CN108218969A - 甘薯花青素转运相关蛋白IbGSTF4及其编码基因与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种甘薯花青素转运相关蛋白IbGSTF4及其编码基因与及在培育转基因植物中的应用。所述的IbGSTF4蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，IbGSTF4蛋白的编码基因如SEQ ID NO：1所示，通过将含有IbGSTF4蛋白编码基因插入到pGWB12的两个attR位点之间得到pGWB12:IbGSTF4重组载体。本发明的IbGSTF4蛋白及其编码基因和重组载体可调控植物花青素运转过程，将编码IbGSTF4蛋白的DNA分子导入目的植物，能够得到花青素积累量增加的转基因植物。本发明提供的IbGSTF4蛋白及其编码基因在提高植物花青素含量方面具有重要的理论意义与应用价值，为转基因植物的培育奠定了基础。

Description

甘薯花青素转运相关蛋白IbGSTF4及其编码基因与应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种甘薯花青素转运相关蛋白IbGSTF4及其编码基因与应用。

背景技术

植物体内主要含有类黄酮、类胡萝卜素及生物碱类色素等3大类色素。花青素属于类黄酮化合物，是一类水溶性色素，在细胞质中合成。花青素的生物合成途径包括20余步化学反应，涉及约15个结构基因和3类转录因子，是目前研究较为清晰的代谢途径之一，但其后期阶段的转运过程仍不是很清楚。因此，了解植物花青素转运调控的分子机制，进而通过遗传改良的方法调控植物的花青素积累，已成为农业科学研究领域的重点。通过遗传转化等分子生物学技术，开展植物花青素转运相关功能基因的挖掘工作，对培育优良品质作物新品种具有重要的应用价值。

发明内容

本发明的目的在于提供一种甘薯花青素转运相关蛋白IbGSTF4及其编码基因与应用。

本发明的IbGSTF4蛋白，来源于甘薯(Ipomoea batatas)，其氨基酸序列如SEQ IDNO：2所示。

本发明的IbGSTF4蛋白的编码基因，为编码SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的核苷酸序列。

具体的，本发明的IbGSTF4蛋白的编码基因，可以是如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

本发明还提供含有所述IbGSTF4蛋白编码基因的重组载体、重组工程菌、转基因细胞系或重组病毒。

具体的，本发明提供的重组载体为将SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列插入到质粒pGWB12的两个attR位点之间得到的重组载体pGWB12:IbGSTF4。

本发明还提供所述的IbGSTF4蛋白或其编码基因或含有所述IbGSTF4蛋白编码基因的重组载体、重组工程菌、转基因细胞系或重组病毒在培育花青素积累量增加的转基因植物中的应用。

具体的，本发明提供的培育花青素积累量增加的转基因植物中的应用，具体方法为将所述IbGSTF4蛋白编码基因导入目的植物，获得转基因植物。

更具体的，所述的IbGSTF4蛋白编码基因通过含有所述IbGSTF4蛋白编码基因的重组载体、重组工程菌、转基因细胞系或重组病毒导入目的植物。

在本发明的具体实施例中，所述的IbGSTF4蛋白的编码基因通过将SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列插入到质粒pGWB12的两个attR位点之间得到的重组载体pGWB12:IbGSTF4导入tt19-1突变体拟南芥中，获得tt19-1/IbGSTF4转基因拟南芥。

本发明的IbGSTF4蛋白及其编码基因，将该基因导入拟南芥tt19-1突变体中，得到了转IbGSTF4拟南芥植株，结果证明IbGSTF4能够恢复拟南芥tt19-1突变体表型，使其花青素积累量正常，说明IbGSTF4蛋白及其编码基因在植物花青素转运过程中起着重要的作用。本发明提供的IbGSTF4蛋白及其编码基因在提高植物花青素含量方面具有重要的理论意义与应用价值。

附图说明

图1为转IbGSTF4拟南芥植株的PCR检测结果图。

图2为转IbGSTF4拟南芥植株幼苗花青素积累恢复图。

图3为转IbGSTF4拟南芥植株幼苗花青素含量变化图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细描述。

下述实施例中所用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

实施例1与甘薯花青素转运相关蛋白IbGSTF4及其编码基因的获得

实验材料：将甘薯品种徐紫薯8号在江苏徐淮地区徐州农业科学研究所试验田栽插，待生长约30天后取1-2片新鲜叶片，液氮速冻，-80℃保存。

1、叶片总RNA提取与纯化

RNA提取所用溶液、器皿等均经过DEPC水的特殊处理，其操作严格按照《分子克隆实验指南(第二版)》(2005-3-1，J.萨姆布鲁克等，科学出版社)有关RNA操作的要求进行，严防RNase污染。

采用上海捷瑞生物工程有限公司生产的Trizol试剂进行总RNA的提取，具体步骤如下：

1)取甘薯品种徐紫薯8号叶片约0.3g；

2)用液氮研磨，将磨好的样品转入1.5ml离心管，并且以每0.1g样品对应1mlTrizol的比例加Trizol试剂，涡旋振荡30s，室温放置5min左右；

3)加入氯仿200.0μl，涡旋振荡30sec，室温静置5min，4℃，12000×g离心10min；

4)取上清约500.0μl至离心柱中，加入200.0μl的无水乙醇，并充分混匀，室温静置2min(可能会有絮状沉淀产生)，常温条件下，8 000rpm离心1min；

5)小心取出柱子，倒掉滤液，并将柱子放回收集柱中，加入600.0μl buffer RWA，8000rpm，室温离心30sec，倒掉滤液；

6)重复7的步骤，倒掉滤液，将柱子放回收集管，12 000rpm离心1min；

7)小心取出柱子，放入新的RNase-Free的1.5ml离心管中，在柱膜中央加入50.0μl的DEPC-H2O，60℃下放置2min；

8)12000×g离心1min，得白色片状RNA沉淀；

取6μl用于电泳检测，取4μl用于浓度测定，剩余的于-80℃保存备用。用紫外分光光度计检测RNA的质量(OD₂₆₀)和纯度(OD₂₆₀/OD₂₈₀)；并用1.2％变性琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性。

2、cDNA第一链的合成

将提取的总RNA，通过First-Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒(TOYOBO)分别反转录成First-strand cDNA，具体步骤如下：

1)取总RNA1μg于PCR管中，然后加入5μl的Oligo(dT)20(10μM)，用RNase-Free H₂O补足至12μl；

2)在水浴锅中65℃反应5min后，立即置于冰上；

3)轻微离心，然后加入以下试剂：4μl 5×RT Buffer，2μl dNTP mix(10mM)，1μlRNase Inhibitor(10U/μl)，1μl ReverTra Ace，加RNase-Free H₂O定容至总体积为20μl；

4)混匀后轻微离心，在PCR仪中42℃温浴20min，90℃反应5min终止First-strandcDNA synthesis；

5)取4μl至0.2ml离心管中，并稀释10倍用于后续实验或放置-20℃保存。

3、IbGSTF4蛋白的cDNA编码序列克隆

根据甘薯转录组测序的结果，通过同源序列比对找到IbGSTF4蛋白的cDNA序列，并设计正向引物1和反向引物2进行IbGSTF4蛋白cDNA编码序列克隆。引物序列如下：

引物1：5’–ATGGTAGTTAAGGTGTTCGGTTCT-3’(SEQ ID NO：3)

引物2：5’–TCAATTTTTGTGGTTCATGAGGTCC-3’(SEQ ID NO：4)

以步骤2中准备好的cDNA为模板，用正向引物1和反向引物2进行PCR反应。

PCR反应体系如下：25μl PrimeSTAR Max Premix(2x)聚合酶(购自大连TAKARA公司)，100ng cDNA，正、反向引物各0.45μM，ddH₂O补充至终体积50μl。热循环参数为：94℃3min；94℃30s，55℃30s，72℃2min，35个循环；725min，1个循环；4℃保存，反应是在PTC-225PCR仪上完成。扩增产物在水平电泳槽上1.2％琼脂糖凝胶电泳检测，获得651bp长度的扩增片段。

经过测序，该PCR产物具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸，该序列所示的基因的编码区为序列表中SEQ ID NO：1自5’端第1-651位核苷酸；序列表中SEQ ID NO：1由651个碱基组成；该基因编码的蛋白命名为IbGSTF4，该蛋白的氨基酸序列为序列表中的SEQ ID NO：2；序列表中SEQ ID NO：2由216个氨基酸残基组成。

实施例2IbGSTF4蛋白在调控植物花青素转运过程中的应用

一、转IbGSTF4拟南芥的获得

1、植物表达载体的构建

根据甘薯IbGSTF4蛋白cDNA的编码序列和构建载体用的gateway技术，以人工合成的SEQ ID NO：1所示的DNA分子为模板(或以徐紫薯8号块根cDNA为模板)，用正向引物1(SEQID NO：3)和反向引物2(SEQ ID NO：4)扩增出651bp包含完整编码序列的PCR产物，纯化后用Taq DNA聚合酶在PCR产物3′加A，然后通过TOPO反应克隆到gateway的入门载体vector(购自Life Technologies生物技术公司，产品目录号为K2500-20)中，命名为TOPO:IbGSTF4载体，进行测序，保证甘薯IbGSTF4蛋白cDNA的阅读框正确。

将载体TOPO:IbGSTF4与植物表达载体pGWB12(由韩国生命工学研究院赠予)进行LR反应，得到重组载体pGWB12:IbGSTF4，即为植物表达载体。

将上述重组载体pGWB12:IbGSTF4转化大肠杆菌感受态细胞Trans-T1(购自北京全式金生物技术有限公司，产品目录号为CD501)，37℃培养16h，对重组载体pGWB12:IbGSTF4进行PCR扩增鉴定并进行测序验证。测序结果表明，重组载体pGWB12:IbGSTF4为将序列表中SEQ ID NO：1自5’端第1位–第651核苷酸插入pGWB12的两个attR位点之间得到的载体。

2、植物表达载体转化农杆菌

1)从-80℃低温冰箱中取出100μl的EHA105感受态细胞(购自上海唯地生物技术有限公司)，置于冰上融化，加入1μg上述步骤1得到的植物表达载体pGWB12:IbGSTF4，混匀；

2)液氮冷冻5min，37℃温育5min；

3)加入1000μl的LB液体培养基，28℃培养4h；

4)取200μl菌液于含有抗生素(100μg/ml利福平(Rif)、50μg/ml卡那霉素(Kan))的LB固体培养基上涂布均匀，于28℃暗培养2天；

5)挑取单菌落并进行PCR鉴定(鉴定引物为引物1和引物2，得到651bp片段的为阳性)；

6)将阳性单菌落接种含有100μg/ml Rif和50μg/ml Kan的LB液体培养基中，28℃培养至OD值达到1.0，即得到了可用于后续转化工作的农杆菌液。

3、转IbGSTF4拟南芥的获得

1)转化

用农杆菌介导的方法将IbGSTF4cDNA的编码序列导入到拟南芥缺失突变体材料tt19-1(由华南农业大学赠予)中，具体方法如下：

①将步骤2中准备好的农杆菌液离心后，加入1倍体积含有10mM MgCl₂、5％蔗糖、0.02％silwet L-77表面活性剂的悬浮溶液；

②将农杆菌悬浮液倒入50mL离心管中，将拟南芥横放使花序浸入离心管悬浮液中浸染10s，轻微晃动离心管；

③用塑料膜包裹植株，并让浸染后的植株保持黑暗条件下高湿度24h；

④次日去掉包裹的塑料，将浸染后的拟南芥放回温室，正常生长1个月后，得到T₀代转IbGSTF4拟南芥。

2)分子鉴定

提取上述生长3周后T₀代转IbGSTF4拟南芥(tt19-1/IbGSTF4)、野生型拟南芥(WT)与tt19-1突变体拟南芥(tt19-1)的总RNA，通过RT-PCR技术检测各个植株中IbGSTF4基因的表达水平，具体步骤如下：

①根据实例1中植物总RNA的提取方法，对上述拟南芥的总RNA进行抽提、纯化、检测与保存；

②根据实例1中cDNA第一链的合成方法，将提取的总RNA反转录成First-strandcDNA，稀释10倍后置于-20℃保存备用；

③设计用于RT-PCR反应的引物4和引物5，以及内参Actin2基因(At3g18780)特异引物6和引物7。引物序列如下：

引物3：5’-CGGCTATTGAGGACGGAGAC-3’(SEQ ID NO：5)

引物4：5’-CATTGATCCACCACGGCTCT-3’(SEQ ID NO：6)

引物5：5’-TGCTGTTGACTACGAGCAGG-3’(SEQ ID NO：7)

引物6：5’-CGAGGGCTGGAACAAGACTT-3’(SEQ ID NO：8)

④以上述cDNA为模板，进行RT-PCR检测。

PCR反应体系如下：1×Premix Taq，100ng DNA，正、反向引物各0.45μl，ddH₂O补充至终体积20μl。热循环参数为：94℃3min；94℃30s，复性温度55℃30s，72℃30s，35个循环；72℃5min，1个循环；4℃保存。

从电泳检测扩增结果见图1可以看出，得到133bp的为阳性T₀代转IbGSTF4拟南芥，表明IbGSTF4基因已经整合到拟南芥基因组中，并证明这些再生植株为阳性转基因植株。

二、转IbGSTF4拟南芥的花青素含量鉴定

将T2代转基因拟南芥、野生型拟南芥以及tt19-1突变体拟南芥的种子消毒后，种植于含有3％蔗糖的1/2MS培养基上，10天后取20-30株拟南芥幼苗，液氮研磨后加入10倍体积的酸性甲醇提取液(乙酸：甲醇：水＝1：80：19)，用分光光度计测定其OD₅₂₅，每个检测样品重复3次。

结果如图2和图3所示，可以看出tt19-1/IbGSTF4转基因拟南芥比突变体tt19-1植株子叶和下胚轴花青素积累量明显提高。

上述实验结果表明，IbGSTF4蛋白及其编码基因可以促进植物花青素转运和积累。

序列表

<110> 江苏师范大学

江苏徐淮地区徐州农业科学研究所(江苏徐州甘薯研究中心)

<120> 甘薯花青素转运相关蛋白IbGSTF4及其编码基因与应用

<141> 2017-12-28

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 651

<212> DNA

<213> 甘薯(Ipomoea batatas)

<400> 1

atggtagtta aggtgttcgg ttctgcagcc gcggcatgtc cgcagagggt gatggcatgt 60

ctctttgagc tcggtgtgga ttttgagctt atccatattg acttcaagtc cttggagcac 120

aaaactcctg agtttttgcg ccgccagccc ttcggacaag ttccggctat tgaggacgga 180

gacttcaaac ttttcgaatc cagggcgatc ataaggtact acgcaacaaa atatgcagaa 240

aaagggaaga acctaatggg aaagacgttg gaagagagag ccgtggtgga tcaatggcta 300

gaagtggaat ccaacaacta caacgaccta gtccagaaca ttgttcttca gatatttgtg 360

ttccccagca tgggacagcc cagcgacatg agtgtggtca agaaatgcgc agaaaagctg 420

ggaaaagtgt tggacgttta tgaagaaagg ctttccaaga gcaaatacct tgccggagat 480

ttcttctcct tggctgatct tagccacatc cccagcctca gattcttgac caatgaatgt 540

ggttttgggc atttggtgag tgagaggaag tgtttaaatg cttggtattc tgacatctct 600

ggtaggcctg cttggaacaa agtgttggac ctcatgaacc acaaaaattg a 651

<210> 2

<211> 216

<212> PRT

<213> 甘薯(Ipomoea batatas)

<400> 2

Met Val Val Lys Val Phe Gly Ser Ala Ala Ala Ala Cys Pro Gln Arg

1 5 10 15

Val Met Ala Cys Leu Phe Glu Leu Gly Val Asp Phe Glu Leu Ile His

20 25 30

Ile Asp Phe Lys Ser Leu Glu His Lys Thr Pro Glu Phe Leu Arg Arg

35 40 45

Gln Pro Phe Gly Gln Val Pro Ala Ile Glu Asp Gly Asp Phe Lys Leu

50 55 60

Phe Glu Ser Arg Ala Ile Ile Arg Tyr Tyr Ala Thr Lys Tyr Ala Glu

65 70 75 80

Lys Gly Lys Asn Leu Met Gly Lys Thr Leu Glu Glu Arg Ala Val Val

85 90 95

Asp Gln Trp Leu Glu Val Glu Ser Asn Asn Tyr Asn Asp Leu Val Gln

100 105 110

Asn Ile Val Leu Gln Ile Phe Val Phe Pro Ser Met Gly Gln Pro Ser

115 120 125

Asp Met Ser Val Val Lys Lys Cys Ala Glu Lys Leu Gly Lys Val Leu

130 135 140

Asp Val Tyr Glu Glu Arg Leu Ser Lys Ser Lys Tyr Leu Ala Gly Asp

145 150 155 160

Phe Phe Ser Leu Ala Asp Leu Ser His Ile Pro Ser Leu Arg Phe Leu

165 170 175

Thr Asn Glu Cys Gly Phe Gly His Leu Val Ser Glu Arg Lys Cys Leu

180 185 190

Asn Ala Trp Tyr Ser Asp Ile Ser Gly Arg Pro Ala Trp Asn Lys Val

195 200 205

Leu Asp Leu Met Asn His Lys Asn

210 215

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atggtagtta aggtgttcgg ttct 24

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tcaatttttg tggttcatga ggtcc 25

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

cggctattga ggacggagac 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

cattgatcca ccacggctct 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

tgctgttgac tacgagcagg 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

cgagggctgg aacaagactt 20

Claims (9)

1.IbGSTF4蛋白，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

2.根据权利要求1所述的IbGSTF4蛋白的编码基因，其特征在于，为编码SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的核苷酸序列。

3.根据权利要求1所述的IbGSTF4蛋白的编码基因，其特征在于，为如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

4.含有权利要求2或3所述的IbGSTF4蛋白的编码基因的重组载体、重组工程菌、转基因细胞系或重组病毒。

5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于，为将SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列插入到质粒pGWB12的两个attR位点之间得到的重组载体pGWB12:IbGSTF4。

6.根据权利要求4所述的含有IbGSTF4蛋白的编码基因的重组载体、重组工程菌、转基因细胞系或重组病毒在培育花青素积累量增加的转基因植物中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，具体方法为将所述IbGSTF4蛋白的编码基因导入目的植物，获得转基因植物。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的IbGSTF4蛋白的编码基因通过含有所述IbGSTF4蛋白编码基因的重组载体、重组工程菌、转基因细胞系或重组病毒导入目的植物。

9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的IbGSTF4蛋白的编码基因通过将SEQID NO：1所示的核苷酸序列插入到质粒pGWB12的两个attR位点之间得到的重组载体pGWB12:IbGSTF4导入tt19-1突变体拟南芥中，获得tt19-1/IbGSTF4转基因拟南芥。