CN116144699B - 一种植物砧穗间运输蛋白质的载体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种植物砧穗间运输蛋白质的载体及其应用。本发明提供的运输蛋白质载体包括含有植物长距离移动肽的核心区，以及辅助肽运输蛋白质的可变区。本发明将其与功能蛋白的融合表达载体转化至砧木内，嫁接后可将功能蛋白运输至接穗中，达到调控接穗性状的目的。本发明提供的载体可直接、高效地运输蛋白质，实现了接穗性状的定向调控，具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，具体说是一种植物砧穗间运输蛋白质的载体及其应用。
背景技术
嫁接是农业生产中重要的繁殖方式。在以往生产栽培过程中发现，相同接穗嫁接至不同砧木上会产生不同性状。嫁接后，砧穗互作对接穗树体发育、开花、抗逆性、果实产量和品质等方面都会产生影响。因此对砧穗相互作用加以利用和改良，培育优良品种的砧木，对于调控接穗性状，提高作物生产效益具有重要意义。
在植物砧穗互作过程中起到重要调控作用的就是植物细胞间通讯。植物细胞间通讯是指植物响应外界刺激，通过信号分子的运输调节自身基因表达及生理生化反应。信号分子的运输分为细胞间的短距离运输以及器官间的长距离运输。目前已知的可进行长距离移动的信号分子包括，mRNA、microRNA、siRNA、蛋白质、肽、激素、第二信使等。这些长距离移动的信号分子可以将感受到的外界刺激传递到靶器官中，系统性地调控植物生理生化过程及抗逆反应。其中肽是一种重要的信号分子，从调节植物生长发育到响应生物和非生物胁迫，涉及植物生长的各个重要阶段。
肽由氨基酸脱水缩合而成，它由特定的组织在特定的环境下产生，通过与特异性受体相结合，进行植物组织和细胞间通讯。自1991年首次在番茄中发现植物肽系统素参与番茄抗虫反应(Pearce et al.，1991)以来，已报道了几十个家族的植物肽，在植物维管束形成、细胞增殖、花粉管生长、分生组织发育以及防御反应等方面都发挥了重要作用。虽然植物肽作为信号分子在植物生长发育过程中影响广泛，但目前对于肽如何通过长距离运输传递环境刺激信号，协调生物过程，调节植物生长仍然知之甚少。因为肽分子量小，在生物体内作用浓度低等特点，目前已鉴定到的具有长距离移动能力的肽数量极少，对其运输和作用机理的研究更少。因此，寻找具有长距离移动能力的肽，并将其应用至调控植物生长发育中就变得尤为重要。
发明内容
针对现有技术中存在的缺陷，本发明的目的在于提供一种植物砧穗间运输蛋白质的载体。本发明提供的运输蛋白质载体包括含有植物长距离移动肽的核心区，以及辅助肽运输蛋白质的可变区。本发明将其与功能蛋白的融合表达载体转化到砧木内，嫁接后可将功能蛋白运输至接穗中，达到调控接穗性状的目的。本发明提供的载体可直接、高效地运输蛋白质，实现了接穗性状的定向调控，具有广阔的应用前景。
为达到以上目的，本发明采取的技术方案是：
一种植物砧穗间运输蛋白质的载体，其特征在于，包括依次连接的可变区、核心区和功能蛋白。
在上述方案的基础上，所述核心区为长距离运动肽SUB1或SUB2，其氨基酸序列分别如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示。
在上述方案的基础上，所述可变区为长度为10-40个氨基酸的多肽，其序列为任意氨基酸组合，包括但不限于如SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14所示的序列，上述氨基酸序列分别与SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ IDNO：5、SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7所示核苷酸序列一一对应。
在上述方案的基础上，所述功能蛋白为在植物砧穗间不能移动的调控功能蛋白，包括但不限于分枝功能蛋白、耐盐功能蛋白、抗旱功能蛋白、着色功能蛋白、成花功能蛋白等。
本发明的另一个目的在于提供一种植物砧穗间运输蛋白质的载体的应用。
为达到以上目的，本发明采取的技术方案是：
一种植物砧穗间运输蛋白质的载体的应用，其特征在于，在植物体内表达载体，将功能蛋白从砧木运输至接穗，并调控接穗性状。
本发明所述的运输蛋白载体，作用方式为重组载体表达，通过嫁接的方式实现功能蛋白长距离运输。具体包括以下步骤：
步骤1：合成核心区长距离移动肽SUB1或SUB2的基因序列和可变区SP的基因序列，并将其构建到载体pCAMBIAsuper1300载体上，得到载体pCAMBIA super1300-sp-SUB1、pCAMBIA super1300-sp-SUB2。
所述长距离移动肽基因SUB1的基因序列为GTCGGGGCGGACGAGGGTGACGCAATAAAG；
所述长距离移动肽基因SUB2的基因序列为CAAGTAGACAATCCGGGGGTAGTCGCGCGTACATAC；
所述可变区基因SP的基因序列可以为10-40个氨基酸(30-120个核苷酸且为3的倍数)的任意序列，例如：ATGGCCTCCAATCCTCTCCTCCCCCTCCTCTTGCTTCTCACATTATTCAAATTCTCAGCC。
步骤2：克隆功能性基因，并将其构建到步骤1所述pCAMBIA super1300-sp-SUB1、pCAMBIA super1300-sp-SUB2载体上。
本步骤中，以促进耐盐功能基因MdMYB121(SEQ ID NO：8)和分枝功能基因SlZFP2(SEQ ID NO：9)为例，构建后可得到载体pCAMBIA super1300-sp-SUB1-MdMYB121、pCAMBIAsuper1300-sp-SUB2-MdMYB121、pCAMBIA super1300-sp-SUB1-SlZFP2，用于后续融合表达。
步骤3：采用农杆菌侵染、叶盘法转化的方式在苹果或烟草中转基因过表达pCAMBIA super1300-sp-SUB1-MdMYB121、pCAMBIA super1300-sp-SUB2-MdMYB121、pCAMBIAsuper1300-sp-SUB1-SlZFP2，以上述转基因植株为砧木，野生型植株为接穗，进行嫁接。
步骤4：对嫁接植株进行盐胁迫处理，调查成活率，以及调查分枝情况。
其中，步骤1所述合成基因SP-SUB1由在原基因SP-SUB1序列两端分别加入HindIII和PstI酶切位点形成；
步骤1所述合成基因SP-SUB2由在原基因SP-SUB2序列两端分别添加HindIII和PstI酶切位点形成。
上述步骤1所述载体构建的具体步骤如下：
将步骤1所述的合成基因SP-SUB1、SP-SUB2与pCAMBIA super1300同时使用HindIII和PstI快切酶进行双酶切，然后将酶切产物用T4DNA连接酶进行连接，得到载体pCAMBIA super1300-SP-SUB1、pCAMBIA super1300-SP-SUB2。
上述步骤2所述将耐盐功能基因MdMYB121和分枝功能基因SlZFP2构建到含有pCAMBIAsuper1300的载体上的具体步骤如下：
1.采用CTAB法提取苹果和番茄叶片RNA；
2.将上述提取的RNA采用TRUEscript 1stStrand cDNA STRAND cDNA SynthesisKit试剂盒反转录成cDNA；
3.PCR克隆苹果MdMYB121基因全长序列，引物序列如下：
MdMYB121-F：ATGAGGAACCCATCGTCTTC
MdMYB121-R：CTACTCCGTTTGATCATTAACG
PCR克隆番茄SlZFP2基因全长序列，引物序列如下：
SlZFP2-F：ATGAGTTATGAACCAAACACGG；
SlZFP2-R：TTAAAGCCTTAATGACAAATCAAG。
4.通过PCR扩增将MdMYB121回收产物加酶切位点，引物序列如下：
PstI-MdMYB121F：CTGCAGATGAGGAACCCATCGTCTTC；
SpeI-MdMYB121R：ACTAGTCTACTCCGTTTGATCATTAACG；
PstI-SlZFP2-F：CTGCAGATGAGTTATGAACCAAACACGG；
SpeI-SlZFP2-R：TTAAAGCCTTAATGACAAATCAAG。
5.琼脂糖凝胶电泳检测并进行胶回收，与pCAMBIAsuper1300-sp-SUB1、pCAMBIAsuper1300-sp-SUB2载体分别进行双酶切，采用T4DNA连接酶进行16℃连接，得到载体pCAMBIA super1300-sp-SUB1-MdMYB121、pCAMBIA super1300-sp-SUB2-MdMYB121、pCAMBIA super1300-sp-SUB1-SlZFP2。转入E.coli DH5α感受态细胞中，挑取单克隆摇菌，测序后提取质粒。
6.将上述提取出的质粒转化至农杆菌GV3101感受态细胞中。
上述步骤3的苹果、烟草转基因的具体步骤如下：
1.吸取100ul上述转化好的农杆菌，加入10ml含有利福平和卡那的YEP培养基中，180rpm，28℃过夜摇菌。
2.摇至菌液OD600＝0.6-0.8，6000rpm，8min集菌。
3. 10ml液体MS重悬。28℃摇4h。
4. 6000rpm，8min集菌，30ml液体MS重悬。
5.将苹果、烟草组培苗叶片剪成0.5cm×0.5cm的方块，放置于三角瓶中，将菌液倒入瓶中摇晃3min侵染。
6.将菌液倒出，用滤纸吸干，将叶片平铺于共培养板上。
7.暗培2d后转入脱菌板上。
上述步骤4苹果嫁接苗耐盐性表型分析的具体步骤为：
嫁接2个月后，用300mM NaCl处理苹果嫁接苗，处理14d后统计存活率。
上述步骤5烟草嫁接苗分枝表型分析的具体步骤为：
嫁接3个月后，观察不同烟草嫁接植株上野生型番茄接穗的分枝情况。
本发明所述的一种植物砧穗间运输蛋白质的载体及其应用，其有益效果为：
(1)利用长距离移动肽携带不同功能蛋白在植物体内进行长距离移动，对嫁接在转基因砧木之上的接穗起到调节生长发育的作用，可应用于植物转基因砧木育种，培育一系列可改良接穗性状的优良砧木。
(2)利用肽作为运输载体，肽分子量极小，可以避免移动过程中受到胞间连丝排阻限的限制，从而使可运输分子量更大，运输能力更强。
(3)可将蛋白运输到作用部位而非运输DNA或RNA等核酸分子，无需经过转录、翻译可直接高效发挥作用，避免了其他因素影响转录翻译过程导致表达量低的状况。
(4)无需使用转基因接穗，只需转化一种砧木就可对多种接穗性状进行改良。本发明提供的载体构建方法简单易行，利用常规的载体构建方法即可快速实现，具有巨大的应用价值。
附图说明
本发明有如下附图：
图1为pCAMBIA super1300-sp-SUB1-MdMYB121运输蛋白质载体示意图；
图2为苹果嫁接植株耐盐性表型示意图；
图3为pCAMBIA super1300-sp-SUB2-MdMYB121运输蛋白质载体示意图；
图4为pCAMBIA super1300-sp-SUB1-SlZFP2运输蛋白质载体示意图；
图5为烟草嫁接植株分枝表型示意图；
图6为pCAMBIA super1300-sp-MdMYB121运输蛋白质载体示意图；
图7为pCAMBIA super1300-SUB1-MdMYB121运输蛋白质载体示意图；
图8为本发明一种植物砧穗间运输蛋白质的载体结构示意图。
具体实施方式
为了进一步解释说明本发明的目的、技术方案，下面结合实施例对本发明进行具体描述，但并不对本发明进行限定。下述实施例中无特殊说明的实验设备、试剂、材料，均可从商业渠道购买。下述实施例中无特殊说明的实验方法，均为常规方法。
本发明中所述功能蛋白为在植物砧穗间不能移动的调控功能蛋白，包括但不限于分枝功能蛋白、耐盐功能蛋白、抗旱功能蛋白、着色功能蛋白、成花功能蛋白等。
以下实施例以载体负载耐盐功能蛋白和负载分支功能蛋白为例说明本发明的技术方案。
实施例1：pCAMBIA super1300-sp-SUB1-MdMYB121可提高接穗的耐盐性
1.运输蛋白载体核心区和可变区基因序列获得
核心区长距离移动肽基因SUB1与可变区基因SP(序列见序列表SEQ ID NO：3)均由生物公司合成，并在序列两端分别添加酶切位点HindIII和PstI
2.运输载体构建
将上述合成基因SP-SUB1与pCAMBIA super1300同时使用HindIII和PstI快切酶进行双酶切，反应温度37℃，反应时间2h。
然后将酶切产物用T4DNA连接酶16℃过夜连接。得到载体pCAMBIA super1300-SP-SUB1，载体图如图1所示。
将连接好的载体转化至E.coli DH5α感受态细胞中，菌落PCR后将阳性菌送测序，选出测序正确的菌落。
3.耐盐功能基因克隆
为扩增MdMYB121基因全长序列，采用CTAB法提取‘嘎啦’苹果叶片RNA。
将上述提取的RNA采用TRUEscript 1stStrand cDNA STRAND cDNA Synthesis Kit试剂盒反转录成cDNA。
PCR克隆苹果MdMYB121基因全长序列，引物序列如下：
MdMYB121-F：ATGAGGAACCCATCGTCTTC；
MdMYB121-R：CTACTCCGTTTGATCATTAACG。
4.运输耐盐蛋白载体构建
(1)通过PCR扩增将MdMYB121回收产物加酶切位点，引物序列如下：
PstI-MdMYB121F：CTGCAGATGAGGAACCCATCGTCTTC；
SpeI-MdMYB121R：ACTAGTCTACTCCGTTTGATCATTAACG。
(2)琼脂糖凝胶电泳检测并进行胶回收，与pCAMBIA super1300-sp-SUB1和pCAMBIA super1300载体分别使用PstI和SpeI快切酶进行双酶切，采用T4DNA连接酶进行16℃连接，得到载体pCAMBIA super1300-sp-SUB1-MdMYB121和pCAMBIA super1300-MdMYB121。
(3)转入E.coli DH5α感受态细胞中，挑取单克隆摇菌，测序后提取质粒。
(4)将上述提取出的质粒转化至农杆菌GV3101感受态细胞中。
5.苹果转基因
采用农杆菌侵染、叶盘法转化的方式在苹果中转基因过表达pCAMBIA super1300-sp-SUB1-MdMYB121和pCAMBIA super1300-MdMYB121，具体步骤如下：
(1)吸取100ul上述转化好的农杆菌，加入10ml含有利福平和卡那的YEP培养基中，180rpm，28℃过夜摇菌。
(2)摇至菌液OD600＝0.6-0.8，6000rpm，8min集菌。
(3)10ml液体MS重悬。28℃摇4h。
(4)6000rpm，8min集菌，30ml液体MS重悬。
(5)将苹果、烟草组培苗叶片剪成0.5cm×0.5em的方块，放置于三角瓶中，将菌液倒入瓶中摇晃3min侵染。
(6)将菌液倒出，用滤纸吸干，将叶片平铺于共培养板上。
(7)暗培2d后转入脱菌板上。
(8)取再生芽进行转基因阳性株鉴定。
6.转基因植株嫁接
待生长大小一致的转基因苹果组培苗，生长一个月后进行嫁接。转基因苹果作为砧木，用剃须刀片横切。野生型苹果作为接穗，从第二片叶以下横切，然后将茎段基部削成楔形，插入砧木的切口内。用嫁接夹将嫁接口紧密夹住。嫁接成活后，可去除嫁接夹。
7.嫁接植株耐盐性分析
嫁接2个月后，用300mM NaCl处理苹果嫁接苗，处理14d后统计存活率。
存活率＝(存活株数/处理株数)×100％
结果显示：嫁接2个月后，野生型苹果接穗的生长状况如图2所示，嫁接植株的存活率如下表所示，可以发现WT/sp-SUB1-MdMYB121嫁接植株的存活率显著高于WT/MdMYB121嫁接植株的存活率。
实施例2：pCAMBIA super1300-sp-SUB2-MdMYB121可提高接穗的耐盐性
1.运输蛋白载体核心区和可变区基因序列获得
核心区长距离移动肽基因SUB2与可变区基因SP均由生物公司合成，并在序列两端分别添加酶切位点HindIII和PstI，序列见序列表。
2.运输载体构建
将上述合成基因SP-SUB2与pCAMBIA super1300同时使用HindIII和PstI快切酶进行双酶切，反应温度37℃，反应时间2h。
然后将酶切产物用T4DNA连接酶16℃过夜连接。得到载体pCAMBIA super1300-SP-SUB2，载体图如图3所示。
将连接好的载体转化至E.coli DH5α感受态细胞中，菌落PCR后将阳性菌送测序，选出测序正确的菌落。
3.耐盐功能基因克隆方法与实施例1中相同。
4.运输耐盐蛋白载体构建
(1)通过PCR扩增将MdMYB121回收产物加酶切位点，引物序列如下：
PstI-MdMYB121F：CTGCAGATGAGGAACCCATCGTCTTC；
SpeI-MdMYB121R：ACTAGTCTACTCCGTTTGATCATTAACG。
(2)琼脂糖凝胶电泳检测并进行胶回收，回收产物与pCAMBIA super1300-sp-SUB2载体分别使用PstI和SpeI快切酶进行双酶切，采用T4DNA连接酶进行16℃连接，得到载体pCAMBIA super1300-sp-SUB2-MdMYB121(图4)。
(3)转入E.coliDH5α感受态细胞中，挑取单克隆摇菌，测序后提取质粒。
(4)将上述提取出的质粒转化至农杆菌GV3101感受态细胞中。
5.苹果转基因、转基因植株嫁接、转基因植株耐盐性分析的方法与实施例1中相同。
结果显示：嫁接2个月后，嫁接植株的存活率如下表所示，可以发现WT/sp-SUB2-MdMYB121嫁接植株的存活率显著高于WT/MdMYB121嫁接植株的存活率。
实施例3：pCAMBIA super1300-sp-SUB1-SlZFP2可调控接穗分枝
1.运输蛋白载体核心区和可变区基因序列获得和运输载体构建的方法，与实施例1中相同。
2.分枝功能基因克隆
为扩增SlZFP2基因全长序列，采用CTAB法提取番茄叶片RNA。
将上述提取的RNA采用TRUEscript 1stStrand cDNA STRAND cDNA Synthesis Kit试剂盒反转录成cDNA。
PCR克隆番茄SlZFP2基因全长序列，引物序列如下：
SlZFP2-F：ATGAGTTATGAACCAAACACGG；
SlZFP2-R：TTAAAGCCTTAATGACAAATCAAG。
3.运输分枝蛋白载体构建
(1)通过PCR扩增将SlZFP2回收产物加酶切位点，引物序列如下：
PstI-SlZFP2-F：CTGCAGATGAGTTATGAACCAAACACGG；
SpeI-SlZFP2-R：TTAAAGCCTTAATGACAAATCAAG。
(2)琼脂糖凝胶电泳检测并进行胶回收，回收产物与pCAMBIA super1300-sp-SUB1和pCAMBIA super1300载体分别使用PstI和SpeI快切酶进行双酶切，采用T4DNA连接酶进行16℃连接，得到载体pCAMBIA super1300-sp-SUB1-SlZFP2和pCAMBIA super1300-SlZFP2。
(3)转入E.coliDH5α感受态细胞中，挑取单克隆摇菌，测序后提取质粒。
(4)将上述提取出的质粒转化至农杆菌GV3101感受态细胞中。
(5)烟草转基因方法与实施例1中相同。
(6)转基因植株嫁接
待生长大小一致的转基因烟草和野生型番茄，生长一个月后进行嫁接。转基因烟草作为砧木，用剃须刀片横切。野生型番茄作为接穗，从第二片叶以下横切，然后将茎段基部削成楔形，插入砧木的切口内。用保鲜膜将嫁接口紧密缠绕。嫁接成活后，可去除保鲜膜。
(7)嫁接3个月后，观察不同烟草嫁接植株上野生型番茄接穗的分枝情况。
结果显示：嫁接3个月后，WT/sp-SUB1-S1ZFP2嫁接植株中野生型番茄接穗的分枝数明显高于WT/SlZFP2(图5)。
实施例4：pCAMBIA super1300-sp-MdMYB121不可提高接穗的耐盐性
1.不含核心区运输蛋白载体的可变区基因序列获得，与实施例1相同。
2.运输载体构建
将上述合成基因SP与pCAMBIA super1300同时使用HindIII和PstI快切酶进行双酶切，反应温度37℃，反应时间2h。
然后将酶切产物用T4DNA连接酶16℃过夜连接。得到载体pCAMBIA super1300-SP，载体图如图6所示。
将连接好的载体转化至E.coli DH5α感受态细胞中，菌落PCR后将阳性菌送测序，选出测序正确的菌落。
3.耐盐功能基因克隆方法与实施例1中相同。
4.运输耐盐蛋白载体构建
(1)通过PCR扩增将MdMYB121回收产物加酶切位点，引物序列如下：
PstI-MdMYB121F：CTGCAGATGAGGAACCCATCGTCTTC；
SpeI-MdMYB121R：ACTAGTCTACTCCGTTTGATCATTAACG。
(2)琼脂糖凝胶电泳检测并进行胶回收，回收产物与pCAMBIA super1300-sp载体分别使用PstI和SpeI快切酶进行双酶切，采用T4DNA连接酶进行16℃连接，得到载体pCAMBIA super1300-sp-MdMYB121。
(3)转入E.coliDH5α感受态细胞中，挑取单克隆摇菌，测序后提取质粒。
(4)将上述提取出的质粒转化至农杆菌GV3101感受态细胞中。
5.苹果转基因、转基因植株嫁接、转基因植株耐盐性分析的方法与实施例1中相同。
结果显示：嫁接2个月后，嫁接植株的存活率如下表所示，可以发现WT/sp-MdMYB121嫁接植株的存活率与WT/MdMYB121嫁接植株的存活率无显著差异。
实施例5：pCAMBIA super1300-SUB1-MdMYB121不可提高接穗的耐盐性
1.不含可变区运输蛋白载体的核心区基因SUB1序列获得，与实施例1相同。
2.运输载体构建
将上述合成基因SUB1与pCAMBIA super1300同时使用HindIII和PstI快切酶进行双酶切，反应温度37℃，反应时间2h。
然后将酶切产物用T4DNA连接酶16℃过夜连接。得到载体pCAMBIA super1300-SUB1，载体图如图7所示。
将连接好的载体转化至E.coli DH5α感受态细胞中，菌落PCR后将阳性菌送测序，选出测序正确的菌落。
3.耐盐功能基因克隆方法与实施例1中相同。
4.运输耐盐蛋白载体构建
(1)通过PCR扩增将MdMYB121回收产物加酶切位点，引物序列如下：
PstI-MdMYB121F：CTGCAGATGAGGAACCCATCGTCTTC；
SpeI-MdMYB121R：ACTAGTCTACTCCGTTTGATCATTAACG。
(2)琼脂糖凝胶电泳检测并进行胶回收，回收产物与pCAMBIA super1300-SUB1载体分别使用PstI和SpeI快切酶进行双酶切，采用T4DNA连接酶进行16℃连接，得到载体pCAMBIA super1300-SUB1-MdMYB121。
(3)转入E.coliDH5α感受态细胞中，挑取单克隆摇菌，测序后提取质粒。
(4)将上述提取出的质粒转化至农杆菌GV3101感受态细胞中。
5.苹果转基因、转基因植株嫁接、转基因植株耐盐性分析的方法与实施例1中相同。
结果显示：嫁接2个月后，嫁接植株的存活率如下表所示，可以发现WT/SUB1-MdMYB121嫁接植株的存活率与WT/MdMYB121嫁接植株的存活率无显著差异。
本说明书中未作详细描述的内容属于本领域专业技术人员公知的现有技术。
Claims (3)
1.一种植物砧穗间运输蛋白质的载体，其特征在于，包括依次连接的可变区、核心区和功能蛋白；
所述核心区为长距离运动肽SUB1，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；
所述可变区为长度为10-40个氨基酸的多肽，其序列如SEQ ID NO:3所示。
2.如权利要求1所述的一种植物砧穗间运输蛋白质的载体，其特征在于：所述功能蛋白为在植物砧穗间不能移动的调控功能蛋白，包括分枝功能蛋白、耐盐功能蛋白、抗旱功能蛋白、着色功能蛋白、成花功能蛋白。
3.如权利要求1所述载体的应用，其特征在于，在植物体内表达载体，将功能蛋白从砧木运输至接穗，并调控接穗性状。
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