CN109913469B - 一种参与桃酯类芳香物质合成调控的转录因子PpNAC1及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种参与桃酯类芳香物质合成调控的转录因子PpNAC1，属于植物分子生物技术和基因工程技术领域，所述PpNAC1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明中，所述转录因子PpNAC1能够与参与酯类物质合成的酰基转移酶PpAAT1基因的启动子区(T/A)NN(C/T)(T/C/G)TNNNNNNNA(A/C)GN(A/C/T)(A/T)结合位点及ACGTA结合位点进行结合，激活PpAAT1基因的表达，进而促进酯类芳香物质合成。经过验证，随着桃果实成熟，PpNAC1表达持续增加。PpNAC1的表达模式与果实中挥发性酯类的积累呈正相关关系，且基因表达的增加先于酯类物质合成的增加。

Description

一种参与桃酯类芳香物质合成调控的转录因子PpNAC1及其 应用

技术领域

本发明涉及植物分子生物技术和基因工程技术领域，尤其涉及一种参与桃酯类芳香物质合成调控的转录因子PpNAC1及其应用。

背景技术

桃(Prunus Persica)属于蔷薇科、桃属植物，原产于中国，在世界各地均有栽植。香气是桃果实重要的品质指标，影响着消费者的喜好。在桃果实中可检测到100多种挥发性物质，其中，脂肪酸途径是桃果实香气物质的最主要来源，主要包括C9类化合物、C6醇类及醛类、酯类、内酯类。C6醇类及醛类主要贡献果实青香型香气，随果实发育逐渐减少，而酯类及内酯类物质是桃果香型香气的主要来源，随果实成熟逐渐增加，实现了桃果实发育过程中由青香型向果香型的转变过程。在成熟的湖景蜜露水蜜桃果实中，脂肪酸途径香气占总香气物质的53.0％，其中酯类物质占脂肪酸途径香气的57.3％。挥发性酯类物质除了作为香气品质影响消费者喜好外，在植物防御反应及植物间信号转导中发挥重要作用。研究表明，挥发性酯类受到机械伤、食草动物伤害及真菌侵染所诱导从而激发周围植物的防御反应。

挥发性酯类物质的合成由醇酰基转移酶AATs(EC 2.3.1.84)催化，AATs属于BAHD家族，包含HxxxD motif及DFGWG motif，催化酰基COA的酰基基团转移至醇类受体形成酯类物质。AATs催化的底物广泛，可利用多种不同的酰基供体，如乙酰CoA、丁酰CoA、己酰CoA、苯甲酰CoA等，也可催化多种醇类受体，如乙醇，己醇，己烯醇等。AAT基因目前已在苹果、草莓、香蕉、甜瓜、猕猴桃、番茄等多个物种上有研究。目前关于果实中酯类物质合成的转录调控研究还较少，在苹果中报道MdMYB1/6参与调控苹果MdAAT2的表达，从而调控酯类合成；在香蕉中报道MabZIP4/5可结合并激活BanAAT1的启动子。在桃果实中与MdMYB1/6同源的MYBs及与MabZIP5同源的bZIP转录因子在果实生长发育过程中的表达与PpAAT1的表达及酯类物质合成呈现负相关关系，而与MabZIP4同源的bZIP不能激活PpAAT1的启动子。现有技术中，桃果实中酯类物质合成的转录调控机制尚不明确，已知的调控桃果实中酯类物质合成的转录因子较少。

发明内容

本发明的目的在于提供一种参与桃酯类芳香物质合成调控的转录因子PpNAC1及其应用，转录因子PpNAC1能够促进酯类芳香物质的合成。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种参与桃酯类芳香物质合成调控的转录因子PpNAC1，所述PpNAC1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述PpNAC1的PCR扩增的上游引物具有如序列表中SEQID No.2所示的核苷酸序列；所述PpNAC1的PCR扩增的下游引物具有如序列表中SEQ IDNo.3所示的核苷酸序列。

本发明提供了上述方案所述转录因子PpNAC1编码的蛋白质，所述蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

本发明还提供了一种包含上述方案所述转录因子PpNAC1的重组载体。

本发明还提供了一种包含上述方案所述重组载体的重组微生物。

本发明提供了上述方案所述的转录因子PpNAC1在促进桃果实中酯类芳香物质的合成中的应用。

本发明提供了上述方案所述的转录因子PpNAC1在促进基因PpAAT1表达中的应用。

本发明提供了上述方案所述的转录因子PpNAC1在桃树育种中的应用。

本发明的有益效果：本发明提供了一种参与桃酯类芳香物质合成调控的转录因子PpNAC1，所述PpNAC1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明中，所述转录因子PpNAC1能够与参与酯类物质合成的酰基转移酶PpAAT1基因的启动子区(T/A)NN(C/T)(T/C/G)TNNNNNNNA(A/C)GN(A/C/T)(A/T)结合位点及ACGTA结合位点进行结合，激活PpAAT1基因的表达，进而促进酯类芳香物质合成。经过验证，随着桃果实成熟，PpNAC1表达持续增加。PpNAC1的表达模式与果实中挥发性酯类的积累呈正相关关系，且基因表达的增加先于酯类物质合成的增加。

附图说明：

图1为不同生长发育阶段的湖景蜜露果实中挥发性酯类物质的含量；

图2为不同生长发育阶段的湖景蜜露果实中PpAAT1的表达量；

图3为不同生长发育阶段的湖景蜜露果实中PpNAC1的表达量；

图4表示PpNAC1对PpAAT1启动子的转录激活效应；

图5表示PpNAC1对不同长度PpAAT1启动子的转录激活效应；

图6表示PpNAC1对含NACBS区及突变NACBS区的PpAAT1启动子的转录激活效应；

图7表示SDS-PAGE电泳检测PpNAC1重组蛋白；

图8表示EMSA检测PpNAC1与NACBS1的结合；

图9表示EMSA检测PpNAC1与NACBS2的结合；

图10表示过量表达PpNAC1的桃叶片中PpNAC1的相对表达量；

图11表示过量表达PpNAC1的桃叶片中PpAAT1的相对表达量；

图12表示过量表达PpNAC1的桃叶片中酯类物质的含量变化。

具体实施方式

本发明提供了一种参与桃酯类芳香物质合成调控的转录因子PpNAC1，所述PpNAC1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述转录因子PpNAC1属于NAC家族。

本发明还提供了上述方案所述转录因子PpNAC1的PCR扩增引物对，所述PpNAC1的PCR扩增的上游引物具有如序列表中SEQ ID No.2所示的核苷酸序列；所述PpNAC1的PCR扩增的下游引物具有如序列表中SEQ ID No.3所示的核苷酸序列。具体如下：上游引物：AGAACTAGTGGATCCATGGAGAGCACCGACTCCTC；下游引物：CCCCTCGAGGTCGACCTATCCCAAATTGGACTCAG。

本发明中，所述PpNAC1的PCR扩增模板优选为桃果实cDNA；所述桃果实cDNA优选的采用桃果实总RNA逆转录合成；本发明对桃果实cDNA的合成方法没有特殊要求，采用本领域常规的植物cDNA合成方法即可，在本发明具体实施过程中，采用TAKARA试剂盒进行合成；本发明对桃果实总RNA的提取方法没有特殊限定，采用本领域常规的植物细胞总RNA提取方法即可。

本发明提供了上述方案所述转录因子PpNAC1编码的蛋白质，所述蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述蛋白质含有363个氨基酸；所述蛋白质的N端含有保守的NAC结构域和核定位信号NLS。

本发明还提供了一种包含上述方案所述转录因子PpNAC1的重组载体；所述重组载体优选的以pGreen II 002962-SK为原始载体，在pGreen II 002962-SK的多克隆位点插入转录因子PpNAC1；优选的，所述PpNAC1插入在原始载体pGreen II 002962-SK上的BamH I和Sal I酶切位点之间。

本发明中，所述重组载体优选的采用以下方法制备获得：以cDNA为模板，结合引物对SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3获得PpNAC1的PCR产物；pGreen II 002962-SK通过BamH I(NEB)和Sal I(NEB)进行双酶切，回收后连接，得到PpNAC1-SK。

本发明中，所述双酶切体系优选为：Cutsmart buffer 5μL、载体1μg,内切酶各1μL，水补足50μL；所述双酶切程序优选为：37℃酶切3h。

本发明中，所述回收优选的采用TAKARA的凝胶回收试剂盒进行；所述连接的试剂盒优选的采用Vazyme的一步克隆试剂盒进行。

本发明还提供了一种包含上述方案所述重组载体的重组微生物；所述重组微生物优选的以农杆菌为原始微生物，在农杆菌中转入重组载体PpNAC1-SK；本发明对所述转入的方法没有特殊限制，采用本领域常规转化方法即可，本发明的具体实施过程中，采用电击转化法进行转化。

本发明的具体实施过程中，优选的转化步骤为：50μL农杆菌感受态加入10μL重组载体，冰上放置30min，加入Bio-Rad 2mm电击杯，通过Bio-Rad GenePulser Xcell在2.5Kv条件电击转入。

本发明还提供了上述方案所述的转录因子PpNAC1在促进桃果实中酯类芳香物质的合成中的应用。

本发明中，随着桃果实成熟，PpNAC1表达持续增加。PpNAC1的表达模式与果实中挥发性酯类的积累呈正相关关系，且基因表达的增加先于酯类物质合成的增加。

本发明还提供了上述方案所述的转录因子PpNAC1在促进基因PpAAT1表达中的应用。

本发明中，所述转录因子PpNAC1能够与参与酯类物质合成的酰基转移酶PpAAT1基因的启动子区(T/A)NN(C/T)(T/C/G)TNNNNNNNA(A/C)GN(A/C/T)(A/T)结合位点及ACGTA结合位点进行结合，进而激活PpAAT1基因的表达。

本发明还提供了上述方案所述的转录因子PpNAC1在桃树育种中的应用；所述应用优选为转录因子PpNAC1在桃果实香气品质改善的基因工程育种中的应用。

下面结合实施例对本发明提供的一种参与桃酯类芳香物质合成调控的转录因子PpNAC1及其应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1桃果实PpNAC1、PpAAT1的表达及挥发性酯类物质含量检测(一)实验方法

1.桃果实材料

采自浙江省奉化市水蜜桃研究所的5个不同生长发育阶段的湖景蜜露果实：S1(花后34天，幼果期)、S2(花后71天，膨大期)、S3(花后108天，成熟期)、S4(成熟后20℃放置3天)、S5(成熟后20℃放置6天)，果肉组织经液氮冷冻后于-80℃保存。每个取样时间点设置3个生物学重复，每个重复5个果实。

2.RNA提取及转录组测序

经液氮充分研磨后的样品1g，加入到有4mL 65℃预热的CTAB/β-巯基乙醇提取缓冲液的离心管中，涡旋混合，65℃水浴5min；加入4mL氯仿：异戊醇(24：1)抽提液，充分涡旋混合；15℃10000rpm离心10min，吸取上清液到新的离心管，重新抽提一次；上清液吸取到新的离心管中，加入1/4体积的10mol/L的LiCl，4℃放置过夜；次日，4℃10000rpm离心20min，倒掉上清液，将离心管倒置于纸巾上以去除多余的溶液；加入400μL 65℃预热的SSTE，溶解沉淀；再加入400μL氯仿：异戊醇(24：1)抽提液，涡旋混合；转移至1.5mL离心管中20℃10000rpm离心10min，吸上清液到新的离心管中加入2倍体积的-20℃预冷的无水乙醇，上下颠倒混匀，-80℃放置30min；4℃10000rpm离心25min，去上清液，短暂离心后吸出残余液体，将沉淀在通风橱晾干(约10min)；加入20μL DEPC水溶解沉淀，得到总RNA样品，后送由百迈克生物科技有限公司进行转录组测序分析。

3.桃果实挥发性酯类物质含量分析

取样后的桃果肉样品经液氮研磨后称取5g，加入3mL200mM EDTA溶液、3mL 20％CaCl₂溶液及30μL的内标2-辛醇(0.8mg/mL)密封后混合均匀，恒温平衡30min后，使用65μm聚二甲基硅氧烷和二乙烯苯(PDMS-DVB)萃取头(Supelco Co.)进行30min固相微萃取。萃取头在GC-MS(Agilent 7890-5975)进样口解吸附5min后用DB-WAX毛细管色谱柱(0.25mm，30m，0.25μm，J&W Scientific)进行分离。升温程序为从40℃以3℃·min^-1速率升至100℃,然后再以5℃·min^-1速率升至245℃。以1.0mL·min^-1氦气为载气，MS离子源温度230℃，采用电子轰击电离方式，电子能量为70eV，质谱扫描范围为35到350m/z。采用质谱库NIST-8(NIST/EPA/NIH,美国)和保留指数(Retention index，RI)进行物质鉴别，内标面积归一化方法进行物质的浓度计算，实验结果参见图1、图2和图3，图1为不同生长发育阶段的湖景蜜露果实中挥发性酯类物质的含量；图2为不同生长发育阶段的湖景蜜露果实中PpAAT1的表达量；图3为不同生长发育阶段的湖景蜜露果实中PpNAC1的表达量。

(二)实验结果

随着果实的生长发育，挥发性酯类物质逐渐积累，在采后后熟过程中达到最高；PpAAT1的表达逐渐增加，在后熟过程明显增加；PpNAC1的表达随果实发育也不断增加，并且先于PpAAT1出现明显增加趋势，与PpAAT1的表达及酯类物质积累均呈现正相关关系。

实施例2烟草双荧光素酶验证PpNAC1的转录激活效应及NAC结合位点

(一)实验方法

1.cDNA合成及DNA提取

取1.0μg果实总RNA，用TAKARA试剂盒去除基因组DNA后，按说明书操作逆转录合成cDNA。利用CTAB法提取桃果实基因组DNA。经液氮研磨后的桃果实材料1g，加入4ml 65℃预热的CTAB/β-巯基乙醇提取液，涡旋混匀，65℃水浴1h；加入4ml氯仿/异戊醇(24:1)，涡旋混匀；10000rpm，15℃离心10min，取上清，加入2ml 5M醋酸钠，4ml经-20℃预冷的异丙醇，颠倒混匀后于-20℃放置1h；12000rpm离心15min，弃上清；沉淀经1ml 75％乙醇洗2次，去上清后晾干乙醇，加100ul水溶解沉淀，即为桃果实DNA。

2.重组载体构建及农杆菌转化

根据PpNAC1在桃基因组数据库(https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html#！info？alias＝Org_Ppersica)中的参考序列，利用PCR技术，以桃果实cDNA为模板，结合引物对SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3扩增获得PpNAC1全长SEQ ID NO.1。利用Vazyme一步克隆试剂盒将PCR产物与经限制性内切酶BamH I和Sal I在37℃水浴条件下酶切3h后的pGreen II 002962-SK载体5ul连接产物加入20ul DH5α感受态，冰上放置30min，42℃热激90s，转化DH5α，挑取阳性菌落后测序验证。PpAAT1启动子区存在2个NAC结合位点：(T/A)NN(C/T)(T/C/G)TNNNNNNNA(A/C)GN(A/C/T)(A/T)类型结合位点(NACBS1)及ACGTA结合位点(NACBS2)。结合引物对SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6，以桃果实DNA为模板通过PCR扩增获得ATG上游2000bp长度的PpAAT1启动子序列(SEQ ID NO.7，PpAAT1-pro-2000，P1)，结合引物对SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9，SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11，SEQ ID NO.12和SEQID NO.13，SEQ ID NO.14和SEQ ID NO.15，分别扩增获得不同长度PpAAT1-promoter(P2、P3、P4、P5)序列。利用上述方法构建于BamH I和Sal I酶切后的pGreen-LUC载体。将序列确认正确的PpNAC1-SK载体及PpAAT1-pro-2000/1200/800/600/400-LUC载体利用电击转化法，分别转入农杆菌GV3101::pSoμp中，并分别挑取阳性克隆保存。以PpAAT1-pro-2000-LUC载体为模板，通过PCR技术，结合引物对SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.16以及引物对SEQ IDNO.17和SEQ ID NO.9分别获得PCR产物。上述PCR产物1:1混合后为模板，结合引物对SEQ IDNO.8和SEQ ID NO.9经过PCR获得PpAAT1-P2突变产物；两轮PCR获得P2-突变序列；结合如SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.18所述的引物对和SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.9所述的引物对，通过两轮PCR获得P5-突变序列，通过上述方法构建于pGreen-LUC载体，并转入农杆菌。

4.农杆菌侵染烟草叶片及LUC/REN荧光检测

含有PpNAC1-SK及PpAAT1-pro-LUC(不同长度)载体的农杆菌用渗透液(10mMMgCl₂、10mM MES、150μM乙酰丁香酮、pH为5.6)悬浮后调整OD₆₀₀＝0.75，以10:1(v/v)混合均匀后用注射器注入本氏烟叶片，每棵烟草注射3片叶片，空的SK载体代替PpNAC1-SK作为对照。注射后的烟草于25℃，16h/8h(光照/黑暗)培养3d后检测LUC及REN荧光值。实验结果参见图4～图6，图4表示PpNAC1对PpAAT1启动子的转录激活效应；图5表示PpNAC1对不同长度PpAAT1启动子的转录激活效应；图6表示PpNAC1对含NACBS区及突变NACBS区的PpAAT1启动子的转录激活效应。

(二)实验结果

PpNAC1能够极显著的激活PpAAT1-promoter的启动子活性，与空载SK相比，激活倍数达到13倍；当PpAAT1的启动子区NACBS1被删减后，PpNAC1的转录激活效应下降了45％；与启动子P2相比，NACBS1序列突变后PpNAC1的转录激活效应下降，与启动子P5相比，NACBS2序列突变后PpNAC1的转录激活效应消失。结果表明，PpNAC1通过与PpAAT1启动子区的2个NACBS结合激活PpAAT1的表达。

实施例3EMSA验证PpNAC1与PpAAT1-promoter的结合效应

(一)实验方法

1.重组载体构建及表达菌株的转化

结合引物对SEQ ID NO.20和SEQ ID NO.21，通过PCR扩增获得PpNAC1 DNA结合Domain片段(N端480bp)，通过同源重组方法构建于EcoR I和Xho I酶切后的pGEX-GST载体，转化DH5α测序确认后转化大肠杆菌表达菌株BM Rosetta(DE3)，挑取阳性克隆保存。

2.诱导表达及重组蛋白的纯化

转化后的BM Rosetta(DE3)菌于20mL含AMP(100mg/L)的LB中培养12h，然后以1:50转移至500mL含AMP(100mg/L)的LB中继续培养至OD600＝0.6，加入IPTG(终浓度0.5mM)，30℃诱导表达5h，离心(5000g，15min，15℃)收集菌。用25mL PBS缓冲液重悬。重悬后的菌经过超声破碎，1000rpm，4℃离心30min。上清经过Glutathione Sepharose 4B(GE healthcare)纯化柱，按照说明书纯化，获得PpNAC1-N重组蛋白，并通过SDS-PAGE电泳检测。

3.PpAAT1-promoter序列分析及EMSA验证

EMSA通过Lightshift Chemilunimescent EMSA kit(Thermo)根据说明书操作完成。根据PpAAT1-pro-2000上预测获得的NABS1位点，合成双链探针SEQ ID NO.22和SEQ IDNO.23，根据NABS2位点，合成双链探针SEQ ID NO.24和SEQ ID NO.25探针经过DNA 3'EndBiotinylation Kit(Thermo)完成生物素标记，未标记的探针作为竞争探针；将NACBS1序列突变为SEQ ID NO.26和SEQ ID NO.27，将NACBS2序列突变为SEQ ID NO.28和SEQ IDNO.29，作为突变探针。在25℃下，探针与重组蛋白在Binding buffer(10×concentration:100mM Tris,500mM KCl,and 10mM dithiothreitol,pH 7.5)中孵育25min，反应体系为20μL(0.2pmoL探针，2μg融合蛋白，1μg poly(Di-dC))。反应产物经过PAGE电泳后转移至带正电尼龙膜，380mA 4℃电泳30min。紫外交联30min后，通过化学发光检测仪检测。实验结果参见图7～图9，图7表示SDS-PAGE电泳检测PpNAC1重组蛋白；图8表示EMSA检测PpNAC1与NACBS1的结合；图9表示EMSA检测PpNAC1与NACBS2的结合。

(二)实验结果

PpNAC1-N可以与生物素标记的NACBS1及NACBS2探针结合而发光，加入未标记的竞争探针后发光减弱，并且随竞争探针浓度增加，发光更弱；当竞争探针序列突变后，不能与PpNAC1-N重组蛋白结合，不会影响发光。结果表明，PpNAC1-N重组蛋白可分别与PpAAT1启动子上的2个NACBS位点(T/A)NN(C/T)(T/C/G)TNNNNNNNA(A/C)GN(A/C/T)(A/T)及ACGTA结合。

实施例4桃叶片中瞬时过量表达PpNAC1基因，增加了PpAAT1的表达及叶片中挥发性酯类的含量

(一)实验方法

1.桃叶片侵染

将含有PpNAC1-SK载体的GV3101农杆菌在含卡那霉素(50mg/L)及庆大霉素(25mg/L)的固体培养基上划线28℃培养2d后，挑取单克隆菌株于5mL含卡那霉素与庆大霉素的LB中，过夜培养后转移至500mL LB(kan 50mg/L+Get 25mg/L)，培养至OD600＝0.8～1.0。4℃，5000g，离心10min收集菌。用等体积渗透液(10mM MES，10mM MgCI₂，150mM乙酰丁香酮，0.04％Triton^RX-100，pH 5.6)重悬，常温放置2h，待用。含空SK载体的农杆菌以同样方法准备，作为对照。

选择无机械伤，发育一致的叶片，洗去表面污物，然后用50％的乙醇溶液消毒1min，再用有效氯含量在100mg/L的次氯酸钠水溶液浸泡15min消毒，最后用无菌水漂洗5次，在无菌状态下晾干待用。叶片分为3组(A,B,C)每组20片，将叶片沿叶脉刨开，一半用于SK对照菌液侵染，一半用于PpNAC1-SK菌液侵染，放于200mL烧杯，加入菌液。烧杯放于真空渗透仪，抽真空至-70Kpa，保持压强直到叶片表面无明显气泡冒出，缓慢释放真空，让侵染液渗入叶片组织，大约15min。侵染后的叶片组织用无菌水漂洗3次，放于滤纸上吸干水分，放于MS固体培养基在23℃，培养3d。

2.叶片PpNAC1、PpAAT1基因表达及香气物质检测

培养3d后的叶片用液氮研磨，利用CTAB法提取总RNA，取1.0μg RNA按(TAKARA)试剂说明书操作合成cDNA。Qpcr以桃PpTEF2(SEQ ID NO.30和SEQ ID NO.31)为内参基因，PpNAC1引物序列为SEQ ID NO.32和SEQ ID NO.33，PpAAT1引物序列为SEQ：NO.34和SEQ IDNO.35。Qpcr反应体系包括10μL Ssofast EvaGreen Supermix(Bio-Rad)，上下游引物(10μM)各1μL，2μL cDNA，6μL H₂O。PCR程序为：95℃3min；95℃10s，60℃30s，45个循环；95℃10s；从65℃到95℃，每上升0.5℃读取一次荧光信号值。所用仪器为Bio-Rad CFX96实时荧光定量PCR仪，所有QPCR引物特异性经熔点曲线分析、凝胶电泳分析和QPCR产物测序验证。

经液氮研磨后的叶片组织1g用GC-MS分析挥发性酯类含量。方法参照实施例1。实验结果参见图10～12，图10表示过量表达PpNAC1的桃叶片中PpNAC1的相对表达量；图11表示过量表达PpNAC1的桃叶片中PpAAT1的相对表达量；图12表示过量表达PpNAC1的桃叶片中酯类物质的含量变化。

(二)实验结果

瞬时过量表达PpNAC1基因后，叶片中PpAAT1的表达相比对照增加了2.1倍，同时，叶片中2种重要的挥发性酯类物质苯甲酸乙酯及苯甲酸甲酯的含量分别增加了2倍及1.6倍，表明PpNAC1在桃中可以通过转录激活PpAAT1的表达，增加挥发性酯类物质的含量。

由以上实施例可知，本发明提供了一种参与桃酯类芳香物质合成调控的转录因子PpNAC1，PpNAC1在桃中可以通过转录激活PpAAT1的表达，增加挥发性酯类物质的含量。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 浙江大学

<120> 一种参与桃酯类芳香物质合成调控的转录因子PpNAC1及其应用

<160> 35

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1092

<212> DNA

<213> 桃(Prunus persica)

<400> 1

atggagagca ccgactcctc cacagcctca cagcagcagc agcagcagca accccagccc 60

ccgccacagc caaacctacc accggggttt cgcttccacc cgaccgacga ggagctagtg 120

gtccactatc tcaagaaaaa ggtcacctct gcaccccttc ccgttgccat catcgcagag 180

atcgaacttt ataagttcga cccttgggag ctcccagcta aggctacgtt tggagagcaa 240

gaatggtatt tcttcagccc gagagaccgg aagtacccga acggagcgag acccaataga 300

gcagcgacgt cagggtattg gaaggcaaca gggactgata agccggtgtt gacttctgga 360

ggtacacaga aagttggtgt gaaaaaagca cttgtgttct acggagggaa gcccccaaaa 420

ggaattaaaa ccaattggat tatgcacgag tataggctgg ctgatagcaa gaccagcaac 480

aagccaccgg ggtgtgactt gggcaacaag aagaactcat tgaggcttga tgattgggtg 540

ctgtgtagaa tttacaagaa gaacaattcg cataggccaa tggatcttga aagagaagac 600

tctatggagg acatgatggg gccattaatg ccaccatcca taagtcatgt gggccatcac 660

cagaatatga acctgcacct tccaaaatct aacacaaatt atggaccgcc attcatagaa 720

aatgaccaaa ttatttttga tgggataatg agcagcaccg atggatcggc ctctttgtcc 780

aacgggacta gtcagctgcc tctaaagcgg tctatagtgc catccttgta ctggaatgat 840

caggaggatg atcaaacggc tggggcttca tcaagcaaga gggtggtaca actgcaccaa 900

ttggacagtg gtactaataa ttctgttgct gctaataaca attctacttc tattgccaac 960

ttgctctctc agcttccaca gacacctcca ttgcatcagc atgcaatgct aggatccctt 1020

ggtgatggcc tatttcgaac accgtatcag cttcctggga tgaattggtt ttctgagtcc 1080

aatttgggat ag 1092

<210> 2

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

agaactagtg gatccatgga gagcaccgac tcctc 35

<210> 3

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cccctcgagg tcgacctatc ccaaattgga ctcag 35

<210> 4

<211> 363

<212> PRT

<213> Prunus persica

<400> 4

Met Glu Ser Thr Asp Ser Ser Thr Ala Ser Gln Gln Gln Gln Gln Gln

1 5 10 15

Gln Pro Gln Pro Pro Pro Gln Pro Asn Leu Pro Pro Gly Phe Arg Phe

20 25 30

His Pro Thr Asp Glu Glu Leu Val Val His Tyr Leu Lys Lys Lys Val

35 40 45

Thr Ser Ala Pro Leu Pro Val Ala Ile Ile Ala Glu Ile Glu Leu Tyr

50 55 60

Lys Phe Asp Pro Trp Glu Leu Pro Ala Lys Ala Thr Phe Gly Glu Gln

65 70 75 80

Glu Trp Tyr Phe Phe Ser Pro Arg Asp Arg Lys Tyr Pro Asn Gly Ala

85 90 95

Arg Pro Asn Arg Ala Ala Thr Ser Gly Tyr Trp Lys Ala Thr Gly Thr

100 105 110

Asp Lys Pro Val Leu Thr Ser Gly Gly Thr Gln Lys Val Gly Val Lys

115 120 125

Lys Ala Leu Val Phe Tyr Gly Gly Lys Pro Pro Lys Gly Ile Lys Thr

130 135 140

Asn Trp Ile Met His Glu Tyr Arg Leu Ala Asp Ser Lys Thr Ser Asn

145 150 155 160

Lys Pro Pro Gly Cys Asp Leu Gly Asn Lys Lys Asn Ser Leu Arg Leu

165 170 175

Asp Asp Trp Val Leu Cys Arg Ile Tyr Lys Lys Asn Asn Ser His Arg

180 185 190

Pro Met Asp Leu Glu Arg Glu Asp Ser Met Glu Asp Met Met Gly Pro

195 200 205

Leu Met Pro Pro Ser Ile Ser His Val Gly His His Gln Asn Met Asn

210 215 220

Leu His Leu Pro Lys Ser Asn Thr Asn Tyr Gly Pro Pro Phe Ile Glu

225 230 235 240

Asn Asp Gln Ile Ile Phe Asp Gly Ile Met Ser Ser Thr Asp Gly Ser

245 250 255

Ala Ser Leu Ser Asn Gly Thr Ser Gln Leu Pro Leu Lys Arg Ser Ile

260 265 270

Val Pro Ser Leu Tyr Trp Asn Asp Gln Glu Asp Asp Gln Thr Ala Gly

275 280 285

Ala Ser Ser Ser Lys Arg Val Val Gln Leu His Gln Leu Asp Ser Gly

290 295 300

Thr Asn Asn Ser Val Ala Ala Asn Asn Asn Ser Thr Ser Ile Ala Asn

305 310 315 320

Leu Leu Ser Gln Leu Pro Gln Thr Pro Pro Leu His Gln His Ala Met

325 330 335

Leu Gly Ser Leu Gly Asp Gly Leu Phe Arg Thr Pro Tyr Gln Leu Pro

340 345 350

Gly Met Asn Trp Phe Ser Glu Ser Asn Leu Gly

355 360

<210> 5

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ggtatcgata agcttacccc gaacagagtc ttcttg 36

<210> 6

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tggcgtcttc catggcacac actgcgaggg cctgt 35

<210> 7

<211> 2000

<212> DNA

<213> 桃(Prunus persica)

<400> 7

accccgaaca gagtcttctt gggcacaccc accagtatcc taggctgctc tcggtggatg 60

attgtcaccc ttggccgaga gggaccggta atgccctcac cacgaccgga ggtggaggcc 120

tcaggctgat gctctaacgg cccgacgcgg gtaccgtcct tgtacaccgc tgccaagagt 180

agcggttgcc ccgtcataag ccccttgccg attccatggg tgggaacgga gctcacctcc 240

tcaccgaata actcaacatc ggtatcttct ccaccctcgg cgtcgaggct cacagcctcg 300

ctggacgtat cccagcctga tgacaactcc ccatcgaacg cgttgggctc actgccgaac 360

ggcgattcgc tatcggacat ctacaaaaca aagaaaggga agttaaggcc catgccacaa 420

actactctac cgatacctac atcgctacct atggccacta gactaccgaa ggaaaatcct 480

aattaacgtt cggctagcct acgccatgga aagacgtata attaaataaa aagagagtat 540

tctgagggtg cggaacggta tcttaccttg agtagtgtgg gatgatttga tcgccgatca 600

gagacttcag aaatcgccct ttatgccgaa gaaccactgt aaaaatcgcc ttgattgccg 660

ttcactctct tcagaaatcg cccgcacaga gctctcgcat caactcacaa ttgcaaagtg 720

agccttgcgt ctggagaaac tcctatttat agggagagag ccacaacggt actcctcggg 780

agactaaacg gctcattaat gcgccgtcag gcgtgctttt actgaccacg cgtcacccga 840

cgaatggcgc cgctgactgc acgccaggca cggaagacga agcgtctctc tgccctctcg 900

cctctcagca tcgacgaccc ctcgggtccc aggtcaatct ctcccgaacg atatcttccg 960

aaaggatcga cacgcatcct ttcctccccc caaacgatat ctaccgaacg gcaggataac 1020

ctccgaaccg acatagagaa ctaaattccc ttccgaagga tcttcggaag agaacttggg 1080

ggactactgt ttataccgaa ataaacggcc tatgaccacc gaacacgtgg acaggatcga 1140

tattgatcac agaactcctt cggcatgctt cctaccgaag ccatctatct tggccctttt 1200

accatcggac acgtgtcatg ctcacaatcc gtgtccacag tcccacatcg aaaatatgag 1260

cacagtgcac acctcccaag gcctatataa ggagacccat atccccaaaa ggagaggatc 1320

agaactaacg gtacgctatc gattgatctg tcagttaaca ttactaaaac cgtacttact 1380

aaagcatcgg agagccttcg gccggtacta caccggtacc ccaaggactt accgaacgtg 1440

accttttgca ggtacttacc ctttcgaagt agaacatctt ctgaagacag tcacctaccg 1500

aagacataat atcactaagt tgacgaaata cgtgctgaac cactttttcg catcaacaga 1560

catctctaat gaacatgtca atagttaatg aacttgaaag gacatttttg ttcgtgcatg 1620

ccagcttcac atgcgacttc tggacgtaac tggttcgcct gagtacataa ttaaagggtt 1680

cccactacgg atggtcatct tcagatagcg agccacaggg tgacaacatc catggaattt 1740

ggcctttcta ttatttgcta atcaccgtag ccaacttctc caccgcacac agttttgcat 1800

tatttctcat atattcacaa gaaaacataa aataaaataa taacgttcac gcggatgttg 1860

gatccaaatt ccaatcccca tagaagtaaa cacgttttaa ggcagtaggg tcaacgtggt 1920

cctatgcata aataccaatt cgatgactca tactatgtag tcattttgtt gcaataatac 1980

aggccctcgc agtgtgtgag 2000

<210> 8

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ggtatcgata agcttgcgcc gtcaggcgtg cttttac 37

<210> 9

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

tggcgtcttc catggcacac actgcgaggg cctgt 35

<210> 10

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

ggtatcgata agcttaccat cggacacgtg tcatg 35

<210> 11

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

tggcgtcttc catggcacac actgcgaggg cctgt 35

<210> 12

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

ggtatcgata agcttgccgg tactacaccg gtacc 35

<210> 13

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

tggcgtcttc catggcacac actgcgaggg cctgt 35

<210> 14

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

ggtatcgata agcttgacat ttttgttcgt gcatg 35

<210> 15

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

tggcgtcttc catggcacac actgcgaggg cctgt 35

<210> 16

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

gcggcacggt aggcttcacg ccgaaggagt tctgtga 37

<210> 17

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

gtgaagccta ccgtgccgct ctatcttggc ccttttac 38

<210> 18

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

caggcgaact agtggaaccc agaagtcgca tgtga 35

<210> 19

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

ctgggttcca ctagttcgcc tgagtacata attaaag 37

<210> 20

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

ggatccccgg aattcatgga gagcaccgac tcctc 35

<210> 21

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

atgcggccgc tcgagctagt tgctggtctt gctatc 36

<210> 22

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

ttcggcatgc ttcctaccga agccatctat c 31

<210> 23

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

gatagatggc ttcggtagga agcatgccga a 31

<210> 24

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

cttctggacg taactggttc gcct 24

<210> 25

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

aggcgaacca gttacgtcca gaag 24

<210> 26

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

ttcggcgtga agcctaccgt gccgctctat c 31

<210> 27

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

gatagagcgg cacggtaggc ttcacgccga a 31

<210> 28

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

cttctgggtt ccactagttc gcct 24

<210> 29

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

aggcgaacta gtggaaccca gaag 24

<210> 30

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

ggtgtgacga tgaagagtga tg 22

<210> 31

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 31

tgaaggagag ggaaggtgaa ag 22

<210> 32

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 32

caagaccagc aacaagccac 20

<210> 33

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 33

ttggacaaag aggccgatcc 20

<210> 34

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 34

caattgggga gatggcccaa g 21

<210> 35

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 35

gaaagtgtcc ggcatctcca g 21

Claims (2)

1.转录因子PpNAC1在促进桃叶片中酯类芳香物质的合成中的应用；所述PpNAC1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述酯类芳香物质为苯甲酸乙酯和/或苯甲酸甲酯。

2.转录因子PpNAC1在激活桃基因PpAAT1的启动子中的应用；所述PpNAC1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述PpAAT1的启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。

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