FR2766206A1 - Gene chimere codant pour la drosomycine, vecteur le contenant pour la transformation des cellules vegetales et plantes transformees obtenues resistantes aux maladies - Google Patents
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Abstract
La présente invention a pour objet un gène chimère contenant une séquence d'ADN codant pour la drosomycine, un vecteur contenant le gène chimère, un procédé pour la transformation des plantes et les plantes transformées.La drosomycine produite par les plantes transformées leur confère une résistance aux maladies, en particulier d'origine fongique.
Description
Gène chimère codant pour la drosomycine, vecteur le contenant pour la tranformation
des cellules végétales et plantes transformées obtenues résistantes aux maladies
La présente invention a pour objet une séquence d'ADN codant pour la drosomycine, un gène chimère la contenant, un vecteur contenant le gène chimère et un procédé pour la transformation des plantes et les plantes transformées résistantes aux maladies.
des cellules végétales et plantes transformées obtenues résistantes aux maladies
La présente invention a pour objet une séquence d'ADN codant pour la drosomycine, un gène chimère la contenant, un vecteur contenant le gène chimère et un procédé pour la transformation des plantes et les plantes transformées résistantes aux maladies.
Il existe aujourd'hui un besoin grandissant de rendre les plantes résistantes contre les maladies notamment fongiques afin de diminuer, voire d'éviter, d'avoir recours à des traitements avec des produits de protection antifongiques, en vue de protéger l'environnement. Un moyen d'augmenter cette résistance aux maladies consiste à transformer les plantes de manière qu'elles produisent des substances à même d'assurer leur défense contre ces maladies.
On connaît différentes substances d'origine naturelle, en particulier des peptides, présentant des propriétés bactéricides ou fongicides, notamment contre les champignons responsables des maladies des plantes. Toutefois, le problème consiste à trouver de telles substances qui pourront non seulement être produites par des plantes transformées, mais encore conserver leurs propriétés bactéricides ou fongicides et les conférer aux dites plantes. Au sens de la présente invention, on entend par bactéricide ou fongicide tant les propriétés bactéricides ou fongicides proprement dites que les propriétés bactériostatiques ou fongistatiques.
La drosomycine est un peptide produit par les larves et adultes de drosophiles par induction à la suite d'une blessure septique ou de l'injection d'une faible dose de bactéries. Ce peptide a été décrit comme présentant certaines propriétés antifongiques et antibactériennes in vitro, notamment dans la demande de brevet français 2 725 992, où le peptide est obtenu par induction sur les drosophiles et purification. Le gène codant pour le dit peptide a également été décrit par Fehlbaum & coll. (1994). La possibilité d'intégrer ce gène à une plante pour lui conférer une résistance aux maladies d'origine fongique ou bactérienne n'a toutefois pas été décrite à ce jour.
On a maintenant trouvé que le gène de la drosomycine pouvait être inséré dans une plante pour lui conférer des propriétés de résistance aux maladies fongiques et aux maladies d'origine bactérienne, apportant une solution particulièrement avantageuse au problème énoncé ci-dessus.
L'invention a donc d'abord pour objet un gène chimère comprenant une séquence ADN codant pour la drosomycine ainsi que des éléments de régulation en position 5' et 3' hétérologues pouvant fonctionner dans les plantes et un vecteur pour la transformation des plantes contenant ce gène chimère. Elle comprend aussi une cellule végétale transformée contenant au moins un ADN codant pour la drosomycine et une plante résistante aux maladies contenant la dite cellule. Elle concerne enfin un procédé de transformation des plantes pour les rendre résistantes aux maladies dans lequel on insère un gène codant pour la drosomycine.
Par drosomycine, on entend selon l'invention tout peptide comprenant essentiellement la séquence peptidique définie dans la demande de brevet FR 2 725 992, ainsi que les séquences homologues équivalentes dans lesquelles certains acides aminés sont remplacés par des acides aminés différents mais équivalents sur des sites n'induisant pas de modification substantielle de l'activité antifongique ou antibactérienne de la dite séquence homologue. Par séquence peptidique comprenant essentiellement la séquence peptidique définie dans la demande de brevet FR 2 725 992, on entend non seulement la drosomycine mature décrite dans cette demande et définie par l'identificateur de séquence n" 4, mais également une telle séquence comprenant à l'une ou l'autre de ses extrémités, ou les deux, des résidus peptidiques nécessaires à son expression et ciblage dans la plante transformée, notamment la séquence dite "pre-pro" définie par l'identificateur de séquence n" 6.
La présente invention concerne donc un gène chimère comprenant une séquence codante pour la drosomycine ainsi que des éléments de régulation en position 5' et 3' hétérologues pouvant fonctionner dans les plantes, la séquence codante comprenant au moins une séquence d'ADN codant pour la drosomycine telle que définie ci-dessus, et notamment l'ADN codant pour la protéine mature ou l'ADN "longueur totale" (full-length) codant pour la séquence dite "pre-pro", en particulier l'ADN tel que défini par les identificateurs de séquences n"l, 3 ou 5. Elle peut comprendre également une séquence d'ADN codant pour une protéine de fusion protéine-drosomycine , dont la coupure par les systèmes enzymatiques de la plante permet la libération de la drosomycine. C'est le cas notamment d'une protéine de fusion ubiquitine-drosomycine.
On entend par "plante" tout organisme multicellulaire différentié capable de photosynthèse et par "cellule végétale" toute cellule issue d'une plante et pouvant constituer des tissus indifférenciés tels que des cals, ou des tissus différentiés tels que des embryons ou des parties de plantes ou des plantes ou des semences.
Les éléments de régulation sont bien connus de l'homme du métier, et comprennent notamment des séquences promotrices, des activateurs de transcription, des peptides de transit, des séquences terminatrices, etc.
Comme séquence de régulation promotrice on peut utiliser toute séquence promotrice d'un gène s'exprimant naturellement dans les plantes en particulier un promoteur d'origine bactérienne, virale ou végétale tel que, par exemple, celui d'un gène de la petite sous-unité de ribulose-biscarboxylase (RuBisCO) ou d'un gène de virus de plante tel que, par exemple, celui de la mosaïque du choux fleur (CAMV 19S ou 35S), ou un promoteur inducible par les pathogènes comme PR-la du tabac ou
AoPRT-L d'asperge, tout promoteur convenable connu pouvant être utilisé. De préférence on a recours à une séquence de régulation promotrice qui favorise la surexpression de la séquence codante de manière constitutive ou induite par l'attaque d'un pathogène, tel que par exemple, celle comprenant au moins un promoteur d'histone tel que décrit dans la demande EP 0 507 698.
AoPRT-L d'asperge, tout promoteur convenable connu pouvant être utilisé. De préférence on a recours à une séquence de régulation promotrice qui favorise la surexpression de la séquence codante de manière constitutive ou induite par l'attaque d'un pathogène, tel que par exemple, celle comprenant au moins un promoteur d'histone tel que décrit dans la demande EP 0 507 698.
Selon l'invention, on peut également utiliser, en association avec la séquence de régulation promotrice, d'autres séquences de régulation, qui sont situées entre le promoteur et la séquence codante, telles que des activateurs de transcription "enhancer", comme par exemple l'activateur de translation du virus etch du tabac (TEV) décrit dans la demande WO 87/07644, ou des peptides de transit, soit simples, soit doubles, et dans ce cas éventuellement séparés par une séquence intermédiaire, c'est à dire comprenant, dans le sens de la transcription, une séquence codant pour un peptide de transit d'un gène végétal codant pour une enzyme à localisation plastidiale, une partie de séquence de la partie mature N-terminale d'un gène végétal codant pour une enzyme à localisation plastidiale, puis une séquence codant pour un second peptide de transit d'un gène végétal codant pour une enzyme à localisation plastidiale.constituée d'une partie de séquence de la partie mature N-terminale d'un gène végétal codant pour une enzyme à localisation plastidiale, tels que décrit dans la demande EP 0 508 909.
Comme séquence de régulation terminatrice ou de polyadénylation, on peut utiliser toute séquence correspondante d'origine bactérienne, comme par exemple le terminateur nos d'Agrobacterium tumefaciens, ou encore d'origine végétale, comme par exemple un terminateur d'histone tel que décrit dans la demande EP 0 633 317.
La présente invention concerne également un vecteur d'intégration pour la transformation des plantes contenant au moins un gène chimère tel que défini cidessus.
L'invention a encore pour objet un procédé de transformation des cellules végétales par intégration d'au moins un gène chimère tel que défini ci-dessus, transformation qui peut être obtenue par tout moyen connu approprié, amplement décrit dans la littérature spécialisée et notamment les demandes citées dans la présente demande.
Une série de méthodes consiste à bombarder des cellules ou des protoplastes avec des particules auxquelles sont accrochées les séquences d'ADN.
Une autre série de méthodes consiste à utiliser comme moyen de transfert dans la plante un gène chimère inséré dans un plasmide Ti d'Agrobacterium tumefaciens ou
Ri d'Agrobacterium rhizogenes.
Ri d'Agrobacterium rhizogenes.
D'autres méthodes peuvent être utilisées telles que la micro-injection ou l'électroporation.
L'homme du métier fera le choix de la méthode appropriée en fonction de la
nature de la plante, notamment de son caractère monocotylédone ou dicotylédone.
nature de la plante, notamment de son caractère monocotylédone ou dicotylédone.
La présente invention a encore pour objet les cellules végétales, de plantes
monocotylédones ou dicotylédones, notamment de cultures, transformées et contenant
dans leur génome une quantité efficace d'un gène comprenant une séquence codante pour la drosomycine définie ci-dessus.
monocotylédones ou dicotylédones, notamment de cultures, transformées et contenant
dans leur génome une quantité efficace d'un gène comprenant une séquence codante pour la drosomycine définie ci-dessus.
La présente invention a encore pour objet les plantes contenant des cellules transformées, en particulier les plantes régénérées à partir des cellules transformées. La régénération est obtenue par tout procédé approprié qui dépende de la nature de l'espèce, comme par exemple décrit dans les demandes ci-dessus.
Les plantes ainsi transformées sont résistantes à certaines maladies, en particulier à certaines maladies fongiques. De ce fait, la séquence d'ADN codant pour la drosomycine peut être intégré avec pour objectif principal la réalisation de plantes résistantes aux dites maladies, la drosomycine étant efficace contre des maladies fongiques telles que celles causées par Botrytis, en particulier Botrytis cinerea (mycélium ou spores), Cercospora, en particulier Cercospora beticola, Septoria, en particulier Septoria tritici, ou Fusarium, en particulier Fusarium culmorum (mycélium ou spores) ou Fusarium graminearum.
Dans ce cas, le gène chimère pourra comprendre également et de manière avantageuse au moins un marqueur de sélection, tel qu'un ou plusieurs gènes de tolérance aux herbicides.
La séquence d'ADN codant pour la drosomycine peut également être intégrée comme marqueur de sélection lors de la transformation de plantes avec d'autres séquences codant pour d'autres peptides ou protéines d'intérêt, comme par exemple des gènes de tolérance aux herbicides. De tels gènes de tolérance aux herbicides sont bien connus de l'homme du métier.
Bien entendu, les cellules et plantes transformées selon l'invention peuvent comprendre outre la séquence codant pour la drosomycine, d'autres séquences hétérologues codant pour d'autres peptides complémentaires susceptibles de conférer à la plante des résistances à d'autres maladies d'origine bactérienne ou fongique.
Les autres séquences peuvent être intégrées au moyen du même vecteur comprenant un gène chimère, lequel comprend une première séquence codant pour la drosomycine et au moins une autre séquence codant pour un autre peptide ou protéine d'intérêt.
Elles peuvent également être intégrées au moyen d'un autre vecteur comprenant au moins la dite autre séquence, selon les techniques usuelles définies ci-dessus.
Les plantes selon l'invention peuvent encore être obtenues par croisement de parents, l'un portant le gène selon l'invention codant pour la drosomycine, l'autre portant un gène codant pour au moins un autre peptide ou protéine d'intérêt.
Les exemples ci-après permettent d'illustrer l'invention, la préparation du gène chimère, du vecteur d'intégration, des plantes transformées et leur résistance à différentes maladies d'origine fongique. Les figures 1 à 7 en annexe décrivent les structures schématiques de certains plasmides préparés pour la construction des gènes chimères. Dans ces figures, les différents sites de restriction sont marqués en italiques.
Exemple 1: Construction des gènes chimères
Toutes les techniques employées ci-après sont des techniques standard de laboratoire. Les protocoles détaillés de ces techniques sont notamment décrits dans
Ausubel & coll.
Toutes les techniques employées ci-après sont des techniques standard de laboratoire. Les protocoles détaillés de ces techniques sont notamment décrits dans
Ausubel & coll.
pRPA-RD-180:
On insère un clone entier de 1'ADNc codant pour la drosomycine décrit par
Fehlbaum & coll (SEQ. ID N" 1) dans le plasmide pCR-1000 (INVITROGEN) comme fragment EcoRI-Hindlll.
On insère un clone entier de 1'ADNc codant pour la drosomycine décrit par
Fehlbaum & coll (SEQ. ID N" 1) dans le plasmide pCR-1000 (INVITROGEN) comme fragment EcoRI-Hindlll.
pRPA-RD-182: Création d'une région codant pour la drosomycine dite "longueur totale" (correspondant au peptide pre-pro) en éliminant la région non transcrite en 5' et en supprimant le premier codon ATG.
Le plasmide pRPA-RD-180 est digéré avec les enzymes de restriction Scal et EcoRl, et le grand fragment d'ADN est purifié. Un oligonucléotide synthétique double brins de séquence Oligo 1 suivante est ensuite lié à la séquence d'ADN purifiée dérivée de pRPA-RD-180:
Oligol: 5 AATTCCCGAAGACGACATGCAGATCAAGT 3
GGGCTTCTGCTGTACGTCTAGTTCA PRPA-RD-183: Création d'une séquence codant pour la drosomycine mature qui ne comprend pas la région non transcrite en 3'.
Oligol: 5 AATTCCCGAAGACGACATGCAGATCAAGT 3
GGGCTTCTGCTGTACGTCTAGTTCA PRPA-RD-183: Création d'une séquence codant pour la drosomycine mature qui ne comprend pas la région non transcrite en 3'.
Les deux oligonucléotides synthétiques complémentaires de séquences Oligo 2 et Oligo 3 ci-après sont hybridés à 65"C pendant 5 minutes puis par diminution lente de la température à 30"C pendant 30'.
Oligo2: 5' GAGAGATCCC CCGCGGTGGT GACTGCCTGT CCGGAAGATA
CAAGGGTCCC TGTGCCGTCT GGGACAACGA GACCTGTCGT
CGTGTGTGCA AGGAGGAGGG 3'
Oligo3: 5' GCGCGCGGAT CCTTAGCATC CTTCGCACCA GCACTTCAGA
CTGGGGCTGC AGTGGCCACT GGAGCGTCCC TCCTCCTTGC
ACACACGACG 3'
Après hybridation entre l'Oligo 2 et l'Oligo 3, l'ADN resté simple brin sert de matrice au fragment klenow de la polymérase l de E. coli (dans les conditions standard préconisées par le fabriquant (New England Biolabs)) pour la création de l'oligonucléotide double brin. Cet oligonucléotide double brin est ensuite digéré par les enzymes de restriction Sacll et EcoRI et clonés dans le plasmide pBS II SK(-) (Stratagene) digéré par les même enzymes de restriction. On obtient alors un clone comprenant la région codant pour la drosomycine mature située entre les sites de restriction Sacll et BamHI (SEQ ID 3).
CAAGGGTCCC TGTGCCGTCT GGGACAACGA GACCTGTCGT
CGTGTGTGCA AGGAGGAGGG 3'
Oligo3: 5' GCGCGCGGAT CCTTAGCATC CTTCGCACCA GCACTTCAGA
CTGGGGCTGC AGTGGCCACT GGAGCGTCCC TCCTCCTTGC
ACACACGACG 3'
Après hybridation entre l'Oligo 2 et l'Oligo 3, l'ADN resté simple brin sert de matrice au fragment klenow de la polymérase l de E. coli (dans les conditions standard préconisées par le fabriquant (New England Biolabs)) pour la création de l'oligonucléotide double brin. Cet oligonucléotide double brin est ensuite digéré par les enzymes de restriction Sacll et EcoRI et clonés dans le plasmide pBS II SK(-) (Stratagene) digéré par les même enzymes de restriction. On obtient alors un clone comprenant la région codant pour la drosomycine mature située entre les sites de restriction Sacll et BamHI (SEQ ID 3).
pRPA-RD-186: Elimination de la région 3' non transcrite de la région codant pour la drosomycine longueur totale de pRPA-RD-182.
Le plasmide pRPA-RD-182 est digéré avec les enzymes de restriction BspEI et
Kpnl, et le grand fragment d'ADN est purifié. Le plasmide pRPA-RD-183 est ensuite digéré avec les enzymes de restriction BspEI et Kpnl, et le petit fragment d'ADN est purifié. Ces deux fragments purifiés sont ensuites liés de manière à obtenir un plasmide contenant la région codant pour le peptide pre-pro de la drosomycine dont le premier codon ATG et les deux régions non codantes en 5' et 3' ont été supprimées (SEQ ID 5).
Kpnl, et le grand fragment d'ADN est purifié. Le plasmide pRPA-RD-183 est ensuite digéré avec les enzymes de restriction BspEI et Kpnl, et le petit fragment d'ADN est purifié. Ces deux fragments purifiés sont ensuites liés de manière à obtenir un plasmide contenant la région codant pour le peptide pre-pro de la drosomycine dont le premier codon ATG et les deux régions non codantes en 5' et 3' ont été supprimées (SEQ ID 5).
pRPA-RD-187: Création d'un vecteur d'expression dans les plantes comprenant la séquence codant pour la forme mature de la drosomycine.
Le plasmide pUGUS(118), dérivé du pUC-19, a été obtenu auprès du Dr.
Richard Vierstra de l'Université du Wisconsin (plasmide non décrit). Ce plasmide dont la structure schématique est représentée sur la figure 1, contient le promoteur CaMV 35S qui dirige l'expression d'un ARN contenant la séquence non traduite en 5' du virus de la mosaïque alfalfa (AMV 5' UTR; Brederode & coll., 1980), la région N-terminale du gène de l'ubiquitine ubqll d'Arabidopsis thaliana jusqu'au site de clivage de l'ubiquitine hydrolase (ubql 1 N-term; Callis & coll., 1993) laquelle est fusionnée dans le même cadre de lecture avec le gène de la -glucuronidase de E. coli (GUS; Jefferson & coll., 1987), suivi du site de polyadenylation du gène de la nopaline synthase d'Agrobacterium tumefaciens (NOS polyA; Bevan & coll., 1983).
Le plasmide pUGUS(118) est digéré avec les enzymes de restriction Sacll et
BamHI et le grand fragment d'ADN est purifié. Le plasmide pRPA-RD-183 est digéré avec les enzymes de restriction Sacll et BamHI et le petit fragment d'ADN contenant la région codante pour la forme mature de la drosomycine est ensuite purifié. Les deux fragments d'ADN purifiés sont liés ensemble dans une cassette d'expression dans les plantes qui synthétisent une protéine de fusion ubiquitine-drosomycine dans le cytoplasme des cellules végétales. La structure schématique de cette cassette d'expression est représentée sur la figure 2. Sous l'action de l'ubiquitine hydrolase sur cette protéine de fusion, la drosomycine mature est libérée dans le cytoplasme des cellules de la plante.
BamHI et le grand fragment d'ADN est purifié. Le plasmide pRPA-RD-183 est digéré avec les enzymes de restriction Sacll et BamHI et le petit fragment d'ADN contenant la région codante pour la forme mature de la drosomycine est ensuite purifié. Les deux fragments d'ADN purifiés sont liés ensemble dans une cassette d'expression dans les plantes qui synthétisent une protéine de fusion ubiquitine-drosomycine dans le cytoplasme des cellules végétales. La structure schématique de cette cassette d'expression est représentée sur la figure 2. Sous l'action de l'ubiquitine hydrolase sur cette protéine de fusion, la drosomycine mature est libérée dans le cytoplasme des cellules de la plante.
pRPA-RD-188: Création d'un vecteur d'expression dans les plantes comprenant la longueur totale de la séquence codant pour la drosomycine (pre-pro).
Le plasmide pRTL-2 GUS, dérivé du plasmide pUC-19, a été obtenu auprès du
Dr. Jim Carrington (Texas A & M University, non décrit). Ce plasmide dont la structure schématique est représentée sur la figure 3, contient le promoteur CaMV 35S dupliqué isolé du virus de la mosaique du choux fleur (Promoteur CaMV 2x35S; Odell & coll., 1985) qui dirige l'expression d'un ARN contenant séquence non traduite en 5' du virus etch du tabac (TEV 5' UTR; Carrington & Freed, 1990), le gène de la ,B-glucuronidase de E. coli (GUS Jefferson & coll., 1987) suivi du site de polyadenylation de 1'ARN 35S de CaMV (CaMV polyA; Odell & coll., 1985).
Dr. Jim Carrington (Texas A & M University, non décrit). Ce plasmide dont la structure schématique est représentée sur la figure 3, contient le promoteur CaMV 35S dupliqué isolé du virus de la mosaique du choux fleur (Promoteur CaMV 2x35S; Odell & coll., 1985) qui dirige l'expression d'un ARN contenant séquence non traduite en 5' du virus etch du tabac (TEV 5' UTR; Carrington & Freed, 1990), le gène de la ,B-glucuronidase de E. coli (GUS Jefferson & coll., 1987) suivi du site de polyadenylation de 1'ARN 35S de CaMV (CaMV polyA; Odell & coll., 1985).
Le plasmide pRTL-2 GUS est digéré avec les enzymes de restriction Ncol et
BamHI et le grand fragment d'ADN est purifié. Le plasmide pRPA-RD-186 est digéré avec les enzymes de restriction Bbsll et BamHI et le petit fragment d'ADN contenant la région codant pour la drosomycine pre-pro est purifié. Les deux fragments d'ADN purifiés sont ensuite liés ensemble dans une cassette d'expression dans les plantes qui synthétisent une protéine de drosomycine pre-pro. La structure schématique de cette cassette d'expression est représentée sur la figure 4. La drosomycine est transportée vers la matrice extra-cellulaire de la plante par l'action d'un peptide signal (pre-pro).
BamHI et le grand fragment d'ADN est purifié. Le plasmide pRPA-RD-186 est digéré avec les enzymes de restriction Bbsll et BamHI et le petit fragment d'ADN contenant la région codant pour la drosomycine pre-pro est purifié. Les deux fragments d'ADN purifiés sont ensuite liés ensemble dans une cassette d'expression dans les plantes qui synthétisent une protéine de drosomycine pre-pro. La structure schématique de cette cassette d'expression est représentée sur la figure 4. La drosomycine est transportée vers la matrice extra-cellulaire de la plante par l'action d'un peptide signal (pre-pro).
DRPA-RD-195: Création d'un plasmide contenant un site de clonage multiple modifié.
Le plasmide pRPA-RD-195 est un plasmide dérivé du pUC-19 qui contient un site de clonage multiple modifié. Les oligonucléotides synthétiques complémentaires
Oligo 4 et Oligo 5 ci-après, sont hybridés et rendus double brin selon la procédure décrite pour pRPA-RD-183.
Oligo 4 et Oligo 5 ci-après, sont hybridés et rendus double brin selon la procédure décrite pour pRPA-RD-183.
Oligo4: 5' AATTAGGGCC CCCTAGGGTT TAAACGGCCA GTCAGGCCGA
ATTCGAGCTC GGTACCCGGG GATCCTCTAG AGTCGACCTG
CAGGCATGC 3'
Oligo 5: 5' AGCTCCCTGA ACCAGGCTCG AGGGCGCGCC TTAATTAAAA
GCTTGCATGC CTGCAGGTCG ACTCTAGAGG 3'
L'oligonucléotide double brin obtenu est ensuite lié dans pUC-19 qui a été préalablement digéré avec les enzymes de restriction EcoRI et Hindili pour obtenir un vecteur contenant de multiples sites de clonage pour faciliter l'introduction des cassettes d'expression dans un plasmide vecteur d'Agrobucterium tumefaciens. La structure schématique de ce site de clonage multiple est représentée sur la figure 5.
ATTCGAGCTC GGTACCCGGG GATCCTCTAG AGTCGACCTG
CAGGCATGC 3'
Oligo 5: 5' AGCTCCCTGA ACCAGGCTCG AGGGCGCGCC TTAATTAAAA
GCTTGCATGC CTGCAGGTCG ACTCTAGAGG 3'
L'oligonucléotide double brin obtenu est ensuite lié dans pUC-19 qui a été préalablement digéré avec les enzymes de restriction EcoRI et Hindili pour obtenir un vecteur contenant de multiples sites de clonage pour faciliter l'introduction des cassettes d'expression dans un plasmide vecteur d'Agrobucterium tumefaciens. La structure schématique de ce site de clonage multiple est représentée sur la figure 5.
r > RPA-RD-190: Introduction de la cassette d'expression de la drosomycine de pRPA-RD-187 dans pRPA-RD-195.
Le plamide pRPA-RD-187 est digéré avec les enzymes de restriction KpnI et
Sali, et le fragment d'ADN contenant la cassette d'expression de la drosomycine est purifié. Le fragment purifié est ensuite lié dans pRPA-RD-195 qui a été préalablement digéré avec les même enzymes de restriction.
Sali, et le fragment d'ADN contenant la cassette d'expression de la drosomycine est purifié. Le fragment purifié est ensuite lié dans pRPA-RD-195 qui a été préalablement digéré avec les même enzymes de restriction.
r > RPA-RD-191: Introduction de la cassette d'expression de la drosomycine de pRPA-RD-188 dans pRPA-RD-195.
Le plasmide pRPA-RD-188 est digéré avec l'enzyme de restriction Hindlll et déphosphorylé avec de la phosphatase intestinale de veau. Le fragment d'ADN contenant la cassette d'expression de la drosomycine est purifié. Le fragment purifié est ensuite lié dans pRPA-RP-195 qui a été préalablement digéré avec l'enzyme de restriction Hindili.
PRPA-RD-174: Plasmide dérivé de pRPA-BL-lSOA (EP 0 508 909) contenant le gène de tolérance au bromoxynil de pRPA-BL-237 (EP 0 508 909).
Le gène de tolérence au bromoxynil est isolé de pRPA-BL-237 par une amplification génique par PCR. Le fragment obtenu est à bouts francs et est cloné dans le site EcoRI de pRPA-BL- l5OA qui a été rendu bouts francs par l'action de la polymérase klenow dans des conditions standard. On obtient un vecteur d'Agrobacterium tumefaciens qui contient le gène de tolérance au bromoxynil à proximité de sa bordure droite, un gène de tolérance à la kanamycine à proximité de sa bordure gauche et le site de clonage multiple de pUC-19 entre ces deux gènes.
La structure schématique de pRPA-RD-174 est représentée sur la figure 6. Sur cette figure, "nos" représente le site de polyadenylation de la nopaline synthase d'Agrobacterium tumefaciens (Bevan & coll., 1983), "NOS pro" représente le promoteur de la nopaline synthase d'Agrobacterium tumefaciens (Bevan & coll., 1983), "NPT ll" représente le gène de la néomycine phosphotransphérase du transposon Tn5 de E. coli (Rothstein & coll., 1981), "35S pro" représente le promoteur 35S isolé du virus de la mosaïque du choux fleur (Odell & coll., 1985), "BRX" représente le gène de la nitrilase isolé de K. ozaenae (Stalker & coll., 1988), "RB" et "LB" représentent respectivement les bordures droite et gauche de la séquence d'un plasmide Ti d'Agrobacterium tumefaciens.
pRPA-RD-184: Addition d'un nouveau site de restriction, unique, dans pRPA RD-174.
Le plasmide pRPA-RD-174 est digéré avec l'enzyme de restriction Xmal, et le grand fragment d'ADN est purifié. Un oligonucléotide synthétique double brin Oligo 6 ci-après, est ensuite lié dans le fragment purifié de pRPA-RD-174.
Oligo6: 51 GGCCAGTCAG GCCACACTTA ATTAAGTTTA AACGCGGCCC
CGGCGCGCCT AGGTGTGTGC TCGAGGGCCC AACCTCAGTA
CCTGGTTCAG GCCGG 3'
On obtient un plasmide dérivé de pRPA-RD-174 comprenant d'autres sites de restriction entre le gène de tolérance au bromoxynil et le gène de la kanamycine marqueur de sélection.
CGGCGCGCCT AGGTGTGTGC TCGAGGGCCC AACCTCAGTA
CCTGGTTCAG GCCGG 3'
On obtient un plasmide dérivé de pRPA-RD-174 comprenant d'autres sites de restriction entre le gène de tolérance au bromoxynil et le gène de la kanamycine marqueur de sélection.
La strucure schématique du plasmide pRPA-RD-184 est représentée sur la figure 7 où les termes "nos", "NPT H", "NOS pro", "35S pro", "BRX gene", "RB" et "LB" ont la même signification que pour la figure 6.
pRPA-RD-192: Création d'un vecteur d'Agrobacterium tumefaciens contenant la construction du gène codant pour la drosomycine dirigée vers le cytosol des cellules.
Le plasmide pRPA-RD-190 est digéré avec les enzymes de restriction Apal et Ascl, et le fragment d'ADN contenant la cassette d'expression de la drosomycine est purifié. Le fragment d'ADN purifié contenant la cassette d'expression de la drosomycine est lié dans pRPA-RD-184, après digestion préalable avec les même deux enzymes. On obtient ainsi un vecteur d'Agrobacterium tumefaciens contenant la séquence codant pour la protéine de fusion drosomycine-ubiquitine qui conduit à l'expression de la drosomycine dans le cytosol des cellules de la plante.
pRPA-RD-193: Création d'un vecteur d'Agrobacterium tumefaciens contenant la construction du gène codant pour la drosomycine dirigée vers la matrice extracellulaire.
On reprend le mode opératoire décrit ci-dessus avec le plasmide pRPA-RD-191 et les enzymes de restriction Pmel et Ascl, remplaçant le plasmide pRPA-RD-190 et les enzymes de restriction Apal et Ascl. On obtient ainsi un vecteur d'Agrobacterium tumefaciens contenant la séquence codant pour la protéine pre-pro de la drosomycine qui conduit à l'expression de la drosomycine dans la matrice extracellulaire de la plante.
Exemple 2: Tolérance aux herbicides des tabacs transformés.
2.1- Transformation
Les vecteurs pRPA-RD-192 and pRPA-RD-193 sont introduit dans la souche d'Agrobacterium tumefaciens EHAlOl (Hood & colt., 1987) porteuse du cosmide pTVK291 (Komari & coll., 1986). La technique de transformation est basée sur la procédure de Horsh & coll. (1985).
Les vecteurs pRPA-RD-192 and pRPA-RD-193 sont introduit dans la souche d'Agrobacterium tumefaciens EHAlOl (Hood & colt., 1987) porteuse du cosmide pTVK291 (Komari & coll., 1986). La technique de transformation est basée sur la procédure de Horsh & coll. (1985).
2.2- Régénération
La régénération du tabac PBD6 (provenance SEITA France) à partir d'explants foliaires est réalisée sur un milieu de base Murashige et Skoog (MS) comprenant 30 g/t de saccharose ainsi que 200 yg/ml de kanamycine. Les explants foliaires sont prélevés sur des plantes cultivées en serre ou in vitro et transformées selon la technique des disques foliaires (Horsh & coll., 1985) en trois étapes successives: la première comprend l'induction des pousses sur un milieu additionné de 30 g/l de saccharose contenant 0,05 mg/i d'acide naphtylacétique (ANA) et 2 mg/l de benzylaminopurine (BAP) pendant 15 jours. Les pousses formées au cours de cette étape sont ensuite développées pendant 10 jours par culture sur un milieu MS additionné de 30 g/l de saccharose mais ne contenant pas d'hormone. Puis on prélève des pousses développées et on les cultive sur un milieu d'enracinement MS à teneur moitié en sels, vitamines et sucre et ne contenant pas d'hormone. Au bout d'environ 15 jours, les pousses enracinées sont passées en terre.
La régénération du tabac PBD6 (provenance SEITA France) à partir d'explants foliaires est réalisée sur un milieu de base Murashige et Skoog (MS) comprenant 30 g/t de saccharose ainsi que 200 yg/ml de kanamycine. Les explants foliaires sont prélevés sur des plantes cultivées en serre ou in vitro et transformées selon la technique des disques foliaires (Horsh & coll., 1985) en trois étapes successives: la première comprend l'induction des pousses sur un milieu additionné de 30 g/l de saccharose contenant 0,05 mg/i d'acide naphtylacétique (ANA) et 2 mg/l de benzylaminopurine (BAP) pendant 15 jours. Les pousses formées au cours de cette étape sont ensuite développées pendant 10 jours par culture sur un milieu MS additionné de 30 g/l de saccharose mais ne contenant pas d'hormone. Puis on prélève des pousses développées et on les cultive sur un milieu d'enracinement MS à teneur moitié en sels, vitamines et sucre et ne contenant pas d'hormone. Au bout d'environ 15 jours, les pousses enracinées sont passées en terre.
2.3- Tolérance au bromoxvnil
Vingt plantes transformées ont été régénérées et passées en serre pour chaque construction pRPA-RD-192 et pRPA-RD-193. Ces plantes ont été traitées en serre au stade 5 feuilles avec une suspension aqueuse de Pardner correspondant à 0,2 kg de matière active bromoxynil par hectare.
Vingt plantes transformées ont été régénérées et passées en serre pour chaque construction pRPA-RD-192 et pRPA-RD-193. Ces plantes ont été traitées en serre au stade 5 feuilles avec une suspension aqueuse de Pardner correspondant à 0,2 kg de matière active bromoxynil par hectare.
Toutes les plantes montrant une tolérance complète au bromoxynil sont employées dans les expérimentations suivantes pour tester les effets de l'expression de la drosomycine sur la tolérance des plantes transformées aux agressions fongiques.
Exemple 3: Détection de la drosomycine dans les tabacs transformés
Une analyse immunoblot (telle que décrites par Coligan & coll.) est employée pour détecter la drosomycine produite par les tabacs transformés, en employant un anticorps de lapin dirigé contre la drosomycine synthétique fixée sur une protéine porteuse KLH, avec la drosomycine synthétique comme antigène.
Une analyse immunoblot (telle que décrites par Coligan & coll.) est employée pour détecter la drosomycine produite par les tabacs transformés, en employant un anticorps de lapin dirigé contre la drosomycine synthétique fixée sur une protéine porteuse KLH, avec la drosomycine synthétique comme antigène.
Les protéines de feuilles sont extraites d'abord par broyage des tissus congelés à -180 C, suivi par l'addition d'un tampon d'extraction (urée 8 M, tris HCl pH 6,8 50 mM, SDS 2 %, 5-mercaptoéthanol 5 %, saccharose 10 %, EDTA 2 mM et dithiothreitol 10 mM). La quantité totale de protéines extractables est ensuite mesurée.
100 g de protéines extraites sont ensuite chargées dans des puits de gel SDS-PAGE (20 % acrylamide) pour une analyse immunoblot (selon Coligan & coll.).
Pour les plantes transformées avec le plasmide pRPA-RD-193 (drosomycine poe-pro) on a trouvé jusqu'à 160 ng de drosomycine pour 100 llg du total de protéines extraites des feuilles.
Pour les plantes transformées avec le plasmide pRPA-RD-192 (drosomycine mature), on a trouvé jusqu'à 50 ng de drosomycine pour 100 pg du total de protéines extraites des feuilles.
La drosomycine synthétisée et isolée dans les plantes transformées avec les plasmides pRPA-RD-192 et pRPA-RD-193 co-migre avec la drosomycine isolée des drosophiles. Ce résultat montrent que chacune des drosomycines dirigée soit vers le cytoplasme (pRPA-RD-192) soit vers la matrice extracellulaire (pRPA-RD-193) conduisent à une drosomycine mature. En outre, le système de gel employé dans cet analyse (20 % acrylamide) aurait permis de détecter aisément de la drosomycine qui n'aurait pas été transformée puisque les deux constructions (ubiquitine-drosomycine et drosomycine pre-pro) font approximativement 10 kD, contre 5 kD pour la drosomycine mature.
Exemple 4: Résistance au Botrytis cinerea des tabacs transformés.
15/20 plantes issues des plantes obtenues à l'exemple 2.3, sont cultivées en serre dans des pots de repiquage de 7 cm de côté dans les conditions suivantes:
- température: 16 C durant la nuit; 19" C durant le jour;
- photopériode: 14 h de nuit; 10 h de jour,
- hygrométrie: 90-1400
Deux feuilles par plantes sont innoculées avec 6 disques de 6 mm de diamètre par feuille, chaque disque de I ml d'une suspension d'endoconidies à 1 000 000 conidies/ml. La lecture des résultats de l'infection est effectuée 21 jours après l'innoculation en observant les racines des plantules préalablement nettoyées à l'eau. L'évolution de la maladie est appréciée par une échelle de notation de 0 à 11, 0 correspodant à une absence d'infection. Pour les plantes transformées par le plasmide pRPA-RD-192 (protéine mature dans le cytoplasme) et celles transformées par le plasmide pRPA-RD-193 (drosomycine extra-cellulaire), la notation moyenne est de 4, ce qui correspond à une forte résistance à Chalara elegans.
- température: 16 C durant la nuit; 19" C durant le jour;
- photopériode: 14 h de nuit; 10 h de jour,
- hygrométrie: 90-1400
Deux feuilles par plantes sont innoculées avec 6 disques de 6 mm de diamètre par feuille, chaque disque de I ml d'une suspension d'endoconidies à 1 000 000 conidies/ml. La lecture des résultats de l'infection est effectuée 21 jours après l'innoculation en observant les racines des plantules préalablement nettoyées à l'eau. L'évolution de la maladie est appréciée par une échelle de notation de 0 à 11, 0 correspodant à une absence d'infection. Pour les plantes transformées par le plasmide pRPA-RD-192 (protéine mature dans le cytoplasme) et celles transformées par le plasmide pRPA-RD-193 (drosomycine extra-cellulaire), la notation moyenne est de 4, ce qui correspond à une forte résistance à Chalara elegans.
Les résultats obtenus in vivo dans les exemples 4 et 5 montrent que la transformation par le gène chimère selon l'invention confère à la plante transformée de nouvelles propriétés de résistance aux champignons, activité est liée à la conservation des propriétés antifongiques de la drosomycine produite par les plantes transformées selon l'invention.
REFERENCES
Ausubel, F. A. & coll. (eds. Greene). Current Protocols in Molecular Biology. Publ.
Ausubel, F. A. & coll. (eds. Greene). Current Protocols in Molecular Biology. Publ.
Wiley & Sons.
Bevan, M. & coll. (1983). Nuc. Acids Res. 11:369-385.
Brederode, F.T.M. & coll. (1980). Nuc. Acids Res. 8:2213-2223.
Callis & coll. (1993). Plant Mol. Biol. 21:895-906.
Carrington and Freed (1990). J. Virol. 64: 1590-1597.
Coligan, J.E. & coll. (ed. V.B. Chanda). Current Protocols in Protein Science. Publ.
Wiley & Sons.
Fehlbaum & coll. (1994). J. Biol. Chem 269: 331459-33163.
Horsch & coll. (1985). Science 227:1229-1231.
Jefferson & coll. (1987). EMBO J. 6:3901-3907.
Komari & coll. (1986). J. Bacteriol. 166:88-94.
Stalker & coll. (1988). J. Biol. Chem. 263:6310-6314.
Odell, J.T. & coll. (1985). Nature 313:810-812.
LISTE DE SEQUENCES
(') INFORMATION GENERALE:
(;ii) NOMBRE DE SEQUENCES: 6
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO:1:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 488 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: double
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc
(vi) SOURCE D'ORIGINE:
(A) ORGANISMEE: Drosophila melanogaster
(vii) SOURCE IMMEDIATE:
(B) CLONE: pRPA-RD-180
(ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONNELLE:
(A) NOM/CLE: CDS
(B) EMPLACEMENT: 101.. 310
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO:1:
GAATTCGAGC TCGGTACCCC TCGAGACCAT GGTCGACCCC ACGCGTCCGG ATAATTCTTT 60
CAGAAATCAT TTACCAAGCT CCGTGAGAAC CTTTTCCAAT ATG ATG CAG ATC AAG 115
Met Met Gln Ile Lys
1 5
TAC TTG TTC GCC CTC TTC GCT GTC CTG ATG CTG GTG GTG CTG GGA GCC 163
Tyr Leu Phe Ala Leu Phe Ala Val Leu Met Leu Val Val Leu Gly Ala
10 15 20
AAC GAG GCC GAT GCC GAC TGC CTG TCC GGA AGA TAC AAG GGT CCC TGT 211
Asn Glu Ala Asp Ala Asp Cys Leu Ser Gly Arg Tyr Lys Gly Pro Cys
25 30 35
GCC GTC TGG GAC AAC GAG ACC TGT CGT CGT GTG TGC AAG GAG GAG GGA 259
Ala Val Trp Asp Asn Glu Thr Cys Arg Arg Val Cys Lys Glu Glu Gly
40 45 50
CGC TCC AGT GGC CAC TGC AGC CCC AGT CTG AAG TGC TGG TGC GAA GGA 307
Arg Ser Ser Gly His Cys Ser Pro Ser Leu Lys Cys Trp Cys Glu Gly
55 60 65
TGC TAAATCCATG AGCAATTAGC ATGAACGTTC TGAAAAGCGC GTTTAGCTCT 360
Cys
70
CCACTACTTA CGACATATTC TATGCTGCAA TATTGAAAAT CTAATAAACA AAACTAATGT 420
ACATTAAAAA a A AAAAAAAGGG AAAAAAAAAA AAAAAAAGGG CGGCCGCGAC CTGCAGGCAT 480
GCAAGCTT 488
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO:2:
(i) CHARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 70 acides aminés
(B) TYPE: acides aminés
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO:2:
Met Met Gln Ile Lys Tyr Leu Phe Ala Leu Phe Ala Val Leu Met Leu
1 5 10 15
Val Val Leu Gly Ala Asn Glu Ala Asp Ala Asp Cys Leu Ser Gly Arg
20 25 30
Tyr Lys Gly Pro Cys Ala Val Trp Asp Asn Glu Thr Cys Arg Arg Val
35 40 45
Cys Lys Glu Glu Gly Arg Ser Ser Gly His Cys Ser Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Cys Trp Cys Glu Gly Cys
65 70 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO:3:
(i) CHARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 167 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: double
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc
(vi) SOURCE D'ORIGINE:
(A) ORGANISME: SynThetique
(vii) SOURCE IMMEDIATE:
(B) CLONE: pRPA-RD-183
(ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONNELLE:
(A) NOM/CLE: CDS
(B) EMPLACEMENT: 21..152
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO:3:
GAGAGATCCC CCGCGGTGGT GAC TGC CTG TCC GGA AGA TAC AAG GGT CCC 50
Asp Cys Leu Ser Gly Arg Tyr Lys Gly Pro
1 5 10
TGT GCC GTC TGG GAC AAC GAG ACC TGT CGT CGT GTG TGC AAG GAG GAG 98
Cys Ala Val Trp Asp Asn Glu Thr Cys Arg Arg Val Cys Lys Glu Glu
15 20 25
GGA CGC TCC AGT GGC CAC TGC AGC CCC AGT CTG AAG TGC TGG TGC GAA 146
Gly Arg Ser Ser Gly His Cys Ser Pro Ser Leu Lys Cys Trp Cys Glu
30 35 40
GGA TGC TAAGGATCCG CGCGC 167
Gly Cys (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO:4:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 44 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO:4:
Asp Cys Leu Ser Gly Arg Tyr Lys Gly Pro Cys Ala Val Trp Asp Asn
1 5 10 15
Glu Thr Cys Arg Arg Val Cys Lys Glu Glu Gly Arg Ser Ser Gly His
20 25 30
Cys Ser Pro Ser Leu Lys Cys Trp Cys Glu Gly Cys
35 40
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO:5:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 236 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: double
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc *--
(vi) SOURCE D'ORIGINE:
(A) ORGANISME: Synthetique
(vii) SOURCE IMMEDIATE:
(B) CLONE: pRPA-RD-186
(ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONNELLE:
(A) NOM/CLE: CDS
(B) EMPLACEMENT: 15..221
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO:5:
GAATTGAAGA CGCC ATG CAG ATC AAG TAC TTG TTC GCC CTC TTC GCT GTC 50
Met Gln Ile Lys Tyr Leu Phe Ala Leu Phe Ala Val
1 5 10
CTG ATG CTG GTG GTG CTG GGA GCC AAC GAG GCC GAT GCC GAC TGC CTG 98
Leu Met Leu Val Val Leu Gly Ala Asn Glu Ala Asp Ala Asp Cys Leu
15 20 25
TCC GGA AGA TAC AAG GGT CCC TGT GCC GTC TGG GAC AAC GAG ACC TGT 146
Ser Gly Arg Tyr Lys Gly Pro Cys Ala Val Trp Asp Asn Glu Thr Cys
30 35 40
CGT CGT GTG TGC AAG GAG GAG GGA CGC TCC AGT GGC CAC TGC AGC CCC 194
Arg Arg Val Cys Lys Glu Glu Gly Arg Ser Ser Gly His Cys Ser Pro
45 50 55 60
AGT CTG AAG TGC TGG TGC GAA GGA TGC TAAGGATCCG CGCGC 236
Ser Leu Lys Cys Trp Cys Glu Gly Cys
65
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO:6:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 69 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO:6:
Met Gln Ile Lys Tyr Leu Phe Ala Leu Phe Ala Val Leu Met Leu Val
1 5 10 15
Val Leu Gly Ala Asn Glu Ala Asp Ala Asp Cys Leu Ser Gly Arg Tyr
20 25 30
Lys Gly Pro Cys Ala Val Trp Asp Asn Glu Thr Cys Arg Arg Val Cys
35 40 45
Lys Glu Glu Gly Arg Ser Ser Gly His Cys Ser Pro Ser Leu Lys Cys
50 55 60
Trp Cys Glu Gly Cys 65
(') INFORMATION GENERALE:
(;ii) NOMBRE DE SEQUENCES: 6
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO:1:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 488 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: double
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc
(vi) SOURCE D'ORIGINE:
(A) ORGANISMEE: Drosophila melanogaster
(vii) SOURCE IMMEDIATE:
(B) CLONE: pRPA-RD-180
(ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONNELLE:
(A) NOM/CLE: CDS
(B) EMPLACEMENT: 101.. 310
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO:1:
GAATTCGAGC TCGGTACCCC TCGAGACCAT GGTCGACCCC ACGCGTCCGG ATAATTCTTT 60
CAGAAATCAT TTACCAAGCT CCGTGAGAAC CTTTTCCAAT ATG ATG CAG ATC AAG 115
Met Met Gln Ile Lys
1 5
TAC TTG TTC GCC CTC TTC GCT GTC CTG ATG CTG GTG GTG CTG GGA GCC 163
Tyr Leu Phe Ala Leu Phe Ala Val Leu Met Leu Val Val Leu Gly Ala
10 15 20
AAC GAG GCC GAT GCC GAC TGC CTG TCC GGA AGA TAC AAG GGT CCC TGT 211
Asn Glu Ala Asp Ala Asp Cys Leu Ser Gly Arg Tyr Lys Gly Pro Cys
25 30 35
GCC GTC TGG GAC AAC GAG ACC TGT CGT CGT GTG TGC AAG GAG GAG GGA 259
Ala Val Trp Asp Asn Glu Thr Cys Arg Arg Val Cys Lys Glu Glu Gly
40 45 50
CGC TCC AGT GGC CAC TGC AGC CCC AGT CTG AAG TGC TGG TGC GAA GGA 307
Arg Ser Ser Gly His Cys Ser Pro Ser Leu Lys Cys Trp Cys Glu Gly
55 60 65
TGC TAAATCCATG AGCAATTAGC ATGAACGTTC TGAAAAGCGC GTTTAGCTCT 360
Cys
70
CCACTACTTA CGACATATTC TATGCTGCAA TATTGAAAAT CTAATAAACA AAACTAATGT 420
ACATTAAAAA a A AAAAAAAGGG AAAAAAAAAA AAAAAAAGGG CGGCCGCGAC CTGCAGGCAT 480
GCAAGCTT 488
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO:2:
(i) CHARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 70 acides aminés
(B) TYPE: acides aminés
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO:2:
Met Met Gln Ile Lys Tyr Leu Phe Ala Leu Phe Ala Val Leu Met Leu
1 5 10 15
Val Val Leu Gly Ala Asn Glu Ala Asp Ala Asp Cys Leu Ser Gly Arg
20 25 30
Tyr Lys Gly Pro Cys Ala Val Trp Asp Asn Glu Thr Cys Arg Arg Val
35 40 45
Cys Lys Glu Glu Gly Arg Ser Ser Gly His Cys Ser Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Cys Trp Cys Glu Gly Cys
65 70 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO:3:
(i) CHARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 167 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: double
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc
(vi) SOURCE D'ORIGINE:
(A) ORGANISME: SynThetique
(vii) SOURCE IMMEDIATE:
(B) CLONE: pRPA-RD-183
(ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONNELLE:
(A) NOM/CLE: CDS
(B) EMPLACEMENT: 21..152
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO:3:
GAGAGATCCC CCGCGGTGGT GAC TGC CTG TCC GGA AGA TAC AAG GGT CCC 50
Asp Cys Leu Ser Gly Arg Tyr Lys Gly Pro
1 5 10
TGT GCC GTC TGG GAC AAC GAG ACC TGT CGT CGT GTG TGC AAG GAG GAG 98
Cys Ala Val Trp Asp Asn Glu Thr Cys Arg Arg Val Cys Lys Glu Glu
15 20 25
GGA CGC TCC AGT GGC CAC TGC AGC CCC AGT CTG AAG TGC TGG TGC GAA 146
Gly Arg Ser Ser Gly His Cys Ser Pro Ser Leu Lys Cys Trp Cys Glu
30 35 40
GGA TGC TAAGGATCCG CGCGC 167
Gly Cys (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO:4:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 44 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO:4:
Asp Cys Leu Ser Gly Arg Tyr Lys Gly Pro Cys Ala Val Trp Asp Asn
1 5 10 15
Glu Thr Cys Arg Arg Val Cys Lys Glu Glu Gly Arg Ser Ser Gly His
20 25 30
Cys Ser Pro Ser Leu Lys Cys Trp Cys Glu Gly Cys
35 40
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO:5:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 236 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: double
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc *--
(vi) SOURCE D'ORIGINE:
(A) ORGANISME: Synthetique
(vii) SOURCE IMMEDIATE:
(B) CLONE: pRPA-RD-186
(ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONNELLE:
(A) NOM/CLE: CDS
(B) EMPLACEMENT: 15..221
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO:5:
GAATTGAAGA CGCC ATG CAG ATC AAG TAC TTG TTC GCC CTC TTC GCT GTC 50
Met Gln Ile Lys Tyr Leu Phe Ala Leu Phe Ala Val
1 5 10
CTG ATG CTG GTG GTG CTG GGA GCC AAC GAG GCC GAT GCC GAC TGC CTG 98
Leu Met Leu Val Val Leu Gly Ala Asn Glu Ala Asp Ala Asp Cys Leu
15 20 25
TCC GGA AGA TAC AAG GGT CCC TGT GCC GTC TGG GAC AAC GAG ACC TGT 146
Ser Gly Arg Tyr Lys Gly Pro Cys Ala Val Trp Asp Asn Glu Thr Cys
30 35 40
CGT CGT GTG TGC AAG GAG GAG GGA CGC TCC AGT GGC CAC TGC AGC CCC 194
Arg Arg Val Cys Lys Glu Glu Gly Arg Ser Ser Gly His Cys Ser Pro
45 50 55 60
AGT CTG AAG TGC TGG TGC GAA GGA TGC TAAGGATCCG CGCGC 236
Ser Leu Lys Cys Trp Cys Glu Gly Cys
65
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO:6:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 69 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO:6:
Met Gln Ile Lys Tyr Leu Phe Ala Leu Phe Ala Val Leu Met Leu Val
1 5 10 15
Val Leu Gly Ala Asn Glu Ala Asp Ala Asp Cys Leu Ser Gly Arg Tyr
20 25 30
Lys Gly Pro Cys Ala Val Trp Asp Asn Glu Thr Cys Arg Arg Val Cys
35 40 45
Lys Glu Glu Gly Arg Ser Ser Gly His Cys Ser Pro Ser Leu Lys Cys
50 55 60
Trp Cys Glu Gly Cys 65
Claims (22)
1. Gène chimère comprenant une séquence codante ainsi que des éléments de régulation en position 5' et 3' hétérologues pouvant fonctionner dans une plante, caractérisé en ce que la séquence codante comprend au moins une séquence d'ADN codant pour la drosomycine.
2. Gène chimère selon la revendication 1, caractérisé en ce que la séquence d'ADN code pour la drosomycine mature.
3. Gène chimère selon la revendication 2, caractérisé en ce que la séquence d'ADN est représentée par la SEQ ID 3.
4. Gène chimère selon la revendication 1, caractérisé en ce que la séquence d'ADN code pour la drosomycine pre-pro.
5. Gène chimère selon la revendication 4, caractérisé en ce que la séquence d'ADN est représentée par la SEQ ID 5.
6. Gène chimère selon la revendication 1, caractérisé en ce que la séquence d'ADN code pour une protéine de fusion ubiquitine-drosomycine.
7. Gène chimère selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que la séquence codante comprend en outre au moins un gène de tolérance aux herbicides.
8. Gène chimère selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que la séquence codante comprend en outre au moins une séquence codante pour un autre peptide susceptible de conférer à la plante des résistances à d'autres maladies d'origine bactérienne ou fongique.
9. Gène chimère selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que les éléments de régulations comprennent les séquences promotrices, les activateurs de transcription, les peptides de transit et/ou les séquences terminatrices.
10. Gène chimère selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que la séquence de régulation promotrice est choisie parmi les séquences promotrices d'origine bactérienne, virale ou végétale.
11. Gène chimère selon la revendication 10, caractérisé en ce que la séquence de régulation promotrice est choisie parmi le promoteur du gène de la petite sous-unité de ribulose-biscarboxylase (RuBisCO) ou celui de la mosaique du choux fleur (CAMV 19S ou 35S).
12. Gène chimère selon la revendication 10, caractérisé en ce que la séquence de régulation promotrice comprend au moins un promoteur d'histone.
13. Vecteur pour la transformation des plantes caractérisé en ce qu'il contient au moins un gène chimère selon l'une des revendications 1 à 12.
14. Cellule végétale transformée contenant au moins un ADN tel que défini dans l'une des revendications 1 à 12.
15. Plante résistante aux maladies, caractérisée en ce qu'elle comprend une cellule transformée selon la revendication 14.
16. Plante selon la revendication 15, caractérisée en ce qu'elle est obtenue par régénération à partir d'une cellule transformée selon la revendication 13.
17. Procédé de transformation des plantes pour les rendre résistantes aux maladies, caractérisé en ce qu'on insère un ADN selon l'une des revendications 1 à 6.
18. Procédé de transformation des plantes pour les rendre résistantes aux maladies fongiques, caractérisé en ce qu'on insère un ADN selon l'une des revendications 1 à 6.
19. Procédé selon l'une des revendications 17 ou 18, caractérisé en chaque le transfert est effectué avec Agrobacterium tumefaciens ou Agrobacterium rhizogenes.
20. Procédé selon l'une des revendications 17 ou 18, caractérisé en ce que le transfert est effectué par apport par bombardement à l'aide de particules chargées de 1'ADN.
21. Procédé selon l'une des revendications 17 à 20, caractérisé en ce que l'on insère également au moins un gène de tolérance aux herbicides.
22. Procédé selon l'une des revendications 17 à 21, caractérisé en ce que l'on insère également au moins une séquence codante pour un autre peptide susceptible de conférer à la plante des résistances à d'autres maladies d'origine bactérienne ou fongique.
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Citations (7)
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|---|---|---|---|---|
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-
1997
- 1997-07-11 FR FR9709115A patent/FR2766206A1/fr active Pending
-
1998
- 1998-07-09 ZA ZA986093A patent/ZA986093B/xx unknown
Patent Citations (7)
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Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| H. LEE ET AL.,: "Structure and expression of ubiquitin genes of drosophila melanogaster", MOLECULAR AND CELLULAR BIOLOGY, vol. 8, no. 11, 1988, WASHINGTON, DC, US, pages 4727 - 4735, XP000644354 * |
| P. FELHBAUM ET AL.,: "Insect immunity. Septic injury of Drosophila induces the synthesis of a potent antifungal peptide with sequence homology to plant antifungal peptides", JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, vol. 269, 1994, BETHESDA, MD, US, pages 33159 - 33163, XP002061373 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ZA986093B (en) | 1999-01-22 |
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