CN112011550A - 一种阻断叶柄韧皮部鉴定信号交流的方法 - Google Patents

一种阻断叶柄韧皮部鉴定信号交流的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种阻断叶柄韧皮部鉴定信号交流的方法，本发明利用农杆菌侵染叶片瞬时表达基因的方式，通过叶柄环剥技术切断韧皮部筛管系统，阻断韧皮部信号分子运输，之后对叶柄进行mRNA分子或蛋白检测，实现快速验证韧皮部信号分子交流，同时也可验证互作基因或蛋白对信号分子长距离运输之间影响的问题，具有能够普遍应用于韧皮部与木质部分明的其他植物的特点。解决了果树等木本植物两个基因共转化困难的问题，能够快速、灵敏、简便、准确的验证不具有组织特异性的mRNA及蛋白等信号分子可否通过韧皮部长距离运输，克服了果树通过转基因技术验证信号分子交流较难、耗时长且不方便等问题。

Description

一种阻断叶柄韧皮部鉴定信号交流的方法
技术领域
本发明涉及植物分子生物学领域，具体涉及的是阻断韧皮部mRNA及蛋白信号分子交流的方法。
背景技术
嫁接是果树最主要的无性繁殖方式，砧穗间相互作用会对植株的生长量、开花结果、营养、抗性等方面产生一定影响。近年来随着分子生物学的发展，人们发现砧穗间信号分子的长距离运输可调控植株表型。迄今为止果树中发现的信号分子主要包括激素、核酸信号分子和蛋白信号分子，如核酸信号分子PbGAI(Zhang et al.,2012)、PbNACP(Zhang etal.,2013)、PbKNOTTED1(Duan et al.,2014)和蛋白信号分子PbPTB3(Duan et al.,2016)、PbTTG1(Wang et al.,2019)等经验证可通过韧皮部长距离运输。与草本植物相比，多年生果树的高杂合度遗传背景、转基因过程中再生率低以及采样技术的相对落后使得果树信号分子的鉴定存在一定难度。
品种间嫁接结合高通量测序技术是检测植物韧皮部运输mRNA、蛋白等信号分子长距离运输常用的方法，然而该方法耗时较长，得到的数据量庞大，假阳性率较高，从而使得进一步验证信号分子的运输性十分必要。
品种间嫁接结合CAPS方法对于鉴定mRNA韧皮部长距离运输性应用较广泛，但仅能应用于品种间同一基因存在SNP位点的情况，且仅能鉴定mRNA的运输性，对于同源性较高基因、蛋白质分子或品种间嫁接不亲和的情况无法应用。
对某一信号分子的运输性鉴定还可采用转基因植株嫁接野生型植株的方式，但该方法耗时较长，且对于木本植物等难于转基因的物种较难实现。
前期关于PbWoxT1信号分子在梨韧皮部长距离运输的研究中，采用枝条环剥的方式分别检测两道环剥口上、中、下位置信号分子的移动情况，进而确定其可在韧皮部中从源到库运输(Duan et al.,2016)。然而该方法需要信号分子具有组织特异性，而且需要在植物体内稳定表达，而果树等木本植物转基因困难，难以获得稳定表达的植株，且无法在不具有组织特异性的信号分子上应用，该方法要求高，耗时长，工作量大，且存在局限性。从而使得果树韧皮部信号分子的运输性难以快速鉴定，为我们进行果树韧皮部中信号分子交流的鉴定研究过程中增加了难度。
环剥是果树生产上常用的调控措施，将树干或枝条的韧皮部环剥掉，可以有效阻断树体上下部营养物质、光合作用同化物和信号分子在植物体内的运输，进而调控营养生长、成花、增加果实产量和提高果实品质等。该项技术的应用，既能媲美外用生长调节剂对果实的影响，又可以减少农药对树体和土壤的污染，同时很大程度上提高果实产量和品质。对于环剥部位一般选择在主干、主枝或副主枝上，以树体的生长情况而定。一般环剥的深度要达到木质部，而不伤及木质部。关于环剥的作用机理研究分别从营养、激素和核酸等不同的角度进行了深入研究，如环剥促进柑桔花芽分化主要是由于可溶性糖在割口上方的叶片中大量积累，降低了叶片的含氨量，因而显著提高了叶片的碳氮比值导致。目前国内外关于果树环剥技术多停留在栽培技术上，而对于其在信号分子交流的研究中应用较少。
发明内容
针对现有技术中存在的缺陷，本发明的目的在于提供一种阻断叶柄韧皮部鉴定信号交流的方法，解决了不具有组织特异性的信号分子快速验证韧皮部长距离运输的问题，同时也解决了果树通过转基因技术验证信号分子长距离运输较难、耗时长且不方便等问题。
为达到以上目的，本发明采取的技术方案是：
本发明利用农杆菌侵染叶片瞬时表达基因的方式，通过叶柄环剥技术切断韧皮部筛管系统，阻断韧皮部信号分子运输，之后对叶柄进行mRNA分子或蛋白检测，实现快速验证韧皮部信号分子交流，同时也可验证互作基因或蛋白对信号分子长距离运输之间影响的问题，解决了果树等木本植物两个基因共转化困难的问题，具有快速、灵敏、简便、准确性高，能够普遍应用于韧皮部与木质部分明的其他植物的特点。
一种阻断叶柄韧皮部鉴定信号交流的方法，包括如下步骤：
(1)根据‘砀山酥梨’基因组(http://peargenome.njau.edu.cn/default.asp？d＝4&m＝2)进行比对分析设计特异性引物，获得PbWoxT1核酸信号分子和PbPTB3蛋白信号分子的基因全长序列；
PbWoxT1核酸信号分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；PbPTB3蛋白信号分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
(2)分别以CAMV35S和SUC2为启动子，将PbWoxT1和PbPTB3构建到pCAMBIA1305.1载体上，制备pCAMBIA1305.1-PbWoxT1和pCAMBIA1305.1-PbPTB3载体，并分别转化根癌农杆菌；
(3)将杜梨源叶片与叶柄连接处的叶柄部位用手术刀片环剥掉宽约2mm左右大小的韧皮部；
(4)将含有pCAMBIA1305.1-PbWoxT1或pCAMBIA1305.1-PbPTB3载体的根癌农杆菌在杜梨叶片中瞬时表达；
(5)暗培1天转光下培养3天后，分别选取杜梨的完整叶柄及叶柄环剥部位制作石蜡切片，观察韧皮部去除情况；
(6)完整叶柄基部及环剥叶柄基部取样，提取植物总RNA，反转录成cDNA，RT-qPCR检测PbWoxT1运输情况；同时提取植物总蛋白，免疫印迹检测PbPTB3运输情况；
结果表明：PbWoxT1在杜梨叶片瞬时表达4天后，在完整的叶柄基部能够检测到PbWoxT1的运输情况，而在环剥掉叶柄韧皮部的叶柄基部无法检测到PbWoxT1的运输，说明以此方法环剥叶柄韧皮部，能够阻断PbWoxT1核酸信号分子交流；
PbPTB3在杜梨叶片瞬时表达4天后，在完整的叶柄基部能够检测到PbPTB3的运输情况，而在环剥掉叶柄韧皮部的叶柄基部无法检测到PbPTB3的运输，说明以此方法环剥叶柄韧皮部，能够阻断PbPTB3蛋白信号分子交流；
同时PbWoxT1信号分子与PbPTB3信号分子分别采用不同启动子启动表达，均能通过叶柄环剥方式阻断信号分子交流，进一步说明核酸及蛋白信号分子通过韧皮部长距离运输。
步骤(1)中，设计PbWoxT1核酸信号分子的特异性引物为：
上游5'ATGGACCCTCAACAGATGCCAAATG 3'
下游5'TCAATATGATCTGAAGTAATCATGG 3'；
设计PbPTB3核酸信号分子的特异性引物为：
上游5'ATGACAGAACCTTCTAAAGTCATTC 3'
下游5'TCATATTGCCTGTAGCTGCGAGAAGG 3'。
步骤(2)中，构建pCAMBIA1305.1-PbWoxT1载体过程中，PCR扩增所用的引物为：
上游5'GCGAGATCTATGGACCCTCAACAGATGCCAAATG 3'
下游5'TATCCAGTGGTCAATATGATCTGAAGTAATCATGG 3'；
构建pCAMBIA1305.1-PbPTB3载体过程中，PCR扩增所用的引物为：
上游5'GCGACTAGTATGACAGAACCTTCTAAAGTCATTC 3'
下游5'TATCCAGTGGTCATATTGCCTGTAGCTGCGAGAAGG 3'。
本发明的有益效果：本发明提供的方法能够快速、灵敏、简便、准确的验证不具有组织特异性的mRNA及蛋白等信号分子可否通过韧皮部长距离运输，克服了果树通过转基因技术验证信号分子交流较难、耗时长且不方便等问题。同时采用此方法可以在叶片中同时表达多个基因，以此验证互作基因或蛋白对信号分子长距离运输之间的影响等问题，解决了果树等木本植物通过两个或多个基因共转化验证相互之间影响的问题，具有能够普遍应用于韧皮部与木质部分明的其他植物的特点。
附图说明
本发明有如下附图：
图1为载体构建示意图；
图中PbWoxT1为p35S:GFP-PbWoxT1；PbPTB3为pSUC2:PbPTB3-mCherry；
图2中，A：注射杜梨示意图；B：注射叶片示意图；C：环剥口示意图；
图3中，A：完整叶柄横切面石蜡切片示意图；B：环剥叶柄横切面石蜡切片示意图；
图4为完整叶柄及叶柄环剥后PbPTB3蛋白运输性分析示意图；Anti-PbPTB3：PbPTB3抗体；Anti-Actin：Actin抗体；
图5为完整叶柄及叶柄环剥后PbWoxT1 mRNA运输性分析示意图；**P<0.01。
具体实施方式
以下结合附图与实施例对本发明作进一步详细说明。
实施例1杜梨韧皮部RNA提取
为扩增PbWoxT1和PbPTB3两个基因全长序列，首先采用CTAB法提取杜梨韧皮部RNA，具体步骤如下：
(1)65℃预热CTAB，每1mL加入20μLβ-巯基乙醇；
(2)液氮中研磨样品，取0.5g样品装入2mL无RNA酶离心管中，加入1mL预热的CTAB，涡旋振荡30s，65℃水浴10min；
(3)加入1mL CI(氯仿：异戊醇＝24：1)，涡旋振荡；
(4)置于预冷的4℃离心机中13000rpm 10min；
(5)取上清，加入等体积CI，轻轻混匀；
(6)4℃离心机中13000rpm 10min；
(7)取上清，加入2倍体积异丙醇，-20℃ 30min以上；
(8)4℃离心机中13000rpm 10min；
(9)弃上清，沉淀用75％乙醇(DEPC水配制)1mL洗2次，4℃离心机中13000rpm5min；
(10)吹干残留乙醇，加入40μL DEPC水溶解，用DNase Ⅰ去除DNA，37℃ 30min，体系如下；
Figure BDA0002636284180000061
(11)加入550μL DEPC水，600μL CI，颠倒混匀，4℃离心机中13000rpm 10min；
(12)取上清，加入2倍体积无水乙醇，-20℃ 1h；
(13)4℃离心机中13000rpm 15min；
(14)弃上清，沉淀用75％乙醇(DEPC水配制)1mL洗2次，4℃离心机中13000rpm5min；
(15)吹干残留乙醇，加入30μL DEPC水溶解，-80℃保存备用。
实施例2将RNA反转录为cDNA
将实施例1提取的植物总RNA采用PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒(Promega Bio)反转录成cDNA，所得到的cDNA作为下述PCR扩增的模板。
反应体系如下：
Figure BDA0002636284180000071
冰上操作，轻轻吸打混匀，放入PCR仪中，70℃ 10min，4℃ forever。再加入如下反应体系：
Figure BDA0002636284180000072
冰上操作，轻轻吸打混匀，放入PCR仪中，42℃ 1h，70℃ 10min，-20℃保存。
实施例3 PbWoxT1和PbPTB3全长基因克隆
根据‘砀山酥梨’基因组序列比对结果，设计引物克隆PbWoxT1和PbPTB3，引物序列如下：
Figure BDA0002636284180000081
上述引物均由生工生物技术有限公司合成。
PCR体系及程序：
Figure BDA0002636284180000082
2×Es Taq MasterMix(Dye)购自(北京康为世纪生物科技有限公司，CW0682S)
Figure BDA0002636284180000083
实施例4目的片段琼脂糖凝胶回收
琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物片段大小，Axgen回收试剂盒回收目的片段。
(1)将切下的胶块置于2mL离心管中，加入500μL DE-A，65℃溶胶至胶块完全溶解，加入250μL DE-B，混合溶液上到回收住中；
(2)12000rpm离心30s，弃去回收柱中的废液；
(3)加入500μL漂洗液PW1，12000rpm离心30s，弃去回收柱中的废液；
(4)加入700μL漂洗液PW2，12000rpm离心30s，弃去回收柱中的废液，此步骤重复2次；
(5)将回收柱放回收集管内，12000rpm离心2min，吹干残留乙醇；
(6)将回收柱置于新的1.5mL离心管中，加入35μL已65℃预热的EB洗脱液，室温放置2min；
(7)12000rpm离心2min，-20℃保存备用。
实施例5载体构建(图1)
设计引物，PCR扩增将以上PCR回收产物加酶切位点，引物序列如下：
Figure BDA0002636284180000091
琼脂糖凝胶电泳检测并回收，与pCAMBIA1305.1分别进行双酶切，反应体系如下：
Figure BDA0002636284180000092
Figure BDA0002636284180000101
将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，Axgen回收试剂盒回收目标大小片段，进行连接，反应体系如下：
Figure BDA0002636284180000102
T4连接酶购自TAKARA公司。
混匀，16℃过夜；将连接体系加入50μL E.coli DH5α感受态细胞(购自全式金生物技术有限公司)中，冰上放置20min；42℃热击45s，冰上放置2min；加入200μL无抗LB培养基，37℃ 160rpm振荡培养1h；4500rpm 3min离心收集菌体，弃掉150μL上清液，用剩余的培养基重悬细胞，均匀涂布于Kan抗性固体LB培养基上，37℃倒置过夜培养。
次日挑取单克隆于200μL Kan抗性的LB培养基中，37℃ 200rpm振荡培养6h后进行PCR鉴定，挑取阳性菌液测序(生工生物技术有限公司)，测序正确菌株重摇，加入等体积甘油，-80℃保存备用。
实施例6质粒提取
测序正确菌株接种于5mL Kan抗性的LB培养基中，37℃ 200rpm过夜振荡培养，次日提取质粒(Axygen质粒提取试剂盒)。
(1)将菌液加入2mL离心管中，12000rpm离心30s多次集菌，弃上清；
(2)在沉淀中加入S1涡旋振荡混匀；
(3)在溶液中加入S2轻轻颠倒混匀10次；
(4)在溶液中加入S3，立即轻轻颠倒混匀10次；
(5)12000rpm离心10min，吸上清加入吸附柱上；
(6)静置2min，12000rpm离心30s，弃废液；
(7)加入500μL漂洗液PW1，12000rpm离心30s，弃去吸附柱中的废液；
(8)加入700μL漂洗液PW2，12000rpm离心30s，弃去吸附柱中的废液，此步骤重复2次；
(9)将吸附柱放回收集管内，12000rpm离心2min，吹干残留乙醇；
(10)将吸附柱置于新的1.5mL离心管中，加入70μL已65℃预热的EB洗脱液，室温放置2min；
(11)12000rpm离心2min，-20℃保存备用。
实施例7根癌农杆菌GV3101感受态细胞制备
(1)将农杆菌GV3101划线在YEP+Rif固体培养基上，28℃培养2-3d；
(2)挑取单克隆接种于5mL液体YEP+Rif培养基中，28℃200rpm振荡培养12h；
(3)5000rpm 5min集菌，转接于50mL液体YEP培养基中，28℃200rpm振荡培养过夜至OD600值为0.6-0.8；
(4)于50mL离心管中5000rpm 5min集菌，弃上清；
(5)将菌体用10mL 0.15M NaCl溶液重悬，冰上静置20min；
(6)4℃5000rpm 5min集菌，弃上清；
(7)用1mL预冷的0.02M CaCl2溶液轻轻重悬；
(8)分装于预冷的1.5mL离心管中，每管100μL，加等体积甘油-80℃保存备用。
实施例8根癌农杆菌GV3101感受态细胞转化
(1)将质粒1-2μL加入100μL感受态细胞中，冰上放置30min；
(2)将带有质粒的感受态细胞放入液氮中1min；
(3)放在37℃金属浴5min；
(4)置于冰上2min；
(5)加入500μL无抗性的YEP液体培养基，28℃160rpm振荡培养4-6h；
(6)4000rpm集菌，吸除300μL上清，剩余菌液重悬，涂布于YFP+Rif+Kan固体培养基上，28℃过夜培养；
实施例9杜梨叶柄环剥
选择从茎尖起第3-4片叶，在叶柄上部与叶片连接处用小刀对表皮至木质部深度进行切割，并在距离2mm处进行第二道切割，剥去环割处的韧皮部，直至露出纤维状木质部，未做环剥处理的叶片为对照(图2)。
实施例10杜梨叶片瞬时转化
(1)挑取单克隆，将阳性克隆菌液接种于5mL YEP+Rif+Kan液体培养基中，28℃160rpm振荡过夜培养；
(2)5000rpm 5min集菌，弃上清，用1mL悬浮液重悬菌体；
(3)紫外分光光度计检测菌液的OD600值，根据数值加入相应体积悬浮液使OD600调至1.0；
(4)室温静置2-5h；
(5)分别对环剥与未环剥叶柄的叶片在叶背面进行注射，避免注射到叶柄部位，遮光培养1天后转到光下培养3天，进行后续实验(图2)。
悬浮液：
Figure BDA0002636284180000121
实施例11石蜡切片
避光培养1天转光照培养3天后，将环剥口与未环剥叶柄分别取样制作石蜡切片。
(1)样品置于FAA固定液中24h，期间用注射器抽真空3-4次；
(2)梯度乙醇脱水：30％乙醇2h，50％乙醇2h，70％乙醇过夜，85％乙醇2h，95％乙醇2h，100％乙醇2h，再换100％乙醇2h，注射器抽真空，以下各步骤均需在换完后抽真空；
(3)将样品换正丁醇固定，分别为乙醇：正丁醇＝3:1中1h，乙醇：正丁醇＝1:1中1h，乙醇：正丁醇＝1:3中1h，正丁醇中30min，再换正丁醇中30min，换正丁醇：石蜡＝1:1，58℃烘箱中静置2d；
(4)换取纯蜡静置2d，期间换3-4次；
(5)取模具用纯蜡包埋，并于4℃保存或继续切片；
(6)用切片机连续切成0.1mm厚度的样品，并于37℃展片24h；
(7)对切片进行番红和固绿染色，步骤分别为：二甲苯10min(洗蜡)，二甲苯10min，1/2二甲苯+1/2乙醇5min，100％乙醇2min，95％乙醇2min，85％乙醇2min，70％乙醇2min，50％乙醇2min，番红(0.5％)2-2.5h，50％乙醇2min，70％乙醇2min，85％乙醇2min，95％乙醇2min，固绿(30-60s)，95％乙醇2min，100％乙醇2min，1/2二甲苯+1/2乙醇5min，二甲苯1min，二甲苯1min。
(8)晾干后于光学显微镜下观察。
结果表明：采用此种方式环剥叶柄，能够完全去除叶柄部位的韧皮部，环剥后叶柄仅剩余形成层、木质部和髓(图3)。
实施例12 RT-qPCR分析
环剥或未环剥的叶柄基部取样，液氮研磨，采用植物总RNA提取试剂盒(博迈德生物技术有限公司)提取植物总RNA后反转录成cDNA，使用FastStart Universal SYBR GreenMaster(Roche Life Science)试剂盒进行RT-qPCR分析，以PbACTIN为内参。
结果表明：PbWoxT1在杜梨叶片瞬时表达4天后，在完整的叶柄基部能够检测到PbWoxT1的运输情况，而在环剥掉叶柄韧皮部的叶柄基部无法检测到PbWoxT1的运输(图4)，说明以此方法环剥叶柄韧皮部，能够阻断PbWoxT1 mRNA信号分子交流。
实施例13免疫印迹分析
环剥或未环剥的叶柄基部取样，液氮研磨，加入植物蛋白提取液(购自华兴博创生物技术有限公司)，12000rpm离心15min，上清液即为植物总蛋白，继续进行免疫印迹分析。
(1)植物总蛋白提取物中加入5×SDS上样缓冲液，100℃ 5min，进行SDS-PAGE电泳；
(2)电泳45min后，利用湿电转膜仪将蛋白转移至硝酸纤维素膜上；
(3)将膜用5％的脱脂奶粉封闭液室温封闭2h；
(4)按1：3000的比例在2.5％的封闭液中加入Anti-PbPTB3多克隆抗体或Anti-Actin单克隆抗体，4℃过夜震荡孵育；
(5)TBST漂洗，5min/次，共洗5次；
(6)按1：10000的比例在0.5％的封闭液中加入HRP标记的二抗，室温震荡孵育1h；
(7)TBST漂洗，5min/次，共洗5次；
(8)膜上添加发光剂，暗室中曝光。
结果表明：PbPTB3在杜梨叶片瞬时表达4天后，在完整的叶柄基部能够检测到PbPTB3的运输情况，而在环剥掉叶柄韧皮部的叶柄基部无法检测到PbPTB3的运输(图5)，说明以此方法环剥叶柄韧皮部，能够阻断PbPTB3蛋白信号分子交流。
同时PbWoxT1信号分子与PbPTB3信号分子分别采用不同启动子启动表达，均能通过叶柄环剥方式阻断信号分子交流，进一步说明核酸及蛋白等信号分子是通过韧皮部长距离运输。
以上实施例仅用于说明本发明，而并非对本发明的限制，有关技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明的实质和范围的情况下，还可以做出各种变化和变型，因此所有等同的技术方案也属于本发明的保护范围。
本说明书中未作详细描述的内容属于本领域专业技术人员公知的现有技术。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国农业大学
<120> 一种阻断叶柄韧皮部鉴定信号交流的方法
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 987
<212> DNA
<213> 梨Pyrus spp
<400> 1
atggaccctc aacagatgcc aaatgaacta caagacggag gcaacaggca ggggggtgga 60
atcatgtgca ggcaaagcag tacgcggtgg acacccacaa ctgatcagat aaaaatcttg 120
aaggaccttt actacaacaa tggcattagg tcacccagcg ctgagcagat tcagaggatc 180
tctgctaagc tgcgacagtt cggcaagatc gaaggcaaga acgttttcta ttggtttcag 240
aaccacaaag ctcgtgagag gcagaagaaa agattcactt cttcttctgc tcctgatcac 300
catcatcatg cagcaccacc agtgccagct gtaccactag aagccaataa tatcaggcaa 360
agatcatcag gggttgggat tgatattaat gcaactgctg ctgctgctta tgaacaacta 420
cccattaatc agcacagcaa gtattccaac atttctgctc caccagctgg gttttcttct 480
gcatcttctt cttcagttgg tgtgaatctt tctcttgggg cacagatggg aaactatggg 540
tatggatcca ttgccatgga gaagagcttt agggagtgct caatatcatc tggaggaagt 600
actagcactg gtcatgtggg tggatctaat tatgatactt ttaatcacaa ctatggatca 660
tgggttgggg ttgatccata ttcctcgccc tacactatct ttgacaagaa atcgtcatca 720
aaaccagtgt ttggtgatca ggaaaatatg acggaagaag aatactacag tctgcaagct 780
tcccaagaga ttgagactct ccctctcttc cccatgcacg gtgaagacat ccatggcttt 840
ggcaacatca agtcatcctc catggacggc tactactccg gctggtacca ctccagtggc 900
ggcaacgatg gtggctctcg cacttccctt gagcttagcc tcaattccta cggtcacatg 960
acccatgatt acttcagatc atattga 987
<210> 2
<211> 1335
<212> DNA
<213> 梨Pyrus spp
<400> 2
atgacagaac cttctaaagt cattcatgtt cgaaacgtgg ggcatgaaat ttctgaaaat 60
gatttacttc agctatttca gccatttgga gtcataacta agcttgtgat gcttcgtgca 120
aaaaatcagg ctcttatcca aatgcaagat actgctgctg cagtcagtgc actgcagttc 180
tatgcaaatg ttcagcctgc cataagggga aggaatgtat atgtccaatt ctcctcacat 240
caagaactga caacaatgta ccagaatgct caaggacgag gagatgagcc aaaccgaatt 300
ctgttagtta cagttcatca catgctatat cctattacag tggaagtcct gcatcaagtg 360
tttgttcctc atggttttgt tgagaagatc gtcacttttc agaagtcagc tggttttcag 420
gccctaattc agtatcaatc ccgccagagt gctgttgcag ctagaacagc cctgcaggga 480
cgtaatattt atgatggttg ttgtcaacta gacattcggt tctcaaacct tgatgaatta 540
caagtgaact acaataatga gcgttcaagg gatttcacaa atcccaattt gccttcagaa 600
cagaaaggaa gatctccaca atctggatat ggtgatgcag gaggcatgta tggccttcaa 660
ggtactggag ccagggcagt tggatttccg cagatgccta atgcggctgc aattgcagca 720
gccttcggtg gaggtttgcc tcctggtata agtggaacca acgacaggtg tacagtcctt 780
gtctccaatc cgaatcctga taaaatagat gaggacaagc tttttaacct gttttccatc 840
tatggaaaca ttgtgagaat taaacttctt cggaacaaga cagaccatgc ccttgtccag 900
atgggtgatg gcttccaggc tgaactggca gtacactttc taaagggtgc actactgttt 960
gggaagcgat tggaggtcaa cttctcaaag catccaaata taacgcaagg tgctgacaca 1020
catgaatatg tgaactcaaa tctcaaccgc ttcaaccgta atgcagcaaa gaactaccgc 1080
tattgctgct ccccaacaaa gatgatccac ttgtcttctc ttccccagga agtcaccgaa 1140
gaggagattg tgagccacct agaggaaatt gggaccattg tcagcacaaa gctctttgag 1200
atgaatggaa agaagcaggc cttggttatg tttgaaactg aggagcaggc cactgaagca 1260
cttgtgtgca agcatgctac ttccatcggt gggtcaataa ttcgaatctc cttctcgcag 1320
ctacaggcaa tatga 1335

Claims (3)

1.一种阻断叶柄韧皮部鉴定信号交流的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)根据‘砀山酥梨’基因组进行比对分析设计特异性引物，获得PbWoxT1核酸信号分子和PbPTB3蛋白信号分子的基因全长序列；
(2)分别以CAMV35S和SUC2为启动子，将PbWoxT1和PbPTB3构建到pCAMBIA1305.1载体上，制备pCAMBIA1305.1-PbWoxT1和pCAMBIA1305.1-PbPTB3载体，并分别转化根癌农杆菌；
(3)将杜梨源叶片与叶柄连接处的叶柄部位用手术刀片环剥掉宽约2mm的韧皮部；
(4)将含有pCAMBIA1305.1-PbWoxT1或pCAMBIA1305.1-PbPTB3载体的根癌农杆菌在杜梨叶片中瞬时表达；
(5)暗培1天转光下培养3天后，分别选取杜梨的完整叶柄及叶柄环剥部位制作石蜡切片，观察韧皮部去除情况；
(6)完整叶柄基部及环剥叶柄基部取样，提取植物总RNA，反转录成cDNA，RT-qPCR检测PbWoxT1运输情况；提取植物总蛋白，免疫印迹检测PbPTB3运输情况；
结果表明：PbWoxT1在杜梨叶片瞬时表达4天后，在完整的叶柄基部能够检测到PbWoxT1的运输情况，而在环剥掉叶柄韧皮部的叶柄基部无法检测到PbWoxT1的运输，说明以此方法环剥叶柄韧皮部，能够阻断PbWoxT1核酸信号分子交流；
PbPTB3在杜梨叶片瞬时表达4天后，在完整的叶柄基部能够检测到PbPTB3的运输情况，而在环剥掉叶柄韧皮部的叶柄基部无法检测到PbPTB3的运输，说明以此方法环剥叶柄韧皮部，能够阻断PbPTB3蛋白信号分子交流；
同时PbWoxT1信号分子与PbPTB3信号分子分别采用不同启动子启动表达，均能通过叶柄环剥方式阻断信号分子交流，进一步说明核酸及蛋白信号分子通过韧皮部长距离运输。
2.如权利要求1所述的阻断叶柄韧皮部鉴定信号交流的方法，其特征在于：
步骤(1)中，设计PbWoxT1核酸信号分子的特异性引物为：
上游5'ATGGACCCTCAACAGATGCCAAATG 3'
下游5'TCAATATGATCTGAAGTAATCATGG 3'；
设计PbPTB3核酸信号分子的特异性引物为：
上游5'ATGACAGAACCTTCTAAAGTCATTC 3'
下游5'TCATATTGCCTGTAGCTGCGAGAAGG 3'。
3.如权利要求1所述的阻断叶柄韧皮部鉴定信号交流的方法，其特征在于：
步骤(2)中，构建pCAMBIA1305.1-PbWoxT1载体过程中，PCR扩增所用的引物为：
上游5'GCGAGATCTATGGACCCTCAACAGATGCCAAATG 3'
下游5'TATCCAGTGGTCAATATGATCTGAAGTAATCATGG 3'；
构建pCAMBIA1305.1-PbPTB3载体过程中，PCR扩增所用的引物为：
上游5'GCGACTAGTATGACAGAACCTTCTAAAGTCATTC 3'
下游5'TATCCAGTGGTCATATTGCCTGTAGCTGCGAGAAGG 3'。
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