CN114480432B

CN114480432B - 一种芹菜耐热基因AgHSFA6a-1及其应用

Info

Publication number: CN114480432B
Application number: CN202210336260.0A
Authority: CN
Inventors: 李梦瑶; 周瑾; 李晓燕; 张冉; 王超; 孙悦; 汤浩茹; 王小蓉; 罗娅; 张勇; 陈清; 王燕; 林源秀; 张云婷
Original assignee: Sichuan Agricultural University
Current assignee: Sichuan Agricultural University
Priority date: 2022-03-31
Filing date: 2022-03-31
Publication date: 2022-08-30
Anticipated expiration: 2042-03-31
Also published as: CN114480432A

Abstract

本发明公开了一种芹菜耐热基因AgHSFA6a‑1及其应用，属于植物基因工程技术领域。本发明公开了一种分离的芹菜耐热基因AgHSFA6a‑1，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。具体涉及到在芹菜中表达的AgHSFA6a‑1的克隆、转基因载体的构建、拟南芥的转化以及上述基因在提高转基因植株的耐热性中的应用。通过实验验证该基因能够应用于植物对于高温抗逆机制中，为其在植物耐热性方面的研究提供了科学依据。

Description

一种芹菜耐热基因AgHSFA6a-1及其应用

技术领域

本发明涉及植物基因工程技术领域，特别是涉及一种芹菜耐热基因AgHSFA6a-1及其应用。

背景技术

芹菜(Apium graveolens L.)为伞形科一年或多年生草本植物，原产于地中海沿岸的沼泽地带，世界各国已普遍栽培，是一种重要的蔬菜作物。芹菜富含丰富的胡萝卜素、维生素及挥发性芳香成分，除作为蔬菜外，还具有极好的药用功能。“津南实芹”是天津津南区选育的优良地方品种，抗逆性强，生长速度快，我国南北四季均可栽培。农作物的生长、发育及产量受到许多生物和非生物胁迫的影响，如干旱、低温或高温等极端天气、土壤盐渍化等。在植物中，许多基因在胁迫下被诱导表达，这些基因不仅自身能产生有抵抗力的功能性蛋白，同时也作为信号传导因子参与胁迫应答。

热激转录因子(Heat shock transcriptior factor,HSF)是热激反应的主要调控因子，通常在高温胁迫下被激活，通过与热激蛋白(Heat shock protein,Hsp)基因启动子区的热激响应元件(Heat shock element,HSE)结合，启动热激蛋自表达。作为分子伴侣的热激蛋白可以通过帮助靶蛋白重新折叠、稳定、组装、胞内运输和降解，有力地缓解或者解除高温胁迫造成的破坏，使植物在高温逆境中得以生存。研究植物HSF在基因组中的分布、染色体定位、功能结构域、进化关系和高温胁迫下的表达模式，对进一步研究植物HSF的功能具有重要意义。

HSF基因最早从酵母中被分离获得。近年来，越来越多的植物HSF基因被鉴定、克隆。据报道，拟南芥中发现了21个HSF基因，水稻中有25个、番茄中有18个、玉米中有25个、杨树中有28个、苜蓿中有16个。分析HSF蛋白结构发现，典型的HSF含有5个结构域：分别为N末端的DNA结合区(DNAbinding domain,DBD)、疏水氨基酸残基重复区或寡聚域(Hydrophobicrepeat domain,HR-A/Bor Oligomerization domain,OD)、核定位信号区(Nuclearlocalization signal domain NLS)、核输出信号区(Nuclear export signal,NES)和C末端的激活区(Activation motif,AHA)。根据DBD.OD结构域以及两者之间的连接部分的不同。植物HSF分为A、B、C 3类；根据同源进化关系，A类HSF可以再分为A1、A2、A3、A4、A5、A6、A7、A8、A9和A10亚类，B类HSF可分为B1、B2、B3和B4亚类，C类HSF分为C1C2亚类，共计16个亚类。

研究显示，HSF不仅参与多种非生物胁迫响应而且可以调控植物的生长发育。但是目前还没有关于芹菜HSF基因的相关报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种芹菜耐热基因AgHSFA6a-1及其应用，以解决上述现有技术存在的问题，利用基因工程得到的含有该基因的转基因植株的耐热能力明显提高，在耐热性植物研究方面具有广泛的应用前景。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供一种分离的芹菜耐热基因AgHSFA6a-1，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，如下：

ATGGAGCAAA AGCTACAAGG AACAGAAAAG AAACAGCAAC ATATGATGAG TTTCCTAGCAAGAGCCATAC AAAATCCTGC TTTTATGAAC CAGTTAGTCC AGCAAAAGGA GAAAAGGAAG GAACTCAAAGATTCCATTAC CAAAAAAAGG CGGCGCCCAA TTGATCAAGG CTGTAGAGGT TTTGAACTTG GAGAATCAAGCCAAAGCACT CAGGGAGTAC TAAAGCCTAT CAAAGCTGAG CCTACAGAAT TCGGAGATTA TTATGGGCTTCCCGTGTCTG AGCTAGACGT TCTTGCATTA GAAATGCAGG GATTCGGTAG AGCAAGGAGT GAGAAAGAGGAAGGCAGTGAAGAGTTTGAG AAATTTGATG ATAAAGAACT CGATGATGAA TTTTGGGAAG AATTATTGAATGATGGATTT GATGATGAAT TACGTACCAG TGGAAATGAA GAGGATGAGG AGGAAGATGT CAGTGTCCTGGCTCATAGGA TAGGCTTCTT AGGTTCAACC CCAAATTAG

本发明还提供一种蛋白，其由所述的芹菜耐热基因AgHSFA6a-1编码，其氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示，如下：

MEQKLQGTEKKQQHMMSFLARAIQNPAFMNQLVQQKEKRKELKDSITKKRRRPIDQGCRGFELG ESSQSTQGVLKPIKAEPTEFGDYYGLPVSELDVLALEMQGFGRARSEKEEGSEEFEKFDDKELDD EFWEELLNDGFDDELRTSGNEEDEEEDVSVLAHRIGFLGSTPN*

本发明还提供一种重组载体，包含所述的芹菜耐热基因AgHSFA6a-1。

本发明还提供一种重组基因工程细胞，包括所述的重组载体或者其基因组中整合有所述的芹菜耐热基因AgHSFA6a-1。

本发明还提供一种培育耐热性芹菜的方法，包括将所述的芹菜耐热基因AgHSFA6a-1转入受体植物中的步骤。

优选的是，所述芹菜耐热基因AgHSFA6a-1克隆所需引物如SEQ ID NO:2-3所示。

本发明还提供所述的芹菜耐热基因AgHSFA6a-1或所述的蛋白或所述的重组载体或所述的重组基因工程细胞或所述的方法的应用，应用于如下任一项：

(1)增加受体植物的根系生长活力；

(2)提高受体植物的耐热性；

(3)培育耐热性转基因植物。

优选的是，所述植物为双子叶植物。

优选的是，所述双子叶植物包括拟南芥和芹菜。

本发明公开了以下技术效果：

本发明从芹菜品种‘津南实芹’中获得一个响应逆境胁迫的基因AgHSFA6a-1，其为植物的一个新的HSF转录因子，通过实验验证了，该基因在植物耐热性方面的功能，结果显示：通过基因工程获取的含有该基因的转基因植物的耐热性显著提高，证明该基因在植物耐热性方面具有广泛的应用前景。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明WT拟南芥植株根系与转AgHSFA6a-1基因拟南芥T2代植株根系在高温处理下的结果图；

图2为本发明WT拟南芥植株与转AgHSFA6a-1基因拟南芥T2代植株在高温处理下的生长状态对比图；

图3为本发明转AgHSFA6a-1基因拟南芥T1代筛选结果图；

图4为本发明转pCAMBIA1301+AgHSFA6a-1基因拟南芥T2代PCR检测图；M：Marker；1-25：代表不同标号的DNA样品；

图5为本发明转AgHSFA6a-1基因拟南芥T2代植株的GUS染色图；

图6为本发明WT与转AgHSFA6a-1基因拟南芥T2代植株在三个不同时长高温处理后的荧光定量表达验证结果对比图，其中，WT表示野生型对照组，OE-AgHSFA6a-1表示转AgHSFA6a-1基因拟南芥T2代植株；

图7为本发明WT与转AgHSFA6a-1基因拟南芥T2代植株在三个不同时长高温处理后的各项生理指标对比图，其中，WT表示野生型对照组，OE-AgHSFA6a-1表示转AgHSFA6a-1基因拟南芥T2代植株。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

实施例1芹菜耐热基因AgHSFA6a-1及其应用

一、试验方法

1、芹菜总RNA的提取及cDNA的合成

采用Plant Total RNA Isolation Kit(成都福际生物技术有限公司)分别从芹菜‘津南实芹’成熟叶片中分别提取总RNA。用Goldenstar^TMRT6 cDNA Synthesis Mix Rnasinselected(北京擎科生物科技有限公司)将提取的总RNA反转录成cDNA。

2、芹菜转录因子AgHSFA6a-1基因的克隆

基于芹菜转录组测序信息，以拟南芥HSF转录因子家族为信息探针，进行检索分析，获得芹菜AgHSFA6a-1的基因序列。根据该序列设计一对引物：

正引物向(SEQ ID NO:3)：5’-ATGTACCCATCCAGCTCCT-3’，反向引物(SEQ ID NO:4)：5’-CTATATAGATGCCCAATCGATTT-3’。

以‘津南实芹’cDNA为模板进行扩增，PCR反应体系为：模板DNA 2μl，上游引物2μl，下游引物2μl，10×PCR Buffer 5μl，dNTP(each 10mM)1μl，Pfu DNA Polymeraes(5U/μl)1μl，ddH2O to 50μl；PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸60s，共30个循环；72℃延伸10min。PCR产物经质量体积分数1.0％琼脂糖凝胶电泳后回收目的条带，连接到pUCm-T载体(生工生物工程(上海)股份有限公司)上并转化大肠杆菌DH5α，提取质粒经PCR鉴定后委托北京擎科生物科技有限公司测序。

3、AgHSFA6a-1基因的重组表达载体构建

(1)首先利用双酶切BamHI和ScaI(Thermo Scientific)方法获得pCAMBIA1301的线性化载体，然后通过琼脂糖凝胶电泳和胶回收试剂盒(生工生物工程(上海)股份有限公司)纯化获得高纯度的pCAMBIA1301的线性化载体；

(2)将目的片段DNA和线性化载体pCAMBIA1301以3:1的摩尔比加到1.5ml的离心管中进行重组反应，混匀后在室温连接约30min，加入10μl的反应液到50μl的DH5a感受态细胞中，用移液器轻轻混匀，于冰上孵育30min，42℃水浴中热激45秒后快速置冰上冷却2min；

(3)加入300μl LB液体培养基，37℃孵育45-60min。5000rpm离心2min收集菌体，弃掉部分上清，用剩余的培养基将菌体重悬，用无菌涂布棒在含有Kan抗性的LB固体培养基上轻轻涂匀，37℃培养箱中倒置培养16-24h；

(4)挑取重组反应转化平板上若干个克隆进行菌落PCR鉴定，鉴定为阳性的菌落，挑取相应单菌落于含有Kan抗生素的液体LB培养基中37℃、200rpm培养箱中培养过夜，提取质粒或将菌液直接测序以鉴定载体准确性。

(5)鉴定成功后，保存pCAMBIA1301-AgHSFA6a-1的质粒。

4、重组载体转入农杆菌GV3101

(1)每100μl GV3101农杆菌感受态细胞中加入2μg重组载体pCAMBIA1301-AgHSFA6a-1，用手拨打管底混匀，依次于冰上静置5min、液氮5min、37℃水浴5min、冰浴5min。加入700μl无抗生素的LB液体培养基，于28℃振荡培养2h；

(2)6000rpm离心1min收集菌体，留取100μl左右上清，轻轻吹打重悬菌体，将其均匀地涂布于含有Kan和Rif的YEB固体培养基上，倒置放于28℃培养箱培养2天，挑取若干个阳性克隆利用菌落PCR简单验证结果。

5、拟南芥的培养

(1)根据实验需要取一定数量的拟南芥种子装于无菌的1.5mL离心管中，加入1mL75％乙醇，上下颠倒混匀，弃上清，重复3次。加入1ml超纯水，洗涤种子，弃上清，重复3次。在超净工用1mL移液器将种子点种于准备好的MS平板上；

(2)将平板封口，黑暗条件下倒置于4℃春化72h，春化结束后，将平板置于光照培养箱中竖直培养，出苗一周后即可移栽；

(3)用镊子将幼苗栽入小盆的土中，先用保鲜膜保湿24h，置于植物生长间中培养直至拟南芥生长抽薹时(约一个月)，用于转化实验。

6、拟南芥遗传转化

(1)农杆菌活化：在20mL的LB液体培养基中分别加入10μL Rif和20μL Kan(Sigma公司)，摇匀并接菌，28℃220rpm震荡活化8-10h后，得到农杆菌的活化菌液；

(2)农杆菌扩大培养：在200mL的YEB液体培养基中分别加入100μL Rif和200μLKan，再加入5-10mL的活化菌液，28℃220rpm震荡培养14-16h，至OD值1.6-2.0，4500rpm离心10min，沉淀菌体弃上清，自然晾干；

(3)在沉淀菌体中加入100mL 5％蔗糖和20uL SILWETL-77表面活性剂溶液重悬菌体，移液器吹打均匀、重悬菌体；

(4)将离心瓶中菌液加到平皿中，将拟南芥花序合拢，浸入平皿，轻轻晃动15s，转化完后搅匀菌液用黑袋子将植株套好，避光保湿24h。一周后再重复转化一次。

7、T1代阳性植株筛选

种植拟南芥T0代所收获的种子，将T0代种子消毒，接种含30mg/L潮霉素的MS筛选培养基(添加25mg/L头孢霉素抑菌)上22℃光照培养7-10天，筛选获得T1代阳性植株(幼苗和根系都正常生长的植株)，如图3所示。将阳性苗移栽到营养土中，用保鲜膜盖上2-3天后揭膜，然后正常生长。取筛选出的T1代阳性植株的叶片提取DNA，利用PCR方法鉴定其含有AgHSFA6a-1基因，进行转基因植株的目的基因的分子验证，最终确认基因已经转入T1代阳性植株。

8、转基因植株T2代阳性检测

(1)将T1代阳性植株进行单株收种以获得T1代种子，继续进行潮霉素筛选获得T2代阳性植株，植株生长至10d时，用镊子取出，使用GUS染色试剂盒(北京酷来搏科技有限公司)对T2代阳性植株和WT对照进行染色，结果如图5所示；

(2)获得的阳性植株移栽生长，提取叶片基因组DNA进行PCR分子鉴定，确定T2代阳性植株，PCR鉴定结果如图4所示。

9、拟南芥阳性植株表型观测

(1)将野生型WT拟南芥与T1代种子同时播种于消毒后的营养土中，4℃春化72h后，移入植物生长间，待拟南芥叶片开展至5cm时(20d)，进行高温胁迫处理；

(2)将WT、OE-AgHSFA6a-1-17和OE-AgHSFA6a-1-19植株同时放入38℃光照培养箱中，保持湿度在60％左右，处理24h，处理结果如图2所示。

10、拟南芥阳性植株根系测定

(1)将野生型WT拟南芥与T1代种子用“5、拟南芥的培养”中的方法消毒后，接种于MS平板上，4℃春化72h后，移入光照培养箱竖直培养，25℃培养至根系明显生长。

(2)待拟南芥根系均生长10d时，将光照培养箱温度调至38℃，保持湿度在60％左右，处理24h，处理结果如图1所示。

11、拟南芥阳性植株定量表达验证

(1)对WT、OE-AgHSFA6a-1-1和OE-AgHSFA6a-1-2植株进行高温处理：38℃高温分别处理0h、4h、12h、24h，取叶片样本并立即用液氮速冻后，保存于-80℃冰箱中，根据“1、芹菜总RNA的提取及cDNA的合成”中方法获取RNA和cDNA；

(2)选择拟南芥的7个基因和拟南芥中Actin的转录表达水平为内参序列设计表达检测引物，如表1。

表1引物

(3)实时定量PCR使用北京擎科生物科技有限公司2×TSINGKE^TMMaster qPCR Mix(SYBR Green I)试剂盒，按照操作说明进行。

(4)目的基因相对转录表达水平的计算公式为2^-ΔΔCt，ΔΔCt＝(Ct_目的基因-Ct_Actin)处理组-(Ct_目的基因-Ct_Actin)对照组。

(5)对数据进行分析处理，绘制相对表达量水平验证结果图，如图6所示。

二、试验结果

(1)将本发明克隆获得的芹菜AgHSFA6a-1基因转入拟南芥植株中获得的T2代阳性植株，在38℃高温胁迫下，生长状态与表型明显优于WT植株(如图2所示)。

(2)荧光定量PCR结果显示OE-AgHSFA6a-1植株中的7个基因均响应了高温胁迫，随着处理时间增加，表达量也呈上升趋势，且在12小时之后表达量迅速上升，且保持在较高水平(如图7所示)。

(3)根系测定结果表明：转基因植株的根系长度和侧根量明显高于野生型拟南芥对照，表明AgHSFA6a-1基因的表达增加了受体植物的根系生长活力。

(4)荧光定量表达与生理指标分析结果可证明：芹菜AgHSFA6a-1基因能显著提高受体植株对高温胁迫的抗逆性。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

序列表

<110> 四川农业大学

<120> 一种芹菜耐热基因AgHSFA6a-1及其应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 519

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atggagcaaa agctacaagg aacagaaaag aaacagcaac atatgatgag tttcctagca 60

agagccatac aaaatcctgc ttttatgaac cagttagtcc agcaaaagga gaaaaggaag 120

gaactcaaag attccattac caaaaaaagg cggcgcccaa ttgatcaagg ctgtagaggt 180

tttgaacttg gagaatcaag ccaaagcact cagggagtac taaagcctat caaagctgag 240

cctacagaat tcggagatta ttatgggctt cccgtgtctg agctagacgt tcttgcatta 300

gaaatgcagg gattcggtag agcaaggagt gagaaagagg aaggcagtga agagtttgag 360

aaatttgatg ataaagaact cgatgatgaa ttttgggaag aattattgaa tgatggattt 420

gatgatgaat tacgtaccag tggaaatgaa gaggatgagg aggaagatgt cagtgtcctg 480

gctcatagga taggcttctt aggttcaacc ccaaattag 519

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgtacccat ccagctcct 19

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ctatatagat gcccaatcga ttt 23

<210> 4

<211> 172

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Met Glu Gln Lys Leu Gln Gly Thr Glu Lys Lys Gln Gln His Met Met

1 5 10 15

Ser Phe Leu Ala Arg Ala Ile Gln Asn Pro Ala Phe Met Asn Gln Leu

20 25 30

Val Gln Gln Lys Glu Lys Arg Lys Glu Leu Lys Asp Ser Ile Thr Lys

35 40 45

Lys Arg Arg Arg Pro Ile Asp Gln Gly Cys Arg Gly Phe Glu Leu Gly

50 55 60

Glu Ser Ser Gln Ser Thr Gln Gly Val Leu Lys Pro Ile Lys Ala Glu

65 70 75 80

Pro Thr Glu Phe Gly Asp Tyr Tyr Gly Leu Pro Val Ser Glu Leu Asp

85 90 95

Val Leu Ala Leu Glu Met Gln Gly Phe Gly Arg Ala Arg Ser Glu Lys

100 105 110

Glu Glu Gly Ser Glu Glu Phe Glu Lys Phe Asp Asp Lys Glu Leu Asp

115 120 125

Asp Glu Phe Trp Glu Glu Leu Leu Asn Asp Gly Phe Asp Asp Glu Leu

130 135 140

Arg Thr Ser Gly Asn Glu Glu Asp Glu Glu Glu Asp Val Ser Val Leu

145 150 155 160

Ala His Arg Ile Gly Phe Leu Gly Ser Thr Pro Asn

165 170

Claims

1.一种分离的芹菜耐热基因AgHSFA6a-1，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.一种蛋白，其特征在于，其由权利要求1所述的芹菜耐热基因AgHSFA6a-1编码，其氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。

3.一种重组载体，其特征在于，包含权利要求1所述的芹菜耐热基因AgHSFA6a-1。

4.一种重组基因工程细胞，其特征在于，包括权利要求3所述的重组载体或者其基因组中整合有权利要求1所述的芹菜耐热基因AgHSFA6a-1。

5.一种培育耐热性芹菜的方法，其特征在于，包括将权利要求1所述的芹菜耐热基因AgHSFA6a-1转入受体植物中的步骤，所述受体植物为芹菜。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述芹菜耐热基因AgHSFA6a-1克隆所需引物如SEQ ID NO:2-3所示。

7.根据权利要求1所述的芹菜耐热基因AgHSFA6a-1或权利要求2所述的蛋白或权利要求3所述的重组载体或权利要求4所述的重组基因工程细胞或权利要求5所述的方法的应用，其特征在于，应用于如下任一项：

（1）增加受体植物的根系生长活力；

（2）提高受体植物的耐热性；

（3）培育耐热性转基因植物；

所述植物选自拟南芥和芹菜。