CN112029774B - 一种增强植物韧皮部rnp信号交流的伴侣蛋白与应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种增强植物韧皮部RNP信号交流的伴侣蛋白与应用。本发明获得了一个新的韧皮部RNP信号交流辅助因子伴侣蛋白CCT复合体，通过根癌农杆菌梨叶片瞬时表达及发根农杆菌转基因方式证实缺少伴侣蛋白CCT复合体，明显减弱RNP复合体在韧皮部中的运输效率。通过伴侣蛋白CCT复合体的过量表达可快速提高RNP复合体在韧皮部中的交流，同时也可通过沉默伴侣蛋白CCT复合体减弱某些信号分子的长距离运输，使用协助因子促进RNP复合体通过嫁接口由砧木向接穗的远距离运输，人为操控砧木基因影响接穗性状，解决了RNP复合体在韧皮部中的运输性无法人为调控的问题，且能够普遍应用于各种类型植物。

Description

一种增强植物韧皮部RNP信号交流的伴侣蛋白与应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及的是通过伴侣蛋白的表达增强植物韧皮部RNA和蛋白质等信号分子交流的方法。

背景技术

韧皮部筛管为植物最主要的运输系统，会通过共质体途径将蔗糖、氨基酸、蛋白质、激素、RNA等物质和信号分子运输至库器官(Lucas et al.,2013)。嫁接作为广泛应用于果树的一种无性繁殖方式，主要将砧木与接穗的运输系统连接，进而促使砧穗间营养物质、信号分子等通过伴胞装载，由胞间连丝进入筛管后远距离传递(Duan et al.,2015)。砧穗间信号分子主要包括激素(Mahajan et al.,2012)、核酸信号分子(Notaguchi et al.,2012)及蛋白信号分子等(Ham et al.,2019)。目前果树中发现的核酸信号分子为植物内源RNA，包括mRNA和非编码RNA，如PbGAI(Zhang et al.,2012)、PbNACP(Zhang et al.,2013)、PbKNOTTED1和PbWoxT1(Duan et al.,2014)的mRNA信号可通过嫁接口在砧穗间韧皮部长距离运输，进而调控接穗形态、花柱长短和增强植株抗旱性等(Duan et al.,2015)。这些mRNA分子为防止在运输过程中被降解，必须要与RNA结合蛋白组装成RNP(Ribonucleoprotein)复合体在韧皮部长距离运输(Xoconostle-Cázares et al.,1999)。目前发现的梨韧皮部中的RNP复合体由一种多聚嘧啶结合蛋白PbPTB3(Polypyrimidine Tract Binding Protein,PTB)与含有CUCU结构域的mRNA分子PbWoxT1组装形成，共同在韧皮部筛管中长距离运输(Cho et al.,2015；Duan et al.,2015；Ham et al.,2009)。然而该RNP复合体分子量较大，难于通过伴胞与筛管间的胞间连丝进入韧皮部，导致信号分子交流效率较低，无法达到运用砧木mRNA分子调控接穗表型的目的，因此开发一个可辅助RNP复合体在韧皮部中运输的因子十分必要。

目前国内外关于RNP复合体韧皮部中信号交流的研究仅限于自身的运输性方面，而对于其辅助因子的发掘及功能研究较少。前期在南瓜的研究中，发现CmeIF5、CmPP16、CmCPI、CmGTPbP和CmPSPL可以作为辅助因子间接促进GAIP-CmRBP50的RNP复合体长距离运输，而这种促进作用基于RNP复合体上蛋白的加入，导致mRNA的结合能力逐步增强，从而增加RNP复合体的稳定性(Ham et al.,2009)。然而这些因子的功能仅在于增加RNP复合体的稳定性，均没有证实可增加RNP复合体的运输效率。从而使得韧皮部信号交流辅助因子的开发缓慢，为我们利用辅助因子调控RNP信号分子交流效率方面的应用增加了难度。

发明内容

针对现有技术中存在的缺陷，本发明提供的方法解决了大分子RNP复合体在韧皮部中运输效率低的问题。

为达到以上目的，本发明采取的技术方案是：

一种伴侣蛋白的编码基因序列，为序列表中SEQ ID No.3或SEQ ID No.4或SEQ IDNo.5或SEQ ID No.6或SEQ ID No.7或SEQ ID No.8或SEQ ID No.9或SEQ ID No.10所示的核苷酸序列。

上述基因序列编码的伴侣蛋白。

一种增强植物韧皮部RNP信号交流的方法，包括如下步骤：

(1)以RNP复合体核心组分PbPTB3为诱饵，筛选梨韧皮部cDNA文库，获得伴侣蛋白PbCCT5的片段核苷酸序列，比对‘砀山酥梨’基因组(http://peargenome.njau.edu.cn/default.asp？d＝4&m＝2)并设计特异性引物，获得PbCCT5的基因全长序列，编码区长度为1573bp；通过基因家族分析发现PbCCT5为含有8个亚基的伴侣蛋白家族中的一种，根据NCBI序列比对获得伴侣蛋白家族中其它7种的基因全长序列，比对‘砀山酥梨’基因组并设计特异性引物，得到其它7个亚基基因全长序列，编码区长度分别为1653bp、1584bp、1671bp、1605bp、1608bp、1680bp和1564bp；

(2)分别将PbWoxT1(核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.1所示)和PbPTB3(核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.2所示)构建到pCAMBIA1305.1载体上，获得过表达载体；选取PbCCT1-PbCCT8(核苷酸序列分别如序列表中SEQ ID No.3-10所示)各亚基特异的200bp插入到pFGC5941载体上，获得各亚基沉默载体。并将以上载体分别转化两种农杆菌：根癌农杆菌和发根农杆菌；

(3)采用发根农杆菌转基因的方式在杜梨种子苗新生根中分别过表达PbPTB3或PbWoxT1，同时沉默PbCCT5亚基，5周后转基因新生根及对应籽苗取样，提取植物总RNA，反转录成cDNA，RT-qPCR检测PbWoxT1运输情况；提取植物总蛋白，免疫印迹检测PbPTB3运输情况；

(4)采用瞬时表达的方式在杜梨叶片中过表达PbWoxT1或PbPTB3，同时分别沉默PbCCT各亚基，暗培1天转光下培养3天后，完整叶柄基部取样，提取植物总RNA，反转录成cDNA，RT-qPCR检测PbWoxT1运输情况；提取植物总蛋白，免疫印迹检测PbPTB3运输情况；

(5)采用烟草转基因的方式共同过表达PbPTB3和PbWoxT1，同时分别沉默NtCCT5、NtCCT7或NtCCT8，以三转基因植株为砧木、野生型烟草为接穗进行嫁接，嫁接2周后砧木与接穗分别取样，提取植物总RNA，反转录成cDNA，RT-qPCR检测PbWoxT1运输情况；提取植物总蛋白，免疫印迹检测PbPTB3运输情况；

结果表明：伴侣蛋白CCT作为PbWoxT1与PbPTB3形成的RNP复合体的辅助因子，辅助mRNA和蛋白质在韧皮部中的长距离运输。

步骤(1)中，设计PbWoxT1核酸信号分子的特异性引物为：

上游5'ATGGACCCTCAACAGATGCCAAATG 3'

下游5'TCAATATGATCTGAAGTAATCATGG 3'；

设计PbPTB3核酸信号分子的特异性引物为：

上游5'ATGACAGAACCTTCTAAAGTCATTC 3'

下游5'TCATATTGCCTGTAGCTGCGAGAAGG 3'；

PbCCT1的特异性引物为：

上游5'CTTCGATGACCATGTCCTCTCAG 3'

下游5'GGTCAAATGGTACTCCACGCATC 3'；

PbCCT2的特异性引物为：

上游5'AATTCTCCCTTCACTATCTCCGTC 3'

下游5'CGTTTCTGGCAAATCACATTCTATC 3'；

PbCCT3的特异性引物为：

上游5'ATGCAAGCCCCAGTGCTCGTC 3'

下游5'TCACTCGGGAATCATTTGCTCATTA 3'；

PbCCT4的特异性引物为：

上游5'ATCCCACCGTCCATGGCTTC 3'

下游5'CTATCTTACTGTAACTATGTCATCG 3'；

PbCCT5的特异性引物为：

上游5'AATGGCGCTGGCATTCGACGAG 3'

下游5'ATCAGAGGGGGAAATAACATCATCG 3'；

PbCCT6的特异性引物为：

上游5'CAAGAGCTTTCAGAACTCGCAC 3'

下游5'CTAGTGTTTAAGTTGGCTTCCGC 3'；

PbCCT7的特异性引物为：

上游5'CGCATCGGCAACGATGTCATC 3'

下游5'TCTATCGTCTTCGCATCCCGCG 3'；

PbCCT8的特异性引物为：

上游5'ATGGGGTTCGGAATGC 3'

下游5'TACTCGTAGAACAGTGCAG 3'。

步骤(2)中，PCR扩增所用的引物如下：

PbWoxT1的扩增引物为：

上游BglII：5'GCGAGATCTATGGACCCTCAACAGATGCCAAATG 3'

下游BstEII：5'TATCCAGTGGTCAATATGATCTGAAGTAATCATGG 3'；

PbPTB3的扩增引物为：

上游SpeI：5'GCGACTAGTATGACAGAACCTTCTAAAGTCATTC 3'

下游BstEII：5'TATCCAGTGGTCATATTGCCTGTAGCTGCGAGAAGG 3'；

PbCCT1的两次扩增引物分别为：

上游NcoI：5'CCATGGAAACTTTTGAGTGCG 3'

下游SwaI：5'ATTTAAATAAGTGATGGTTCGAAAG 3'

上游SmaI：5'CCCGGGAAACTTTTGAGTGCG 3'

下游BamHI：5'GGATCCAAGTGATGGTTCGAAAG 3'；

PbCCT2的两次扩增引物分别为：

上游NcoI：5'CCATGGGAGGGAGGCAGAAAAGC 3'

下游SwaI：5'ATTTAAATTCTGGATTGCCTCAAGATTGG 3'

上游SmaI：5'CCCGGGGAGGGAGGCAGAAAAG 3'

下游BamHI：5'GGATCCTCTGGATTGCCTCAAGATTG 3'；

PbCCT3的两次扩增引物分别为：

上游NcoI：5'CCATGGCTGTAATATGTCGAGCTTAC 3'

下游SwaI：5'ATTTAAATTAAGCACCACTGAGTCTTCC 3'

上游SmaI：5'CCCGGGCTGTAATATGTCGAGCTTAC 3'

下游BamHI：5'GGATCCTAAGCACCACTGAGTCTTCC 3'；

PbCCT4的两次扩增引物分别为：

上游AscI：5'GGCGCGCCCAAACAATGCCTTTC 3'

下游SwaI：5'ATTTAAATAACGATGTCAGGTTTTGAG 3'

上游SmaI：5'CCCGGGCAAACAATGCCTTTCTC 3'

下游BamHI：5'GGATCCAACGATGTCAGGTTTTGAG 3'；

PbCCT5的两次扩增引物分别为：

上游NcoI：5'CCATGGGCGTGTAGCAAACAAG 3'

下游SwaI：5'ATTTTAAATTTCTAACTTTCCACCAAC 3'

上游SmaI：5'CCCGGGGCGTGTAGCAAACAAG 3'

下游BamHI：5'GGATCCTTCTAACTTTCCACCAAC 3'；

PbCCT6的两次扩增引物分别为：

上游NcoI：5'CCATGGAAGAACAAGGTCTGTGC 3'

下游SwaI：5'ATTTAAATGGTATACTTCTCTTCACCAAG 3'

上游SmaI：5'CCCGGGAAGAACAAGGTCTGTGC 3'

下游BamHI：5'GGATCCGGTATACTTCTCTTCACCTTG 3'；

PbCCT7的两次扩增引物分别为：

上游AscI：5'GGCGCGCCATAGAGAAGGTAAAAG 3'

下游SwaI：5'ATTTAAATTCCAATCATGTTCAGCC 3'

上游SmaI：5'CCCGGGATAGAGAAGGTAAAAGAATTGG 3'

下游BamHI：5'GGATCCTCCAATCATGTTCAGCC 3'；

PbCCT8的两次扩增引物分别为：

上游NcoI：5'CCATGGTGGCTATGTTGATTCTGTTTC 3'

下游SwaI：5'ATTTAAATTTCCAGACGCATGTTCAGC 3'

上游SmaI：5'CCCGGGTGGCTATGTTGATTCTGT 3'

下游BamHI：5'GGATCCTTCCAGACGCATGTTCAG 3'。

上述伴侣蛋白在辅助蛋白质韧皮部长距离运输中的应用。

上述伴侣蛋白在辅助mRNA韧皮部长距离运输中的应用。

本发明的有益效果：本发明利用酵母双杂交筛库的方式，获得了一个新的韧皮部RNP信号交流辅助因子伴侣蛋白CCT复合体，通过根癌农杆菌、梨叶片瞬时表达及发根农杆菌转基因方式证实缺少伴侣蛋白CCT复合体，明显减弱RNP复合体在韧皮部中的运输效率。通过伴侣蛋白CCT复合体的过量表达可实现快速提高RNP复合体在韧皮部中的交流，同时也可通过沉默伴侣蛋白CCT复合体减弱某些信号分子的长距离运输，将其运用在果树转基因新型砧木育种中，使用协助因子促进RNP复合体通过嫁接口由砧木向接穗的远距离运输，人为操控砧木基因影响接穗性状，解决了RNP复合体在韧皮部中的运输性无法人为调控的问题，且具有能够普遍应用于各种类型植物的特点。

附图说明

本发明有如下附图：

图1为载体构建示意图；

图中PbWoxT1为p35S:GFP-PbWoxT1；PbPTB3为pSUC2:PbPTB3-mCherry；siPbCCT为PbCCT各亚基沉默载体；EV为pFGC5941空载体。

图2中，a为杜梨种子苗示意图，b为发根农杆菌产生根毛示意图，c为根到新生叶片传递示意图。

图3：PbPTB3蛋白杜梨转基因根至新生叶运输性分析。

其中，α-PbPTB3：PbPTB3抗体；CBB：考马斯亮蓝染色；PbCCT5RNAi：PbCCT5沉默株系；EV：pFGC5941空载体；Root：根；New Leaf：新生叶；*P<0.1，**P<0.01。

图4：杜梨叶片注射示意图

图5：PbPTB3蛋白杜梨叶片至叶柄运输性分析；

其中，α-PbPTB3：PbPTB3抗体；CBB：考马斯亮蓝染色；PbCCT1-PbCCT8 RNAi：PbCCT1-PbCCT8沉默株系；EV：pFGC5941空载体。

图6：转基因烟草嫁接示意图；

图7：转基因烟草PbPTB3蛋白运输性分析；

其中，α-PbPTB3：PbPTB3抗体；CBB：考马斯亮蓝染色；NtCCT5 RNAi：NtCCT5沉默株系；NtCCT7 RNAi：NtCCT7沉默株系；NtCCT8 RNAi：NtCCT8沉默株系；WT：野生型烟草；EV：pFGC5941空载体。

图8：PbWoxT1 mRNA杜梨转基因根至新生叶运输性分析

图9：PbWoxT1 mRNA杜梨叶片至叶柄运输性分析其中，PbCCT1-PbCCT8 RNAi：PbCCT1-PbCCT8沉默株系；EV：pFGC5941空载体；**P<0.01

图10：转基因烟草PbWoxT1 mRNA运输性分析其中，NtCCT5 RNAi：NtCCT5沉默株系；NtCCT7 RNAi：NtCCT7沉默株系；NtCCT8 RNAi：NtCCT8沉默株系；WT：野生型烟草；EV：pFGC5941空载体；**P<0.01。

具体实施方式

以下结合实施例和附图对本发明作进一步详细说明。

实施例1伴侣蛋白基因序列获得过程

1.杜梨韧皮部RNA提取

为扩增PbWoxT1、PbPTB3和PbCCT1-PbCCT8十个基因全长序列，首先采用CTAB法提取杜梨韧皮部RNA，具体步骤如下：

(1)65℃预热CTAB，每1mL加入20μLβ-巯基乙醇；

(2)液氮中研磨样品，取0.5g样品装入2mL无RNA酶离心管中，加入1mL预热的CTAB，涡旋振荡30s，65℃水浴10min；

(3)加入1mL CI(氯仿：异戊醇＝24：1)，涡旋振荡；

(4)置于预冷的4℃离心机中13000rpm 10min；

(5)取上清，加入等体积CI，轻轻混匀；

(6)4℃离心机中13000rpm 10min；

(7)取上清，加入2倍体积异丙醇，-20℃ 30min以上；

(8)4℃离心机中13000rpm 10min；

(9)弃上清，沉淀用75％乙醇(DEPC水配制)1mL洗2次，4℃离心机中13000rpm5min；

(10)吹干残留乙醇，加入40μL DEPC水溶解，用DNaseⅠ去除DNA，37℃ 30min，体系如下；

(11)加入550μL DEPC水，600μL CI，颠倒混匀，4℃离心机中13000rpm 10min；

(12)取上清，加入2倍体积无水乙醇，-20℃ 1h；

(13)4℃离心机中13000rpm 15min；

(14)弃上清，沉淀用75％乙醇(DEPC水配制)1mL洗2次，4℃离心机中13000rpm5min；

(15)吹干残留乙醇，加入30μL DEPC水溶解，-80℃保存备用。

2.将RNA反转录为cDNA

将提取的植物总RNA采用PrimeScript 1st Strand cDNA SynthesisKit试剂盒(Promega Bio)反转录成cDNA，反应体系如下：

冰上操作，轻轻吸打混匀，放入PCR仪中，70℃ 10min，4℃ forever。再加入如下反应体系：

冰上操作，轻轻吸打混匀，放入PCR仪中，42℃ 1h，70℃ 10min，-20℃保存。

3.PbCCT各亚基全长基因克隆

根据‘砀山酥梨’基因组序列比对结果，设计引物克隆各基因，引物序列如下：

上述引物均由生工生物技术有限公司合成。

PCR体系及程序：

2×Es Taq MasterMix(Dye)购自(北京康为世纪生物科技有限公司，CW0682S)

4.目的片段琼脂糖凝胶回收并测序

琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物片段大小，Axgen回收试剂盒回收目的片段。

(1)将切下的胶块置于2mL离心管中，加入500μL DE-A，65℃溶胶至胶块完全溶解，加入250μL DE-B，混合溶液上到回收住中；(2)12000rpm离心30s，弃去回收柱中的废液；

(3)加入500μL漂洗液PW1，12000rpm离心30s，弃去回收柱中的废液；

(4)加入700μL漂洗液PW2，12000rpm离心30s，弃去回收柱中的废液，此步骤重复2次；

(5)将回收柱放回收集管内，12000rpm离心2min，吹干残留乙醇；

(6)将回收柱置于新的1.5mL离心管中，加入35μL已65℃预热的EB洗脱液，室温放置2min；

(7)12000rpm离心2min，产物送生工生物技术有限公司测序。

实施例2伴侣蛋白辅助蛋白质韧皮部长距离运输应用

1.载体构建(图1)

选取可韧皮部长距离运输的RNP复合体上核心蛋白PbPTB3为例说明伴侣蛋白的具体应用。设计引物，通过一次PCR扩增在PbPTB3上添加酶位点，构建到pCAMBIA1305载体上；伴侣蛋白CCT各亚基片段分别通过两次PCR扩增添加不同酶切位点，将正反向序列构建到pFGC5941载体上。引物序列如下(其中PbCCT1-PbCCT8的第一对引物和第二对引物分别为第一次PCR扩增和第二次PCR扩增的引物)：

琼脂糖凝胶电泳检测并回收，与pCAMBIA1305.1和pFGC5941分别进行双酶切，反应体系如下：

将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，Axgen回收试剂盒回收目标大小片段，进行连接，反应体系如下：

T4连接酶购自TAKARA公司。

混匀，16℃过夜；将连接体系加入50μL E.coli DH5α感受态细胞(购自全式金生物技术有限公司)中，冰上放置20min；42℃热击45s，冰上放置2min；加入200μL无抗LB培养基，37℃ 160rpm振荡培养1h；4500rpm 3min离心收集菌体，弃掉150μL上清液，用剩余的培养基重悬细胞，均匀涂布于Kan抗性固体LB培养基上，37℃倒置过夜培养。

次日挑取单克隆于200μL Kan抗性的LB培养基中，37℃ 200rpm振荡培养6h后进行PCR鉴定，挑取阳性菌液测序(生工生物技术有限公司)，测序正确菌株重摇，加入等体积甘油，-80℃保存备用。

2.质粒提取

测序正确菌株接种于5mL Kan抗性的LB培养基中，37℃ 200rpm过夜振荡培养，次日提取质粒(Axygen质粒提取试剂盒)。

(1)将菌液加入2mL离心管中，12000rpm离心30s多次集菌，弃上清；

(2)在沉淀中加入S1涡旋振荡混匀；

(3)在溶液中加入S2轻轻颠倒混匀10次；

(4)在溶液中加入S3，立即轻轻颠倒混匀10次；

(5)12000rpm离心10min，吸上清加入吸附柱上；

(6)静置2min，12000rpm离心30s，弃废液；

(7)加入500μL漂洗液PW1，12000rpm离心30s，弃去吸附柱中的废液；

(8)加入700μL漂洗液PW2，12000rpm离心30s，弃去吸附柱中的废液，此步骤重复2次；

(9)将吸附柱放回收集管内，12000rpm离心2min，吹干残留乙醇；

(10)将吸附柱置于新的1.5mL离心管中，加入70μL已65℃预热的EB洗脱液，室温放置2min；

(11)12000rpm离心2min，-20℃保存备用。

3.发根农杆菌K599与根癌农杆菌GV3101感受态细胞制备

(1)将农杆菌划线在YEP+Rif固体培养基上，28℃培养2-3d；

(2)挑取单克隆接种于5mL液体YEP+Rif培养基中，28℃200rpm振荡培养12h；

(3)5000rpm 5min集菌，转接于50mL液体YEP培养基中，28℃200rpm振荡培养过夜至OD₆₀₀值为0.6-0.8；

(4)于50mL离心管中5000rpm 5min集菌，弃上清；

(5)将菌体用10mL 0.15M NaCl溶液重悬，冰上静置20min；

(6)4℃5000rpm 5min集菌，弃上清；

(7)用1mL预冷的0.02M CaCl₂溶液轻轻重悬；

(8)分装于预冷的1.5mL离心管中，每管100μL，加等体积甘油-80℃保存备用。

4.农杆菌感受态细胞转化

(1)将质粒1-2μL加入100μL感受态细胞中，冰上放置30min；

(2)将带有质粒的感受态细胞放入液氮中1min；

(3)放在37℃金属浴5min；

(4)置于冰上2min；

(5)加入500μL无抗性的YEP液体培养基，28℃160rpm振荡培养4-6h；

(6)4000rpm集菌，吸除300μL上清，剩余菌液重悬，涂布于YFP+Rif+Kan固体培养基上，28℃过夜培养；

5.发根农杆菌遗传转化

将上述载体PbCCT5 RNAi、pSUC2:PbPTB3-mCherry分别转入发根农杆菌K599菌株中，共同注射2周大小杜梨种子苗地上部1-2cm茎部，2周后待注射部位长出新生根，southern-blot技术进行阳性株筛选，获得长距离运输基因超表达同时沉默PbCCT5转基因植株3-5个株系，去除阳性根以下部分及非阳性根，将植株种植于基质中，2周后通过western-blot分析检测转基因新生根对应叶片中PbPTB3的长距离运输情况(图2，3)。

6.杜梨叶片瞬时转化

(1)挑取单克隆，将阳性克隆菌液接种于5mL YEP+Rif+Kan液体培养基中，28℃160rpm振荡过夜培养；

(2)5000rpm 5min集菌，弃上清，用1mL悬浮液重悬菌体；

(3)紫外分光光度计检测菌液的OD₆₀₀值，根据数值加入相应体积悬浮液使OD₆₀₀调至1.0；

(4)室温静置2-5h；

(5)将pSUC2:PbPTB3-mCherry分别与PbCCT1-PbCCT8 RNAi各亚基的混合菌液在叶片背面注射，避免注射到叶柄部位，遮光培养1天后转到光下培养3天，通过western-blot分析检测叶柄中PbPTB3的运输情况(图4，5)。

悬浮液：

7.烟草转基因

(1)取烟草叶片用流水冲洗2-3h；

(2)超净台中75％乙醇漂洗30s，灭菌水冲洗2次；

(3)2％NaClO漂洗6min，灭菌水冲洗5-6次；

(4)叶片沿主脉将两侧叶片切成0.5cm×0.5cm大小的方块，平铺于预培养基上，25℃光下培养48h。

(5)挑取转化农杆菌阳性克隆，接种于5mL含Rif和Kan的YEP液体培养基中，28℃200rpm过夜培养至OD₆₀₀＝0.6-0.8；

(6)6000rpm 5min集菌，弃上清，用50ml含Rif和Kan的YEP液体培养基重悬，28℃200rpm培养3-4h至OD₆₀₀＝0.6-0.8；

(7)6000rpm 5min集菌，弃上清，用30mL液体MS培养基重悬，28℃200rpm培养3-4h；

(8)将预培养的叶片置于菌液中轻轻摇动1min取出，在无菌滤纸中吸取多余菌液，放回原预培养基中25℃暗培养48h；

(9)转入脱菌固体培养基中，光下继续培养；

(10)待再生苗长出，切取接种在含有Cef的培养基中。

8.烟草转基因阳性株鉴定

取阳性苗叶片，用CTAB法提取DNA，方法如下：

(1)液氮中研磨叶片，加入700μL 60℃预热含0.2％β-巯基乙醇的CTAB提取液；

(2)65℃约30min，加入700μL氯仿：异戊醇＝24:1，涡旋振荡15s；

(3)室温13000rpm离心10min，将上清转移到新的离心管中；

(4)加入等体积异丙醇，充分混匀，-20℃沉淀30min以上；

(5)室温13000rpm离心10min，70％乙醇漂洗2次，晾干；

(6)加入30μL ddH₂O溶解；

(7)用特异性跨区引物鉴定阳性植株，并对阳性植株提取RNA，特异性定量PCR引物鉴定RNA水平阳性植株。

转基因顺序为：PbPTB3转基因植株中共转NtCCT5 RNAi、NtCCT7 RNAi或NtCCT8RNAi，以获得共转基因植株后，再以野生型烟草为接穗嫁接2周后，通过western-blot分析检测野生型接穗中PbPTB3的运输情况(图6、7)。

9.免疫印迹分析

对所取样品采用液氮研磨，加入植物蛋白提取液(购自华兴博创生物技术有限公司)，12000rpm离心15min，上清液即为植物总蛋白，继续进行免疫印迹分析。

(1)植物总蛋白提取物中加入5×SDS上样缓冲液，100℃ 5min，进行SDS-PAGE电泳；

(2)电泳45min后，利用湿电转膜仪将蛋白转移至硝酸纤维素膜上；

(3)将膜用5％的脱脂奶粉封闭液室温封闭2h；

(4)按1：3000的比例在2.5％的封闭液中加入Anti-PbPTB3多克隆抗体或Anti-Actin单克隆抗体，4℃过夜震荡孵育；

(5)TBST漂洗，5min/次，共洗5次；

(6)按1：10000的比例在0.5％的封闭液中加入HRP标记的二抗，室温震荡孵育1h；

(7)TBST漂洗，5min/次，共洗5次；

(8)膜上添加发光剂，暗室中曝光。

结果表明：1.杜梨种子苗新生根中转基因过表达PbPTB3，同时沉默PbCCT5，PbPTB3的信号与对照相比明显减弱(图3)；2.叶片中过表达PbPTB3，同时分别沉默PbCCT各亚基，PbPTB3的信号与对照相比明显减弱(图5)；3.烟草转基因砧木中过表达PbPTB3，同时分别沉默NtCCT各亚基，野生型接穗中PbPTB3的信号与对照相比明显减弱(图7)。说明沉默PbCCT的任何一个亚基均能够影响PbPTB3在韧皮部中长距离运输。

实施例3伴侣蛋白辅助mRNA韧皮部长距离运输应用

1.载体构建(图1)

选取可韧皮部长距离运输RNP复合体上mRNA PbWoxT1为例说明伴侣蛋白的具体应用。设计引物，PCR扩增将以上回收产物加酶切位点，引物序列如下：

2.质粒提取

同实施例2。

3.农杆菌感受态细胞转化

同实施例2。

4.发根农杆菌遗传转化

将上述载体PbCCT5 RNAi、pSUC2:GFP-PbWoxT1分别转入发根农杆菌K599菌株中，共同注射2周大小杜梨种子苗地上部1-2cm茎部，2周后待注射部位长出新生根，southern-blot技术进行阳性株筛选，获得超表达PbWoxT1同时沉默PbCCT5转基因植株3-5个株系，去除阳性根以下部分及非阳性根，将植株种植于基质中，2周后通过RT-qPCR分析检测转基因新生根对应叶片中PbWoxT1的长距离运输情况(图2，8)。

5.杜梨叶片瞬时转化

(1)挑取单克隆，将阳性克隆菌液接种于5mL YEP+Rif+Kan液体培养基中，28℃160rpm振荡过夜培养；

(2)5000rpm 5min集菌，弃上清，用1mL悬浮液重悬菌体；

(3)紫外分光光度计检测菌液的OD₆₀₀值，根据数值加入相应体积悬浮液使OD₆₀₀调至1.0；

(4)室温静置2-5h；

(5)将pSUC2:GFP-PbWoxT1分别与PbCCT1-PbCCT8 RNAi各亚基的混合菌液在叶片背面注射，避免注射到叶柄部位，遮光培养1天后转到光下培养3天，通过RT-qPCR分析检测叶柄中PbWoxT1的运输情况(图4，9)。

6.烟草转基因

同实施例2。

7.烟草转基因阳性株鉴定

转基因顺序为：PbWoxT1转基因植株中共转NtCCT5 RNAi、NtCCT7 RNAi或NtCCT8RNAi，以获得共转基因植株后，再以野生型烟草为接穗嫁接2周后，通过RT-qPCR分析检测野生型接穗中PbWoxT1的运输情况(图6、10)。

8.RT-qPCR分析

对所取样品采用液氮研磨，植物总RNA提取试剂盒(博迈德生物技术有限公司)提取植物总RNA后反转录成cDNA，使用FastStart Universal SYBR Green Master(RocheLife Science)试剂盒进行RT-qPCR分析，以PbACTIN为内参。

结果表明：1.杜梨种子苗新生根中转基因过表达PbWoxT1，同时沉默PbCCT5，PbWoxT1的信号与对照相比明显减弱(图8)；2.叶片中过表达PbWoxT1，同时分别沉默PbCCT各亚基，PbWoxT1的信号与对照相比明显减弱(图9)；3.烟草转基因砧木中过表达PbWoxT1，同时分别沉默NtCCT各亚基，野生型接穗中PbWoxT1的信号与对照相比明显减弱(图10)。说明沉默PbCCT的任何一个亚基均能够影响PbWoxT1在韧皮部中长距离运输。

以上实施例说明：伴侣蛋白CCT作为PbWoxT1与PbPTB3形成的RNP复合体的辅助因子，辅助mRNA和蛋白质在韧皮部中的长距离运输。

以上实施方式仅用于说明本发明，而并非对本发明的限制，有关技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明的实质和范围的情况下，还可以做出各种变化和变型，因此所有等同的技术方案也属于本发明的保护范围。

本说明书中未作详细描述的内容属于本领域专业技术人员公知的现有技术。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国农业大学

<120> 一种增强植物韧皮部RNP信号交流的伴侣蛋白与应用

<160> 10

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 987

<212> DNA

<213> 梨（Pyrus spp）

<400> 1

atggaccctc aacagatgcc aaatgaacta caagacggag gcaacaggca ggggggtgga 60

atcatgtgca ggcaaagcag tacgcggtgg acacccacaa ctgatcagat aaaaatcttg 120

aaggaccttt actacaacaa tggcattagg tcacccagcg ctgagcagat tcagaggatc 180

tctgctaagc tgcgacagtt cggcaagatc gaaggcaaga acgttttcta ttggtttcag 240

aaccacaaag ctcgtgagag gcagaagaaa agattcactt cttcttctgc tcctgatcac 300

catcatcatg cagcaccacc agtgccagct gtaccactag aagccaataa tatcaggcaa 360

agatcatcag gggttgggat tgatattaat gcaactgctg ctgctgctta tgaacaacta 420

cccattaatc agcacagcaa gtattccaac atttctgctc caccagctgg gttttcttct 480

gcatcttctt cttcagttgg tgtgaatctt tctcttgggg cacagatggg aaactatggg 540

tatggatcca ttgccatgga gaagagcttt agggagtgct caatatcatc tggaggaagt 600

actagcactg gtcatgtggg tggatctaat tatgatactt ttaatcacaa ctatggatca 660

tgggttgggg ttgatccata ttcctcgccc tacactatct ttgacaagaa atcgtcatca 720

aaaccagtgt ttggtgatca ggaaaatatg acggaagaag aatactacag tctgcaagct 780

tcccaagaga ttgagactct ccctctcttc cccatgcacg gtgaagacat ccatggcttt 840

ggcaacatca agtcatcctc catggacggc tactactccg gctggtacca ctccagtggc 900

ggcaacgatg gtggctctcg cacttccctt gagcttagcc tcaattccta cggtcacatg 960

acccatgatt acttcagatc atattga 987

<210> 2

<211> 1335

<212> DNA

<213> 梨（Pyrus spp）

<400> 2

atgacagaac cttctaaagt cattcatgtt cgaaacgtgg ggcatgaaat ttctgaaaat 60

gatttacttc agctatttca gccatttgga gtcataacta agcttgtgat gcttcgtgca 120

aaaaatcagg ctcttatcca aatgcaagat actgctgctg cagtcagtgc actgcagttc 180

tatgcaaatg ttcagcctgc cataagggga aggaatgtat atgtccaatt ctcctcacat 240

caagaactga caacaatgta ccagaatgct caaggacgag gagatgagcc aaaccgaatt 300

ctgttagtta cagttcatca catgctatat cctattacag tggaagtcct gcatcaagtg 360

tttgttcctc atggttttgt tgagaagatc gtcacttttc agaagtcagc tggttttcag 420

gccctaattc agtatcaatc ccgccagagt gctgttgcag ctagaacagc cctgcaggga 480

cgtaatattt atgatggttg ttgtcaacta gacattcggt tctcaaacct tgatgaatta 540

caagtgaact acaataatga gcgttcaagg gatttcacaa atcccaattt gccttcagaa 600

cagaaaggaa gatctccaca atctggatat ggtgatgcag gaggcatgta tggccttcaa 660

ggtactggag ccagggcagt tggatttccg cagatgccta atgcggctgc aattgcagca 720

gccttcggtg gaggtttgcc tcctggtata agtggaacca acgacaggtg tacagtcctt 780

gtctccaatc cgaatcctga taaaatagat gaggacaagc tttttaacct gttttccatc 840

tatggaaaca ttgtgagaat taaacttctt cggaacaaga cagaccatgc ccttgtccag 900

atgggtgatg gcttccaggc tgaactggca gtacactttc taaagggtgc actactgttt 960

gggaagcgat tggaggtcaa cttctcaaag catccaaata taacgcaagg tgctgacaca 1020

catgaatatg tgaactcaaa tctcaaccgc ttcaaccgta atgcagcaaa gaactaccgc 1080

tattgctgct ccccaacaaa gatgatccac ttgtcttctc ttccccagga agtcaccgaa 1140

gaggagattg tgagccacct agaggaaatt gggaccattg tcagcacaaa gctctttgag 1200

atgaatggaa agaagcaggc cttggttatg tttgaaactg aggagcaggc cactgaagca 1260

cttgtgtgca agcatgctac ttccatcggt gggtcaataa ttcgaatctc cttctcgcag 1320

ctacaggcaa tatga 1335

<210> 3

<211> 1653

<212> DNA

<213> 梨（Pyrus spp）

<400> 3

atgaccatgt cctctcagac ccccgatatc ttgggcgacc gtcagtacgg tcaggacgtc 60

cgcactcaaa atgtgatggc ctgccaagct gttgcaaaca ttgtcaaatc ttcactcggc 120

cccgttggcc tcgacgagat gcttgtcgat gatattggtg atgtgactat tactaatgat 180

ggagctacta tactcaagat gttagaagtt gagcatcctg ctgccaaggt gcttgtggag 240

ttggctgagc tccaagatcg agaagttgga gatgggacga catcagtggt gattgtagct 300

gcagagttgc ttaagagagc aaatgatctt gtaaggaata agattcaccc aacatccata 360

atcagtggtt acagacttgc tatgagggaa gcatgcaaat atgttgagga aaaattagct 420

gtgaaggttg acaagcttgg aaaagattct ctagtaaatt gtgcaaagac aagcatgtcc 480

tcaaagttga taggcggtga cagtgacttc tttgcaaata tggttgtcga tgcagtacaa 540

gctgtaaaga tgaccaatgc acggggtgaa gtcaagtacc caatcaaggg gattaatgtt 600

ttgaaagctc atggaaaaag tgcaagagat agctatctct taactggtta tgcactaaat 660

acgggccgtg ctgcacaagg aatgccactt agagtttccc ctgcaaagat tgcctgtctt 720

gactttaatc ttcagaaaac caaaatgcaa atgggtgtcc aagttttagt tggtgatccc 780

agggagcttg aaaaaattcg ccaaagagaa gctgatatga caaaagagcg tattgaaaaa 840

cttctgaaag ctggagcaaa tgttattctg actaccaagg ggattgacga catggcactc 900

aagtattttg tggaggctgg ggctatcgct gtaagacgtg ttcagaaaga agatatgcgc 960

catgttgcta aggctacagg tgcaacaatg gtttcaactt tcgctgatat ggaaggggag 1020

gaaacattcg atacgtcact tcttggatct gccgacgaag ttgtagagga gcgcatttct 1080

gatgatgatg tgattttgat aaaaggaaca aaaaataaca gtgcggtgtc attgatcctc 1140

agaggtgcaa atgactatat gcttgatgag atggaaagag cccttcatga tgctttgtct 1200

attgtcaaga ggactctaga atctaacatg gtggtaccag gtggaggtgc agttgagtcc 1260

gcattgtctg tgtatttgga gagttttgct acaacattag gatcacgtga gcagttggcc 1320

attgctgagt ttgctgaagc tttgttgatt ataccaaagg tgcttgccgt caatgctgcc 1380

aaggattcta cagatctagt ttcaatacta cgggccaacc accacagggc acaaaccaag 1440

gcaacaacca agactgacaa gaaggataag gattattcta gcatgggctt agacctatta 1500

aagggagaag ttcgtaacaa ccttgaagcc ggagtcattg agcctgcaat gagtaaagtg 1560

aagataattc agtttgctac tgaagcagct attaccattc tccgaattga tgacatgatc 1620

aggctagtca aggatgaaag ccaagagggt taa 1653

<210> 4

<211> 1584

<212> DNA

<213> 梨（Pyrus spp）

<400> 4

atggcggtgg agagaatttt caaagatgaa gctagtgagg agaaaggaga gcgcgccaga 60

ctggcttcat ttgtgggcgc aatggcaatt gctgacttgg ttaagacaac attagggccg 120

aagggaatgg ataaaatttt gcaatcaact ggaagaggac acgaggttac tgttacgaat 180

gatggggcca ccatcttaaa gtccctgcat attgacaatg cagctgctaa agttcttgtt 240

gatatttcaa aagttcaaga tgatgaagtt ggtgatggga caacttctgt tgttgttttg 300

gcgggtgagc tcttaaggga ggctgaaaag ctggtttcat caaagattca cccaatgaca 360

atcatttcag gttatcggat ggcagctgaa tgtgctcgta atgctttatt gcagaaggtt 420

gtggataaca aggctgactc tgaaaaattt aagtcggact taatgaagat cgcaatgact 480

actttgagct ccaaaattct ttctcaggac aaagaacatt ttgcacagct agctgtggat 540

gctgtgatgc gcctaaaggg aagcaccaac ttagaggcta tccaaattat aaagaagccc 600

ggtggatcac ttgtagattc atttttagat gaaggattta ttcttgacaa gaaaataggt 660

cttggtcagc cgaagcgcat agagaatgca aacattttgg tcgcaaacac agcaatggac 720

acagacaaag tgaagattta tggggcacgt gttcgtgttg attcaatggc gaaggttgct 780

gaaattgaag gggctgagaa agataaaatg agagaaaaag tgcagaagat cataggtcat 840

ggaattaact gtttcgttaa cagacagttg atctacaatt tcccagaaga actctttgct 900

gatgctggaa tacttgcaat tgagcatgct gattttgatg gcattgagcg tttggcctta 960

gttactggtg gtgaaattgc atcaaccttt gataacccag agtccgttaa gcttgggcac 1020

tgcaagctca ttgaggaaat tatgattggt gaggacaagt tgatccactt ttctggagtt 1080

gaactgggtc aggcttgcac aatagtgctg agaggcgcaa gccatcacgt tcttgacgag 1140

gctgaaaggt ctttgcatga tgccttgtgt gtgctgtctc agacggtcaa tgacagcaga 1200

gttttgcttg gaggtggatg gcctgagatg ataatggcaa aggaagttga tgagctggcc 1260

aggaaaacgc ctggaaagaa atcccatgct attgaagctt tctcgcgggc actcttggcc 1320

attcctacca tcattgctga caatgccggt ttggacagtg ctgagttgat tgcaaagcta 1380

cgtgcagagc accagaaaga aggatgcact tctgggattg atgtcatctc tggaacagta 1440

ggagacatgg cagaacgagg gatatcagaa gcgtttaaag ttaagcaggc cgtcctgctc 1500

tctgcaacag aggctgcaga gatgattctt agagtcgacg agatcatcac ctgtgcacca 1560

aggaaaagag aagatagaat gtga 1584

<210> 5

<211> 1671

<212> DNA

<213> 梨（Pyrus spp）

<400> 5

atgcaagccc cagtgctcgt cctcaaagat tcattgaagc gtgagtcggg gactaaagta 60

caccatggaa atatccaggc gtcgaaggcc gttgctgaca taatccggac aaccttgggt 120

cctcggtcca tgctcaagat gctacttgat gctagtggag gaattgtagt gactaatgat 180

ggaaatgcca ttctgcgtga attggatctt gctcacccag cagcaaagtc aatgattgaa 240

ttaagtcgca cacaagatga agaagtaggt gatggaacaa catctgtcat tgtccttgct 300

ggtgagatgc tccatgttgc agaagcattt attgacaagc actatcatcc tactgttatt 360

tgccgagcct acaacaaagc tctggaggat gctattgctg ttcttgacaa aatagcaatg 420

gacattgatg tgaaggatcg tgcaacaatg ttgggactgg tcaagagttg tatcggtaca 480

aagttcacta gtcagtttgg ggatttaatt gcggatttag cgcttgatgc caccacaata 540

gtgggggtgg accttggcca gggtctgcga gaagtggata tcaaaaagta cattaaggtt 600

gagaaggttc ctggtggcca gttggaagat tcaatggttc tgaaaggagt aatgtttaac 660

aaagatgtta tctcacctgg aaaaatgaga agaaagattg ttaacccaag gatcattctt 720

cttgattgtc ctcttgagta taagaaaggt gagaaccaaa caaatgctga gttacttaaa 780

gaagaagatt ggggagtcct gctaaaattg gaagaagaat acatcgagag cctctgtgtg 840

cagatattga agtttaagcc agatgtggtt attacagaaa aggggcttag tgacttggca 900

tgccattacc taagcaaggc tggcgtcagc gcaatcagga ggttgcgaaa aacagacaat 960

aaccgaatcg ctaaggcctg tggggcagtt attgttaaca gaccggatga attgcaagag 1020

tctgatgttg gtacaggggc tgggctattt gaggtcaaga aaattggtga tgagtttttt 1080

gcattcattg ttgattgcaa agatcccaaa gcatgtacta tactcttaag aggccctagt 1140

aaggatctct taaatgaagt ggaaagaaat ttgcaggatg ctatgtcagt agcaagaaac 1200

atcctcaaaa atccaaaact tgttcctggt ggtggtgcta cagagttaac tgtatcggca 1260

acattgaagc aaaatagttc atctgtagaa ggtatcgaaa agtggccgta tgaagctgct 1320

gctatagctt ttgaggctat accacgaact ttggctcaga attgtggtgt taatgtgatt 1380

agaactatga cagcgctgca gggaaagcac gcgaatggtg aaaatgcatg gattggcata 1440

gatggaaaca ctggtgcaat aactgacgtg aaagagaaaa agatctggga tgcgtacaac 1500

gtgaaggctc agacctttaa aacagccata gaatccgctt gcctacttct cagaatcgat 1560

gacattgtga gcgggattaa gaagaagcag cctcctggtt ccaaagctcc ttcaaagcct 1620

caagttgaaa cagaaggtga tgctgataat gagcaaatga ttcccgagtg a 1671

<210> 6

<211> 1605

<212> DNA

<213> 梨（Pyrus spp）

<400> 6

atggcttccc cggcagtcat ctcccaaccg cgctcctcca agaccgagtc ttatgtcgat 60

aacaagcgca aggaggacat ccgccaggcc aacatcaccg ccgcccgcgc cgtcgccgat 120

gccgtccgaa ccagcctggg acccaagggc atggacaaga tgatctccac cgccaacggc 180

gaggttatca tcaccaacga cggcgccacg attcttaaca agatggaggt catccaaccg 240

gccgccaaga tgcttgtcga gctttccaag tcccaggacg ccgccgccgg cgacggcacc 300

actaccgtcg tcgtcattgc cggcgctctc ctgaaacagt gccaggtcct tctgtcccat 360

ggcattcacc cgactgtgat ctccgactct ctctacaagg cttccaccaa agcggtcgac 420

gtcttgaccg ccatggccgt ccccgtcgag ctcacggacc gtgattcgct tgtcaagtct 480

gcaagcacgt cgctcaacag caaggtggtg agccagtact cgactctgct tgcgccgatg 540

gccgtggacg ccgtgctctc cgtggtggac ccggcgaagc cagaggtggt ggacctgagg 600

gatatcagga tcgtgaagaa gcttggagga accgtggacg atactgagac ggtgaaggga 660

cttgttttcg ataagaaggc gagccacgct gctggtgggc cgacgaggat ggagaacgcc 720

aagattgctg tgattcagtt ccagatttcg cctccaaaaa ccgatatcga gcagagcatt 780

gtcgtctcgg attatactca gatggatagg attttgaagg aagagaggaa ttacattctg 840

ggtatgatta agaagatcaa ggcgaccggt tgcaacgttt tgctgattca aaagagtatt 900

ctgagagatg cagttactga tttgtccttg cattacttgg cgaaagcgaa gatcttggtg 960

atcaaggatg tggagagaga tgagattgag ttcatcacca agactctgaa ttgcttgccc 1020

attgcgaata tcgagcattt ccgggcagag aaattgggtt atgctgatct ggttgaggag 1080

gtttcgcttg gtgatgggaa gattgtgaag atcacgggga ttcaaaacat gggtcggacc 1140

accactgtgc tggttcgcgg gtcaaaccag ctggtgctag atgaggcgga gcggagcctg 1200

cacgatgctc tgtgtgtggt gaggtgtttg gtgggcaaaa ggtttttgat tgcaggtggc 1260

ggtgcgccag agattgagct gtcaaggcag ttgggggcgt gggctaaggt gctgcagggg 1320

atggagggtt attgtgtgaa gtcgtttgct gaggcgctcg aggttgttcc ctatacgctg 1380

gctgagaatg ccgggttgaa cccaatttca attgtgactg agctgaggaa ccgtcacgca 1440

cagggagaga tcaacaccgg gattaatgtg aggaaggggc agattaccaa catcttggag 1500

gagaatgtgg tgcagccatt gctcgtcagc acaagtgcca tcactctggc cgccgagtgt 1560

gtacggatga ttttgaagat cgatgacata gttacagtaa gatag 1605

<210> 7

<211> 1573

<212> DNA

<213> 梨（Pyrus spp）

<400> 7

atggcgctgg cattcgacga gtacgggcgg cccttcataa tactgaggga gcaggagcag 60

aagtctcgat tgcgcggcct cgatgctcag aaggccaaca tttccgccgg caaggcagtc 120

gctcgaatcc tccggacctc cctcggaccc aagggcatgg acaagatgct ccagagcccc 180

gatggtgaaa tcactgtcac aaatgatggt gcaacgattc tggagaagat ggatgtcgac 240

aatcagattg cgaagctgat ggttgaacta tcccagagtc aggactatga aattggtgat 300

gggacaactg gcgtcattgt gttggctggt gcacttctag agcatgctga gcgactgttg 360

gagcgcggta tccaccccat acgtgttgca gagggatacg aattggcatc cagaatagcg 420

gtcgaccatt tgcagcatat atcacacaaa tttgaatttg gtctggataa tatagagcct 480

ctggttggaa cttgcatgac cactttatcg tcgaagattg tgaatcggtg caagcgtgcc 540

cttgctgaga ttgctgtgaa ggcagttttg gccgttgccg atttagagag gaaagatgtg 600

aacctagatt tgataaaagt agaggggaaa gttgggggta agttggaaga cactgagctg 660

gtatatggta ttcttattga caaggatatg agccatccac aaatgccaaa gtatattgaa 720

aatgcaaaaa ttgctatctt gacttgccct tttgagccac caagcccaaa gacaaaacat 780

aaggttgata ttgatacagt ggaaaagttt cagactctac gtatgcaaga acagaagtac 840

tttgacgaca tggtccaaaa atgcaaggat gttggtgcta ccttggtcat ctgtcaatgg 900

gggtttgatg atgaagcaaa tcacctattg atgcacagga acttgcctgc tgtcagatgg 960

gttggtggtg tagagttgga actaattgca atagctacgg gaggaagaat tgtgcccagg 1020

ttccaagaat tgacacccga gaaattagga aaggctggta tagttcgtga aaaatcattc 1080

ggcacaacaa aagatcgaat gctgtacatc gaacactgtg caaattcaag ggctgtgacc 1140

atatttatcc gtggaggtaa caaaatgatg atagaggaga ctaagcgcag catccacgat 1200

gccctctgtg ttgctaggaa tctcatccgc aacaattcta ttgtgtacgg tggtggctca 1260

gcagagatat cttgctccgt tgccgtagag gcagcagcag accgataccc aggagttgag 1320

caatatgcca ttagagcatt tgcagatgct ttggatgctg ttcctatggc gcttgcagag 1380

aatagtggcc ttcaacccat cgaaacgcta tctgcagtga aagctgagca gattaaggag 1440

aacattccct actatggaat agactgcaac gacgttggca cgaatgatat gcggaagcag 1500

aatgtcttcg agacattgat cgggaagcag cagcaaatct tactggcaac gcaagtcgtg 1560

aagatgatac taa 1573

<210> 8

<211> 1608

<212> DNA

<213> 梨（Pyrus spp）

<400> 8

atgtcgattc gagtgctgaa tccgaatgcg gaggtgctga acaaatcggc ggcgctacac 60

atgaacatca acgccgccaa gggcttgcag gacgtcctca agaccaacct cggccccaag 120

ggcaccatca aaatgcttgt tggcggagcc ggcgacatta agctcactaa ggatggcaac 180

actctgctca aagaaatgca aattcaaaac ccaacagcaa ttatgattgc gcgtacagct 240

gttgcccaag atgacattag cggagatggc accacgtcta ctgtcttgtt cattggcgag 300

cttatgaaac aatcagaacg atatattgac gaagggatgc atccccgtgt cctggttgat 360

ggttttgaga tagccaaaag agcaacgctg cagtttcttg agaaattcaa aactcctgtg 420

gtgatgggcg atgagcctga caaagagatt ttgaaaatgg tagcaagaac aacattgcga 480

acaaagttat atgaagcatt ggcagatcaa ttgactgaca tagttgttaa ttcggttctt 540

tgcatccgca aacctgagga gcccattgat ctgttcatgg tggagattat gcacatgcga 600

cacaaatttg atgcagacac acgcttggtt gagggtcttg ttctcgatca cggttctagg 660

catcctgata tgaagcggag agcagagaat tgtttcattt tgacaagcaa tgtatctttg 720

gaatatgaca aaagtgaagt aaactcaggc tttttctatt caaatgcgga gcagagagaa 780

gcaatggttt tagctgaaag gcgccaggtt gatgaaagag ttaaaaaaat cattgacctg 840

aaaaataagg tttgctctgg taatgataat aactttgtcg ttatcaatca gaaggggatt 900

gatcccccat ctctggacct tctcgcaagg gcagggatta ttgccctgag aagagcaaag 960

aggagaaata tggaacggtt ggttttggct tgtggcgggg aggctgtaaa ctctgtagat 1020

gatttaactc ctgattgcct tggttgggct ggacttgtat acgagcatgt ccttgatgaa 1080

gagaagtata catttgttga aaatgtgaag aatccccact cttgcacaat cttaatcaaa 1140

gggcctaatg accatacaat tgctcagatt aaggatgctg ttcgtgatgg cctgagggca 1200

gttaaaaaca cagttgaaga tgaagctgtc atcttaggtg ctggagcttt tgaagttgca 1260

gccagacaat atttagtgaa tgaagtaaag aaaactgtta aagggcgtgc tcaactcggt 1320

gttgaagctt ttgctgatgc tcttcttgtg gtgcccaaaa cacttgctga gaattctggc 1380

ctcgatacac aagatgtgat aattgctctt acgggagagc atgatcgggg aaatgtcgtg 1440

ggactaaatc acaacactgg agaaccgctt gatccacaga tggagggtat ctttgacaac 1500

tactctgtga agcgacagat tataaactca gggcccgtaa ttgcatctca gctgttgttg 1560

gtcgatgaag taattcgtgc tgggcgtaac atgcggaagc caacttaa 1608

<210> 9

<211> 1680

<212> DNA

<213> 梨（Pyrus spp）

<400> 9

atgtcatcca tgctgcaacc acagatcata ctgttgaagg agggtacgga tacgtcgcaa 60

gggaaggcgc agctggtgag caatataaac gcctgcacgg cggtggccga tgtggtgagg 120

accacgctgg gccctagggg catggacaag ctcattcacg acgacaaggg cagcgttact 180

atttccaatg atggcgccac catcatgaag ttgctcaata ttgttcaccc cgctgccaag 240

atccttgtcg acatcgccaa gtctcaggat tctgaggttg gtgatggaac cacaacagtt 300

gttctgcttg caggggagtt tctgaaggag gccaagcctt tcattgagga tggggtgcac 360

ccacaaagct tgataaaaag ttatcgtact gctagctatt tggcaattgg gaaaatcaaa 420

gaacttgctg taagcataga gggcaaaagc cttgaagaga agaaaaacct gctagctaaa 480

tgtgcggcta caacactatc ttcaaaactt attggtggag aaaaggaatt ttttgcatca 540

atggtcgtgg atgctgtcat tgcgattggt gatgaagatc gtctcaacat gattggaata 600

aagaaggttt ctgggggcaa catgcgtgac tcctttttag taaatggtgt tgccttcaag 660

aagacatttt catatgctgg atttgaacaa cagccaaaga agtttcttaa tcccaaaata 720

cttctactga acattgaatt ggaactgaaa tctgagaaag aaaatgctga gataaggttg 780

tcagatccat cccagtatca gtccattgtt gatgcagaat ggaatattat ttatgacaag 840

ttggataagt gtgtgcagag tggggccagg gttgttcttt cacggctggc cataggcgat 900

ctagcaacac agtattttgc agatagagat atattctgtg ctggacgtgt aactgaagaa 960

gatctgcacc gggtagctgc tgccactggt gggactgtgc aaacatccat caacaatgtt 1020

attgatgagg tccttggaac gtgcgagtgt tttgaggaaa ggcaagttgg aaatgagagg 1080

tttaatatat ttagtggatg tccgtcaggt aggacagcta caattgttct tcgtggtgga 1140

gctgatcagt tcattgagga agctgagcga agtttacatg atgctattat gattgtcaga 1200

agagcgctaa agaattcaac tgtagttgct ggtggtggtg ctatagatat ggaaatcagc 1260

cggtacttgc ggcagaaagc acatgaaatt agggggaagt ctcagtttgt cattaactct 1320

tatgcaaaag ctcttgaggt tatcccacgg cagctctgtg ataatgcggg atttgatgca 1380

actgatgtgc taaacaaact tagacagaaa cacgcgcatc catctggcga gggtgcactt 1440

tatggagttg acatcaacac aggtggaatt gctgattcat ttgctaactt tgtctgggag 1500

ccagctgttg tgaagatcaa tgctataaat gctgctactg aggctgcttg ccttgtttta 1560

agtgtcgacg agacagtaaa aaacccaaag tccgagagtg cacagggaga agctgctgca 1620

agtgccatgg gaggtcgagg tcgtggaggc ggtcgtgggc gcgggatgcg aagacgatag 1680

<210> 10

<211> 1564

<212> DNA

<213> 梨（Pyrus spp）

<400> 10

atggggttcg gaatgcagcc ctacggaata caatcgatgc tgaaggaggg ccacaagcat 60

ctccccggtt tggacgaggc ggtgctgaag aacatcgatg cctgcaagca actctccacc 120

atcaccagaa cttctctcgg tcccaatggt atgaacaaga tggtaatcaa tcacttggac 180

aagctatttg tgaccaatga tgccgccacc attgtcaatg aactggaggt tcagcatcct 240

gctgccaaga tattagtttt ggcaggcagg gctcagcagg aagaaatcgg cgatggcgct 300

aatctcacca tttcttttgc cggggagctc cttcaaaacg cagaggagct tatcaggatg 360

ggcctgcacc cgagcgagat cattagtgga tacaataaag ccatcaaaaa gacaattgaa 420

atcttagatg gactggttga ggaaggttct gagaacatgg atgtgcgcaa caaagaacag 480

gtggtttgta gaatgaaagc tgctattgcc agcaagcaat tcgggcaaga agatatctta 540

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gtggataatg tacgtgttgc aaagattgtg ggagggggtt tgcataattg tacagtagtt 660

cgaggtatgg tgttgaaaac tgatgctctg gggagtataa agcgaatgga taaggccaag 720

gttgctgtgt ttgctggtgg tgttgatacc tctgcaactg agaccaaagg aactgtccta 780

attcatactg ctgaccagct agaaaattat gcaaaaacag aagaagctaa aattgaggag 840

ctcatcaaag cagttgcaga ttccggtgct aaagtaattg tcagtggagc agcagttgga 900

gagatggcac tacatttttg tgagcggtac aagctcatgg tgttgaaaat cagttcaaag 960

tttgagttga gacgcttttg ccgtacaact ggtgctgttg ccatgttgaa gctcagccag 1020

cctaacccag atgatttggg atatgttgac tctgtctcgg tcgaggaaat tgctggtgtt 1080

agggtcactg ttgtgaagaa tgaagaaggg ggtaactctg tatccactgt gcttctacga 1140

gggagtactg acagtatatt ggatgacctc gaaagagcgg ttgatgatgg agtgaacact 1200

tacaaggcaa tgtgcaagga tagccgtatt gttcctggag ctgcagctac tgaaattgag 1260

ttagctagga gagtaaagga attctctttt acagaaacag gattggatca gtatgctata 1320

gcaaaatttg ctgaaagctt cgagatggta cctaaaacac tggctgaaaa tgctggactt 1380

aatgcaacgg agatcatatc ttctctatat gctgaacatg catcaggaaa taccaaagtt 1440

ggccttgact tggagggagg ctgttgcaga gatgtgtcaa ctcttaatgt ttgggacctc 1500

cacataacca agttctttgc tcttaagtat gctgcagatg ctgcctgcac tgttctacga 1560

gtag 1564

Claims (4)

1.一种伴侣蛋白的编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.3或SEQ ID No.4或SEQ IDNo.5或SEQ ID No.6或SEQ ID No.7或SEQ ID No.8或SEQ ID No.9或SEQ ID No.10所示。

2.如权利要求1所述的基因序列编码的伴侣蛋白。

3.如权利要求2所述的伴侣蛋白在辅助PbPTB3韧皮部长距离运输中的应用，其特征在于，PbPTB3为SEQ ID No.2所示的核苷酸序列编码的蛋白。

4.如权利要求2所述的伴侣蛋白在辅助PbWoxT1韧皮部长距离运输中的应用， 其特征在于，PbWoxT1的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

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