CN111875687B - 芝麻蛋白SiBRB在调控植物根系发育中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明阐述了芝麻蛋白SiBRB在调控植物根系发育中的应用。通过将芝麻蛋白SiBRB的编码基因在拟南芥中的过表达，发现此基因可显著减少拟南芥植株的总侧根长度和根鲜重，最终可以减少根系总量。依此表明，该基因是限制植株根系生长的关键基因，在调控植物根系发育、调节植物根冠比中有很好的应用前景。

Description

芝麻蛋白SiBRB在调控植物根系发育中的应用

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体涉及芝麻蛋白SiBRB在调控植物根系发育中的应用。

背景技术

芝麻(Sesamum indicum L.)是世界上重要的优质油料作物之一，中国芝麻年种植面积80万公顷，总产量约75万吨，居世界首位。同时，芝麻是典型夏季种植的油料作物，喜温、喜光，在3-4个月内可完成整个生育期。尽管芝麻有许多优点，但芝麻的产量低且不稳定的问题一直是限制芝麻产业发展的重大问题。芝麻产量有限的主要原因是芝麻主要分布在发展中国家，通常是小农生产。尽管芝麻具有很高的产量潜力，但是由于受到生物和非生物逆境胁迫的共同作用，实际产量相当低且不稳定，这也是芝麻产业发展的重大瓶颈问题。

芝麻是一种浅根系作物，芝麻根系不仅是支撑植株体进行营养生长的器官，而且是吸收水分、矿物质元素的主要器官，同时也是一种代谢循环器官，它对外界环境条件反应较为敏感。芝麻根系分为直根系和支根系，直根系表现为主根很长，侧根较少；支根系则主根不发达，侧根较多。一般干旱地区的芝麻品种多为直根系而沙土或湿润地区芝麻品种多为支根系。但总的来说芝麻的根系是一种不发达根系，根系总量较少，从而也间接的影响了芝麻单株产量的提高。

发明内容

本发明中的目的是提供一种芝麻蛋白SiBRB在调控植物根系发育中的应用。芝麻蛋白SiBRB及其编码基因，与拟南芥及其它作物同源性都非常低，且该基因序列尚未有功能注释，本发明是首次证明该基因及其表达蛋白具有减少植物根系总量的作用，可以通过基因工程技术将该基因转入受体植物，来达到减小根系、调节根冠比的目的，也可以通过基因编辑手段，突变该基因，达到提高植物根系总量的目的。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

芝麻蛋白SiBRB或其相关生物材料在调控植物根系发育中的应用；所述相关生物材料为能够表达所述芝麻蛋白SiBRB的核酸分子或含有所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系。

一种培育总侧根长减少和/或根鲜重减少的植物品种的方法，包括使受体植物中所述的芝麻蛋白SiBRB的表达量和/或活性增加的步骤。

一种培育总侧根长减少和/或根鲜重减少的转基因植物的方法，包括如下步骤：向受体植物中导入能够表达所述的芝麻蛋白SiBRB的核酸分子，得到转基因植物；所述转基因植物与所述受体植物相比总侧根长减少和/或根鲜重减少。

与现有技术相比，本发明的优点在于：

本发明通过将能够表达芝麻蛋白SiBRB的核酸分子转入受体植物，通过其过量表达可减少受体植物根系总量。根据本发明提供的方法，可利用芝麻蛋白SiBRB的过表达来调控植物根系发育、调节植物根冠比。

附图说明

图1为本发明实施例提供的含SiBRB基因的植物重组表达载体pCAMBIA1301S-SiBRB的构建图；

图2为本发明实施例提供的转SiBRB基因在拟南芥T1代植株的筛选平板图；图中，左图为整个平板图，右图为局部放大图；

图3为本发明实施例提供的转SiBRB基因拟南芥T1代的PCR鉴定结果示意图，其中M泳道表示Marker，1-4泳道为转基因T1代植株，WT泳道为野生型拟南芥；

图4为本发明实施例提供的转SiBRB基因在拟南芥T2代植株的筛选平板图，其中左图为整个平板图，右图为局部放大图；

图5为本发明实施例提供的转SiBRB基因拟南芥T2代的PCR鉴定结果示意图，其中M泳道表示Marker，1-6泳道为转基因T2代植株，WT泳道为野生型拟南芥；

图6为本发明实施例提供的转SiBRB基因拟南芥T2代植株组(SiBRB-1、SiBRB-2和SiBRB-3)与野生型拟南芥植株组(WT)的定量表达验证结果对比图；

图7为本发明实施例提供的拟南芥植株根系扫描图，其中，左图为野生植株，右图为转SiBRB基因植株；

图8为本发明实施例提供的转SiBRB基因拟南芥T2代植株组(SiBRB-1和SiBRB-2)与野生型拟南芥植株组(WT)的总侧根长度(cm)结果对比图；

图9为本发明实施例提供的转SiBRB基因拟南芥T2代植株组(SiBRB-1和SiBRB-2)与野生型拟南芥植株组(WT)的根鲜重(mg)结果对比图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:ColdSpring Harbor Laboratory Press,1989)，或Draper等人(Blackwell科学出版社，1988)所述的条件，或按照所用试剂制造厂商所建议的条件。

克隆本发明中所述的芝麻根系大小相关的基因SiBRB的方法是本领域中所常用的方法。提取植物根系RNA是常用的分子生物学技术，提取mRNA的方法也有多种成熟的技术，试剂盒(EASY spin Plus Plant RNA kit)可从商业途径获得(购于AidlabBiotechnologies Co.,Ltd)。构建本发明中所述的载体和将载体转入植株所用到的酶切、连接、花序侵染等方法也是本领域中常用技术。其中所涉及的质粒(pCAMBIA1301)，转染用媒体(根癌农杆菌LBA4404和所用试剂成分如蔗糖、Kan、潮霉素等)可从商业途径获得。

芝麻基因SiBRB的获得

本发明所述的芝麻基因SiBRB的获得方法包括如下步骤：

(1)根据抗旱相关性状的表型、地理来源和遗传多样性检测结果，从国家芝麻中期库保存的7910份国内外的芝麻种质资源中，采取逐级取样策略，选取了327份抗旱性不同的芝麻样本，以便进行重测序分析；

(2)利用Illumina Hiseq2500测序平台，用2×76双末端测序法对327份芝麻样本进行低覆盖度的全基因组重测序，获得了2.6倍覆盖的基因组序列；

(3)结合327份芝麻样本的种质资源群体水培条件下的根系及抗旱(PEG介导)相关性状数据、基因型数据和群体结构，采用EMMAX软件包和Peal程序对芝麻相关性状进行全基因组关联分析，检测到1个位于15号连锁群上5024573的位置与芝麻根系干重和根总数都显著关联的标记位点；

(4)通过芝麻参考基因组(http://ocri-genomics.org/Sinbase/index.html)比对和基因注释分析，发现该标记位点落在SIN_1025576基因的内部、且在该基因的CDS序列内的1713bp的位置存在，通过同源比对，该基因与拟南芥及其它作物未有同源基因，因此，该基因是一个新发现的未知功能的芝麻基因，推测该基因可能与芝麻根系发育有关，命名为SiBRB；

(5)根据SiBRB基因的CDS序列，利用Primer5.0设计可以扩增其完整CDS序列的引物，引物序列(包含修饰碱基)及名称如下：

SiBRB-F：5’-gctttcgcgagctcggtaccatggaaatgagcatcccatt-3’，如SEQ ID NO.3所示；

SiBRB-R：5’-cgactctagaggatcctcatgacaagtgttggctgc-3’，如SEQ ID NO.4所示；

(6)取苗期芝麻材料G340的根系，提取根系总RNA，逆转录生成cDNA，以反转后的cDNA为模板，利用步骤S5中的引物SiBRB-F/SiBRB-R进行RT-PCR扩增，将扩增得到的片段进行测序，获得与芝麻根系发育相关的SiBRB基因序列，如SEQ ID NO.2所示。

转SiBRB基因拟南芥的构建

1、SiBRB基因重组表达载体构建

将上述实施例克隆得到的芝麻基因SiBRB利用同源重组的方法与pCAMBIA1301S(本实验室提供)质粒连接构建植物重组表达载体，命名为pCAMBIA1301S-SiBRB(图1)。具体操作如下：

(1)首先利用双酶切(BamHI和KpnI)(Takara)方法获得pCAMBIA1301S的线性化载体，然后通过琼脂糖凝胶电泳和胶回收试剂盒(天根生化科技有限公司)纯化获得高纯度的pCAMBIA1301S的线性化载体；

(2)将目的片段DNA和线性化载体pCAMBIA1301S以3:1的摩尔比加到1.5ml的离心管中进行重组反应，混匀后在37℃放置约30min，加入10μl的反应液到50μl的DH5a感受态细胞中，用移液器轻轻混匀，于冰上孵育20min，42℃水浴中热激45秒后快速置冰上冷却2min；

(3)加入300μl LB液体培养基，37℃孵育45-60min。5000rpm离心2min收集菌体，弃掉部分上清，用剩余的培养基将菌体重悬，用无菌涂布棒在含有Kan抗性的LB固体培养基上轻轻涂匀，37℃培养箱中倒置培养16-24h；

(4)挑取重组反应转化平板上若干个克隆进行菌落PCR鉴定，鉴定为阳性的菌落，挑取相应单菌落于含有Kan抗生素的液体LB培养基中37℃、200rpm培养箱中培养过夜，提取质粒或将菌液直接测序以及通过酶切电泳鉴定载体准确性。

任何含有上述的芝麻基因SiBRB的植物重组表达载体、转基因细胞系和重组菌均属于本发明用于表达芝麻基因SiBRB的载体。

可用现有的植物重组表达载体构建含有芝麻基因SiBRB的重组表达载体。所述植物重组表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等，如pCAMBIA3301、pCAMBIA1300、pBI121、pBin19、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301-UbiN或其它衍生植物重组表达载体。

使用芝麻基因SiBRB构建植物重组表达载体时，可在其转录起始核苷酸前加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、泛素(Ubiquitin)基因启动子(pUbi)等，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物重组表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。

2、表达

本发明实施例中具体的表达步骤如下：

将实施例中制备的载体pCAMBIA1301S-SiBRB转入根癌农杆菌LBA4404(上海唯地生物技术有限公司)，再导入拟南芥植株中，进行表达。具体操作如下：

(1)植物重组表达载体转入农杆菌LBA4404：

每100μl LBA4404农杆菌感受态细胞中加入2μg植物重组表达载体pCAMBIA1301S-SiBRB，用手拨打管底混匀，依次于冰上静置5min、液氮5min、37℃水浴5min、冰浴5min；

加入700μl无抗生素的LB液体培养基，于28℃振荡培养5h。6000rpm离心1min收集菌体，留取100μl左右上清，轻轻吹打重悬菌体，将其均匀地涂布于含有Kan和Rif的LB固体培养基上，倒置放于28℃培养箱培养2天，挑取若干个阳性克隆利用菌落PCR简单验证结果。

(2)拟南芥的平板培养：

1)根据实验需要数出一定数量的拟南芥种子装于无菌的1.5mL离心管中；

2)加入1mL 75％乙醇，上下颠倒混匀，弃上清，重复1次。放入37℃200rpm摇床中摇10min表面灭菌；

3)弃75％乙醇，加入1mL 95％乙醇，上下颠倒混匀，弃上清，并重复1次。在超净工作台中，向各管种子加入300-500μL无水乙醇，用1mL移液器将种子和乙醇一同喷洒到无菌滤纸上；

4)待乙醇挥发完，用牙签将拟南芥种子点种于准备好的平板上；

5)将平板封口，黑暗条件下倒置于4℃春化48h，春化结束后，将平板置于光照培养箱中竖直培养，出苗一周后即可移栽；

6)用镊子将幼苗栽入小盆的土中，先用保鲜膜保湿24h，置于植物生长间中培养直至拟南芥生长抽薹时(约一个月)，用于转化。

(3)遗传转化：

为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物重组表达载体进行加工，如加入在植物中表达可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、GFP基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

携带有本发明的与植物根系发育相关蛋白编码基因SiBRB的植物重组表达载体可通过Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化到受体植物细胞或组织中。上述芝麻基因SiBRB是通过上述植物重组表达载体导入上述受体植物中的。

本实施例中SiBRB基因的遗传转化步骤具体如下：

1)农杆菌活化：在20mL的LB液体培养基中分别加入20μL Rif和Kan(Sigma公司)，摇匀并接菌，28℃220rpm震荡活化8-10h后，得到农杆菌的活化菌液；

2)农杆菌扩大培养：在200mL的LB液体培养基中分别加入200μL Rif和Kan，再加入5-10mL的活化菌液，28℃220rpm震荡培养14-16h，至OD值1.6-2.0，4500rpm离心10min，沉淀菌体弃上清，自然晾干；

3)在沉淀菌体中加入100mL 5％蔗糖溶液重悬菌体，移液器吹打均匀、重悬菌体；

4)将离心瓶中菌液加到平皿中，再加入100mL 5％蔗糖溶液，转化前加入40μLSilwet-L-77(0.02％)，晃动平皿混匀；

5)将拟南芥花序合拢，浸入平皿，轻轻晃动15s。转化完后搅匀菌液；

6)用黑袋子将植株套好，避光保湿24h；

7)一周后再重复转化一次。

(4)筛选T1代阳性植株

种植拟南芥T0代所收获的种子，将T0代种子消毒，接种含30mg/L潮霉素的MS筛选培养基(添加25mg/L头孢霉素抑菌)上22℃光照培养7-10天，筛选获得T1代阳性植株(幼苗和根系都正常生长的植株)(如图2)。本实验获得6个阳性株系，将阳性苗移栽到土壤中，用保鲜膜盖上2-3天后揭膜，然后正常生长。取筛选出的T1代阳性植株的叶片提取DNA，利用PCR方法鉴定其含有SiBRB基因，进行转基因植株的目的基因的分子验证(如图3)，最终确认基因已经转入T1代阳性植株。

(5)转基因植株T2代阳性检测

将T1代阳性植株进行单株收种以获得T1代种子，继续进行潮霉素筛选获得T2代阳性植株(如图4)，获得的阳性植株移栽生长，提取叶片基因组DNA进行PCR分子鉴定，确定T2代阳性植株(如图5)；

(6)转基因植株T2代阳性植株定量表达验证

取转基因植株T2代阳性植株和野生型拟南芥植株生长时期的幼嫩叶片，用RNA提取试剂盒(北京艾德莱生物科技有限公司)提取叶片总RNA，然后用反转录试剂盒(南京诺唯赞生物科技有限公司)获得cDNA，以各自cDNA为模板，以拟南芥β-actin为内参(aF：5’-CCCGCTATGTATGTCGCCA-3’，如SEQ ID NO.5所示；aR：5’-AACCCTCGTAGATTGGCACAG-3’，如SEQID NO.6)；目标基因定量引物序列为：BRBF：5’-ATGGAAATGAGCATCCCATT-3’，如SEQ ID NO.7所示；BRBR：5’-TCATGACAAGTGTTGGCTGC-3’，如SEQ ID NO.8所示，进行qRT-PCR表达验证(qRT-PCR Mix：南京诺唯赞生物科技有限公司；仪器：Roche LightCyclerR 480)。

如图6所示，结果表明以未转基因的野生型拟南芥为对照，芝麻基因SiBRB在检测的3个拟南芥转基因株系的叶片中表达量显著提高，而在未转基因对照拟南芥的叶片中，没有检测到芝麻基因SiBRB的过表达，这表明芝麻基因SiBRB均转化并插入到了相应拟南芥基因组中并得到了过表达。

拟南芥阳性植株根系测定

用方形的塑料培养皿竖直培养T2代转基因植株，待植株处于苗期(10天)时测量，利用EPSONV800对培养皿进行扫描，结果如图7。用ImageJ软件来测量的总侧根长度(结果如图8)，并称量根鲜重(结果如图9)。

通过图7中的转SiBRB基因拟南芥T2代株组与野生型拟南芥植株组对比，可见野生型拟南芥株组的根系发育更旺盛。图8表明，SiBRB-1组和SiBRB-2组的总侧根长度均显著低于WT组。图9表明，SiBRB-1组和SiBRB-2组的根鲜重均显著低于WT组。因此，本研究所获得的转SiBRB基因拟南芥株系总侧根长度和根鲜重明显低于野生型拟南芥对照，表明芝麻基因SiBRB的过表达减弱了受体植物的根系发育。

综上，在生产上克隆和利用调控植物根系生长发育的芝麻基因SiBRB，将为主要农作物的根冠比调控及养分高效吸收利用研究提供了更有特色和效果的基因资源，在基因工程改良植物的根冠比及养分高效吸收利用研究中将发挥重要作用，具有重要的实用价值和直接的经济效益。

以上所述本发明的具体实施方式，并不构成对本发明保护范围的限定。任何根据本发明的技术构思所做出的各种其他相应的改变与变形，均应包含在本发明权利要求的保护范围内。

序列表

<110> 中国农业科学院油料作物研究所

<120> 芝麻蛋白SiBRB在调控植物根系发育中的应用

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 138

<212> PRT

<213> 芝麻(Sesamum indicum)

<400> 1

Met Glu Met Ser Ile Pro Phe Ser Ala Ser Leu Arg Arg Gln Trp Arg

1 5 10 15

Arg Arg Gly Tyr Asn Arg Leu Ser Pro Thr Asn Arg Arg Asn Leu Lys

20 25 30

Val Ala Arg Leu Gly Ala Gly Arg Asn Arg Ser Trp Arg Leu Arg Leu

35 40 45

Ala Pro Lys Leu Arg Leu Ile Arg Leu Ala Ala Ser Pro Phe Lys Leu

50 55 60

Trp Tyr Lys Leu Lys Asn Ala Tyr Ile Asn Met Met Leu Arg Phe Ala

65 70 75 80

Ala Ser Ala Gly Tyr Ser Asn Thr Ser Ser Val Phe Gly Ala Lys Arg

85 90 95

Ile Pro Lys Ala Arg Gly Ala Pro Met Ala Tyr Ser Arg Thr Glu Phe

100 105 110

Glu Asn Arg Leu Val Phe Glu Ile Tyr Lys Ser Val Val Ala Ser Leu

115 120 125

Glu Leu Gly Tyr Ser Ser Gln His Leu Ser

130 135

<210> 2

<211> 417

<212> DNA

<213> 芝麻(Sesamum indicum)

<400> 2

atggaaatga gcatcccatt cagtgcaagt ctgaggaggc agtggagaag aagaggttac 60

aacagattgt cacctacaaa cagaagaaac ctcaaagtag ccaggctcgg agccggcagg 120

aatcgctcat ggcgcctcag gctcgctccg aagctgcgcc tcatcaggct ggctgcttcg 180

cccttcaaac tctggtacaa actcaaaaac gcttacatca acatgatgct gaggttcgcc 240

gccagcgccg gctactccaa cacctccagt gtgttcggcg cgaagaggat cccgaaagct 300

cgcggcgcgc ccatggccta ttcgaggact gagtttgaga acaggctggt ttttgagata 360

tacaagtccg tggtggcttc tctcgagctg ggttacagca gccaacactt gtcatga 417

<210> 3

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gctttcgcga gctcggtacc atggaaatga gcatcccatt 40

<210> 4

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cgactctaga ggatcctcat gacaagtgtt ggctgc 36

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

cccgctatgt atgtcgcca 19

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

aaccctcgta gattggcaca g 21

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

atggaaatga gcatcccatt 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

tcatgacaag tgttggctgc 20

Claims (7)

1.芝麻蛋白SiBRB或其相关生物材料在调控植物根系发育中的应用，其特征在于，所述芝麻蛋白SiBRB的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述相关生物材料为能够表达所述芝麻蛋白SiBRB的核酸分子或含有所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系，所述植物为拟南芥。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述芝麻蛋白SiBRB或其编码基因在所述植物中的表达量增加，减弱植物根系发育。

3.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述植物根系发育体现为如下中至少一种：植物总侧根长、根鲜重。

4.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述芝麻蛋白SiBRB的编码基因为具有如SEQ ID NO.2所示的DNA序列。

5.一种培育总侧根长减少和/或根鲜重减少的植物品种的方法，包括使受体植物中如权利要求1中所述的芝麻蛋白SiBRB的表达量增加的步骤；其中所述受体植物为拟南芥。

6.一种培育总侧根长减少和/或根鲜重减少的转基因植物的方法，包括如下步骤：向受体植物中导入能够表达如权利要求1中所述的芝麻蛋白SiBRB的核酸分子，得到转基因植物；所述转基因植物与所述受体植物相比总侧根长减少和/或根鲜重减少；其中所述受体植物为拟南芥。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述向受体植物中导入能够表达芝麻蛋白SiBRB的核酸分子是通过向所述受体植物中导入含有如SEQ ID NO.2所示的芝麻蛋白SiBRB的编码基因的重组表达载体实现的。

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