CN107460200B - 一种HMGR基因mRNA在梨属砧穗间传递的分子鉴定方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了HMGR基因mRNA在梨属砧穗间传递的分子鉴定方法，包括如下步骤：(1)鸭梨为接穗，杜梨为砧木进行试管苗微嫁接；(2)分别提取杜梨、鸭梨以及嫁接后砧木与接穗的总RNA，反转录成cDNA，PCR扩增HMGR基因的全长，以此为模板进行第二次PCR，得到各自的HMGR基因片段；两次PCR的上下游引物序列分别如SEQ ID NO.1‑4所示；(3)限制性内切酶对第二次PCR产物进行酶切，比较嫁接前后的酶切谱图鉴定传递情况。本发明提供的方法快速、灵敏，准确性高，简便，能够应用于其他梨属植物。

Description

一种HMGR基因mRNA在梨属砧穗间传递的分子鉴定方法

技术领域

本发明涉及植物分子生物学领域，具体涉及的是HMGR基因mRNA分子在梨属植物砧木和接穗间长距离传递的分子鉴定方法。

背景技术

在园艺作物生产实践过程中，应用嫁接技术可以提高植株抗性、增加产量、改善果实品质，对品种的改良，经济价值的提高都有着非常重要的意义，其中在果树生产上嫁接更是得到了广泛运用。在果树生产上发现，不同砧木对接穗的生理生化特性、开花结实、环境的适应能力以及树体生长发育等方面能产生不同的影响，而这些影响最终会对果品的形成以及后期的经济价值起到关键性的作用。

到目前为止，已经发现砧穗间存在许多通过植物韧皮部远距离传递的內源mRNA分子，长距离传递mRNA信号能够由砧木传递到接穗，进而影响接穗生理和发育进程。因此，通过对果树砧穗间长距离传递mRNA分子进行鉴定和机理研究，可以为mRNA在多年生木本植物远距离传递机理以及砧穗间互作机理研究提供理论基础，也可利用可传递mRNA开发一种可以定向改良接穗性状的新型砧木育种方法，进而达到通过嫁接调控接穗性状，避免转基因果品，而获得优良果实品质，提高经济效益，为今后果树育种及生产提供指导。

3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMGR)是甲羟戊酸途径中合成萜类物质的第一个重要限速酶，是细胞质萜类化合物代谢中的重要调控位点(Bach,1986；Choi et al.,1992)，在植物的生长发育过程中起到非常重要的作用。在植物中HMGR多肽链部分都是由N-末端区、连接区、跨膜区和C-末端区这四部分组成，其中C-末端催化区域由基因中的近3’端编码形成，且在多数植物中高度保守(Roberts,2007)。在目前所报道的植物中，HMGR多由一个基因家族编码，且不同植物中同源基因的数目是不同的。拟南芥中已经克隆得到4个同源基因(Caelles et al.,1989；Lin et al.,1999；Theologis et al.,2000)，在苹果中至少有2个不同基因能编码HMGR，分别为MdHMG1和MdHMG2(Rupasinghe et al.,2001)，沙梨在NCBI中登录编码HMGR基因有2个，梨属的杜梨PbHMGR1也被克隆得到(黄晶等，2015)。

迄今为止，已经发现许多可以通过植物韧皮部远距离传递的內源mRNA分子，比如拟南芥Aux/IAA18和Aux/IAA28(Notaguchi et al.,2012)、南瓜CmNACP(Ruiz-Medrano etal.,1999)、CmPP16(Xoconostle-Cazares et al.,1999)、CmGAIP(Haywood et al.,2005)、番茄the PFP-LeT6fusion gene(Kim et al.,2001)、马铃薯StBEL5(Banerjee et al.,2006；Hannapel,2010)、POTH1(a KNOTTED1-Liketranscription factor)(Mahajan etal.,2012)等富含韧皮部汁液的草本植物，而在韧皮部汁液较少的多年生木本植物并不多见。目前，在果树上鉴定到的可以进行远距离传递的内源mRNA分子，有苹果内源的GAI(Xuet al.,2010)、梨内源的KN1(张文娜，2012)、GAI(Zhang etal.,2012)、NACP(Zhang etal.,2013)，对于鉴定草本植物基因的mRNA是否能够进行远距离传递的方法，目前只有通过构建携带特异性标签的载体进行转基因嫁接后检测(Haywood et al.,2005)，将mRNA标记上特异的分子探针微注射检测(Xoconostle-Cazares et al.,1999)及巢式RT-PCR(Kanehira et al.,2010)等技术，虽然这些技术检测基因的传递性比较准确，但是其中存在的不足之处是过程繁琐，成本高，要求高，耗时长，工作量较大，工作周期长，效率低等，一般实验室难以完成。而对于多年生木本植物在研究mRNA在砧穗间传递的过程中，目前较为简便的方法是RT-PCR-CAPS(Xu et al.,2010)，但是这种方法仍然有其不足之处，其对基因序列要求高，对于想要鉴定的mRNA要求砧穗间基因序列存在天然的有差异的酶切位点，一般基因也难以满足的问题，因此在研究mRNA在砧穗间传递的过程中，其苛刻的要求大大限制了所能鉴定的mRNA的数量，这样就为进行果树内源mRNA嫁接传递的研究更增加了难度，使得果树在mRNA远距离传递方面的研究难以推进，新的远距离传递的内源mRNA难以发现。

发明内容

本发明的目的是提供一种HMGR基因mRNA在梨属砧穗间传递的分子鉴定方法。

本发明首先根据沙梨(Pyrus pyrifolia)、杜梨(Pyrus betulaefoliaBunge)等植物HMGR基因序列以及梨‘砀山酥梨’基因组(http://peargenome.njau.edu.cn/default.asp？d＝4&m＝2)进行比对分析设计特异性引物，分离和克隆鸭梨(Pyrusbretschneideri)中编码HMGR基因全长，利用生物信息学方法进行序列相似性分析，并对所得基因进行了聚类分析，证实所得鸭梨基因属于HMGR家族。

本发明提供的鸭梨HMGR基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO 3所示，其编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO 4所示。

本发明提供了一种用于鉴定梨属植物砧穗间HMGR基因传递的特异性引物对，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.7-8所示。

含有核苷酸序列如SEQ ID NO.7-8所示的特异性引物对的试剂盒属于本发明的保护范围。

本发明提供了核苷酸序列如SEQ ID NO.7-8所示的特异性引物对在鉴定梨属植物砧穗间HMGR基因传递中的应用。

本发明提供了核苷酸序列如SEQ ID NO.7-8所示的特异性引物对在梨属植物栽培中的应用。

进一步地，本发明提供了一种用于鉴定梨属植物砧穗间HMGR基因传递的引物组合，含有2对引物，其核苷酸序列分别如SEQ IDNO.5-6、SEQ ID NO.7-8所示。

本发明提供了上述引物组合在鉴定梨属植物砧穗间HMGR基因传递中的应用。

本发明提供了上述引物组合在梨属植物栽培中的应用。

含有上述引物组合的试剂盒属于本发明的保护范围。

本发明提供了上述试剂盒在鉴定梨属植物砧穗间HMGR基因传递中的应用。

本发明提供了一种HMGR mRNA分子在梨属砧穗间传递的分子鉴定方法，包括如下步骤：

(1)鸭梨为接穗，杜梨为砧木进行试管苗微嫁接；

(2)分别提取杜梨、鸭梨以及嫁接后砧木与接穗的总RNA，反转录成cDNA，第一次PCR扩增HMGR基因的全长，以此为模板进行第二次PCR，得到各自的HMGR基因片段；

(3)限制性内切酶对第二次PCR产物进行酶切，比较嫁接前后的酶切谱图鉴定传递情况。

上述分子鉴定方法中，步骤(2)中所述第一次PCR所采用的引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.5-6所示；第二次PCR所采用的引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.7-8所示。

步骤(3)中所述限制性内切酶为BamHⅠ。

经由15％聚丙烯酰胺凝胶进行分离酶切产物，鸭梨的产物得到18bp和193bp两个片段，杜梨产物不能被酶切，只有一个211bp的片段。

优选地，本发明用于提取接穗总RNA的样品选自微嫁接1-10天接穗鸭梨的叶片、茎尖、茎段韧皮部、嫁接口或砧木杜梨茎段韧皮部与木质部。

进一步地，本发明提供了上述分子鉴定方法在果树栽培上的应用。

优选地，所述果树为梨属植物。

本发明提供的方法解决了同源性很高的基因在砧木和接穗间无法通过设计特异性引物进行RT-PCR鉴定的问题，同时也解决了果树转基因技术较难，耗时长而不方便鉴定的问题。本发明利用不同品种间基因序列中存在的SNPs(单核苷酸多态性)，通过设计特异的引物，使得不同品种砧穗间基因序列原本并不存在天然的有差异的酶切位点，而获得了酶切位点，之后对PCR扩增产物使用限制性内切酶酶切，将酶切产物用聚丙烯酰胺凝胶进行分离，比较嫁接前后的酶切谱图，最终解决了同源性很高的基因在砧木和接穗能否进行远距离传递的问题，具有快速、灵敏、准确性高、简便，能够应用于其他植物的特点。

附图说明

图1所示为鸭梨和杜梨HMGR基因全长第一轮PCR扩增电泳图。图中M：DNA分子量标准；1：鸭梨；2：杜梨。

图2所示为HMGR氨基酸序列同源性比较。图中YL-HMGR为鸭梨；DL-HMGR为杜梨；PpHMGR1为沙梨；MdHMG1为苹果。

图3所示为HMGR氨基酸序列系统进化树分析。

图4所示为鸭梨和杜梨HMGR基因片段第二轮PCR扩增电泳图。图中M：DNA分子量标准；1：鸭梨；2：杜梨。

图5所示为鸭梨和杜梨HMGR第二轮PCR产物限制性内切酶酶切后聚丙烯酰胺凝胶电泳检测结果。图中M：DNA分子量标准；Y’：鸭梨第二轮PCR产物；D’：杜梨第二轮PCR产物；Y：鸭梨第二轮PCR产物酶切结果；D：杜梨第二轮PCR产物酶切结果；M’：鸭梨和杜梨等量混合物第二轮PCR产物酶切结果。

图6所示为嫁接后砧木和接穗第一二轮RT-PCR结果。图中1：鸭梨茎尖；2：鸭梨叶片；3：鸭梨茎段韧皮部；4：嫁接口；5：杜梨茎段韧皮部；6：杜梨茎段木质部；CK：对照组；Y：鸭梨嫁接鸭梨；D：杜梨嫁接杜梨；M’：鸭梨嫁接鸭梨和杜梨嫁接杜梨等量混合物。

图7所示为该发明进行分子鉴定的原理图。

图8所示为微嫁接接穗与砧木HMGR PCR产物限制性内切酶酶切聚丙烯酰胺凝胶电泳检测结果。M：DNA分子量标准；1：鸭梨茎尖；2：鸭梨叶片；3：鸭梨茎段韧皮部；4：嫁接口；5：杜梨砧木茎段韧皮部；6：杜梨砧木茎段木质部；CK：对照组；Y：鸭梨嫁接鸭梨；D：杜梨嫁接杜梨；M’：鸭梨嫁接鸭梨和杜梨嫁接杜梨等量混合物。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1试管微嫁接

选取砧木杜梨(Pyrus betulaefolia Bunge)和接穗鸭梨(Pyrusbretschneideri)组培苗幼叶，恒定光源，光强1500lx，光照14h/10h昼夜循环，室温23～25℃，相对湿度85％，30～40d继代一次。

表1鸭梨和杜梨组培苗培养基

液氮处理后放入-80℃冰箱保存用于基因克隆。在无菌条件下，将扩繁30d后的杜梨组培苗去头，留约1.5cm长茎段作为砧木，沿顶部纵切约0.5cm口子；取苗高1cm的鸭梨组培苗，顶端留2-3片叶，基部削成“V”型，插入砧木切口，用锡箔纸包裹固定，置入培养基MS+0.5mg·L^–1 6-BA+0.1mg·L^–1IBA中生长。

实施例2基因RNA提取

植物材料总RNA的提取采用CTAB法(张玉刚等，2005)，从杜梨、鸭梨以及嫁接后砧木与接穗的叶片和茎段中提取总RNA，用30μL DEPC水溶解，电泳检测后置-80℃冰箱保存备用。

(1)去除RNA中DNA：

加入成分及反应体系如下：

(2)在37℃下处理30min；加入550μL无RNase水(0.1％DEPC处理)，再加入等体积600μL CI混匀；

(3)在4℃下，10000rpm离心10min，吸取上清，再加入等体积CI轻轻混匀；在4℃下，10000rpm离心10min；

(4)吸取上清，向管中加入2倍体积的无水乙醇，在-20℃下，沉淀1h；

(5)在4℃下，12000rpm离心20min；弃上清，再加入1mL 75％乙醇进行漂洗沉淀，12000rpm离心5min，漂洗2次后用枪头吸出多余的乙醇；

(6)放于超净工作台里进行吹干，溶于30-50μL DEPC水中，之后放入-80℃冰箱保存以备用；

(7)1％琼脂糖凝胶电泳检测提取核酸的完整性，用紫外分光光度计通过测260nm处的吸光度计算提取的RNA浓度。

实施例3将RNA反转录为cDNA

反转录体系及程序如下：

(1)在冰上向0.2mL RNase-free PCR管中加入以下成分：

(2)混匀后瞬时离心，放入PCR仪中70℃10min，之后立刻置于冰上5min；

(3)在冰上继续向上一步骤中的PCR管中加入以下成分：

(4)混匀后瞬时离心，放入PCR仪中42℃60min，70℃10min，等待反应结束以后，取出产物置于-20℃保存备用。所得到的cDNA作为下述PCR扩增的模板。

实施例4鸭梨杜梨HMGR基因全长克隆

根据沙梨(Pyrus pyrifolia)、杜梨(Pyrus betulaefolia Bunge)等植物HMGR基因序列以及梨‘砀山酥梨’基因组(http://peargenome.njau.edu.cn/default.asp？d＝4&m＝2)

进行比对分析设计特异性引物，分离和克隆鸭梨(Pyrusbretschneideri)中编码HMGR基因全长。

扩增鸭梨杜梨HMGR基因使用引物如下：

上游引物：5‘-ATGGACGTCCGAAGGCGATCTA-3’，(SEQ IDNO.5)

下游引物：5’-TTAAGCGGACGCAACAGCTGA-3’(SEQ IDNO.6)。

上述引物均由中美泰和生物技术有限公司合成。

PCR反应体系：2×Es Taq MasterMix(Dye)购自(北京康为世纪生物科技有限公司，CW0682S)

PCR反应程序如下：94℃预变性5min；94℃30s，60℃30s，72℃2min，28个循环。72℃最后延伸10min。

PCR产物检测：根据目标片段大小制作1％琼脂糖凝胶，0.1％TAE电泳缓冲液，70-110V电压电泳约15min，溴化乙啶染色，紫外灯下检测PCR产物片段大小，可得鸭梨和杜梨两条大小相同的条带(见图1)。

实施例5目的片段琼脂糖凝胶回收

使用AXYGEN公司琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒，方法参照其公司说明书：

(1)切取含有目的DNA片断的琼脂糖，尽量切除多余的凝胶；

(2)将凝胶块放入2mL离心管中，再加入3倍体积的凝胶熔化剂Buffer DE-A；

(3)放置于75℃水浴锅中水浴10min，期间不断温和地上下翻转离心管，以确保胶块完全溶解于红色的溶胶液中。等待10min之后，若还有未溶解的胶块，可以再补充一些溶胶液或再放置几分钟，直至完全溶解；

(4)吸取0.5个Buffer DE-A体积的Buffer DE-B加入到离心管中；

(5)将溶解好的黄色溶胶液，加到回收柱中，在室温下，10000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液；

(6)重复(5)中的操作一次；

(7)加入500μL的漂洗液W1，在室温下，10000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液；

(8)加入700μL的漂洗液W2(已加无水乙醇)，在室温下，10000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液；

(9)将回收柱放回收集管内，在室温下，10000rpm离心1min，去除多余的漂洗液；

(10)取出回收柱，在超净台上吹干未挥发的乙醇，放入一个新的1.5mL离心管中，在回收柱膜中央加入30μL已预热至65℃的洗脱液，在室温下静置2min，让PCR产物完全溶解于洗脱液中，13000rpm离心1min以洗脱下来；

(11)取2-5μL回收产物，用浓度为1.0％的琼脂糖凝胶进行电泳检测回收效果，其余回收得到的PCR产物放入-20℃保存备用。

实施例6制备大肠杆菌感受态细胞

(1)从-70℃冰箱中取出菌种，未完全解冻前用已经灭菌的牙签轻轻点一下后在备好的90mm培养基上划线，37℃过夜培养16h左右，培养至可见单菌落时封口于4℃冰箱中保存备用；

(2)配制LB液体培养基300mL，分装于6个200mL的三角瓶(50mL/瓶)，高温高压灭菌20min，冷却至55℃左右，每个三角瓶中取LB液体培养基50μL都装于同一个已经灭菌的玻璃试管中。三角瓶中培养基封口于4℃冰箱备用；

(3)用已灭菌的枪头于90mm培养好的菌板上挑取单菌落，将枪头推入装有LB液体培养基的玻璃试管中，封口，于37℃恒温震荡床中228rpm过夜培养16h以上；

(4)从培养好的液体菌液中分别取50μL于备用的6个装有液体培养基的三角瓶中，以1：100比例接种，225rpm培养至OD600为0.6，大约为3h左右；

(5)将菌液分装到12个50mL无菌聚丙烯离心管中，冰上放置10min，然后4000rpm，4℃离心10min收菌；

(6)弃上清，倒置离心管1min以彻底去除上清。每管加入25ml预冷的0.1M CaCl₂，轻轻混匀，冰上置30min；

(7)4000rpm，4℃离心10min；

(8)弃上清，倒置离心管1min以彻底去除上清。每管加入25ml预冷的0.1M CaCl₂，轻轻混匀；

(9)此时感受态可以直接使用，若需长时间保存，可加入浓度为80％的甘油，并使甘油终浓度为20％，于-80℃保存。

实施例7目的片段T-载体连接和转化

取纯化的PCR产物加入pMD19-T载体及缓冲液(Takara公司，3271，Japan)(参照pMD19-T载体连接说明书)

连接体系：

混匀，稍离心，16℃水浴12h以上。载体与基因片段(实施例5回收得到鸭梨和杜梨HMGR基因片段)的摩尔比1:4。

(1)取50μL大肠杆菌trans5α感受态细胞，置于冰上；

(2)等待完全溶解后加入10μL连接产物，将其轻轻混匀，放置于冰上30min；

(3)42℃金属浴上进行热激45s后，立刻放置于冰上2-3min；

(4)加入500μL的LB培养基，放入37℃摇床中200rpm振荡培养45min；

(5)室温下10000rpm离心1min，用枪头吸掉400μL的上清液，再用剩余培养基将细胞悬浮；

(6)将菌液均匀地涂布于含有氨苄抗生素的固体LB培养基上；

(7)将平板于37℃温箱中倒置培养过夜(16-18h)。用灭过菌的枪头挑取阳性克隆于20μL含有氨苄抗生素的LB液体培养基中，吸打混匀，放入37℃摇床中培养20min，吸取1μL菌液作为模板，进行PCR阳性克隆的鉴定。同时设置阳性对照(以PCR回收纯化后的产物为模板)和阴性对照(以蓝斑菌液为模板)以及单引物对照；琼脂糖凝胶电泳检测插入片段大小。选择阳性克隆菌液，由中美泰和生物技术有限公司进行测序。测序结果显示两条目的片段鸭梨和杜梨目的片段均为1827bp，编码608个氨基酸。

实施例8杜梨和鸭梨HMGR基因生物信息学分析

将所得序列在http://www.ncbi.nlm.nih.gov等网站上提供的软件中进行同源性比较、分子量的预测；用DNAMAN(Lynnon BioSoft)进行多序列比对分析、MEGA5.0绘制进化树分析。

在NCBI上Blast比对结果显示：实施例7得到的鸭梨和杜梨HMGR基因氨基酸序列与其他植物的具有较高的相似性，其中鸭梨和杜梨HMGR基因编码的氨基酸序列完全相同(见图2)，与苹果和沙梨HMGR1的相似性达到96.63％，证明克隆得到的序列为编码鸭梨HMGR1蛋白基因。因此，将其命名为YL-HMGR，对应的将杜梨HMGR基因命名为DL-HMGR。

通过MEGA5.0构建YL-HMGR、DL-HMGR等10种植物HMGR基因氨基酸序列的系统进化树。该进化树显示，所获得的氨基酸序列鸭梨(Pyrus bretschneideri)与杜梨(Pyrusbetulaefolia Bunge)HMGR1、苹果(Malus domestica)HMG1亲缘关系最近，与沙梨(Pyruspyrifolia)HMGR1关系较近，与苹果(Malus domestica)HMR2、沙梨(Pyrus pyrifolia)HMGR2亲缘关系较远，而与烟草(Nicotiana tabacum)HMGR1、HMGR2以及拟南芥(Arabidopsis thaliana)HMGR1、HMGR2亲缘关系最远(见图3)。本发明获得的系统进化树在一定程度上与植物学分类结果一致。表明氨基酸的序列进化与植物的进化保持一致，同科植物在进化树上处于同一分支，而亲缘关系较远的处于不同分支，且氨基酸的同源百分率也随物种亲缘关系的变远而变小。

实施例9杜梨和鸭梨HMGR片段PCR扩增

YL-HMGR与DL-HMGR基因核苷酸序列相似性高达99.89％，只有两个碱基的差异，因此特异性引物很难设计，利用RT-PCR的方法鉴定不可行。而利用DNAMAN分析砧木与接穗核苷酸序列间酶切位点，比较酶切位点之间的差异，选择砧木对接穗特异的酶切位点，这种方法也不可行，于是发明人想到利用Primer5.0与DNAMAN，在有差异的核苷酸位点两端设计引物。即通过对两个基因单核苷酸的差异位点的分析，通过利用引物设计，将本来不是酶切位点的地方，改造成了一个酶切位点，通过PCR扩增得到带有酶切位点的片段(见图4)，因此本发明使用一个特异的限制性内切酶BamHⅠ(Thermo公司，FD0054)，即可将鸭梨与杜梨切成不同大小的片段。采用酶切鉴定的方法验证HMGR基因mRNA的传递。

表2

引物均由中美泰和生物技术有限公司合成。

PCR反应体系：

PCR反应条件：94℃预变性5min；94℃30s，56℃30s，72℃20s，34个循环。72℃最后延伸10min。

实施例10PCR产物BamHⅠ酶切与聚丙烯酰胺凝胶电泳

将PCR产物回收、纯化，方法同实施例5，随后进行酶切，酶切体系如下：

根据目标片段大小制作15％聚丙烯酰胺凝胶，用TBE电泳缓冲液在70-110V电压电泳约3-4h，溴化乙啶染色，紫外灯下检测PCR产物片段大小。

发现杜梨的PCR产物不能被酶切，鸭梨的PCR产物可以被酶切成18bp、193bp两个条带(见图5)，结果与预期的酶切图谱一致。由此可见，所设计的引物及限制性内切酶BamHⅠ可被用于鉴定梨中HMGR基因mRNA的传递。

实施例11微嫁接后HMGR mRNA在杜梨和鸭梨间传递的鉴定

微嫁接后1-10d，分别从接穗鸭梨茎尖、叶片、茎段韧皮部，嫁接口及砧木杜梨茎段韧皮部、木质部组织中取样，提取总RNA，反转录后按实施例4，9的方法进行PCR(图6)。以各自鸭梨和杜梨自身嫁接苗的茎段韧皮部的cDNA为阴性对照，以鸭梨和杜梨自身嫁接苗的茎段韧皮部的cDNA等量混合为阳性对照。按实施例10对PCR产物用限制性内切酶进行BamHⅠ酶切和聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定(图8)。

结果表明：在嫁接后的前7天，砧木和接穗各组织都表现为各自的特异性酶切条带，但从第8天开始，可以看到除了杜梨茎段木质部外，其余各组织都有新的酶切条带出现，即接穗鸭梨各部位除了含有自身特异性酶切条带之外，同时还增加了砧木杜梨的特异性酶切条带；而砧木杜梨的茎段韧皮部除了含有自身特异性酶切条带之外，同时也增加了接穗鸭梨的特异性酶切条带。对照组中的鸭梨和杜梨自身嫁接苗并未发现有新的特异性酶切条带。

本发明提供的方法可实现快速、灵敏、准确性高、简便地去鉴定同源性很高的基因在砧木和接穗能否进行远距离传递，具有广阔的市场前景。该方法过程简单，要求不高，耗时短，工作量较小，工作周期较小，效率高，花费便宜，一方面为科研者大大节约了金钱成本，另一方面，缩短了实验时间，也节约了时间成本，提高了工作的效率。可以大范围的在植物上应用，解决了同源性很高的基因在砧木和接穗间无法通过设计特异性引物进行RT-PCR鉴定的问题，省去了转基因所耗费的时间，而mRNA标记上特异的分子探针微注射要求高且花费高，一般实验室难以完成，RT-PCR-CAPS对基因序列要求也高，而一般基因也难以满足，若可以大力推广该方法，这样不仅可以节约金钱与时间，还能够应用于其他植物，大大拓宽了可以鉴定砧穗间远距离传递mRNA的数量，也使得多年生基因组高度杂合的木本植物信号传递方面的研究得以推进。

虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (2)

1.一种HMGR mRNA分子在梨属砧穗间传递的分子鉴定方法，包括如下步骤：

(1)鸭梨为接穗，杜梨为砧木进行试管苗微嫁接；

(2)分别提取杜梨、鸭梨以及嫁接后砧木与接穗的总RNA，反转录成cDNA，第一次PCR扩增HMGR基因的全长，以此为模板进行第二次PCR，得到各自的HMGR基因片段；

(3)限制性内切酶对第二次PCR产物进行酶切，比较嫁接前后的酶切谱图鉴定传递情况；

步骤(2)中第一次PCR所采用的引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.5-6所示；第二次PCR所采用的引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.7-8所示；

所述限制性内切酶为BamHⅠ；

经由15％聚丙烯酰胺凝胶进行分离酶切产物，鸭梨的产物得到18bp和193bp两个片段，杜梨产物不能被酶切，只有一个211bp的片段；

在嫁接后的前7天，砧木和接穗各组织都表现为各自的特异性酶切条带，从第8天开始，除了杜梨茎段木质部外，其余各组织都有新的酶切条带出现，接穗鸭梨各部位除了含有自身特异性酶切条带之外，同时还增加了砧木杜梨的特异性酶切条带；而砧木杜梨的茎段韧皮部除了含有自身特异性酶切条带之外，同时也增加了接穗鸭梨的特异性酶切条带；

用于提取接穗总RNA的样品选自微嫁接1-10天接穗鸭梨的叶片、茎尖、茎段韧皮部、嫁接口或砧木杜梨茎段韧皮部与木质部。

2.根据权利要求1所述的分子鉴定方法在果树栽培上的应用。

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