースにおいては、このような同時分離はつねに望ましいわ けではなく、第２のキメラ遺伝子は第１のキメラ遺伝子とは異なる遺伝子座にあ る可能性がある。

本発明に従うと、第１のキメラ遺伝子内の第１の外来性ＤＮＡは、真菌感染部位 をとり囲む、好ましくはこれを直接とり囲む植物細胞内で産生又は過剰産生され た時点で、ａ）このようなとり囲む植物細胞を殺すか又は少な（ともその代謝、 機能及び／又は発達を著しく妨害して人工的過敏性細胞死滅を誘発し、かくして 侵入する真菌のそれ以上の蔓延を制限する；及び／又はｂ）このようなとり囲む 細胞をさらに感染させた時点で真菌を殺すか、不能状態にするか又は忌避する第 １のＲＮＡ及び／又はタンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子又はＤＮ Ａフラグメントである。第１の外米性ＤＮＡは好ましくは、例えば、とり囲む植 物細胞を殺すか又は少なくともその代謝、機能及び／又は発達を著しく妨害する ことのできる、ＲＮアーゼＴ１又はバルナーゼのようなＲＮアーゼ；エンドヌク レアーゼのようなりＮアーゼ（例えば旦旦ｏＲＩ）；パパインのようなプロテア ーゼ；　Ａ　ｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍのＴ−ＤＮＡの遺伝子工及び遺伝子２の遺 伝子産物又はインペンテニルトランスフェラーゼのような植物ホルモンの合成を 触媒する酵素；グルカナーゼ；リパーゼ；脂質ペルオキシダーゼ；植物細胞壁阻 害物質；又はジフテリア毒素又はボッリンのＡフラグメントのような毒素をコー ドする。このような第１の外来性ＤＮＡのその他の好ましい例としては、とり囲 む植物細胞の代謝、機能及び／又は発達にとって必須の産物をコードする遺伝子 に対し、相補的なＲＮＡをコードするアンチセンスＤＮＡがある。第１の外来性 ＤＮＡは同様に、好ましくは、真菌を殺すか、忌避するか又は不能状態にするこ とのできる、真菌細胞壁の加水分解を触媒するキチナーゼ及びβ−１，３グルカ ナーゼのような溶菌酵素；プロテアーゼ阻害物質（Ｒｙａｎ、　１９９０）　； 及びレクチン（Ｂｒｏｅｋａｅｒｔ　ｅｔ　ａｌ、　１９８９）　；ならびに、 トウモロコシから分離された小さい塩基性ペプチドＣＭＩＩＩ　（欧州特許公報 （ＥＰ）４６５００９）及びオスモチン様タンパク質（ＥＰ４６０７５３）のよ うな抗菌活性をもつその他の植物タンパク質、ならびにＢｒｏｅｋａｅｒｔ　ｅ ｔ　ａｌ、により　（１９９２）　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　３１．４３０８ −４３１４に記述されたＡｍａｒａｎｔｈｕｓ　ｃａｕｄａｔｕｓ種子からの抗 菌性ペプチド、Ｃａｍｍｕｅ　ｅｔ　ａｌにより　（１９９２）　Ｊ、　Ｂｉｏ ｌ、　Ｃｈｅａｐ、　２６７、２２８−２２３３に記述されたＭｉｒａｂｉｌｉ ｓ　’ａｌａ　ａ種子からの抗菌性ペプチド、ＰＣＴ公報ＷＯ９１／１９７３８ 　（Ｓｃｈｅｌｌｅｔａｌ）に記述されたＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｇｉｇａｎｔ ｅｕｓからの抗菌性ペプチド、ＥＰ４６５００９に記述されたトウモロコシ種子 からの塩基性ペプチド、Ｔｅｒｒａｓ　ｅｔ　ａｌにより（１９９２）、　Ｊ、 　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、　２６７、１５３０１−１５３０９に記述されたハツ カダイコンから得られたＲｓ−ＡＦＰタンパク質、及びフィトアレキシンをコー ドする遺伝子（Ｈａｉｎ　ｅｔ　ａｌ、　Ｎａｔｕｒｅ　３６１．１５３）など の第１のポリペプチド又はタンパク質をコードする。第１の外来性ＤＮＡは同様 に、ＰＣＴ公報ＷＯ９１／１５５８５に記述されているような無毒性遺伝子（例 えばａｖｒ９遺伝子）及び／又は相応する耐性遺伝子（例えば旦工旦遺伝子）で もありうる。

本発明の第１のキメラ遺伝子の中で、このような第１の外来性ＤＮＡで形質転換 された植物は、過敏性応答を提供することになる、真菌感染部位をとり囲む、好 ましくはこれを直接取り囲むその植物細胞の実質的に選択的な形での植物の真菌 応答性分解を理由として、或は又、例えば、真菌感染部位をとり囲む好ましくは これを直接とり囲む植物細胞によりインサイチュ（ｉｎ　５ｉｔｕ）で実質的に 選択的に産生される真菌毒素によって真菌が殺されるか、忌避されるか又は不能 状態にされることになるという理由により、真菌感染に対する耐性をもつことに なる。

真菌感染部位をとり囲む、好ましくはこれを直接とり囲む細胞内で、実質的に排 他的に、好ましくは排他的に本発明の第１の外来性ＤＮＡの発現を制御するのに 使用することのできる本発明の真菌応答性プロモータ及びその有効部分は、真菌 感染植物の細胞内で周知の要領で同定し分離することができる。例えば、適切な 真菌応答性プロモータを、各々の植物について以下のプロセス段階により、真菌 による感染を受けた単数又は複数の植物、好ましくは２つ以上の植物（例えば、 セイヨウアブラナ、トウモロコシ及びジャガイモ）の中で同定し分離することが 可能である：１、真菌感染植物のｃＤＮＡライブラリを構築し、ｃＤＮＡライブ ラリを分別スクリーニングに付すことにより、その真菌感染の後のみに植物の組 織内（例えば葉）に高レベルで存在するｍ　ＲＮ　Ａを探索する段階、 ２、真菌応答性ｍＲＮＡに相応するｃＤＮＡを分離する段階（真菌応答性ｃＤＮ Ａは同様にＨｏｄｇｅ　ｅｔ　ａｌ　［１９９０］の方法によっても分離するこ とができる）； ３、真菌応答性ｍＲＮＡをコードするＤＮＡを含む植物ゲノム内の領域を同定す るべく、プローブとしてこのｃＤＮＡを用いる段階；そしてその後、 ４、このＤＮＡより上流（すなわち５′）にあり、このＤＮＡの真菌応答性プロ モータをコードする植物ゲノムの部分を同定する段階。

この方法によりジャガイモから得られる好ましい真菌応答性プロモータは、Ｌ二 ■ユ遺伝子、特に２二ニュー１遺伝子のブロモ−・夕、特定的にはＳＥＱ　ＩＤ 番号１のヌクレオチド１と６９６の間にあるそのプロモータ有効部分、きわめて 特定的には、ＳＥＱ。

ＩＤ番号１のヌクレオチド２９５と６９６の間のそのプロモータ有効部分、さら にきわめて特定的には、ＳＥＱ　ＩＤ番号１のヌクレオチド２９５と５６７の間 のプロモータ有効部分である。驚くべきことに、真菌応答性２」」とＬ：」２プ ロモータは、熱ショック、創傷、光（例えば紫外線）又は重金属塩でのインキュ ベーションによって誘発され得ない（しかしながら、未変性全長Ｐ」」とよ＝」 エブロモータはＣｄ　ＣＱ　＊により誘発可能である）。例えば二二二↓二エブ ロモータ及びそのプロモータ有効部分に対して相同な本発明のその他の真菌応答 性プロモータは、従来の要領でハイブリダイゼーションプローブとしてＳＥＱ　 ＩＤ番号ｌのヌクレオチド１と６９６の間のプロモータフラグメント、又は好ま しくはそのプロモータ有効部分を用いてその他の植物（例えばナタネ、トウモロ コシなど）のゲラミックＤＮＡ内で同定されつると信じられている。

本発明の第１のキメラ遺伝子内の真菌応答性プロモータが、真菌感染部位を直接 とり囲む植物の細胞に対して１００％特異的でない場合、及び特定的には第１の 外来性ＤＮＡが、植物細胞を殺すか又は植物細胞の代謝、機能及び／又は発達を 著しく不利に妨害する第１のＲＮＡ、ポリペプチド又はタンパク質をコードする 場合、植物細胞ゲノムは、その核ゲノムがその中に安定した形で組込まれた形で 本発明の第２のすなわち回復キメラ遺伝子を含むように、さらに形質転換される ことが好ましい。第２のキメラ遺伝子の第２のプロモータは、少なくとも真菌感 染部位をとり囲む細胞以外の実質的に全ての植物細胞内で、又好ましくは少なく とも真菌感染部位を直接とり囲む細胞以外の実質的に全ての植物細胞内で、発現 された第１の外来性ＤＮＡ又はあらゆる第１のＲＮＡ、タンパク質又はポリペプ チドを阻害又は好ましくは失活させるため第２のＲＮＡ、タンパク質又はポリペ プチドの充分に高い発現レベルを提供するべく、第２の外来性ＤＮＡの転写に向 けることができるように選択される。

適当な植物発現可能な第２のプロモータの例としては、分離株ＣＭ１８４１　（ Ｇａｒｄｎｅｒ　ｅｔ　ａｌ、　１９８１）、　ＣａｂｂＢ−Ｓ　（Ｆｒａｎｃ ｋ　ｅｔａｌ、　１９８０）及びＣａｂｂＢ−ＪＩ　（Ｈｕｌｌ及びＨｏｗｅｌ ｌ、　１９８７）のカリフラワーモザイクウィルスの強い構成３５Ｓプロモータ ；比較的弱い構成ｎｏｓプロモータ（Ｄｅ　Ｐｉｃｋｅｒ　ｅｔ　ａｌ、　１９ ８２）　；及びＴ−ＤＮＡのそれぞれ１′及び２′遺伝子の発現を駆動するＴＲ Ｉ’及びＴＲ２′プロモータといった創傷誘発性プロモータ（Ｖｅｌｔｅｎ　ｅ ｔａｌ、　１９８４）がある。代替的には、真菌による感染を受けていないもの のそれでも第１の外来性ＤＮＡが発現されているような単数又は複数の植物組織 又は器官（例えば葉）、特に特定的な組織又は器官（例えば板端）に対し特異的 な第２のプロモータを利用することができ、かくして第２のキメラ遺伝子は、こ のような特定的植物組織又は器官の中でのみ発現されることになる。もう１つの 代替案は、その発現が誘発可能（例えば温度又は化学的因子により）であるプロ モータを使用することにある。

本発明に従うと、第２のキメラ遺伝子中の第２の外来性ＤＮＡは、植物の細胞内 で産生又は過剰産生された時点で、このような細胞の中で発現されたあらゆる第 １のＲＮＡ、タンパク質又はポリペプチド或いは、第１の外来性ＤＮＡを阻害す るか又は好ましくは失活させる、特に第１のＲＮＡ、タンパク質又はポリペプチ ドがこのような細胞を殺すか又はその代謝、機能又は発達を著しく不利に妨害す ることになる、第２のＲＮＡ及び／又はタンパク質又はポリペプチドをコードす る遺伝子又はＤＮＡフラグメントである。第２の外来性ＤＮＡは好ましくは、例 えば、（あらゆるグアニン残基の後の結合を加水分解することによってＲＮＡ分 子を分解する）バルナーゼの活性を中和するｂａｒｓｔａｒ　；エンドヌクレア ーゼＥｃｏＲＩの活性を妨げるＥｃｏＲＩメチラーゼ；又はパパインのようなプ ロテアーゼの活性を中和するプロテアーゼ阻害物質（例えば、パパインチモーゲ ン及びパパイン活性タンパク質）をコードする。第２の外来性ＤＮＡのもう１つ の好ましい例は、センス第１　ＲＮＡのストランドに対して相補的なものとなる アンチセンス第２ＲＮＡの１本のストランドをコードする（例えばＥＰ２２３３ ９９に記述されているとおり）。

本発明の第１及び第２のキメラ遺伝子において、３′転写終結シグナル又は３′ 末端は、植物細胞内でｍＲＮＡの適正な転写終端及びポリアデニル化を提供する ことのできるものの中から選択されつる。転写終結シグナルは、転写されるべき 第１及び第２の外来性ＤＮＡの天然のものであてもよいし、外来性であってもよ い。外来性３′転写終結シグナルの例としては、オクトビン−シンターゼ遺伝子 のもの（Ｇｉｅｌｅｎ　ｅｔ　ａｌ、　１９８４）及びＴ−ＤＮＡ遺伝子７のも の（Ｖｅｌｔｅｎ及び５ｃｈｅｌｌ、　１９８５）がある。

植物特にアグロバクテリウムによる感染を受けることのできる植物の細胞のゲノ ムは、本発明の第１のキメラ遺伝子、そして任意に第２のキメラ遺伝子を含みア グロバクテリウムにより運ばれる無力化されたＴｉ−プラスミドであるベクター を用いて形質転換されつる。この形質転換は、例えばＥＰ１１６，７１８、ＥＰ ２７０．８２２及びＧｏｕｌｄ　ｅｔ　ａｌ　（１９９１）に記述された手順を 用いて行なうことができる。好ましいＴｉ−プラスミドベクターは、Ｔｉ−プラ スミドのＴ−ＤＮＡの右辺縁配列の左側に少なくとも位置づけされているか又は 辺縁配列の間の第１及び第２のキメラ遺伝子を内含している。当然のことながら 、直接的遺伝子トランスファ（例えばＥＰ２３３，２４７中に記述されている） 、花粉媒介形質転換（例えばＥＰ２７０，３５６、ＰＣＴ公報ＷＯ８５１０１８ ５６及び米国特許４，６８４，６１１に記述されている）、植物ＲＮＡウィルス 媒介形質転換（例えばＥＰ６７５５３及び米国特許４４０７９５６に記述されて いる）及びリポソーム媒介形質転換（例えば米国特許４，５３６，４７５に記述 されている）といった手順を用いて、植物細胞を形質転換するためにその他のタ イプのベクターを使用することも可能である。形質転換しようとする植物がトウ モロコシである場合、例えば、Ｆｒｏｍｎ　ｅｔ　ａｌ　（１９９０）及びＧｏ ｒｄｏｎ−Ｋａｍａ＋　ｅｔ　ａｌ　（１９９０）が成る系統のトウモロコシに ついて記述した方法、及びＰＣＴ公報ＷＯ９２１０９６９６中に記述されている 穀物についての方法といった、さらに最近になって開発された方法を使用するこ とが好まれる。このとき、結果として得られた形質転換済みの植物細胞は、従来 の要領で、形質転換植物を再生するのに使用することができる。

本発明の第１及び第２のキメラ遺伝子が、植物ゲノム内の同じ遺伝子座の中、好 ましくは真菌応答性の第２のプロモータのシス作用性要素の間での干渉が最小限 となる構成にて挿入されることが好ましい。従って、単一のＤＮＡ片として第１ 及び第２のキメラ遺伝子を植物ゲノムにトランスファし、かくして植物のゲノム 内の単一の遺伝子座へのそれらの挿入を導くことが好ましい。しかしながら、２ つのキメラ遺伝子を含む植物を、以下の方法で得ることも可能である１すなわち 、 ■、キメラ遺伝子を独立した形質転換手順で別々の植物の核ゲノムに個別にトラ ンスファすることができ、その後交雑を通して単一の植物ゲノム内で組合せるこ とができる。

２、多数の遺伝子座でのそれぞれのキメラ遺伝子の挿入を導（同じ形質転換手順 （同時形質転換）で、単一の植物のゲノムに対してキメラ遺伝子を別々にトラン スファすることができる。

３．２つのキメラ遺伝子のうちの一方を、すでにもう１つのキメラ遺伝子により 形質転換された植物のゲノムにトランスファすることができる。

好ましくは、第１及び第２のキメラ遺伝子は各々、従来のキメラ標識遺伝子と同 じ遺伝子座の中の植物細胞ゲノム内に挿入される。

キメラ標識遺伝子は適切には、第２のプロモータとして使用できる構成プロモー タの１つのような第３の植物発現可能プロモータの制御下にあり、しかもこのプ ロモータに５′末端で融合され、その３′末端において、第１又は第２のキメラ 遺伝子内で使用されつるような、適切な植物転写終結シグナルに融合されている 標識ＤＮＡを含める可能性がある。標識ＤＮＡは、好ましくは、植物の細胞内で 発現されたとき、第３のＲＮＡ、タンパク質又はポリペプチドが中で発現されて いない細胞から前記細胞を容易に分離することができるようにする第３のＲＮＡ 及び／又はタンパク質又はポリペプチドをコードする。第１及び第２のキメラ遺 伝子が植物細胞ゲノムに別々にトランスファされる場合、各々のキメラ遺伝子は 好ましくはキメラ標識遺伝子と共にトランスファされる。標識ＤＮＡの選択はさ ほど重要ではな（、周知の要領で適切な標識ＤＮＡを選択することができる。例 えば、標識ＤＮＡは、ジヒドロケルセチン−４−１／ダクターゼをコードするＡ １遺伝子のような形質転換された植物細胞に識別可能な色を提供する（Ｍｅｙｅ ｒ　ｅｔ　ａｌ、１９８７）か又は、カナマイシン耐性をコードするｎｅｏ遺伝 子のように形質転換された植物細胞に対して抗生物質耐性を提供することのでき る（ＥＰ１３１６２３）タンパク質をコードすることができる。

第１及び第２のキメラ遺伝子のコーディング領域ならびにキメラ標識遺伝子のコ ーディング領域は、当然のことながら、例えば植物内での高い発現レベルを得る 目的で、自然に発生するＤＮＡ或いは合成又は人工のＤＮＡ配列を各々含んでい る。このような人工的ＤＮＡは、好ましくは相応する自然に発生するＤＮＡによ ってコードされるタンパク質と実質的に同じ特性をもった実質的に同じタンパク 質をコードする。

結果として得られる形質転換された植物は、同じ特徴をもつさらに多くの形質転 換植物を産生ずるため、又は同じ又は関連する植物種のその他の変種の中に第１ のキメラ遺伝子及び任意に第２のキメラ遺伝子を導入するために、従来の育種ス キーマの中で使用することができる。形質転換された植物から得られる種子は、 安定したゲノミックインサートとして本発明のキメラ遺伝子を含んでいる。

以下の例は、ＳＥＱ　ＩＤ番号１のＰ」」と上：」２遺伝子の真菌応答性プロモ ータのフラグメントのプロモータ有効部分の分離と特徴づけ及び真菌耐性植物を 提供するためのこのようなプロモータ有効部分の使用について記述している。例 中に相反する記載のないかぎり、全ての核酸操作は、Ｓａｍｈｒｏｏｋ　ｅｔ　 ａｌ、　クローニング：！二三土工丑、第２版、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａ ｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ。

ＮＹ　（１９８９）に記述された標準的手順により行なわれる。

以下の例においては、次の図面及び配列表が参照される。

区血Ω又単皇脱灰 区↓：例１の異なる非生物的刺激に応えてのＰＲＰｌｍＲＮＡの蓄積パターンで ある。形質転換されていないジャガイモ栽培品種Ｄａｔｕｒａの葉を、処置の開 始後指示された時間に収穫した。図版Ａは真菌培養ろ液での刺激を示す０図版Ｂ は、機械的創傷による刺激を示す（「Ｃ」は、真菌の胞子を用いたジャガイモ栽 培品種Ｄａｔｕｒｅからの葉の接種から３６時間後の共存性ある相互作用におけ るＰＡＬとＰＲＰｌｍＲＮＡの間の比率を示す対照である）。図版Ｃは、植物の 暗順応の後の白色光に対する応答を示している。図版りは、４０℃における葉の 熱処理を示す（Ｒｅｃ、は１８℃での回復である）。各々の図版において、ル− ンにつき２０悶の合計ＲＮＡが負荷され、各パネルの左側にマークされているよ うに、ＰＲＰＩ及びＰＡＬのためのＤＮＡプローブ又はＨ３Ｐ７０のためのアン チセンスＲＮＡを用いてハイブリッド形成された。相応する転写の長さは、各図 版の右側に示されている。

区旦：例２において使用されたベクター及びそのＤＮＡインサートの概略図であ る。図版Ａは、プロモータ及びエンハンサ−テストベクターｐＰＴＶｇｕｓ及び ｐＥＴＶｇｕｓを示している；図版Ｂは、ｐＰＴＶｇｕｓ及びｐＥＴＶｇｕｓの 多重クローニング領域内のＥｃｏＲＩ及びＸｂａＩ分割部位（下線あり）の間の ｐｒｐｌ−１プロモータ、３５Ｓプロモータ及び／又はＧＵＳ遺伝子の部分を含 む異なるＤＮＡインサートを示す。図版ＡではＰｓｔＩ及び５ａｌＩを除いて制 限エンドヌクレアーゼのためのｐＰＴＶｇｕｓ及びｐＥＴＶｇｕｓ内の全ての表 示された分割部位は、唯一のものである；Ａｐ’／Ｃｂ’は、アンピシリン及び カルベニシリン耐性についての遺伝子を表わす、ＧＵＳは、β−グルクロニダー ゼをコードするＥ、　ｃｏｌｉ　ｕｉｄＡ遺伝子である。ＨＰＴは、ハイグロマ イシンホスフォトランスフェラーゼ遺伝子である。ＬＢ及びＲＢは、それぞれ左 側及び右側のＴ−ＤＮＡ辺縁部である。Ｐ３５ＳはＣａＭＶ３旦玉遺伝子ＴＡＴ Ａ−ボックス領域（位置−４６〜＋８）である；　ｐ　Ａ　ｘｃ及びｐＡｎ、、 は、それぞれエントウ豆ｒｂｃｓ−３ｃのポリアデニル化シグナル及びアグロバ クテリウムノパリンシンターゼ遺伝子である＋Ｐｎ０１１は、ツバリンシンター ゼプロモータである；　Ｏｒｌ　ｃｏ　Ｉ　Ｅ　＋はプラスミドＣｏ１Ｅ１の複 製起点である；ｏｒｉアは、接合性Ｔｉ−プラスミドトランスファの起源である ；又Ｏｒ　ＬｖはＴｉ−プラスミド複製の起源である。

ｐＰＴＶｇｕｓ及びＰＥＴＶｇｕｓ内に挿入されＧＵＳ遺伝子の発現を制御する ために用いられるＬ二旦エニュブロモー夕の部分の終点は、図版Ｂ中にマークさ れている（ｒ−６９６Ｊは、５ＥＱＩＤ番号１内のヌクレオチド１にあり、ｒ− ４０２Ｊは、５ＥＱＩＤ番号１内のヌクレオチド２９５にある）。図版Ｂ中のＰ ＧＯ及びＥＧＯは、ＬＬ■上ニュプロモータの部分の無い、ｐｐＴｖｇｕｓ及び ｐＥＴＶｇｕｓ中の対照インサートを表わす。図版ＢのＬ二！上ニュブロモータ フラグメントの中で、垂直な棒は、推定のＬ二！土ニュＴＡＴＡボックスを示す 。

区ｌ：例２中のＰｈ　ｔｏ　ｈｔｈｏｒａ　１ｎｆｅｓｔａｎｓ種４の接種によ り、４８時間後のＥＧ２７形質転換体の葉の中のＧＵＳ活性の組織化学的位置確 認。ＧＵＳを発現する組織は、Ｘ−ＧＬＵＣでの葉の染色及びエタノールでの色 素の透明化の後のインディゴブルー染料の沈着物により認識される。図Ａは、液 滴感染された小葉の外観であり、図Ｂは、壊死性接種部位の拡大図である。

区Ａ：例２のＰ、　１ｎｆｅｓｔａｎｓによる感染後（共存性相互作用）の個々 の形質転換体内の転写の蓄積。ＲＮＡは、水での処理（Ｗ）から４８時間後又は 真菌胞子の接種（ｃ）から４８時間後の葉から分離された。ル−ンあたり２０＆ ４の合計ＲＮＡを負荷し、ＧＵＳ又はＰＲＰｌｍＲＮＡに特異的なりＮＡプロー ブを用いてハイブリッド形成させた。図版Ａは、ＰＧ４２系列の独立した形質転 換体からのＲＮＡを示す。図版Ｂは、ＥＧ２７系列の独立した形質転換体からの ＲＮＡを示す。図版Ｃは、表示された接種後時間に分離された、ＰＧ４２植物Ｐ Ｇ４２０１及びＥＧ２７植物ＥＧ２７０６からのＲＮＡを示す。

【剋去 真菌応答性ジャガイモ遺伝子ｒ」」とよ：」１及びヌクレオチド１〜１９７２の そのプロモータのフラグメントのＤＮＡ配列。ｍユニプロモータフラグメントは ヌクレオチドｌからヌクレオチド６９６まで広がっている。

１　：　ｒ　ｌ゛　ハ　の さまざまな環境シグナルによる刺激の時点で二二ュユ遺伝子から派生する転写の 蓄積を、ＲＮＡ−プロットハイブリダイゼーション実験により分析した。ジャガ イモ栽培品種Ｄａｔｕｒａの葉をＬｉｎｆｅｓｔａｎｓ種１又は４の胞子懸濁液 で液滴接種し、結果として、共存性（宿主感受性／真菌毒性）又は非共存性（宿 主耐性／真菌無毒性）相互作用が得られた。感染過程中のＰＲＰｌｍＲＮＡの定 常状態レベルの変化を、もう１つの防衛関連タンパク質、フェニルアラニンアン モニアリアーゼ（ｒＰＡＬＪ　）をコードするｍＲＮＡの蓄積と並行して測定し た。共存性相互作用において接種より４時間後に、すでに、ＰＲＰ１ｍＲＮＡ濃 度の増大が検出できた；最大転写レベルには、接種より２４〜３６時間後に到達 する。非共存性相互作用においては、ＰＲＰｌｍＲＮＡの蓄積はまず接種から１ ２〜１８時間後に検出可能であるが、同様に接種より約２４時間後にその最大に 達する；非共存性相互作用において存在するＰＲＰ　１ｍ　ＲＮ　Ａの絶対量は 、共存性相互作用におけるよりもはるかに低い。感染の時間的経過中のＰＡＬｍ ＲＮＡ定常状態レベルのグラフは、ＰＲＰｌｍＲＮＡについて見い出されるもの と並行している（Ｔａｙｌｏｒ　ｅｔ　ａｌ、、　１９９０）。図ＩＡに示され るように、ＰＲＰＩｍＲＮＡ転写レベルは同様に、Ｐ、　１ｎｆｅｓｔａｎｓか らの培養ろ液誘い出す物質を用いたジャガイモの葉のインキュベーションの時点 でも増大する。

異なる非生物的環境刺激に対するｐｒｐｌ遺伝子の応答をテストするため、創傷 及び白色光での照明の後のｍＲＮＡ蓄積パターンをテストした。葉の機械的損傷 時点では、ＰＲＰ１ｍＲＮＡ濃度の著しい変化は全（観察されなかったが、一方 、ＩＬ±−特異プローブとハイブリッド形成するｍＲＮＡの量はこれらの条件下 で急速にかつ過渡的に増加した（図ＩＢ）。同様に、ＰＲＰ１ｍＲＮＡ濃度は、 ジャガイモの葉の暗順応の７２時間中及びその後の４８時間にわたるこれらの葉 の白色光による照明の間、低いレベルにとどまつたが、このような暗順応の間Ｐ ＡＬｍＲＮＡの量は減少し、次に植物が白色光に露出された時点で増大した（図 ＩＣ）。

且二且エニュ遺伝子及び大豆垣且■旦亙遺伝子のコーディング領域の間の構造的 類似性ならびにＬＬＬ上ニュプロモータ中の熱シヨツク要素様の配列の存在のた め、ジャガイモ栽培品種Ｄａｔｕｒａの葉の中のＬＬ旦ユ遺伝子系統群の発現に 対する熱処理の影響も同様にテストした。トウモロコシＨｓｐ７０ＲＮＡと相同 な転写の急速かつ過渡的な蓄積へと導いた３９℃の温度で、ＲＮＡ−プロットハ イブリダイゼーション実験（図ＩＤ）では２ニエユ遺伝子の明白な応答性は全く 検出されなかった。

真菌感染の時点での比較的特異なＰＲＰ１ｍＲＮＡ蓄積は、ｐｒｐｌ−１遺伝子 ならびにｐｒｐｌ遺伝子系統群のその他のメンバーを、疫病の発達の間にジャガ イモ中の転写活性化を提供することのできるシス作用性要素を提供するための理 想的な候補とするように思われる。

２：　八　ｒ　１−１゛　のプロモータ　の　と丘徴ゴリ ジャガイモ栽培品種Ｄａｔｕｒａ及びＤｅｓｉｒｅｅの植物（それぞれ耐性遺伝 子Ｒ１及びＲＯを運ぶＳｏｌａｎｕｍ　ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ　Ｌ）を、１８℃で 一日あたり１６時間の日射時間で温室内で６週間上の中で成育させた。これらの 植物の成熟した切断葉を、Ｐｈ　ｔｏ　ｈｔｈｏｒａ　１ｎｆｅｓｔａｎｓ種４ からの２０４の水性胞子懸濁液（１０４の胞子）又は精製水のいずれかを１５〜 ２０滴用いて、背軸側から接種し、次に、無菌水道水の入ったバイアル中に入れ た；１６時間／１８時間の明／暗型で、１８℃、相対湿度７０％で小さい成長チ ャンバ内でインキュベーションを行なった。さまざまな時間の後、接種部位をコ ルク穿孔器を用いて穿孔し、液体窒素内で凍結させた。

Ｔａｙｌｏｒ　ｅｔ　ａｌ　（１９９０）により記述されているとおり、ｐｒｐ ｌ−１ｃＤＮＡクローンを分離した。ｐｒｐｌ−１ｃＤＮＡクローンに相応する 遺伝子の調節配列を支持するゲラミックＤＮＡクローンを分離するため、ジャガ イモＣＶ、（栽培品種）　ＤａｔｕｒａＤ　Ｎ　Ａがらゲノミックライブラリを 構築した。ライブラリをスクリーニングするためのプローブとして真菌応答性ｐ ｒｐｌ−１ｃＤＮＡを使用した。、３つのゲノミッククローンを分離した。その うちの２つは同一であるように思われた。ｃＤＮＡに存在しない５′部分を検出 した。ｐｒｐｌ−１ｃＤＮＡ又は末端標識づけされたｍＲＮＡでハイブリッド形 成する領域を同定し配列決定した。各々のゲノミッククローンの相同性領域の５ ′末端において、真菌応答性プロモータ領域を位置設定するため、ＡＴＧ翻訳開 始コドン及びＴＡＴＡコンセンサス配列を同定した。

リポータ−遺伝子としてＥ、　ｃｏｌｉ　ｕｉｄＡ遺伝子（ｌ旦旦）を含む、図 ２のプロモータ及びエンハンサ−テストベクター、ｐｐ”ｒｖベクターｐＰｃＶ ８１１内の右側Ｔ−ＤＮＡ辺縁部に近い４５０ｂｐのＸｈｏ　Ｉ／Ａｐａ　Ｉ　 （Ｋｏｎｃｚ　ｅｔ　ａｌ、　１９８９）を欠失させ、が（して２つのＢｓｔＥ ｒ　Ｉ部位のうちの１つを除去した。この修正されたベクターの５ａＩＩ／Ｂｓ ｔＥＩＩフラグメントを、ｇｕｓを含むプラスミドｐＢ１１０１の５ａｉｌ／Ｅ ｃｏＲＩフラグメントで置換しくＪｅｆｆｅｒｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ、　１９８７ ）、か（してｐＰＴＶｇｕｓ　（図２）を作り上げた。

エンハンサ−テストベクターｐＥＴＶｇｕｓの構築のためには、Ｃａ　Ｍ　Ｖ　 ３旦５ＴＡＴＡボツクス領域（位置−４６〜＋８）、ＧＵＳ−コーディング遺伝 子及びエントウ豆ｒｂｃＳ−３ｃ３　’　−末端を網羅するＢｇｍ／ＥｃｏＲＩ フラグメントによって、修正されたプラスミドｐＰＣＶ８１１のＢｇＩＩ［／Ｂ ｓｔＥＩＩフラグメントを置換させた（Ｂｅｎｆｅｙ及びＣｈｕａ、　１９９０ ）。ゲノミッククローンラムダ５ｔ１２８の中に含まれている２１」とよ：」２ の５′−フランキング領域（Ｔａｙｌｏｒ　ｅｔ　ａｌ、　１９９０）を、７２ ２ｂｐの長いＥｃｏＲＩ／５ｔｙｒフラグメントとして切除し、ＥｃｏＲＩ−及 びＳｍａ　Ｉ　−消化されたプラスミドｐ　Ｂ　Ｓ　（＋　）　（Ｓｔｒａｔａ ｇｅｎｅ、　ＬａＪｏｌｌａ、　ＵＳＡ）にサブクローニングさせた；ベクター のＳｍａＩ部位との平滑末端連結状態に、インサートのｓｔｙ　Ｉ部位を維持し た。このクローニング段階は、中間プラスミドｐＢＳ７２−１を生み出した。こ のプラスミドからのＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩフラグメントの５ａｕ３Ａ１分割は 、４２８ｂｐの５ａｕ３ＡＩ／ＢａｍＨＩサブフラグメントという結果をもたら した；このフラグメントをＢａｍＨＩを介してベクターｐＢＳ　（＋）の中に挿 入し、中間プラスミドｐＢＳ４２−１及びｐＢ５４２−２（２つの考えられる方 向性）が得られた。

これら２つのプラスミドは、推定のＴＡＴＡボックス配列を除去するためゲラミ ック３′−末端から始めて、２」」と上：」２インサートのＢａ１３Ｉ処理のた めに利用した。まず第１に、Ｂａ１３１での処理及びＸｂａ　Ｉ又はＥｃｏＲＩ リンカ−の付加の後、それぞれＸｂａＩ及びＥｃｏＲＩを用いてｐＢＳ４２−１ 及びｐＢＳ４２−２を分割し、その後の再連結の結果、プラスミドｐＢＳ２７− １及びｐＢＳ２８−２が得られた。プラスミドｐＢＳ２７−１及びｐＢＳ４２− １中の二二且上ニュブロモータ領域をＥｃｏＲＩ／ＸｂａＩフラグメントとして 切除し、ＥｃｏＲＩ／ＸｂａＩ−消化されたプロモータテストベクターｐＰＴＶ ｇｕｓ　（図２）に連結させて、それぞれ構成体ＰＧ７２及びＰＧ４２を収容す る転写ｒｌ−１ｕｓ−遺伝子融合ブラスミドｐＰＴＶｇｕｓ７２−１及びｐＰＴ Ｖｇｕｓ４２−１を得た。プラスミドｐＢＳ２７−１及びｐＢ３２８−２のＥｃ ｏＲＩ／ＸｂａＩフラグメントをエンハンサテストベクターｐＥＴＶｇｕｓ内の ＣａＭＶ３５ＳＴＡＴＡボックス領域の適当なポリリンカ一部位５′末端（図２ ）内に挿入して、それぞれ構成体ＥＧ２７及びＥＧ２８を含むプラスミドｐＥＴ Ｖｇｕｓ２７−１及びｐＥＴＶｇｕｓ２８−２を得た。

結果として得られたキメラ構成体を、ジャガイモ栽培品種Ｄｅｓｉｒｅｅ（ＲＯ ）中にトランスファさせた。これに関しては、植物形質転換のためのプラスミド は、Ｅ、　ｃｏｌｉ菌株５１７−１からヘルパープラスミドｐＭＰ９０ＲＫを収 容するＡ　ｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ菌株Ｃ５８Ｃ１−Ｇ Ｖ３１０１へと動員された（Ｋｏｎｃｚ　ｅｔ　ａｌ、　１９８９）ｅ次に、転 写活性化を付与するさまざまなプロモータフラグメントの能力を、水（対照）で の処理及び、共存性相互作用という結果をもたらすＰ、　１ｎｆｅｓｔａｎｓ種 ４の胞子懸濁液での接種の後の形質転換されたＤｅｓｉｒｅｅの葉の中で測定し た。まず第１に、ＧＵＳ活性レベルで発現パターンを検定した。構成体１つにつ き６〜１ｏの独立した形質転換体の個体群をテストした；各植物から、３枚の成 葉に接種し、最終的に合計６０の接種部位を生み出した。全ての構成体は、水で の葉の処理の時点で低いＧＵＳ活性しか示さなかった。しかしながら、真菌胞子 の接種から４８時間後には、最高６倍及び１８倍のＧＵＳ活性がＰＧ４２−及び ＥＧ２７−植物の葉の中にそれぞれ発見された（表１）。構成体ＥＧ２８を収容 するいくつかの形質転換体の中にもＧＵＳ活性のわずかな誘導可能性が観察され た。構成体ＰＧ７２、ＰＧＯ又はＥＧＯを含む植物の中では、ＧＵＳ活性は、真 菌感染時点で水処理のレベルにとどまっていた（表１）。

ゲノミックＤＮＡを用いたサザンハイブリダイゼーション実験は、これらの植物 全てが実際に形質転換されていたことを立証した。

ＥＧ２７構成体を支持する植物内のＧＵＳ活性の空間的パターンは、最も活性な 代表（ＥＧ２７０６）の組織化学的分析によって決定した。感染を受けた小葉に 、ＧＬＩＳ基質Ｘ−ＧＬＵＣを含む溶液を浸潤させた。接種より４８時間後に、 ＧＵＳ活性は、青色染色によって示された壊死性接種部位の中又はそのすぐ近（ で検出可能であった（図３）。ＥＧＯ系列の遺伝子導入植物からの感染を受けた 葉の中では、接種部位のいかなる染色も観察されず、かくして、ＥＧ２７代表の 小葉の中のＧＵＳ活性が真菌に由来するものでないことを立証していた。

構成体ＰＧ４２とＥＧ２７の誘発性転写についても同様に、ｍＲＮＡ蓄積のレベ ルでテストした。真菌の胞子が接種されたが又は水で処理された相応する植物の 葉からの全ＲＮＡを、ＧＵＳ又はＰＲＰｌｍＲＮＡに対し特異なプローブを用い てハイブリッド形成した。図４は、これらのノーザンハイブリダーゼーション実 験の結果を示している。ＰＧ４２系列の全ての独立した形質転換体及びＥＧ２７ 系列の７つの形質転換体のうちの５つにおいて、ＰＲＰＩ及びＧＵＳ写しレベル は、Ｐ、　１ｎｆｅｓｔａｎｓ種４の胞子での葉の接種から４８時間以内に増大 した；ＰＲＰｌｍＲＮＡの著しく高い絶対量は、キメラ構成体と比べた場合にｐ ｒｐｌ遺伝子のコピー数の方が多いためである（すなわち１０〜１５対１〜２） と考えられる。対照構成体ＰＧＯ及びＥＧＯは、誘発されない又は誘発された状 態のいずれにおいても検出可能なレベルのＧＵＳｍＲＮＡを導かなかった。

構成体ＰＧ４２及びＥＧ２７により付与される転写活性の時間的推移を決定する ため、接種後早い時点から始めて、個々の形質転換体（ＰＧ４２０１及びＥＧ２ ７０６）の転写の蓄積を追跡調査した（図４０）、接種から２時間後にＧＵＳｍ ＲＮＡが最初に検出され、接種から４８時間後まで、転写レベルは定常的に増大 した。定量的に、感染中のＧＵＳ及びＰＲＰｌｍＲＮＡの蓄積の動態は非常に類 似している（図４Ｃ）。

ＧＬＩＳ、ノーザンプロット及び組織化学分析により、２７３ｂｐ−３５３プロ モータフラグメント（ＥＧ２７植物中）が、創傷、Ｃｄ　ＣＩ２ｍ処理、熱ショ ック（４０℃で１時間）及び白色光での照明（５，２００１ｕｘ）の時点で活性 化されないことが確認された。

比較すると、ＰＡＬ発現は、白色光での暗順応された葉の照明及び創傷によって 誘発されることがわかり、未変性ＬＬ！エニュブロモータは、ＣｄＣｊ２．処理 の後に誘発を示した。真菌感染、真菌誘引（惹起）調製剤、サルチル酸（０，１ ｏＭ、実験開始から４時間後）そしてはるかに程度は低いもののサイトカイニン 及びインドール−３−酢酸（両方共６時間、５０ｐＭ）だけが、ジャガイモ植物 内で２７３ｂｐ−３５Ｐプロモータにより応答を誘発することができた。真菌感 染に対する応答は急速であり、厳密に局在化されており、感染を受けていない組 織中の唯一の活性は機端に見られた。構成的に発現されたｂａｒｓｔａｒ遺伝子 を伴う植物内で多（の健康な再生体が得られたことから、バルナーゼの板端内の 発現は植物の再生及び成長を著しく妨害するとは思われなかった。乃を凹±ｔｏ ｒａ活性化を誘発することがわかった。

これらの結果は、５ＥＱ−ＩＤ番号１内の位置２９５と５６７の間のｐｒｐｌ　 １　５’　−末端配列が、Ｐ、　１ｎｆｅｓｔａｎｓ及びその他の真菌とのジャ ガイモの共存性及び非共存在相互作用内の急速でかつ厳密に局在化された転写活 性化に充分なシス作用性要素を含んでいるということを示している。位置−４６ と＋８の間のＣａＭＶ３５旦配列からの非相同ＴＡＴＡボックス領域とのプロモ ーターセグメントの組合せの後、この機能は維持され、特異性は増大しさえする 。しかしながら、平均して構成体ＰＧ４２は、構成体ＥＧ２７よりも、病原体に よる刺激の前に高い全体的ＧＵＳ活性及びｍ　ＲＮ　Ａレベルを付与した。驚く べきことに、ＳＥＱ　ＩＤ番号１中の位置１及び２９４の間の配列の上流にｐｒ ｐｌ−１を付加することにより（構成体ＰＧ７２）　、真菌感染時点での転写活 性化は遮断され、これはこの領域内に負のシス作用性要素が存在することを示唆 している。

３：盲　ン　ベクターの 以下に詳述するように、次に植物形質転換ベクターを構築するべく本発明の第２ のキメラ遺伝子と共に用いられる本発明の第１のキメラ遺伝子を構築するために 、例２のｚユニ上ニュ遺伝子から誘導される２つのプロモータフラグメントを使 用した。１方の２二旦ユニ上プロモータは、ＳＥＱ、ＩＤ番号１内のヌクレオチ ド２９５からヌクレオチド７２２までのＬニュ土ニュ遺伝子の５′領域の４２８ ｂｐのフラグメントから成り、もう１方のユニり上ニュブロモータフラグメント は、５ＥＱＩＤ番号１中のヌクレオチド２９５からヌクレオチド５６７までのＬ Ｌ２土ニュ遺伝子の５′領域の２７３ｂｐ及びＣａＭＶ３５Ｓプロモータのヌク レオチド−４６からヌクレオチド＋８までの最小ＣａＭＶ３旦旦プロモータフラ グメントで構成されている（Ｂｅｎｆｅｙ　ｅｔ　ａｌ、　１９９０　ａ、　ｂ ）。プロモータフラグメントの各々は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｍ　１ｏｌｉ　ｕ ｅｆａｃｉｅｎｓがらのバルナーゼをコードする第１の外来性ＤＮＡの上流で、 かつこの外来性ＤＮＡと同じ転写ユニットの中にある（Ｈａｒｔｌｅｙ、　１９ ８８）、第１の外来性ＤＮＡの下流には、ツバリンシンターゼ遺伝子から２６０ ｂｐ工立且■フラグメントとして分離されたツバリンシンターゼ遺伝子の３′未 翻訳末端（ｒ３’　ｎｏｓＪ　）がある（Ｇｉｅｌｅｎ　ｅｔ　ａｌ。

１９８４）　。この結果、ｒｐＰＲＰｌ−バルナーゼ−３’　ｎｏｓＪ及びｒ　 ｐ　Ｐ　ＲＰ　１　／　３５　Ｓ−バルナーゼ−３’　ｎｏｓＪと呼称される２ つのキメラ遺伝子構成体が得られた。これらの第１のキメラ遺伝子は、Ｄｅｂｌ ａｅｒｅ　ｅｔ　ａｌ　（１９８７）が記述しているように植物の形質転換に適 したベクターｐＧＶ９４１のＴ−ＤＮＡ辺縁反復の間に導入された。このベクタ ーは、ツバリンシンターゼプロモータ（ｒｐｎｏｓＪ　；Ｄｅｐｉｃｋｅｒｅｔ ａｌ、　１９８２）　、Ｔｎ５　（Ｂｅｃｋｅｔａｌ。

１９８２）からのｎｅｏコーディング領域及び、オクトビンシンターゼ遺伝子（ Ｇｉｅｌｅｎ　ｅｔ　ａｌ、　１９８４）からの７０６ｂｐＰｖｕＩＩフラグメ ントに相応するオクトビンシンターゼ遺伝子の３′未翻訳末端（ｒ３’　ｏｃｓ Ｊ　）を含むキメラ標識遺伝子を含んでいる。このキメラｒｐｎｏｓ−ｎｅｏ− ３′ｏｃｓＪ遺伝子の構築については、Ｈａｉｎ　ｅｔ　ａｌ　（１９８５）に よって、及びＥＰ３５９６１７に記述されている。

第１のキメラ遺伝子は同様に、以下に詳述するように本発明の第２のキメラ遺伝 子と共に、Ｔ−ＤＮＡベクター、ｐＧＶ９４１内に導入された。第２のキメラ遺 伝子は、ｂａｒｓｔａｒコーディング領域（Ｈａｒｔｌｅｙ、　１９８８）に融 合されたＣａＭＶ３５Ｓプロモータ（ＥＰ３５９６１７）、及び転写終結及びポ リアデニル化のためのシグナルを支持するＴ−ＤＮＡ遺伝子７の３′未翻訳末端 （３′　ｇ７）を含む（Ｖｅｌｔｅｎ　ａｎｄ　５ｃｈｅｌｌ、　１９８５）ａ バルナーゼ遺伝子を含む本発明の第１のキメラ遺伝子の構築は、以下のとおりで あった。ｐＧＥＭ２のポリリンカー領域内でクローニングされたキメラＰＴＡ２ ９−バルバーゼー３′ｎｏｓ遺伝子構成体を含む中間プラスミドベクターｐＣＶ ３が構築された（Ｐｒｏｍｅｇａ、　Ｍａｄｉｓｏｎ、　ＷＩ、　ＵＳＡ）。タ バコのタペート組織に特異的なプロモータＰＴＡ２９の制御下でバルナーゼコー ディング領域を支持する構成体ｐＴＴＭ８については、ＥＰ３４４０２９に記述 されている。ＰＴＡ２９−バルナーゼフラグメントをｐＴＴＭ８からのＥｃｏＲ Ｉフラグメントとして検索し、ｐＧＥＭ２ポリリンカー内に挿入した。ベクター 内でクローニングされたＴＡ２９−バルナーゼフラグメントから誘導されるよう なバルナーゼ遺伝子の発現を妨げるため、ｂａｒｓｔａｒ遺伝子を同様にｐＧＥ Ｍ２のポリリンカー領域内でクローニングさせた。このようにして、微生物宿主 内のバルナーゼをコードするＤＮＡフラグメントの発現によりひき起こされる細 菌宿主内の潜在的な致死効果が避けられる。独自のプロモータの制御下にあるｂ ａｒｓｔａｒ遺伝子は、ｐＭＴ４１６からのＸｂａｌフラグメントとして得られ た（Ｈａｒｔｌｅｙ、　１９８ｇ）。ポリリンカー領域内の両方のフラグメント のクローニングは、プロモータ領域の５′末端に局在化された唯一のＥｃｏＲＩ 部位及びバルナーゼコーディング領域のＡＴＧ開始コドンと重複するＮｃｏ　Ｉ 部位を用いて、ＴＡ２９プロモータフラグメントをＬ二且上二エブロモータフラ グメントで容易に置換することができるような形で設計された。

ＰＲＰ　１−１及びＰＲＰＩ−１／３５Ｓプロモータフラグメントを、それぞれ Ｘ　ｂ　ａ　Ｉ　／　Ｅ　ｃ　ｏ　ＲＩフラグメント及びＨｉｎｄｌｌｌ／Ｅｃ ｏＲＩフラグメントとしてプラスミドｐＢＳ４２−１及びｐＥＴＶＧＵｓ２７− １　（図２から）から分離した。連結のため。

Ｘｂａｌ及びＨｉｎｄＩ［［５’　−突出末端には、フレノウＤＮＡポリメラー ゼを充てんし、この末端をバルナーゼコーディング領域のＡＴＧコドンにてフレ ノウ充てんされたＮｃｏ　Ｉ末端に連結させた。こうしてそれぞれ、ｐＰＲＰｌ −バルナーゼ−３”　ｎｏｓの第１のキメラ遺伝子構成体を支持するプラスミド ｒｐｃＶ４Ｊ及びｐＰＲＰｌ／３５Ｓ−バルナーゼ−３’　ｎｏｓの第１のキメ ラ遺伝子構成体を支持するプラスミドｐｃＶ１１が生み出された。

本発明の上述の第１のキメラ遺伝子、キメラ標識遺伝子及び任意に本発明の第２ のキメラ遺伝子を含むＴ−ＤＮＡ植物形質転換ベクターは、以下のとおりに構築 された。すなわち、各々の第１のキメラ遺伝子をＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩフ ラグメントとして検索し、Ｔ−ＤＮＡベクター、ｐＴＴＭ８　（ＥＰ３４４，０ ２９）内でクローニングした。第１のキメラ遺伝子構成体を支持するＴ−ＤＮＡ ベクターを得るために、ｐＴＴＭ８をＥｃｏＲＩ及び５ｎａＢＩで消化して、そ のキメラバルナーゼ遺伝子及びｓｆ工遺伝子（ＥＰ２４２２３６）Ｉ成体を除去 した。ｐＴＴＭ８ベクター内のそれぞれの第１のキメラ遺伝子構成体のクローニ ングにより、Ｔ−ＤＮＡベクター、ｐＴｃｖｌ　３及びｐＴｃｖｌ４が生成され た。これらのベクターは、Ｔ−ＤＮＡの末端辺縁反復の間でクローニングされた キメラ標識遺伝子（ｐｎｏｓ−ｎｅｏ−３’　ｏｃｓ）及びキメラバルナーゼ遺 伝子（それぞれｐＰＲＰｌ−バルナーゼ−３’　ｎｏｓ又はｐ　Ｐ　ＲＰ　１　 ／　３５　Ｓ−バルナーゼ−３′ｎｏｓ）を含んでいる。

同様に本発明の第２のキメラ遺伝子を支持するＴ−ＤＮＡ植物形質転換ベクター を構築するためには、ｐ”ｒｃｖｌ　３及びｐ’ｒｃｖ１４の中に、ＣａＭＶ３ ５Ｓ−ｂａｒｓｔａｒ　−３′　ｇ７遺伝子構成体を含むＤＮＡフラグメントを 導入した。これに関して、ＣａＭＶ３５Ｓ　−ｂａｒｓｔａｒ　−３’　ｇ７キ メラ遺伝子は、ＥＰ４１２９１１に記されているように、ｂａｒｓｔａｒ遺伝子 を支持する構成体から出発して以下のとおりに構築された。部位特異的突然変異 誘発によりこの構成体のＡＴＧコドンにてＣｌａｌ部位を導入した（ＥＰ３１９ ３５３）。次に、結果として得られた構成体からＣ１ａｌ／Ｈｉｎｄｍフラグメ ントとしてｂａｒｓｔａｒ遺伝子を分離した。

ｂａｒｓｔａｒ遺伝子フラグメントをその５′末端でＣａＭＶ３５Ｓプロモータ フラグメントに連結させ、Ｔ−ＤＮＡ遺伝子から転写終結及びポリアデニル化の ためのシグナルを具備させた。この目的のため、ＣｌＡｌ／ＨｉｎｎｄＩＩＩｂ ａｒｓｔａｒ遺伝子フラグメントをベクターｐＧｓＪ２８０内でクローニングさ せ（Ｄｅｂｌａｅｒｅ　ｅｔ　ａｌ。

１９８７）　、　ＣｌＡｌ及びＢａｍＨＩで消化させた。連結のため、ＢａｍＨ Ｉ及びＨｉｎｄＩＩＩ突出末端に、フレノウＤＮＡポリメラーゼを充てんした。

結果として得られたプラスミド、ｐＴＴＭ７は、５ｃａＩ部位がフラグメントの ＣａＭＶ３５Ｓプロモータの５′末端に局在化され、５ｎａＢＩ部位がフラグメ ントの３′　ｇ７から下流に局在化されている状態で、５ｃａＩ／５ｎａＢＩフ ラグメントとして検索されたキメラＣａＭＶ　３５　Ｓ　−ｂａｒｓｔａｒ　− ３′ｇ　７遺伝子構成体を支持している。このフラグメントをフレノウＤＮＡポ リメラーゼで処理し、Ｔ−ＤＮＡ領域の２つのキメラ遺伝子の間に局在化されて いるｐＴｃｖｌ３とｐＴｃｖｌ４（７）平滑ＥｃｏＲＩ部位の中でクローニング させた。こうして、Ｔ−ＤＮＡ辺縁反復の間に３つのキメラ遺伝子、すなわちｐ ｎｏｓ−ｎｅｏ−３’　ｏｃｓ、ＣａＭＶ３５Ｓ−ｂａｒｓｔａｒ　−３’　ｇ ７及びｐ　Ｐ　ＲＰ　１−ｂａｒｎａｓｅ　−３’　ｎｏｓ又はｐＰＲＰｌ／３ ５Ｓ−ｂａｒｈａｓｅ　−３′ｎｏｓを支持す６Ｔ−ＤＮＡベクター、ｐＴｃＶ １５及びｐＴＣＶｌ　６が生み出された。ベクターｐＴＣＶ１７は、キメラ遺伝 子ＣａＭＶ３５Ｓ−ｂａｒｓｔａｒ　−３′ｇ　７が相対する方向性を有し、Ｌ Ｌ旦ユニー３５３プロモータフラグメントらさらに離れて３５３プロモータを有 するという点を除いて、ｐＴｃＶ１６に類似している。このベクターは、ハイグ ロマイシン耐性遺伝子がキメラユｅｏ遺伝子で置換されているという点を除いて 、図２のｐＰＴＶｇｕｓベクターと同一である。

上述の手順を用いて、Ｂｒｏｅｃｋａｅｒｔ　ｅｔ　ａｌ　（１９８９）からの レクチンを用い、ｒｐｒｐｌ−１−レクチン−３′ｎｏｓＪと呼ばれる第１のキ メラ遺伝子を含む植物形質転換ベクターも構築する。

４：　３の１１　’　＜　２９−　’ｋ　ｔ　６　Ａｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔ ｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ　を　いたジャＪゴ孟及μよイｊり’７；’５＋（１）１ 厘転換 ジャガイモ及びセイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ　凹：拒）の形質転換及び その中での主要な発現を得るため、例３の植物形質転換ベクターは、各々、Ｄｅ ｂｌａｅｒｅ　ｅｔ　ａｌ　（１９８５）により記述されているとおり無毒性Ｔ ｉプラスミドｐＧＶ２２６０を支持するＡ　ｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔ、ｕｍｅ ｆａｃｉｅｎｓ菌株Ｃ５８ＣＩ　Ｒｉ　ｆＲ内に結集される。トランス接合体を サザンブロッティングで分析する。それぞれのアグロバクテリウム菌株は、Ｄｅ Ｂｌｏｃｋ　ｅｔ　ａｌ　（１９８７）により記述されているような塊茎円盤感 染を用いてジャガイモ植物（Ｓｏｌａｎ　ｍ　ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ　ｃｖｓ。

Ｂｉｎｔ、ｊｅ及びＤｅｓｉｒｅ）を形質転換するため、及びＤｅＢｌｏｃｋ　 ｅｔ　ａｌ（１９８９）により記述されている方法を用いてセイヨウアブラナを 形質転換するために使用される。１００ｇ／−のカナマイシンを含む培地上で形 質転換されたカルスを選択し、耐性あるカルスを植物に再生させる。各々の形質 転換実験について、約１０の個々の形質転換を再生させ、遺伝子組込みパターン についてサザンブロッティングにより分析する。

例２の真菌応答性！」」と１＝」、プロモータフラグメントを含む、本発明の真 菌応答性の第１のキメラ遺伝子で形質転換された植物は、形質転換を受けていな い対照植物に比べて、はるかに高い真菌感染耐性レベル特に匹ハ匹里血昆」バ朋 印朋感染耐性レベルを示す。その結果、形質転換された植物は、対照植物に比べ てはるかに低い収量損失を有する。

バルナーゼキメラ遺伝子とｂａｒｓｔａｒキメラ遺伝子（植物ＤＳＴ２２−６及 びＤＳＴ９−３）の両方を含むベクターで形質転換された成る種の植物は、真菌 感染時点でその地金てのものよりもはるかに優れた実績を示した（表２）。これ らの系統の葉は、Ｐｈ　ｔｏ　ｈｔ、ｏｒａ　１ｎｆｅｓｔａｎｓを接種した後 、真菌感染の徴候の開始特に胞子形成及び感染部位の蔓延において著しい遅延を 示した（種１）。対照植物と比較した場合、真菌胞子形成は、感染後７日目でさ え著しく阻害されていた。胞子形成の後ひきつづき、ジャガイモの葉の底面側に ２０μの液滴（２Ｘ１０’〜５Ｘ１０’個の胞子／−を用いる場合）を塗布する ことにより、真菌感染後にステレオスコープ検査を行なった。水中に葉を維持し た後、ステレオスコープ下での目視により真菌の成長及び胞子形成を追跡調査す ることができた。系統９−３の葉においては、壊死性「褐色化」ゾーンが、キメ ラｐｒｐｌ−１−ｇｕｓ遺伝子を含む対照植物又は形質転換されていない対照植 物のいずれの場合よりも緩慢に蔓延していることがわかった。真菌感染部位にお いて実質的に特異的にバルナーゼを発現する本発明の形質転換されたＢｊ、ｎｔ ｊｅ植物は、形質転換を受けていない植物に比較した場合、著しく高い真菌感染 耐性を明らかに示し２ている。病害耐性表現型は、ＲＮＡ数量化及び分離子孫に おける表現型の評価に基づく分子分析によって確認される。

言うまでもないことであるが、本発明の真菌応答性プロモータ及びキメラ遺伝子 の使用は、何らかの特異的植物の形質転換に制限されるわけではない。このよう なプロモータ及びキメラ遺伝子は、プロモータが遺伝子発現を制御することがで きる場合、好ましくはこのような発現が真菌感染部位を直接とり囲む植物細胞内 にて豊富に発生するべきである場合に、アルファルファ、トウモロコシ、綿、テ ンサイ、アブラナ属野菜、トマト、大豆、小麦又はトマトといったあらゆる作物 を形質転換する上で有効でありうる。

同様に、本発明の真菌応答性プロモータの使用は、特定の第］の外来性ＤＮＡの 制御に制限されるわけではな（、植物中のあらゆる外来性遺伝子又はＤＮＡフラ グメントの発現を制御するのに使用することができる。

さらに、本発明は、前述の例で記述した特異的真菌応答性ユニ旦上ニュブロモー タ及びプロモータフラグメントに制限されるわけではない。むしろ、本発明は、 真菌感染部位を直接とり囲む植物細胞中で少なくとも実質的に選択的に第１の外 来性ＤＮＡといった構造遺伝子の発現を制御するために使用することのできる、 その他のＰ」二Ｐ」４プロモータのような、例中のものに匹敵するプロモータ及 びプロモータフラグメントを包含している。実際、実施例のＬＬ二±ニュブロモ ータ及びプロモータフラグメントのＤＮＡ配列は、その修正が、修正された状態 のプロモータを認識するべく真菌感染部位を直接とり囲む植物細胞の転写活性化 体を含むポリメラーゼ複合体の能力を実質的に変えないことを条件として、その ヌクレオチドのいくつかをその他のヌクレオチドと置換することにより修正する ことが可能である。

さらに又、本発明は、Ｐ、　１ｎｆｅｓｔａｎｓといった匹ハ匹肛匡匹に対して 植物を防御するための本発明の真菌応答性キメラ遺伝子の使用に制限されるわけ ではない。このようなキメラ遺伝子は、一般に植物病原性真菌に対して、特に皿 法泄山コｓｐｐ、団函ｕｍ　ｓｐｐ。

Ｆｕｓａｒｉｕｍ　ｓｐｐ、　５ｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ　ｓｐｐ、　Ｐｕｃｃｉ ｎｉａ　ｓｐｐ、　垣且圏翻ｓｐｐ、Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ　ｓｐｐ、　Ｈｅ１ ｍ１ｎｔｈｏｓ　ｏｒｉｕｍ　ｓｐｐ、　５ｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ植物を防御す るために使用することのできるものである。

表１　遺伝子導入ジャガイモ栽培品種Ｄｅｓｉｒｅ内でのｐｒｐｌ−１／ｕｉｄ Ａ転写融合の発現ＧＵＳ活性（ｐＭｏ１ＭＵ／分／ａｇタンパク質）　倍数形質 転換体　水　真菌胞子　誘発 ☆処理開始より４８時間後；２−４回の独立した感染の平均値表２ 表２の凡例： 植物：　ＤＳＴ２−３は、ｐＴＣｖ１形質転換事象のカナマイシン耐性（ｋｍ” ）植物であり、ＤＳＴ２３−１及び２３−６はそれぞれｐ”ｒｃｖ１５事象のＫ ｍ’″及びカナマイシン感受性（Ｋｍ−）植物であり、ＤＳＴ９−１及び９−３ はそれぞれｐＴｃＶ１７形質転換事象からのＫｍ−及びＫｍ’″植物であり、Ｄ ＳＴ２２−３及び２２−６はそれぞれ、ｐＴｃｖ１７事象からのＫｍ−及びＫｍ ″″植物である。（Ｋｍ−植物は、カナマイシン培地では成長できず、従って機 能的抗生物質耐性遺伝子を含まない選択検定からの漏れた植物である）　、　ｌ ５ｏｌａは、試験されたＰｈ　ｔｏ　ｈｔｏｒａ　１ｎｆｅｓｔａｎｓ品種に対 して天然に耐性をもつジャガイモの変種である。

ずかな胞子形成を示している。

６日目二３７の接種部位のうち５つの部位が、弱〜中の胞子形成を示している。

３７のうちｌＯの接種部位が中位の胞子形成を示している。

＊４日目二６２の接種部位のうち８つの部位が、縁部で非常にわずかな胞子形成 を示している。

５日目＝６２の接種部位のうち６つがわずかな胞子形成を示している。

６日目＝６２の接種部位のうち７つが弱い胞子形成を示している。

目４日目：４４の接種部位のうち４つが、縁部で非常に弱い胞子形成を示してい る。

５日月：接種部域の約５０％がわずかな胞子形成を示している。

（通常の条件下で、約９０％の接種部位が胞子形成を示している。） 評定・ 「０」　：検出不能 「３」：強 参考文献 ＢＥＣＫ　ＥＴ　ＡＬ、、　Ｇｅｎｅ　１９．３３７−３３６　（１９８２）Ｂ ＥＣＫＥＲ−ＡＮＤＲＥ　Ｍ、、　５ＣＨＵＬＺＥ−ＬＥＦＥＲＴ　Ｐ、及びＨ ＡＨＬＢＲＯＣＫ　Ｋ、、　Ｊ。

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ＦＲＩＴＺＥＭＥＩＥＲ，Ｋ、Ｈ，、ＣＲＥＴＩＮ　Ｃ，、ＫＯＭＢＲＩＮＫ　 Ｅ、、　ＲＯＨＷＥＲＦ、。

ＴＡＹＬＯＲＪ、、　５ＣＨＥＥＬ　Ｄ、及びＨＡＨＬＢＲＯＣＫ　Ｋ、、フェ ニルアラニンアンモニア−リアーゼ及び４−クマラントの過渡的誘発：　Ｐｈｙ ｔｏｐｈｔｈｏｒａｉｎｆｅｓｔａｎｓの毒性又は無毒性系統の感染を受けたジ ャガイモの葉の中のＣｏＡリガーゼｍ　ＲＮ　Ａ、　Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｊｏ ｌ、　８５　ｐ３４〜４１　（１９８７）中。

ＦＲＯＭＭ　Ｍ、、　ＭＯＲＲＩＳＨＦ、、　ＡＲＭＳＴＲＯＮＧ　＋’、、、 　ＷＩＬＬＩＡＭＳ　Ｒ，、Ｔｌ（ＯＭＡＳ　Ｊ。

及びＫＬＥＩＮ　Ｔ、、　Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｂ、　８３３−８３ ９　（１９９０）ＧＡＲＤＮＥＲ，ＨＯＷＡＲＤ、　ＨＡＩＩＮ、　ＢＲＯＷＮ −ＬＵＥＤＩ、　５ＨＥＰＡＲＤ及びＭＥＳＳＩＮＧ。

Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ（核酸研究）　９．２８７１− ２８８７　（１９８１）ＧＩＥＬＥＮ　Ｊ、、　ＤＥ　ＢＥＵＣＫＥＬＥＥＲＭ 、、　５ＥＵＲＩＮＣＫ　Ｊ、、　ＤＥＢＯＥＣＫ　Ｆ、、　ＤＥＧＲＥＶＥ　 Ｈ，、ｌ、ＥＭＭＥＲ３Ｍ、、　ＶＡＮ　ＭＯＮＴＡＧＵ　Ｍ、及び５ＣＨＥＬ Ｌ　Ｊ、、　ＥＭＢＯＪ。

３、８３５−８４５　（１９８４） ＧＯＲＤＯＮ−ＫＡＭＭ　Ｗ、、　５ＰＥＮＣＥＲＭ、、　ＭＡＮＧＡＮＯＭ、 、　ＡＤＡＭＳ　Ｔ、、　ＤＡＩＮＥＳＲ，、５ＴＡＲＴ　Ｗ、、　０°ＢＲＩ ＥＮ　Ｊ、、　ＣＨＡＭＢＥＲ３Ｓ、、　ＡＤＡＭＳ　Ｗ、、　ＷＩＬＬＥＴＳ 　Ｎ、。

ＲＩＣＥ　Ｔ、、　ＭＡＣＫＥＹ　Ｃ，、ＫＲＵＥＧＥＲＲ，、ＫＡＵＳＣＨＡ 、　ａｎｄ　ＬＥＭＡＵＸ　Ｐ、。

Ｔｈｅ　Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ１ｌ（植物細胞）　２．６０３−６１８　（１９９０ ）ＧＯＵＬＤ　ＥＴ　ＡＬ、、　Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ（植物生物 学）　９５．４２６−４３４ＨＡＧＥＮ　Ｇ１．　ＵＨＲＨＡＭＭＥＲＮ、及び ＧＵＩＬＦＯＹＬＥ　Ｔ、Ｊ、、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅａｐ。

２６３、　６４４２−６４４６　（１９８８）ＨＡＨＬＢＲＯＣＫ、　Ｋ、及び ５ＣＨＥＥＬ　Ｄ、、　Ａｎｎｕ、　Ｒｅｖ、　Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｃｉ。

Ｐｌａｎｔ　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、４０．　３４７−３６９　（１９８９）ＨＡ ＩＮ　ＥＴ　ＡＬ、、　Ｍｏ１．　Ｇｅｎ、　Ｇｅｎｅｔ、１９９．　１６１− １６８　（１９８５）ＨＡＲＴＬＥＹ　ＥＴ　ＡＬ、、　Ｊｏｕｒｎａｌ　Ｍｏ １．　Ｂｉｏｌ、　２０２．９１３−９１５　（１９８８）。

ＨＡＲＴＬＥＹ及びＲＯＧＥＲＳＯＮ、　Ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ　Ｂｉｏｃｈ ｅｍｉｓｔｒｙ　（標本生化学）　２．２４３〜２５０　（１９７２）ＨＯＤＧ Ｅ　ＥＴ　ＡＬ、、　Ｇｌａｓｇｏｗ　Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ（グラスゴーシンポ ジウム）ｐ、３３　（１９９０９月） ）Ｉ　Ｕ　Ｌ　Ｌ及びＨＯＷＥＬＬ、　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　（ウィルス学）　８ ６．４８２−４９３　（１９８７）ＪＥＦＦＥＲ３ＯＮ　Ｒ，Ａ、、　ＫＡＶＡ ＮＡＧＨＴ、Ａ、及びＢＥＶＡＮ　Ｍ、Ｗ、、　ＥＭＢＯＪ、　６゜ＪＯＯＳ　 Ｈ，−Ｊ、及びＨＡＨＬＢＲＯＣＫ　Ｋ、、　Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅ＋ ＋＋、　２０４．６２１−６２９ＫＯＮＣＺ　Ｃ，、ＭＡＲＴＩＮＩ　Ｎ、、Ｍ ＡＹＥＲＨＯＦＥＲＲ，、ＫＯＮＣＺ−ＫＡＬＭＡＮ　Ｚ、。

ＫＯＲＥＥＲＨ，、ＲＥＤＥＴ　Ｇ、及び５ＣＨＥＬＬ　Ｊ、、　Ｐｒｏｅ、　 Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ。

ＵＳＡ　８６．　８４６７−８４７１　（１９８９）に０ＮＣＺ及び５ＣＨＥＬ Ｌ、　Ｍｏ１．　Ｇｅｎ、　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　２０４．３８３−３９６　（１ ９８６）にＲＡＭＥＲ及びＦＲＩＴＺ、　Ｍｅｅｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏ ｌｏｇｙ　（酵素学方法）　１５４゜３５０　（］、９８８） にＲＯＭＢＲＩＮＫ　Ｅ、、　５ＣＨＲＯＤＥＲＭ、及びＨＡＨＬＢＲＯ（：に 、に、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８５．　７８２−７８６　（１９８８）ＬＡＭＥ　 ＣＪ、、　ＬＡＷＴＯＮ　Ｍ、Ａ、、　ＤＲＯＮ　Ｍ、及びＤＩＸＯＮ　Ｒ，Ａ 、、　Ｃｅ１ｌ　（細胞）　５６．２１５−２２４　（１９８９）ＬＡＰＥＹＲ Ｅ　Ｂ、及びＡＭＡＬＲＩＣＦ、　、　ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａライブラリの調製のため の強力な方法：　１００−に−Ｄａｊ２核小体タンパク質をコードするｃＤＮＡ の分離。Ｇｅｎｅ　（遺伝子）３７．ｐ２１５〜２２０（１９８５）。

ＭＥＹＥＲＥＴ　ＡＬ、、　Ｎａｔｕｒｅ　（ネイチャー）　３３０．６７７− ６７８　（１９８７）Ｏ３）ＩＩＭＡ　Ｍ、、　ＩＴＯＨＨ，、ＭＡＴＳＵＯＫ Ａ　Ｍ、、　ＭＵＲＡＫＡＭＩ　Ｔ、及び０ＨＡＳＨＩ　Ｙ、。

Ｔｈｅ　Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ１ｌ　（植物細胞）　２．９５−１０６　（１９９０ ）ＲＹＡＮＮ　Ｃ，Ａ、、　Ａｎｎｕ、　Ｒｅｖ、　Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌ、 　２８．４２５−４４９　（１９９０）ＳＣＨＭＩＤ　Ｊ、、　ＤＯＥＲＮＥＲ Ｐ、Ｗ、、　ＣＬＯＵＳＥ　Ｓ、Ｄ、、　ＤＩＸＯＮ　Ｒ，Ａ、　ａｎｄ　ＬＡ ＭＢＣ，、ｌ、　Ｔｈｅ　Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ１ｌ　（植物細胞）　２．６１９− ６３１　（１９９０）ＳＴＥＲＭＥＲＢ、Ａ、、　ＳＣＨＭＩＤ　Ｊ、、　ＬＡ ＭＢ　Ｃ，Ｊ、及びＤＩＸＯＮ　Ｒ，Ａ、、　Ｍｏｌ。

Ｐｌａｎｔ−Ｍｉｃｒｏｂｅ　Ｉｎｔｅｒａｃｔ、　３．３８１−３８８　（１ ９９０）ＴＡＹＬＯＲＪ、Ｌ、、　ＦＲＩＴＺＥＭＥＩＥＲＫ、Ｈ，、ＨＡＵＳ ＥＲ１，、ＫＯＭＢＲＩＮＫ　Ｅ、。

ＲＯＨＷＥＦ　Ｆ、、　５ＣＨＲＯＤＥＲＭ、、　ＳＴＲＩＴＴＭＡＴＴＥＲＧ 、及びＨＡＨＬＢＲＯＣＫ　Ｋ、。

Ｍｏ１．　Ｐｌａｎｔ−Ｍｉｃｒｏｂｅ　Ｉｎｔｅｒａｃｔ　３．７２−７７　 （１９９０）ＶＡＮ　ＬＯＯＮ　Ｌ、Ｃ，、Ｐｌａｎｔ　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、 　４．１１１−１１６　（１９８５）ＶＥＬＴＥＮ　Ｊ、及び５ＣＨＥＬＬ　Ｊ 、、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒ１５ｅａｒｃｈ（核酸研究）１３、６９ ８１−６９９８　（１９８５）ＶＥＬＴＥＮ　Ｊ、、　ＶＥＬＴＥＮ　Ｌ、、　 ＨＡＩＮ　Ｒ１及び５ＣＨＥＬＬ　Ｊ、、　ＥＭＢＯＪ、　３゜ＶＩＥＲＬＩＮ Ｇ　Ｅ、、Ａｎｎｕ、Ｒｅｖ、Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ、Ｐｌａｎｔ　Ｍｏ １．Ｂｊ、ｏｌ。

４２、　５７９−６２０　（１９９１）ＷＡＲＤ　Ｅ、Ｒ，ＥＴ　ＡＬ、、　Ｔ ｈｅ　Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ１ｌ　（植物細胞）　３．１０８５−１０９４配烈未 １．一般情報 １）出願人：　ＰＬＡＮＴ　ＧＥＮＥＴＩＣＳＹＳＴＥＭＳ　Ｎ、Ｖ。

ｌ）発明の名称：真菌応答性キメラ遺伝子ｉ）配列番号＝１ １ｖ）通信用住所： Ａ、宛て先：　Ｐｌａｎｔ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｓｙｓｔｅｍｓ、　Ｎ、Ｖ。

Ｂ、通り名：　Ｐｌａｔｅａｕｓｔｒａａｔ　２２゜Ｃ１郵便番号及び都市名： 　９０００ＧｈｅｎｔＤ０国名：ベルギー Ｖ）コンピュータ読取り可能書式： Ａ、メディアのタイプ、５．２５インチ、２ＨＤ　１．２Ｍｂフロッピーディス ク Ｂ、コンビエータ：Ｉ’ＢＭ　ＰＣ／ＡＴＣ１演算システム：ＤＯＳバージョン ３．３Ｄ、ソフトウェア：　Ｗｏｒｄ　ｐｅｒｆｅｃｔｖｌ）原稿出願データ： 利用不可 ｖｉｉ）先行出願データ：該当せず ＳＥＱ　ＩＤ番号１ 配列タイプ：ヌクレオチド 配列長さ：１，９７２ｂｐ 鎖状態：２本鎖 トポロジー：直鎖状 分子タイプ：　ＤＮＡ 供給源：ジャガイモ 生体：ジャガイモ栽培品種Ｄａｔｕｒａ特徴ニー　位置７５１にＡＴＧ翻訳開始 コドン−位置１８０９にＬＩＧＡ停止コドン −位置６４３に推定上のＴＡＴＡボックスの５′末端−位置１−６にＥｃｏＲＩ 部位（下線入り）−位置２９５−２９８に５ａｕ３ＡＩ部位（下線入り）。

特性：真菌応答性ジャガイモ遺伝子ｍ上二１Ｆｉａｕｒｅ　１ 塁ミニ」 Ｆｉａｕｒｅ　４ 接種後時間（１１） フロントベージの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，’　識別記号　庁内整理番号／／　Ｃｌ２Ｐ　２１ １０２　Ｃ９２８２−４ＢＩ

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. １．真菌感染から防御する目的で植物を形質転換するのに適した真菌応答性キメ ラ遺伝子において、 ａ）特定的にはＰｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ（例えばＰ．ｉｎｆｅｓｔａｎｓ）な らびにＣｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ（例えばＣ．ｆｌｕｖｕｍ）のような植物病原 性真菌である真菌による植物の感染部位をとり囲む、好ましくはこれを直接とり 囲む植物細胞内で、少なくとも実質的に選択的に、好ましくは選択的に外来性Ｄ ＮＡの転写に向けることのできる真菌応答性プロモータ、好ましくはＰｒＰｌプ ロモータ、特にＰｒＰｌ−１プロモータ、特定的にはヌクレオチド１と６９６の 間のＳＥＱＩＤ番号１のｐｒｐ１−１プロモータフラグメントのプロモータ有効 部分、きわめて特定的にはヌクレオチドおよそ２９５と６９６の間のプロモータ 有効部分、例えばＳＥＱＩＤ番号１のヌクレオチドおよそ２９５と５６７の間の そのプロモータ有効部分、ｂ）前記真菌感染部位をとり囲む、好ましくはこれを 直接とり囲む植物細胞内で産生又は過剰産生された時点で、ｉ）この真間菌を殺 すか、不能状態にするか又は忌避する、或いは（ｉｉ）前記真菌感染部位をとり 囲む、好ましくは直接とり囲む植物細胞を殺すか又は少なくともその代謝、機能 及び／又は発達を著しく妨害して、その真菌のそれ以上の蔓延を制限する、第１ のＲＮＡ及び／又はタンパク質又はポリペプチドをコードする第１の外来性ＤＮ Ａ；及びｃ）前記真菌感染部位をとり囲む、好ましくは直接とり囲む植物の細胞 内で、前記第１の外来性ＤＮＡを発現するための適切な３′転写終結シクナル、 という作動的に連鎖されたＤＮＡ配列を含む、真菌応答性キメラ遺伝子。
2. ２．請求の範囲第１項に記載の、真菌応答性キメラ遺伝子で形質転換された植物 細胞又は植物細胞培養物。
3. ３．請求の範囲第２項に記載の、植物細胞で特に構成されている植物又はその種 子。
4. ４．前記真菌応答性プロモータが、前記真菌感染部位を直接とり囲む植物細胞内 で、単に実質的に選択的に前記第１の外来性ＤＮＡの転写に向けられ、好ましく は真菌応答性キメラ遺伝子と同じ遺伝子座内に回復キメラ遺伝子を含み、この回 復キメラ遺伝子が、ａ）少なくとも前記真菌感染部位をとり囲むもの以外の植物 の細胞内、好ましくは少なくともこの真菌感染部位を直接とり囲むもの以外の植 物の細胞内で、外来性ＤＮＡの転写に向けることのできる、構成（例えば３５Ｓ ）プロモータといった第２のプロモータ； ｂ）植物の少なくとも前記その他の細胞内で、産生又は過剰産生された時点で、 植物の少なくともこのその他の細胞内で、第１の外来性ＤＮＡ又は第１のＲＮＡ 或いはタンパク質又はポリペプチドを阻害又は失活させることのできる、第２の ＲＮＡ及び／又はタンパク質又はポリペプチドをコードする第２の外来性ＤＮＡ ；及びｃ）植物の少なくとも前記その他の細胞内で、前記第２の外来性ＤＮＡを 発現するための適当な３′転写終結シグナル、といった作動的に連鎖されたＤＮ Ａ配列を有している、請求の範囲第３項に記載の植物又はその種子。
5. ５．請求の範囲第４項に記載の、植物の細胞又は基本的にこれらの細胞から成る 細胞培養物。
6. ６．請求の範囲第３項又は第４項に記載の、植物のゲノム。
7. ７．真菌、特定的には植物病原性真菌、例えばＰｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ（例え ばＰ．ｉｎｆｅｓｔａｎｓ）ならびにＣｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ．Ｐｙｔｈｉｕ ｍｓｐｐ．Ｆｕｓａｒｉｕｍｓｐｐ．，Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａｓｐｐ，Ｐｕｃ ｃｉｎｉａｓｐｐ，Ｕｓｔｉｌａｇｏｓｐｐ．Ａｌｔｅｒｎａｒｉａｓｐｐ，Ｈ ｅｌｍｉｎｔｈｏｓｐｏｒｉｕｍｓｐｐ．，Ｐｙｒｅｎｏｐｅｒｉｚａｂｒａｓ ｓｉｃａｅ，Ｃｙｌｉｎｄｒｏｓｐｏｒｉｕｍ　ｃｏｎｃｅｎｔｒｉｃｕｍ．Ｐ ｈｏｍａ　ｌｉｎｇａｍ．Ｌｅｐｔｏｓｐａｅｒｉａ　ｍａｃｕｌａｎｓ，Ｂｏ ｔｒｙｔｉｓ　ｃｉｎｅｒｅａ，Ｅｒｙｓｉｐｈｅｃｒｕｃｉｆｅｒｏｒｕｍ． Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ　ｐａｒａｓｉｔｉｃａ，Ｐｌａｓｍｏｄｉｏｐｈｏｒ ａｂｒａｓｓｉｃａｅ，Ｐｓｅｕｄｏｃｅｒｃｏｓｐｏｒｅｌｌａ　ｃａｐｓｅ ｌｌａ，Ｓｅｐｔｏｒｉａｓｐｐ．Ｐｙｒｅｎｏｐｈｏｒａｓｐｐ，Ｕｓｔｉｌ ａｇｏｓｐｐ．Ｂｏｔｒｙｔｉｓｓｐｐ．及びＥｒｙｓｉｐｈｅｓｐｐ．に対す る耐性を植物に付与するための方法において、請求の範囲第１項に記載の真菌応 答性キメラ遺伝子、及び任意に請求の範囲第４項に記載の回復キメラ遺伝子を用 いて、植物の核ゲノムを形質転換する段階を含む方法。