CN111217899A - 一个参与桃芳樟醇合成调控的转录因子PpbHLH1及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一个参与桃芳樟醇合成调控的转录因子PpbHLH1及其应用，所述转录因子PpbHLH1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。所述转录因子PpbHLH1能够结合萜类合成酶PpTPS3基因启动子区的E‑box(CACATG)结合位点，激活PpTPS3基因的表达，进而促进桃芳樟醇含量的增加。经过验证，桃的PpbHLH1基因表达与芳樟醇含量呈正相关关系。采用遗传转化技术过量表达PpbHLH1基因，显著促进了芳樟醇积累，所述PpbHLH1可促进桃芳樟醇生物合成、促进基因PpTPS3表达，以及在在促进基因PpTPS3表达中的应用，作为桃果实开展基因工程与改良育种的重要候选基因，提升桃果实的芳香品质。

Description

一个参与桃芳樟醇合成调控的转录因子PpbHLH1及其应用

技术领域

本发明涉及植物分子生物技术和基因工程技术领域，涉及一个参与桃果实挥发性萜烯类物质芳樟醇合成调控的转录因子PpbHLH1及其应用。

背景技术

桃(Prunus Persica)属于蔷薇科、桃属植物，原产于中国，在世界各地均有栽植。桃作为重要的大众经济水果，其基因组较小，可以作为蔷薇科植物研究的模式材料。芳香是影响桃果实消费的重要品质，芳樟醇作为一种单萜醇，具花香、甜香和醇香，是桃果实香味形成的重要物质基础。此外，芳樟醇在植物防御反应及植物间信号转导中发挥重要作用。芳樟醇是重要的化学信息素，可吸引植物取食害虫的天敌或直接作为一些蚜虫的驱虫剂，也具有一定抗菌作用。因此，鉴别参与芳樟醇合成调控的转录因子具有重要生物学和产业意义。

挥发性芳樟醇的合成由萜类合成酶TPS催化，TPS基因目前已经在番茄，苹果，葡萄，猕猴桃，小苍兰等多个物种上有研究，而TPS基因表达水平受转录因子调控。转录因子是一类反式作用因子，通常能够与靶标基因启动子上的顺式作用元件结合，调控靶标基因的表达水平。目前，鉴别出的参与转录调控萜类物质代谢的多个转录因子家族成员主要来自于AP2/ERF，bHLH，MYB，NAC，WRKY和bZIP家族。针对转录调控芳樟醇代谢的研究较少。主要集中在模式植物番茄中，SlMYC1和SlWRKY73可激活番茄芳樟醇合成酶SlTPS5，且SlMYC1在反式激活SlTPS5启动子中表现出与锌指类转录因子萜类化合物SlEOT1有协同调控作用。桃果实中与SlMYC1，SlWRKY73和SlEOT1同源的转录因子均不能激活PpTPS3启动子。桃果实芳樟醇生物合成的上游调控因子尚不明确，比如还未鉴定出调控芳樟醇合成的转录因子。

发明内容

本发明的目的在于提供一个参与桃果实芳樟醇合成调控的转录因子PpbHLH1，转录因子PpbHLH1能够促进芳樟醇的生物合成。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种参与挥发性萜烯类物质芳樟醇合成调控的转录因子PpbHLH1，所述PpbHLH1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述PpbHLH1的PCR扩增的上游引物具有如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列，所述PpbHLH1的PCR扩增的下游引物具有如SEQ ID No.3所示的核苷酸序列。

本发明提供了上述方案所述转录因子PpbHLH1编码的蛋白质，所述蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

本发明还提供了一种包含上述方案所述转录因子PpbHLH1的重组载体，所述重组载体为PpbHLH1-pGreen II 002962-SK。

本发明还提供了一种包含上述方案所述重组载体的重组微生物，所述微生物是农杆菌GV3101::pSoup菌株，所述重组载体为PpbHLH1-pGreen II 002962-SK。

本发明的另一个目的是提供所述转录因子PpbHLH1在促进桃果实挥发性萜烯类物质芳樟醇的合成中的应用。

本发明的再一个目的是提供所述的转录因子PpbHLH1在促进基因PpTPS3表达中的应用。

本发明的又一个目的是提供所述的转录因子PpbHLH1在桃树育种中的应用；所述应用优选为转录因子PpbHLH1在桃果实香气品质改善的基因工程育种中的应用。

本发明的有益效果：本发明提供了一个参与桃芳樟醇合成调控的转录因子PpbHLH1，属于植物分子生物技术和基因工程技术领域，所述PpbHLH1具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。本发明中，所述转录因子PpbHLH1能够结合萜类合成酶PpTPS3基因启动子区的E-box(CACATG)结合位点，激活PpTPS3基因的表达，进而促进桃芳樟醇含量的积累。经过验证，在不同桃品种中，PpbHLH1的基因表达与PpTPS3转录本及芳樟醇含量呈正相关关系；在桃果实的发育阶段及采后的紫外线B处理中，PpbHLH1基因表达的变化都先于PpTPS3基因表达及芳樟醇的含量变化。采用遗传转化技术过量表达PpbHLH1基因可以增加果实的芳樟醇含量。由此表明，所述PpbHLH1可显著促进桃芳樟醇生物合成，提升桃果实的芳香品质。

附图说明

图1为10个品种桃果实中芳樟醇含量及PpbHLH1和PpTPS3的表达量。

图2为不同桃品种中桃PpbHLH1的表达与PpTPS3的表达的相关性。

图3为不同桃品种中桃PpbHLH1的表达与芳樟醇含量的相关性。

图4为不同生长发育阶段的湖景蜜露果实中芳樟醇含量。

图5为不同生长发育阶段的湖景蜜露果实中PpTPS3的表达量。

图6为不同生长发育阶段的湖景蜜露果实中PpbHLH1的表达量。

图7为紫外线B处理下湖景蜜露中芳樟醇含量(**P<0.01)。

图8为紫外线B处理下湖景蜜露中PpTPS3的表达量(**P<0.01)。

图9为紫外线B处理下湖景蜜露中PpbHLH1的表达量(**P<0.01)。

图10表示PpbHLH1对PpTPS3启动子的转录激活效应(**P<0.01)。

图11表示酵母单杂交检测PpbHLH1与PpTPS3启动子结合。

图12表示SDS-PAGE电泳检测PpbHLH1重组蛋白。

图13表示EMSA检测PpbHLH1与PpTPS3启动子结合；

图14表示PpbHLH1编码蛋白定位在细胞核；

图15表示过量表达PpbHLH1的桃果肉中PpbHLH1的相对表达量(**P<0.01)；

图16表示过量表达PpbHLH1的桃果肉中PpTPS3的相对表达量(**P<0.01)；

图17表示过量表达PpbHLH1的桃果肉中芳樟醇的含量变化(**P<0.01)。

具体实施方式

本发明结合附图和实施例作进一步的说明。

本发明提供了一种参与挥发性萜烯类物质芳樟醇合成调控的转录因子PpbHLH1，所述PpbHLH1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述转录因子PpbHLH1属于bHLH家族。

本发明中，所述PpbHLH1的PCR扩增模板优选为桃果实cDNA；所述桃果实cDNA优选的采用桃果实总RNA逆转录合成；本发明对桃果实cDNA的合成方法没有特殊要求，采用本领域常规的植物cDNA合成方法即可，在本发明具体实施过程中，采用TAKARA试剂盒进行合成；本发明对桃果实总RNA的提取方法没有特殊限定，采用本领域常规的植物细胞总RNA提取方法即可。

本发明提供了上述方案所述转录因子PpbHLH1编码的蛋白质，所述蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述蛋白质含有344个氨基酸；所述蛋白质的N端含有核定位信号NLS，C端含有保守的bHLH结构域。

本发明还提供了一种包含上述方案所述转录因子PpbHLH1的重组载体；所述重组载体优选的以pGreen II 002962-SK为原始载体，在pGreen II 002962-SK的多克隆位点插入转录因子PpbHLH1；优选的，所述PpbHLH1插入在原始载体pGreen II 002962-SK上的BamHI和Sal I酶切位点之间。

本发明中，所述重组载体优选的采用以下方法制备获得：以cDNA为模板，结合引物对SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3获得PpbHLH1的PCR产物；pGreen II 002962-SK通过BamH I(NEB)和Sal I(NEB)进行双酶切，回收后连接，得到PpbHLH1-pGreen II 002962-SK。

本发明中，所述双酶切体系优选为：Cutsmart buffer 5μL、载体1μg,内切酶各1μL，水补足50μL；所述双酶切程序优选为：37℃酶切3h。

本发明中，所述回收优选的采用TAKARA的凝胶回收试剂盒进行；所述连接的试剂盒优选的采用Vazyme的一步克隆试剂盒进行。

本发明还提供了一种包含上述方案所述重组载体的重组微生物；所述重组微生物优选的以农杆菌为原始微生物，在农杆菌中转入重组载体PpbHLH1-pGreen II 002962-SK；本发明对所述转入的方法没有特殊限制，采用本领域常规转化方法即可，本发明的具体实施过程中，采用电击转化法进行转化。

本发明的具体实施过程中，优选的转化步骤为：50μL农杆菌感受态加入5μL重组载体，冰上放置30min，转入Bio-Rad 2mm电击杯，通过Bio-Rad GenePulser Xcell在2.5Kv条件电击转入。

本发明还提供了上述方案所述的转录因子PpbHLH1在促进基因PpTPS3表达中的应用。

本发明中，所述转录因子PpbHLH1能够结合参与桃芳樟醇合成的萜类合成酶PpTPS3基因启动子区的E-box(CACATG)结合位点，进而激活PpTPS3基因的表达。

本发明还提供了上述方案所述的转录因子PpbHLH1在桃树育种中的应用；所述应用优选为转录因子PpbHLH1在桃果实香气品质改善的基因工程育种中的应用。

下面结合实施例对本发明提供的一个参与桃芳樟醇合成调控的转录因子PpbHLH1及其应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1桃PpbHLH1、PpTPS3的表达及挥发性芳樟醇含量检测

(一)实验方法

1.桃果实材料

不同品种桃果实材料：

采集九个桃品种果实的成熟期样品，包括‘早白凤79号’(ZBF9H)，‘撒花红蟠桃’(SHHPT)，‘罐桃5号’(GT5H)，‘玉露蟠桃’(YLPT)，‘西圃大玉露’(XPDYL)，‘唐行白花’(TXBH)，‘早熟离核玉露’(ZSLHYL)，‘徐蜜’(XM)，‘93-17-36’(93-17-36)和‘霞晖8号’(XH8H)，设置三个生物学重复，每个重复包含5个桃果实，样品经液氮冷冻后于-80℃保存待用。

桃果实发育阶段材料：

以水蜜桃品种‘湖景蜜露’(Prunus persica L.Batsch cv.Hujingmilu)为材料，其果实采自浙江省奉化市水蜜桃研究所。样品当天采收，并运达实验室，挑选大小、成熟度一致，且未受病虫害和机械伤的果实为材料。桃果实分别在四个发育阶段(S1，S2，S3和S4)进行采收，S1表示第一个快速生长期(即为花后34天(34DAB))，S2表示硬核期(即为花后7l天(71DAB))，S3表示第二次快速生长期(即为花后94天(94DAB))，S4表示成熟期(即为花后108天(108DAB))。S4成熟阶段的桃果实采收后，在20℃和90-96％相对湿度的条件下转货架3天(S4+3d，S5)进行取样。、每个取样时间点设置3个生物学重复，果实每个重复5个，样品经液氮冷冻后于-80℃保存待用。

紫外线B处理及取样：

另外，将S4成熟阶段桃果实随机分成两组，并贮藏在没有任何自然光的气候室(20℃，相对湿度90-96％)中。将处理组的桃果实平行摆放在紫外线B紫外灯(波长为280-315nm)下照射48h。紫外线B灯管(Luzchem Research，Gloucester，ON，加拿大)距离果实高度约50cm，光强为1.5w/m²。对照果实用锡箔纸覆盖以避免暴露于紫外光下，并置于被紫外线B辐射的样旁。实验设置三个生物学重复，每个重复包含5个桃果实，取样时，切下约1mm厚度的果皮组织，并迅速用液氮冷冻后放置于-80℃保存待用。

2.RNA提取及转录组测序

经液氮充分研磨后的果实样品1g，果皮样品0.1g，加入到有4mL 65℃预热的CTAB/β-巯基乙醇提取缓冲液的离心管中，涡旋混合，65℃水浴5min；加入4mL氯仿：异戊醇(24：1)抽提液，充分涡旋混合；15℃10000rpm离心10min，吸取上清液到新的离心管，重新抽提一次；上清液吸取到新的离心管中，加入1/4体积的10mol/L的LiCl，4℃放置过夜；次日，4℃10000rpm离心20min，倒掉上清液，将离心管倒置于纸巾上以去除多余的溶液；加入400μL65℃预热的SSTE，溶解沉淀；再加入400μL氯仿：异戊醇(24：1)抽提液，涡旋混合；转移至1.5mL离心管中4℃10000rpm离心10min，吸上清液到新的离心管中加入2倍体积的-20℃预冷的无水乙醇，上下颠倒混匀，-80℃放置30min；4℃10000rpm离心25min，去上清液，短暂离心后吸出残余液体，将沉淀在通风橱晾干(约10min)；加入20μL DEPC水溶解沉淀，得到总RNA样品后，送由百迈克生物科技有限公司进行转录组测序分析。

3.桃果实挥发性芳樟醇含量分析

桃果肉样品经液氮研磨后称取5g，果皮样品称取1g，加入3mL 200mM EDTA溶液、3mL 20％CaCl₂溶液及30μL的内标2-辛醇(0.8mg/mL)密封后混合均匀，恒温平衡30min后，使用65μm聚二甲基硅氧烷和二乙烯苯(PDMS-DVB)萃取头(Supelco Co.)进行30min固相微萃取。萃取头在GC-MS(Agilent 7890-5975)进样口解吸附5min后用DB-WAX毛细管色谱柱(0.25mm，30m，0.25μm，J&W Scientific)进行分离。升温程序为从40℃以3℃·min^-1速率升至100℃,然后再以5℃·min^-1速率升至245℃。以1.0mL·min^-1氦气为载气，MS离子源温度230℃，采用电子轰击电离方式，电子能量为70eV，质谱扫描范围为35到350m/z。采用质谱库NIST-8(NIST/EPA/NIH，美国)和保留指数(Retention index，RI)进行物质鉴别，内标面积归一化方法进行物质的浓度计算。实验结果参见图1、图2、图3、图4、图5、图6、图7、图8和图9，图1为10个品种桃果实中芳樟醇含量及PpbHLH1和PpTPS3的表达量；图2为不同桃品种中桃PpbHLH1的表达与PpTPS3的表达的相关性；图3为不同桃品种中桃PpbHLH1的表达与芳樟醇含量的相关性；图4为不同生长发育阶段的湖景蜜露果实中芳樟醇含量；图5为不同生长发育阶段的湖景蜜露果实中PpTPS3的表达量；图6为不同生长发育阶段的湖景蜜露果实中PpbHLH1的表达量；图7为紫外线B处理下湖景蜜露中芳樟醇含量；图8为紫外线B处理下湖景蜜露中PpTPS3的表达量；图9为紫外线B处理下湖景蜜露中PpbHLH1的表达量。

(二)实验结果

在不同桃品种中，PpbHLH1的表达与PpTPS3的表达及芳樟醇的含量都有显著的正相关关系。随着果实的生长发育，挥发性芳樟醇含量逐渐积累，在S5达到最高，PpTPS3的表达量逐渐增加并同样在S5阶段最高，与芳樟醇含量呈现正相关关系；PpbHLH1的表达量整体呈现先上升至花后71天(71DAB)最高后逐渐下降的趋势，明显增加趋势先于PpTPS3的表达量及芳樟醇含量的增加。采后紫外线B处理桃果实48h后，芳樟醇含量和PpTPS3的表达量显著被抑制，而PpbHLH1的表达量被显著抑制程度明显高于芳樟醇含量及PpTPS3的表达量的下降程度。推测PpbHLH1是调控PpTPS3表达进而影响了芳樟醇合成的转录因子。

实施例2烟草双荧光素酶验证PpbHLH1转录激活PpTPS3启动子

(一)实验方法

1.cDNA合成及DNA提取

取1.0μg果实总RNA，用TAKARA试剂盒去除基因组DNA后，按说明书操作逆转录合成cDNA。利用CTAB法提取桃果实基因组DNA。经液氮研磨后的桃果实材料1g，加入4ml65℃预热的CTAB/β-巯基乙醇提取液，涡旋混匀，65℃水浴1h；加入4ml氯仿/异戊醇(24:1)，涡旋混匀；10000rpm，15℃离心10min，取上清，加入2ml 5mol/L醋酸钠，4ml经-20℃预冷的异丙醇，颠倒混匀后于-20℃放置1h；12000rpm离心15min，弃上清；沉淀经1ml 75％乙醇洗2次，去上清后晾干乙醇，加100μL水溶解沉淀，即为桃果实DNA。

2.重组载体构建及农杆菌转化

根据PpbHLH1在桃基因组数据库

(https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html#！info？alias＝Org_Ppersica)中的参考序列，利用PCR技术，以桃果实cDNA为模板，结合引物对SEQ ID NO.2和SEQ IDNO.3扩增获得PpbHLH1全长SEQ ID NO.1。PCR反应体系为50μL，成分分别为：25μLPrimeSTAR Max Premix(2x)酶(TAKARA)，上下游引物(10μM)各1μL，1μL桃果实cDNA，22μLH₂O。PCR反应程序为：98℃10s；55℃15s，72℃10s，35个循环。利用Vazyme一步克隆试剂盒将PCR产物与经限制性内切酶BamH I和Sal I在37℃水浴条件下酶切3h后的pGreen II002962-SK载体5μL连接产物加入20μL DH5α感受态，冰上放置30min，42℃热激90s，转化DH5α，挑取阳性菌落后测序验证。结合引物对SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6，以桃果实DNA为模板通过PCR扩增获得ATG上游2000bp长度的PpTPS3启动子序列(SEQ ID NO.7，PpTPS3-promoter-2000)，利用上述方法构建于Hind III和Nco I酶切后的pGreen II 0800-LUC载体。将序列确认正确的PpbHLH1-pGreen II 002962-SK载体及PpTPS3-pro-pGreen II0800-LUC载体利用电击转化法，分别转入农杆菌GV3101::pSoup中，并分别挑取阳性克隆保存。

3.农杆菌侵染烟草叶片及LUC/REN荧光检测

含有PpbHLH1-pGreen II 002962-SK及PpTPS3-pro-pGreen II 0800-LUC载体的农杆菌用渗透液(10mM MgCl₂、10mM MES、150μM乙酰丁香酮、pH为5.6)悬浮后调整OD₆₀₀＝0.75，以10:1(v/v)混合均匀后用注射器注入本氏烟叶片，每棵烟草注射3片叶片，空的pGreen II002962-SK载体代替PpMADS2-pGreen II 002962-SK作为对照。注射后的烟草于25℃，16h/8h(光照/黑暗)培养3d后检测LUC及REN荧光值。用直径4mm的打孔器在叶片注射口附近取样，每株烟草取6个样品，放置于100μL的l x PBS溶液中研磨，吸取上清50μL，用Dual-Luciferase Reporter Assay System(Promega，美国)和Modulus Luminometer(Promega，美国)检测叶片中两种荧光素酶(LUC和REN)的比值，每个结果至少有3次独立试验重复。实验结果参见图10，图10表示PpbHLH1对PpTPS3启动子的转录激活效应。

(二)实验结果

烟草双荧光素酶结果显示，PpbHLH1能够显著激活PpTPS3启动子活性，与空载相比，激活倍数超过4倍。

实施例3酵母单杂交Y1H验证PpbHLH1与PpTPS3-promoter的结合

(一)实验方法

1.重组载体构建

结合引物对SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9，利用PCR技术扩增获得PpbHLH1，PCR体系及反应程序同实施例2。利用Vazyme一步克隆试剂盒将PCR产物与经限制性内切酶EcoR I和BamH I在37℃水浴条件下酶切3h后的pGADT7载体5μL连接产物加入20μL DH5α感受态，冰上放置30min，42℃热激90s，转化DH5α，挑取阳性菌落后测序验证。结合引物对SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11，以桃果实DNA为模板通过PCR扩增获得ATG上游2000bp长度的PpTPS3启动子序列(SEQ ID NO.7)，利用上述方法构建于Hind III和Sma I酶切后的pAbAi载体。

2.酵母转化及结合验证

测序正确的PpTPS3-pro-pAbAi载体用限制性内切酶BstB I(NEB)在65℃条件下酶切3h，将线性化后的PpTPS3-pro-pAbAi载体依据Matchmaker^TM Gold Yeast One-Hybrid(Clontech，美国)说明书转入酵母Y1H菌株中，测序验证，并用含不同的Aureobasidin A(AbA)浓度(100、200、300、400、500、700、1000ng/ml)和SD缺uracil(SD-Ura)的板上筛选合适浓度。将构建成功的PpbHLH1-pGADT7载体及pGADT7空载体分别转化到含启动子序列线性化质粒的YIH酵母菌株中，pGADT7空载体作为对照，根据前面筛选得到的合适AbA浓度，在SD缺leucine(SD-Leu)的板上验证转录因子和启动子之间的互作。实验结果参见图11，图11表示酵母单杂交检测PpbHLH1与PpTPS3启动子结合。

(二)实验结果

在AbA筛选浓度为200ng/ml的SD-Leu板上，转入pGADT7空载体的含启动子序列线性化质粒的YIH酵母菌株未生长，而转入PpbHLH1-pGADT7载体的YIH酵母菌株可正常生长，证明PpbHLH1可以与PpTPS3启动子结合。

实施例4EMSA验证PpbHLH1与PpTPS3-promoter结合

(一)实验方法

1.重组载体构建及大肠杆菌转化

结合引物对SEQ ID NO.12和SEQ ID NO.13，利用PCR技术扩增获得PpbHLH1，PCR体系及反应程序同实施例2。利用Vazyme一步克隆试剂盒将PCR产物与经限制性内切酶BamH I和EcoR I在37℃水浴条件下酶切3h后的pGEX-4T-1载体5μL连接产物加入20μL DH5α感受态，冰上放置30min，42℃热激90s，转化DH5α，挑取阳性菌落后测序验证。将序列确认正确的PpbHLH1-pGEX-4T-1载体利用热激转化法转入BL21(DE3)中，挑取阳性克隆保存。

2.诱导表达及重组蛋白的纯化

转化后的BL21(DE3)菌于20mL含AMP(100mg/L)的LB中培养12h，然后以1:50转移至500mL含AMP(100mg/L)的LB中继续培养至OD600＝0.5-0.8，加入IPTG(终浓度0.5mmol/L)，16℃诱导表达24h，离心(5000g，15min，15℃)收集菌。用25mL 1x PBS缓冲液重悬。重悬后的菌经过超声破碎，10000rpm，4℃离心30min。上清液过

的除菌膜(0.45μm,diameter 33mm,Millipore，美国)，除菌后的上清液按照试剂盒GST-tag ProteinPurification Kit(Beyotime)说明书纯化得到粗蛋白并通过SDS-PAGE电泳检测。粗蛋白液用脱盐柱PD-10(GE Healthcare，英国)进行脱盐，并将蛋白置换到Tris-HCl缓冲液(100mmol/L Tris,2mmol/L DTT,pH 7.5)，加入10％甘油储存在超低温冰箱。

3.PpTPS3-promoter序列分析及EMSA验证

EMSA通过Lightshift Chemilunimescent EMSA kit(Thermo)根据说明书操作完成。根据PpTPS3-pro-2000上预测获得的E-box位点，合成双链探针SEQ ID NO.14和SEQ IDNO.15，探针经过DNA 3'End Biotinylation Kit(Thermo)完成生物素标记，未标记的探针作为竞争探针；将E-box序列突变为SEQ ID NO.16和SEQ ID NO.17，经过生物素标记作为突变探针。在25℃下，探针与重组蛋白在Binding buffer(10×concentration:100mM Tris,500mM KCl,10mM dithiothreitol,pH 7.5)中孵育25min，反应体系为20μL(0.2pmoL探针，2μg融合蛋白，1μg poly(Di-dC))。反应产物经过PAGE电泳后转移至带正电尼龙膜，380mA 4℃电泳30min。紫外交联30min后，通过化学发光检测仪检测。实验结果参见图12和图13，图12表示SDS-PAGE电泳检测PpbHLH1重组蛋白；图13表示EMSA检测PpbHLH1与PpTPS3启动子结合。

(二)实验结果

GST-PpbHLH1可以与生物素标记的E-box探针结合而发光，加入未标记的竞争探针后发光减弱，并且随竞争探针浓度增加，发光更弱；当生物素标记的探针序列突变后，不能与GST-PpbHLH1重组蛋白结合，无发光结合条带。结果表明，GST-PpbHLH1重组蛋白可与PpTPS3启动子上的E-box(CACATG)位点结合。

实施例5PpbHLH1定位在细胞核

(一)实验方法

1.载体构建及农杆菌转化

结合引物对SEQ ID NO.18和SEQ ID NO.19，利用PCR技术扩增获得去除终止密码子的PpbHLH1，PCR体系及反应程序同实施例2。利用Vazyme一步克隆试剂盒将PCR产物与经限制性内切酶BamH I和Sal I在37℃水浴条件下酶切3h后的P2300-eGFP载体5μL连接产物加入20μL DH5α感受态，冰上放置30min，42℃热激90s，转化DH5α，挑取阳性菌落后测序验证。将序列确认正确的PpbHLH1-P2300-eGFP载体利用电击转化法，分别转入农杆菌GV3101::pSoup中，并分别挑取阳性克隆保存。

2.烟草叶片侵染

含有PpbHLH1-P2300-eGFP载体的农杆菌用渗透液(10mmol/L MgCl₂、10mmol/LMES、150μmol/L乙酰丁香酮、pH为5.6)悬浮后调整OD₆₀₀＝1.0，用无菌注射器选取生长4周的本氏烟草的第5-6片叶片进行注射。以空载体作为阴性对照。为了确定细胞内结构，选用细胞核表达红色荧光蛋白(Nucleus-RFP)的转基因烟草(Nicotiana benthamiana)进行注射。注射后2d，选取叶片注射部位做成载玻片，使用Zeiss LSM710NLO共聚焦激光扫描显微镜对烟草叶片的绿色荧光蛋白(GFP)进行荧光成像。实验结果参见图14，图14表示PpbHLH1编码蛋白定位在细胞核。

(二)实验结果

烟草瞬时表达结果证明PpbHLH1编码的蛋白定位在细胞核。

实施例6桃果实中瞬时过量表达PpbHLH1基因，增加了PpTPS3的表达及果实中芳樟醇的含量

(一)实验方法

1.桃果实的侵染

将含有PpbHLH1-pGreen II 002962-SK载体的GV3101农杆菌在含卡那霉素(50mg/L)及庆大霉素(25mg/L)的固体培养基上划线28℃培养2d后，挑取单克隆菌株于5mL含卡那霉素与庆大霉素的LB中，过夜培养后转移至500mL LB(Kan 50mg/L+Get 25mg/L)，培养至OD600＝0.8～1.0。4℃，5000g，离心10min收集菌。用等体积渗透液(10mmol/L MES，10mmol/L MgCl₂，150mmol/L乙酰丁香酮，0.04％Triton^RX-100，pH 5.6)重悬，常温放置2h，待用。含空SK载体的农杆菌以同样方法准备，作为对照。

选取转色期的果实，洗净去除表面污物，然后用50％的乙醇溶液消毒1min，再用有效氯含量在75-100mg·L^-1的次氯酸钠水溶液浸泡20min消毒，最后用无菌水漂洗3-5次，在无菌状态下晾干待用。消毒后去除表皮，选取中部果肉，切成为厚度1cm，面积为4-8cm²的小块，将制备好的果肉切片放置在MS固体培养基上，黑暗条件下预培养24-30h。500ml渗透液经过2h诱导后，倒入提前消毒过的真空渗透装置中，将培养基上的切片放入渗透液进行抽真空渗透。每个果实切取的2片一半用来渗透含有重组载体PpbHLH1-SK的菌液，一半用来渗透只含SK空载的菌液，互为对照。真空压力抽至-70Kpa，保持压强直到果肉组织表面气泡渗出速度明显下降，开始缓慢释放真空，让侵染液能够渗入果肉组织，过程大约需要15-20min。侵染后的果肉组织用无菌水漂洗3-5次，晾干后转入新配置的MS固体培养基在25℃培养2天，然后用液氮迅速冷冻果肉组织并储藏在-80℃冰箱。

2.桃果实PpbHLH1、PpTPS3基因表达及香气物质检测

桃果实样品用液氮研磨，利用CTAB法提取总RNA，取1.0μg RNA按(TAKARA)试剂说明书操作合成cDNA。qPCR以桃PpTEF2(SEQ ID NO.20和SEQ ID NO.21)为内参基因，PpbHLH1引物序列为SEQ ID NO.22和SEQ ID NO.23，PpTPS3引物序列为SEQ：NO.24和SEQ ID NO.25。qPCR反应体系包括10μL Ssofast EvaGreen Supermix(Bio-Rad)，上下游引物(10μM)各1μL，2μL cDNA，6μL H₂O。PCR程序为：95℃3min；95℃10s，60℃30s，45个循环；95℃10s；从65℃到95℃，每上升0.5℃读取一次荧光信号值。所用仪器为Bio-Rad CFX96实时荧光定量PCR仪，所有qPCR引物特异性经熔点曲线分析、凝胶电泳分析和qPCR产物测序验证。

经液氮研磨后的果实组织5g用GC-MS分析挥发性芳樟醇含量。方法参照实施例1。实验结果参见图15、图15和图17，图15表示过量表达PpbHLH1的桃果肉中PpbHLH1的相对表达量；图16表示过量表达PpbHLH1的桃果肉中PpTPS3的相对表达量；图17表示过量表达PpbHLH1的桃果肉中芳樟醇的含量变化。

(二)实验结果

在桃果实体内瞬时过量表达PpHLH1基因后，果实中PpTPS3的表达相比对照增加了2.3倍，同时芳樟醇含量比对照增加了30％。因此，PpHLH1在桃果实中可以通过转录激活PpTPS3的表达，进而增加芳樟醇的积累。

由以上实施例可知，本发明提供了一个参与桃芳樟醇合成调控的转录因子PpbHLH1及其应用，PpbHLH1在桃中可以通过转录激活PpTPS3的表达，增加挥发性芳樟醇的含量。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 浙江大学

<120> 一个参与桃芳樟醇合成调控的转录因子PpbHLH1及其应用

<160> 25

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1035

<212> DNA

<213> 桃(Prunus persica)

<400> 1

atggagattt cgtcgatagg agggatgtct gaactgggaa tggaagatcc ctacttcatc 60

aaccagtggc acatgaactc tctggatgaa gtcagcatgc tgccactagc agctccattt 120

ggagagaact ttaaccagtc tcactttcac ccaaatttca atcttaaaac ttctatggat 180

agttgtcata gtggcattga tagacccatg aaacagctca aaactgatgg ctggagttca 240

tgcaaaaccg atcaacacgg atcgaacccg caagttgctt cctctccaaa tattctttcc 300

tttgtcaact ctaatagcac aaaccaaatg ggggttctta agcctaagga ggaggcagca 360

gtgtgttcaa agagcaacaa cagtctccct tctgacatat tgctctctca aagttcgttt 420

ggcaaccaaa gttatttgtt taaggccagt cagggaacaa agagggtcaa cacaaacact 480

aggctttcta caactcaaga tcacattatt gcagaaagga aaaggagaga gaagctcagc 540

caacggttca tagctttatc tgcaatggtt cctggcctaa agaagatgga caaggcttct 600

gttcttggag atgctatcaa gtatatcaaa caactgcagg acaaggtaaa aacacttgag 660

gaacagacca gaaagaaaaa catggaatcc gtcgtctttg tgaagaaaac gcagctcttc 720

gccaacgatg acaactcatc ctcagaagaa aataattcca gtggcccctt tgaggagaca 780

ctgcctgaaa ttgaagcaag gttctgtgac aacaatgtca tgataagaat tcactgtgag 840

aaaagaaaag gagttgtgga gaaaactata gcagaggttg agaagctcca acttaagttc 900

atcaatagca gtgtcttgac atttgggggc tgtgctcttg atgtaaccat tattgctcag 960

atggaagtgg aattcagcct ctcagtgaag gaacttgtca agaatctacg ctctgctttc 1020

gacatgttca tgtga 1035

<210> 2

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 2

agaactagtg gatccatgga gatttcgtcg atagg 35

<210> 3

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 3

cccctcgagg tcgactcaca tgaacatgtc gaaag 35

<210> 4

<211> 344

<212> PRT

<213> 桃(Prunus persica)

<400> 4

Met Glu Ile Ser Ser Ile Gly Gly Met Ser Glu Leu Gly Met Glu Asp

1 5 10 15

Pro Tyr Phe Ile Asn Gln Trp His Met Asn Ser Leu Asp Glu Val Ser

20 25 30

Met Leu Pro Leu Ala Ala Pro Phe Gly Glu Asn Phe Asn Gln Ser His

35 40 45

Phe His Pro Asn Phe Asn Leu Lys Thr Ser Met Asp Ser Cys His Ser

50 55 60

Gly Ile Asp Arg Pro Met Lys Gln Leu Lys Thr Asp Gly Trp Ser Ser

65 70 75 80

Cys Lys Thr Asp Gln His Gly Ser Asn Pro Gln Val Ala Ser Ser Pro

85 90 95

Asn Ile Leu Ser Phe Val Asn Ser Asn Ser Thr Asn Gln Met Gly Val

100 105 110

Leu Lys Pro Lys Glu Glu Ala Ala Val Cys Ser Lys Ser Asn Asn Ser

115 120 125

Leu Pro Ser Asp Ile Leu Leu Ser Gln Ser Ser Phe Gly Asn Gln Ser

130 135 140

Tyr Leu Phe Lys Ala Ser Gln Gly Thr Lys Arg Val Asn Thr Asn Thr

145 150 155 160

Arg Leu Ser Thr Thr Gln Asp His Ile Ile Ala Glu Arg Lys Arg Arg

165 170 175

Glu Lys Leu Ser Gln Arg Phe Ile Ala Leu Ser Ala Met Val Pro Gly

180 185 190

Leu Lys Lys Met Asp Lys Ala Ser Val Leu Gly Asp Ala Ile Lys Tyr

195 200 205

Ile Lys Gln Leu Gln Asp Lys Val Lys Thr Leu Glu Glu Gln Thr Arg

210 215 220

Lys Lys Asn Met Glu Ser Val Val Phe Val Lys Lys Thr Gln Leu Phe

225 230 235 240

Ala Asn Asp Asp Asn Ser Ser Ser Glu Glu Asn Asn Ser Ser Gly Pro

245 250 255

Phe Glu Glu Thr Leu Pro Glu Ile Glu Ala Arg Phe Cys Asp Asn Asn

260 265 270

Val Met Ile Arg Ile His Cys Glu Lys Arg Lys Gly Val Val Glu Lys

275 280 285

Thr Ile Ala Glu Val Glu Lys Leu Gln Leu Lys Phe Ile Asn Ser Ser

290 295 300

Val Leu Thr Phe Gly Gly Cys Ala Leu Asp Val Thr Ile Ile Ala Gln

305 310 315 320

Met Glu Val Glu Phe Ser Leu Ser Val Lys Glu Leu Val Lys Asn Leu

325 330 335

Arg Ser Ala Phe Asp Met Phe Met

340

<210> 5

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 5

ggtatcgata agcttaagat agaagtcagc tggaa 35

<210> 6

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 6

tggcgtcttc catgggtcgt taatatgccg agtat 35

<210> 7

<211> 2000

<212> DNA

<213> 桃(Prunus persica)

<400> 7

aagatagaag tcagctggaa gaacagatca aggcagagaa ggtaaaggcg gtaaatttga 60

aacgtgcagg aaaacaagct gaggccttgg atgctcttcg gaaggccaag ttgctcgaaa 120

agaagctgaa ttcctcgcct tcgaagtgaa aagtgaagac gtcaccttgg taagtttgga 180

aggtccatta ttcgttacaa gctatgaagc tcgatagctc agtaaatgtt gttggtatgc 240

aaaattagcc aggaaacagg atgattgagg atttatgcaa gaatggtttt actcattgaa 300

tggtaataac gaaaatgtat catcataatg taaaggggca ttttctgcct gcacacttgg 360

agatgtgttt ttgtcttgtt gcttaaattt tttctctttt tccttgtgta ttatttgtgg 420

aagttgtaat agcacgagat gcatgtatca gcagcagctt caactgattc agtggcatcg 480

ttacatttgt tagcatcaac ctcatttctc ctttcagttt attgactcca tatgggacca 540

gaaggttatg caagggagag taacagttgc tgctatagat agaagaaaat ctcgatttta 600

gttgtggaaa ttgccaattt accatcataa tggtaaaata aataggatga gttaaacctg 660

aatctgtaac tcttgatata taccatgtat gtggtgaaaa atatacacgt atttgtaaca 720

acaaaaatgc aatataaagt agggagcttg tagctacacg gttaagagca ctcaatgttt 780

catttatgcg agcaagttgt gggaaaaaat ttcagagtca agattgcgta attgtattct 840

attatgcaag caggttctta atcaatgtct aatcagcact tacataattc tctccgaaca 900

ataccagaaa tgtggaattt gagaaatctg agattcctcc gttcaatgat agaaagaaag 960

acgacacaac actcgttttg gttgagaaag tcctacgatg ccctcccgct tcatacaaaa 1020

cgatatcatc gtgtgtctcc tacacagagt ttgggacgta atcaatcctt tcaagcggac 1080

aatcacatga tgcgtcgtcg ttctcatcag catagtccca aattttgggt tggtacgacc 1140

acgtgaaatt acgttatggt atttcgttat tttcttcgca ccttcttttc ctttttttaa 1200

tgaacttcgt ggcaactcat gaacgtcgtg aaaattgact actttttttg gcaatgaaga 1260

atgaccgcta cccactaatt caagttgaag ttaatgatcc ttaatttctt gttcaaacat 1320

atcacaaaac aaaaaaagga gaccacacat aaataaaagg aggaaagaat aaaaacactt 1380

ctaaagtgga agtactagaa aataggaatt cgtgtcccaa aacaagctgt agacttgtca 1440

aatttatctt agcttagggt gaaatagggg ctcaaattaa aatataaaaa aatctcatat 1500

gaaatggaat ttagaaacac acataaaatt cattaataat taaaattaaa ttcaataggg 1560

ccagctatca gctatcattt tttagattta tttatagaaa ttaaatagta tataatttat 1620

ctatatcact agtgctaaga ataggtatat aactaaatat ttccaaataa aataaaaaca 1680

ggagctgcaa caaccgacac tgaaatgatg ataagcacat ggatatatgg cctggaaaac 1740

tacttgtcct gcatcaatta ttgttagcgt tttggatacg ttgtaacttc tttttctccc 1800

accaaataaa tgcgcgcgca aaacgttgtg tagattgacg gagatgtcac cactcaagtc 1860

tgcaacgcgt tctcattgtc gttgtggcct ataaattggg gggatgactt cattaattta 1920

ttacaagtat tctagttctc gtccaaaatc aaactgtttc tttgttttct cctttgacct 1980

atactcggca tattaacgac 2000

<210> 8

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 8

gaggccagtg aattcatgga gatttcgtcg atagg 35

<210> 9

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 9

gagctcgatg gatcctcaca tgaacatgtc gaaag 35

<210> 10

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 10

tgaattgaaa agcttaagat agaagtcagc tggaa 35

<210> 11

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 11

cgacagatcc ccggggtcgt taatatgccg agtat 35

<210> 12

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 12

gttccgcgtg gatccatgga gatttcgtcg atagg 35

<210> 13

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 13

tcgacccggg aattctcaca tgaacatgtc gaaag 35

<210> 14

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 14

tgaaatgatg ataagcacat ggatatatgg cctggaaaac 40

<210> 15

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 15

gttttccagg ccatatatcc atgtgcttat catcatttca 40

<210> 16

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 16

tgaaatgatg ataagagtgg agatatatgg cctggaaaac 40

<210> 17

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 17

gttttccagg ccatatatct ccactcttat catcatttca 40

<210> 18

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 18

ggtacccggg gatccatgga gatttcgtcg atagg 35

<210> 19

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 19

gctcaccatg tcgaccatga acatgtcgaa agcag 35

<210> 20

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 20

ggtgtgacga tgaagagtga tg 22

<210> 21

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 21

tgaaggagag ggaaggtgaa ag 22

<210> 22

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 22

cccctttgag gagacactgc 20

<210> 23

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 23

tgtcgaaagc agagcgtaga 20

<210> 24

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 24

ggtcgcggta taactcagca 20

<210> 25

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 25

caaagtcatc ccagagccgt 20

Claims (6)

1.一个参与桃芳樟醇合成调控的转录因子PpbHLH1，其特征在于，所述转录因子PpbHLH1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述转录因子PpbHLH1的PCR扩增的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，所述转录因子PpbHLH1的PCR扩增的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。

2.权利要求1所述的一个参与桃萜类芳香物质芳樟醇生物合成的转录因子PpbHLH1，其特征在于，所述转录因子PpbHLH1编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

3.权利要求1所述的转录因子PpbHLH1在促进桃果实中芳樟醇合成中的应用。

4.权利要求1所述的转录因子PpbHLH1在促进基因PpTPS3表达中的应用。

5.权利要求1所述的转录因子PpbHLH1在基因工程中的应用。

6.权利要求5所述的应用，其特征在于，所述转录因子PpbHLH1作为桃果实开展基因工程与改良育种的重要候选基因，提升桃果实芳香品质。

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